DK164875B

DK164875B - Gonadoliberinderivater og deres farmaceutisk acceptable syreadditionssalte eller metalcomplexer, en fremgangsmaade til fremstilling heraf samt et farmaceutisk praeparat indeholdende disse

Info

Publication number: DK164875B
Application number: DK625084A
Authority: DK
Inventors: Tamas Gulyas; Aniko Horvath; Gyoergy Keri; Karoly Nikolics; Balazs Szoeke; Istvan Teplan
Original assignee: Koezponti Valto Hitelbank
Priority date: 1983-12-23
Filing date: 1984-12-21
Publication date: 1992-08-31
Also published as: SE469032B; DK625084A; FI845051A0; JPS60226898A; ES8607992A1; CZ1021084A3; ZA849985B; NO166449B; ES538988A0; LU85710A1; AT394727B; FI82255B; SE8406554D0; NO845193L; DK625084D0; FI845051L; FI82255C; IL73902A; CH664968A5; FR2557114B1

Description

DK 164875B

i

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte gonadoliberinderi-vater og deres farmaceutisk acceptable salte eller metalcomplexer og en fremgangsmåde til fremstilling deraf samt et farmaceutisk præparat indeholdende disse.

5 Mere specifikt angår opfindelsen hidtil ukendte gonadoliberinderiva-ter med den almene formel I

Glp - His - Trp - S er - Tyr -Xjl -X2 -X3 - Pro -X4 I

og syreadditionssalte deraf dannet med terapeutisk tolerable syrer og complexer deraf samt farmaceutiske præparater indeholdende disse 10 forbindelser. I den almene formel I betegner XL D-Phe.Gly, X2 en L-aminosyregruppe med 1-4 carbonatomer i sidekæden, L-phenylalanyl eller L-tryptophyl, X3 en L-aminosyregruppe med en alkyl- eller C^ 4-alkano- 15 ylamidsidekæde, og X4 en glycylamid- eller ^-alkylamidgruppe, med det forbehold, at hvis Xj_ betegner en anden gruppe end glycyl, og X2 betegner en tryptophylgruppe, da kan X3 ikke være leucyl.

De i formlen anvendte forkortelser er identiske med den nomenklatur, 20 der er accepteret inden for peptidkemien, og som fx er beskrevet i J.

Biol. Chem. 241, 1966, s. 527.

Det er en almindelig egenskab ved gonadoliberin (andre navne kendt i litteraturen er: gonadotrop-frigørende hormon, GnRH, luteiniserende og follikelstimulerende hormon, Ui/FSH) og kendte derivater deraf, at 25 de er i stand til at frigøre det luteiniserende hormon (LH) og det follikelstimulerende hormon (FSH).

Fra tidligt i 1980'erne har det været beskrevet i litteraturen, at gonadoliberin fra visse fisk og fugle afviger strukturelt fra gonadoliberin fra pattedyr [J.A. King og R.P. Millar, J. B-iol Chem. 257, 30 1982, s. 10722-28; South-African Journal of Science 78, 1982, s. 124; 2

DK 164875 B

N. Sherwood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 1983, s. 2794-2798].

Disse forskelle skyldes aminosyrerne i stilling 7 og/eller 8.

Det er også kendt fra litteraturen, at de derivater af gonadoliberin, som i 6-stilling indeholder visse D-aminosyrer i stedet for glycin, 5 har forøget biologisk virkning i sammenligning med det oprindelige gonadoliberin (J. Sandow et al., Control of Ovulation, Butterworth,

London, 1978, s. 49-70).

Det er endvidere kendt, at erstatning af glycinamiddelen i 10-stil-ling med amidgrupper med aliphatisk carbonkæde [M. Fujino et al., J.

10 Hed. Chem. 16, 1973, s. 1144-1147 hæver den biologiske virkning til et højere niveau.

US patent No. 4 410 514 beskriver peptider med formlen pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Rg-Trp-Leu-Pro-R^g-NHR eller et ikke-toxisk salt heraf, hvor Rg er en D-isomer af en a-aminosyre valgt blandt Trp, Ala, Phe, Lys, 15 Pro, Met, Leu, Glu, Asn, Arg, Tyr, Cys, His, Chg, Nva, Orn, Thr,

Abu, Phg, Ile, Glu, Asp, Nle og Val og hvor Rjlq er Gly eller des-R^g og R er H eller CnY2nCY3, hvor Y er H eller F, og n er 0, 1, 2 eller 3 forudsat, at når Rj_q er des-Rj_gj er n ikke 0. De D-isomere a-amino-syrer kan indeholde kendte substituenter. Disse forbindelser er 20 anvendelige til at fremme gydningen hos fisk i deres naturlige gydningsperiode, men de er i modsætning til de foreliggende forbindelser ikke anvendelige til opnåelse af modne kønsprodukter fra fisk udenfor deres naturlige gydningsperiode.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe hidtil 25 ukendte gonadoliberinderivater, som effektivt kan anvendes til reproduktionsprocessen hos fisk, fugle og pattedyr.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er der endvidere tilvejebragt derivater med forøget biologisk virkning i forhold til virkningen af de oprindelige forbindelser.

30 Opfindelsen er baseret på den erkendelse, at ændring af aminosyrer i 7- og 8-stilling i gonadoliberinmolekylet til andre aminosyrer og 3

DK 164875 B

visse kombinationer af disse ændringer fører til gonadoliberin-analoge, der kan anvendes ved reproduktion hos fisk, fugle og pattedyr.

Opfindelsen er endvidere baseret på den erkendelse, at effektiviteten af gonadoliberinderivater, der er fremstillet ved at ændre amino-5 syrerne i 7- og 8-stilling, kan forøges ved at indsætte visse D-aminosyrer i 6-stilling og alkylamidgrupper i 10-stilling i stedet for henholdsvis glycin og glycinamid.

Nonapeptid-C^ ^-alkylamider og decapeptidamider med den almene formel

10 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X^-X2-X3-Pro-X4 I

hvor , X£, X3 og X4 har den ovenfor anførte betydning, eller salte og complexer deraf kan fremstilles ved en fremgangsmåde, som er ejendommelig ved, at a) der anvendes en fastfase-peptidsyntese, hvor relevant beskyttede 15 aminosyrer i den nødvendige sekvens kobles til et fast polymerbærestof ved hjælp af carbodiimid eller en aktiv ester, og, i et givet tilfælde, det fremstillede peptid spaltes fra bærestoffet ved acido-lyse eller aminolyse, og aminosyrebeskyttelsesgruppemeVfjernes fra peptidet samtidig med, eller, om ønsket, før eller efter fraspaltning 20 af peptidet fra polymerbærestoffet, eller b) det ønskede slutprodukt bygges op fra de egnede beskyttede aminosyrer ved at anvende en egnet kombination af fragmentkondensering og trinvis syntese, alt afhængig af de forskellige aminosyrekomponenter-nes kemiske karakter hvorpå aminosyrebeskyttelsesgruppeme fjernes, 25 og det dannede peptid med formlen I, om ønsket, omdannes til et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt eller et metalcomplex deraf.

Det er fordelagtigt at anvende benzhydrylamin- eller Boc-prolinhar-piks som fast bærestof.

4

DK 164875 B

Det er velegnet at eliminere det beskyttede peptid fra bærestoffet ved behandling med hydrogenfluorid, og/eller ved ethylammonolyse.

Ved fremgangsmådevariant b) foretrækkes det at fremstille de hidtil ukendte nona- eller decapeptidderivater ved at kondensere et penta-5 peptidazid med formlen II

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N3 II

med et tetra- eller pentapeptid med den almene formel III

xl*x2'x3‘^r°-x4 III

eller ved at kondensere et hexapeptidazid med den almene formel IV

10 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-N3 IV

med et tri- eller tetrapeptid med den almene formel V

X2-X3-Pro-X4 V

eller ved at kondensere et heptapeptidazid med den almene formel VI

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Xi-X2-N3 VI

15 med et di- eller tripeptid med den almene formel VII

X3-Pro-X4 VII

I hvilke almene formler X^, X2, X3 og X4 har den ovenfor anførte betydning.

Om ønsket kan det vundne nona- eller decapeptidamid omdannes til et 20 syresalt ved omsætning med en farmaceutisk egnet syre eller, om . ønsket, den frie base kan frigøres fra et syreadditionssalt med en base og, om ønsket, et vundet nona- eller decapeptidamid kan omdannes til et metalcomplex.

5

DK 164875 B

Opfindelsen angår endvidere farmaceutiske præparater, der er kendetegnet ved som aktiv bestanddel at indeholde forbindelser med den almene formel I eller salte og complexer deraf.

De farmaceutiske præparater fremstilles almindeligvis ved at blande 5 mindst én forbindelse med formlen I eller et farmaceutisk tolerabelt salt eller complex deraf med bærestoffer og/eller additiver, der normalt anvendes til fremstilling af farmaceutiske præparater, og formulere det vundne præparat fx som tabletter, dragéer, kapsler, suppositorier, injicerbare opløsninger, næsesprays, etc.

10 Gonadoliberinderivateme med formlen I kan effektivt anvendes til fisk, fugle og pattedyr ved intramuskulær eller subcutan administration af en dosis på mellem 0,1 μ% og 5 mg.

Hovedfordelen ved forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse er, at de hidtil ukendte gonadoliberinderivater med den almene formel 15 I indeholder aminosyrekombinationer i 7- og 8-stilling, som er karakteristiske for fisk og fugle, hvorved de fortrinsvis anvendes til reproduktionsprocesser hos disse dyrearter.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler.

I eksempel 1-5 syntetiseres forbindelserne ved fastfaseteknikken 20 [R.B. Merrifield, Am. Chem. Soc. 85, 1953, s. 2149-2151] under an vendelse af chlormethyleret polystyren-d iviny lb enzen - harp iks i tilfælde af peptid-alkylamider, eller benzhydrylamin-harpiks i tilfælde af peptidamider. De enkelte aminosyrer kobles til harpiksen i form af deres Ν-α-tert.butyloxycarbonyl (Boc)-derivater under anvendelse af 25 en metode med dicyclohexylcarbodiimid (DCC) , N,N'-diisopropylcar-bodiimid (DIC) eller en aktiv ester. De reaktive sidekædegrupper i aminosyren beskyttes, om ønsket, med relevante beskyttelsesgrupper.

Koblingsreaktionens fuldstændighed måles ved ninhydrintest [E. Kaiser, R.L. Colescott, C.D. Bossinger og P.I. Cook, Anal. Biochem. 34, 30 1970, s. 595-598]. Hvis testen er positiv, gentages koblingen. Kob lingens varighed varierer mellem 1 og 16 timer, alt afhængig af aminosyren.

6

DK 164875 B

Afbeskyttelse af peptidet samt spaltning af peptidet fra harpiksen foretages fortrinsvis i ét trin med flydende flussyre (HF) [S. Saka-kibara, Y. Shimonishi, Y. Kishida, M. Okada og H. Sugikara, Bull.

Soc. Japan 40, 1967, s. 2164-2167. Når en N^m-dinitrophenyl (DNP)-5 beskyttelsesgruppe anvendes, fjernes den fra sidekæden i histidin før HF-spaltningen. Den beskyttede peptidharpiks omrøres i dimethylform-amid indeholdende nogle dråber propylamin. Efter fjernelse af opløsningsmidlet behandles peptidharpiksen med hydrogenfluorid på sædvanlig måde. Når der skal fremstilles en peptidforbindelse af alkyl-10 amidtypen, skilles peptidet fra harpiksen ved alkyl-ammono lyse efterfulgt af hydrogenolyse og/eller acidolyse, alt afhængig af beskyttelsesgruppernes natur.

Det efter HF-spaltningen vundne råprodukt underkastes gelfiltrering på en søjle pakket med Sephadex® G-25 under anvendelse af en eddi-15 kesyreopløsning som eluent.

Yderligere rensning udføres under anvendelse af præparativ HPLC og/eller silicagelchromatografi. Peptidernes renhed undersøges ved aminosyreanalyse og ved tyndtlagschromatografi. Tyndtlagschromato-grafi-Rf-værdieme bestemmes på silicagel (DC, Alufolien, Merck)-20 plader under anvendelse af følgende solventblandinger: 1. Ethylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 30:20:6:11 2. Ethylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 60:20:6:11 3. Ethylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 120:20:6:11 4. Ethylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 240:20:6:11 25 5. n-Butanol/eddikesyre/vand/ethylacetat 1:1:1:1 6. n-Butanol/eddikesyre/vand 4:1:1 7. i-Propanol/ΙΜ eddikesyre 2:1 8. Ethylacetat/pyridin/eddikesyre/vand 5:5:1:3 9. n-Butanol/eddikesyre/ammoniak 30 (1 cm3 NH3:4H20)/vand 6:1:1:2 10. Methylethylketon/eddikesyre/vand 120:15:20 EKSEMPEL 1

DK 164875B

7

Fremstilling af D-Phe^, Gln®-gonadoliberin M: 1243 a) Syntese 5 1,25 g (1 millimol) benzhydrylamiriharpiks.HC1 [0,8 meq/g] (Pierce) kvældes i CH2CI2 i 2 tiner, hvorefter nedenstående skema anvendes til kobling af aminosyreresterne:

Trin Reagenser og operationer Blandingstid (min.) 10 1 CH2CI2, vask 3 gange 1 2 33%'s trifluoreddikesyre (TFA) i CH2CI2 1 3 33%'s TFA i CH2C12 25 4 CH2CI2, vask 3 gange 1 5 CHCI3, vask 2 gange 1 15 6 10%'s triethylamin (TEA) i CHCI3, 2 gange 2 7 CHCI3, vask 2 gange 1 8 Ethanol, vask 2 gange 1 9 CH2CI2, vask 2 gange 1 10 Boc-aminosyre (3 millimol) i CH2CI2 og, 20 om ønsket, dimethylformamid, plus DIC eller DCC (3 millimol) i CH2CI2* 60 - variabel 11 CH2CI2, vask 2 gange 1 12 Ethanol, vask 2 gange 1 25 * Gin kobles i form af sit Boc-Gln-ONP (p-nitrophenyl)-derivat ved den aktive estermetode; i tilfælde af Glp er o-aminogruppen ikke beskyttet.

Efter hver cyklus (efter trin 12) udtages en prøve til ninhydrintest; hvis testen er negativ, startes næste cyklus med trin 1, og hvis den 30 er positiv, indføres endnu en rekobling (trin 5-12).

8

DK 164875 B

Efter syntesen fås 2,28 g Glp-His(Tos)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-peptid-harpiks. AW: 1,05 g (66%) 1577).

peptid b) HF-Spaltning

5 2,28 g af det beslsyttede peptid behandles med 30 ml redestilleret HF

i nærværelse af 3 ml anisol og 100 mg dithiothreitol i 60 minutter ved 0°C. HF elimineres i en vandfri nitrogengasstrøm, og harpiksen suspenderes derefter i absolut ether og filtreres. Den faste remanens vaskes med 50%'s eddikesyre, hvorefter opløsningen inddampes i vakuum 10 ved 37°C. Det inddampede stof underkastes direkte gelfiltrering (se nedenstående trin c).

c) Gelfiltrering

Det i trin b) vundne rå peptid renses på en kolonne med Sephadex® G-25 (2,5 x 100 cm) i 50%'s eddikesyre med en strømningshastighed på 15 15 ml/time. Adskillelsen overvåges ved UV-absorption ved 280 nm og ved tyndtlagschromatografi. Fraktioner (300-350 ml) opsamles og lyofili-seres. Udbytte 690 mg (55%).

d) Præparativ HPLC

Yderligere rensning udføres vinder anvendelse af omvendt fase C^g-20 bunden silicagel LRP-1 (13-24 pm) (Whatman) præparativ HPLC-kolonne (2,5 x 45 cm), som ækvilibreres med en opløsning af 25% methanol i 30% eddikesyre. Efter ækvilibrering hældes 230 mg gelfiltreret stof på kolonnen. Eluering udføres med et lineært gradientsystem af methanol-30% eddikesyre (25-40% methanol) med en strømningshastighed på 2 25 ml/minut og et tryk på 3,5 x 105 Pa. Indholdet af fraktionerne måles ved 280 nm og overvåges ved TLC. Opsamling i lyofilisering af produktet giver 133 mg D-Phe^, Gln^-GnRH. Absolutte mængder skal multipliceres med 3 til normalisering til 690 mg gelfiltreret stof (399 mg, 32%).

9

DK 164875 B

Aminosyreanalyse:

Ser 0,93, Glu 1,96, Pro 0,95, Gly 1,02, Leu 1,00,

Tyr 1,01, Phe 1,02, His 0,99.

Smeltepunkt: 175-178'C; [a]2§ - -68,0° (c - 0,1 i 0,1M AcOH).

5 EKSEMPEL 2

Fremstilling af Trp7, Gln®-gonadoliberin M: 1226 a) Syntese 2,5 g (1 millimol) benzhydrylaminharpiks.HCl (0,4 meq/g) kvældes i 10 CH2CI2, hvorefter der fremstilles 3,62 g Glp-His(DNP)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-Gly-peptid-harpiks som beskrevet i eksempel 1, a) .

AV,·. 1,12 g (76Ϊ) /Mbeskyttet pepc.d: 1468).

b) Afbeskyttelse og spaltning af peptidet fra harpiksen 15 Spaltning af DNP-gruppen 3,62 g af den beskyttede decapeptidharpiks omrøres i 20 ml dimeth-ylformamid og 1 ml propylamin i 60 minutter ved stuetemperatur, hvorefter den delvis beskyttede peptidharpiks frafiltreres, vaskes med CH2CI2 og ethanol og til sidst tørres i vakuum.

20 HF-Spaltning

Efter fjernelse af DNP-beskyttelsesgruppen behandles peptidet med HF som beskrevet i eksempel 1, b). På denne måde fås 0,8 g (65%) råt decapeptidamid.

c) Gelfiltrering 25 Gelfiltreringen udføres som beskrevet i eksempel 1, c). Udbytte 520 mg (42%).

10

DK 164875 B

d) Præparativ HPLC

Den udføres som beskrevet i eksempel 1, d), bortset fra, at LRP-1-gelen ækvilibreres med en opløsning af 18% methanol i 30% eddikesyre.

Det rå, gelfiltrerede materiale elueres fra kolonnen med et lineært 5 gradientsystem af methanol-30% eddikesyre (18-35% methanol). Således fås 380 mg (31%) af det rene peptid.

Rf - 0,66, Rf - 0,57, Rf - 0,78.

Aminosyreanalyse:

Ser 0,93, Glu 1,93, Pro 1,00, Gly 2,04, Tyr 0,98, 10 Trp 1,86, His 1,03.

EKSEMPEL 3

Fremstilling af Trp^, Leu®, desGly^-gonadoliberinethylamid M: 1198 a) Syntese 15 Først fremstilles Boc-Pro-harpiks ved den metode, der er beskrevet af Merrifield [R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 86, 1964, s. 304], 2,0 g (1 millimol) Boc-Pro-harpiks (0,5 meq/g) kvældes i 2 timer, hvorefter de relevante aminosyrer kobles til harpiksen, den ene efter den anden, som beskrevet i eksempel 1, a). Efter sidste cyklus fås 3,02 g 20 Glp-His(DNP)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-Gly-Trp-Leu-Pro-nonapeptid-harpiks.

AH: 1,02 g (832) peptld: I486).

b) Afbeskyttelse og spaltning af peptidet fra harpiksen Først fjernes DNP-beskyttelsesgruppen som beskrevet i eksempel 2, b).

25 Derefter spaltes det delvis beskyttede peptid fra harpiksen i sin ethylamidform [D.H. Coy et al., Biochemistry 13, 1974, s. 323-326].

Til dette formål omrøres peptidharpiksen med 15 ml kondenseret ethy-lamin ved 0eC i 3 timer. Overskydende ethylamin elimineres i en nitrogengasstrøm. Remanensen vaskes med ethanol og DMF og filtreres

DK 164875 B

u derefter. Filtratet inddampes i vakuum, remanensen behandles med ether, og det faste stof filtreres.

Fuldstændig afbeskyttelse af peptidet udføres ved behandling med vandfrit HF som beskrevet i eksempel 1, b). Udbytte: 710 mg (59%).

5 c) Gelfiltrering

Nonapeptid-ethylamidet ledes gennem en kolonne med Sephadex® G-25 i 30%'s eddikesyre som beskrevet i eksempel 1, c). Udbytte 490 mg (41%).

d) Chromatografi på silicagel 10 Det rå peptid renses på en kolonne med silicagel 60, 2 x 100 cm (230-400 mesh, 0,037-0,063 mm, Merck) i en 30:20:6:11-blanding af ethyla-cetat, pyridin, eddikesyre og vand med en strømningshastighed på 8 ml/time. Fraktioner på 4 ml opsamles, og elueringen overvåges ved tyndtlagschromatografi. De fraktioner, som indeholder det rene stof, 15 inddampes og lyofiliseres. Udbytte: 320 mg (26%).

Rf - 0,61, Rf - 0,42, Rf - 0,75.

Aminosyreanalyse:

Ser 0,89, Glu 0,96, Pro 0,95, Gly 0,97, Leu 1,00,

Tyr 1,02, Trp 1,88, His 1,03.

20 EKSEMPEL 4

Fremstilling af Phe^, Gin®-gonadoliberin M: 1187 a) Syntese 1,25 g (1 millimol) benzhydrylamin.HCl-harpiks (0,8 meq/g) kvældes i 25 CH2CI2 i 2 timer, hvorefter der som beskrevet i eksempel 1, a) fremstilles 2,9 g Glp-His(Tos)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-Gly-Phe-Gln-Pro-Gly-peptid-harpiks.

i 12

DK 164875 B

AW: 1,27 g (83%) peptid: 1521).

b) HF-Spaltning

Det beskyttede peptid behandles med vandfri HF som beskrevet i eksempel 1, b). På denne måde fås 980 mg (82%) af det afbeskyttede 5 stof.

c) Gelfiltrering

Det rå decapeptidamid renses på en kolonne med Sephadex® G-25 i 2M eddikesyre på den i eksempel 1, c) beskrevne måde. Udbytte 576 mg (49%).

10 d) Præparativ HPLC

Fremgangsmåden udføres som beskrevet i eksempel 1, d), med den undtagelse, at LRP-1-gelen ækvilibreres med en opløsning af 10% methanol i 20% eddikesyre. Elueringen udføres med et lineært gradient system af methanol-20% eddikesyre (10-25% methanol, 150-150 ml), hvorefter der 15 fortsættes med et 25-40% methanolholdigt lineært gradient system (150-150 ml af hver). Fraktioner, der indeholder det rene peptid, isoleres og inddampes. Udbytte 448 mg (38%).

Rf = 0,12, Rf = 0,7, Rf = 0,24, Rf * 0,87.

Aminosyreanalyse: 20 Ser 0,87, Glu 2,05, Pro 1,03, Gly 2,13, Tyr 0,92,

Phe 1,00, His 0,95, Trp 0,81.

Smeltepunkt: 182°C.

EKSEMPEL 5

Fremstilling af Phe^, Leu^-gonadoliberin 25 M: 1172

DK 164875B

13 a) Syntese 0,62 g (0,5 millimol) benzhydrylamin.HCl-harpiks (0,8 meq/g) kvældes i CH2CI2 i 2 timer, hvorefter der som beskrevet i eksempel 1, a) syntetiseres 1,33 g Glp-His(Tos)-Trp-Ser(OBzl)-Tyr(OBzl)-Gly-Phe-5 Leu-Pro-Gly-peptid-harpiks.

ΔΗ: 695 m6 (92%) peptld= 1506).

b) HF-Spaltning

Det beskyttede peptid behandles med HF som beskrevet i eksempel 1, b) . Således fås 510 mg (87%) af det rå decapeptid.

10 c) Gelfiltrering

Det i trin b) vundne rå decapeptidamid hældes på en kolonne med Sephadex® G-25 i 2M eddikesyre og renses som beskrevet i eksempel 1, c) . Udbytte 363 mg (62%).

d) Chromatografi på silicagel 15 Peptidet renses yderligere på en kolonne med silicagel 60 (2 x 100 cm) i en l:l:l:l-blanding af n-butanol, eddikesyre, vand og ethyl-acetat. Indholdet af fraktionerne overvåges ved 280 nm og ved tyndt-lagschromatografi. Således fås 299 mg (51%) af det rene decapeptidamid.

20 Rf - 0,55, Rf - 0,39, Rf - 0,62, Rf - 0,73.

Aminosyreanalyse:Ser 0,91, Glu 0,97, Pro 1,07, Gly 2,12, Leu 1,00,

Tyr 1,03, Trp 0,94, His 1,05.

14

DK 164875 B

EKSEMPEL 6

Fremstilling af D-Phe®, Gin**, desGly^ -gonadoliberin-ethylamid M: 1198 a) Boc-His(DNP)-Trp-OMe 5 M: 623 21,12 g (50 millimol) Boc-His(DNP)-OH opløses i 100 ml dimethylform-amid, og opløsningen afkøles til 0°C. Derefter tilsættes under omrøring 10,32 g (50 millimol) DCCI og 7,66 g (50 millimol) N-hydroxy-benztriazol. Blandingen omrøres ved 0°C i 10 minutter, og det udfæl-10 dede dicyclohexylurinstof frafiltreres.

12,74 g (50 millimol) H-Trp-OMe.HCl opløses i 70 ml dimethylformamid, og opløsningen afkøles til 0°C. 693 ml (50 millimol) triethylamin tilsættes, og efter omrøring i 5 minutter frafiltreres det udfældede tr ie thy lamin-hydrochlor id.

15 De to opløsninger hældes sammen og omrøres natten over ved 0eC.

Derefter frafiltreres udfældet DCU, og opløsningen inddampes til tørhed. Den olieagtige remanens opløses i 500 ml ethylacetat og rystes med tre 100 ml's portioner iskold 1M KHSO^opløsning, fem 100 ml's portioner mættet NaHCOj-opløsning og til slut med to 100 ml's 20 portioner af en 10%'s NaCl-opløsning. Den organiske fase tørres over magnesiumsulfat, filtreres og inddampes til tørhed. Det vundne olie- agtige stof pulveriseres med petroleumsether, filtreres og tørres.

Det vundne krystallinske produkt kan omkrystalliseres af ethylacetat med petroleumsether. Udbytte 27,7 g (89%).

22 25 Smeltepunkt: 119-122°C; [a] q = +14,1° (c = 1 i dimethylformamid).

Rf = 0,62.

b) H-His(DNP)-Trp-OMe.2HC1 M: 522,5 (fri base); 595 (.2HC1) 24,9 g (40 millimol) Boc-His(DNP)-OMe-dipeptid opløses i 100 ml 30 methanol, og der tilsættes 100 ml af en 4N methanolisk saltsyreopløsning. Blandingen lades henstå i 30 minutter ved stuetemperatur,

DK 164875B

15 medens dipeptid-hydrochloridet krystalliseres. Krystallerne frafil- treres, vaskes med ether og tørres. Udbytte 21,91 g (92%).

22

Smeltepunkt 198-202°C; [a] p « 0,49° (c = 1 i dimethylformamid).

Rf - 0,46, Rf = 0,18.

5 c) Glp-His(DNP)-Trp-OMe M: 634 * 4,85 g (36,8 millimol) L-pyroglutaminsyre, 7,58 g dicyclohexylcarbo- diimid og 5,63 g N-hydroxybenztriazol opløses i 100 ml dimethylformamid. Blandingen omrøres ved 5-10eC i 10 minutter, hvorefter udfældet 10 DCU frafiltreres.

20,84 g (35 millimol) H-His(DNP)-Trp-OMe.2HC1 opløses i 100 ml dimethylformamid, og til opløsningen sættes 9,72 ml (70 millimol) tri-ethylamin. Efter omrøring i 5 minutter frafiltreres udfældet tri-ethylamin-hydrochlorid. De to opløsninger sammenhældes og omrøres 15 natten over ved stuetemperatur. Derefter sættes 90 ml acetone til blandingen, og udfældet uopløseligt stof frafiltreres. Inddampning af opløsningen giver et olieagtigt stof, som tritureres med ethylacetat, filtreres og tørres. Det tørre krystallinske stof vaskes med tre 25 ml's portioner vand og tørres. Produktet kan omkrystalliseres ved 20 opløsning i varmt ethylacetat og afkøling. Udbytte 18,42 g (83,1%).

23

Smeltepunkt: 148-151eC; [a] D = +5,2 (c - 1 i dimethylformamid).

Rf - 0,53, Rf = 0,38.

d) Glp-His-Trp-OMe M: 466 25 15,84 g (25 millimol) Glp-His(DNP)-Trp-OMe-beskyttet tripeptid oplø ses i en blanding af 100 ml dimethylformamid og 40 ml vand. 4 ml mercaptoethanol tilsættes, og opløsningens pH indstilles på 8 med triethylamin. Den lades henstå ved stuetemperatur i 30 minutter og inddampes til tørhed i vakuum. Det olieagtige stof tritureres med 30 ether, filtreres og tørres. Det vundne produkt opløses i en lille smule methanol og omkrystalliseres ved tilsætning af ether. De udfældede krystaller frafiltreres og tørres. Udbytte 10,92 g (93,6%).

16

DK 164875 B

Smeltepunkt: 228-232°C; [a]^ = +4,04° (c = 0,42 i dimethylform-amid). r| - 0,30.

e) Glp-His-Trp-N2H3 5 M: 466,5 9,33 g (20 millimol) Glp-His-Trp-OMe-tripeptid opløses i 250 ml methanol. 20 ml 98%'s hydrazinhydrat sattes til opløsningen. Reaktions-blandingen omrøres ved 40° C i 3 timer og derefter natten over ved stuetemperatur. Derefter frafiltreres det udfældede stof, vaskes med 10 koldt methanol og tørres. Udbytte 7,58 g (81,2%).

22

Smeltepunkt: 166-169eC [o] p «* -22,3 (c = 0,5 i dimethylformamid).

Rf - 0,50, Rf = 0,14.

f) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe M: 717 15 7,0 g (15 millimol) Glp-His-Trp-^l^ fremstillet i trin e) opløses i 60 ml dime thylf ormamid. Opløsningen afkøles til 0°C, og under omrøring tilsættes 7,5 ml (45 millimol) 6N HC1-opløsning. Derefter dryppes 1,035 g (15 millimol) NaN02 til blandingen i form af en koncentreret vandig opløsning, og blandingen omrøres ved 0eC i yder-20 ligere 15 minutter. En opløsning af 4,78 g (15 millimol) H-Ser-Tyr-OMe.HCl i 15 ml dimethylformamid sættes til reaktionsblandingen. pH indstilles på neutral værdi med 6,25 ml (45 millimol) triethylamin, og blandingen omrøres natten over ved 0-4eC. Den næste dag inddampes blandingen til tørhed i vakuum, og det olieagtige produkt tritureres 25 med ether.

Der fås 12,1 g (100%) af det ønskede produkt indeholdende en lille smule urenhed. Dette produkt kan omdannes til hydrazidet uden rensning, og det vundne hydrazid kan let krystalliseres.

Fysiske egenskaber hos en kontrolprøve omkrystalliseret af methanol: 30 Smeltepunkt: 188-190°G; [a]^ = -3,48° (c — 1 i dimethylformamid);

Rf - 0,58, Rf = 0,26.

17

DK 164875 B

g) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 M: 717 12 g rå, pulveriseret Glp-His-Trp-Ser-Tyr-OMe-pentapeptidester opløses i 200 ml methanol, og der tilsættes 10 ml 98%'s hydrazirihydrat.

5 Blandingen omrøres ved 40°C i 3 timer og derefter natten over ved stuetemperatur, hvorefter de udfældede krystaller frafiltreres og tørres i exsiccator over koncentreret svovlsyre. Det tørre krystallinske materiale opløses i 250 ml 0,5N saltsyreopløsning. Opløsningens pH indstilles på 8 med mættet natriumcarbonatopløsning. Efter 10 henstand ved 0eC i 2 timer filtreres de udfældede krystaller, vaskes med iskoldt vand og tørres. Udbytte: 6,12 g (56,9%, beregnet for de to trin).

22

Smeltepunkt: 205-206eC; [a] q *= -21,51° (c - 1 i dimethylformamid).

Rf - 0,39, Rf - 0,14.

15 Hydrazin-nitrogen:

Fundet: 3,79, 3,76

Beregnet: 3,91.

h) Z-Gln-Pro-NHEt M: 405 20 3,242 g prolinethylamid (fremstillet ud fra 22,8 millimol Z-Pro-NHEt ved hydrogenolyse) opløses i 70 ml tetrahydrofuran, hvorefter der til opløsningen sættes 5,6 g (20 millimol) Z-Gln-OH og 1,034 g N-hydr-oxybenztriazol. Reaktionsblandingen afkøles til 0°C, og en opløsning af 5,34 g (25,9 millimol) dicyclohexylcarbodiimid i tetrahydrofuran 25 dryppes til den omrørte reaktionsblanding. Omrøringen fortsættes i 5 timer ved 0°C og derefter i 20 timer ved stuetemperatur. Det udfældede stof filtreres og vaskes med tetrahydrofuran, hvorefter filtratet inddampes i vakuum, og remanensen opløses i chloroform. Opløsningen rystes med tre 35 ml's portioner af en blanding af NH^OH og 30 vand i forholdet 1:5, to 20 ml's portioner vand, tre 35 ml's portioner 0,1N HCl-opløsning og til slut to 20 ml's portioner vand. Den organiske fase tørres over vandfrit natriumsulfat, filtreres, vaskes med chloroform og inddampes. Den vundne olieagtige remanens opløses i en blanding af 35 ml tetrahydrofuran og 50 ml ethylacetat, hvorefter 35 der filtreres. Opløsningen inddampes og remanensen tritureres med 18

DK 164875 B

ether. Det vundne faste produkt filtreres, vaskes med ether og tørres i vakuum. Udbytte: 7,68 g (95%).

Rf - 0,73, Rf - 0,45.

i) Z-Leu-Gln-Pro-NHEt 5 M: 518,6 4,5 g (11 millimol) Z-Gln-Pro-NHEt opløses i 30 ml iseddike, og til opløsningen sættes 55 ml 4N hydrogenbromid i iseddike. Reaktions-blandingen holdes i 90 minutter ved stuetemperatur, hvorefter der til blandingen sættes 250 ml vandfri ether, og den holdes ved stuetem-10 peratur i 60 minutter. Den overstående væske dekanteres, 100 ml ether sættes til remanensen, og efter 15 minutters forløb filtreres den og vaskes med ether. Den faste remanens tørres i vakuum over phosphor-pentoxid og natriumhydroxid. Udbytte: 4,9 g (hygroskopisk).

3,8 g (11 millimol) af det vundne dipeptid-ethylamin.HBr suspenderes 15 i 150 ml chloroform, og til suspensionen sættes 7 ml triethylamin.

6,4 g benzyloxycarbonyl-leucyl-pentachlorphenylester i 65 ml chloroform tilsættes. Reaktionsblandingen omrøres natten over ved stuetemperatur. Dagen efter vaskes den med IN saltsyre, mættet natriumch-lorid, 2N ammoniumhydroxid og igen med mættet natriumchloridopløs-20 ning. Chlorof ormf asen tørres over vandfrit natriumsulfat og inddampes i vakuum. Remanensen tritureres med ether, filtreres, vaskes med ether og tørres i vakuum. Udbytte: 4,6 g (81%).

j) Η-Leu-Gin-Pro-NHEt.HBr M: 465,5 25 Det i trin i) vundne råprodukt opløses i 10 ml iseddike og omrøres i 60 minutter ved stuetemperatur, hvorefter opløsningen fortyndes med 100 ml vandfri ether. Det udfældede stof filtreres og tørres i vakuum. Udbytte: 3,54 g (76%).

Rf - 0,1, Rf = 0,55, Rf - 0,13, r| = 0,77.

30 Aminosyreanalyse:

Glu 1,05, Pro 1,19, Leu 1,00.

19

DK 164875 B

k) Boc-D-Phe-Leu-Gin-Pro-NHEt M: 631,7 2,33 g (5 millimol) H-Leu-Gln-Pro-NHEt.HBr opløses i 5 ml dimethyl-formamid og afkøles til 0eC, hvorefter der til opløsningen sættes 0,7 5 ml (5 millimol) triethylamin og 2,57 g (5 millimol) tert.butyloxycar-bonyl-D-phenylalanyl-pentachlorphenylester i 10 ml dimethylformamid. pH indstilles på mellem 7 og 8, hvorefter reaktionsblandingen omrøres i 48 timer ved stuetemperatur, medens pH nu og da justeres til neutral værdi med triethylamin. Efter inddampning af reaktionsblandingen 10 tritureres remanensen med ether, hvorefter den filtreres og tørres.

Det vundne råprodukt underkastes afbeskyttelse uden yderligere rensning. Udbytte 2,81 g (89%).

l) H-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt.TFA M: 645,6 15 1,26 g (2 millimol) Boc-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt opløses i 10 ml tri- fluoreddikesyre og omrøres i 20 minutter ved stuetemperatur. Tri-fluoreddikesyren afdampes i vakuum, og remanensen tritureres med ether, filtreres og tørres. Remanensen underkastes chromatografi på en silicagelkolonne med en 4:1:1-blanding af n-butanol, eddikesyre og 20 vand. De relevante fraktioner isoleres og inddampes i vakuum. Remanensen opløses i nogle få ml vand og lyofiliseres derefter. Udbytte: 880 mg (68%).

Rf - 0,25, Rf - 0,35.

20

Smeltepunkt: 142°C; [a] jj - -66° (c - 0,1 i dimethylformamid).

25 m) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt M: 1199 1 mg (0,4 millimol) af det i trin g) fremstillede pentapeptidhydra-zid Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N2H3 opløses i 10 ml dimethylformamid. Opløsningen afkøles til -10°C, hvorefter der under omrøring tildryppes 30 0,27 ml 6N saltsyre og derefter en koncentreret vandig opløsning af 30,2 mg natriumnitrit. Efter 5 minutters forløb tilsættes en opløsning af trifluoracetatsaltet af 258 mg (0,4 millimol) af tetrapepti-det H-D- Phe-Leu-Gln-Pro-NHEt fremstillet i 1 ml dimethylformamid 20

DK 164875 B

med 0,27 ml triethylamin ved -10°C. Om nødvendigt indstilles reaktionsblandingens pH på neutral værdi med triethylamin, hvorefter der omrøres i 1 time ved en temperatur på -5°C, il time ved 0°C og i 12 timer ved stuetemperatur.

5 Dimethylformamidet elimineres i vakuum, den olieagtige remanens opløses i 5 ml 0,2N eddikesyre, og opløsningen underkastes chroma-tografi på en kolonne med Sephadex® G-25 (2 x 95 cm) med 0,2N eddikesyre. De relevante fraktioner isoleres og lyofiliseres. Udbytte 298 mg (62%).

10 Rf - 0,39, Rf *= 0,13, Rf = 0,48, Rf = 0,14.

Aminosyreanalyse:

Ser 0,89, Glu 1,98, Pro 0,97, Leu 1,00, Tyr 1,03,

Phe 0,99, His 1,01, Trp 0,91.

EKSEMPEL 7 15 Fremstilling af Trp^, Gin®, desGly^-gonadoliberin-ethylamid M: 1220 a) Boc-Gln-Pro-NHEt M: 370 1,0 g (7 millimol) prolin-ethylamid opløses i 15 ml dime thylf ormamid, 20 og pH indstilles på 8 med triethylamin, hvorefter 3,2 g (8,4 millimol) tert.butyloxycarbonyl-glutaminyl-p-nitrophenylester i 15 ml dime thylformamid sættes til opløsningen. Reaktionsblandingen omrøres i 48 timer ved stuetemperatur, medens pH nu og da justeres til 8 med triethylamin. Efter inddampning af reaktionsblandingen opløses den 25 olieagtige remanens i vand og vaskes med ether, og den fraskilte vandige fase inddampes i vakuum og tørres. Udbytte 1,93 g (74,5%).

Rf = 0,76.

21

DK 164875 B

b) H-Gln-Pro-NHEt.TFA

M: 270 (fri base) M: 367 (TFA-salt) 1,9 g (7,2 millimol) Boc-Gln-Pro-NHEt opløses i 10 ml trifluoreddike- syre og omrøres i 20 minutter ved stuetemperatur. Opløsningen ind- 5 dampes i vakuum, og remanensen tritureres med ether, filtreres og tørres i vakuum. Udbytte: 1,52 g (58¾).

Rf - 0,45, Rf - 0,45, R| - 0,25, R1® - 0,30.

20

Hygroskopisk stof; [a] jj » -34,8° (c = 1 i methanol).

c) Boc-Trp-Gln-Pro-NHEt 10 M: 557 500 mg (1,85 millimol) H-Gln-Pro-NHEt opløses i 10 ml dimethylform-amid. pH-Værdien indstilles på 8 med triethylamin, hvorefter 608 mg (2 millimol) tert.butyloxycarbonyl-tryptophan i 10 ml dimethylforma-mid og 620 /iliter (4 millimol) N,N'-diisopropylcarbodiimid tilsættes.

15 Reaktionsblandingen omrøres i 48 timer ved stuetemperatur og inddampes derefter i vakuum. Remanensen opløses i ethylacetat og fortyndes med ether. Det udfældede Boc-Trp-Gln-Pro-NHEt filtreres, vaskes med ether og tørres. Udbytte: 740 mg (72%).

Rf - 0,75, Rf - 0,38.

20 d) H-Trp-Gln-Pro-NHEt.TFA

M: 456,5 (fri base) M: 554 (TFA-salt) 700 mg (1,25 millimol) Boc-Trp-Gln-Pro-NHEt opløses i 15 ml af en l:l-blanding af trifluoreddikesyre og CH2CI2 og omrøres i 20 minutter ved stuetemperatur. Derefter inddampes opløsningen i vakuum, og 25 remanensen tritureres med ether. Den faste remanens filtreres og tørres. Det således vundne råprodukt på ca. 500 mg renses ved chroma-tografi på en silicagelkolonne i en 47:20:6:ll-blanding af ethylacetat, pyridin, eddikesyre og vand. De relevante fraktioner isoleres og inddampes til tørhed i vakuum, og remanensen tritureres med ether.

30 På denne måde fås 360 mg (52%) af et hvidt pulver.

Rf = 0,46, Rf - 0,18.

20

Smeltepunkt: 119-123eC; [e] D = -4,8° (c = 0,1 i 0,1N HCl).

22

DK 164875 B

e) Boc-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt M: 613,7 350 mg (0,76 millimol) H-Trp-Gln-Pro-NHEt opløses i dimethylformamid og kobles med 104 mg (0,8 millimol) Boc-Gly som beskrevet i eksempel 5 7, trin c). På denne måde fås 375 mg (81%) af et krystallinsk stof.

Rf - 0,88, r| - 0,82, Rf - 0,61.

f) H-Gly-Trp-Gin-Pro-NHEt.TFA M: 609,6 375 mg (0,6 millimol) Boc-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt afbeskyttes og renses 10 som beskrevet i eksempel 7, trin d). På denne måde fås 285 mg (76,6%) af hvidt pulver.

Rf - 0,08, Rf - 0,16, Rf = 0,67, Rf = 0,28.

g) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gin-Pro-NHEt M: 1216,4 15 286 mg (0,4 millimol) af pentapeptid-hydrazidet Glp-His-Trp-Ser-Tyr- N2H3 kobles med 243,8 mg (0,4 millimol) H-Gly-Trp-Gln-Pro-NHEt.TFA fremstillet som beskrevet i eksempel 6, trin m). På denne måde fås 252,9 mg (52%) af et rent stof.

Rf - 0,26, Rf - 0,32.

20 Aminosyreanalyse:

Ser 0,87, Glu 2,02, Pro 0,91, Gly 1,00, Tyr 1,12,

His 1,05, Trp 1,80.

EKSEMPEL 8

Fremstilling af injektionspræparater til intramuscular, subcutan 25 eller intravenøs administration.

a) Et gonadoliberinderivat med formlen I opløses i destilleret vand, i fysiologisk saltopløsning eller pufret vandig opløsning i en koncentration på 1-10 mg/ml. Opløsningen sterilfiltreres, og små portio-

DK 164875B

23 ner indeholdende 50-500 pg aktiv bestanddel fyldes i ampuller og lyofiliseres, hvorefter ampullerne forsegles. Indholdet af aktiv bestanddel i ampullerne opløses umiddelbart før behandlingen ved tilsætning af 1-10 ml destilleret vand, og der administreres et 5 rumfang svarende til den ønskede dosis.

b) 20-500 pg/ml af et gonadoliberinderivat med formlen I opløses i en vandig opløsning indeholdende 0,9% NaCl og 0,9% benzylalkohol. Portioner indeholdende 20-500 pg/ml aktiv bestanddel fyldes i ampuller, som derefter forsegles. De vundne opløsninger kan injiceres direkte.

10 EKSEMPEL 9

Induceret kunstig formering af sterlet (Acipenser ruthenus L.)

Fra en population i givne omgivelser udvælges modne fisk, som derefter transporteres til formeringsstedet. Kønnene adskilles, og modningstrinet for æggene for hunfiskene bestemmes. Fiskene anses for 15 at være modne til ægløsning, hvis kernen er beliggende på periferien af ægcellen. Sperma fra hanfisk undersøges ikke, da kønsprodukterne fra han- og hunfisk i populationen fra givne omgivelser er praktisk talt på samme modnings trin. Hvis fisk er modne til ægløsning, injiceres decapeptid med den almene formel I i en enkelt dosis på 70 pg 20 hver i hver fisk, herunder hanfiskene.

Hvis fiskene ikke er modne til ægløsning, bør de holdes ved den naturlige gydningstemperatur, og den ovenfor nævnte forbindelse bør administreres i doser på 10 pg hver, i det mindste 2, men højst 12 gange, så længe kernen fjerner sig fra centrum til periferien. An-25 tallet af behandlinger afhænger af det faktiske modningstrin af kønsprodukterne i sammenligning med trinet "modent til ægløsning".

Denne modningsproces varer mindst 100, men højst 630 graddage i temperaturområdet 12-18°C (graddage betegner antallet af dage multipliceret med gennemsnitstemperaturen af det vand, som anvendes i 30 modningsperioden).

Claims

1. Gonadoliberinderivater med den almene formel I

2. Gonadoliberinderivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er valgt fra gruppen bestående af Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gin-Pro-Gly-NH2,

20 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-Gly-NH2» Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Pro-EA, Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Phe-Gln-Pro-Gly-NH2> Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Phe-Leu-Pro-Gly-NH2, Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-EA og 25 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Gln-Pro-EA og terapeutisk anvendelige salte og complexer deraf.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af gonadoliberinderivater med den almene formel I Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X^-X2-X3-Pro-X4 I DK 164875 B hvor Xi D-Phe.Gly, X2 betegner en L-aminosyregruppe med 1-4 carbonatomer i sidekæden, L-phenylalanyl eller L-tryptophyl,

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, a), kendetegnet ved, at der som fast bærestof anvendes benz-hydrylamin- eller Boc-prolin-harpiks.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, a), 30 kendetegnet ved, at det beskyttede peptid spaltes fra harpiksen ved behandling med hydrogenfluorid og/eller ved ethylam-monolyse. DK 164875 B

5 X3 betegner en L-aminosyregruppe med en ^-alkyl- eller C2 ^-alkanoylamidsidekæde, og X4 betegner en glycinamid- eller ^-alkylamidgruppe, med den begrænsning, at hvis betegner en anden gruppe end glycyl, og X2 betegner en tryptophylgruppe, da kan X3 ikke være leucyl, 10 eller terapeutisk anvendelige syreadditionssalte og complexer deraf, kendetegnet ved, at a) der anvendes en fastfase-peptidsyntese, hvor de relevant beskyttede aminosyrer i den nødvendige sekvens kobles til et fast polymerbærestof ved hjælp af carbodiimid eller aktiv ester og, i et givet 15 tilfælde, det færdige peptid spaltes fra bærestoffet ved acidolyse eller aminolyse, og aminosyrebeskyttelsesgrupperne fjernes fra pepti-det samtidig med, eller, om ønsket, før eller efter fraspaltning af peptidet fra polymerbærestoffet, eller b) det ønskede slutprodukt bygges op fra velegnede beskyttede amino-20 syrer ved anvendelse af en passende kombination af fragmentkondensation og trinvis syntese, alt afhængig af de forskellige aminosyrekom-ponenters kemiske karakter hvorpå aminosyrebeskyttelsesgrupperne fjernes og det dannede peptid med formlen 1, om ønsket, omdannes til et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt eller et metalcomplex 25 deraf.

5 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X^-X2-X3*Pto-X^ I hvor X^ D-Phe,Gly, X2 betegner en L-aminosyregruppe med 1-4 carbonatomer i sidekæden, L-phenylalanyl eller L-tryptophyl,

10 X3 betegner en L-aminosyregruppe med en ^-alkyl- eller ^-alkanoylamidsidekæde, og X4 betegner en glycinamid- eller ^-alkylamidgruppe, med den begrænsning, at hvis X^ betegner en anden gruppe end glycyl, og X2 betegner en tryptophylgruppe, da kan X3 ikke være leucyl, 15 og additionssalte dannet med terapeutisk anvendelige syrer og com-plexer deraf.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3, b), kendetegnet ved, at et pentapeptidazid med formlen II Glp-His-Trp-Ser-Tyr-N3 II kondenseres med et tetra- eller peptapeptid med den almene formel III 5 X1-X2-X3-Pro-X4 III hvor X^, X2, X3 og X4 har den i krav 1 anførte betydning.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 3, b), kendetegnet ved, at et hexapeptidazid med den almene formel IV

10 Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X^-N3 IV kondenseres med et tri- eller tetrapeptid med den almene formel V X2-X3-Pro-X4 V hvor Xj_, X2, X3 og X4 har den i krav 1 angivne betydning.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 3, b), 15 kendetegnet ved, at et heptapeptidazid med den almene formel VI Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-N3 VI kondenseres med et di- eller tripeptid med den almene formel VII X3-Pro-X4 VII 20 hvor X^, X2, X3 og X4 har den i krav 1 angivne betydning.

9. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det som aktiv bestanddel indeholder mindst én forbindelse med den almene formel I, hvor X^, X2, X3 og X4 DK 164875 B har den i krav 1 anførte betydning, eller et farmaceutisk tolerabelt salt eller complex deraf sammen med et bærestof eller fortyndings-middel.