FI83660C - Foerfarande foer framstaellning bukspottskoertelns grf hos maenniskan. - Google Patents

Description

1 83660

Menetelmä ihmisen haiman GRF:n valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää farmaseuttista aktiivisuutta omaavien peptidien valmistamiseksi, joilla on 5 kaava (I): H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu- D-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-

Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH2 10 tai C-terminaalisesti päästä lyhennetyn, vähintään 27 aminohappoa pitkän muunnoksen valmistamiseksi.

Peptideillä on vaikutusta ihmisten ja muiden eläinten, erityisesti nisäkkäiden aivolisäkkeen toimintaan.

15 Erityisesti tässä esitetään peptidejä, jotka edistävät ai volisäkkeen toimesta tapahtuvaa kasvuhormonin vapauttamista.

Fysiologit ovat pitkään tienneet, että hypothalamus säätelee kaikkia aivolisäkkeen etulohkon eritystoimintoja 20 tuottamalla erityisiä polypeptidejä, jotka laukaisevat kunkin aivolisäkehormonin erityksen. Estotekijä karakterisoitiin aikaisemmin somatostatiinin, joka estää kasvuhormonin (GH) eritystä, muodossa.

Vastaavaa, hypothalamuksen aivolisäkkeen GH:a va-25 pauttavaa tekijää etsittiin pitkään, ja vuonna 1982 ihmisen haimakasvaimesta valmistetusta uutteesta eristettiin, puhdistettiin, karakterisoitiin, syntetisoitiin ja testattiin polypeptidi, joka edistää aivolisäkkeen toimesta tapahtuvaa GH:n vapautumista. Tämän, 40 aminohappotähteestä 30 koostuvan peptidin kaava on seuraava: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-OH.

2 8 3 6 60

Peptidistä käytetään jäljempänä merkintää hpGRF (human pancreatic tumor GH releasing factor). Eräästä toisesta kasvaimesta eristettiin tämän peptidin 44 tähteestä koostuva amidoitu muunnos, joka sisälsi C-pääteasemassa 5 fragmentin Arg-Ala-Arg-Leu.

On havaittu, että hpGRF:n synteettisillä peptidi-analogeilla, joissa D-Ala on korvannut 15-asemassa olevan glysiinitähteen, on täysi hpGRF:lie ominainen biologinen aktiivisuus ja suurentunut vastustuskyky kehossa tapahtu-10 van entsymaattisen hajoamisen suhteen, mikä pienentää bio logisen vaikutuksen kestoa. Lisäksi on yllättäen havaittu, että hpGRF:n kahdella fragmentilla, jotka käsittävät vastaavasti 29 N-terminaalista tähdettä tai 32 N-terminaalis-ta tähdettä C-pääteaseman ollessa amidoitu, on yhtä voima-15 kas biologinen vaikutus kuin alkuperäisellä, 40 tähteestä koostuvalla peptidillä.

Tässä esitetään myös synteettisiä hpGRF-fragmentteja, jotka koostuvat korkeintaan 32 tähteestä ja joiden C-pääteasema on amidoitu ja jotka sisältävät N-terminaalisen 20 peptidijakson ja riittävästi lisätähteitä biologisen vai kutuksen aikaansaamiseksi.

Tässä kuvatut farmaseuttiset koostumukset sisältävät sellaisia hpGRF:n analogeja tai niiden biologisesti aktiivisia amidoituja fragmentteja tai edellä mainittujen 25 myrkytöntä suolaa dispergoituna farmaseuttisesti hyväksyt tävään, nestemäiseen tai kiinteään kantaja-aineeseen. Koostumuksia voidaan käyttää kliinisessä lääketieteessä sekä ihmis- että eläinlääketieteessä terapeuttisiin tarkoituksiin annettaviksi sekä myös diagnostisesti.

30 Peptidien määrittelyyn käytettävä nimistö on teok- . .. sessa Schröder ja Liibke; "The Peptides", Academic Press (1965), määritelty; jossa nimistössä tavanomaisen esitystavan mukaisesti N-pääteasemassa oleva aminoryhmä esiintyy vasemmalla ja C-pääteasemassa oleva karboksyyliryhmä '3.5 esiintyy oikealla. Siinä tapauksessa, että aminotähteellä on isomeerisiä muotoja, tarkoitettava muoto on aminohapon L-muoto, ellei toisin ole nimenomaisesti ilmoitettu.

Il 3 83660 Tässä kuvataan synteettisiä hpGRF-peptidejä, joilla on seuraava kaava: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-5 D-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-

Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH2.

Myös edellä mainittujen peptidien fragmenteilla on biologista vaikutusta.

10 Peptidit syntetisoidaan jollakin sopivalla menetel mällä, kuten yksinomaan kiinteäfaasitekniikalla, osaksi kiinteässä faasissa toteutettavalla tekniikalla, fragmenttien kondensaatiolla, klassisin liuosliittämismenetelmin tai soveltamalla hiljattain kehitettyä yhdistelmä-DNA-tek-15 niikkaa fragmentteihin, jotka sisältävät ainoastaan L-iso- meeritähteitä. Esimerkiksi yksinomaan kiinteässä faasissa toteutettavan synteesin tekniikka esitetään oppikirjassa "Solid Phase Peptide Synthesis", Stewart & Young, Freeman & Co., San Francisco (1969), ja siitä esitetään esimerk-20 kejä US-patenttijulkaisussa 4 105 603 (Vale et ai.); 8.

elokuuta 1978. Synteesimenetelmästä, joka käsittää fragmenttien kondensaation, esitetään esimerkkejä US-patentti-julkaisussa 3 972 859; 3. elokuuta 1976. Muista käyttökelpoisista synteeseistä esitetään esimerkkejä US-patentti-25 julkaisuissa 3 842 067; 15. lokakuuta 1974, ja 3 862 925; 28. tammikuuta 1975.

Esillä olevan keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että a) muodostetaan yhdiste, joka sisältää vähintään 30 yhden suojaryhmän ja jolla on kaava (II)

Xx-Tyr( X2) -Ala-Asp( X3) -Ala-Ile-Phe-Thr (X4) -Asn( X5) -Ser (X4) -Tyr (X2) -Arg( X6) -Lys( X7) -Val-Leu-D-Ala-Gln( X5) -Leu-Ser (X4 ) -Ala-Arg( X6 )-Lys( X7)-Leu-Leu-Gln( X5)-Asp( X3 ) - Ile-Met-Ser (X4) -35 Arg( X6) -Gln( X5) -Gln( X5) -Gly-Glu( X3) -Ser (X4 )-Asn( X5) -Gln( X5) -

Glu (X3) - Arg (X6)-Gly-Ala-X8 4 83660 tai C-terminaalisesta päästä tarkoituksenmukaisesti lyhennetty muunnos siitä, jossa kaavassa X1 on vety tai α-aminoryhmää suojaava ryhmä; X2 on vety tai Tyr;n fenolihydroksyyliryhmää suojaava ryh-5 mä; X3 on vety tai Aspin tai Gluin karboksyyliryhmää suojaava ryhmä; X4 on vety tai Serin tai Thrin alkoholihydroksyyliryhmää suoj aava ryhmä; 10 X5 on vety tai Asm n tai Ginin sivuketjun amidoryhmää suo- jaava ryhmä; X6 on vety tai Argin guanidinoryhmää suojaava ryhmä; X7 on vety tai Lysin sivuketjun aminoryhmää suojaava ryhmä; ja 15 X8 on hartsikantaja; liittämällä järjestyksessä suojatut aminohapot suhteessa noin 1 millimooli suojattua aminohappoa 1 grammaa sopivassa liuottimessa, edullisesti metyleenikloridissa tai dime-tyyliformamidissa tai niiden seoksessa olevaa hartsia koh-20 ti; ja b) suojaryhmät poistetaan ja peptidi irrotetaan hartsikantajasta käyttämällä TFAita sopivassa liuottimessa ja sen jälkeen käyttämällä HFia alhaisessa lämpötilassa, minkä jälkeen peptidi liuotetaan sopivaan liuottimeen ja 25 puhdistetaan tunnetuilla menetelmillä.

Kemiallisille eli liittämissynteeseille on yhteistä eri aminohappo-osien labiilien sivuketjuryhmien suojaaminen soveltuvilla suojaryhmillä, jotka estävät kemiallista reaktiota tapahtumasta kyseisessä asemassa siihen asti, 30 kunnes ryhmä lopulta poistetaan. Tavallisesti yhteistä on myös aminohapon tai fragmentin α-aminoryhmän suojaaminen siksi aikaa, kun kyseisen yksikön karboksyyliryhmä reagoi, jonka jälkeen α-aminoryhmän suojaryhmä poistetaan selektiivisesti, jotta kyseisessä asemassa voi tapahtua reaktio 35 myöhemmin. Niinpä on yleistä, että yhtenä vaiheena synteesiä saadaan aikaan välituoteyhdiste, jossa kukin aminohap- li 5 83660 potähde sijaitsee halutulla paikallaan peptidiketjussa si-vuketjuryhmien suojaryhmien ollessa liittyneinä asianmukaisiin tähteisiin.

Sellaisia α-aminoryhmän suojaryhmiä, joita X1 voi 5 tarkoittaa, ovat ryhmät, joiden tiedetään olevan käyttö kelpoisia polypeptidien vaiheittaisessa syntetisoinnissa. X*:n tarkoittamien α-aminoryhmän suojaryhmien kategorioita ovat: 1) asyylityyppiset suojaryhmät, kuten formyyli, trifluori- 10 asetyyli, ftalyyli, tolueenisulfonyyli (Tos), bentseeni- sulfonyyli, nitrofenyylisulfenyyli, trityylisulfenyyli, o-nitrofenoksiasetyyli, klooriasetyyli, asetyyli ja ^-kloo-ributyyli; 2) aromaattiset uretaanityyppiset suojaryhmät, kuten bent- 15 syylioksikarbonyyli (Z) ja substituoitu Z, kuten p-kloori- bentsyylioksikarbonyyli, p-nitrobentsyylioksikarbonyyli, p-bromibentsyylioksikarbonyyli ja p-metoksibentsyylioksi-karbonyyli; 3) alifaattiset uretaanisuojaryhmät, kuten t-butyylioksi- 20 karbonyyli (BOC), di-isopropyylimetyylioksikarbonyyli, isopropyylioksikarbonyyli, etoksikarbonyyli ja allyyliok-sikarbonyyli; 4) sykloalkyyliuretaanityyppiset suojaryhmät, kuten syk-lopentyylioksikarbonyyli, adamantyylioksikarbonyyli ja 25 sykloheksyylioksikarbonyyli; 5) tiouretaanityyppiset suojaryhmät, kuten fenyylitiokar-bonyyli; 6) alkyylityyppiset suojaryhmät, kuten trifenyylimetyyli (trityyli) ja bentsyyli; ja 30 7) alkyylisilaaniryhmät, kuten trimetyylisilaani.

Edullinen α-aminoryhmän suojaryhmä on BOC.

X2 on Tyr:n fenolihydroksyyliryhmän suojaryhmä ja se voi olla tetrahydropyranyyli, t-butyyli, trityyli, Bzl, CBZ, 4Br-CBZ tai 2,6-diklooribentsyyli (DCB). Edullinen 6 83660 suojaryhmä on 2,6-diklooribentsyyli. X2 voi olla vety, mikä merkitsee sitä, että hydroksyyliryhmässä ei ole suojaryh-mää.

X3 on vety tai esterin muodostava, Asp:n tai Glu:n 5 karboksyyliryhmän suojaryhmä, joka voi olla bentsyyli (OBzl), 2,6-diklooribentsyyli, metyyli tai etyyli.

X4 on Thr:n tai Ser:n hydroksyyliryhmän suojaryhmä ja se voi olla asetyyli, bentsoyyli, t-butyyli, trityyli, tetrahydropyranyyli, Bzl, 2,6-diklooribentsyyli tai CBZ. 10 Edullinen suojaryhmä on Bzl. X4 voi olla vety, mikä merkit see sitä, että hydroksyyliryhmässä ei ole suojaryhmää.

X5 on vety tai Asn:n tai Gin:n sivuketjuaminoryhmän suojaryhmä, ja se on edullisesti ksantyyli (Xan).

X6 on Arg:n guanidinoryhmän suojaryhmä, joka voi 15 olla nitro, Tos, CBZ, adamantyylioksikarbonyyli tai BOC, tai vety.

X7 on vety tai Lys:n sivuketjuaminoryhmän suojaryhmä. Esimerkkejä soveltuvista sivuketjuaminoryhmän suoja-ryhmistä ovat 2-klooribentsyylioksikarbonyyli (2C1-Z), 20 Tos, t-amyylioksikarbonyyli ja BOC.

Met voidaan suojata vaihtoehtoisesti hapella, mutta edullisesti se jätetään suojaamatta.

Sivuketjuaminoryhmän suojaryhmän valinta ei ole ratkaisevaa, paitsi että sen täytyy olla sellainen ryhmä, 25 joka ei irtoa α-aminoryhmien suojausta poistettaessa syn teesin aikana. Tästä syystä α-aminoryhmän suojaryhmän ja sivuketjuaminoryhmän suojaryhmän ei pitäisi olla samoja.

X8 on -NH-hartsikantaja, jolla esim voi olla kaavat: -NH-bentshydryyliamiini(BHA)hartsialusta ja -NH-parametyy-30 libentsyhydryyliamiini(MBHA)hartsialusta. Substituoitua amidia haluttaessa BHA- tai MBHA-hartsin käyttö on edullista; irrotus antaa suoraan tuotteeksi amidin. N-metyyli-amidia haluttaessa se voidaan tuottaa suoraan N-metyyli-BHA-hartsista.

ti 7 83 660

Peptidien synteesissä käytettävää määrättyä sivu-ketjun suojaryhmää valittaessa noudatetaan seuraavia sääntöjä: a) suojaryhmän täytyy säilyttää suojausominaisuutensa eikä 5 se saa irrota liittämisreaktion olosuhteissa; b) suojaryhmän pitäisi olla stabiili reagenssia kohtaan ja, Xan:ia lukuunottamatta, stabiili niissä reaktio-olosuhteissa, joita käytetään kussakin synteesivaiheessa α-aminoryhmän suojaryhmän poistamiseksi; ja 10 c) sivuketjun suojaryhmän täytyy olla poistettavissa halu tun aminohappojärjestyksen sisältävän synteesin päätyttyä sellaisissa reaktio-olosuhteissa, jotka eivät muuta pepti-diketjua.

Peptidit valmistetaan edullisesti käyttämällä kiin-15 teäfaasisynteesiä, kuten esim. sellaista, jonka Merrifield on esittänyt [J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), s. 2149], vaikka myös muita vastaavia alalla tunnettuja kemiallisia synteesejä voidaan käyttää. Kiinteäfaasisynteesi aloitetaan peptidin C-terminaalisesta päästä liittämällä suojattu 20 α-aminohappo soveltuvaan hartsiin. Sellainen, 40 tähteestä koostuvan peptidin valmistukseen soveltuva lähtöaine voidaan valmistaa kiinnittämällä Ala, jonka α-aminoryhmä on suojattu, esterisidoksella kloorimetyloituun hartsiin tai hydroksimetyylihartsiin tai amidisidoksella BHA-hartsiin.

2.5 BHA- ja MBHA-hartsialustoja on kaupallisesti saatavissa ja niitä käytetään yleensä vain halutun syntetisoitavan polypeptidin sisältäessä C-pääteasemassa substituoimatto-man amidin. Jos syntyvään polypeptidiin on määrä sisällyttää metyyli-, etyyli- tai propyyliamidi, käytetään kloori-30 metyloitua tai hydroksimetyylihartsia ja irrotus toteutetaan edullisesti käyttämällä sopivaa amiinia, esimerkiksi etyyliamiinia.

B0C:lla suojattu Ala voidaan liittää kloorimetyloituun hartsiin julkaisussa Monahan ja Cillon; Biopolymer 12 35 (1973), ss, 2513 - 2519, esitettyä menettelytapaa noudat- 8 8 3 6 60 taen. Sen jälkeen kun BOC-Ala on kiinnitetty hartsialus-taan, α-aminoryhmän suojaryhmä poistetaan esimerkiksi käyttämällä trifluorietikkahappoa (TFA) metyleenikloridis-sa, pelkkää TFA:a tai HCl:a dioksaanissa. Suojauksen pois-5 to toteutetaan noin 0 °C:n ja huoneen lämpötilan välillä olevassa lämpötilassa. Muita tavanomaisia tarkoin määrättyjen α-aminoryhmien suojaryhmien poistamiseen soveltuvia lohkaisureagensseja ja -olosuhteita voidaan käyttää, kuten Schröder ja Liibke ovat kuvanneet teoksessa "The Peptides" 10 1, (Academic Press, 1965), ss. 72 - 75.

Phe:n α-aminoryhmän suojaryhmän poistamisen jälkeen loput aminohapot, joiden α-aminoryhmät ja sivuketjut on suojattu, voidaan liittää vaiheittain halutussa järjestyksessä, jolloin saadaan edellä määritelty välituoteyhdiste, 15 tai vaihtoehtona kunkin aminohapon sisällyttämiselle erik seen synteesiin, jotkut niistä voidaan yhdistää toisiinsa ennen lisäämistä kiinteäfaasireaktoriin. Sopivan liittävän reagenssin valinta on alalla tunnettua. Erityisen sopiva liittävä reagenssi on N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidi 20 (DCCI).

Peptidien kiinteäfaasisynteesissä käytettävät aktivoivat reagenssit ovat peptidialalla tunnettuja. Esimerkkejä soveltuvista aktivoivista reagensseista ovat karbodi-imidit, kuten N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidi ja N-etyy-25 li-N'-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidi. Muita akti voivia reagensseja ja niiden käyttöä liittämisreaktioissa peptidisynteeseissä kuvaavat Schröder ja Liibke, supra, luku III, ja Kapoor; J. Pharm. Sei., 59 (1970), ss. 1 - 27.

Kutankin suojattua aminohappoa tai aminohappoketjua 30 lisätään kiinteäfaasireaktoriin noin nelinkertainen tai sitä suurempi ylimäärä ja liittäminen voidaan toteuttaa dimetyyliformamidia (DMF) ja CH2Cl2:a (suhteessa 1:1) sisältävässä väliaineessa tai pelkässä DMF:ssa tai CH2Cl2:ssa. Niissä tapauksissa, jolloin tapahtuu epätäydel-35 linen liittyminen, liittymismenettely toistetaan ennen

II

9 83660 kuin a-aminoryhmän suojaryhmä poistetaan ennen seuraavan aminohapon liittämistä. Liittämisreaktion onnistumista synteesin kussakin vaiheessa seurataan ninhydriinireaktion avulla, kuten E. Kaiser et ai. [Anal. Biochem. 34 (1970), 5 s. 595] ovat kuvanneet. Liittämisreaktiot voidaan toteut taa automaattisesti, esimerkiksi automaattisella Beckman 990-syntetisointilaitteella, käyttäen esimerkiksi sellaista ohjelmaa, jota selostetaan artikkelissa Rivier et ai., Biopolymers 17 (1978), ss. 1927 - 1938.

10 Sen jälkeen kun haluttu aminohappoketju on saatu valmiiksi, välituotepeptidi voidaan irrottaa hartsialus-tasta käsittelemällä jollakin reagenssilla, kuten nestemäisellä vetyfluoridilla, joka ei pelkästään irrota peptidiä hartsista, vaan lohkaisee myös kaikki jäljellä olevat 15 sivuketjujen suojaryhmät X2, X3, X4, X5, X6 ja X7 kiinnittä vän sidoksen X8 sekä α-aminoryhmän suojaryhmän X1, jolloin saadaan peptidi vapaana happona. Haluttaessa esimerkiksi etyyliamidia, peptidi voidaan irrottaa käsittelemällä kuivalla etyyliaminolla. Koska Met on mukana ketjussa, BOC-20 suojaryhmä lohkaistaan edullisesti ensimmäiseksi trifluo- rietikkahappoa (TFA) ja etaaniditiolia käyttäen ennen peptidin irrottamista hartsista HFrlla, jotta vältetään mahdollinen S-alkyloituminen. Käytettäessä irrottamiseen HF: a reaktioastiassa on mukana anisolia ja metyylietyylisulfi-25 dia radikaalien vastaanottamiseksi.

Seuraava esimerkki osoittaa edullisen menetelmän hpGRF:n syntetisoimiseksi kiinteäfaasitekniikalla. On luonnollisesti huomattava, että vastaavasti lyhyemmän peptidi fragmentin synteesi toteutetaan samalla tavalla pel-30 kästään jättämällä ketjun jommasta kummasta päästä pois • · vaadittava määrä aminohappoja; nykyisin ollaan kuitenkin sitä mieltä, että biologisesti aktiivisten fragmenttien pitäisi sisältää N-terminaalisessa päässä ilmoitettu jak-so.

10 83660

Esimerkki I

[D-Ala15]-hpGRF( 1 - 40)-NH2:n, jolla on kaava: H-Tyr-AIa-Asp-AIa-1le-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-5 Leu-D-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-

Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH2 synteesi toteutetaan vaiheittain Beckman 990 Peptide Syn-thesizer-laitetta käyttäen MBHA-hydrokloridihartsilla, 10 jonka substituutioaste on noin 0,1 - 0,5 mmol/g hartsia (jota on saatavissa esim. Bachem Inc.rsta). B0C-Ala:n liittäminen hartsiin toteutetaan jäljempänä taulukoissa A ja B esitettyä yleistä menettelytapaa noudattaen, jota menettelytapaa käytetään läpi koko synteesin, ja se johtaa 15 substituutioasteeseen, joka on noin 0,35 mmol Ala/g hart sia. Kaikista käytettävistä liuottimista poistetaan kaasu huolellisesti hajottamalla ne pisaroiksi inertin kaasun, esimerkiksi heliumin tai typen kanssa hapen (joka saattaisi hapettaa epätoivottavalla tavalla Met-tähteen rikin) 20 poissaolon varmistamiseksi.

Suojauksen poiston ja neutraloinnin jälkeen pepti-diketju rakennetaan vaihe kerrallaan hartsilla. Suojauksen poisto, neutralointi ja kunkin aminohapon lisääminen tehdään yleensä US-patenttijulkaisussa 4 292 313 (Vale et 25 ai.) yksityiskohtaisesti esitettyä menettelytapaa noudat taen.

Suojauksen poisto toteutetaan edullisesti seuraavan taulukon A mukaisesti:

II

11 83660

Taulukko A

_Reagenssl_Sekoltusaika (min) 1. 60 % TFA/2 % etaaniditioli 10 2. 60 % TFA/2 % etaaniditioli 15 5 3. IPA/1 % etaaniditioli 0,5 4. Et3N (10 %) CH2C12:ssa 0,5 5. MeOH 0,5 6. Et3N (10 %) CH2C12:ssa 0,5 7. MeOH (kahdesti) 0,5 10 8. CH2C12 (kahdesti) 0,5

Liittämiset toteutetaan edullisesti seuraavassa taulukossa B esitetyllä tavalla: 15

Taulukko B

_Reagenssi_Sekoitusaika (min)

9. DCCI

10. BOC-aminohappo 50-90 20 11. MeOH (kahdesti) 0,5 12. CH2C12 (kahdesti) 0,5 13. Ac20 (3 M) CH2C12: ssa 15,0 14. CH2C12 0,5 15. MeOH 0,5 25 16. CH2C12 (kahdesti) 0,5

Lyhyesti esitettynä: 1-2 mmol BOC:llä suojattua aminohappoa metyleenikloridissa käytetään 1 grammaa kohti 30 hartsia sekä 1 ekvivalentti 1,0 M DCCI:ä metyleenikloridissa, sekoitusajan ollessa 2 tuntia. Kun BOC-Arg(TOS) liitetään, käytetään 50 % DMF:a ja 50 % metyleenikloridia sisältävää seosta. Bzl-eetteriä käytetään Ser:n ja Thr:n hydroksyylisivuketjun suojaryhmänä. Asn:n tai Gin:n karb-35 oksyylipään aktivointiin käytetään p-nitrofenyyliesteriä (ONp), ja esimerkiksi BOC-Asn(ONp) liitetään yön yli se- i2 83 660 koittaen ja käyttäen 1 ekvivalentti HOBt:a seoksessa, joka sisältää 50 % DMF:a ja 50 % metyleenikloridia, jossa tapauksessa DCC:ä ei lisätä ollenkaan. Aktiivisen esterin käytön sisältävän menetelmän asemesta DCC-liittämistä käy-5 tettäessä Asn:n tai Gin:n amidoryhmä suojataan Xan:lla.

2C1-Z:a käytetään Lys:n sivuketjun suojaryhmänä. Tosia käytetään suojaamaan Arg:n guanidinoryhmä ja Glu:n tai Aspin karboksyyliryhmä suojataan OBzlinä. Tyrin fenolihyd-roksyyliryhmä suojataan DCBillä. Synteesin lopussa saadaan 10 seuraava koostumus: X3-Tyr ( X2) -Ala-Asp( X3) -Ala-Ile-Phe-Thr (X4) -Asn( X5) -Ser (X4) -Tyr( X2) - Arg (X6) -Lys (X7) -Val-Leu-D-Ala-Gln( X5) -Leu-Ser (X4) -Ala-Arg( X6) -Lys (X7) -Leu-Leu-Gln( X5) -Asp( X3) -Ile-Met-Ser (X4) -15 Arg( X6) -Gln( X5) -Gln( X5) -Gly-Glu( X3) -Ser (X4 ) -Asn( X5) -Gln( X5) -

Glu( X3) -Arg( X6) -Gly-Ala-X8 jossa X1 on BOC, X2 on DCB, X3 on bentsyyliesteri, X4 on Bzl, X5 on Xan, X6 on Tos, X7 on 2C1-Z ja X8 on -NH-hartsi-20 alusta. Xan voi olla osaksi tai kokonaan poistettu TFA- käsittelyllä, jota käytetään α-aminoryhmän suojaryhmän poistamiseen.

Sen jälkeen kun viimeinen Tyr-tähde on liitetty hartsiin, BOC poistetaan 60 % TFAia sisältävällä 25 CH2Cl2:lla. Peptidin irrottamiseksi hartsista ja loppujen suojaryhmien poistamiseksi peptidi-hartsia käsitellään 1,5 mlilla anisolia, 0,5 ml:11a metyylietyylisulfidia ja 15 mlilla HF:a 1 grammaa kohti peptidi-hartsia 1,5 tuntia -20 °C:ssa ja 1,5 tuntia 0 °C:ssa. Sen jälkeen kun HF on 30 poistettu suuressa alipaineessa, hartsi/peptidi-jäännös pestään vuorotellen kuivalla dietyylieetterillä ja kloroformilla ja sen jälkeen peptidi uutetaan etikkahapon 2 N vesiliuoksella, jolle on tehty kaasunpoistokäsittely, ja erotetaan hartsista suodattamalla.

li i3 8 3 6 60

Irrotettu peptidi, josta suojaukset on poistettu, liuotetaan sitten 0 - 5-%:iseen etikkahappoon ja puhdistetaan, joka puhdistus voi sisältää Sephades^ G-50-hienogee-lisuodatuksen.

5 Peptidi puhdistetaan sitten edelleen preparatiivi- sen tai puolipreparatiivisen HPLCrn avulla, kuten Rivier et ai. [Peptides: Structure and Biological Function (1979), ss. 125 - 128] ja Marki et ai. [J. Am. Chem. Soc. 103 (1981), s. 3178] ovat kuvanneet. Lyhyesti kuvattuna: 10 Waters Associates prep LC-500:aan soveltuvat patruunat täytetään Vydac:n 15 - 18 C18-Silica: 11a (300 A). Kehitetään CH3CN:n gradientti TEAP:ssa alhaisella paineella toimivalla Eldex-gradientinmuodostajalla, kuten artikkelissa J. Rivier; J. Liq. Chromatography 1 (1978), ss. 343 - 367, 15 on kuvattu. Kromatografiajakeita seurataan tarkasti HPLC:n avulla ja ainoastaan suurin piirtein puhtaat jakeet yhdistetään. Suolan poisto puhdistetuista jakeista, joiden puhtaus on tarkistettu erikseen, toteutetaan käyttämällä CH3CN:n gradienttia 0,l-%:isessa TFA:ssa. Sen jälkeen kes-20 kijae kylmäkuivataan, jolloin saadaan haluttua peptidiä, jonka puhtausaste voi olla yli 98 %.

Esimerkki II

[D-Ala15]-hpGRF( 1 - 32)-NH2:n, jolla on kaava: 25 H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu- D-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-NH2

synteesi toteutetaan vaiheittain Beckman 990 Peptide Syn-30 thesizer-laitetta käyttäen MBHA-hartsilla esimerkissä I

kuvatulla tavalla, jolloin saadaan 149 mg peptidiä, jonka päätellään TLC:a ja HPLC:a käyttämällä olevan 96,5-%:ises-ti puhdas ja jonka optinen kierto [a]D = -57,9°.

i4 83 660

Esimerkki III

[D-Ala15]-hpGRF( 1 - 39)-NH2:n, jolla on kaava: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-5 D-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-

Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-NH2 synteesi toteutetaan vaiheittain Beckman 990 Peptide Syn-thesizer-laitetta käyttäen MBHA-hartsilla esimerkissä I 10 kuvatulla tavalla.

BOC-Gly liitetään 2 g:aan hartsia. B0C:n poistamisen jälkeen saadaan 3,4 g suojattua peptidihartsia. Irrotettua peptidiä, josta suojaukset on poistettu ja jota on puhdistettu, saadaan noin 1,62 g. Patruunat täytetään Vy-15 dac:n 17 μ:η silikalla. Keskijakeen kylmäkuivauksen jäl keen saadaan 107 mg haluttua peptidiä, jonka puhtausaste on TLC:a ja HPLC:a käyttäen noin 100 % ja jonka optinen kierto [ctjD = -56,3°.

Esimerkissä I valmistettua synteettistä peptidiä 20 verrataan in vitro-kokeissa puhdistettuun luonnon hpGRF:ään ja sillä havaitaan olevan samanlaiset tehot, mitä tulee GH:n eritykseen, ja samanlaiset luonteenomaiset aktiivisuudet.

Jotta saadaan määritetyksi erilaisten synteettisten 25 peptidien kyky edistää kasvuhormonin vapautusta, suorite taan in vitro-kokeita käyttäen synteettistä hpGRF(l - 40)-0H:a standardina (koska se vastaa luonnon peptidiä) rin-nakkaisvertailussa erilaisten muiden syntetisoitujen analogien ja fragmenttien ekvivalenttisiin moolisiin pitoi-30 suuksiin.

Käytetään viljelmiä, jotka sisältävät noin 4-5 vrk aikaisemmin poistettuja rottien aivolisäkkeiden soluja. Viljelmiä, joita pidetään ihanteellisina kasvuhormonin eritykselle, käytetään vertailukokeessa artikkelissa Vale 35 et ai.; Endocrinology 91 (1972), ss. 562 - 572, kuvatulla yleisellä tavalla. Inkubointia tutkittavan aineen kanssa li 15 83660 suoritetaan 3-4 tuntia ja yhtä suuret määrät viljelyvä-liainetta poistetaan ja käsitellään niiden sisältämien im-munoreaktiivisen GH:n määrien mittaamiseksi hyvin tunnettua radioimmunologista määritystä käyttäen.

5 Tämän, ekvivalenttisten moolisten pitoisuuksien vertailutestin tulokset esitetään taulukossa I.

Taulukko I

10 _Peptidi_Vertallu-%

hpGRF(1 - 40)-OH

(tässä kokeessa käytettävä standardi) 100 hpGRF(1 - 40)-NH2 110 hpGRF(1 - 32)-NH2 140 15 hpGRF(1 - 29)-NH2 230 hpGRF(1 - 29)-OH2 29 hpGRF(1 - 27)-NH2 20 20 Näiden synteettisten peptidien in vitro-testi osoittaa, että EC50 vaihtelee välillä 20 - 100 pmol/1 ja alhaisin vaikuttava pitoisuus on 3 - 8 pmol/1. Suurin vaikuttava pitoisuus hpGRF(l - 40)-NH2:lle oli noin 1 nmol/1.

Kasvuhormonin eritystä mittaavien in vitro-kokeiden ' 25 lisäksi suoritetaan myös in vivo-kokeita ruiskuttamalla jatkuvasti paikallaan olevan katetrin kautta vapaasti juokseviin normaaleihin urosrottiin synteettistä peptidiä. Eläimet esikäsitellään FLA-63:lla, dopamiinihydroksylaasi-inhibiittorilla, joka tukahduttaa luonnostaan tapahtuvan 30 GH:n erityksen vaikuttamatta ulkopuolisen GRF:n aikaansaa maan vasteeseen. Verinäytteet otetaan saman katetrin kautta välittömästi ennen ruiskeita ja 5 sekä 20 minuuttia ruiskeiden jälkeen. Veren GH-tasot mitataan radioimmunologista määritystä käyttäen. Tulokset osoittavat, että syn-35 teettinen hpGRF(l - 40)-NH2 ja muut analogit ovat voimak kaita aivolisäkkeen GH:n erityksen kiihdyttäjiä.

16 83660

Annosten, jotka olivat noin 40 ng:n ja noin 25 pg:n välillä kehon painokiloa kohti, havaittiin olevan tehokkaita.

Lisätestaus osoittaa, että synteettisillä hpGRF-5 analogeilla, jotka on syntetisoitu esimerkeissä I, II ja III, on täysi hpGRF(1 - 40)-OH:lle luonteenomainen biologinen aktiivisuus.

Synteettisten hpGRF-peptidien pitäisi soveltua sellaisiin käyttöihin, joissa lääkäri haluaa lisätä GH:n tuo-10 tantoa. GH:n erityksen kiihdyttäminen sellaisilla hpGRF- peptideillä on kiinnostavaa potilaissa, jotka kärsivät täydellisestä tai osittaisesta GH:n puutteesta, joka aiheutuu endogeenisen GRF:n alituotannosta. Sitä paitsi suurentunut GH:n eritys ja sitä seuraava kasvun lisääntyminen 15 pitäisi olla saavutettavissa ihmisissä tai eläimissä, joi den GH-tasot ovat normaaleja. Lisäksi hpGRF-peptidien antamisen pitäisi muuttaa kehon sisältämää rasvamäärää ja muuttaa muita GH:sta riippuvaisia aineenvaihduntaprosesse-ja, immunologisia prosesseja ja kehitysprosesseja. hpGRF-20 peptidit saattavat soveltua esimerkiksi anabolisten prosessien kiihdyttämiseen ihmisessä sellaisissa olosuhteissa kuten esimerkiksi palohaavojen syntymisen jälkeen.

Toisena esimerkkinä, hpGRF-peptidien pitäisi olla käyttökelpoisia hyötyeläinten, kuten kanojen, sikojen, 25 nautakarjan ja lampaiden kasvun kiihdyttämisessä ja saavu tettavan proteiinin ja rasvan suhteen kohottamisessa.

Ihmisille antamista varten synteettisten peptidien puhtausasteen tulisi olla vähintään noin 93 % ja edullisesti vähintään 98 %. Tämä puhtausaste merkitsee sitä, et-30 tä tarkoitettua peptidiä on mainittu painoprosenttiosuus kaikista mukana olevista samankaltaisista peptideistä ja peptidifragmenteista.

Synteettisten hpGRF-fragmenttien antamiseen hyötyjä muille eläimille niiden kasvun edistämiseksi ja rasva-35 määrän pienentämiseksi niinkin alhainen puhtausaste kuin noin 5 % tai jopa 0,1 % voi olla hyväksyttävä.

Il 17 83660

Synteettisiä hpGRF-peptidejä tai niiden myrkyttömiä suoloja, jotka on yhdistetty farmaseuttisesti hyväksyttävään kantaja-aineeseen farmaseuttisen koostumuksen muodostamiseksi, voidaan antaa eläimille, ihmiset mukaan lukien, 5 joko laskimoon, ihon alle, lihakseen, nenän kautta tai jo pa suun kautta (sellaiseen aikaan, että tehokkaita sitoja-tai kantaja-aineita kehittyy). Tässä käytettynä "farmaseuttisesti hyväksyttävän" tulee käsittää sisältävän eläinlääketieteellisesti hyväksyttävän. Lääkäri voi käytit) tää antamista GH:n vapautumisen kiihdyttämiseksi, silloin kun hoidettava potilas on sellaisen terapeuttisen käsittelyn tarpeessa. Vaadittava annos vaihtelee kulloinkin hoidettavan tilan, tilan vakavuuden ja halutun hoidon keston mukaan.

15 Peptidejä annetaan usein farmaseuttisesti hyväksyt tävien myrkyttömien suolojen, kuten happoadditiosuolojen tai metallikompleksien, esimerkiksi sinkin, raudan tai vastaavien muodostamien kompleksien (joita pidetään suoloina tämän keksinnön tarkoituksiin) muodossa. Esimerkkejä 20 sellaisista happoadditiosuoloista ovat hydrokloridi, hyd-robromidi, sulfaatti, fosfaatti, maleaatti, asetaatti, sitraatti, bentsoaatti, sukkinaatti, malaatti, askorbaat-ti, tartraatti ja vastaavat. Mikäli vaikuttava aineosa on tarkoitus antaa suun kautta tablettien muodossa, tabletti 25 voi sisältää sideainetta, kuten trakanttikumia, maissi- tärkkelystä tai gelatiinia; hajottavaa ainetta, kuten al-giinihappoa; ja liukuainetta, kuten magnesiumstearaattia. Mikäli toivotaan antamista nestemäisessä muodossa, voidaan käyttää makeuttamista ja/tai maustamista, ja antaminen voi 30 tapahtua laskimoon isotonista suolaliuosta ja fosfaatti- puskuria sisältävinä liuoksina.

Peptidejä tulisi antaa ihmiselle lääkärin opastuksella, ja farmaseuttiset koostumukset sisältävät peptidiä tavallisesti tavanomaiseen farmaseuttisesti hyväksyttävään 35 kantaja-aineeseen yhdistettynä. Parenteraalinen annos on tavallisesti noin 40 ngrsta noin 25 pg:aan peptidiä ruumiin painokiloa kohti.

18 83660

Tulisi ymmärtää, että monenlaisia alan ammattimiehelle selviä muutoksia ja modifiointeja voidaan tehdä. Esimerkiksi voidaan tehdä muutoksia peptidiketjussa, erityisesti poistoja peptidin karboksyylipäässä tähän mennes-5 sä tunnetun kokemusperäisen käytännön mukaisesti sellais ten fragmenttien aikaansaamiseksi, jotka säilyttävät peptidin koko tehon tai hyvin huomattavan osan siitä. Vaikuttaa siltä, että asemien 1 ja 27 välisten tähteiden tai niiden kanssa ekvivalenttisten tähteiden muodostaman jak-10 son tulisi olla mukana; jotkut muutokset jakson sisällä saattavat kuitenkin olla mahdollisia. Lisäksi voidaan tehdä lisäyksiä jompaan kumpaan päähän tai molempiin päihin, ja/tai yleensä ekvivalenttiset tähteet voidaan korvata luonnossa esiintyvillä tähteillä, mikä on tunnettua kaik-15 kialla peptidikemian alalla, sellaisten analogien tuotta miseksi, joilla on ainakin olennainen osa kuvattujen peptidien tehosta.

li

Claims (2)

19 83660

1. Menetelmä farmaseuttista aktiivisuutta omaavien peptidien valmistamiseksi, joilla on kaava (I): 5 H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val- Leu-D-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met- Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH2 10 tai C-terminaalisesti päästä lyhennetyn, vähintään 27 ami nohappoa pitkän muunnoksen valmistamiseksi, tunnet-t u siitä, että a) muodostetaan yhdiste, joka sisältää vähintään yhden suojaryhmän ja jolla on kaava (II) 15 X1-Tyr (X2) -Ala-Asp( X3) -Ala-Ile-Phe-Thr( X4 )-Asn( X5) -Ser (X4 )-Tyr (X2) -Arg( X6) -Lys( X7) -Val-Leu-D-Ala-Gln( X5) -Leu-Ser ( X4)-Ala-Arg( X6) -Lys(X7) -Leu-Leu-Gln( X5) -Asp( X3) -Ile-Met-Ser (X4) -Arg( X6) -Gln( X5) -Gln( X5) -Gly-Glu( X3) -Ser (X4) -Asn( X5) -Gln( X5) -20 Glu( X3 )-Arg( X6)-Gly-Ala-X8 tai C-terminaalisesta päästä tarkoituksenmukaisesti lyhennetty muunnos siitä, jossa kaavassa X1 on vety tai α-aminoryhmää suojaava ryhmä;

25 X2 on vety tai Tyrrn fenolihydroksyyliryhmää suojaava ryh mä; X3 on vety tai Asp:n tai Glu:n karboksyyliryhmää suojaava ryhmä; X4 on vety tai Ser:n tai Thr:n alkoholihydroksyyliryhmää 30 suojaava ryhmä; X5 on vety tai Asn:n tai Gin:n sivuketjun amidoryhmää suojaava ryhmä; X6 on vety tai Arg:n guanidinoryhmää suojaava ryhmä; X7 on vety tai Lys:n sivuketjun aminoryhmää suojaava ryhmä; 35 ja Xs on hartsikantaja; 20 8 3 660 liittämällä järjestyksessä suojatut aminohapot suhteessa noin 1 millimooli suojattua aminohappoa 1 grammaa sopivassa liuottimessa, edullisesti metyleenikloridissa tai dime-tyyliformamidissa tai niiden seoksessa olevaa hartsia koh-5 ti; ja b) suojaryhmät poistetaan ja peptidi irrotetaan hartsikantajasta käyttämällä TFA:ta sopivassa liuottimessa ja sen jälkeen käyttämällä HF:a alhaisessa lämpötilassa, minkä jälkeen peptidi liuotetaan sopivaan liuottimeen ja 10 puhdistetaan tunnetuilla menetelmillä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että X8 on -NH-parametyylibentshyd-ryyliamiini(MBHA)hartsikantaj a. 5 2i 83660