SU793385A3 - Способ получени полипептида - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА

Claims (2)

1. Изобретение относитс  к способу получени  нового полипептида-аналога кальцитонина, биологически активного соединени , которое может найти применение в медицине. В пептидной хими широко известны способы образовани  пептидной св зи, например карбодиимидный l , также широко используют дл  отщеплени  защитных групп фтористый водород 2J. Цель изобретени  - получение новых соединений, обладающих ценными фармакологическими свойствами. Поставленна  цель достигаетс  опи сываемым способом получени  полипептида формулы (1) , -tCHo), ;0-Гли-Асн-Лей-Сер-Тр- HN С Н С 0-Мет- Лей -Гли-Тр-Тир-Тр-Глн-Асп-Фе-Асн-Лиз-Фе -Гис-Тр-Фе-Про-Глн-Тр-Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-М Н
2. 2. Способ заключаетс  в том, что соеди нение формулы С1 I) I: (CHj);,; Ч;0-Гли-Асн-Лей-Сер-/Взе ЬТр-/Взе ;- Н N с Н -Мет-Лей-Гли-ОН денсируют с соединением форму (III) р- Взе -Тир- ВзС-(Cl2)-Tp-Bзe-Глнп-OBзC-Фe-Acн-Лиз-CECбз-Фe-Гиc-Bз6 -Фе-Про-Глн-Тр-Вз г -Ала-Илеи-Baл-Гли-Aлa-Пpo-NHг оследующим отщеплением защитных пп от полученного лродук та кондении . В указанных формулах прин ты слещие сокращени : Вос-трет-бутоксикарбонил Сбз-бензилоксикарбонил Вз -бензил ВзЕ (Сба. )-дихлорбензил OEt-этиловый сложный эфир ОВзй-бензиловый сложный зфир Cep-L-серин Лей-1-лейцин Вал-1-валин Apr-L-аргинин Ала-L-аланин Лиз-1-лизин Глю-1-глютаминова  кислота Тир-1-тирозин Фе-L-фенилаланин ТФК-трифторуксусна  кислота ЦГА-циклогексиламин ТГФ-тетрагидрофуран AcOEt-этилацетат WSC-К-этил-Ы-диметиламинопропилкарбодиимид rCH-N-OKCHcyKUHHMMHfl МеОН-метанол АсОН-уксусна  кислота ГМФА-гексаметилфосфортриамид АОС-трет-амилоксикарбонил СССбэ-о-хлорбензилоксикарбонил Тоз-тозил Ови-трет-бутиловый сложный эфир ONP-п-нитрофениловый сложный эфир OSU-N-оксисукцинилимидный сложный AcH-L-аспарагин Tp-L-треонин Про-1-пролин Acn-L-аспарагинова  кислота Гли-глицин Глн-1-глютамин Гис-1-гистидин Мет-1-метионин Иле-1-изолейцин ТозОН-п-толуолсульфокислота ДЦГА-дициклогексиламин ДМФ-диметилформамид ДЦК-дициклогексилкарбодйимид ОБТ-1-оксибензотриазол EtOH-этанол БуОН-бутанол Аминокислотный анализ. Образец гидролизуют 6 в. сол ной кислотой (с добавлениеп нескольких капель анизола) при 110°С в течение 45 ч и сушат при пониженном давлени а затем подвергают аминокислотному анализу. Пример. Получение (С.2 )5 :0-Гли-Асн-Лей-Сер-Тр-ННСНСО-Мет-Ле -Гли-Тр-Тир-Тр-Глн-Асп-Фе-Асн-Лиз-Ф Гис-Тр-Фе-Про-Глн-Тр-Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-МНг 2,О г (0,6 моль) ВОС-Тр-ВзЕ-Тир-тЬзе/ (,С&а ) -Тр-ВзЕ-Глн-Асп-ВзЕ -Фе-Асн -Лиз-СЕСбз-Фе-Гис-Тр-ВзЕ.-Фе-Про-Глн -Тр Вз -Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про -NH2. раствор ют в 10 мл ТГФ при -5° Раствор перемешивают в течение 30 м при комнатной температуре и концент рируют в вакууме, продукт осаждают этилацетатом. Осадок отдел ют, суша над гидроокисью натри . Сухой осадо раствор ют в 10 мл ДМФ и устанавливают рН 9 путем добавлени  триэтила на при охлаждении. К раствору приба л ют воду до образовани  осадка. Ос док отдел ют, сушат над дл  по лучени  вое соединени  в виде свобо ного основани . 0,8 г(О,71 моль) Ю-Гли-Асн-Лей-Сер-ВзЕ-Тр-Взб-HNCHC -Мет-Лей-Гли-ОН раствор ют в 5 мл смеси ДМФ и N-метилпирролидона (1:1 К раствору прибавл ют 122 мг 0511, а затем при охлаждении 146 мг ДЦК, растворенного в 3 мл ДМФ, и перемешивают в течение ночи. Выпавший осадок удал ют и к маточнику прибавл ют ВОС-свободное основание, полученное выше, и прибавл ют 100 мг ОБТ, потом смесь перемешивают 5 дней при 30 С. К реакционной смеси прибавл ют воду. Отфильтровывают образовавшийс  при этом осадок, промывают водой, затем сушат, получают 2,6 г CO-Гли-Асн-Лей-Сер-ВзВ-Тр-Взб-HNCHCO-Мет-Лей-Гли-Тр-ВзК-Тир-ВзЕ (СК)-Тр-Взе-Глн-Асн-ОВзе-Фе-Асн-Лиз-Cg Сбз-Фе-Гис-Тр-Взб-Фе-Про-Глн-ТрВзЕ-Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-МНг в качестве сырого продукта. 1,0 г этого продукта обрабатывают 25 мл фтористого водорода, 0,1 г метионина и 2 мл анизола при -5°С в течение 60 мин при охлаждении смесью сухого льда и метанола при пониженном давлении в присутствии диметилтиоэфира. После отгонки фтористого водорода остаток промывают диэтиловым эфиром и собирают декантацией . Процедуру повтор ют три раза, и осадок раствор ют в смешанном растворе 30 мл уксусной кислоты и 10 мл воды. Затем раствор пропускают через колонку с Дауэкс (12) ацетатна  форма (2, см), промывают 200 мл воды и снова пропускают элюат через колонку НР-20 (2,5x7 см). 80%-ный этанольный раствор пропускают через колонку и после удалени  из элюата этанола раствор лиофилизируют, получают 440 мг порошка. Раствор 440 мг порошка в 0,01 М водном ацетате аммони  внос т в колонку, наполненную СМ-целлюлозой (2, см) и продукт элюируют с линейным градиентом элюировани  0,01-0,2 1 М ацетатом аммони  (каждый - 750 мл), рН-4,5. Собирают фракции по 10 мл и активные фракции (фракции №№ 67-70) объедин ют и сушат вымораживанием дл  получени  активного порошка. Лиофилизат раствор ют в 1 М уксусной кислотеи хроматографируют на колонке с Сефадексом (2, м), элюиру  продукт 1 М АсОН. Собирают фракции по 6 мл, активные фракции (№№ 28-37) лиофилизируют. Лиофилиэат раствор ют в верхнем слое смеси бутанола, уксусной кислоты и воды (4:1:5) и загружают раствор в колонку с Сефадексом G-25 (2,7 f Х52 см), который был упакован вместе. с нижним слоем указанной выше смеси растворителей и после этого помещен в верхний слой указанной смеси растворителей . Элюирование провод т тем же верхним слоем, активные фракции (трубки 5-14) собирают и лиофилизируют . Полученный порошок повторно хроматографируют в тех же услови х на Сефадексе G-25 и лиофйлизируют. Лиофилизированный активный порошок раствор ют в 1 М уксусной кислоте, выливают в колонку с Сефадексом LH-20 (2, см), элюируют 1 М уксусной кислотой, собирают фракции по 5 г. Активные фракции объедин ют и лиофйлизируют дл  получени  29,7 мг продукта 1000 MRC (мг) . Rr О,82/носитёль Мерк целлюлоза, про витель:н-бутанолуксусна  кислота-вода-пиридин (15: 3:12:10). RI; О, 43/носитель Мерк целлюлоза, про витель:н-бутанол-уксусна  кислота-вода (верхний слой)4:1:5/. (d)j)- -69,6(,72, 1 М уксусна  кислота). Аминокислотный анализ: Лиз 1,15(1) Гис 1,01(1), Асп 2,94(3),Тр 4,80(5), Сер 1,06(1), Глю 2,14(2),Про 1,96(2), Гли 4,00(4), Ала 2,00(2),Вал 0,95(1), Мет 0,87(1), Иле 0,96(1),Лей 1,84(2), Тир 0,96(1),Фе 3,18(3), .L-аминопробкова  кислота 1,02(1). Формула изобретени  Способ получени  полипептида формулы (I) (снг),., :О-Гли-Асн-Лей-Сер-Тр- HN с Н С 0-Meт-rЛeй-Гли-Tp-Tиp-Tp-Глн-Acп-Фe-Acн-Лиз-Фe-Гиc-Tp-Фe-Пpo-Глн-Tp-Aлa-Илe-Гли-Вал-Гли-Ала-Про-МНа , отличающийс  тем, что соединение формулы (II) (CH,j)5-Гли-Асн-Лей-Сер-Взб-Тр-ВзЕ-HN С Н С О-Мет-Лей-Глй-ОН конденсируют с соединением формулы (III) Н-Тр-Вз6-Тир- взЕ(CKj)J-Тр-ВзЕ-Глн-Дсп-ОВзЕ-Фе-Асн-Лиз-сеСбз-Фе-Гис-Тр-ВзЕ-Фе-Про-Глн-Тр-ВзЕ-Ала-Иле-Гли-Вал-Гли-Ала-Про- N с последующим отщеплением защитных групп от полученного продукта конденсации . Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1.Шредер Э., Любке К., Пептиды, ч, 1, М., Мир, 1967, с. 116. 2,Там же, стр. 112.