FI85866C - Foerfarande foer framstaellning av nya gonadoliberinderivat vilka foermaor frigoera luteniserande eller follikelstimulerande hormon. - Google Patents

Description

85866

Menetelmä lutenisoivaa tai follikkelia stimuloivaa hormonia vapauttavan vaikutuksen omaavien uusien gonadoliberiini-johdannaisten valmistamiseksi

Keksinnön kohteena ovat uudet yleisen kaavan (I)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Xi-X2-X3-Pro-X4 (I) mukaiset gonadoliberiininonapeptidietyyliamidi- tai dekapep-tidiamidi-johdannaiset, jossa kaavassa Χχ merkitsee 2-aminobentsoehappo- tai 3-aminobentsoehappo-ryhmää, X2 merkitsee leusyyli-, tryptofyyli- tai fenyylialanyyliryh-mää, X3 merkitsee arginyyli-, leusyyli- tai glutaminyyliryhmää ja X4 merkitsee glysyyliamidi- tai etyyliamidiryhmää, samoin kuin niiden happoadditiosuolat ja näitä yhdisteitä sisältävät farmaseuttiset valmisteet.

Kaavoissa käytetyt lyhennykset ovat yhdenmukaisia peptidike-miassa käytetyn nimistön kanssa [ks. esim.: J. Biol. Chem. 241, 527 (1966)]. Siten tässä selityksessä käytettyjen lyhennysten merkitys on seuraava: X -X-

Glp: pyroglutamiinihappo (pyroglutamyyli)

His: histidiini (histidyyli)

Trp: tryptofaani (tryptofyyli)

Ser: seriini (seryyli)

Tyr: tyrosiini (tyrosyyli)

Gly: glysiini (glysyyli)

Phe: fenyylialaniini (fenyylialanyyli)

Leu: leusiini (leusyyli)

Pro: proliini (prolyyli)

Glu: glutamiinihappo (glutamyyli)

Gin: glutamiini (glutaminyyli)

Arg: arginiini (arginyyli)

Mab: 3-aminobentsoehappo 2 8 5 C 6 6

Aa: antraniilihappo

Boc: tert-butyylioksikarbonyyli

Bzl: bentsyyli DCC: disykloheksyylikarbodi-imidi DCU: disykloheksyyliurea DIC: di-isopropyylikarbodi-imidi DMF: dimetyyliformamidi DNP: dinitrofenyyli EA: etyyliamidi

Et: etyyli HPLC: korkeapainenestekromatografia

Me: metyyli ONP: pentakloorifenyyli OPCP: pentafluorifenyyli TEA: trietyyliamiini TFA: trifluorietikkahappo THF: tetrahydrofuraani TLC: ohutkerroskromatografia

Tos: tosyyli UV: ultravioletti Z: bentsyylioksikarbonyyli

Gonadoliberiinin [muita kirjallisuudesta tunnettuja nimityksiä: gonadotropiinia vapauttava hormoni, lutenisoivaa ja follikkelia stimuloivaa hormonia vapauttava hormoni (LH/FSH-RH), kemiallisesti Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2] ja tämän hormonin tunnettujen johdannaisten yhteisenä ominaisuutena on kyky vapauttaa lutenisoivia ja follikkelia stimuloivia hormoneja (LH ja FSH).

80-luvun alussa tuli tunnetuksi, että gonadoliberiinin rakenne joissakin kaloissa ja linnuissa poikkeaa nisäkkäissä löydetystä gonadoliberiinistä [J. A King ja R. P. Millar: J. Biol. Chem. 257, 10722 (1982); South-African J. of Science 78, 124 (1978); N. Sherwood et ai.: Proc. Natl. Acad. Sei.

80, 2794 (1983)]. Nämä erot esiintyvät lintujen kohdalla aminohapoissa 8-asemassa ja kalojen kohdalla 7- tai vastaavasti 8-asemassa.

3 85C66

Kirjallisuudesta on myös tunnettua, että gonadoliberiinijoh-dannaisilla, jotka sisältävät D-aminohappoa, joissa on hydrofobinen alifaattinen tai aromaattinen sivuketju 6-asemassa olevan glysiinin sijasta on suurempi vaikutus verrattuna go-nadoliberiiniin [J. Sandow et ai.: "Control of Ovulation", Ed. Butterworth, Lontoo 1978, 49 - 70; A.v. Schally et ai.: Ann. Rev. Biochem., £7, 89 (1978)].

Edelleen on tunnettua, että gonadoliberiinin biologista aktiivisuutta voidaan parantaa suuremmalle tasolle korvaamalla 10-asemassa oleva glysiiniamidiryhmä amidiryhmillä, jotka sisältävät alifaattisen ketjun [M. Fujino et ai.: J. Med. Chem. 16, 1144 (1973)].

Tutkittaessa dekapeptidin erilaisten mahdollisten rakenteiden energiapitoisuutta F.A. Momany [J. Amer. Chem.

Soc. 9S, 2990 (1976) ja ibidem 98, 2996 (1976)] on osoittanut, että pienimmän energiapitoisuuden muodostaa spatiaalinen järjestys, jossa molekyyli on taipunut "U"-muotoon (β-muoto) 6-asemassa olevassa glysiinissä tai D-alaniinissä.

R. M. Freidinger et ai. [Science 210, 656 (1980)] ovat valmistaneet kaavan (IV)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-NH

0=c ίΗ2 (IV) \ /CH2

N

f^N-Gly-Pro-Arg-C-CH-CH

Il I

o ch2 CH / \ H3C ch3 mukaisen GnRH-johdannaisen, jossa tämä avaruusrakenne on kiinnitetty korvaamalla 6-asemassa oleva glysiini y-laktaa-milla. Tämän yhdisteen biologinen aktiivisuus on suurempi kuin luonnollisen gonadoliberiinin.

Keksinnön tehtävänä on valmistaa uusia gonadoliberiini-johdannaisia, joilla on parempi biologinen tehokkuus kuin tunnetuilla yhdisteillä ja joita voidaan käyttää muiden 4 8 5 8 66 lajien, kuten kalojen ja sammakkoeläinten lisääntymiseen nisäkkäiden lisääntymisen lisäksi.

Keksinnön tehtävänä on etenkin kehittää menetelmä, jossa 6-asemassa olevan glysiinin sijasta on liitetty uudentyyppinen aminohappo, joka sisältää aromaattisen renkaan, joka parantaa biologista aktiivisuutta parhaimman spatiaalisen järjestyksen kiinnityksen lisäksi, ja samanaikaisesti vältetään rasemisoitumisvaara.

Keksintö perustuu siihen havaintoon, että yllä mainittu tehtävä voidaan saada aikaan liittämällä kaavan (V)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-NH

/0

HnN-Gly-Pro-Arg-Leu-C

1!

O

mukainen 2-aminobentsoehapporyhmä tai kaavan (VI) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-NH

.···;· ;VI)

H2N-Gly-Pro-Arg-Leu-C

. : Il : o mukainen 3-aminobentsoehapporyhmä gonadoliberiinin 6-ase-· man glysiiniryhmän sijasta.

Edelleen keksintö perustuu siihen havaintoon, että tällaisten gonadoliberiinijohdannaisten tehokkuutta voidaan lisätä edelleen korvaamalla 10-aseman glysiiniamidiryhmä 1-4 hii-' liatomia sisältävällä alkyyliamidiryhmällä.

. Lopuksi keksintö perustuu siihen havaintoon, että korvaa- maila gonadoliberiinin 8-aseman tai 7- ja 8-aseman amino- 5 85366 hapot määrätyillä aminohapoilla, voidaan valmistaa gonado-liberiinijohdannaisia, joita voidaan käyttää muiden lajien kuin nisäkkäiden lisääntymiseen.

Näihin tosiseikkoihin perustuen saadaan aikaan menetelmä yleisen kaavan (I) mukaisten nonapeptidietyyliamidi- tai dekapeptidiamidiyhdisteiden, joissa tähteillä x^, X2, X3 ja X4 on yllä määritelty merkitys, ja niiden suolojen valmistamiseksi, jonka menetelmän mukaan a) kondensoidaan mahdollisesti suojatut aminohapot käyttämällä asteittaisen ja fragmenttikondensaation sopivia yhdistelmiä ja poistamalla suojaryhmät, tai b) kondensoidaan asteittain käyttämällä kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmää suojatut aminohapot kiinteäksi kantoaineeksi sopivassa järjestyksessä, lohkaistaan lopullinen tuote kiinteästä kantoaineesta happaman tai alkalisen lohkaisun avulla ja poistetaan suojaryhmät samanaikaisesti lohkaisun kanssa tai ennen sitä tai sen jälkeen hartsista.

Menetelmän a) mukaisten yhdistelmien erittäin edullisessa suoritusmuodossa kaavan (II)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N3 (II) mukainen pentapeptidiatsidi kondensoidaan yleisen kaavan • (HI) χ1-χ2-χ3-ρΓΟ_χ4 (HI) mukaisen tetrapeptidin tai pentapeptidin kanssa, jossa tähteillä Xj_, X2, X3 ja X4 on yllä määritelty merkitys.

Menetelmässä b) on sopivaa käyttää bentshydryyliamiini-hartsia tai kloorimetyloitua polystyreenihartsia kiinteänä kantoaineena (kiinteänä faasina)

On edullista poistaa suojaryhmiä sisältävä lopullinen tuote vetyfluoridilla suoritettavalla lohkaisulla tai käyttämällä etyyliammonolyysiä.

6 85C66 Näin saatu nona- tai dekapeptidiamidi voidaan haluttaessa muuntaa happoadditiosuolaksi saattamalla se reagoimaan farmaseuttisesti sopivan suolan kanssa tai haluttaessa vapaa emäs voidaan vapauttaa happoadditiosuolasta saattamalla se reagoimaan emäksen kanssa.

Keksinnön mukaan valmistettavia yhdisteitä voidaan terapeuttisiin ja biologisiin suvunjatkamistarkoituksiin. Niistä muodostetaan tällöin valmisteita, jotka sisältävät aktiivisena aineosana yleisen kaavan (I) mukaisia yhdisteitä tai niiden happoadditiosuoloja.

Mainitut koostumukset valmistetaan siten, että yleisen kaavan (I) mukainen yhdiste tai sen happoadditiosuola sekoitetaan tavanomaisesti käytettyjen apuaineiden ja kantoaineiden kanssa valmisteen aikaansaamiseksi terapeuttisiin ja biologisiin suvunjatkamistarkoituksiin.

Karjan kohdalla yleisen kaavan (I) mukaiset gonadoliberiini-johdannaiset tehoavat 5 - 200 yg:n annoksina intramuskulääri-sessä, subkutaanisessa tai intravenöösisessä käytössä, kun taas kalojen kohdalla ne tehoavat 0,1 - 100 yg:n annoksen injektoitaessa niitä intramuskuläärisesti tai subkutaanises-ti.

·': Uusien kaavan (I) mukaisten gonadoliberiinijohdannaisten ja keksinnön mukaisen menetelmän pääedut ovat seuraavat: a) Uudet gonadoliberiinijohdannaiset ovat tehokkaampia kuin nyt tunnetut gonadoliberiinijohdannaiset, mitä tulee karjalla ja kaloilla suoritettuihin biologisiin suvunjatkamisko-keisiin.

b) Uudet 6-asemaan liitetyt substituentit eivät sisällä mitään asymmetriakeskusta, jolloin mitään rasemisoitumista ei voi tapahtua ja lopullisen tuotteen valmistus on helpompaa ja halvempaa.

c) 2- ja 3-bentsoehapon valmistuskustannukset ovat paljon halvemmat kuin D-aminohappojen, joilla on sama merkitys tunnetuissa GnRH-johdannaisissa.

7 8 5 8 66 d) Menetelmässä a) lähtöaineena käytetyn kaavan (II) mukainen pentapeptidi on jokaisen lopullisen tuotteen yleinen väliyhdiste.

Esillä olevien yhdisteiden kanssa samankaltaisten kemiallisen rakenteen omaavia gonadoliberiinijohdannaisia tunnetaan GB-hakemusjulkaisusta 2 152 059 ja Fl-patenttijulkaisusta 71567.

Tunnetun tekniikan yhdisteet eroavat hakemuksen kohteena olevista yhdisteistä siinä, että tunnetuissa yhdisteissä Χχ on alfa-aminohappotähde, kuten glysyyliryhmä. Hakemuksen mukaisessa yhdisteessä on taas aromaattinen aminokarboksyy-lihappo. On yllättävää, että keksinnön mukaisilla yhdisteillä, joiden peptidiketjussa Χχ-tähteenä on fenyylirengas, on samankaltainen vaikutus kuin niillä tunnetun tekniikan mukaisilla yhdisteillä, joissa X^ on aminohappo, jolla ei ole aromaattista rengasta. Hakemuksen kohteena olevien yhdisteiden edullinen ja yllättävä vaikutus käy ilmi seuraavassa annettavasta taulukosta, jossa on verrattu gonadoliberiinin ja keksinnön mukaisten yhdisteiden luteinisoivaa ja follikkelia stimuloivaa hormonia vapauttavaa vaikutusta.

TAULUKKO

GnRH-analogien LH- ja FSH-vapauttava vaikutus rottien aivolisäkesoluissa

Johdannainen LH FSH

yg/ml väliainetta yg/ml väliainetta

Vertailu \ (GnRH) 1,25 0,37

Esimerkki 1 2,58 0,72

Esimerkki 2 3,46 1,02 8 85 C 66

Esimerkki 3 2,91 0,86

Esimerkki 4 3,09 0,94

Esimerkki 5 2,75 0,90

Yllä esitetyt tiedot osoittavat selvästi, että hakemuksen kohteena olevien yhdisteiden vaikutus on huomattavasti korkeampi kuin gonadoliberiinin (GnRH).

Keksintöä havainnollistetaan lähemmin seuraavien ei-ra-joittavien esimerkkien avulla, joissa ohutkerroskroma-tografian (TLC) Rf-arvot on määritetty piihappogeelile-vyillä (DC Alufolien, Merck) käyttämällä seuraavia liuo-tinjärjestelmiä, joiden numero on merkitty merkkien "Rf" yläpuolelle: 1. Etyyliasetaatti/pyridiini/etikkahappo/vesi 30:20:6:11 2. Etyyliasetaatti/pyridiini/etikkahappo/vesi 60:20:6:11 3. Etyyliasetaatti/pyridiini/etikkahappo/vesi 120:20:6:11 4. Etyyliasetaatti/pyridiini/etikkahappo/vesi 240:20:6:11 5. n-butanoli/etikkahappo/vesi/etyyliasetaatti 1:1:1:1 6. n-butanoli/etikkahappo/vesi 4:1:1 7. isopropanoli/l-molaarinen etikkahappo 2:1 8. etyyliasetaatti/pyridiini/etikkahappo/vesi 5:5:1:3 9. asetoni/tolueeni 1:1 10. kloroformi/etikkahappo 24:2 11. butanoni/pyridiini/vesi 65:15:20 12. kloroformi/metanoli/etikkahappo 85:10:5 13. n-butanoli/etikkahappo/ammoniakki (1 tilav. konsentroitua ammoniumhydroksidia + 4 tilav. vettä)/vesi 6:1:1:2 9 85,366

Esimerkki 1 [Aa6,Gin8,desGly10]-gonadoliberiinietyyliamidin valmistus vaihe a)

Boc-His(DNP)-Trp-OMe:n valmistus (molekyylipaino: 622,62) 21,12 g (50 mmoolia) Boc-His(Dnp)-OH:ta liuotetaan 100 ml:aan DMF:a ja lisätään 7,66 g (50 mmoolia) N-hydroksi-bentsotriatsolia sekoittaen. Seosta sekoitetaan 0eC:ssa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen saostunut DCU suodatetaan pois.

Liuos, jossa on 12,74 g (50 mmoolia) H-Trp-OMe*HCl:a 70 ml:ssa DMF:a, jäähdytetään 0°C:seen, lisätään 6,94 ml (50 mmoolia) TEA:a ja sekoitetaan 5 minuutin ajan, minkä jälkeen saostunut trietyyliamidihydrokloridi suodatetaan pois.

Yllä esitetyt liuokset yhdistetään ja sekoitetaan 0eC:ssa yön yli. DCU-sakka suodatetaan ja liuos haihdutetaan kuiviin. Öljyinen jäännös liuotetaan 500 ml:aan etyyliasetaattia ja uutetaan 3 kertaa 100 ml:11a jääkylmää 1 molaarista kaliumvetysulfaattiliuosta, sitten 5 kertaa 100 ml:lla kyllästettyä natriumvetykarbonaattiliuosta ja lopuksi 2 kertaa 100 mlrlla 10 %:sta natriumkloridiliuosta. Orgaaninen faasi kuivataan vedettömän magnesiumsulfaatin päällä, suodatetaan ja haihdutetaan kuiviin. Öljyinen jäännös trituroidaan perusteellisesti petrolieetterillä ja saatu jauhe suodatetaan ja kuivataan. Näin saatu kiteinen tuote kiteytetään uudelleen etyyliasetaatista, jolloin saadaan aiottu tuote, saanto 27,70 g (89 %), sp. 119 - 122°C.

[Q]d22 = + 14,1°.(C = 1, DMF)

Rf4 = 0,62, Rf5 = 0,41.

Vaihe b) H-His-(DNP)-Trp-OMe*HC1:n valmistus [molekyylipaino: 522,49 (vapaa emäs), 595,41 (dihydrokloridi) ] .

100 ml 4N metanolista vetykloridiliuosta lisätään liuokseen, jossa on 24,9 g (40 mmoolia) Boc-His(DNP)-Trp-OMe-dipeptidiä 10 85866 100 ml:ssa metanolia. Seos laitetaan sivuun 30 minuutin ajaksi huoneenlämpötilassa samalla, kun dipeptidiesterihydro-kloridi kiteytyy. Sakka suodatetaan, pestään eetterillä ja kuivataan, jolloin saadaan 21,91 g (92 %) aiottua yhdistettä, sp. 198 - 202°C.

[a]D22 = 0,49e.(c * 1, DMF)

Rf3 = 0,46, Rf4 = 0,18.

Vaihe c)

Glp-His-(DNP)-Trp-OMe:n valmistus (molekyylipaino: 633,60)

Seosta, jossa on 4,85 g (36,8 mmoolia) L-pyroglutamiini-happoa, 7,58 g DCC:tä ja 5,63 g N-hydroksibentsotriatsolia 100 ml:ssa DMF:a, sekoitetaan 5 - 10eC:ssa 10 minuutin ajan, sitten DCU-sakka suodatetaan.

9,72 ml (70 mmoolia) TEA:a lisätään liuokseen, jossa on 20,84 g (35 mmoolia) H-His(DNP)-Trp-OMe.2HCl:a 100 ml:ssa DMF:a. Sekoitetaan 5 minuutin ajan, minkä jälkeen saostunut trietyyliaminihydrokloridi suodatetaan pois. Molemmat liuokset yhdistetään ja sekoitetaan huoneenlämpötilassa yön yli. Seuraavana päivänä lisätään 90 ml asetonia ja liukenematon sakka suodatetaan. Haihduttamisen jälkeen saatu öljyinen jäännös trituroidaan perusteellisesti etyyliasetaatilla, suodatetaan ja kuivataan. Kuiva kiteinen tuote pestään 3 kertaa 25 ml:11a vettä ja kuivataan jälleen. Näin saatu tuote kiteytetään uudelleen kuumasta etyyliasetaatista, jolloin saadaan aiottu yhdiste, saanto 18,42 g (83,1 %), sp. 148 -151eC.

[a]D23 = +5,2°.(C = 1, DMF)

Rf3 = 0,53, Rf7 = 0,38.

Vaihe d)

Glp-His-Trp-OMe:n valmistus (molekyylipaino: 466,50)

Liuokseen, joka sisältää 15,84 g (25 mmoolia) suojattua Glp-His(DNP)-Trp-OMe-tripeptidiä 100 ml:ssa DMF:a ja 40 ml:ssa vettä, lisätään 4 ml merkaptoetanolia, sitten liuoksen pH säädetään arvoon 8 lisäämällä TEA:ta. Liuoksen anne- li 85G66 taan seistä huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan, sitten se haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa. Öljyinen jäännös trituroidaan perusteellisesti eetterin kanssa, suodatetaan ja kuivataan. Näin saatu tuote liuotetaan pieneen määrään metanolia ja kiteytetään lisäämällä eetteriä. Kiteet suodatetaan ja kuivataan, jolloin saadaan 10,92 g (93,6 %) aiottua yhdistettä, sp. 228 - 232°C.

[a]D22 = +4,04°.(c = 0,42, DMF)

Rf2 = 0,30.

vaihe e)

Glp-His-Trp-N2H3:n valmistus (molekyylipaino: 466,51) 20 ml 98 %:sta hydratsiinihydraattia lisätään liuokseen, joka sisältää 9,33 g (20 mmoolia) Glp-His-Trp-OMe-tri-peptidiä 250 ml:ssa metanolia. Seosta sekoitetaan 40eC:ssa 3 tunnin ajan ja sitten huoneenlämpötilassa yön yli. Seuraa-vana päivänä sakka suodatetaan, pestään kylmällä metanolilla ja kuivataan, jolloin saadaan 7,58 g (81,2 %:n saanto) aiottua yhdistettä, sp. 166 - 169eC.

[a]D22 = -22,3*.(C, 0,5, DMF)

Rf1 = 0,50, Rf2 = 0,14.

Vaihe f)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe:n valmistus (molekyylipaino: 716,8) . Liuos, jossa on 7,0 g (15 mmoolia) Glp-His-Trp-N2H3:a (valmistettu edellisessä vaiheessa e) esitetyllä tavalla) 60 ml:ssa DMF:a, jäähdytetään 0*C:seen ja siihen lisätään 7,5 ml (45 mmoolia) 6N kloorivetyhappoliuosta sekoittaen. Sitten seokseen lisätään tipoittain hitaasti konsentroitu vesipitoinen liuos, jossa on 1,035 g (15 mmoolia) natrium-nitriittiä ja seosta sekoitetaan 0*C:ssa vielä 15 minuutin ajan. Lisätään liuos, jossa on 4,78 g (15 mmoolia) H-Ser-Tyr-OMe*HCl:a 15 ml:ssa DMF:a, minkä jälkeen seoksen pH säädetään neutraaliksi lisäämällä 6,25 ml (45 mmoolia) TEA:a. Seosta sekoitetaan yön yli 0 - 4*C:ssa, sitten se haihdutetaan kuiviin alennetussa paineessa. Öljyinen jäännös tritu- 12 ε 5 G 66 roidaan perusteellisesti eetterin kanssa ja kuivataan, jolloin saadaan jauhe 12,1 g:n (100%) saantona, jossa esiintyy kaksi epäpuhdasta täplää TLC:ssä, mutta se voidaan muuntaa puhdistamatta hydratsidiksi, joka voidaan kiteyttää hyvin. Näytteen uudelleenkiteyttämisen jälkeen metanolista aiottu yhdiste sulaa 188 - 190eC:ssa.

[a]D22 = -3,48°.(c = l, DMF)

Rf1 = 0,58, Rf2 = 0,26.

Vaihe g)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3:n valmistus (molekyylipaino: 716,8)

Lisätään 10 ml 98%:sta hydratsiinihydraattia liuokseen, joka sisältää 12 g raakaa, jauhettua Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe-pen-tapeptidiesteriä 200 ml:ssa metanolia, minkä jälkeen seosta sekoitetaan 40°C:ssa 3 tunnin ajan. Tämän jälkeen seosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa yön yli, sitten kiteinen sakka suodatetaan ja kuivataan eksikkaattorissa konsentroidun rikkihapon päällä. Kuivatut kiteet liuotetaan 250 ml:aan 0,5 N kloorivetyhappoliuosta, neutraloidaan pH-arvoon 8 lisäämällä kyllästettyä natriumkarbonaattiliuosta ja annetaan seistä 0°C:ssa 2 tunnin ajan. Kiteinen sakka suodatetaan, pestään jääkylmällä vedellä ja kuivataan, jolloin saadaan 6,12 g (56,9 %:n saanto laskettuna kahdelle vaiheelle yhteisesti) aiottua yhdistettä, sp. 205 - 206eC.

[a]D22 = 21,51*.(c = 1,

Rf1 = 0,39, Rf2 = 0,14.

Hydratsiinitypen analyysi tuotti 3,79 % ja 3,76 % (laskettu arvo on 3,91 %).

Vaihe h) H-Gln-Pro-NHEt*TFA:n valmistus [molekyylipaino: 367,3 (Boc: 370,49)] 10 g (70 mmoolia) proliinietyyliamidia (saatu hydraamalla 72 mmoolia Z-Pro-NHEt:a) liuotetaan 100 ml:aan DMF:a ja liuoksen pH saatetaan arvoon 8 lisäämällä TEA:a. Lisätään sekoittaen liuos, joka sisältää 32 g (87 mmoolia) Boc-Gln-ONP:tä 100 ml:ssa DMF:a.

i3 85266 Öljyinen jäännös liuotetaan seokseen, jossa on 50 ml 30 %:sta TFA:a dikloorimetaanissa, ja annetaan seistä huoneenlämpötilassa 20 minuutin ajan. Tämän jälkeen liuos haihdutetaan alennetussa paineessa ja öljyinen jäännös trituroidaan perusteellisesti eetterin kanssa. Näin saatu kiinteä tuote pestään eetterillä ja kuivataan alennetussa paineessa, jolloin saadaan 15,9 g (62 %:n saanto) aiottua tuotetta, jonka sulamispistettä ei voida mitata, koska se on erittäin hygroskooppinen.

[a]o20 = -44,4*.(c = 1, metanoli)

Rf1 = 0,32, Rf7 = 0,37, Rf13 = 0,21.

Vaihe i) Z-Leu-Gln-Pro-NHEt:n valmistus (molekyylipaino: 518,57) 7 g (26 mmoolia) H-Gln-Pro-NHEt*TFA:ta liuotetaan 50 ml:aan DMF:a, jäähdytetään 0“C:seen, sitten liuoksen pH säädetään arvoon 8 lisäämällä TEA:ta. Lisätään liuos, joka sisältää 14 g (27,3 mmoolia) Z-Leu-pentakloorifenyyliesteriä 40 ml:ssa DMF:a, ja sekoitetaan 4eC:ssa yön yli. Seuraavana päivänä seos haihdutetaan alennetussa paineessa ja jäännös liuotetaan 70 ml:aan etyyliasetaattia. Orgaaninen liuos uu-·; tetaan 3 kertaa 15 ml:11a kylmää 0,01N natriumhydroksidi- liuosta, sitten 3 kertaa 15 ml:11a vettä. Natriumhydroksidi ja vesipitoinen uute yhdistetään ja pestään kaksi kertaa 10 ml:lla etyyliasetaattia. Etyyliasetaattiliuoksen yhdistämisen jälkeen se kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä ja haihdutetaan alennetussa paineessa. Jäännös trituroidaan perusteellisesti eetterin kanssa, näin saatu kiinteä jäännös suodatetaan, pestään eetterillä ja kuivataan alennetussa paineessa, jolloin saadaan 10,4 g (77 %:n saanto) aiottua tuotetta, sp. 84 - 88°C.

[alD20 = -32,8°.(c = 1, metanoli)

Rf2 = 0,90.

14 8 5 ό ό 6

Vaihe j) H-Leu-Gln-Pro-NHEt·HBr:n valmistus (molekyylipaino: 465,5) 70 ml 4N vetybromidin jääetikassa olevaa liuosta lisätään liuokseen, jossa on 7,6 g (14,6 mmoolia) Z-Leu-Gln-Pro-NHEt:tä 50 ml:ssa jääetikkaa, sitten seoksen annetaan seistä huoneenlämpötilassa 90 minuutin ajan. Seos kaadetaan hitaasti 800 ml:aan jääkylmää eetteriä sekoittaen. 30 minuutin kuluttua sekoittaminen lopetetaan ja saostunut sakka suodatetaan ja kuivataan eksikkaattorissa fosforipentoksidin päällä, jolloin saadaan 7,9 g aiottua tuotetta, sp. 147°C.

[ci]d20 = -72,8°. (c = 1, 2N etikkahappo)

Rf2 = 0,30, Rf11 = 0,82.

Vaihe k)

Boc-antraniilihapon valmistus (molekyylipaino: 237,27)

Liuoksen, joka sisältää 4 g (30 mmoolia) antraniilihappoa 20 ml:ssa DMF:a, pH säädetään arvoon 8 lisäämällä TEA:ta. Lisätään 9 g tert-butyylioksikarbonaattia, minkä jälkeen reak-tioseosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa yön yli. Liuotin haihdutetaan ja paksu öljyinen jäännös liuotetaan 50 ml:aan etyyliasetaattia. Orgaaninen faasi pestään 3 kertaa 20 ml:11a jääkylmää 0,01N rikkihappoa, sitten 3 kertaa 20 ml:11a vettä. Etyyliasetaattiliuos kuivatetaan vedettömän natriumsulfaatin päällä ja haihdutetaan alennetussa paineessa. Paksusta öljyisestä jäännöksestä tulee kiteinen jääkaapissa. Saadaan aiottu tuote 5,7 g:n (80 %) saantona, sp. 91 - 93eC.

Rf9 = 0,87, Rf10 = 0,79.

Vaihe 1)

Boc-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt:n valmistus (molekyylipaino: 603,85)

Liuos, joka sisältää 2,3 g (5 mmoolia) H-Leu-Gln-Pro-NHEt-hydrobromidia 10 ml:ssa DMF:a, jäähdytetään 0°C:seen, sitten liuoksen pH säädetään arvoon 8 lisäämällä TEA:ta. Lisätään 750 mg (5,5 mmoolia) N-hydroksibentsotriatsolia ja 1,1 g (5,5 mmoolia) DCC:a, minkä jälkeen lisätään tipoittain hi- 15 85 866 taasti liuos, jossa on 1,3 g (5,5 mmoolia) Boc-antranii-lihappoa 5 ml:ssa DMF:a, sitten reaktioseosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa 48 tunnin ajan. Saostunut DCU suodatetaan, sitten liuos haihdutetaan alennetussa paineessa.

Jäännös liuotetaan 50 ml:aan etyyliasetaattia ja pestään 3 kertaa 20 ml:11a 10 %:sta sitruunahappoa, sitten 3 kertaa 20 ml:11a vettä, 3 kertaa 20 ml:11a kyllästettyä natriumvety-karbonaattiliuosta ja lopuksi 20 ml:11a kyllästettyä natrium-kloridiliuosta. Etyyliasetaattikerros kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä ja haihdutetaan alennetussa paineessa. Öljyinen jäännös trituroidaan perusteellisesti eetterin kanssa ja pestään eetterillä, jolloin saadaan 2,4 g (80 %:n saanto) aiottua tuotetta, sp. 119 - 121°C.

Rf9 =* 0,91.

Aminohappoanalyysi tuotti seuraavat arvot:

Gin 0,97, Pro 1,03, Leu 1,00, Aa 0,92.

Vaihe m) H-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt * TFA:n valmistus (molekyylipaino: 599,63) 603 mg (1 mmoolia) Boc-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt:tä liuotetaan 10 mitään 30 %:sen trifluorietikkahapon (TFA) dikloorimetaanis-sa olevaa liuosta ja liuosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa 20 minuutin ajan. Sitten TFA poistetaan nopeasti alennetussa paineessa, jäännös jauhetaan lisäämällä eetteriä ja kuivataan, jolloin saadaan aiottu tuote 5,15 mg:n (86 %) saantona. Rf5 = 0,52.

Vaihe n)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEttn valmistus (mole-kyylipaino: 1188,48) *" Liuos, jossa on 358 mg (0,5 mmoolia) Glp-His-Trp-Ser-Tyr- N2H3~pentapeptidiä (valmistettu tämän esimerkin vaiheessa g) esitetyllä tavalla) 10 mltssa DMFta, jäähdytetään 0eCtseen ja tähän liuokseen lisätään sekoittaen tipoittain 0,34 ml 6N kloorivetyhappoa ja sitten konsentroitua vesipitoista liuos- 16 8 5 G 6 6 ta, jossa on 37,7 mg natriumnitriittiä. 5 minuutin kuluttua lisätään OeC:ssa 230 mg (0,5 mmoolia) H-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt.TFA-tetrapeptidiä, joka on liuotettu seokseen, jossa 1 ml DMF:a ja 0,34 ml TEA:ta. Tarvittaessa reaktioseos neutraloidaan lisäämällä TEA:ta ja sekoitetaan 0eC:ssa 2 tunnin ajan, sitten sen annetaan lämmetä huoneenlämpötilaan. DMF poistetaan alennetussa paineessa ja jäännös erotetaan kroma-tografoimalla Sephadex G-25-pylväällä (9 x 95 cm) liuotettuna 0,2N etikkahappolluokseen. Erotuksen jälkeen suoritetaan UV-absorptio (mitattuna 280 nmrssä) ja TLC. Sopivat fraktiot kerätään ja lyofilisoidaan, jolloin saadaan aiottu tuote 315 mg:n (52 %) saantona.

Rf5 = 0,58, Rf7 = 0,83, Rf8 = 0,72.

Aminohappoanalyysi tuotti seuraavat arvot:

Ser 0,91, Gin 2,03, Pro 0,95, Leu 1,00, Tyr 1,10, His 1,02, Trp 0,81, Aa 0,95.

Esimerkki 2 [Aa6,desGly10]-gonadoliberiinietyyliamidin valmistus Vaihe a) Z-Arg(NC>2)-Pro-NHEt:n valmistus (molekyylipaino: 465,47) 7,33 g (29,7 mmoolia) Z-Arg(NC>2)-OH:ta ja 1,034 g N-hyd-roksi-bentsotriatsolia lisätään liuokseen, jossa on 3,24 g (22,8 mmoolia) proliinietyyliamidia 70 ml:ssa THF:a. Reaktioseos jäähdytetään jäädytetyssä vesikylvyssä ja siihen lisätään annoksittain sekoittaen 5,34 g (25,8 mmoolia) DCC:tä, joka on liuotettu 50 ml:aan THF:a. Seosta sekoitetaan jäähdyttäen jäällä 5 tunnin ajan, sitten huoneenlämpötilassa 20 tunnin ajan, sitten se suodatetaan ja pestään THF:llä. Suo-dos haihdutetaan alennetussa paineessa, jäännös liuotetaan kloroformiin ja pestään peräkkäin 3 kertaa 35 ml:11a ammo-niumhydroksidin ja veden l:5-seosta, 2 kertaa 20 ml:11a vettä, 3 kertaa 35 ml:11a IN kloorivetyhappoa ja lopuksi 2 kertaa 20 ml:11a vettä. Kloroforminen liuos kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä, suodatetaan, pestään klorofor- i.

i7 85 D66 mila, sitten suodos haihdutetaan. Jäännös liuotetaan seokseen, jossa on 35 ml THF:a ja 50 ml etyyliasetaattia, suodatetaan ja pestään 30 ml:11a THF:n ja etyyliasetaatin lyseosta. Liuos haihdutetaan, minkä jälkeen kiinteään vaahto-maiseen jäännökseen lisätään 100 ml etyylieetteriä. Näin saatu tuote suodatetaan, pestään eetterillä ja kuivataan alennetussa paineessa, jolloin saadaan 9,69 g (98 %:n saanto) aiottua tuotetta, sp. 125°C.

[a]D20 = -42,5°.(c = 1, metanoli)

Rf3 = 0,5, Rf12 = 0,72.

Vaihe b) Z-Leu-Arg(NC>2)-Pro-NHEt:n valmistus (molekyylipaino: 578,65)

Liuokseen, joka sisältää 5,6 g (11,73 mmoolia) suojattua Z-Arg(NC>2)Pro-NHEt-dipeptidietyyliamidia 30 ml:ssa jääetikkaa, lisätään 55 ml 4N vetybromidin jääetikassa olevaa liuosta. Reaktioseoksen annetaan seistä huoneenlämpötilassa 90 minuutin ajan, sitten lisätään 250 ml abs. eetteriä ja seos laitetaan sivuun tunniksi. Emäliuos dekantoidaan sakasta ja jäännökseen lisätään 100 ml eetteriä. Annetaan seistä 15 minuutin ajan, minkä jälkeen seos suodatetaan ja pestään perusteellisesti vedellä. Kiinteä hygroskooppinen aine kuivataan fosforipentoksidin ja natriumhydroksidin päällä alennetussa paineessa. Näin saadaan hieman hygroskooppinen tuote 6,44 g:n saantona.

6,04 g (11,0 mmoolia) yllä mainittua dipeptidietyyliamidi-hydrobromidia suspendoidaan 150 ml:aan kloroformia ja lisätään 5,5 ml TEA:ta. Suspensio liukenee nopeasti; lisätään vielä 2,5 ml TEA:ta täydellisen liukenemisen aikaansaamiseksi. Sitten reaktioseokseen lisätään tipoittain liuos, joka sisältää 6,4 g Z-Leu-OPCP:tä 65 ml:ssa kloroformia, ja se-... koitetaan yön yli. Seuraavana päivänä seos uutetaan peräk- • käin IN kloorivetyhapolla, sitten kyllästetyllä natriumklo- ridiliuoksella ja 2N ammoniumhydroksidiliuoksella ja lopuksi jälleen natriumkloridiliuoksella. Orgaaninen faasi kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä ja haihdutetaan alenne- 18 8 5 G 6 6 tussa paineessa. Jäännös trituroidaan perusteellisesti eetterin kanssa. Näin saatu kiinteä tuote suodatetaan, pestään eetterillä ja kuivataan alennetussa paineessa, jolloin saadaan 5,5 g (84,6 %) raakaa tuotetta.

Yllä mainittu suojattu tripeptidietyyliamidi liuotetaan 30 ml:aan etyyliasetaattia lämmittäen hieman, selkeytetään käyttämällä aktivoitua hiiltä ja pestään kahdesti 10 ml:11a etyyliasetaattia. Suodokseen lisätään 75 ml etyylieetteriä annoksittain. Öljyinen sakka kiinteytyy nopeasti. Annetaan seistä 2 tunnin ajan, minkä jälkeen seos suodatetaan, pestään etyyliasetaatin ja eetterin 2:3-seoksella, sitten eetterillä ja kuivataan alennetussa paineessa, jolloin saadaan 4,7 g (74,3 %:n saanto) aiottua yhdistettä, sp. 116 -118 eC.

[α]ο20 = 57,0°.(c = 1, metanoli)

Rf3 = 0,74, Rf4 = 0,49.

Vaihe c) H-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt·HBr:n valmistus (molekyylipaino: 537,4)

Liuosta, jossa on 1,18 g (2 mmoolia) Z-Leu-Arg(NC>2)-Pro-NHEt-tripeptidiä 10 ml:ssa vetybromidin jääetikassa olevaa liuosta, sekoitetaan huoneenlämpötilassa tunnin ajan. Lisätään 100 ml vedetöntä eetteriä, minkä jälkeen jauhemainen sakka suodatetaan ja näin saatu vaaleankeltainen jauhe kuivataan eksikkaattorissa. Näin saadaan aiottu yhdiste vaaleankeltaisena hygroskooppisina tuotteena 1,30 g:n saantona. Rf2 = 0,14.

Vaihe d)

Boc-Aa-OPFP:n valmistus (molekyylipaino: 403,32)

Liuos, jossa on 2,4 g (10 mmoolia) Boc-antraniilihappoa 20 ml:ssa THF:a, jäähdytetään 0°C:seen, sitten lisätään 2,2 g (11 mmoolia) DCC:tä ja 2,0 g pentafluorifenolia liuotettuna 10 ml:aan THF:a sekoittaen. Seosta sekoitetaan 0°C:ssa 3 tunnin ajan, sitten huoneenlämpötilassa yön yli. Liuos suo- il i9 8 b o 6 6 datetaan, sakka liuotetaan 30 ml:aan etyyliasetaattia ja pestään peräkkäin 3 kertaa 10 ml:11a jääkylmää 10 %:sta sitruunahappoa, 3 kertaa 10 ml:11a kylmää vettä, 3 kertaa 10 ml:11a kyllästettyä natriumvetykarbonaattiliuosta ja lopuksi 3 kertaa 10 ml:11a vettä. Etyyliasetaattifaasi kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä, suodatetaan ja haihdutetaan alennetussa paineessa. Pidettäessä +4eC:ssa öljyinen jäännös kiteytyy. Näin saadaan aiottu yhdiste 3,06 g:n (76 %) saantona.

Rf9 = 0,90, Rf10 = 0,85.

Vaihe e)

Boc-Aa-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt:n valmistus (molekyylipaino: 675,75)

Liuos, jossa on 1,07 g (2 mmoolia) H-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt *HBr-tripeptidisuolaa 5 ml:ssa DMF:a, jäähdytetään 0eC:seen lisätään 0,28 ml (2 mmoolia) TEA:a ja 806 mg (2 mmoolia) Boc-Aa-OPFP:a liuotettuna 5 ml:aan DMF:a. Liuoksen pH säädetään arvoon 8 lisäämällä TEA:a, liuoksen annetaan lämmetä ja sitten sitä sekoitetaan 20°C:ssa 48 tunnin ajan pitämällä pH suunnilleen arvossa 8 lisäämällä TEA:a. DMF poistetaan alennetussa paineessa, jäännös liuotetaan 50 ml:aan etyyliasetaattia ja pestään peräkkäin 3 kertaa 20 ml:lla 10 %:sta sitruunahappoa, 3 kertaa 20 ml:lla vettä, 3 kertaa 20 ml:11a kyllästettyä natriumvetykarbonaattiliuosta ja lopuksi 20 ml:11a kyllästettyä natriumkloridiliuosta. Etyyliasetaattiliuos kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä, suodatetaan ja haihdutetaan alennetussa paineessa. Öljyinen jäännös trituroidaan perusteellisesti eetterin kanssa ja näin saatu kiinteä tuote suodatetaan, jolloin saadaan 1,05 g (77,8 %:n saanto) aiottua yhdistettä.

Rf3 = 0,30, Rf9 = 0,91, Rf10 = 0,96.

Vaihe f)

Boc-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt:n valmistus (molekyylipaino: 630,74)

Liuos, joka sisältää 1,0 g (1,5 mmoolia) Boc-Aa-Leu-

Arg (N02)-Pro-NHEt-tetrapeptidiä 50 ml:ssa 50%:sta etikkahap- 20 8 5 c; 66 poa, hydrataan 10%:sen palladiumhiilikatalysaattorin (400 mg) läsnäollessa 4 tunnin ajan. Sitten katalysaattori suodatetaan pois, liuos haihdutetaan ja jäännös trituroidaan eetterin kanssa, jolloin saadaan 779 mg (82,5 %:n saanto) aiottua yhdistettä.

Rf2 = 0,45.

Vaihe g) H-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt·(TFA)2valmistus (molekyylipaino: 724,67) 630 mg (1 mmoolia) Boc-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt-tetrapeptidiä liuotetaan 5 ml:aan TFA:a ja sekoitetaan huoneenlämpötilassa 20 minuutin ajan. TFA poistetaan nopeasti alennetussa paineessa ja jäännös jauhetaan eetterin kanssa, sitten se suodatetaan ja kuivataan, jolloin saadaan 648,5 mg (89,5 %:n saanto) aiottua yhdistettä.

Rf2 = 0,34, Rf8 = 0,76.

Vaihe h)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt’CI^CC^Hrn valmistus (molekyylipaino: 1276,54)

Liuos, jossa on 358 mg (0,5 mmoolia) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3~pentapeptidin (valmistettu esimerkin 1 vaiheessa g) esitetyn menetelmän mukaisesti) 10 ml:ssa DMF:a, jäähdytetään -10eC:seen ja ensin lisätään tipoittain sekoittaen 0,34 ml 6N kloorivetyhappoa ja sitten konsentroitua vesiliuosta, jossa on 37,7 mg natriumnitriittiä. 5 minuutin kuluttua lisätään liuos, joka sisältää 362,3 mg (0,5 mmoolia) H-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt.(TFA)2-tetrapeptidiä 1 ml:ssa DMF:a ja 0,34 ml:ssa TEA:a ja joka on valmistettu -10°C:ssa. Seosta sekoitetaan -5eC:ssa tunnin ajan, 0eC:ssa vielä tunnin ajan ja sitten sen annetaan lämmetä huoneenlämpötilaan. DMF poistetaan alennetussa paineessa ja jäännös, joka on liuotettu 0,2N etikkahappoon, puhdistetaan kromatografoimalla Sephadex G-25-pylväällä (2 x 95 cm). Sopivat fraktiot kerätään ja lyofilisoidaan, jolloin saadaan 365,7 mg (57,3 %:n saanto) i: 2i 8 5 £ 66 aiottua yhdistettä.

Rf5 = 0,65, Rf6 = 0,49, Rf8 = 0,69.

Aminohappoanalyysi tuotti seuraavat arvot:

Ser 0,87, Glu 0,99, Pro 1,02, Leu 1,00, Tyr 0,97, His 1,03, Trp 0,82, Aa 0,91, Arg 1,01.

Esimerkki 3 [Mab6]-gonadoliberiinin valmistus Vaihe a)

Boc-3-amino-bentsoehapon (Boc-Mab) valmistus (molekyylipai-no: 237,25) 1,0 g (7,5 mmoolia) 3-amino-bentsoehappoa liuotetaan 10 ml:aan DMF:a ja liuoksen pH säädetään arvoon 8 lisäämällä TEA:ta. Sitten lisätään 2,5 g tert-butyylioksikarbonaattia ja seosta sekoitetaan päivän ajan. Reaktioseos viimeistellään samalla tavalla kuin esimerkin 1 vaiheessa k), jolloin saadaan 1,4 g (80,9 %:n saanto aiottua yhdistettä, sp. 92eC. Rf10 = 0,88, Rf10 = 0,84.

Vaihe b)

Boc-Mab-Leu-Arg(N02)“Pro-Gly-NH2:n valmistus (molekyylipai-no: 704,78)

Liuos, joka sisältää 1,5 g (2,5 mmoolia) H-Leu-Arg(NC>2)-Pro-Gly—NH2.TFA-suolaa [M. Yanaihara et ai.: J. Med. Chem. 16, 373 (1973)] 10 ml:ssa DMF:a, jäähdytetään 0eC:seen ja liuoksen pH säädetään arvoon 8 lisäämällä TEA:ta. Sitten liuokseen lisätään 383 mg (2,5 mmoolia) N-hydroksi-bentsotriatso-lia ja 515 mg (2,5 mmoolia) DCC:tä, minkä jälkeen lisätään . tipoittain ja hitaasti 593 mg (2,5 mmoolia) Boc-Mab:tä liuo tettuna 3 ml:aan DMF:a. Reaktioseosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa 48 tunnin ajan, sitten saostunut DCU suodatetaan ja liuos haihdutetaan alennetussa paineessa. Öljyinen jäännös liuotetaan 30 ml:aan etyyliasetaattia ja pestään peräkkäin 3 kertaa 10 ml:11a 10 %:sta sitruunahappoa, 3 kertaa 10 ml:11a vettä, 3 kertaa 10 ml:11a kyllästettyä natriumvety- 22 8 5 c 66 karbonaattiliuosta ja lopuksi 10 ml:11a kyllästettyä nat-riumkloridiliuosta. Etyyliasetaattifaasi kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä ja haihdutetaan alennetussa paineessa. Öljyinen jäännös trituroidaan perusteellisesti eetterin kanssa, minkä jälkeen valkoinen kiteinen sakka suodatetaan ja pestään eetterillä, jolloin saadaan 1,2 g (68 %:n saanto) aiottua yhdistettä, sp. 132 - 133eC.

Rf6 = 0,43.

Vaihe c)

Boc-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2:n valmistus (molekyylipaino: 659,78)

Suojaryhmä poistetaan 1,0 g:sta (1,5 mmoolia) Boc-Mab-Leu-Arg(NC>2)-Pro-Gly-NH2~pentapeptidistä esimerkin 2 vaiheen f) mukaisesti, jolloin saadaan 775 mg (78,3 %) aiottua yhdistettä.

Rf2 = 0,52.

Vaihe d) H-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2·(TFA)2valmistus (molekyylipaino: 753,72)

Liuosta, joka sisältää 670 mg (1 mmoolia) Boc-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2-pentapeptidiamidia 5 ml:ssa TFA:ta, sekoitetaan huoneenlämpötilassa 20 minuutin ajan, sitten TFA poistetaan alennetussa paineessa. Öljyinen jäännös trituroidaan eetterin kanssa, jolloin saadaan jauhemainen tuote, joka suodatetaan ja kuivataan, jolloin saadaan 689 mg (91,5 %:n saanto) aiottua yhdistettä.

Rf1 = 0,50, Rf5 = 0,53, Rf7 = 0,42.

Vaihe e)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2:n valmistus (molekyylipaino: 1244,39)

Liuos, joka sisältää 358 mg (0,5 mmoolia) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3~pentapeptidiä (valmistettu esimerkin 1 vaiheessa g) esitetyllä tavalla) 10 ml:ssa DMF:a, jäähdytetään -10°C:seen 23 8 b ο β 6 ja sitten lisätään tipoittain 0,34 ml 6N kloorivetyhappoa ja tämän jälkeen konsentroitua vesipitoista liuosta, jossa on 37,7 mg natriumnitriittiä. 5 minuutin kuluttua lisätään 377 mg (0,5 mmoolia) H-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(TFA)2~pentapepti-diä, joka on liuotettu 1 ml:aan DMF:a ja jäähdytetty -10eC:seen. Reaktioseosta sekoitetaan 0eC:ssa 2 tunnin ajan, sitten sen annetaan lämmetä huoneenlämpötilaan. Seuraavana päivänä seos haihdutetaan alennetussa paineessa. Raaka deka-peptidijäännös puhdistetaan kromatografoimalla Sephadex G-25-pylväällä (2 x 95 cm) käyttämällä butanolin, propanolin, etikkahapon ja veden 15:l:4:20-seosta. Fraktioiden aineosa-pitoisuus määritetään käyttämällä TLC:tä ja UV-absorptiota. Dekapeptidin sisältävä fraktio lyofilisoidaan, sitten tämä toimenpide toistetaan käyttämällä etikkahappoa. Aiottu tuote saadaan 323 mg:n saantona (52 %).

Rf2 = 0,31, Rf7 = 0,49, Rf8 = 0,62.

Aminohappoanalyysi tuotti seuraavat arvot:

Ser 0,91, Glu 1,03, Pro 0,97, Gly 1,10, Leu 1,00, Tyr 0,97, His 1,05, Trp 0,87, Mab 0,90, Arg 1,11.

Esimerkki 4 [Aa8]-gonadoliberiinin valmistus (molekyylipaino: 1244,39) a) Synteesi Tämä yhdiste valmistetaan yleisesti kiinteän faasin peptidi-synteesimenetelmän mukaisesti [Merrifield, R.B.: J. Am.

Chem. Soc. 85, 2149 (1963)].

0,75 g (0,3 mmoolia) bentsyyliamiini’HCl-hartsia (0,4 mmoo-lia/g, Pierce) annetaan turvota dikloorimetaanissa 2 tunnin ajan. Sitten aminohappojen kanssa tapahtuvassa asyloinnissa toistetaan seuraava jakso: 24 85266

Vaihe Reagenssi ja toimenpide Sek.aika _(min.) 1 CH2CI2, 3 pesua 1 2 Seos, joka sisältää 33% TFA:ta ja 67 % CH2Cl2:ta 1 3 Seos, joka sisältää 33% TFA:ta ja 67 % CH2C12 25 4 CH2CI2, 3 pesua 1 5 CHCI3, 3 pesua 1 6 Seos, joka sisältää 10 % TEA:ta ja 90 % CHCl3:a, 2 pesua 2 7 CHCI3, 2 pesua 1 8 Etanoli, 2 pesua 1 9 CH2CI2, 2 pesua 1 10 3 ekvivalenttia Boc-aminohappoa, joka on liuotettu CH2Cl2-DMF-seokseen, 3 ekvivalenttia DCC:tä tai DIC:tä, joka on liuotettu CH2Cl2:een 60 vaihteleva 11 CH2cl2' 2 pesua 1 12 Etanoli, 2 pesua 1

Jokaisen vaiheen jälkeen suoritetaan ninhydriinitesti [E. Kaiser et ai.: Anal. Biochem. 3jl, 595 (1970)], yllä oleva jakso toistetaan vaiheesta 5 alkaen, kun havaitaan vapaa aminoryhmä. Viimeisen vaiheen jälkeen Glp-His(Tos)-Trp-Ser-(oBzl)-Tyr(oBzl)-Aa-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-peptidihartsin paino osoittaa, että aiottua tuotetta on 344 mg (65 % W:nä). (Suojatun peptidin molekyylipaino on 1764,92).

Vaihe b)

Lohkaisu käyttämällä vetyfluoridia

Suojaryhmät poistetaan ja samanaikaisesti peptidi lohkaistaan hartsista yhdessä ainoassa vaiheessa käyttämällä nestemäistä vesipitoista vetyfluoridia [S. Sakakibara et ai.: Bull. Soc. Japan £0, 2164 (1967)]. Edellisessä vaiheessa a) valmistettuun peptidihartsiin lisätään 5 ml anisolia ja 100 mg ditiotreitolia. Sitten 20 ml vetyfluoridia kondensoidaan 25 8 5 o 66 tähän seokseen ja sekoittamista jatketaan tunnin ajan. Tämän jakson jälkeen vetyfluoridi poistetaan typpivirran avulla, jäännös suspendoidaan abs. eetteriin ja suodatetaan. Kiinteä jäännös pestään 50 %:sella etikkahapolla ja suodos haihdutetaan 37°C:n lämpötilassa. Näin saatu dekapeptidi’HF-suola (371 mg) alistetaan suoraan geelikromatografiaan.

Vaihe c)

Geelikromatografia

Edellisessä vaiheessa b) valmistettu tuote puhdistetaan Se-phadex G-25-pylväällä (2,5 x 100 cm) käyttämällä eluenttina 20 %:sta etikkahappoa. Erotuksen jälkeen suoritetaan uv-ab-sorptio (mitattuna 280 nm:ssä) ja TLC. Dekapeptidin sisältävät fraktiot kerätään ja lyofilisoidaan, jolloin saadaan puhdistettu tuote 202 mg:n (54%) saantona.

Vaihe d)

Preparatiivinen HPLC

Tähän tarkoitukseen käytetään Cie-piihappogeeli-LRP-l (13 -24 m, Whatman) tyyppistä preparatiivista HPLC-pylvästä (2,5 x 45 cm). Tasapaino saadaan aikaan käyttämällä seosta, joka ; sisältää 15 % metanolia ja 85 % 20 %:sta etikkahappoliuosta.

Tasapainon saavuttamisen jälkeen 202 mg geelikromatografiällä puhdistettua tuotetta levitetään liuotettuna yllä mainittuun seokseen. Eluointi käynnistetään lineaarisen gradientin sarjoilla seoksesta, joka sisältää 15 % metanolia ja 85 % 20 %:sta etikkahappoa, seokseen, joka sisältää 25 % metanolia ja 75 % 20 %:sta etikkahappoa, minkä jälkeen käytetään seosta, jossa on 40 % metanolia ja 60 % 20 %:sta etikkahappoa, ja lopetetaan seoksella, jossa on 80 % metanolia ja 20 % 20 %:sta etikkahappoa. Nämä toimenpiteet suoritetaan 2 ml/min.:n virtausnopeudella 3,5 x 105 Pa:n paineessa. Fraktiot tutkitaan 280 nm:ssä ja niiden pitoisuus tutkitaan käyttämällä TLC:tä. Näin saadaan puhdasta lopullista [Aa6]-gonadoliberiini-tuotetta 123 mg (61,0 %) lyofilisoinnin jälkeen, sp. 185 - 192eC.

26 8 5 G β 6 [a]D20 = -63,2*.(c = 1, O,IN etikkahappo)

Rf1 = 0,17.

Arainohappoanalyysi tuotti seuraavat arvot:

Ser 0,92, Glu 1,03, Pro 1,1, Gly 0,97, Leu 1,00, Tyr 0,95, His 1,08, Trp 0,83, Aa 0,90, Arg 1,05.

Esimerkit 5 ja 6

Seuraavat yhdisteet valmistetaan esimerkissä 4 esitetyllä tavalla:

Esim. Yhdisteen nimi Rf5 Saanto n:o_ 5 [Aa6,Trp7,Leu8]-gona- 0,57 35 % doliberiini 6 [Mab6,phe7,Gin8]-gona- 0,63 43 % doliberiini

Esimerkkien 5 ja 6 mukaisten yhdisteiden aminohappoanalyysi tuotti seuraavat arvot:

Esim. 5: Ser 0,91, Glu 1,02, Pro 0,97, Gly 1,00, Leu 0,98, Tyr 1,03, His 0,93, Trp 1,82, Aa/Mab 0,96.

Esim. 6 Ser 0,93, Glu 2,02, Pro 1,12, Gly 1,12, Tyr 0,97, Phe 1,07, His 0,95, Trp 0,87, Aa/Mab 0,89.

Esimerkki 7 • ·« * : Intramuskulääriseen, subkutaaniseen tai intravenöösiseen käyttöön tarkoitettujen injektioliuosten valmistus a) Yleisen kaavan (I) mukainen gonadoliberiinijohdannainen liuotetaan 1-10 mg/ml:n konsentraatiossa tislattuun veteen, fysiologiseen suolaliuokseen tai puskuroituun vesipitoiseen liuokseen. Liuos steriloidaan suodattamalla, sitten 27 8 5 C66 50 - 500 yg gonadoliberiinijohdannaista sisältävät määrät täytetään ampulleihin, lyofilisoidaan ja lopuksi ampullit suljetaan.

Ennen käyttöä ampullien sisältö muunnetaan tuoreeksi liuokseksi lisäämällä 1 - 10 ml tislattua vettä ja injektoidaan halutun annoksen sisältävä määrä.

b) Fysiologinen suolaliuos tai vast, bentsyylialkoholi, joka sisältää yleisen kaavan (I) mukaista gonadoliberiinijohdannaista 20 - 500 pg/ml, täytetään ampulleihin, jotka sitten suljetaan. Näin saadut liuokset sopivat suoraan käytettäviksi .

Claims (6)

1. 28. C < /; 'JoUOO
2. 1. Menetelmä lutenisoivaa tai follikkelia stimuloivaa hormonia vapauttavan vaikutuksen omaavien yleisen kaavan (I) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-X3-Pro-X4 (I) mukaisten uusien gonadoliberiinijohdannaisten valmistamiseksi, jossa kaavassa Xl merkitsee 2-aminobentsoehappo- tai 3-aminobentsoehappo-ryhmää, X2 merkitsee leusyyli-, tryptofyyli- tai fenyylialanyyliryh-mää, X3 merkitsee arginyyli-, leusyyli- tai glutaminyyliryhmää ja X4 merkitsee glysyyliamidi- tai etyyliamidiryhmää, ja niiden happoadditiosuolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) kondensoidaan mahdollisesti suojatut aminohapot käyttämällä asteittaista ja/tai fragmenttikondensaatiota ja poistetaan mahdolliset suojaryhmät, tai b) kondensoidaan asteittain käyttämällä kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmää mahdollisesti suojatut aminohapot kiinteälle kantoaineelle sopivassa järjestyksessä, lohkaistaan lopullinen tuote kiinteästä kantoaineesta happaman tai alkalisen lohkaisun avulla ja poistetaan suojaryhmät samanaikaisesti lohkaisun kanssa tai ennen sitä tai sen jälkeen hartsista.
3. 2. Patenttivaatimuksen l, kohdan a) mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan (II) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N3 (II) mukainen pentapeptidiatsidi kondensoidaan yleisen kaavan (III) X1-X2-X3-Pro-X4 (III) i 29 85 G 66 mukaisen tetrapeptidin tai pentapeptidin kanssa, jossa tähteillä Xi, X2, X3 ja X4 on yllä määritelty merkitys.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 kohdan b) mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään bentshydryyliamiini-hartsia kiinteänä kantoaineena.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 kohdan b) mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suojaryhmiä sisältävä lopullinen tuote poistetaan kiinteästä kantoaineesta käsittelemällä vetyfluoridilla.
6. 30. S o 6 6