CN107936090B - 一种低成本合成ARK-Cu的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种低成本合成ARK‑Cu的方法，采用液相合成法，将Cbz‑Ala‑OH与H‑Arg(NO2)‑OH连成二肽Cbz‑Ala‑Arg(NO2)‑OH，再与Lys(Cbz)‑OH反应，生成全保护三肽Cbz‑Ala‑Arg(NO2)‑Lys(Cbz)‑OH，然后经氢气/钯碳脱保护生成H‑Ala‑Arg‑Lys‑OH，最后在水中与醋酸铜生成ARK‑Cu。本发明合成方法简单，无需柱色谱纯化，用乙酸乙酯重结晶就可得到纯度97％以上的Cbz‑Ala‑Arg(NO2)‑Lys(Cbz)‑OH，合成低成本，可用于大量合成ARK‑Cu。

Description

一种低成本合成ARK-Cu的方法
技术领域
本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种铜肽的合成方法。
背景技术
ARK-Cu是一种新型铜肽，是由丙氨酸、精氨酸和赖氨酸组成的三肽与铜形成的络合物，具有深层修复疤痕，修复老损细胞，灭菌以及深层美白等功效。ARK-Cu是基于GHK-Cu的一种改构，用丙氨酸替代甘氨酸，用精氨酸替代组氨酸。现在目前针对这种三肽的合成有固相合成和液相合成两种，固相合成的优点在于快速、方便、产率高、纯度好，缺点在于成本高，以及将肽从固相树脂上切割下来经常用三氟乙酸，因此非常依赖反向色谱纯化以及离子交换。液相合成的优点是成本低，但是合成的纯度较差，每步中间体都需要处理，纯化，周期太长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低成本、大量合成ARK-Cu的方法。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、合成Cbz-Ala-Arg(NO2)-OH
以N,N'-二甲基甲酰胺为溶剂，将Cbz-Ala-OH与N-羟基琥珀酰亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺、H-Arg(NO2)-OH、N,N'-二异丙基乙胺在室温条件下反应，反应完后将反应液倒入水中，用柠檬酸调节pH＝3～4，室温搅拌析出固体，过滤，水洗，干燥，得到Cbz-Ala-Arg(NO2)-OH。
2、合成Cbz-Ala-Arg(NO2)-Lys(Cbz)-OH
以N,N'-二甲基甲酰胺为溶剂，将Cbz-Ala-Arg(NO2)-OH与N-羟基琥珀酰亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺、Lys(Cbz)-OH、N,N'-二异丙基乙胺在室温条件下反应，反应完后将反应液倒入水中，用柠檬酸调节pH＝3～4，室温搅拌析出固体，过滤，水洗，干燥，用乙酸乙酯重结晶，得到纯度97％以上的Cbz-Ala-Arg(NO2)-Lys(Cbz)-OH。
3、合成H-Ala-Arg-Lys-OH
将Cbz-Ala-Arg(NO2)-Lys(Cbz)-OH溶解于甲醇和水的混合溶剂中，加入钯碳，通氢气脱保护，生成H-Ala-Arg-Lys-OH，即ARK。
4、合成ARK-Cu
将H-Ala-Arg-Lys-OH与醋酸铜在水中络合，经冷冻干燥，得到ARK-Cu。
上述步骤1中，优选Cbz-Ala-OH与N-羟基琥珀酰亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺、H-Arg(NO2)-OH、N,N'-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1.1～1.3:1.3～1.5:1～1.1:1～1.1，室温反应时间优选4～7小时。
上述步骤2中，优选Cbz-Ala-Arg(NO2)-OH与N-羟基琥珀酰亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺、Lys(Cbz)-OH、N,N'-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1.1～1.3:1.3～1.5:1～1.1:1～1.1，室温反应时间优选2～5小时。
上述步骤4中，优选H-Ala-Arg-Lys-OH与醋酸铜的摩尔比为1:1。
本发明的创新点和有益效果：
1、本发明以Cbz-Ala-OH、H-Arg(NO2)-OH、H-Lys(Cbz)-OH为起始原料，最后合成的全保护三肽Cbz-Ala-Arg(NO2)-Lys(Cbz)-OH，在脱除保护的时候，用氢气/钯碳还原即可得到三肽H-Ala-Arg-Lys-OH，避免了传统意义上常用三氟乙酸脱除保护，避免了用三氟乙酸脱保护时带来的副产物，以及避免了用三氟乙酸脱完保护后必须用反相色谱纯化除杂质，以及再用离子交换除三氟乙酸的繁琐过程。
2、本发明用液相法直接合成全保护三肽Cbz-Ala-Arg(NO2)-Lys(Cbz)-OH的粗品，无需柱色谱纯化，用乙酸乙酯重结晶就可以到达97％以上的纯度，克服了常规液相合成中每步中间体都需要柱色谱纯化，操作非常繁琐的技术问题。
3、本发明用N,N'-二异丙基乙胺(DIC)代替N,N'‐二环己基碳酰亚胺(DCC)作为缩合剂，DCC的副产物DCU很难除去，即使柱色谱纯化都很难去除干净，但是用DIC就很好的解决了这个问题，在用乙酸乙酯重结晶的过程中，就可以完全除去。
4、本发明ARK在与铜的络合中，用水作为溶剂，用醋酸铜为铜的供体，在等摩尔条件下生成ARK-Cu，反应完后，无需处理，直接将水冻干，就得到ARK-Cu，简单方便。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实例。
实施例1
1、合成Cbz-Ala-Arg(NO2)-OH
将44.6g(0.2mol)Cbz-Ala-OH搅拌溶解于600mL N,N'-二甲基甲酰胺中，然后加入27.6g(0.24mol)N-羟基琥珀酰亚胺、37.8g(0.30mol)N,N'-二异丙基碳二亚胺，室温搅拌3小时，再加入44g(0.2mol)H-Arg(NO2)-OH、26g(0.2mol)N,N'-二异丙基乙胺，室温搅拌2小时，将反应液倒入3L水中，用柠檬酸调节pH＝3～4，室温搅拌30分钟，析出大量固体，过滤，水洗2遍，40℃烘干，得到76g Cbz-Ala-Arg(NO2)-OH，产率90％。
2、合成Cbz-Ala-Arg(NO2)-Lys(Cbz)-OH
将63.75g(0.15mol)Cbz-Ala-Arg(NO2)-OH搅拌溶解于750mL N,N'-二甲基甲酰胺中，然后加入20.7g(0.18mol)N-羟基琥珀酰亚胺、28.35g(0.225mol)N,N'-二异丙基碳二亚胺，室温搅拌3小时，再加入42g(0.15mol)Lys(Cbz)-OH、19.5g(0.15mol)N,N'-二异丙基乙胺，室温搅拌2小时，将反应液倒入3L水中，用柠檬酸调节pH＝3～4，室温搅拌30分钟，析出大量固体，过滤，水洗2遍，40℃烘干，得到82.5g Cbz-Ala-Arg(NO2)-Lys(Cbz)-OH粗品，用乙酸乙酯重结晶，得到68.7g纯度97％的Cbz-Ala-Arg(NO2)-Lys(Cbz)-OH，产率67％。
3、合成H-Ala-Arg-Lys-OH
将68.7g Cbz-Ala-Arg(NO2)-Lys(Cbz)-OH搅拌溶解于600mL水与甲醇体积比为1:1的混合溶剂中，加入5g 10％钯碳，常温常压下通入氢气，搅拌5小时，反应完全，减压蒸干甲醇，加入300mL乙酯，搅拌，分层，取水层，将水层冻干，得到35g H-Ala-Arg-Lys-OH，产率95％。
4、合成ARK-Cu
将35g(0.093mol)H-Ala-Arg-Lys-OH搅拌溶解于200mL水中，加入18.6g(0.093mol)醋酸铜，室温搅拌2小时，将反应液冷冻干燥，得到40g ARK-Cu产率99％。
实施例2
1、合成Cbz-Ala-Arg(NO2)-OH
将89.2g(0.4mol)Cbz-Ala-OH搅拌溶解于1200mL N,N'-二甲基甲酰胺中，然后加入50.6g(0.44mol)N-羟基琥珀酰亚胺、65.52g(0.52mol)N,N'-二异丙基碳二亚胺，室温搅拌3小时，再加入96.8g(0.44mol)H-Arg(NO2)-OH、57.2g(0.44mol)N,N'-二异丙基乙胺，室温搅拌2小时，将反应液倒入6L水中，用柠檬酸调节pH＝3～4，室温搅拌30分钟，析出大量固体，过滤，水洗2遍，40℃烘干，得到147g Cbz-Ala-Arg(NO2)-OH，产率87％。
2、合成Cbz-Ala-Arg(NO2)-Lys(Cbz)-OH
将127.5g(0.3mol)Cbz-Ala-Arg(NO2)-OH搅拌溶解于1500mL N,N'-二甲基甲酰胺中，然后加入37.95g(0.33mol)N-羟基琥珀酰亚胺、49.14g(0.39mol)N,N'-二异丙基碳二亚胺，室温搅拌3小时，再加入92.4g(0.33mol)Lys(Cbz)-OH、42.9g(0.33mol)N,N'-二异丙基乙胺，室温搅拌2小时，将反应液倒入3L水中，用柠檬酸调节pH＝3～4，室温搅拌30分钟，析出大量固体，过滤，水洗2遍，40℃烘干，得到163g Cbz-Ala-Arg(NO2)-Lys(Cbz)-OH粗品，用乙酸乙酯重结晶，得到133g纯度96.5％的Cbz-Ala-Arg(NO2)-Lys(Cbz)-OH，产率65％。
3、合成H-Ala-Arg-Lys-OH
将133g Cbz-Ala-Arg(NO2)-Lys(Cbz)-OH搅拌溶解于1200mL水与甲醇体积比为1:1的混合溶剂中，加入10g 10％钯碳，常温常压下通入氢气，搅拌5小时，反应完全，减压蒸干甲醇，加入600mL乙酯，搅拌，分层，取水层，将水层冻干，得到68g H-Ala-Arg-Lys-OH，产率96％。
4、合成ARK-Cu
将68g(0.18mol)H-Ala-Arg-Lys-OH搅拌溶解于400mL水中，加入36g(0.18mol)醋酸铜，室温搅拌3小时，将反应液冷冻干燥，得到77g ARK-Cu，产率98％。

Claims (6)

1.一种低成本合成ARK-Cu的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：
(1)合成Cbz-Ala-Arg(NO2)-OH
以N,N'-二甲基甲酰胺为溶剂，将Cbz-Ala-OH与N-羟基琥珀酰亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺、H-Arg(NO2)-OH、N,N'-二异丙基乙胺在室温条件下反应，反应完后将反应液倒入水中，用柠檬酸调节pH＝3～4，室温搅拌析出固体，过滤，水洗，干燥，得到Cbz-Ala-Arg(NO2)-OH；
(2)合成Cbz-Ala-Arg(NO2)-Lys(Cbz)-OH
以N,N'-二甲基甲酰胺为溶剂，将Cbz-Ala-Arg(NO2)-OH与N-羟基琥珀酰亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺、Lys(Cbz)-OH、N,N'-二异丙基乙胺在室温条件下反应，反应完后将反应液倒入水中，用柠檬酸调节pH＝3～4，室温搅拌析出固体，过滤，水洗，干燥，用乙酸乙酯重结晶，得到纯度97％以上的Cbz-Ala-Arg(NO2)-Lys(Cbz)-OH；
(3)合成H-Ala-Arg-Lys-OH
将Cbz-Ala-Arg(NO2)-Lys(Cbz)-OH溶解于甲醇和水的混合溶剂中，加入钯碳，通氢气脱保护，生成H-Ala-Arg-Lys-OH；
(4)合成ARK-Cu
将H-Ala-Arg-Lys-OH与醋酸铜在水中络合，经冷冻干燥，得到ARK-Cu。
2.根据权利要求1所述的低成本合成ARK-Cu的方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述Cbz-Ala-OH与N-羟基琥珀酰亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺、H-Arg(NO2)-OH、N,N'-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1.1～1.3:1.3～1.5:1～1.1:1～1.1。
3.根据权利要求2所述的低成本合成ARK-Cu的方法，其特征在于：在步骤(1)中，室温反应的时间为4～7小时。
4.根据权利要求1所述的低成本合成ARK-Cu的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述Cbz-Ala-Arg(NO2)-OH与N-羟基琥珀酰亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺、Lys(Cbz)-OH、N,N'-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1.1～1.3:1.3～1.5:1～1.1:1～1.1。
5.根据权利要求4所述的低成本合成ARK-Cu的方法，其特征在于：在步骤(2)中，室温反应的时间为2～5小时。
6.根据权利要求1所述的低成本合成ARK-Cu的方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述H-Ala-Arg-Lys-OH与醋酸铜的摩尔比为1:1。
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