NL8603291A - Gonadoliberinederivaten met een aromatisch aminocarbonzuur op de 6-plaats, farmaceutische en veterinaire preparaten met dergelijke derivaten erin, alsmede een werkwijze voor de bereiding ervan. - Google Patents

Description

NL 33972-Kp/cs £

Gonadal 3-berinederi vat en met een aromatisch aminocarbonzuur op de 6-plaats, farmaceutische en veterinaire preparaten met dergelijke derivaten erin, alsmede een werkwijze voor de bereiding ervan.

De uitvinding heeft betrekking op nieuwe gonado;libe-rinenonapeptide-ethylamide- of decapeptideamidederivaten met de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin een 2-aminobenzoëzuur- of 3-aminobenzoëzuurgroep 5 voorstelt; X2 een‘leucyl-, tryptofyl- of: fenylalanylgroep is;

Xg een arginyl-, leucyl- af: glutaminylgroep voorstelt; terwijl X^ een glycylamide- of ethylamidegroep is, 10 alsmede hun zuuradditiezouten en farmaceutische preparaten met dergelijke verbindingen erin.

Overeenkomstig een ander aspect van de uitvinding gaat het om een werkwijze voor de bereiding van de nieuwe verbindingen met de algemene formule 1 van het formuleblad, als-15 mede hun zouten.

De in de formules gebruikte afkortingen zijn conform de nomenclatuur, die is geaccepteerd in de peptidechemie [zie bijvoorbeeld: J. Biol. Chem.'241, 527 (1966)]. Zodoende zijn de betekenissen van de in de onderhavige beschrijving gebruik-20 te afkortingen als volgt: X -X-

Glp: pyroglutaminezuur (pyroglutamyl)

His: histidine (histidyl)

Trp: tryptofaan , (tryptofyl) 25 Ser: serine (seryl)

Tyr; tyrosine (tyrosyl)

Gly:. glycine (glycyl)

Phe: fenylalanine (fenylalanyl)

Leu: leucine (leucyl) 30 Pro: proline (prolyl)

Glu: glutaminezuur (glutamyl)

Gin: glutamine (glutaminyl)

Arg: arginine (arginyl) 8603291 * 4 . 2 _ ¢. — Δ ~ X -X-

Mab: 3-aminobenzoëzuur

Aa: anthranilzuur

Boc: tertiair-butyloxycarbonyl

Bzl: benzyl 5 DCC: dicyclohexylcarbodiimide DCU: dicyclohexylureum DIC: diisopropylcarbodiimide DMF: dimethylformamide DNP: dinitrofenyl 10 EA: ethylamide

Et: ethyl HPLC: hoge presta;tie-vloeistofchromatograf ie Me: methyl ONP: 4-nitrofenyl 15 OPCP ï pentachloorfenyl DPFP:: pentafluorfenyl TEA: triethylamine IFA: trifluorazijnzuur THF: tetrahydrofuran 20 TLC: dunne laagchromatografie

Tos: tosyl ÜV: ultraviolet Z: benzyloxycarbonyl

Een algemeen bekende eigenschap van gonadoliberine 25 [ andere uit de literatuur bekende namen: gonadotropine vrijmakend hormoon, GnRH, luteliiiser.end.en follikel-stimulerend hormoon-loslatend hormoon (LH/FSH-RH); chemisch Glp-His-Trp--Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH^J en van de bekende derivaten van dit hormoon is het vermogen om lutèïniserende en follikel-30 stimulerende hormonen (LH en FSH) vrij te maken.

Aan het begin van de tachtiger jaren werd bekend, dat de structuur van gonadoliberine bij bepaalde vissen en vogels verschillend is van die van gonadoliberine, dat in zoogdieren voorkomt [j.A. King en R.P. Millar: J. Biol. Chem. 35 257, 10722 (1982); South-African J. of Science 78^, 124 (1982); N. Sherwood et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. 8_0, 2794 (1983)]. Deze verschillen zijn terug te voeren op de aminozuren op de 8603291 — 3 — £’ i 8-plaats in geval van vogels en op de 7- of 8-plaats in geval van vissen.

Bekend is voorts uit de literatuur, dat gonadolibe-rinederivaten met D-aminozuren en een hydrofobe alifatische 5 of aromatische zijketen in plaats van glycine op de 6-plaats, een verhoogde werking hebben vergeleken met die van gonado-liberine [j. Sandow et al.: "Control of Ovulation", Ed. But-terworth, Londen 1978, 49-70; A.V. Schally et al.: Ann. Rev. Biochem., £7, 89 (1.978)J.

10 Voorts is bekend, dat de biologische activiteit van gonadoliberine op een hoger niveau kan worden gebracht door vervanging van de g lycinamidegroep op de 10-plaats door amide-groepen met een alifatische keten |M. Fujino et al.: J. Med.

Chem. VS, 1144 (1973)4 - 15 Onderzoeking van het energiegehalte van de diverse mogelijke conformaties van het decapeptide, F.A. Momany [j.

Amer. Chem. Soc. £8, 2990 (1976); en ibidem 98, 2996 (1976)J heeft aangetoond, dat het laagste energiegehalte was bij een ruimtelijke rangschikking, waarbij het molecuul gebogen is in 20 een "U"-vorm (6-draai) aan het glycine of D-alanine op de 6-plaats. R.M. Freidinger et al. [Science 210, 656 (1980)] heeft een GnRH-derivaat met de formule 4 van het formuleblad bereid, waarin deze ruimtelijke structuur werd gefixeerd door vervanging van glycine op de 6-plaats door een γ-lactam. De 25 biologische werking van deze verbinding was toegenomen ten opzichte van die van het oorspronkelijke gonadoliberine.

Het doel van de uitvinding is de bereiding van nieuwe gonadoliberinederivaten met een gunstigere biologische werking vergeleken met die van de bekende verbindingen, ge-30 schikt bij het fokken"' van andere species, zoals vis en amfibieën, naast het fokken'- van zoogdieren.

Een ander doel van de uitvinding is het verschaffen van een werkwijze, waarbij in plaats van glycine op de 6-plaats een nieuw type aminozuur wordt ingebouwd, dat de aro-35 matische ring bevat, welke de biologische werking doet toenemen naast het fixeren van de meest gunstige ruimtelijke rangschikking en tegelijkertijd risico voor racemisatie te vermijden.

De uitvinding is gebaseerd op de ontdekking, dat het 8S03291 '* * - 4 - bovengenoemde doel bereikt kan worden door het inbouwen van een 2-aminobenzoëzuurgroep (anthranilzuur) met formule 5 van het formuleblad, of een 3-aminobenzoëzuurgroep met formule 6 van het formuleblad in plaats van de glycinegroep op de 6-5 plaats van gonadoliberine.

Een andere grond voor de uitvinding is de erkenning, dat de doelmatigheid van dergelijke gonadoliberinederivaten verder kan worden opgevoerd door vervanging van de glycine-amidegroep op de 10-plaats door een alkylamidegroep met 1-4 10 koolstofatomen.

Tenslotte is de uitvinding gebaseerd op de erkenning, dat door vervanging van de aminozuren op de 8-plaats of op de 7- en 8-plaatsen van gonadoliberine door bepaalde aminozuren gonadoliberinederivaten kunnen worden bereid, die gebruikt 15 kunnen worden voor het ''-'fokken· van andere species naast zoogdieren.

Gebaseerd' op deze feiten verschaft de uitvinding een werkwijze voor de bereiding van de nonapeptide-ethylamide- of decapeptideamidederivaten met de algemene formule 1 van het 20 formuleblad, waarin , X2, X3 en X4 de bovenvermelde betekenissen hebben, alsmede hun zouten, met het kenmerk, dat a) de beschermde aminozuren worden gecondenseerd onder gebruikmaking van de geschikte combinaties van de trapsgewijze en fragmentcondensatie, gevolgd door de verwijdering van 25 de beschermende groepen, of b) de beschermde aminozuren trapsgewijze worden gecondenseerd onder gebruikmaking van de vaste fase peptide-synthesemethode tot een vaste drager in de geschikte volgorde met behulp van de carbodiimide- of actieve estermethode, ge- 30 volgd door afscheiden van het eindproduct van de vaste drager door een zure of alkalische splitsing en verwijdering van de beschermende groepen tegelijk met of voor of na de splitsing uit de hars.

Een uitvoeringsvorm van de combinaties volgens me-35 thode a), die de voorkeur verdient, omvat het condenseren van een pentapeptideazide met de formule 2 van het formuleblad met een tetrapeptide of pentapeptide met de algemene formule 3 van het formuleblad, waarin X^, X2, X3 en de bovenvermelde betekenissen hebben.

8603291 - 5 - # i

Volgens methode b) is het geschikt gebruik te maken van een benzhydrylaminehars of een chloorgemethyleerd poly-styreenhars als vaste drager (vaste fase).

Bovendien is het gunstig het eindproduct, dat de be-5 schermende groepen bevat, te verwijderen door splitsing met waterstoffluoride en/of door gebruikmaking van ethylammono-lyse.

De aldus verkregen nona- of decapeptideamide kan desgewenst worden omgezet in een zuuradditiezout door reactie 10 met een farmaceutisch aanvaardbaar zuur, of desgewenst, kan de vrije base worden vrijgemaakt uit het zuuradditiezout voor reactie met een base.

Voorts heeft de uitvinding betrekking op preparaten, geschikt voor therapeutische en/of biologische vermeerderings-15 doeleinden, die de verbindingen met de algemene formule 1 van het formuleblad of een zuuradditiezout daarvan bevatten als werkzaam bestanddeel.

Verder heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor de bereiding van deze preparaten, waartoe een ver-20 binding met de algemene formule 1 van het formuleblad of een zuuradditiezout daarvan wordt vermengd met de algemeen gebruikelijke vloeibare en/of vaste dragers onder oplevering van een preparaat, dat geschikt is voor therapeutische en/of biologische vermeerderingsdoeleinden.

25 In geval van vee zijn de gonadoliberinederivaten met de algemene formule 1 van het formuleblad werkzaam in een doseringstraject van 5-200 ug bij intramusculaire, subcutane of intraveneuze toediening, terwijl in geval van vissen zij actief zijn bij een doseringsinterval van 0,1-100 ug bij 30 intramusculaire of subcutane inspuiting.

De belangrijke voordelen van de nieuwe gonadoliberinederivaten met formule 1 van het formuleblad en van de werkwijze volgens de uitvinding zijn als volgt: a) De nieuwe gonadoliberinederivaten zijn effectiever 35 vergeleken met de bekende gonadoliberinederivaten wat betreft debiologische vermeerderingsproeven uitgevoerd bij vee en vis.

b) De nieuwe op de 6-plaats ingebouwde substituenten hebben geen asymmetrisch centrum, met het gevolg, dat geen racemisatie kan plaatsvinden, terwijl de bereiding van het 8603291 ' * * - 6 - eindproduct gemakkelijker en goedkoper is geworden.

c) De met de bereiding van 2- en 3-aminobenzoëzuur gepaard gaande kosten zijn veel lager dan die van de D-amino-zuren, die een soortgelijke rol spelen bij de bekende GnRH- 5 derivaten.

d) De pentapeptidecomponent met de formule 2 van het formuleblad, die gebruikt werd als uitgangsmateriaal bij methode a), is het gebruikelijke tussenproduct voor elk eindproduct,.

10 De uitvinding wordt nader geïllustreerd aan de hand van de volgende niet-limitatieve voorbeelden, waarbij de dunne laagchromatografie (TLC) R^-waarden werden bepaald op Kieselgel (DC Alufoliën, Merck)-platen onder gebruikmaking van de volgende oplosmiddelsystemen, die corresponderen met 15 het nummer, dat bij de "R^-waarden" is vermeld: 1. Ethylacetaat/pyridine/azijnzuur/water 30 :20:6 :1 1 2. Ethylacetaat/pyridine/azijnzuur/water 60:20:6:11 3. Ethylacetaat/pyridine/azijnzuur/water 120:20:6:11 4. Ethylacetaat/pyridine/azijnzuur/water 240:20:6:11 20 5. n-Butanol/azijnzuur/water/ethylacetaat 1:1:1:1 6. n-Butanol/azijnzuur/water 4:1:1 7. Isopropanol/1 molair azijnzuur 2:1 8. Ethylacetaat/pyridine/azijnzuur/water 5:5:1:3 9. Aceton/tolueen 1:1 25 10. Chloroform/azijnzuur 24:2 11. Butanon/pyridine/water 65:15:20 12. Chloroform/methanol/azijnzuur 85:10:5 13. n-Butanol/azijnzuur/ammonia (1 vol. geconcentreerd ammoniumhydroxide + 4 vol. water)/ 3 0 water 6:1 :1 :2

VOORBEELD I

6 Q Λ Q

Bereiding van [Aa , Gin , desGly J-gonadoliberine-ethylamide Trap a)

Bereiding van Boc-His(DNP)-Trp-OMe (molecuulgewicht: 622,62) 35 21,12 g (50 mmol) Boc-His(DNP)-OH werden opgelost in 100 ml DMF en vervolgens tot 0°C afgekoeld, waarna 10,32 g (20 mmol) DCC en 7,66 g (50 mmol) N-hydroxy-benzotriazool onder roeren werden toegevoegd. Na 10 min roeren van het meng- 86 0 3 2 9 1 - 7 - - sel bij 0°C werd het neergeslagen DCU afgefiltreerd.

De oplossing van 12,74 g (50 mmol) H-Trp-OMe.HC1 in 70 ml DMF werd afgekoeld tot 0°C, waarna 6,94 ml (50 mmol) TEA werd toegevoegd, terwijl na 5 min roeren het neergeslagen tri-5 ethylaminehydrochloride werd afgefiltreerd.

De bovengenoemde twee oplossingen werden verenigd en vervolgens gedurende de nacht bij 0°C geroerd. Het DCU-neer-slag werd afgefiltreerd, waarna de oplossing tot droog werd ingedampt. Het olieachtige residu werd opgelost in 500 ml 10 ethylacetaat en vervolgens drie keer geëxtraheerd met telkens 100 ml ijskoude 1 raolaire kaliumwaterstofsulfaatoplossing en daarna vijf keer met telkens 100 ml verzadigde natriumwater-stofcarbonaatoplossing en tenslotte twee keer met telkens 100 ml 10% natriumchlorideoplossing. De organische fase werd 15 boven watervrij magnesiumsulfaat gedroogd, vervolgens gefiltreerd en tot droog ingedampt. Het olieachtige residu werd grondig behandeld met petroleumether, waarna het verkregen poeder werd afgefiltreerd en gedroogd. Het aldus verkregen kristallijne product werd omgekristalliseerd uit ethylacetaat 20 met petroleumether onder oplevering van het beoogde product in een opbrengst van 27,70 g (89%), smeltpunt: 119-122°C, [a]22 = +14,1° (c = 1, DMF)

Rf4 = 0,62, Rf5 = 0,41 .

Trap b) 25 Bereiding van H-His(DNP)-Trp-0Me.2HCl [molecuulgewicht: 522,49 (vrije base); 595,41 (dihydrochloride)] 100 ml 4N methanolwaterstofchlorideoplossing werd toegevoegd aan de oplossing, die 24,9 g (40 inmol) Boc-His(DNP)--Trp-OMe-dipeptide in 100 ml methanol bevatte. Het mengsel 30 werd gedurende 30 min bij kamertemperatuur bewaard, terwijl het dipeptide-esterhydrochloride uitkristalliseerde. Het neerslag werd afgefiltreerd, met ether gewassen en gedroogd onder oplevering van 21,91 g (92%) van de beoogde verbinding, sm.p.:

198-202°C

35 [a]22 = 0,49° (c = 1, DMF)

Rf3 = 0,46; Rf4 = 0,18.

860 3 2 9 1 1 'i - 8 -

Trap c)

Bereiding van Glp-His-(DNP)-Trp-OMe (molecuulgewicht: 633,60) Het mengsel, dat 4,85 g (36,8 mmol’) L-pyroglutamine-zuur, 7,58 g DCC en £,63 g N-hydroxybenzotriazool in 100 ml 5 DMF bevatte, werd gedurende 10 min bij 5-10°C geroerd, waarna het gevormde DCU-neerslag werd afgefiltreerd.

9,72 ml (70 mmol) TEA werd toegevoegd aan de oplossing van 20,84 g (35 mmol) H-His(DNP)-Trp-OMe.2HC1 in 100 ml DMF. Na 5 min roeren werd het neergeslagen triethylamine-10 hydrochloride afgefiltreerd. Beide oplossingen werden verenigd en bij kamertemperatuur gedurende de nacht geroerd. De volgende dag werd 90 ml aceton toegevoegd, waarna het onoplosbare neerslag werd afgefiltreerd. Het na indampen verkregen olieachtige residu werd grondig behandeld met ethylacetaat, ver-15 volgens afgefiltreerd en gedroogd. Het droge kristallijne product werd drie keer gewassen met telkens 25 ml water en daarna opnieuw gedroogd. Het aldus verkregen product werd omgekristalliseerd uit ethylacetaat onder oplevering van de beoogde verbinding in een opbrengst van 18,42 g (83,1%), sm.p.: 20 148-151 °C.

|V|23 = +5,2° (c = 1, DMF)

Rf3 = 0,53, Rf7 = 0,38.

Trap d)

Bereiding van Glp-His-Trp-OMe (molecuulgewicht: 466,50) 25 Aan de oplossing van 15,84 g (25 mmol) Glp-His(DNP)- -Trp-OMe beschermd tripeptide in 100 ml DMF en 40 ml water werd 4 ml mercaptoethano;! toegevoegd, waarna de pH van de oplossing werd ingesteld op een waarde van 8 door toevoeging van TEA. De oplossing werd gedurende 30 min bij kamertempera-30 tuur bewaard, waarna de oplossing onder verminderde druk tot droog werd ingedampt. Het olieachtige residu werd met ether behandeld, afgefiltreerd en gedroogd. Het aldus verkregen product werd opgelost in een gering VQ'lume methanol en vervolgens door toevoeging van ether omgekristalliseerd. De kristallen 35 werden afgefiltreerd en gedroogd onder oplevering van 10,92 g (93,6% opbrengst) van de beoogde verbinding, sm.p.: 228-232°C. fa]32 = +4,04° (c = 0,42, DMF)

Rf2 = 0,30.

8603291 - 9 - *

Trap e)

Bereiding van Glp-His-Trp-^H^ (molecuulgewicht: 466,51) 20 ml 98% hydrazinehydraat werd toegevoegd aan een oplossing van 9,33 g (20 mmol) Glp-His-Trp-OMe tripeptide in 5 250 ml methanol» Het mengsel werd gedurende 3 uur bij 40°C geroerd en vervolgens gedurende de nacht bij kamertemperatuur.

De volgende dag werd het neerslag gefiltreerd, met koud methanol gewassen en gedroogd onder oplevering van 7,58 g (81,2% opbrengst) van de beoogde verbinding, sm.p.: 166-169°C.

10 OJq2 = -22,3° (c = 0,5, DMF)

Rf1 =0,50? Rf2 = 0,14.

Trap f)

Bereiding van Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe (molecuulgewicht: 716,8) 15 De oplossing van 7,0 g (15 mmol) Glp-His-Trp-^Hg [bereid zoals beschreven in de voorgaande trap e)J in 60 ml DMF werd afgekoeld tot 0°C, waarna 7,5 ml (45 mmol) 6N zout-zuuroplossing onder roeren werd toegevoegd. Dan werd een geconcentreerde waterige oplossing van 1,035 g (15 mmol) natrium-20 nitriet langzaam aan het mengsel toegedruppeld, waarna het geheel gedurende 15 min bij 0°C werd geroerd. Een oplossing van 4,78 g (15 mmol) H-Ser-Tyr-OMe.HCl in 15 ml DMF werd toegevoegd, waarna de pH-waarde van het mengsel op neutraal werd ingesteld door toevoeging van 6,25 ml (45 mmol) TEA. Het meng-25 sel werd bij 0-4°C gedurende de nacht geroerd en vervolgens onder verminderde druk tot droog ingedampt. Na grondig behandelen van het olieachtige residu met ether en drogen werd een poeder verkregen in een opbrengst van 12,1 g (100%), dat twee verontreinigingsvlekken op de dunne laagchromatografie ver-30 toonde, welk poeder echter zonder zuivering kon worden omgezet in het hydrazide, dat kristalliseerbaar is. Na omkristalliseren van een monster uit methanol bleek de beoogde verbinding te smelten bij 188-190°C.

Md2 = -3/48° (c = 1, DMF) 35 Rf1 = 0,58; Rf2 = 0,26.

8 6 0 3 2 9 1- * c - 10 -

Trap g)

Bereiding van Glp-His-Trp-Ser-Tyr-^H^ (molecuulgewicht: 716,8)

Na toevoeging van 10 ml 98% hydrazinehydraat aan een 5 oplossing van 12 g ruwe, gepoederde Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe pentapeptide-ester in 200 ml methanol werd het mengsel gedurende 3 uur bij 40°C geroerd. Daarna werd het mengsel bij kamertemperatuur gedurende nacht geroerd, waarna het kristallij ne neerslag werd afgefiltreerd en gedroogd in een droog-10 inrichting boven geconcentreerd zwavelzuur. De gedroogde kristallen werden opgelast in 250 ml 0,5N zoutzuuroplossing, vervolgens tot een pH van 8 geneutraliseerd door toevoeging van een verzadigde natriumcarbonaatoplossing, waarna het geheel gedurende 2 uur bij 0°C werd bewaard. Het kristallijne 15 precipitaat werd neergeslagen, met ijskoud water gewassen en gedroogd onder oplevering van 6,12 g (56,9% opbrengst als berekend voor de beide trappen) van de beoogde verbinding, sm.p. 205-206°C.

[a]22 = 21,51° (c = 1, DMF) 20 Rf1 = 0,39; Rf2 = 0,14.

De analyse van de hydrazinestikstof gaf 3,79% en 3,76% (de berekende waarde was 3,91%).

Trap h)

Bereiding van H-Gln-Pro-NHEt.TFA [molecuulgewicht; 367,3 25 (Boe; 370,49)] 10 g (70 mmol) proline-ethylamide (verkregen door de hydrogenering van 72 mmol Z-Pro-NHEt) werd opgelost in 100 ml DMF, waarna de pH-waarde werd ingesteld op een waarde van 8 door toevoeging van TEA. Een oplossing van 32 g (87 30 mmol) Boc-Gln-DNP in 100 ml DMF werd toegevoegd onder roeren.

Het olieachtige residu werd opgelost in een mengsel van 50 ml 30% TFA in dichloormethaan, waarna de oplossing gedurende 20 min bij kamertemperatuur werd bewaard. Dan werd de oplossing onder verminderde druk ingedampt en het olieachtige 35 residu grondig behandeld met ether. Het aldus verkregen product werd met ether gewassen en vervolgens onder verminderde druk gedroogd onder oplevering van 15,9 g (62% opbrengst) van het beoogde product, waarvan het smeltpunt niet kon worden be- 8603291 A A -* % - 11 - paald vanwege zijn sterk hygroscopische karakter. jVJ^° = -44,4° (c = 1, methanol)

Rf1 = 0,32; Rf7 = 0,37; Rf13 = 0,21.

Trap i) 5 Bereiding van Z-Leu-Gln-Pro-NHEt (molecuulgewicht: 518,57) 7 g (26 mmol) werden opgelost in 50 ml DMF, vervolgens tot 0°C afgekoeld, waarna de pH-waarde van de oplossing werd ingesteld op een waarde van 8 door toevoeging van TEA.

Een oplossing van 14 g (27,3 mmol) Z-Leu-pentachloorfenyl-10 ester in 40 ml DMF werd toegevoegd, waarna de oplossing gedurende de nacht bij 4°C werd geroerd. De volgende dag werd het mengsel onder verminderde druk ingedampt, waarna het residu werd opgelost in 70 ml ethylacetaat. De organische oplossing werd drie keer geëxtraheerd met telkens 15 ml koude 15 0,01N natriumhydroxideoplossing, vervolgens drie keer met telkens 15 ml water. Het natriumhydroxide en het waterige extract werden verenigd en vervolgens twee keer met telkens 10 ml ethylacetaat gewassen. Na het verenigen werd de ethylacetaat-oplossing boven watervrij natriumsulfaat gedroogd en vervol-20 gens onder verminderde druk ingedampt. Het residu werd grondig vermengd met ether, waarna het verkregen vaste product werd afgefiltreerd, met ether gewassen en onder verminderde druk gedroogd onder oplevering van 10,4 g (77% opbrengst) van het beoogde product, sm.p.: 84-880C.

25 [«]q° = -32,8° (c =1, methanol)

Rf2 = 0,90.

Trap j)

Bereiding van H-Leu-Gln-Pro-NHEt.HBr (molecuulgewicht: 465,5) 70 ml van een 4N oplossing van waterstofbromide in 30 ijsazijn werd toegevoegd aan een oplossing van 7,6 g (14,6 mmol) Z-Leu-Gln-Pro-NHEt in 50 ml ijsazijn, waarna het mengsel gedurende 90 min bij kamertemperatuur werd bewaard. Het mengsel werd langzaam uitgegoten in 800 ml ijskoude ether onder roeren. Na 30 min werd het roeren gestaakt, waarbij het be-35 zonken neerslag werd afgefiltreerd en in een drooginrichting boven fosforpentoxide gedroogd onder oplevering van 7,9 g van het beoogde product, sm.p.: 147°C.

860329 1 ' v -12-.

[α]^° =· -72,80 (c = 1, 2N azijnzuur)

Rf2 = 0,30; Rf11 = 0,82.

Trap k)

Bereiding van Boc-anthranilzuur (molecuulgewicht: 237,27) 5 De pH-waarde van een oplossing van 4 g (30 mmol) anthranilzuur in 20 ml DMF werd ingesteld op een waarde van 8 door toevoeging van TEA- Na toevoeging van 9 g tertiair-butyloxycarbonaat werd het reactiemengsel gedurende de nacht bij kamertemperatuur geroerd. Het oplosmiddel werd ingedampt, 10 waarna, het dikke olieachtige residu werd opgelost in 50 ml ethylacetaat. De organische fase werd drie keer gewassen met telkens 20 ml ijskoud 0,01N zwavelzuur, daarna drie keer met telkens 20 ml water. De ethylacetaatoplossing werd boven watervrij natriumsulfaat gedroogd en vervolgens onder vermin-15 derde druk ingedampt. Het dikke olieachtige residu werd kristallijn, waarna het in een koelkast werd bewaard. Het beoogde product werd verkregen in een opbrengst van 5,7 g (80%), sm.p.: 91-93°C.

Rf9 = 0,87; Rf10 = 0,79.

20 Trap 1)

Bereiding van Boc-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt (molecuulgewicht: 603,85) De oplossing van 2,3 g (5 mmol) H-Leu-Gln-Pro-NHEt-hydrobromide in 10 ml DMF werd afgekoeld tot 0°C, waarna de pH-waarde van de oplossing werd ingesteld op een waarde van 8 25 door toevoeging van TEA. Na de toevoeging van 750 mg (5,5 mmol) N-hydroxybenzotriazool en 1,1 g (5,5 mmol) DCC werd een oplossing van 1,3 g (5,5 mmol) Boc-anthranilzuur in 5 ml DMF langzaam toegedruppeld, waarna het reactiemengsel gedurende 48 uur bij kamertemperatuur werd geroerd. Het neergeslagen 30 DCU werd afgefiltreerd, waarna de oplossing onder verminderde druk werd ingedampt. Het residu werd opgelost in 50 ml ethylacetaat en vervolgens drie keer met telkens 20 ml 10% citroenzuur gewassen, daarna drie keer met telkens 20 ml water, drie keer met telkens 20 ml van een verzadigde natriumwaterstof-35 carbonaatoplossing en tenslotte met 20 ml verzadigde natrium- chlorideoplossing. De ethylacetaatlaag werd boven watervrij druk natriumsulfaat gedroogd en onder verminderdeΛingedampt. Het 8 5 0 3 2 9 1 -13 - olieachtigde residu werd grondig behandeld met ether, waarna het lichtgele, poederachtige neerslag werd afgefiltreerd en met ether gewassen onder oplevering van 2,4 g (80% opbrengst) van het beoogde product, sirup.: 119-121 °C.

5 Rf9 = 0,91.

De aminozuuranalyse gaf de volgende waarden:

Gin 0,.97; Pro 1,03; Leu 1,00; Aa 0,92.

Trap m)

Bereiding van H-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt.TFA (molecuulgewicht: 10 599,63) 603 mg (1 mmol) Boc-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt werd opgelost in 10 ml van een oplossing van 30% trifluorazijnzuur (TFA) in dichloormethaan, waarna de oplossing gedurende 20 min bij kamertemperatuur werd geroerd. Dan werd het TFA onder ver-15 minderde druk snel verwijderd, waarna het residu werd gepoederd door toevoeging van ether en gedroogd onder oplevering van het beoogde product in een opbrengst van 5,15 mg (86%).

Rf5 = 0,52.

Trap n) 20 Bereiding van Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt (molecuulgewicht: 1188,48)

Een oplossing van 358 mg (0,5 mmol) Glp-His-Trp-Ser--Tyr-^Hg-pentapeptide (bereid zoals beschreven in trap g)van dit voorbeeld) in 10 ml DMF werd afgekoeld tot 0°C, gevolgd 25 door druppelsgewijs onder roeren toevoegen van 0,34 ml 6N zoutzuur en daarna van een geconcentreerde waterige oplossing van 37,7 mg natriumnitriet. Na 5 min werd 230 mg (0,5 mmol) H-Aa-Leu-Gln-Pro-NHEt.TFA-tetrapeptide opgelost in het mengsel van 1 ml DMF, waarna 0,34 ml TEA bij 0°C werd toegevoegd.

30 Indien nodig werd het reactiemengsel geneutraliseerd door toevoeging van TEA en vervolgens bij 0°C gedurende 2 uur geroerd, waarna men de temperatuur tot kamertemperatuur liet opkomen. Het DMF werd onder verminderde druk verwijderd, waarna het residu werd afgezonden!door chromatografie op een 35 Sephadex G-25 kolom (2 x 95 cm), opgelost in een 0,2N azijn-zuuroplossing. De scheiding werd via UV-absorptie gevolgd (gemeten bij 280 nm) en TLC. De geschikte fracties werden 8603291 Λ Μ - 14 - verzameld en gevriesdroogd onder oplevering van het beoogde product in een opbrengst van 315 mg (52%) .

Rf 5 = 0,58; Rf7 = 0,83; Rf8 = 0,72.

De aminozuuranalyse gaf de volgende waarden: 5 Ser 0,91; Gin 2,03; Pro 0,95; Leu 1,00; Tyr 1,10;

His 1,02; Trp 0,81; Aa 0,95.

VOORBEELD II

'

Bereiding van [Aa°, desGly ] -gonadoliberine-ethylamide Trap a) 10 Bereiding van Z-Arg(NC^)-Pro-NHEt (molecuulgewicht: 465,47) 7,33 g (29,7 mmol) Z-Arg(N02)“OH en 1,034 g N-hydroxy--benzotriazool werden toegevoegd aan een oplossing van 3,24 g (22,8 mmol) proline-ethylamide in 70 ml THF. Het reactiemeng-sel werd afgekoeld in een ijswaterbad, gevolgd door portie-15 gewijze toevoeging onder roeren van 5,34 g (25,8 mmol) DCC opgelost in 50 ml THF. Het mengsel werd onder koeling met ijs gedurende 5 uur geroerd en daarna gedurende 20 uur bij kamertemperatuur, gevolgd door filtreren en wassen met THF. Het filtraat werd onder verminderde druk ingedampt, waarna het 20 residu werd opgelost in chloroform en achtereenvolgens drie keer met telkens 35 ml van een 1:5-mengsel van ammonium-hydroxide en water gewassen, daarna twee keer met telkens 20 ml water, dan drie keer met telkens 35 ml 1N zoutzuur en tenslotte twee keer met telkens 20 ml water. De chloroform-25 oplossing werd boven watervrij natriumsulfaat gedroogd, gefiltreerd, gewassen met chloroform en vervolgens werd het filtraat ingedampt. Het residu werd opgelost in een mengsel van 35 ml THF en 50 ml ethylacetaat, afgefiltreerd en gewassen met 30 ml van een 1:2-mengsel van THF met ethylacetaat. Na 30 indampen van de oplossing werd aan het vaste schuimachtige residu 100 ml ethylether toegevoegd. Het aldus verkregen product werd afgefiltreerd, met ether gewassen en vervolgens onder verminderde druk gedroogd onder oplevering van 9,69 g (98% opbrengst) van de beoogde verbinding, sm.p.: 125°C.

35 |α]^° = -42,5° (c = 1, methanol)

Rf3 = 0,5; Kf12 = 0,72.

860 329 1 - 15 - -

Trap b)

Bereiding van Z-Leu-Arg (N02) -Pro-NHEt (mqlecuulgewicht: 578/65)

Aan een oplossing van 5,6 g (11,73 mmol) Z-ArgtNC^)-5 -Pro-NHEt beschermde dipeptide-ethylamide in 30 ml ijsazijn werd 55 ml van een 4N oplossing van waterstofbromide in ijsazijn toegevoegd. Het reactiemengsel liet men gedurende 90 min bij kamertemperatuur staan, waarna 250 ml absolute ether werd toegevoegd, gevolgd door het bewaren van het mengsel gedurende 10 1 uur. De bovenstaande vloeistof werd van het precipitaat afgegoten, waarna aan het residu 100 ml ether werd toegevoegd.

Na 15 min laten staan werd het mengsel afgefiltreerd en met ether grondig gewassen. De vaste hygroscopische stof werd boven fosforpentoxide en natriumhydroxide onder verminderde 15 druk gedroogd. Hierbij werd een enigszins hygroscopisch product verkregen in een opbrengst van 6,44 g.

6,04 g (11,0 mmol) van het boven verkregen dipeptide-ethylamidehydrobromide werd in 150 ml chloroform gesuspendeerd, gevolgd door toevoeging van 5,5 ml TEA. De suspensie loste 20 langzaam op; dan werd nog eens een hoeveelheid (2,5 ml) TEA toegevoegd voor het verkrijgen·van een volledige oplossing.

Dan werd een oplossing van 6,4 g Z-Leu-OPCP in 65 ml chloroform aan het reactiemengsel toegedruppeld, waarna het mengsel gedurende de nacht werd geroerd. De volgende dag werd het 25 mengsel achtereenvolgens geëxtraheerd met 1N zoutzuur, dan met een verzadigde natriumchlorideoplossing en 2N ammonium-hydroxideoplossing en tenslotte wederom met een verzadigde natriumchlorideoplossing. De organische fase werd gedroogd boven watervrij natriumsulfaat en vervolgens onder verminderde 30 druk ingedampt. Het residu werd grondig behandeld met ether.

Het aldus verkregen vaste product werd afgefiltreerd, met ether gewassen en onder verminderde druk gedroogd onder oplevering van 5,5 g (84,6% opbrengst) van een ruw product.

Het bovenverkregen beschermde tripeptide-ethylamide 35 werd opgelost in 30 ml ethylacetaat onder zacht verwarmen, dan vervolgens helder gemaakt door toevoeging van actieve koolstof en twee keer met eikens 10 ml ethylacetaat gewassen. Aan het filtraat werd druppelsgewijze 75 ml ethylether toegevoegd. Het olieachtige neerslag werd snel vast. Na ca. 2 uur 8603291 - 16 - laten staan werd het mengsel afgefiltreerd, met een 2:3 mengsel van ethylacetaat en ether gewassen, dan met ether en vervolgens onder verminderde druk gedroogd onder oplevering van 4,7 g (74,3% opbrengst) van de beoogde verbinding, sm.p.: 5 116-118 °C.

[a]^° = 57,0° (c = 1, methanol)

Rf3 = 0,74; Rf4 = 0,49.

Trap c)

Bereiding van H-Leu-Arg(N02)-Pro-NHEt.HBr 10 (molecuulgewicht: 573,4)

Een oplossing van 1,18 g (2 mmol) Z-Leu-Arg(N02)--Pro-NHEt-tripeptide in 10 ml van een oplossing van waterstof-bromide in ijsazijn werd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Na toevoeging van 100 ml watervrij ether werd het 15 poederachtige neerslag afgefiltreerd, waarna het aldus verkregen lichtgele poeder werd gedroogd in een drooginrichting. De aldus verkregen verbinding was een lichtgeel hygroscopisch product in een'opbrengst van 1,30 g.

Rf2 = 0,14.

20 Trap d)

Bereiding van Boc-Aa-OPFP (molecuulgewicht: 403,32)

De oplossing van 2,4 g (10 mmol) Boc-anthranilzuur in 20 ml THF werd afgekoeld tot 0°C, gevolgd door toevoeging van 2,2 g (11 mmol) DCC en 2,0 g pentafluorfenol opgelost in 25 10 ml THF onder roeren. Het mengsel werd gedurende 3 uur bij 0°C geroerd, terwijl het roeren gedurende de nacht bij kamertemperatuur werd voortgezet. De oplossing werd afgefiltreerd en het precipitaat werd opgelost in 30 ml ethylacetaat en achtereenvolgens drie keer gewassen met telkens 10 ml ijskoud 30 10% citroenzuur, drie keer met telkens 10 ml koud water, drie keer met telkens 10 ml verzadigd natriumwaterstofcarbonaatop-lossing en tenslotte drie keer met telkens 10 ml water. De ethylacetaatfase werd boven watervrij natriumsulfaat gedroogd, gefiltreerd en onder verminderde druk ingedampt. Bij bewaren 35 bij +4°C werd het olieachtige residu kristallijn. Hierbij werd het beoogde product verkregen in een opbrengst van 3,06 g (76%) .

= 0,90; RflO = 0,85.

8603291 - 17 - * -

Trap e)

Bereiding van Boc-Aa-Leu-Arg(NC>2) -Pro-NHEt (molecuulgewicht: 675,75)

Een oplossing van 1,07 g (2 mine?!) H-Leu-Arg (NC^) -5 -Pro-NHEt.HBr-tripeptidezout in 5 ml DMF werd af gekoeld tot 0°C, waarna 0,28 ral (2 raraol) TEA en 806 mg (2 mmol) Boc-Aa--OPFP opgelost in 5 ml DMF, werd toegevoegd. De pH-waarde van de oplossing werd afgesteld op een waarde van 8 door toevoeging van TEA, waarna men de temperatuur van de oplossing liet 10 opkomen gevolgd door roeren gedurende 48 uur bij 20°C, terwijl de pH-waarde op 8 werd gehouden door toevoeging van TEA. DMF werd onder verminderde druk verwijderd, waarna het residu werd opgelost in 50 ml ethylacetaat en vervolgens drie keer gewassen met telkens 20% 10% azijnzuur, drie keer met telkens 20 ml 15 water, drie keer met telkens 20 ml verzadigdenatriumwaterstof-carbonaatoplossing en tenslotte met 20 ml van een verzadigde natriumchlorideoplossing. De ethylacetaatoplossing werd boven watervrij natriumsulfaat gedroogd, afgefiltreerd en onder verminderde druk ingedampt. Het olieachtige residu werd grondig 20 behandeld met ether, waarna het aldus verkregen vaste product werd gefiltreerd onder oplevering van 1,05 g (77,8% opbrengst) van de beoogde verbinding.

Rf3 = 0,90; Rf9 = 0,91; R£10 = 0,96.

Trap f) 25 Bereiding van Boc-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt (molecuulgewichtj 630,74)

Een oplossing van 1,0 g (1,5 mmol) Boc-Aa-Leu-ArgiNC^)--Pro-NHEt-tetrapeptide in 50 ml 50% azijnzuur werd gehydroge-neerd in de aanwezigheid van 400 mg 10% palladium-op-houts-30 kool-katalysator gedurende 4 uur. Dan werd de katalysator af-gefiltreerd, de oplossing werd ingedampt en het residu werd grondig behandeld met ether onder oplevering van 779 mg (82,5% opbrengst) van de beoogde verbinding.

Rf2 = 0,45.

35 Trap g)

Bereiding van H-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt.(TFA)2 (molecuulgewicht; 724,67) 630 mg (1 mmol) Boc-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt-tetrapeptide 8603291 - 18 - werd opgelost in 5 ml TFA, waarna de oplossing gedurende 20 min bij kamertemperatuur werd geroerd. TFA werd onder verminderde druk snel verwijderd, waarna het residu met ether werd verpoederd, gefiltreerd en gedroogd onder oplevering van 5 648,5 mg (89,5% opbrengst) van de beoogde verbinding.

Rf2 = 0,34; Rf8 = 0,76.

Trap h)

Bereiding van Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Aa-Leu-Arg-Pro-NHEt.CHgCC^H (molecuulgewicht:1276,54) 10 De oplossing van 358 mg (0,5 mmol) Glp-His-Trp-Ser- -Tyr-^H^-pentapeptide (bereid als beschreven in stap g) van voorbeeld I) in 10 ml DMF werd af gekoeld tot -10°C, waarna eerst 0,34 ml 6N zoutzuur en daarna een geconcentreerde waterige oplossing van 37,7 mg natriumnitriet onder roeren drup-15 pelsgewijs werd toegevoegd. Na 5 min werd een oplossing van 362,3 mg (0,5 mmol) H-Aa-Leu-Arg-Pro.NHEt.(TFA)2“tetrapeptide in 1 ml DMF en 0,34 ml TEA, bereid bij -10°C, toegevoegd. Het mengsel werd gedurende een uur bij -5°C geroerd en vervolgens bij 0ÖC nog eens 1 uur, waarna men de temperatuur van het 20 mengsel tot kamertemperatuur liet opkomen. Het DMF werd onder verminderde druk verwijderd, waarna het residu werd opgelost in 0,2N azijnzuur, waarna deze werd gezuiverd door chromato-grafie met behulp van een Sephadex G-25 kolom (2 x 95 cm) .

De geschikte fracties werden verzameld en gevriesdroogd onder 25 oplevering van 365,7 mg (57,3% opbrengst) van de beoogde verbinding .

R58 = 0,65; Rf6 = 0,49; Rf8 = 0,69.

De aminozuuranalyse leverde de volgende waarden op:

Ser 0,87; Glu 0,99; Pro 1,02; Leu 1,00; Tyr 0,97; 30 His 1,03; Trp 0,82; Aa 0,91; Arg 1,01.

VOORBEELD III

Bereiding van [Mab^T-gonadoliberine Trap a)

Bereiding van Boc-3-aminobenzoëzuur (Boc-Mab) 35 (molecuulgewicht: 237,25) 1,0 g ( 7,5 mmol) 3-aminobenzoëzuur werd opgelost in 10 ml DMF, waarna de pH-waarde van de oplossing werd ingesteld 8603231 - 19 - op een waarde van 8 door toevoeging van TEA. Dan werd 2,5 g tertiair-butyloxycarbonaat toegevoegd, waarna het mengse gedurende een dag werd geroerd. Het reactiemengsel werd op dezelfde wijze opgewerkt als in trap k) van voorbeeld I beschre-5 ven, onder oplevering van 1,4 g (80,9% opbrengst) van de beoogde verbinding, sm.p.: 92°C.

= 0,88; Rf10 = 0,84.

Trap b)

Bereiding van Boc-Mab-Leu-ArgiNC^)-Pro-Gly-ïfl·^ 10 (molecuulgewicht; 704,78)

Een oplossing van T,5 g (2,5 mmol) H-Leu-Arg(NC^)" -Pro-Gly-N^-TFA-zout [M.Yanaihara et al.: J. Med. Chem. 16, 373 (1973)] in 10 ml DMF werd afgekoeld tot 0°C, waarna de pH-waarde van de oplossing werd ingesteld op een waarde van 15 8 door toevoeging van TEA. Dan werden druppelsgewijs en langzaam 383 mg (2,5 mmol)N-hydroxy-benzotriazool en 515 mg (2,5 mmol) DCC aan de oplossing toegevoegd, waarna 593 ng (2,5 nmol) Boc-Mab opgelost in 3 ml DMF druppelsgewijs en langzaam werd toegevoegd. Het reactiemengsel werd bij kamertemperatuur ge-20 durende 48 uur geroerd, waarna het neergeslagen DCU werd af-gefiltreerd en de oplossing onder verminderde druk ingedampt. Het olieachtige residu werd opgelost in 30 ml ethylacetaat en vervolgens drie keer met telkens 10 ml 10% citroenzuur gewassen, dan drie keer met telkens 10 ml water, drie keer met 25 telkens 10 ml verzadigde natriumwaterstofcarbonaatoplossing en tenslotte met 10 ml verzadigde natriumehlorideoplossing.

De ethylacetaatfase werd boven watervrij natriumsuifaat gedroogd en onder verminderde druk ingedampt. Na grondig behandelen van het olieachtige residu met ether werd het gevormde 30 witte kristallijne precipitaat afgefiltreerd en. met ether gewassen onder oplevering van 1,2 g (68% opbrenst) van de beoogde verbinding, sm.p.: 132-133°C.

Rf6 = 0,43.

Trap c) 35 Bereiding van Boc-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-N^ (molecuulgewicht :659,78)

De beschermende groep werd verwijderd uit 1,0 g (f'5 mmol) Boc-Mab-Leu-Arg (NC^'Pro-Gly-N^-pentapeptide op 8603291 ' ν' Vr - 20 - dezelfde manier zoals in trap f) van voorbeeld II beschreven onder oplevering van 775 mg (78,3%) van het beoogde product.

Rf2 = 0,52.

Trap d) 5 Bereiding van H-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-N^ ·(TFA)2 )(molecuulgewicht: 753,72)

Een oplossing van 670 mg (1 mmol) Boc-Mab-Leu-Arg--Pro-Gly-NH2-pentapeptideamide in 5 ml TFA werd gedurende 20 min bij kamertemperatuur geroerd, waarna het TFA onder ver-10 minderde druk werd verwijderd. Het olieachtige residu werd behandeld met ether onder oplevering van een poederachtig product, dat werd afgefiltreerd en gedroogd onder oplevering van 689 mg (91,5% opbrengst) van de beoogde verbinding.

Rf1 = 0,50; Rf5 = 0,53; Rf7 = 0,42.

15 Trap e)

Bereiding van Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-N^ (molecuulgewicht: 1244,39)

Een oplossing van 358 mg (0,5 mmol) Glp-His-Trp-Ser--Tyr-^Hj-pentapeptide (bereid volgens de procedure van trap 20 g) van voorbeeld I) in 10 ml DMF werd afgekoeld tot -10°C, waarna achtereenvolgens 0,34 ml 6N zoutzuur en een geconcentreerde waterige oplossing van 37,7 mg natriumnitriet druppelsgewijze werden toegevoegd. Na 5 min loste 377 mg (0,5 mmol) H-Mab-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (TFA) 2_pentapeptide op in 1. ml 25 DMF, waarna de oplossing tot -10°C werd afgekoeld. Het reactie-mengsel werd gedurende 2 uur bij 0°C geroerd, waarna men de temperatuur van het mengsel tot kamertemperatuur liet opkomen.

De volgende dag werd het mengsel onder verminderde druk ingedampt. Het ruwe decapeptideresidu werd via chromatografie op 30 een Sephadex G-25 kolom (2 x 95 cm) gezuiverd onder gebruikmaking van een 15:1:4:20 mengsel van butanol/propanol/azijn-zuur/water. Het componentgehalte van de fracties werd via TLC en UV-absorptie gevolgd. De fractie, die het decapeptide bevatte, werd gevriesdroogd, waarna deze bewerking werd her-35 haald onder gebruikmaking van verdund azijnzuur. Het beoogde product werd verkregen in een opbrengst van 323 g (52%) .

Rf2 = 0,31; Rf7 = 0,49; Rf8 =.0,62.

8603291 - 21 - *

De aminozuuranalyse gaf de volgende waarden:

Ser 0,91? Glu 1,03? Pro 0,97? Gly 1,10? Leu 1,00?

Tyr 0,97? His 1,05? Trp 0,87? Mab 0,90? Arg 1,11.

VOORBEELD IV

5 Bereiding van [Aa6"|-gonadoliberine (molecuulgewicht: 1244,39) a) Synthese

De verbinding werd bereid onder toepassing van de algemeen gebruikelijke methode bij de vaste fase-peptidesynthese [Merrifield, R.B.: J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)"].

10 0,75 g (0,3 mmol) benzhydrylamine.HCl-hars (0,04 mmol/g, Pierce) deed men opzwellen in dichloormethaan gedurende 2 uur. Dan in verloop vaai de acylering met de aminozuren, werd de volgende bewerking herhaald: 15 Trap Reagens en bewerking Tijd van roeren (min) 1 CH2CI2A 3 keer wassen 1 2 Mengsel van 33% TPA en 67% CELjC^ 1 3 Mengsel van 33% TFA en 67% CH2CI2 25 4 CH2CI2, 3 keer wassen 1 20 5 CHClg, 2 keer wassen 1 6 Mengsel van 10% TEA en 90% CHC13, 2 keer wassen 2 7 CHCl^, 2 keer wassen 1 8 Ethanol, 2 keer wassen 1 9 CH2CI2, 2 keer wassen 1 25 10 3 equivalenten Boc-aminozuur, opgelost in een CEUC^-DMF-mengsel, 3 equivalenten DCC of DIC, opgelost in CH2Cl2 60-variërend 11 CH2CI2/ 2 keer wassen 1 12 Ethanol, 2 keer wassen 1

Een ninhydrineproef werd uitgevoerd na elke trap jjE. Kaiser et al.: Anal. Biochem. 595 (1970)], waarbij de 30 bovengenoemde bewerking werd herhaald uitgaande van trap 5, wanneer een vrije aminogroep werd gedetecteerd. Na het uitvoeren van de laatste trap toonde het gewicht van het Glp-His-(Tos)-Trp-Ser(oBzl)-Tyr(oBzl)-Aa-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-peptide-hars, dat de opbrengst van het beoogde product 344 mg (65% 35 als AVI) was. (Het molecuulgewicht van het beschermde peptide 8603291 » Si# - 22 - was 1764,92).

Trap b)

Splitsing onder toepassing van waterstoffluoride

De beschermende groepen werden verwijderd en tege-5 lijkertijd werd het peptide van de hars afgesplitst in een enkele bewerking onder gebruikmaking van vloeibaar watervrij waterstoffluoride [s. Sakakibara et al.: Buil. Soc. Japan 40, 2164 (1967)J. Aan de peptidehars, die verkregen werd bij de procedure volgens trap a), werd 5 ml anisool en 100 mg dithio-10 threitol toegevoegd. Dan werd 20 ml waterstoffluoride gecondenseerd in dat mengsel, waarna het roeren gedurende 1 uur werd voortgezet.. Na deze periode werd het waterstoffluoride met behulp van een stikstofstroom verwijderd, waarna het residu werd gesuspendeerd in absolute ether, gevolgd door filtra-15 tie. Het vaste residu werd gewassen met 50% azijnzuur, waarna het filtraat werd ingedampt bij een temperatuur van 37°C. Het aldus verkregen decapeptide.HF-zout (371 mg) werd direct onderworpen aan gelchromatografie.

Trap c) 20 Gelchromatografie.

Het in de voorgaande trap b) verkregen product werd gezuiverd op een Sephadex G-25 kolom (2,5 x 100 cm) onder gebruikmaking van 20% azijnzuur als eluëns. Het scheiden werd gevolgd via UV-aJbsorptie (gemeten bij 280 nm) en TLC. De 25 fracties, die het decapeptide bevatten, werden verzameld en gevriesdroogd onder oplevering van het gezuiverde product in een opbrengst van 202 mg (54%) .

Trap d)

Preparatieve HPLC

30 C^.g-silicagel LRP-1 (13-24 urn, Whatman) type prepa ratieve HPLC-kolom (2,5 x 45 cm) werd gebruikt voor dit doel. Het evenwicht werd ingesteld door gebruikmaking van een mengsel van 15% methanol en 85% van een 20% azijnzuuroplossing.

Na het bereiken van het evenwicht werd 202 mg van het pro-35 duet, gezuiverd via gelchromatografie, opgebracht, terwijl het in het bovengenoemde mengsel was opgelost. De elutie werd 8603291 - 23 - * gestart met een lineaire gradiëntserie van een mengsel van 15% methanol en 85% van een 20% azijnzuur oplopend tot een mengsel van 25% methanol en 75% van een 20% azijnzuur, gevolgd door een mengsel van 40% methanol en 60% van een azijn-5 zuur en tenslotte met een mengsel van uQ% methanol en 20% van 20% azijnzuur. Deze bewerkingen werden uitgevoerd bij een stroomsnelheid van 2 ml/min onder een druk van 3,5 x 10^ Pa. De fracties werden onderzocht bij 280 nm, terwijl hun gehalte werd gecontroleerd onder gebruikmaking van TLC. Het al-10 dus verkregen zuivere [Aa f-gonadoliberine eindproduct bedroeg 123 mg (61,0%) na vriesdrogen, sm.p.i 185-192°C. fa]^ = -63,2° (c = 1, 0,1N azijnzuur)

Rf1 = 0,17.

De aminozuuranalyse leverde de volgende waarden op: 15 Ser 0,92; Glu 1,03; Pro 1,1; Gly 0,97; Leu 1,00; Tyr 0,95;

His 1,08; Trp 0,83; Aa 0,90; Arg T,05.

VOORBEELDEN V en VI

De volgende verbindingen werden bereid onder gebruikmaking van de in voorbeeld IV beschreven methode:

No.

5 20 Voorbeeld Naam van de verbinding R^ Opbrengst V fAa®, Trp^, Leu^-gonadoliberine 0,57 35% VI fMab^, Phe^, Gln^]-gonadoliberine 0,63 43%

De aminozuuranalyses van de verbindingen van voorbeelden V en VI leverden de in de volgende tabel opgenomen 25 waarden op:

No.

Voorbeeld Ser Glu Pro Gly Leu Tyr Phe His Trp Aa/Mab V 0,91 1,02 0,97 1,00 0,98 1,03 - 0,93 1,82 0,96 VI 0,93 2,02 1,12 1,00 - 0,97 1,07 0,95 0,87 0,89 8603291 - 24 -

VOORBEELD VII

Bereiding van injectieoplossingen voor intramusculaire, sub-cutane of intraveneuze toediening.

a) Het gonadoliberinederivaat met de algemene for- 5 mule 1 van het formuleblad werd opgelost tot een concentratie van 1 tot 10 mg/ml in gedestilleerd water, fysiologische zoutoplossing of gebufferde waterige oplossing. De oplossing werd door filtratie gesteriliseerd, waarna volumina met 50-500 yg van het gonadoliberinederivaat werden overgebracht in ampul-10 len, gevolgd door vriesdrogen, waarna tenslotte de ampullen werden afgesloten.

Voorafgaande aan de toediening werd het gehalte van de ampullen overgebracht in een verse oplossing door toevoeging van 1-10 ml gedestilleerd water, waarbij een volume met 15 de gewenste dosis daarin werd geïnjecteerd.

b) Een fysiologische zoutoplossing respectievelijk benzylalcohol met daarin het gonadoliberinederivaat met de algemene formule 1 van het formuleblad in een concentratie van 20-500 yg/ml werd overgebracht in ampullen, die vervol- 20 gens werden afgesloten.. De aldus verkregen oplossingen waren geschikt voor directe toediening.

8503291

Claims (9)

1. Gonadoliberinenonapeptide-ethylamide- of -decapep- tideamidederivaten met de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin X.j een 2-aminobenzoëzuur- of 3-aminobenzoëzuurgroep 5 voorstelt; X2 een leucyl-r tryptofyl- of fenylalanylgroep is; X^ een arginyl-, leucyl- of glutaminylgroep is, terwijl X^ een glycylamide- of ethylamidegroep voorstelt, alsmede hun zuuradditiezouten.

2. Een luteïniserend en follikel-stimulerend hormoon- vrijmakend farmaceutisch preparaat, met het kenmerk, dat dit als werkzaam bestanddeel een gonadoliberine-derivaat met de algemene formule 1 van het formuleblad bevat, waarin X^, X2, X3 en X^ de in conclusie 1 gedefinieerde be-15 tekenissen hebben, of een farmaceutisch aanvaardbaar zuur-additiezout daarvan vermengd met dragers en/of toevoegsels., die gewoonlijk in de farmaceutische industrie worden gebruikt.

3. Preparaat voor de reproductie van biologische doel einde, met hét kenmerk, dat als werkzaam be-20 standdeel een gonadoliberinederivaat met de algemene formule 1 van het formuleblad wordt gebruikt, waarin X^, X2, Xj en X^ de in conclusie 1 gedefinieerde betekenissen hebben, of een zuuradditiezout daarvan vermengd met dragers en/of toevoegsels, die gebruikelijk zijn in de veterinaire geneeskunde. 25 4. Werkwijze vóór de bereiding van de nieuwe gonado- liberinederivaten met de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin X-j. een 2-aminobenzoëzuur- of 3-aminobenzoëzuurgroep voorstelt;

30 X2 een leucyl-, tryptofyl- of fenylalanylgroep is; X2 een arginyl-, leucyl- of glutaminylgroep is, terwijl X4 een glycylamide- of ethylamidegroep voorstelt, alsmede hun zuuradditiezouten, met het kenmerk, dat 35 a) de eventueel beschermde aminozuurgroepen worden gecondenseerd onder gebruikmaking van de trapsgewijze en/of fragment-condensatie en eventuele verwijdering van de beschermende groepen, of 860 3 29 1 ~ ' - 26 - b) trapsgewijze, onder gebruikmaking van de vaste fase-peptidesynthesemethode, de eventueel beschermde aminozuren worden gecondenseerd tot een vaste drager in de geschikte volgorde, het splitsen van het eindproduct van de 5 vaste drager door een zure of alkalische splitsing en eventuele verwijdering van de beschermende groepen tegelijkertijd met of voor of na de splitsing van de hars.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, methode a), met het kenmerk, dat een beschermd pentapeptideazide met 10 formule 2 van het formuleblad wordt gecondenseerd met een tetrapeptide of pentapeptide met de algemene formule 3 van het formuleblad, waarin , X2, x3 en X4 3e conclusie 1 gedefinieerde betekenissen hebben.

6. Werkwijze volgens conclusie 4, methode b), met 15 h e t kenmerk, dat als vaste drager een benzhydryl- aminehars of een chloorgemethyleerd polystyreenhars wordt gebruikt.

7. Werkwijze volgens conclusie 4, methode b), met het kenmerk, dat het eindproduct met de beschermde^ 20 groepen daarin wordt verwijderd uit de vaste drager door behandeling met waterstoffluoride of onder toepassing van ethyl-ammonolyse.

8. Werkwij ze voor de bereiding van een luteïniserend of follikel-stimulerend hormoonvrijmakend farmaceutisch prepa- 25 raat, met het kenmerk, dat als werkzaam bestanddeel een gonadoliberinederivaat met de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin , X2, X3 en X4 de in conclusie 1 gedefinieerde betekenissen hebben, of een farmaceutisch aanvaardbaar zuuradditiezout daarvan, bereid onder toepassing 30 van methode a) of b) in conclusie 4, wordt gemengd met dragers en/of toevoegsels, die in de farmaceutische industrie gebruikelijk zijn, gevolgd door omzetting ervan in een farmaceutisch preparaat.

9. Werkwijze voor de bereiding van een preparaat ge-35 schikt voor de reproductie voor biologische doeleinden, met het kenmerk, dat als werkzaam bestanddeel een gonadoliberinederivaat met de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin X^, X2, X3 en X^ de in conclusie 1 gedefinieerde betekenissen hebben, of een zuuradditiezout daarvan, 40 bereid onder toepassing van de methode a) of b) in conlusie 4, 8603291 - 27 - wordt gemengd met dragers en/of toevoegsels, die in de veterinaire geneeskunde gebruikelijk zijn, gevolgd door omzetting ervan in een preparaat, geschikt bij het fokken van gewervelde dieren. 8603291 NL 339/2-Kp/cs Behoort biD O.A. ' t.n.v. Innofinance Altalanos InnovSciös Pénzintëzet te Boedapest, Hongarije. FORMULEBLAD (1) GLp-His -Trp -S<2r-Tyr-X1-X2~X3-Pro-X4 (2) Glp —His —Trp—Ser—Tyr —N3 (3) x1-x2-x3- Pro-X4, GLp-His —Trp — Sor-Tyr -NH. yCH / XCH, (« °-\ >2 H0N —Gly — Pro—Arg — C— CH 2. ii I O CH, /c\ h3c ch3 Glp—His—Trp —Ser—Tyr—NH (5) H 2N— Gly — Pro— Arg-Lcu — O Glp—His -Trp-Sor —'Tyr — NH (« β 860 3 29 1 H2N— Gly — Pro —Arg-Leu — O