CN116789731A - 短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了短肽Fmoc‑L‑Ala‑L‑Ala‑OH的制备方法，采用液相合成法，先将N‑芴甲氧羰基‑L‑丙氨酸即Fmoc‑L‑Ala‑OH与活化剂HOR在缩合剂存在下于有机溶剂中反应，制得活性酯Fmoc‑L‑Ala‑OR，再将其与三甲基硅基即TMS临时性保护的L‑丙氨酸即H‑L‑Ala‑OH偶联，制得短肽Fmoc‑L‑Ala‑L‑Ala‑OH。本发明所述制备方法创造性地将‑TMS临时性保护用于短肽合成，无需柱层析纯化，即可简单高效地制得纯度高于90％的目标短肽，具有步骤短、操作简单、产物纯度高、收率高、制备成本低等优势，适合工业化大规模生产，所得短肽可用于生产多肽药物索玛鲁肽、利拉鲁肽、贝那鲁肽、度拉糖肽等，有效避免在制备多肽时逐个偶联H‑L‑Ala‑OH容易产生的氨基酸缺失问题。
Description
技术领域
本发明属于多肽合成技术领域，涉及一种短肽的制备方法。
背景技术
糖尿病是因胰岛素绝对或相对分泌不足以及胰岛素利用障碍引发机体糖、蛋白质、脂质等代谢紊乱性疾病，目前已成为全球性公共健康问题，世界各国糖尿病患者人数逐年增多。作为一类新型降糖药物，索玛鲁肽、利拉鲁肽、贝那鲁肽、度拉糖肽等胰高血糖样肽-1受体激动剂(GLP-1RA)，不仅在降糖方面表现突出，而且在减重、心血管系统获益以及安全性等方面表现出了显著的优势，临床应用越来越广泛。
目前GLP-1RA主要采用从C端至N端逐个氨基酸偶联制备主肽链多肽序列的固相合成法来制备，每一个氨基酸的引入涉及偶联和脱除Fmoc保护基，不仅操作繁琐，而且存在氨基酸消旋、氨基酸异构、氨基酸缺失(缺损肽或不完整肽)等风险。索玛鲁肽、利拉鲁肽、贝那鲁肽、度拉糖肽等多肽肽序中都含有-Ala-Ala-短肽片段，研究发现，氨基酸缺失问题在逐个偶联Ala的过程中尤为明显。如果能预先制备-Ala-Ala-短肽片段，通过短肽片段的偶联来制备多肽序列就能克服上述氨基酸缺失问题。
短肽片段的合成，可以采用固相合成法、液相合成法等。固相合成法具有合成速度相对较快、后处理相对简单的优势，但其需要昂贵的树脂、大量的溶剂以及大大过量的氨基酸，存在制备成本很高、短肽片段纯度较低等不足。如果所得短肽片段不经过纯化就与其他片段偶联，会使最终制得的多肽纯度更低，既增加纯化难度又增加制备成本，显然固相合成法不是制备-Ala-Ala-短肽片段的最佳选择。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于通过液相合成法制备-Ala-Ala-短肽片段，产物纯度高、收率高、耗时短、成本低，适合工业化大规模生产，所得短肽片段可用于生产多肽药物索玛鲁肽、利拉鲁肽、贝那鲁肽、度拉糖肽等。
经研究，本发明提供如下技术方案：
1.短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的制备方法，采用液相合成法，包括以下步骤：
(1)将N-芴甲氧羰基-L-丙氨酸即Fmoc-L-Ala-OH与活化剂HOR在缩合剂存在下于有机溶剂中反应，制得活性酯Fmoc-L-Ala-OR；
(2)将Fmoc-L-Ala-OR与三甲基硅基即TMS临时性保护的L-丙氨酸即H-L-Ala-OH偶联，制得短肽N-芴甲氧羰基-L-丙氨酰-L-丙氨酸即Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH；
上述HOR和Fmoc-L-Ala-OR中的R为
优选的，所述步骤(2)是先将H-L-Ala-OH在缚酸剂存在下于有机溶剂中用三甲基氯硅烷即TMS-Cl进行临时性保护，再与Fmoc-L-Ala-OR偶联，最后在酸性条件下脱除TMS保护基，制得短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH。
更优选的，所述短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的制备方法，包括以下步骤：
(1)将Fmoc-L-Ala-OH和活化剂HOR溶于有机溶剂中，控制温度在0℃以下，滴加缩合剂，加毕，搅拌反应；反应结束后，固液分离，收集含有Fmoc-L-Ala-OR的反应液，备用；
(2)将H-L-Ala-OH和TMS-Cl溶于有机溶剂中，加入缚酸剂，搅拌反应，然后控制温度为-5～0℃，滴加步骤(1)所得含有Fmoc-L-Ala-OR的反应液，加毕，继续控温-5～0℃搅拌反应；反应结束后，依次用1mol/LHCl溶液、5％ NaCl溶液萃洗，收集有机层，无水硫酸钠干燥，固液分离，液体浓缩，加入石油醚，搅拌结晶，固液分离，固体干燥，即得短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH。
在上述技术方案的步骤(2)中，本发明创造性地采用-TMS对H-L-Ala-OH进行临时性保护，生成TMS-L-Ala-OTMS后再与Fmoc-L-Ala-OBt缩合，能完全避免杂质Fmoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-OH的产生，而TMS保护基在缩合反应后通过简单的酸水洗涤就能脱除，可以简单高效地制得纯度高于90％的目标短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH。
优选的，所述HOR和Fmoc-L-Ala-OR中的R为即活化剂HOR为N-羟基苯并三唑(HOBt)。
优选的，步骤(1)中所述缩合剂为N,N’-二异丙基碳二亚胺即DIC或N,N’-二环己基碳二亚胺即DCC，有机溶剂为二氯甲烷即DCM。
更优选的，步骤(1)中所述缩合剂为DIC。
优选的，步骤(2)中所述缚酸剂为N,N-二异丙基乙胺即DIEA、N-甲基吗啉即NMM或三乙胺即TEA，有机溶剂为DCM。
更优选的，步骤(2)中所述缚酸剂为DIEA或TEA。
优选的，所述Fmoc-L-Ala-OH、活化剂、缩合剂、H-L-Ala-OH、TMS-Cl、缚酸剂的摩尔比为1:1.0-1.2:1.0-1.3:1.0-1.3:2.0-2.6:2.0-2.6。
更优选的，所述Fmoc-L-Ala-OH、活化剂、缩合剂、H-L-Ala-OH、TMS-Cl、缚酸剂的摩尔比为1:1.2:1.2:1.2:2.4:2.4。
本发明的有益效果在于：本发明公开了短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的制备方法，创造性地将-TMS临时性保护用于短肽合成，无需柱层析纯化，即可简单高效地制得高纯度的目标短肽，具有步骤短、操作简单、产物纯度高、收率高、制备成本低等优势，适合工业化大规模生产，所得短肽可用于生产多肽药物索玛鲁肽、利拉鲁肽、贝那鲁肽、度拉糖肽等，有效避免在制备多肽时逐个偶联H-L-Ala-OH容易产生的氨基酸缺失问题。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1小试与条件优化
(1)中间体Fmoc-L-Ala-OBt的制备
在500mL反应瓶中加入0.1mol Fmoc-L-Ala-OH、0.12mol HOBt和200mL DCM，搅拌溶清，控制温度在0℃以下，搅拌下以每秒5滴的速率加入0.12mol DIC，加毕，室温搅拌反应，薄层层析(TLC)跟踪反应过程(展开剂为氯仿:甲醇:乙酸＝10:1:0.1,v/v)。反应结束后(约4h)，过滤，收集滤液(含Fmoc-L-Ala-OBt)，备用。
(2)目标短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的制备
在1000mL反应瓶中加入0.12mol H-L-Ala-OH、0.24mol TMS-Cl和300mL DCM，搅拌反应1h，缓慢加入0.24mol DIEA，继续搅拌反应4h，降温至-5～0℃，搅拌下以每秒5滴的速率加入步骤(1)所得滤液(含Fmoc-L-Ala-OBt)，加毕，继续控温-5～0℃搅拌反应，TLC跟踪反应过程(展开剂为乙酸乙酯:石油醚＝1:1,v/v)。反应结束后(约3～4h)，依次用1mol/LHCl溶液(300mL×2)、5％ NaCl溶液(300mL×2)萃洗，收集DCM层，加入60g无水硫酸钠干燥2h，过滤，滤液减压浓缩至1/3体积，加入400mL石油醚，搅拌结晶4h，抽滤，固体干燥，制得33.1g Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH，收率86.6％。HPLC检测显示，产物纯度为99.71％，单个最大杂质为0.12％；产物旋光
采用1H NMR、13C NMR和ES-API MS确认产物为Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH，结构表征数据如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.13(d,J＝7.3Hz,1H),7.89(d,J＝7.5Hz,3H),7.73(t,J＝7.4Hz,2H),7.50(d,J＝7.8Hz,1H),7.42(t,J＝7.4Hz,2H),7.33(t,J＝7.4Hz,2H),4.30-4.25(m,2H),4.23-4.21(m,1H),4.20-4.17(m,1H),4.12-4.03(m,1H),1.28(d,J＝8Hz,3H),1.23(d,J＝8Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ174.51,172.79,156.12,144.26,141.17,128.11,127.55,125.76,120.56,66.07,50.16,47.91,47.12,18.62,17.64.HR MScalcd for C21H22N2O5,[M+H]+:383.1,found:383.1。
目标短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的其它合成实验结果见表1。
表1目标短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的其它合成实验结果
表1数据表明，按照上述制备方法，物料Fmoc-L-Ala-OH、HOBt、DIC、H-L-Ala-OH、TMS-Cl、DIEA的摩尔比为1:1.0-1.2:1.0-1.3:1.0-1.3:2.0-2.6:2.0-2.6时，产物纯度都高于90％，无需进一步纯化即可满足后续偶联要求；上述物料摩尔比为1:1.0-1.2:1.0-1.3:1.1-1.3:2.2-2.6:2.2-2.6时，产物纯度高于96％、收率大于77％；摩尔比为1:1.1-1.2:1.2-1.3:1.2-1.3:2.4-2.6:2.4-2.6时，产物纯度高于98％、收率大于81％；摩尔比为1:1.2:1.2:1.2:2.4:2.4时，产物纯度(99.71％)、收率(86.6％)都最高且成本最低。
基于表1最优的物料摩尔比，本发明考察了不同的活化剂、缩合剂以及缚酸剂对目标产物纯度及收率的影响，结果见表2。
表2不同活化剂、缩合剂、缚酸剂对Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH合成的影响
表2数据表明，其它条件相同时，缩合剂DIC的反应效果优于DCC(比较Entry 1与Entry2)；活化剂HONB、HOBt的反应效果优于HOSu(比较Entry 1与Entry 3和Entry 4)，HONB与HOBt对反应结果的影响相近(比较Entry 3与Entry4)，但HOBt更便宜，使用HOBt成本更低；缚酸剂NMM的反应效果略差于DIEA和TEA(比较Entry 1与Entry 5和Entry 6)，DIEA和TEA对反应结果的影响差别不大(比较Entry1与Entry5)。因此优选DIC作为缩合剂、HOBt作为活化剂、DIEA与TEA作为缚酸剂。
从上述合成实验结果可以看出，含有中间体Fmoc-L-Ala-OBt的反应液不用处理，可直接投入下一步反应；H-L-Ala-OH用TMS-Cl进行简单保护后，就可以与Fmoc-L-Ala-OBt发生缩合反应，且无副反应发生，而TMS保护基后续用简单的酸水萃洗就可脱除；无需柱层析纯化，即可制得纯度高于90％的目标短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH。因此，本发明制备方法具有步骤短、操作简单、产物纯度高、收率高、制备成本低等优势。
实施例2放大试验
(1)中间体Fmoc-L-Ala-OBt的制备
在1000mL反应瓶中加入0.2mol Fmoc-L-Ala-OH、0.24mol HOBt和400mL DCM，搅拌溶清，控制温度在0℃以下，搅拌下以每秒5滴的速率加入0.24mol DIC，加毕，室温搅拌反应，TLC跟踪反应过程(展开剂为氯仿:甲醇:乙酸＝10:1:0.1,v/v)。反应结束后(约4h)，过滤，收集滤液(含Fmoc-L-Ala-OBt)，备用。
(2)目标短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的制备
在3000mL反应瓶中加入0.24mol H-L-Ala-OH、0.48mol TMS-Cl和600mL DCM，搅拌反应1h，缓慢加入0.48mol DIEA，继续搅拌反应4h，降温至-5～0℃，搅拌下以每秒5滴的速率加入步骤(1)所得滤液(含Fmoc-L-Ala-OBt)，加毕，继续控温-5～0℃搅拌反应，TLC跟踪反应过程(展开剂为乙酸乙酯:石油醚＝1:1,v/v)。反应结束后(约3～4h)，依次用1mol/LHCl溶液(600mL×2)、5％ NaCl溶液(600mL×2)萃洗，收集DCM层，加入120g无水硫酸钠干燥2h，过滤，滤液减压浓缩至1/3体积，加入800mL石油醚，搅拌结晶4h，抽滤，固体干燥，制得65.6g Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH，收率85.9％。HPLC检测显示，产物纯度为99.76％，单个最大杂质为0.13％；产物旋光
实施例3放大试验
(1)中间体Fmoc-L-Ala-OBt的制备
在5000mL反应瓶中加入1mol Fmoc-L-Ala-OH、1.2mol HOBt和2000mL DCM，搅拌溶清，控制温度在0℃以下，搅拌下以每秒5滴的速率加入1.2mol DIC，加毕，室温搅拌反应，TLC跟踪反应过程(展开剂为氯仿:甲醇:乙酸＝10:1:0.1,v/v)。反应结束后(约4h)，过滤，收集滤液(含Fmoc-L-Ala-OBt)，备用。
(2)目标短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的制备
在10000mL反应瓶中加入1.2mol H-L-Ala-OH、2.4mol TMS-Cl和3000mL DCM，搅拌反应1h，缓慢加入2.4mol DIEA，继续搅拌反应4h，降温至-5～0℃，搅拌下以每秒5滴的速率加入步骤(1)所得滤液(含Fmoc-L-Ala-OBt)，加毕，继续控温-5～0℃搅拌反应，TLC跟踪反应过程(展开剂为乙酸乙酯:石油醚＝1:1,v/v)。反应结束后(约3～4h)，依次用1mol/L HCl溶液(3000mL×2)、5％ NaCl溶液(3000mL×2)萃洗，收集DCM层，加入600g无水硫酸钠干燥2h，过滤，滤液减压浓缩至1/3体积，加入4000mL石油醚，搅拌结晶4h，抽滤，固体干燥，制得332.8g Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH，收率87.1％。HPLC检测显示，产物纯度为99.73％，单个最大杂质为0.12％；产物旋光
实施例2和3的放大实验结果表明，采用本发明方法合成目标短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH，反应收率优秀，产物纯度极好，单杂没有明显增大，适合大规模工业生产。
对比实施例1
(1)中间体Fmoc-L-Ala-ONB的制备
在500mL反应瓶中加入0.1mol Fmoc-L-Ala-OH、0.12mol HONB和200mL DCM，搅拌溶清，控制温度在0℃以下，搅拌下以每秒5滴的速率加入0.12mol DIC，加毕，室温搅拌反应，TLC跟踪反应过程(展开剂为氯仿:甲醇:乙酸＝10:1:0.1,v/v)。反应结束后(约4h)，过滤，收集滤液浓缩成油状物(含Fmoc-L-Ala-ONB)，备用。
(2)目标短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的制备
在1000mL反应瓶中加入0.12mol H-L-Ala-OH、0.144mol Na2CO3和300mL H2O，搅拌溶清，随后加入50mL THF，搅拌均匀；将步骤(1)得到的油状物(含中间体Fmoc-L-Ala-ONB)溶于100mL THF，以每秒5滴的速率加入到反应体系中，控制温度为20～25℃，快速搅拌反应，用Na2CO3维持反应体系pH＝8～9，TLC跟踪反应过程(展开剂为乙酸乙酯:石油醚＝1:1,v/v)。反应结束后(3-4h)，加入乙酸乙酯+石油醚萃取杂质2次(每次50mL乙酸乙酯+150mL石油醚)，收集水层，用浓盐酸调体系pH＝2～4，加入300mL乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯层，用饱和食盐水萃洗(300mL×2)后，加入30g无水硫酸钠干燥2h，过滤，收集滤液，减压浓缩至1/3体积，加入400mL石油醚，搅拌结晶4h，过滤，固体干燥，得到25.1g Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH，收率为65.7％；HPLC检测显示，目标产物的纯度仅为78.36％，杂质Fmoc-L-Ala-OH为6.9％、Fmoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-OH为11.4％。
由上述对比实施例可以看出，采用Fmoc-L-Ala-ONB与H-L-Ala-OH在碱性含水溶剂中缩合，容易产生Fmoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-OH杂质，难以得到高纯度的目标产物，合成结果明显差于实施例1-3。本发明先采用TMS-Cl对H-L-Ala-OH进行临时性保护，生成TMS-L-Ala-OTMS后再与Fmoc-L-Ala-OBt缩合，就能完全避免杂质Fmoc-L-Ala-L-Ala-L-Ala-OH的产生，而TMS保护基在反应后通过简单的酸水洗涤就能脱除。此外，本发明的反应直接在有机溶剂中进行，H-L-Ala-OH与TMS-Cl反应后可增加其在有机溶剂中的溶解性，有利于缩合反应的高效完成。可见，本发明创造性地将-TMS临时性保护用于短肽合成，可以简单高效地制得高纯度的短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的制备方法，其特征在于，采用液相合成法，包括以下步骤：
(1)将N-芴甲氧羰基-L-丙氨酸即Fmoc-L-Ala-OH与活化剂HOR在缩合剂存在下于有机溶剂中反应，制得活性酯Fmoc-L-Ala-OR；
(2)将Fmoc-L-Ala-OR与三甲基硅基即TMS临时性保护的L-丙氨酸即H-L-Ala-OH偶联，制得短肽N-芴甲氧羰基-L-丙氨酰-L-丙氨酸即Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH；
上述HOR和Fmoc-L-Ala-OR中的R为
2.如权利要求1所述的短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)是先将H-L-Ala-OH在缚酸剂存在下于有机溶剂中用三甲基氯硅烷即TMS-Cl进行临时性保护，再与Fmoc-L-Ala-OR偶联，最后在酸性条件下脱除TMS保护基，制得短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH。
3.如权利要求2所述的短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将Fmoc-L-Ala-OH和活化剂HOR溶于有机溶剂中，控制温度在0℃以下，滴加缩合剂，加毕，搅拌反应；反应结束后，固液分离，收集含有Fmoc-L-Ala-OR的反应液，备用；
(2)将H-L-Ala-OH和TMS-Cl溶于有机溶剂中，加入缚酸剂，搅拌反应，然后控制温度为-5～0℃，滴加步骤(1)所得含有Fmoc-L-Ala-OR的反应液，加毕，继续控温-5～0℃搅拌反应；反应结束后，依次用1mol/L HCl溶液、5％NaCl溶液萃洗，收集有机层，无水硫酸钠干燥，固液分离，液体浓缩，加入石油醚，搅拌结晶，固液分离，固体干燥，即得短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH。
4.如权利要求1至3任一项所述短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的制备方法，其特征在于，所述HOR和Fmoc-L-Ala-OR中的R为
5.如权利要求1至3任一项所述短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述缩合剂为N,N’-二异丙基碳二亚胺即DIC或N,N’-二环己基碳二亚胺即DCC，有机溶剂为二氯甲烷即DCM。
6.如权利要求5所述短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述缩合剂为DIC。
7.如权利要求1至3任一项所述短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述缚酸剂为N,N-二异丙基乙胺即DIEA、N-甲基吗啉即NMM或三乙胺即TEA，有机溶剂为DCM。
8.如权利要求7所述短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述缚酸剂为DIEA或TEA。
9.如权利要求1至3任一项所述短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-L-Ala-OH、活化剂、缩合剂、H-L-Ala-OH、TMS-Cl、缚酸剂的摩尔比为1:1.0-1.2:1.0-1.3:1.0-1.3:2.0-2.6:2.0-2.6。
10.如权利要求9所述短肽Fmoc-L-Ala-L-Ala-OH的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-L-Ala-OH、活化剂、缩合剂、H-L-Ala-OH、TMS-Cl、缚酸剂的摩尔比为1:1.2:1.2:1.2:2.4:2.4。
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