CN116425827A - 短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了结构式如下的短肽Fmoc‑L‑Ile‑Aib‑OH，其制备方法采用液相合成法，先将α‑甲基丙氨酸即H‑Aib‑OH的羧基用酯化法进行保护，制得H‑Aib‑OR，再将其与N‑芴甲氧羰基异亮氨酸即Fmoc‑L‑Ile‑OH进行偶联，制得全保护二肽Fmoc‑L‑Ile‑Aib‑OR，最后将Fmoc‑L‑Ile‑Aib‑OR水解，所得短肽H‑L‑Ile‑Aib‑OH与9‑芴甲基‑N‑琥珀酰亚胺基碳酸酯即Fmoc‑OSu反应以保护氨基，制得目标短肽Fmoc‑L‑Ile‑Aib‑OH。本发明所述短肽可用于生产多肽药物替尔泊肽等，所述制备方法具有产物纯度高、收率高、耗时短、成本低的优势，适合工业化大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于多肽合成技术领域，涉及一种短肽及其制备方法。
背景技术
替尔泊肽(Tirzepatide,CAS No 2023788-19-2)，作为一种治疗糖尿病和减轻体重的多肽药物，是一款葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体双重激动剂，它通过每周一次皮下注射给药，达到控制血糖的目标。2022年5月，Tirzepatide作为“first-in-class”药物获得美国FDA批准上市。
替尔泊肽的分子肽序为：Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu-Asp-Lys-Ile-Ala-Gln-{diacid-C20-gamma-Glu-(AEEA)2-Lys}-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。其主链含有38个氨基酸，侧链含有2个氨基酸、1个C20的二酸和双AEEA片段，还含有非天然的氨基酸，分子比较复杂。现有文献表明，替尔泊肽主要通过逐步固相合成和片段合成来制备。
短肽片段偶联合成多肽法是目前固相合成中一种新型的高效合成方法，它既能减少多肽的合成步骤，进而减少Fmoc不完全脱除引起的氨基酸缺失以及氨基酸消旋的风险，同时能克服多肽合成中某些多肽容易发生的3-哌嗪基丙氨酸(3-(1-piperidinyl)analine)形成反应、二酮哌嗪(diketopiperazine,DKP)反应、异天冬氨酸生成反应等。而短肽片段的合成，可以通过固相合成法(SPPS)、液相合成法(LPPS)、生物合成法完成，其中生物合成法最高效、最经济。但如含有α-甲基丙氨酸(Aib)这种非天然氨基酸的短肽片段，则无法通过生物合成法获得，只能通过固相合成法或者液相合成法来制备。如果采用固相合成法，则需要昂贵的树脂、大量的溶剂以及大大过量的氨基酸，导致成本很高、片段纯度较低等问题；如果所得短肽片段不经过纯化就与其他的片段偶联合成多肽，会使制得的多肽纯度更低，既降低多肽纯度又增加粗肽纯化难度，进而增加最终产物获取成本，显然固相合成法不是含有Aib的短肽片段合成的最佳选择。此外，由于Aib本身具有较大的位阻，如果采用固相合成法来制备含有Aib的短肽片段，对后面的氨基酸的偶联会带来挑战，收率较低，会产生缺失氨基酸类型的杂质等。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于通过液相合成法制备含有Aib的短肽片段，产物纯度高、收率高、耗时短、成本低，适合工业化大规模生产，所得短肽可用于生产多肽药物替尔泊肽等。
经研究，本发明提供如下技术方案：
1.短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH，结构式如下：
2.所述短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备方法，采用液相合成法，包括以下步骤：
(1)将α-甲基丙氨酸即H-Aib-OH与醇即ROH反应成酯以保护羧基，制得H-Aib-OR；
(2)将N-芴甲氧羰基异亮氨酸即Fmoc-L-Ile-OH与H-Aib-OR偶联，制得全保护二肽Fmoc-L-Ile-Aib-OR；
(3)将Fmoc-L-Ile-Aib-OR水解，得到短肽H-L-Ile-Aib-OH，再将其与9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯即Fmoc-OSu反应以保护氨基，制得目标短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH；
上述ROH、H-Aib-OR和Fmoc-L-Ile-Aib-OR中的R为甲基或乙基。
优选的，所述短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备方法，包括以下步骤：
(1)将H-Aib-OH与ROH在二氯亚砜即SOCl2催化下发生酯化反应，制得H-Aib-OR盐酸盐即H-Aib-OR.HCl；
(2)将Fmoc-L-Ile-OH与H-Aib-OR.HCl在活化剂、缚酸剂、缩合剂存在下于有机溶剂中进行缩合反应，制得Fmoc-L-Ile-Aib-OR；
(3)将Fmoc-L-Ile-Aib-OR在碱性条件下于溶剂中发生水解反应，得到短肽H-L-Ile-Aib-OH，再将其与Fmoc-OSu在碱性条件下反应，制得目标短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH。
更优选的，所述短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备方法，包括以下步骤：
(1)控制温度在0℃以下，向ROH中加入SOCl2，搅拌，再加入H-Aib-OH，搅拌，升温至20～50℃反应；反应结束，浓缩，加入二氯甲烷即DCM，减压旋蒸，制得H-Aib-OR.HCl；
(2)控制温度在0℃以下，向有机溶剂中加入H-Aib-OR.HCl和缚酸剂，搅拌，加入Fmoc-L-Ile-OH和活化剂，搅拌，再加入缩合剂，搅拌，升温至10～30℃反应；反应结束，有机层依次用pH 7-8的碱水、pH 4-5的酸水、10％ NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，固液分离，液体浓缩，加入石油醚即PE，结晶，固液分离，固体干燥，制得Fmoc-L-Ile-Aib-OR；
(3)将Fmoc-L-Ile-Aib-OR溶于溶剂中，加碱调节pH至11-12，搅拌反应；反应结束，加酸调节pH为8-9，用乙酸乙酯即EA和PE混合萃取除杂后，加入Fmoc-OSu进行反应，过程中加碱维持pH为8-9；反应结束，用EA和PE混合萃取除杂，加入EA，调节pH至3-4，搅拌，静置，收集EA层，用10％ NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，固液分离，液体浓缩，加入PE，结晶，固液分离，固体干燥，制得Fmoc-L-Ile-Aib-OH。
优选的，上述步骤(1)中，所述H-Aib-OH与SOCl2的摩尔比为1:1.2，H-Aib-OH与ROH的用量比为1mol:1L；反应温度为30～40℃。
优选的，上述步骤(2)中，所述活化剂为1-羟基苯并三氮唑即HOBt，缩合剂为N,N’-二异丙基碳二亚胺即DIC或N,N’-二环己基碳二亚胺即DCC，缚酸剂为N,N-二异丙基乙胺即DIEA、N-甲基吗啉即NMM或三乙胺即TEA，有机溶剂为DCM或四氢呋喃即THF。
更优选的，上述步骤(2)中，所述缩合剂为DIC，有机溶剂为DCM。
优选的，上述步骤(2)中，所述Fmoc-L-Ile-OH、活化剂、H-Aib-OR.HCl、缚酸剂、缩合剂的摩尔比为1:1:1.2:1.2:1.2；反应温度为20～30℃。
优选的，上述步骤(3)中，所述Fmoc-L-Ile-Aib-OR的水解反应是以体积比为1:3的THF和水为溶剂，在用NaOH调节pH为11-12的条件下进行；所述H-L-Ile-Aib-OH与Fmoc-OSu的反应是在用Na2CO3维持pH为8-9的条件下进行。
优选的，步骤(3)中所述H-L-Ile-Aib-OR与Fmoc-OSu的摩尔比为1:1。
优选的，所述短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备方法中，ROH、H-Aib-OR和Fmoc-L-Ile-Aib-OR中的R为乙基。
本发明的有益效果在于：本发明公开了一种短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH及其制备方法，所述短肽可用于生产多肽药物替尔泊肽等，所述制备方法具有产物纯度高、收率高、耗时短、成本低的优势，适合工业化大规模生产。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本发明中缩写名称的含义见表1。优选实施例中主要实验试剂的相关信息见表2。
表1本发明缩写含义
| 缩写 | 含义 |
| Fmoc-L-Ile-Aib-OH | N-芴甲氧羰基-L-异亮氨酰-α-甲基丙氨酸 |
| Fmoc-L-Ile-OH | N-芴甲氧羰基-L-异亮氨酸 |
| Fmoc-L-Ile-Aib-OEt | N-芴甲氧羰基-L-异亮氨酰-α-甲基丙氨酸乙酯 |
| Fmoc-OSu | 9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯 |
| H-Aib-OH | α-甲基丙氨酸 |
| H-Aib-OMe.HCl | α-甲基丙氨酸甲酯盐酸盐 |
| H-Aib-OEt.HCl | α-甲基丙氨酸乙酯盐酸盐 |
| H-L-Ile-Aib-OH | H-L-异亮氨酰-α-甲基丙氨酸 |
| SOCl2 | 二氯亚砜 |
| DIC | N,N’-二异丙基碳二亚胺 |
| DCC | N,N’-二环己基碳二亚胺 |
| MeOH | 甲醇 |
| DCM | 二氯甲烷 |
| THF | 四氢呋喃 |
| EtOH | 乙醇 |
| PE | 石油醚 |
| EA | 乙酸乙酯 |
| HOBt | 1-羟基苯并三唑 |
| DIEA | N,N-二异丙基乙胺 |
| NMM | N-甲基吗啉 |
| TEA | 三乙胺 |
表2主要实验试剂信息
| 试剂名称 | 纯度级别 | 生产厂家 |
| Fmoc-L-Ile-OH | HPLC≥99.5 | 成都郑源生化科技有限公司 |
| H-Aib-OH | 工业级 | 吉尔生化上海有限公司 |
| SOCl2 | 工业级 | 成都科隆化学品有限公司 |
| DIC | 工业级 | 成都科隆化学品有限公司 |
| MeOH | 工业级 | 潍坊欣宇化工有限公司 |
| EtOH | 工业级 | 潍坊欣宇化工有限公司 |
| DCM | 工业级 | 潍坊欣宇化工有限公司 |
| THF | 工业级 | 潍坊欣宇化工有限公司 |
| PE | 工业级 | 潍坊欣宇化工有限公司 |
| EA | 工业级 | 潍坊欣宇化工有限公司 |
| HOBt | 工业级 | 苏州昊帆生物股份有限公司 |
| DIEA | 工业级 | 苏州昊帆生物股份有限公司 |
| NMM | 工业级 | 苏州昊帆生物股份有限公司 |
| TEA | 工业级 | 苏州昊帆生物股份有限公司 |
| DCC | 工业级 | 苏州昊帆生物股份有限公司 |
| NaOH | 工业级 | 成都金山化学试剂有限公司 |
| 盐酸 | 工业级 | 成都徐氏化工有限公司 |
| 无水硫酸钠 | 工业级 | 成都徐氏化工有限公司 |
| Na2CO3(碳酸钠) | 工业级 | 成都徐氏化工有限公司 |
| NaCl(氯化钠) | 工业级 | 成都徐氏化工有限公司 |
实施例1 Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备
(1)中间体H-Aib-OEt.HCl的制备
在三口烧瓶中加入EtOH 480mL，冰浴降温至-10℃～-5℃，搅拌，缓慢滴加SOCl268.5g(0.58mol)，滴毕，搅拌30min，再加入H-Aib-OH 49.5g(0.48mol)，搅拌1h，35℃水浴加热反应，薄层层析(TLC)跟踪反应过程(展开剂为氯仿:甲醇:乙酸＝50:10:1)。反应结束，减压旋蒸除去EtOH，加入DCM 150mL，减压旋蒸至水分、溶残检测合格，得H-Aib-OEt.HCl78g，收率97.5％。
本发明采用上述相同制备方法，用MeOH替换EtOH，比较了游离氨基酸H-Aib-OH合成甲酯(H-Aib-OMe.HCl)和乙酯(H-Aib-OEt.HCl)的结果。合成实验结果见表3。从表3可以看出，游离氨基酸H-Aib-OH合成甲酯和乙酯的收率差距很小、高效液相色谱(HPLC)检测的产物纯度都很高。考虑到MeOH对人体有一定伤害性，因此优选H-Aib-OEt作为H-Aib-OH的羧基保护形式。
表3中间体H-Aib-OR.HCl(R为Me或Et)的合成实验结果
(2)中间体Fmoc-L-Ile-Aib-OEt的制备
在2000mL三口烧瓶中加入DCM 600mL，冰浴降温至-10℃～-5℃，加入H-Aib-OEt.HCl60.3g(0.36mol)和NMM 36.4g(0.36mol)，搅拌使溶解，再加入HOBt 40.5g(0.3mol)和Fmoc-L-Ile-OH 105.9g(0.3mol)，搅拌10min，缓慢滴加DIC 45.4g(0.36mol)，滴毕，继续搅拌1h，然后升温至25℃反应，TLC监测反应进程(展开剂为氯仿:甲醇:乙酸＝50:10:1)。反应结束，有机层依次用pH 7-8的Na2CO3溶液(100mL×3)、pH 4-5的HCl溶液(100mL×3)、10％NaCl溶液(100mL×3)洗涤，加入无水硫酸钠70g干燥8h，真空抽滤，滤液45℃减压浓缩至150mL，加入PE 600mL搅拌结晶，抽滤，固体干燥，得Fmoc-L-Ile-Aib-OEt 97.5g，收率70.3％。
本发明考察了不同溶剂对上述合成实验的影响。结果见表4，羧酸和氨的缩合反应在DCM和THF中进行时，对产物收率和纯度并无显著影响。由于THF的价格高于DCM，从成本考虑，优选DCM为溶剂。
表4溶剂对中间体Fmoc-L-Ile-Aib-OEt合成的影响
本发明也考察了不同缚酸剂对上述合成实验的影响，结果见表5，NMM和DIEA的合成实验结果差距很小，但都略微优于TEA，因此优选前两者作为缚酸剂。进一步从商业成本考虑，更优选价格最便宜的NMM。
表5缚酸剂对中间体Fmoc-L-Ile-Aib-OEt合成的影响
本发明有选择性考察了不同缩合剂对上述合成实验的影响，结果见表6，DIC的合成实验效果明显优于DCC，因此优选DIC作为缩合剂。
表6缩合剂对中间体Fmoc-L-Ile-Aib-OEt合成的影响
(3)目标短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备
将Fmoc-L-Ile-Aib-OEt 104.85g(0.225mol)溶于THF 250mL和H2O 750mL中，加入10NNaOH溶液调节pH至11-12，快速搅拌，TLC监测反应进程(展开剂为乙酸乙酯:石油醚＝3:2,v/v)。反应结束，加入6N HCl溶液调节pH至8-9，用EA 70mL+PE 140mL混合萃取除杂(210mL×3)，快速搅拌，分3批加入Fmoc-OSu(25g/0.075mol，25g/0.075mol，25g/0.075mol)，过程中用Na2CO3调节pH维持在8-9，TLC监测反应进程(展开剂为氯仿:甲醇:乙酸＝50:10:1)。反应结束，用EA 70mL+PE 140mL混合萃取除杂(210mL×3)，再加入EA 400mL，搅拌，加入6N HCl调节pH至3-4，搅拌20min，静置分层，收集EA层，用10％ NaCl溶液洗涤(150mL×3)，加入无水Na2SO4干燥4h，过滤，滤液减压浓缩成油状物，加入PE 600mL，搅拌结晶，过滤，固体干燥，得Fmoc-L-Ile-Aib-OH 92.1g，收率70.6％。产物经HPLC检测，纯度为99.65％，单个最大杂质为0.08％；旋光度为-11.2°。多次合成实验结果见表7。
表7目标短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH的合成实验结果
从表7可以看出，当Fmoc-L-Ile-Aib-OEt与Fmoc-OSu的摩尔比为1:1时，目标产物Fmoc-L-Ile-Aib-OH的纯度与收率优异，并且成本最低(Entry1～Entry4)，且放大实验效果优秀，放大后产物的纯度和收率都很稳定(Entry5、Entry6)。
采用1H NMR、13C NMR和ES-API MS确认产物为Fmoc-L-Ile-Aib-OH，结构表征数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.19(S,1H),8.09(s,1H),7.89(d,J＝7.5Hz,2H),7.74(t,J＝7.4Hz,2H),7.42(t,J＝7.4Hz,2H),7.34-7.29(m,3H),4.33-4.20(m,3H),3.93 -3.88(t,1H),1.75 -1.70(m,1H),1.50-1.44(m,1H),1.35(d＝4.5Hz,6H),1.16-1.05(m,1H)，0.87-0.81(m,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ175.81,171.28,156.90,145.92,140.34,128.09,127.50,124.08,117.04,66.05,57.75,54.17,46.54,32.92,25.59,24.78,16.90,11.37.ES-API MS calcd for C25H30N2O5,[M+H]+:439.2,found:439.1；[M+Na]+:461.2,found:461.1；[M+K]+:477.1,found:477.0。
实施例2 Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备
(1)中间体H-Aib-OEt.HCl的制备
在三口烧瓶中加入EtOH 160mL，冰浴降温至-10℃～-5℃，搅拌，缓慢滴加SOCl222.9g(0.19mol)，滴毕，搅拌30min，再加入H-Aib-OH 16.5g(0.16mol)，搅拌1h，35℃水浴加热反应，TLC跟踪反应过程(展开剂为氯仿:甲醇:乙酸＝50:10:1)。反应结束，减压旋蒸除去EtOH，加入DCM 50mL，减压旋蒸至水分、溶残检测合格，得H-Aib-OEt.HCl 25.1g，收率94.2％。
(2)中间体Fmoc-L-Ile-Aib-OEt的制备
在500mL三口烧瓶中加入DCM 200mL，冰浴降温至-10℃～-5℃，加入H-Aib-OEt.HCl20.0g(0.12mol)和NMM 12.1g(0.12mol)，搅拌使溶解，再加入HOBt 13.5g(0.1mol)和Fmoc-L-Ile-OH 35.3g(1mol)，搅拌10min，缓慢滴加DIC 15.1g(0.12mol)，滴毕，继续搅拌1h，然后升温至25℃反应，TLC监测反应进程(展开剂为氯仿:甲醇:乙酸＝50:10:1)。反应结束，有机层依次用pH 7-8的Na2CO3溶液(30mL×3)、pH 4-5的HCl溶液(30mL×3)、10％NaCl溶液(30mL×3)洗涤，加入无水硫酸钠21g干燥8h，真空抽滤，滤液45℃减压浓缩至50mL，加入PE 200mL搅拌结晶，抽滤，固体干燥，得Fmoc-L-Ile-Aib-OEt 39.2g，收率84.1％。
(3)目标短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备
将Fmoc-L-Ile-Aib-OEt 34.95g(0.075mol)溶于THF 82.5mL和H2O 247.5mL中，加入10N NaOH溶液调节pH至11-12，快速搅拌，TLC监测反应进程(展开剂为乙酸乙酯:石油醚＝3:2)。反应结束，加入6N HCl溶液调节pH至8-9，用EA 22.5mL+PE 45mL混合萃取除杂(67.5mL×3)，快速搅拌，分3批加入Fmoc-OSu(8.42g/0.025mol，8.42g/0.025mol，8.42g/0.025mol)，过程中用Na2CO3调节pH维持在8-9，TLC监测反应进程(展开剂为氯仿:甲醇:乙酸＝50:10:1)。反应结束，用EA22.5mL+PE 45mL混合萃取除杂(67.5mL×3)，再加入EA 130mL，搅拌，加入6N HCl调节pH至3-4，搅拌20min，静置分层，收集EA层，用10％ NaCl溶液洗涤(50mL×3)，加入无水Na2SO4干燥4h，过滤，滤液减压浓缩成油状物，加入PE 195mL，搅拌结晶，过滤，固体干燥，得Fmoc-L-Ile-Aib-OH 31.7g，收率92.3％；HPLC纯度为99.70％、单个最大杂质为0.07％；旋光度为-11.2°。
实施例3 Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备
(1)中间体H-Aib-OEt.HCl的制备
在三口烧瓶中加入EtOH 1600mL，冰浴降温至-10℃～-5℃，搅拌，缓慢滴加SOCl2228.5g(1.92mol)，滴毕，搅拌30min，再加入H-Aib-OH 164.8g(1.6mol)，搅拌1h，35℃水浴加热反应，TLC跟踪反应过程(展开剂为氯仿:甲醇:乙酸＝50:10:1)。反应结束，减压旋蒸除去EtOH，加入DCM 500mL，减压旋蒸至水分、溶残检测合格，得H-Aib-OEt.HCl 257.9g，收率96.8％。
(2)中间体Fmoc-L-Ile-Aib-OEt的制备
在5L三口瓶中加入DCM 2000mL，冰浴降温至-10℃～-5℃，加入H-Aib-OEt.HCl199.8g(1.2mol)和NMM 121.2g(1.2mol)，搅拌使溶解，再加入HOBt 135g(1mol)和Fmoc-L-Ile-OH 353.0g(1mol)，搅拌10min，缓慢滴加DIC 151.2g(1.2mol)，滴毕，继续搅拌1h，然后升温至25℃反应，TLC监测反应进程(展开剂为氯仿:甲醇:乙酸＝50:10:1)。反应结束，有机层依次用pH 7-8的Na2CO3溶液(300mL×3)、pH 4-5的HCl溶液(300mL×3)、10％ NaCl溶液(300mL×3)洗涤，加入无水硫酸钠210g干燥8h，真空抽滤，滤液45℃减压浓缩至500mL，加入PE 2000mL搅拌结晶，抽滤，固体干燥，得Fmoc-L-Ile-Aib-OEt 364.4g，收率78.2％。
(3)目标短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备
将Fmoc-L-Ile-Aib-OEt 349.5g(0.75mol)溶于THF 825mL和H2O 2475mL中，加入10NNaOH溶液调节pH至11-12，快速搅拌，TLC监测反应进程(展开剂为乙酸乙酯:石油醚＝3:2)。反应结束，加入6N HCl溶液调节pH至8-9，用EA 225mL+PE 450mL混合萃取除杂(675mL×3)，快速搅拌，分3批加入Fmoc-OSu(84.25g/0.25mol，84.25g/0.25mol，84.25g/0.25mol)，过程中用Na2CO3调节pH维持在8-9，TLC监测反应进程(展开剂为氯仿:甲醇:乙酸＝50:10:1)。反应结束，用EA 225mL +PE 450mL混合萃取除杂(675mL×3)，再加入EA 1300mL，搅拌，加入6N HCl调节pH至3-4，搅拌20min，静置分层，收集EA层，用10％ NaCl溶液洗涤(500mL×3)，加入无水Na2SO4干燥4h，过滤，滤液减压浓缩成油状物，加入PE 1950mL，搅拌结晶，过滤，固体干燥，得Fmoc-L-Ile-Aib-OH 314.9g，收率91.9％；HPLC纯度为99.63％、单个最大杂质为0.07％；旋光度为-11.2°。
由实施例1-3可以看出，采用液相合成法合成目标短肽，不用昂贵的氨基酸树脂、每步合成不需要某一种原料大大过量，相对于固相合成法，成本更低，且产物纯度高、收率高，具有明显的优势。
实施例1-3采用全保护合成法制备短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH。除此之外，两个氨基酸之间的偶联还可以选择活性酯法。例如，以活性酯法合成目标短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH，可通过以下路线：将Fmoc-L-Ile-OH与缩合剂DIC反应生成混合酸酐、然后与活化剂HONB发生亲核取代反应生成活性酯Fmoc-L-Ile-ONB，再以其为原料，与H-Aib-OH偶联得到目标短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH。
但是，本发明对比实验发现，上述活性酯法虽然路线更短、步骤更简单，但反应收率却低；此外，游离氨基酸H-Aib-OH在碱水中有自身缩合形成二叠肽产物的倾向，导致用活性酯法合成的反应产物中有二叠肽杂质生成，得到的产物纯度较低且难于纯化，合成结果明显差于本发明的全保护合成法，全保护合成法可以防止H-Aib-OH的自身缩合反应，反应体系中杂质相对较少，纯化相对容易，具有产物纯度高、收率高的优势。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH，其特征在于，结构式如下：
2.权利要求1所述短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备方法，其特征在于，采用液相合成法，包括以下步骤：
(1)将α-甲基丙氨酸即H-Aib-OH与醇即ROH反应成酯以保护羧基，制得H-Aib-OR；
(2)将N-芴甲氧羰基异亮氨酸即Fmoc-L-Ile-OH与H-Aib-OR偶联，制得全保护二肽Fmoc-L-Ile-Aib-OR；
(3)将Fmoc-L-Ile-Aib-OR水解，得到短肽H-L-Ile-Aib-OH，再将其与9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯即Fmoc-OSu反应以保护氨基，制得目标短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH；
上述ROH、H-Aib-OR和Fmoc-L-Ile-Aib-OR中的R为甲基或乙基。
3.如权利要求2所述短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将H-Aib-OH与ROH在二氯亚砜即SOCl2催化下发生酯化反应，制得H-Aib-OR盐酸盐即H-Aib-OR.HCl；
(2)将Fmoc-L-Ile-OH与H-Aib-OR.HCl在活化剂、缚酸剂、缩合剂存在下于有机溶剂中进行缩合反应，制得Fmoc-L-Ile-Aib-OR；
(3)将Fmoc-L-Ile-Aib-OR在碱性条件下于溶剂中发生水解反应，得到短肽H-L-Ile-Aib-OH，再将其与Fmoc-OSu在碱性条件下反应，制得目标短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH。
4.如权利要求3所述短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)控制温度在0℃以下，向ROH中加入SOCl2，搅拌，再加入H-Aib-OH，搅拌，升温至20～50℃反应；反应结束，浓缩，加入二氯甲烷即DCM，减压旋蒸，制得H-Aib-OR.HCl；(2)控制温度在0℃以下，向有机溶剂中加入H-Aib-OR.HCl和缚酸剂，搅拌，加入Fmoc-L-Ile-OH和活化剂，搅拌，再加入缩合剂，搅拌，升温至10～30℃反应；反应结束，有机层依次用pH 7-8的碱水、pH4-5的酸水、10％NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，固液分离，液体浓缩，加入石油醚即PE，结晶，固液分离，固体干燥，制得Fmoc-L-Ile-Aib-OR；(3)将Fmoc-L-Ile-Aib-OR溶于溶剂中，加碱调节pH至11-12，搅拌反应；反应结束，加酸调节pH为8-9，用乙酸乙酯即EA和PE混合萃取除杂后，加入Fmoc-OSu进行反应，过程中加碱维持pH为8-9；反应结束，用EA和PE混合萃取除杂，加入EA，调节pH至3-4，搅拌，静置，收集EA层，用10％NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，固液分离，液体浓缩，加入PE，结晶，固液分离，固体干燥，制得Fmoc-L-Ile-Aib-OH。
5.如权利要求3或4所述短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述H-Aib-OH与SOCl2的摩尔比为1:1.2，H-Aib-OH与ROH的用量比为1mol:1L；反应温度为30～40℃。
6.如权利要求3或4所述短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述活化剂为1-羟基苯并三氮唑即HOBt，缩合剂为N,N’-二异丙基碳二亚胺即DIC或N,N’-二环己基碳二亚胺即DCC，缚酸剂为N,N-二异丙基乙胺即DIEA、N-甲基吗啉即NMM或三乙胺即TEA，有机溶剂为DCM或四氢呋喃即THF。
7.如权利要求3或4所述短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述Fmoc-L-Ile-OH、活化剂、H-Aib-OR.HCl、缚酸剂、缩合剂的摩尔比为1:1:1.2:1.2:1.2；反应温度为20～30℃。
8.如权利要求3或4所述短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述Fmoc-L-Ile-Aib-OR的水解反应是以体积比为1:3的THF和水为溶剂，在用NaOH调节pH为11-12的条件下进行；所述H-L-Ile-Aib-OH与Fmoc-OSu的反应是在用Na2CO3维持pH为8-9的条件下进行。
9.如权利要求3或4所述短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述H-L-Ile-Aib-OR与Fmoc-OSu的摩尔比为1:1。
10.如权利要求2至4任一项所述短肽Fmoc-L-Ile-Aib-OH的制备方法，其特征在于，所述ROH、H-Aib-OR和Fmoc-L-Ile-Aib-OR中的R为乙基。
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