FI82255B - Foerfarande foer framstaellning av nya gonadoliberinderivat som paoverkar djurens foeroekningsprocesser. - Google Patents

Description

82255

Menetelmä uusien, eläinten lisääntymisprosesseihin vaikuttavien gonadoliberiini-johdannaisten valmistamiseksi

Keksinnön kohteena on menetelmä uusien, eläinten lisääntymisprosesseihin vaikuttavien gonadoliberiini-johdannaisten valmistamiseksi.

Etenkin keksinnön kohteena on menetelmä uusien yleiskaavan (I)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Xi-Leu-Gln-Pro-X4 (I) mukaisten gonadoliberiini-johdannaisten ja niiden terapeuttisesti käyttökelpoisten happojen kanssa muodostettujen additiosuolojen ja kompleksien valmistamiseksi. Yleiskaavassa (I)

Xl on D-aminohapporyhmä, joka sisältää aromaattisen sivu-ketjun, ja X4 on glysiiniamidi- tai Ci_4-alkyyliamidiryhmä.

Kaavassa käytetyt lyhenteet ovat identtisiä peptidikemiassa hyväksytyn nimistön kanssa, joka on esitetty esim. julkaisussa J. Biol. Chem. Γ241, 527 (1966)].

Gonadoliberiinin (muut kirjallisuudessa tunnetut nimet: go-nadotrooppia vapauttava hormoni, GnRH, luteinisoiva ja follikkelia stimuloiva hormoni, LH/FSH) ja sen tunnettujen johdannaisten ominaisuutena on, että ne pystyvät vapauttamaan luteinisoivaa hormonia (LF) ja follikkelia stimuloivaa hormonia (FSH).

Kahdeksankymmentäluvun alusta on kirjallisuudesta ollut tunnettua, että määrättyjen kalojen ja lintujen gonadoliberiini eroaa rakenteellisesti nisäkkäiden gonadoliberiinistä (J.A. King ja R.P. Millar, J. Biol. Chem. 257, 10722-28 (1982); South-African Journal of Science 7_8» 124 (1982); N. Sherwood et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 80, 2794-2798 (1983). Nämä erot löydetään 7-aseman ja/tai 8-aseman aminohapoista.

2 82255

Kirjallisuudesta on myös tunnettua, että niillä gonadolibe-riinin johdannaisilla, jotka sisältävät 6-asemassa määrättyjä aminohappoja glysiinin sijasta, on lisääntynyt biologinen aktiivisuus verrattuna luonnolliseen gonadolibe-riiniin (J. Sandow et ai., Control of Ovulation, Butter-worth, Lontoo, 1978, SS. 49-70).

Edelleen on tunnettua, että 10-asemassa olevan glysiiniami-di-osan substituutio alifaattisen hiiliketjun omaavilla amidiryhmillä (M. Fujino et ai., J. Med. Chem. _16, 1144-1147 (1973)) nostaa biologisen aktiivisuuden vielä korkeammalle tasolle.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on valmistaa uusia gonadoliberiini-johdannaisia, jotka ovat tehokkaasti käytettävissä kalojen, lintujen ja nisäkkäiden lisääntymisproses-sissa.

Tämän lisäksi keksintö saa lisäksi aikaan johdannaisia, joilla on lisääntynyt biologinen aktiivisuus luonnollisten suhteen.

Keksintö perustuu siihen havaintoon, että gonadoliberiini-molekyylin 7- ja 8-asemassa olevien aminohappojen vaihto muiksi aminohapoiksi ja vastaavasti näiden vaihtojen määrätyt yhdistelmät saavat aikaan gonadoliberiini-analogeja, jotka ovat sopivia kalojen, lintujen ja nisäkkäiden lisään-tymisprosesseissa.

Edelleen keksintö perustuu siihen tietoon, että niiden gonadoliberiini-johdannaisten tehokkuutta, jotka on valmistettu vaihtamalla 7- ja 8-asemassa olevat aminohapot, voidaan lisätä sovittamalla määrättyjä D-aminohappoja 6-asemaan ja alkyyliamidiryhmiä 10-asemaan glysiinin ja vastaavasti glysiiniamidin sijasta.

yleiskaavan (I)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Xi-Leu-Gln-Pro-X4 (I)

II

3 82255 mukaiset nonapeptidi-Ci_4-alkyyliamidit ja dekapeptidiami-dit, jossa kaavassa ja X4 merkitsevät samaa kuin yllä, ja niiden suolat ja kompleksit voidaan valmistaa keksinnön mukaisesti seuraavasti: a) käyttämällä kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmää sopivasti suojatut aminohapot kytketään vaaditussa järjestyksessä kiinteään polymeerikantoaineeseen karbodi-imidin tai aktiivisen esterin avulla ja määrätyssä tapauksessa valmis peptidi lohkaistaan kantoaineesta hapolla tai käyttämällä aminolyysiä, ja haluttaessa aminohappojen suojaryhmät poistetaan peptidistä samanaikaisesti, ennen peptidin loh-kaisua polymeerikantoaineesta tai sen jälkeen, tai b) vaadittu lopputuote muodostetaan sopivista suojatuista aminohapoista käyttämällä fragmenttikondensaation ja asteittaisen synteesin sopivaa yhdistelmää vaihtelevien aminohappo-komponenttien kemiallisen luonteen mukaan.

On edullista käyttää bentshydryyliamiinia tai Boc-proliini-hartsia kiinteänä kantoaineena.

On sopivaa eliminoida suojattu peptidi kantoaineesta vety-fluoridikäsittelyn ja/tai etyyli-ammonolyysin avulla.

Muunnelman b) mukaisesti valmistetaan edullisesti uudet nona- tai dekapeptidi-johdannaiset kondensoimalla kaavan (II)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N3 (II) mukainen pentapeptidiatsidi yleiskaavan (III)

Xl-Leu-Gln-Pro-X4 (III) mukaisen tetra- tai pentapeptidin kanssa, jossa kaavassa X^ ja X4 merkitsevät samaa kuin yllä.

Haluttaessa saatu nona- tai dekapeptidiamidi voidaan muuntaa happoadditiosuolaksi saattamalla se reagoimaan farmaseutti- 4 82255 sesti sopivan hapon kanssa tai haluttaessa vapaa emäs voidaan vapauttaa happoadditiosuolasta emäksellä ja haluttaessa saatu nona- tai dekapeptidiamidi voidaan muuntaa metalli-kompleksiksi.

Edelleen keksinnön tarkoituksena on myös saada aikaan tapa valmistaa farmaseuttiset koostumukset, jotka sisältävät aktiivisina aineosinaan yleiskaavan (I) mukaisia yhdisteitä ja niiden suoloja ja komplekseja.

Farmaseuttiset koostumukset valmistetaan yleensä sekoittamalla vähintään yksi kaavan (I) mukainen yhdiste tai sen farmaseuttisesti sopiva suola tai kompleksi kantoaineiden ja/tai apuaineiden kanssa, joita tavanomaisesti käytetään farmaseuttisten koostumusten valmistuksessa, ja käsittelemällä saadut koostumukset esimerkiksi tableteiksi, rakeiksi, kapseleiksi, suppositorioiksi, injisoitaviksi liuoksiksi, nenäsprayksi jne.

Kaavan (I) mukaisia gonadoliberiini-johdannaisia voidaan käyttää tehokkaasti kaloissa, linnuissa ja nisäkkäissä, kun niitä annetaan intramuskuläärisesti tai subkutaanisesti 0,1 pg - 5 mg:n annoksina.

Keksinnön mukaisten yhdisteiden pääetu on siinä, että yleiskaavan (I) mukaiset uudet gonadoliberiini-johdannaiset sisältävät sellaisia aminohappoyhdistelmiä 7- ja 8-asemassa, jotka ovat luonteenomaisia kaloille ja linnuille, jolloin niitä voidaan käyttää edullisesti myös näiden eläinlajien lisääntymisprosessissa.

Keksinnön muita yksityiskohtia havainnollistetaan seuraavien ei-rajoittavien esimerkkien avulla.

Esimerkeissä 1-5 yhdisteet on syntetisoitu kiinteäfaasi-tekniikalla (Merrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2151 (1963)) käyttämällä kloorimetyloitua polystyreeni-divinyylibentseenihartsia peptidikalkyyliamidien yhteydessä tai bentshydryyliamiinihartsia peptidiamidien yhteydessä.

5 82255

Yksittäiset aminohapot on kytketty hartsiin niiden N-a-tert-butyylioksi-karbonyyli-(Boc)-johdannaisina käyttämällä disykloheksyylikarbodi-imidi- (DCC), N,N'-di-isopropyylikar-bodi-imidi- (DIC) tai aktiivi-esteri-menetelmää. Aminohapon reaktiiviset sivuketjuryhmät on suojattu haluttaessa sopivilla suojaryhmillä.

Kytkentäreaktion täydellisyys mitataan ninhydriinitesteillä (Kaiser, E., Colescott, R.L., Bossinger, C.D. ja Cook, P.I., Anal. Biochem. _34/ 595-598 (1970)). Jos testi on positiivinen, kytkentä toistetaan. Kytkennän kesto vaihtelee tunnista 16 tuntiin aminohapon mukaan.

Peptidin vapauttaminen suojaryhmistä samoin kuin peptidin lohkaisu hartsista suoritetaan sopivimmin yhdessä vaiheessa nestemäisellä fluorivetyhapolla (HF) (Sakakibara, S., Shimo-nishi, Y., Kishida, Y., Okada, M. ja Sugikara, H., Bull.

Soc. Japan 40, 2164-2167 (1967)). Kun käytetään Nim-dinitro-fenyyli(DNP)-suojaryhmää, se poistetaan histidiinin sivuketjusta ennen HF-lohkaisua. Suojattua peptidihartsia sekoitetaan dimetyyliformamidissa (DMF), joka sisältää muutaman tipan propyyliamiinia. Liuottimen poistamisen jälkeen peptidi-hartsi käsitellään vetyfluoridilla tavanomaisella tavalla. Milloin on valmistettava peptidialkyyliamidi-tyyppinen yhdiste, peptidi erotetaan hartsista alkyyli-ammonolyysillä, minkä jälkeen seuraa hydrogenolyysi ja/tai happolohkaisu suojaryhmien luonteen mukaan.

HF-lohkaisun jälkeen saatu raaka tuote alistetaan geelisuo-datukseen pylväällä, joka on täytetty Sephadex G-25:llä ja käyttämällä etikkahappo-liuosta eluenttina.

Lisäpuhdistus suoritetaan preparatiivisellä suurtehoneste-kromatografialla (HPLC) ja/tai silikageelikromatografiällä. Peptidien puhtaus testataan aminohappoanalyysillä ja ohut-kerroskromatografialla (TLC). TLC:n Rf-arvot määritetään Kieselgel-levyillä (DC, Alufolien, Merck) käyttämällä seu-raavia liuotinseoksia: 6 82255 1. etyyliasetaatti/pyridiini/etikkahappo/vesi 30:20:6:11 2. etyyliasetaatti/pyridiini/etikkahappo/vesi 60:20:6:11 3. etyyliasetaatti/pyridiini/etikkahappo/vesi 120:20:6:11 4. etyyliasetaatti/pyridiini/etikkahappo/vesi 240:20:6:11 5. n-butanoli/etikkahappo/vesi/etyyliasetaatti 1:1:1:1 6. n-butanoli/etikkahappo/vesi 4:1:1 7. i-propanoli/1 M etikkahappo 2:1 8. etyyliasetaatti/pyridiini/etikkahappo/vesi 5:5:1:3 9. n-butanoli/etikkahappo/ammoniakki (2 cm3 NH3 : 4 H20)/vesi 6:1:1:2 10. metyyli-etyyli-ketoni/etikkahappo/vesi 120:15:20

II

7 82255

Esimerkki 1 D-Phe^, Gln^-gonadoliberiinin valmistus M: 1243 a) Synteesi 1,25 g (1 mmoolia) bentshydryyliamiinihartsi«HClrä [0,8 mooli ekviv./g] (Pierce) turvotetaan CH2Cl2:ssä kaksi tuntia, sitten käytetään seuraavaa ohjelmaa aminohapporadikaalien kytkemiseksi:

Vaihe Reagenssit ja menetelmät Sekoitusaika (min.) 1 CH2CI2, pesu 3 kertaa 1 2 33¾ trifluorietikkahappoa (TFA) CH2Cl2:ssa 1 3 33¾ TFA CH2Cl2:ssa 25 4 CH2C12, pesu 3 kertaa 1 5 CHCI3, pesu 2 kertaa 1 6 10¾ trietyyli-araiinia (TEA) CH2Cl2:ssa« 2 kertaa 2 7 CHC12, pesu 2 kertaa 1 8 etanoli, pesu 2 kertaa 1 9 CH2CI2, pesu 2 kertaa 1

10 Boc-aminohappo (3 mmoolia) CH2Cl2:ssa ja haluttaessa DMF, plus DIC tai DCC

(3 mmoolia) CH2Cl2:ssa1 60 - vaihtuva 11 CH2CI2, pesu 2 kertaa 1 12 etanoli, pesu 2 kertaa 1

Gin kytkentää sen Boc-Gln-ONP-(p-nitrofenyyli) johdannaisena aktiivi-esteri-menetelmällä;

Glp:n kohdalla α-aminoryhmää ei ole suojattu

Jokaisen jakson jälkeen (vaiheen 12 jälkeen) otetaan näyte ninhydriini-testiä varten; jos testi on negatiivinen, seu- 8 82255 raava jakso käynnistetään vaiheessa 1 ja jos se on positiivinen, toinen uudelleenkytkentä otetaan käyttöön.

Synteesin lopussa saadaan 2,28 g Glp-His(Tos)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-peptidihartsia. AW: 1,05 g (66$) (^suojattu peptidi1 1577) b) HF-lohkaisu

Suojattu peptidi (2,28 g) käsitellään toistotislatulla HFrllä (30 ml) anisolin (3 ml) ja ditiotreitolin (100 mg) läsnäollessa 60 min. 0°C:ssa. HF eliminoidaan vedettömässä typpikaasuvirrassa, hartsi suspendoidaan sitten absoluuttiseen eetteriin ja suodatetaan. Kiinteä jäännös pestään 50$:sella etikkahapolla, sitten liuos haihdutetaan tyhjössä 37°C:ssa. Haihdutettu materiaali alistetaan suoraan geeli-suodatukseen (ks. vaihe c) alla).

c) Geelisuodatus

Raaka peptidi (saatu vaiheessa b)) puhdistetaan Sephadex G-25 pylväällä (2,5 X 100 cm) 50$:sessa etikkahapossa 15 ml/h:n virtausnopeudella. Erotusta valvotaan UV-absorptiolla 280 nm:ssä ja TLC:llä. Fraktiot (300-350 ml) kerätään ja lyofilisoidaan.

Saanto: 690 mg (55$).

d) Preparatiivinen HPLC

Lisäpuhdistus suoritetaan käyttämällä käänteisfaasista C18~ sidotun silikageeli LRP-1:n (13—24 ym) (Whatman) preparatii-vise.tu HPLC-pylvääLtä (2,5x4,5 vm), joka on saatettu tasapainoon 25$:sen metanolin 30$:sessa etikkahapossa olevalla liuoksella. Tasapainoonsaattamisen jälkeen 230 mg geelisuo-datettua materiaalia täytetään pylvääseen. Eluointi suoritetaan metanolin - 30$:sen etikkahapon lineaarisella gradient-tijärjestelmällä (25 - 40$ raetanolia) 2 ml/min.:n virtausnopeudella ja 3,5 x 105 Pa:n paineessa. Fraktioiden sisällöt 9 82255 mitataan 280 nm:ssä ja niitä valvotaan TLCrllä. Tuotteen keräys ja lyofilisointi tuottaa 133 mg D-PHe6, Gln^-GnRH:ta. Absoluuttinen määrä tulisi kertoa kolmella normalisointia varten 690 mg:aan geelisuodatettua materiaalia (399 mg, 32*).

Rf = 0,76; Rf = 0,68; Rf = 0,33; Rf = 0,93; Rf = 0,83.

Aminohappoanalyysi :

Ser 0,93» Glu 1,96, Pro 0,95, Gly 1,02, Leu 1,00,

Tyr 1,01, Phe 1,02, His 0,99.

Sulamispiste: 1 75 - 1780C; [aio = - 68,0° (c = 0,1, 0,1 M AcOH).

Esimerkki 2

Trp?, Gln^-gonadoliberiinin valmistus M: 1226 a) Synteesi 2,5 g (1 mmoolia) bentshydryyliamiinihartsi·HC1:ä (0,4 mooli ekviv./g) turvotetaan CH2Cl2:ssa, sitten valmistetaan 3,6 g Glp-His(DNP)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-Gly-peptidihartsia esimerkin 1/a mukaisesti.

AW: 1,12 g (76*) (Msuojattu peptidi· 1468).

b) Peptidinivapautus suojaryhmistä ja lohkaisu hartsista DNP-ryhmän_lohka_isu

Suojattua dekapeptidihartsia (3,62 g) sekoitetaan 20 ml:ssa DMF:ä ja 1 ral:ssa propyyliamiin ia 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, sitten osittain suojattu peptidihartsi suodatetaan pois, pestään CH2Cl2:Ha ja etanolilla, ja lopuksi se kuivataan tyhjössä.

10 82255 HF-lohka_isu DNP-suojaryhraän poistamisen jälkeen peptidi käsitellään HF:liä esimerkin 1/b mukaisesti. Tällä tavalla saadaan 0,8 g (65*) raakaa dekapeptidiamidia.

c) Geelisuodatus

Geelisuodatus suoritetaan esimerkin 1/c mukaisesti. Saanto: 520 mg (421).

d) Preparatiivinen HPLC

Menetelmä suoritetaan esimerkin 1/d mukaisesti sillä erolla, että LRP-1-geeli saatetaan tasapainoon l8*:sen metanolin 30t:sessa etikkahapossa olevalla liuoksella. Raaka, geeli-suodatettu materiaali eluoidaan pylväästä metanolin -30*:sen etikkahapon lineaarisella gradienttijärjestelmällä (18 - 35* metanolia). Näin saadaan 38Ο mg (31*) puhdasta peptidiä.

Rf = 0,66; Rf = 0,57; Rf = 0,78.

Aminohappoanalyysi:

Ser 0,93, Glu 1,93, Pro 1,00, Gly 2,04, Tyr 0,98,

Trp 1,86, His 1,03-

Esimerkki 3

Trp?, Leu^, desGly^Q-gonadoliberiini-etyyliamidin valmistus M: 1198 a) Synteesi

Ensin valmistetaan Boc-Pro-hartsi Merrifieldin menetelmän mukaisesti (Merrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc. 8_6, 304 (1964)). 2,0 g (1 mmoolia) Boc-pro-hartsia (0,5 raooli-ekviv./g) turvotetaan kahden tunnin ajan, sitten sopivat aminohapot kytketään hartsiin peräkkäin esimerkin 1/a mukaisesti. Viimeisen jakson jälkeen saadaan 3,02 g Glp-His(DNP)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-Gly-Trp-Leu-Pro-nonapepti- 11 82255 dihartsia.

AW: 1,02 g (83¾) (Mguojattu peptidi* i486).

b) Peptidin vapautus suojaryhmistä ja lohkaisu hartsista

Ensin poistetaan DNP-suojaryhmä esimerkin 2/b mukaisesti. Sitten osittain suojattu peptidi lohkaistaan hartsista sen etyyliamidin muodossa (Coy, D.H. et ai., Biochemistry 13, 323-326 (1974)). Tätä tarkoitusta varten peptidihartsia sekoitetaan kondensoidun etyyliamiinin (15 ml) kanssa 0°C:ssa 3 tunnin ajan. Etyyliamiinin ylimäärä eliminoidaan typpikaa-suvirrassa. Jäännös pestään etanolilla ja DMF:llä, sitten se suodatetaan. Suodos haihdutetaan tyhjössä, jäännöstä käsitellään eetterillä ja kiinteä materiaali suodatetaan.

Peptidin täydellinen vapautus suojaryhmistä suoritetaan käsittelemällä vedettömällä HFrllä esimerkin 1/b mukaisesti. Saanto: 710 mg (59¾).

c) Geelisuodatus

Nonapeptidiamidi johdetaan Sephadex-G-25-pylvään läpi 30^sessa etikkahapossa esimerkin 1/c mukaisesti.

Saanto: 490 mg (41¾).

d) Silikageelikromatografia

Raaka peptidi puhdistetaan Kieselgel 60-pylvään läpi (2 x 100 cm, silmäkoko 230 - 400, Merck) etyyliasetaatin, pyridiinin, etikkahapon ja veden 30:20:6:11-seoksessa 8 ml/h:n virtausnopeudella. 4 ml:n fraktiot kerätään ja elu-ointia valvotaan TLC:llä. Puhtaan aineen sisältävät fraktiot haihdutetaan ja lyofilisoidaan. Saanto 320 rag (26¾).

Rf = 0,61; Rf = 0,42; Rf = 0,75.

Aminohappoanalyysi:

Ser 0,89, Glu 0,96, Pro 0,95, Gly 0,97, Leu 1,00,

Tyr 1,02, Trp 1,88, His 1,03- 12 8 2 255

Esimerkki 4

Phe?, Gln^-gonadoliberiinin valmistus M: 1187 a) Synteesi 1,25 g (1 mmoolia) : ^ntshi'dryyliajni.irii*iiCl-harts.l:·. U-,8 mooii-ekviv./g) turvotetaan CH2Cl2:ssa kahden tunnin ajan, sitten valmistetaan esimerkin 1/a mukaisesti 2,9 g Glp-His(Tos)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr-Gly-Phe-Gln-Pro-Gly-peptidihartsia.

Δ W: 1,27 g (83¾) (Msuojattu peptidi' 1521).

b) HF-lohkaisu

Suojattua peptidiä käsitellään vedettömällä HF:llä esimerkin 1/b mukaisesti. Näin saadaan 980 mg (82%) suojaryhmistä vapautettua materiaalia.

c) Geelisuodatus

Raaka dekapeptidiamidi puhdistetaan Sephadex G-25-pylväällä 2 M etikkahapossa esimerkin 1/c mukaisesti. Saanto: 576 mg (49%).

d ) Preparatiivinen HPLC

Menetelmä suoritetaan esimerkin 1/d mukaisesti sillä poikkeuksella, että LRP-1-geeli saatetaan tasapainoon 10%:sen raetanolin 20%:sessa etikkahapossa olevalla liuoksella. Elu-ointi suoritetaan metanolin - 20%:sen etikkahapon lineaarisella gradienttijärjestelmällä (10 - 25% metanolia, 150 -150 ml), sitten sitä jatketaan 25 - 40% metanolia sisältävällä gradienttijärjestelmällä (150 - 150 ml kutakin'. Puhtaan peptidin sisä Itävät fraktiot kerätään ja haihdutetaan. Saanto: 448 mg (38%).

Rf = 0,12; Rf = 0,7; Rf = 0,24; R^ = 0,87.

Aminohappoanalyysi:

Ser 0,87, Glu 2,05, Pro 1,03, Gly 2,13, Tyr 0,92, !3 82255

Phe 1,00, His 0,95; Trp 0,81.

Sulamispiste: 182°C.

Esimerkki 5

Phe?, Leu^-Ronadoliberiinin valmistus M: 1172 a) Synteesi 0,62 g (0,5 mmoolia) bentshydryyliamiini»HCl-hartsia (0,5 mooliekviv./g) turvotetaan kahden tunnin ajan, sitten syntetisoidaan esimerkin 1/a mukaisesti 1,33 g Glp-His(Tos)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-Gly-Phe-Leu-Pro-peptidihartsia.

: 6952 rag (92¾) (Mguojattu peptidi* 1509).

b) HF-lohkaisu

Suojattu peptidi käsitellää HF:llä 1/b mukaisesti. Näin saadaan 510 mg (87¾) raakaa dekapeptidiä.

c) Geelisuodatus

Vaiheessa b) saatu raaka dekapeptidiamidi täytetään Sephadex G-25-pylvääseen 2 M etikkahapossa ja puhdistetaan esimerkin 1/c mukaisesti. Saanto: 363 mg (62i).

d) Silikageelikromatografia

Peptidi puhdistetaan edelleen Kieselgel 60-pyiväällä (2 x 100 cm) ri-butanolin, etikkahapon, veden ja etyyliasetaatin 1:1:1:1-seoksessa. Fraktioiden sisältöjä valvotaan 280 nm:ssä ja TLC:llä. Näin saadaan 299 mg (51¾) puhdasta deka-peptidiamidia.

Rf = 0,55; Rf = 0,39; Rf = 0,62; Rf = 0,73. Aminohappoanalyysi:

Ser 0,91, Glu 0,97, Pro 1,07, Gly 2,12, Leu 1,00,

Tyr 1,03, Phe 0,9*1, His 1,05.

m 82255

Esimerkki 6 P-Phe6, Gln^, desGly1°-gonadoliberiinietyyliamidin valmistus M: 1198 a) Boc-His(DNP)-Trp-OMe M: 1198 21,12 g (50 mmoolia) Boc-His(DNP)-OH:ta liuotetaan 100 raitaan DMF:ä ja liuos jäähdytetään 0°C:seen. Tämän jälkeen lisätään sekoittaen 10,32 g (50 mmoolia) DCCIttä ja 7,66 g (50 mmoolia) N-hydroksi-bentstriatsolia. Seosta sekoitetaan 0°C:ssa 10 minuuttia ja saostunut disykloheksyyli-virtsa-aine suodatetaan pois.

12,7*1 g (50 mmoolia) H-Trp-OMe·HC1:ä liuotetaan 70 mitään DMFtä ja liuos jäähdytetään 0°Ctseen. 693 ml (50 mmoolia) trietyyliamiinia lisätään ja 5 minuuttia kestävän sekoittamisen jälkeen saostunut trietyyliamiinihydrokloridi suodatetaan pois.

Nämä kaksi liuosta yhdistetään ja sekoitetaan 0°Ctssa yön yli. Tämän jälkeen saostunut DCU suodatetaan pois ja liuos haihdutetaan kuiviin, öljyinen jäännös liuotetaan 500 mlraan etyyliasetaattia ja ravistellaan jääkylmän 1 M KHSO^-liuoksen kolme 100 ml:n annoksen kanssa, kyllästetyn NaHCO^-liuoksen viiden 100 ml:n annoksen kanssa sekä lopuksi !0 %:sen NaCl-1luokse» kahden 100 ml:n annoksen kanssa. Orgaaninen faasi kuivataan magnesiumsulfaatin oäällä, suodatetaan ja haihdutetaan kuiviin. Saatu öljyinen aine jauhetaan petrolieetterin kanssa, suodatetaan ja kuivatetaan. Saatu kiteinen tuote voidaan kiteyttää uudellleen etyyliasetaatista petrolieetterillä.

Saanto: 27,7 g (89¾>.

Sulamispiste: 119 - 122°C; C α]ξ2 = + 1*1,1° (c = 1, DMF).

Rf = 0,62.

is 82255 c) H-His(DNP)-Trp-OMe·2HC1 M: 522,5 (vapaa emäs); 595 (.2HC1) 24,9 g (40 ramoolia) Boc-His(DNP)-OMe-dipeptidiä liuotetaan 100 ml:aan raetanolia ja lisätään 100 tai 4 n metanolista kloorivetyhappoliuosta. Seoksen annetaan seistä 30 minuuttia huoneenlämpötilassa, samalla kun dipeptidihydrokloridi kiteytyy. Kiteet suodatetaan pois, pestään eetterillä ja kuivataan. Saanto 21,19 g (92¾).

Sulamispiste: 198 - 202°C, [a] 22 - o,49° (c = 1, DMF).

Rf = 0,46; Rf = 0,81.

c) Glp-His(DNP)-Trp-0Me M: 634 4,85 g (36,8 mmoolia) L-pyroglutamiinihappoa, 7,58 disyklo-heksyyli-karbodi-imidiä ja 5,63 g N-hydroksi-bentstriatsolia liuotetaan 100 mlraan DMF:ä. Seosta sekoitetaan 5 - 10°C:ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen saostunut DCU suodatetaan pois.

20,84 g (35 ramoolia) H-His(DNP)-Trp-OME·2HC1:ä liuotetaan 100 ml:aan diraetyyliformamidia ja liuokseen lisätään 9,72 ml (70 ramoolia) trietyyliaraiinia. 5 minuuttia kestävän sekoittamisen jälkeen saostunut trietyyliamiinihydrokloridi suodatetaan pois. Nämä kaksi liuosta yhdistetään ja sekoitetaan huoneenlämpötilassa yön yli. Sitten seokseen lisätään 90 ml asetonia ja saostunut liukenematon materiaali suodatetaan pois. Liuoksen haihduttaminen tuottaa öljyisen materiaalin, joka trituroidaan etyyliasetaatin kanssa, suodatetaan ja kuivataan. Kuiva kiteinen materiaali pestään kolmella 25 ml:n annoksella vettä ja kuivataan. Tuote voidaan kiteyttää uudelleen liuottamalla se kuumaan etyyliasetaattiin ja jäähdyttämällä. Saanto: 18,42 g (83,1¾).

Sulamispiste: 148 - 151 °C; [a]23 = +5,2 (c = 1, DMF).

= 0,53; Rf = 0,38.

'6 82255 d) Glp-His-Tro-OMe M: Μ66 15,84 g (25 ramoolia) Glp-His(DNP)-Trp-OMe-suojattua tripep-tidiä liuotetaan seokseen, jossa on 100 ml DMF:ä ja 40 ral vettä. Lisätään 4 ml merkaptoetanolia ja liuoksen pH säädetään arvoon 8 trietyyliamiinilla. Sen annetaan seistä huoneenlämpötilassa 30 minuuttia ja sitten se haihdutetaan kuiviin tyhjössä, öljyinen materiaali trituroidaan eetterin kanssa, suodatetaan ja kuivataan. Saatu tuote liuotetaan pieneen osaan metanolia ja kiteytetään uudelleen lisäämällä eetteriä. Saostuneet kiteet suodatetaan pois ja kuivataan. Saanto: 10,92 g (93,6¾).

Sulamispiste: 228 - 232°C; [ <*]22 _ +1^04° (c = 0,42, DMF).

Rf = 0,30.

e) Glp-His-Trp-N2H3 M: 466,5 9,33 g (20 ramoolia) Glp-His-Trp-OMe-tripeptidiä liuotetaan 250 ral:aan metanolia. Liuokseen lisätään 20 ral 9ö^sta hyd-ratsiinihydraattia. Reaktioseosta sekoitetaan 40°C:ssa 3 tuntia ja tämän jälkeen huoneenlämpötilassa yön yli. Saostunut materiaali suodatetaan sitten pois, pestään kylmällä me-tanolilla ja kuivataan. Saanto: 758 g (81,2¾).

Sulamispiste: 166 - 169°C; [a]£2 = -22,3 (c = 0,5, DMF).

Rf = 0,50, Rf = 0,14.

f) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe M: 717 7,0 g (15 mmoolia) vaiheessa e) saatua Glp-His-Trp-N2H3:a liuotetaan 60 ml:aan DMF:ä. Liuos jäähdytetään 0°C:seen ja lisätään sekoittaen 7,5 ml (45 mmoolia) 6 n HCl-liuosta. Tämän jälkeen seokseen lisätään tipoittain 1,035 g (15 ramooli- a) NaN02*.a konsentroituna vesipitoisena liuoksena ja seosta sekoitetaan 0°C:ssa vielä 15 minuuttia. Reaktioseokseen li 17 82255 sätään liuos, jossa on 4,78 g (15 mmoolia) H-Ser-Tyr-OMe-HCltä 15 raltssa DMF:ä. pH säädetään neutraaliksi 6,25 ral:lla (45 mmoolia) trietyyliamiinia ja seosta sekoitetaan 0 - 4°C:ssa yön yli. Seuraavana päivänä se haihdutetaan kuiviin tyhjössä ja öljyinen tuote trituroidaan eetterillä.

Saadaan 12,1 g (100¾) aiotua yhdistettä, jossa on pieni määrä epäpuhtautta. Tämä tuote voidaan muuntaa hydratsidik. : puhdistamatta ja saatu hydratsidi voidaan kiteyttää helposti. Metanolista uudelleenkiteytetyn kontrollinäytteen fysikaaliset ominaisuudet:

Sulamispiste: 188 - 190°C; [a]22 = .3,48° (c = 1, DMF).

1 2 Rf = 0,58, Rf = 0,26.

s Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 g) —--=* M: 717 12 g raakaa jauhettua Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe-pentapeptidiesteriä liuotetaan 200 ml:aan metanolia ja sitten lisätään 10 ml 98^sta hydratsiinihydraattia. Seosta sekoitetaan 40°C:ssa 3 tuntia, sitten sitä sekoitetaan huoneenlämpötilassa yön yli, minkä jälkeen saostuneet kiteet suodatetaan pois ja kuivataan eksikkaattorissa konsentroidun rikkihapon päällä. Kuiva kiteinen materiaali liuotetaan 250 raitaan 0,5 n kloorivetyhappoliuosta. Liuoksen pH säädetään arvoon 8 kyllästetyllä natriumkarbonaatti liuoksella. Annetaan seistä 0°C:ssa 2 tuntia, minkä jälkeen saostuneet kiteet suodatetaan pois, pestään jääkylmällä vedellä ja kuivataan. Saanto: 6,12 g (56,9*, laskettu kahdelle vaiheelle).

Sulamispiste: 205 - 206°C; Ccx]22 = -21,51° (c = 1, DMF).

Rf = 0,39; Rf = 0,14.

Hydratsiinityyppi: löydetty: 3,79%, 3,76¾ laskettu: 3,c>1* is 82255 h) Z-Gln-Pro-NHEt M: 405 3,242 g proliinietyyliamiidia (saatu 22,8 mmoolista Z-Pro-NHE:tä hydrogenolyysillä) liuotetaan 70 ralraan tetrahydrofu-raania (THF), sitten liuokseen lisätään 5,6 g (20 mmoolia) Z-Gln-0H:ta ja 1,034 g N-hydroksi-bentstriatsolia. Reaktio-seos jäähdytetään 0°C:seen ja reaktioseokseen lisätään ti-poittain liuos, jossa on 5,34 g (25,9 mmoolia) disyklohek-syyli-karbodi-imidiä THF:ssä. Sekoittamista jatketaan 5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sakka suodatetaan, pestään THF:llä, sitten suodos haihdutetaan tyhjössä ja jäännös liuotetaan kloroformiin. Liuosta ravistetaan kolmen 35 ml:n annoksen kanssa NHi|0H:n ja veden seosta (1:5), kahden 20 ral:n annoksen kanssa vettä, kolmen 35 ml:n annoksen kanssa 0,1 n HCl-liuosta ja lopuksi kahden 20 ml:n annoksen kanssa vettä. Orgaaninen faasi kuivataan vedettömän natriumsulfaa-tin päällä, suodatetaan, pestään kloroformilla ja haihdutetaan. Saatu öljyinen jäännös liuotetaan seokseen, jossa on 35 ml THF:ä ja 50 ml etyyliasetaattia, sitten se suodatetaan. Liuos haihdutetaan ja jäännös trituroidaan eetterin kanssa. Saatu kiinteä tuote suodatetaan, pestään eetterillä ja kuivataan tyhjössä.

Saanto: 7,68 g (95¾).

Rf = 0,73, Rf = 0,45.

i) Z-Leu-Gln-Pro-NHEt M: 518,6 4,5 g (11 mmoolia) Z-Gln-Pro-NHEt:tä liuotetaan 30 ml:aan jääetikkaa ja liuokseen lisätään 55 ml 4 n vetybroraidia jääetikassa. Reaktioseosta pidetään 90 minuuttia huoneenlämpötilassa, sitten lisätään 250 ml vedetöntä eetteriä seokseen ja se pidetään 60 minuuttia huoneenlämpötilassa. Emä-liuos dekantoidaan, jäännökseen lisätään 100 ml eetteriä ja 15 minuutin kuluttua se suodatetaan ja pestään eetterillä. Kiinteä jäännös kuivataan tyhjössä fosforipentoksidin ja natriumhydroksidin päällä. Saanto: 4,9 g (hygroskooppinen).

Il i9 82255 3,8 g ( 11 moolia) saatua dipeptidietyyliamidi·HBr:ä suspen-doidaan 150 ralraan kloroformia ja suspensioon lisätään 7 ml trietyyliamiinia. Lisätään 6,4 g karbobentsoksi-leusyyli-pentakloorifenyyliesteriä 65 mlrssa kloroformia. Reaktio-seosta sekoitetaan yön yli huoneenlämpötilassa. Seuraavana päivänä se pestään 1 n kloorivetyhapolla, kyllästetyllä nat-riumkloridi 11a, 2 n ammoniurr.hydroksidilla ja toistuvasti kyllästetyllä natriumkloridiliuoksella. Kloroformi faasi kuivataan vedettömän natriumsulfaatin päällä ja haihdutetaan tyhjössä. Jäännös trituroidaan eetterillä, suodatetaan, pestään eetterillä ja kuivataan tyhjössä. Saanto: 4,6 g (81 %).

j ) H-Leu-Gln-Pro-NHEt·HBr M: 465,5

Vaiheessa i) valmistettu raaka tuote liuotetaan 10 ml:aan jääetikkaa ja sekoitetaan 60 min. huoneenlämpötilassa, sitten liuos laimennetaan 100 ml:lla vedetöntä eetteriä. Sakka suodatetaan ja haihdutetaan. Saanto 3,54 g (76¾) -Rf = 0,1, Rp = 0,55, Rf = 0,13, R? = 0,77.

Aminohappoanalyysi:

Glu 1,05, Pro 1,19, Leu 1,00.

k) Boc-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt M: 631,7 2,33 g (5 mmoolia) H-Leu-Gln-Pro-NHEt·HBr:ä liuotetaan 5 ml:aan DMF:ä ja jäähdytetään 0°C:seen, sitten liuokseen lisätään 0,7 ml (5 mmoolia) trietyyliamiinia ja 2,57 g (5 mmoolia) tert-butyylioksikarbonyyli-D-fenyylialanyyli-pentakloorifenyyliesteriä 10 ml:ssa DMF:ä. pH säädetään arvoon 7 - 8, sitten reaktioseosta sekoitetaan 48 tuntia huoneenlämpötilassa, sekoituksen aikana pH-arvo säädetään aika-ajoin neutraaliksi trietyyliamiinilla. Reaktioseoksen haihduttamisen jälkeen jäljelle jäävä aine trituroidaan eetterin kanssa, sitten se suodatetaan ja kuivataan. Saadusta raa’asta tuotteesta poistetaan suojaryhmät ilman 1isäpuhdistusta. Saanto: 2,8l g (89¾).

20 82255 l) H-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt-TFA M: 645,6 1,26 g (2 ramoolia) Boc-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt: tä liuotetaan 10 raitaan trifluorietikkahappoa ja sekoitetaan 20 minuuttia huoneenlämpötilassa. Trifluorietikkahappo haihduteteaan tyhjössä ja jäännös trituroidaan eetterin kanssa, suodatetaan ja kuivataan. Jäännös alistetaan kroraatografiaan silikageelipylväällä n-butanolin, etikkahapon ja veden 4:1:1-seoksella. Sopivat fraktiot kerätään ja haihdutetaan tyhjössä. Jäännös liuotetaan muutamaan mitään vettä, sitten se lyofilisoidaan.

Saanto 880 mg (68%).

2 6 Rf = 0,25, Rf = 0,35.

Sulamispiste: 142°C; [ot]20 _ _66° (c - 0,1, DMF).

m) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt M: 1199 286 mg (0,4 mmoolia) vaiheessa g) valmistettua pentapeptidi-hydratsidiä Glp-His-Trp-Ser-Tyr-^Hjta liuotetaan 10 raitaan dimetyyliformaraidia. Liuos jäähdytetään -10°C:seen, sitten siihen lisätään tipoittain sekoittaen 0,27 ml 6 n kloorive-tyhappoa ja tämän jälkeen konsentroitu vesipitoinen liuos, jossa on 30, 2 mg natriumnitriittiä. 5 minuutin kuluttua lisätään -10°C:ssa liuos, jossa on tetrapeptidin H-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt (258 mg, 0,4 mmoolia) trifluoriasetaattisuolaa, joka on valmistettu 1 mltssa dimetyyliformamidia käyttämällä 0,27 ml trietyyliamiinia. Tarvittaessa reaktioseos säädetään neutraaliin pH-arvoon trietyyliamiinilla, sitten sitä sekoitetaan tunnin ajan -5°C:n lämpötilassa, tunnin ajan 0°C:ssa ja 12 tuntia huoneenlämpötilassa.

Dimetyyliformamidi eliminoidaan tyhjössä, öljyinen jäännös liuotetaan 5 raitaan 0,2 n etikkahappoa ja liuos alistetaan kroraatografiaan Sephadex G-25-pylväällä (2 x 95 cm) 0,2 n etikkahapolla. Sopivat fraktiot kerätään ja lyofilisoidaan. Saanto: 298 mg (62%).

Il 21 82255

Rf = 0,39, Rf = 0,13, = 0,48, Rf = 0,14.

Aminohappoanalyysi:

Ser 0,89, Glu 1,98, Pro 0,97, Leu 1,00, Tyr 1,03,

Phe 0,99, His 1,01, Trp 0,91.

Esimerkki 7

Trp7, Gin8, desGly10-gonadoliberiini-etyyliamidin valmistus M: 1220 a) Boc-Gln-Pro-NHEt M: 370 1,0 g (7 mmoolia) proliinietyyliamidia liuotetaan 15 ral-aan dimetyyliformamidia ja pH-arvo säädetään arvoon 8 trietyyn amiinilla, sitten liuokseen lisätään 3,2 g (8,4 mmoolia) tert-but yylioksikarbonyyli-glut ami nyy 1 i-p-ni tro-fenyyues__ teriä 15 ml:ssa dimetyyliformamidia. Reaktioseosta sekoite taan 48 tuntia huoneenlämpötilassa säätäen samalla aika-ajoin pH arvoon 8 trietyyliamiini11a. Reaktioseoksen haihduttamisen jälkeen öljyinen jäännös liuotetaan veteen, pestään eetterillä ja erotettu vesipitoinen faasi haihdutetaan tyhjössä ja kuivataan. Saanto: 1,93 g (74,5%).

Rf = 0,76.

b) H-Gln-Pro-NHEt‘TFA

M: 270 (vapaa emäs) M: 367 (TFA-suola) 1,9 g (7,2 mmoolia) Boc-Gln-Pro-NHEt:tä liuotetaan 10 mlraan trifluorietikkahappoa ja sekoitetaan 20 minuuttia huoneenlämpötilassa. Liuos haihdutetaan tyhjössä, jäännös trituroi-daan eetterin kanssa, suodatetaan ja kuivataan tyhjössä. Saanto: 1,52 g (58%).

Rf = 0,45, R/ = 0,45, Rf = 0,25, Rf°= 0,30.

Hygroskooppinen aine; [a]20 = -34,8° (c = 1} MeOH).

22 82255 c) Boc-Trp-Gln-Pro-NHEt M: 557 500 mg (1,85 mmoolia) H-Gln-Pro-NHEt liuotetaan 10 ralraan dimetyyliformaraidia. pH-arvo säädetään 8 trietyyliamiinin avulla, sen jälkeen lisätään 608 mg (2 mmoolia) tert-butyyli-oksikarbonyylitryptofaania dimetyyliformamidin (10 ml) ja N,N’-di-isopropyylikarbodi-iraidin (620 yl, 4 mmoolia) seoksessa. Reaktioseosta sekoitetaan 48 tuntia huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen se haihdutetaan kuiviin. Jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja laimennetaan eetterillä. Saostunut Boc-Trp-Gln-Pro-NHEt suodatetaan, pestään eetterillä ja kuivataan. Saanto: 740 mg (72 ί).

2 3 Rf = 0,75, Rf = 0,38.

d) H-Trp-Gln-Pro-NHEt-TFA

M: 456,5 (vapaa emäs) M: 554 (TFA-suola) 700 mg (1,25 mmoolia) Boc-Trp-Gln-Pro-NHEt:tä liuotetaan 15 ml:aan trifluorietikkahapon ja CH2Cl2:n 1:1-seosta ja sekoitetaan 20 minuuttia huoneenlämpötilassa. Sitten liuos haihdutetaan tyhjössä ja jäännös trituroidaan eetterillä.

Kiinteä jäännös suodatetaan ja kuivataan. Näin saatu raaka tuote, jota on noin 500 mg, puhdistetaan kroraatografiällä silikageelipylväällä etyyliasetaatin, pyridiinin, etikkaha-pon ja veden 47:20:6:11-seoksella. Sopivat fraktiot kerätään, haihdutetaan kuiviin tyhjössä ja jäännös trituroidaan eetterillä. Näin saadaan 360 mg (52ί) valkoista jauhetta.

1 2 Rf = 0,46, Rf = 0,18.

Sulamispiste: 119 - 123°C; [a]20 = -4,8° (c = 0,1, 0,1 n HC1).

e) Boc-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt M: 613,7 350 mg (0,76 mmoolia) H-Trp-Gln-Pro-NHEt:tä liuotetaan dirae-tyyliformamidiin ja kytketään 104 mg:aan (0,8 mmoolia) esi- 23 82255 merkin 7 vaiheen c) mukaista Boc-Gly:tä. Näin saadaan 375 mg (81¾) kiteistä ainetta.

3 5 6

Rf s 0,88, Rf = 0,82, Rf = 0,61.

f) H-Gly-Trp-Qln-Pro-NHEt·TFA M: 609,6 375 mg (0,6 mmoolia) Boc-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt: r. s ;ojar;. :,n. ; 1 poisti Laar. j;i. puhdistetaan esimerkin 7 vaiheen d) mukaisesti. Näin saadaan 285 mg (76,6¾) valkoista jauhetta.

Rf = 0,08, = 0,16, Rf = 0,67, Rf = 0,28.

g) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt M: 1216,4 286 mg (0,4 mmoolia) pentapeptidihydratsidi-Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3:a kytketään 243*8 mg:n kanssa (0,4 mmoolia) esimerkin 6 vaiheen m) mukaisesti saatua H-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt*TFA:ta. Näin saadaan 252,9 mg (52¾) puhdasta ainetta.

Rf1 = 0,26, R^ = 0,32.

Aminohappoanalyysi:

Ser 0,87, Glu 2,02, Pro 0,91, Gly 1,00, Tyr 1,12,

His 1,05, Trp 1,80.

Claims (4)

24 82255

1. Menetelmä uusien, eläinten lisääntymisprosesseihin vaikuttavien yleiskaavan (I) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Xi~Leu-Gln-Pro-X4 (I) mukaisten gonadoliberiini-johdannaisten ja niiden terapeuttisesti käyttökelpoisten happoadditiosuolojen ja kompleksien valmistamiseksi, jossa kaavassa Xl on D-aminohapporyhmä, joka sisältää aromaattisen sivu-ketjun, ja X4 on glysiiniamidi- tai Ci_4-alkyyliamidiryhmä. tunnettu siitä, että a) käyttämällä kiinteän faasin peptidisynteesimenetelmää sopivasti suojatut aminohapot kytketään vaaditussa järjestyksessä kiinteään polymeerikantoaineeseen karbodi-imidin tai aktiivisen esterin avulla ja määrätyssä tapauksessa valmis peptidi lohkaistaan kantoaineesta hapolla tai käyttämällä aminolyysiä, ja haluttaessa aminohappojen suojaryhmät poistetaan peptidistä samanaikaisesti, ennen peptidin loh-kaisua polymeerikantoaineesta tai sen jälkeen, tai b) vaadittu lopputuote muodostetaan sopivista suojatuista aminohapoista käyttämällä fragmenttikondensaation ja asteittaisen synteesin sopivaa yhdistelmää vaihtelevien aminohappo-komponenttien kemiallisen luonteen mukaan.

2. Patenttivaatimuksen 1/a mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään bentshydryyliamiinia tai Boc-proliinihartsia kiinteänä kantoaineena.

3. Patenttivaatimuksen 1/a mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suojattu peptidi eliminoidaan hartsista käsittelemällä vetyfluoridilla ja/tai etyyliammono-lyysin avulla.

4. Patenttivaatimuksen 1/b mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan (II) II 2s 82255 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N3 (II) mukainen pentapeptidiatsidi kondensoidaan yleiskaavan (III) X1-Leu-Gln-Pro-X4 (III) mukaisen tetra- tai pentapeptidin kanssa, joissa kaavoissa X1 ja X4 merkitsevät samaa kuin patenttivaatimuksessa 1. 26 82255