CH633566A5

CH633566A5 - Process for the preparation of a novel polypeptide which reduces the levels of serum calcium

Info

Publication number: CH633566A5
Application number: CH1373377A
Authority: CH
Inventors: Shumpei Sakakibara; Tadanori Morikawa; Yasuo Nakagawa
Original assignee: Toyo Jozo Kk
Priority date: 1976-11-11
Filing date: 1977-11-10
Publication date: 1982-12-15
Also published as: BE860698A; DK498777A; FR2370720B1; SU793385A3; AT365165B; AU512714B2; HU180539B; NL7712386A; SE7712634L; NZ185658A; ATA804377A; AU3049577A; JPS5761730B2; JPS5359688A; DE2750567A1; SU1028662A1; CA1094051A; GB1590645A; FR2370720A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur 5° enthält<in welcher R einen reaktionsfähigen Esterrest darstellt, Herstellung eines neuen Polypeptides der Formel I m jeder behebigen Stufe der Reaktion einer Ringschlussreaktion unterwirft. Allfällige Schutzgruppen für die reaktionsfähigen ————— l LH 2 J g-i Gruppen können in jeder gewünschten Stufe der Reaktion

• entfernt werden. Falls erwünscht, kann das Produkt in seine

CO-GIy-Asn-Leu-Ser-Thr-NH-CH-CO-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-55 Säureadditionssalze oder Komplexe übergeführt werden. Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-IIe-Gly-Val- Die Schutzgruppen für die Synthese der Ausgangsmaterialien Gly-Ala-Prp-NH2 [I] oder Zwischenstufen sind übliche Schutzgruppen für die Peptid-

und deren Säureadditionssalze. synthese und sollten durch Hydrolyse, Säurezersetzung, Reduk-

Das Polypeptid der Formel I weist Serumcalcium herabset- tion, Aminolyse oder Hydrazinolyse leicht entfernbar sein, zende Wirksamkeit auf. 60 Beispielsweise können die Aminogruppen auf übliche Weise

Calcitonin ist ein bekanntes Polypeptid, welches Serumcal- geschützt werden durch eine Acylgruppe, wie die Formyl-,

cium herabsetzende Wirksamkeit bei Säugetieren aufweist und Trifluoracetyl-, Phthaloyl-, Benzolsulfonyl-, p-Toluolsulfonyl-, aus der Schilddrüse von Säugetieren oder dem letzten Branchial- o-Nitrophenylsulfenyl- oder 2,4-Dinitrophenylsulfenylgruppe, körper (ultimo branchial body) von Vögeln oder Fischen isoliert eine Aralkylgruppe, wie z. B. die Benzyl-, Diphenylmethyl- oder wird. Die Folge der Aminosäuren in Calcitonin hängt vom 65 Triphenylmethylgruppe (diese Gruppen können gegebenenfalls Ursprung der Arten ab, und synthetische Calcitonine mit dersel- mit einer niederen Alkoxygruppe, wie der o-Methoxy- oder p-ben chemischen Struktur wie diejenigen natürlichen Ursprungs Methoxygruppe substituiert sein), eine Benzyloxycarbonyl-wurde vor kurzem bekannt. gruppe,wiedieBenzyloxycarbonyl-,o-Brombenzyloxycarbo-

[

nyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, o-Chlorbenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl- oder p-(p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxycarbonylgruppe, eine aliphatische Oxycarbonyl-gruppe, wie die Cyclopentyloxycarbonyl-, Trichloräthyloxycar-bonyl-, t-Amyloxycarbonyl-, t-Butoxycarbonyl-oderDiisopro-pylmethoxycarbonylgruppe, oder eine Aralkyloxycarbonyl-gruppe, wie die 2-Phenylisopropoxycarbonyl-, 2-Toryl-isopropo-xycarbonyl- oder 2-p-Diphenyl-isopropoxycarbonylgruppe. Diese Aminogruppen können geschützt werden durch Enamin-bildung durch Umsetzung mit 1,3-Diketon, wie Benzoylaceton, Acetylaceton oder Dimedon.

Die Carboxylgruppe kann geschützt werden durch Amidbil-dung, Hydrazidbildung oder Veresterung. Die Amidgruppe wird mit einer 3,4-Dimethoxybenzyl- oder Bis-(p-methoxyphenyl)-methylgruppe substituiert. Die Hydrazidgruppe ist substituiert mit einer Benzyloxycarbonyl-, Trichloräthyloxycarbonyl-, Tri-fluoracetyl-, t-Butoxycarbonyl-, Trityl- oder2-p-Diphenyl-iso-propoxycarbonylgruppe. Die Estergruppe ist substituiert mit einem Alkanol, wie Methanol, Äthanol, t-Butanol oder Cyano-methylalkohol; einem Aralkanol, wie Benzylalkohol, p-Brom-benzylalkohol, p-Chlorbenzylalkohol, p-Methoxybenzylalko-hol, p-Nitrobenzylalkohol, 2,4,6-Trimethylbenzylalkohol, Benz-hydrylalkohol, Benzoylmethylalkohol, p-Brombenzoylmethylal-kohol oder p-Chlorbenzoylmethylalkohol; einem Phenol wie 2,4,6-Trichlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, p-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, p-Cyanphenol oderp-Methansulfonylphenol ; oder einem Thiophenol, wie Thiophe-nol, Thiocresol oder p-Nitro thiophenol. Die Hydroxygruppe in Serin, Threonin oder Tyrosin kann gegebenenfalls durch Veresterung oder Verätherung geschützt werden. Eine durch Veresterung geschützte Gruppe ist zum Beispiel eine niedere Al-kanoylgruppe, wie eine Acetylgruppe; eine Aroylgruppe, wie eine Benzoylgruppe oder eine von einem Carbonyl abgeleitete Gruppe, wie Benzyloxycarbonyl oder Äthyloxycarbonyl. Ein durch Verätherung geschützte Gruppe ist zum Beispiel eine Benzyl-, Tetrahydropyranyl- oder t-Butylgruppe. Der Schutz der Hydroxygruppe kann mit einer 2,2,2-Trifluor-l-t-butyloxycarbo-nylaminoäthyl- oder 2,2,2-Trifluor-l-benzyloxycarbonylamino-äthylgruppe erfolgen. Es ist jedoch nicht immer notwendig, diese Hydroxygruppen zu schützen.

Die Iminogruppe in Histidin kann geschützt werden durch eine Benzyl-, Trityl-, Benzyloxycarbonyl-, Tosyl-, Adamantyl-oxycarbonyl-,2,2,2-Trifluor-l-t-butyloxycarbonylaminoäthyl-oder2,2,2-Trifluor-l-benzyloxycarbonylaminoäthylgruppe, jedoch erfordert die Iminogruppe nicht immer einen derartigen Schutz.

Die Peptide der Ausgangsmaterialien oder Zwischenprodukte werden üblicherweise durch Kondensation von Aminosäuren oder Peptiden - vorzugsweise 2 bis 4 Aminosäuren - in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel I synthetisiert. Beispielsweise wird eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter endständiger Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und geschützter endständiger Carboxylgruppe umgesetzt. Andererseits wird eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter endständiger Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier endständiger Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umgesetzt.

Die Carboxylgruppe kann aktiviert werden, z. B. durch Umwandlung in ein Säureazid, Säureanhydrid, Säureimidazolid oder einen aktiven Ester, wie durch Umwandlung in Cyanome-thylester, Thiophenylester, p-Nitrophenylester, p-Nitrothiophe-nylester, p-Methansulfonylphenylester, Thiodylester, 2,4-Dini-trophenylester,2,4,5-Trichlorphenylester, 2,4,6-Trichlorphenyl-ester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, N-Hydroxyphthaliminoester, 8-Hydroxychinolinester oder N-

633 566

Hydroxypiperidinester, Carbodiimid, N,N'-Carbonyl-diimida-zol oder ein Isoxazoliumsalz, wie Woodward-Reagens.

Die Carboxylgruppe kann auf übliche Weise aktiviert werden, z. B. durch Umwandlung in ein Säureazid, ein Säureanhydrid, einen aktiven Ester oder Carbodiimid.

Bevorzugte Kondensationsreaktionen sind die Wünsch-Methode, die Azide, Aktivester- oder Geiger-Methode. Bei der Kondensationsreaktion sollte eine Racemisierung sorgfältig vermieden werden.

Die Aufbaueinheit, welche das derart erhaltene Peptid der Formel

(CH7)CCOOR I 25

H-Glys-Asn-Leu-Ser-Thr-NHCHCO-

enthält, in welcher R dieselbe Bedeutung wie oben aufweist, wird der Ringbildung unterworfen. Die Ringbildung wird durch eine Kondensationsreaktion mit der aktivierten co-Carboxylgruppe in a-Aminokorksäure und der freien Aminogruppe in endständiger N-Aminosäure durchgeführt. Während der Kondensationsreaktion wird die Hydroxylgruppe von Serin und Threonin mit Vorteil geschützt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Kondensationsreaktion mit einem Peptid-ring (welcher gegebenenfalls geschützte aktive Gruppen enthält), welcher a-Aminokorksäure enthält und dem restlichen anderen grossen Peptid, welches gegebenenfalls geschützte aktive Gruppen aufweist, durchgeführt. Das heisst, das N-endständige Fragment bestehend aus der 1.6. —9. Aminosäure wird mit dem restlichen Peptid der ganzen Folge der 7.—10. bis 31. Aminosäure kondensiert. Um die Reaktionsfähigkeit der beiden Fragmente bei der Kondensation zu fördern und eine Racemisierung zu verhindern wird vorzugsweise Glycerin als C-endständige Aminosäure verwendet.

In der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise ein Peptid, welches aus der 1. —9. Aminosäurefolge besteht, mit einem Peptid umgesetzt, welches aus der 10.—31. Aminosäure besteht.

Diese Kondensationsreaktion kann durchgeführt werden, indem man von dem Peptid mit einer freien endständigen Carboxylgruppe nach der sogenannten Wünsch-Methode ausgeht, odernach der Aktivestermethode. Sie kann vorzugsweise jedoch auch nach der Azid-Methode erfolgen, welche von einem Peptid mit einer endständigen Azid- oder Hydrazidgruppe ausgeht, oder nach der gemischten Anhydrid-Methode.

Die Synthese des N-endständigen Fragmentes, wie eines Nonapeptides bestehend aus der 1. —9. Aminosäurefolge wird nun im Detail beschrieben, jedoch können auch das Hexapeptid 1—6, dasHeptapeptid 1—7 oder das Octapeptid 1—8 im wesentlichen nach derselben Methode erhalten werden.

Die Nonapeptidsequenz kann erzeugt werden durch Verbinden jeder Aminosäure mit niederem Peptid, bestehend aus 2 bis 4 Aminosäuren in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz von der C-endständigen Aminosäure ausgehend. Eine Aminosäure, wie Glycin, Leucin, a-Aminokorksäure, Threonin, Methionin, Serin oder Asparagin wird vorzugsweise nach der Aktivester-Methode kondensiert. Das niedere Peptid, wie Tripeptid 2—4, wird vorzugsweise nach der Geiger-Methode oder der Wünsch-Methode kondensiert.

Bei der Kondensationsreaktion mit Hilfe der Azid-, Aktivester- oder Säureanhydridmethode ist es nicht notwendig, die endständige Carboxylgruppe in Nonapeptid zu schützen. Die Carboxygruppe kann jedoch durch Veresterung mit einem Alkohol, wie Methanol, Benzylalkohol oder anderen Alkoholen geschützt werden. Die Estergruppe, wie die Methylestergruppe, kann mit verdünnter Natriumhydroxidlösung oder durch Umwandlung in das Hydrazid entfernt werden und die Benzyle-stergruppe kann durch katalytische Hydrierung entfernt werden.

3

5

10

i;

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65

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io

Die Aminogruppe des Zwischenproduktes wird durch eine übliche Schutzgruppe geschützt, wie z. B. einer Benzyloxycarbonyl-, Trityl-, t-Butoxycarbonyl- oder2-p-Diphenyl-isopropoxycarbo-nylgruppe. Die Carboxylgruppe kann, falls notwendig, durch übliche Veresterung geschützt werden. Die Hydroxylgruppe in 5 Serin und Threonin kann, falls notwendig, durch Veresterung unter Verwendung von t-Butanol, Benzylalkohol oder einem anderen Alkohol geschützt werden.

Die Benzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzylester- und Benzyl-estergruppe können durch katalytische Hydrierung in Gegenwart von Palladium auf Kohle entfernt werden. Die N-Trityl-gruppe wird mit wässriger Essigsäure abgespalten und die t-Butoxycarbonylgruppe kann mitTrifluoressigsäure entfernt werden. Die o-Nitrophenylsulfenylgruppe wird mit Chlorwasserstoff, Cyanwasserstoff oder schwefeliger Säure in einem organi- 15 sehen Lösungsmittel abgespalten. Die Diphenylisopropoxycar-bonylgruppe wird mit einem Gemisch von Essigsäure/Ameisen-säure/Wasser (7:1:2) abgespalten. Der Methylester, Äthylester oder p-Nitrobenzylester wird unter Verwendung von Hydrazin-hydrat in das Hydrazid umgewandelt. Die Methylestergruppe 20 kann mit verdünnter Natriumhydroxidlösung entfernt werden und der t-Butylester wird mit Trifluoressigsäure gespalten.

Ein Peptid mit endständigem C bestehend aus der Aminosäuresequenz von 7—10 bis 31, welches mit dem oben beschriebenen N-endständigen Peptid kondensiert wird, wird vorzugsweise synthetisiert durch Verbindung von C-endständiger Aminosäure (Aminosäure Nr. 31) oder C-endständigem Fragment, wie ein Peptid aus der Aminosäuresequenz 30—31,28—31,25—31, 24—31 oder 23—31, mit jeder Aminosäure oder niederem Peptid bestehend aus 2 bis 4 Aminosäuren in der Reihenfolge der gewünschten Aminosäuresequenz. Beispielsweise kann das C-endständige Fragment 10—31 hergestellt werden durch Kondensation von Aminosäuren von niederen Peptiden, wie das Dipep-tid 30—31 oder 28—29, das Tripeptid 25—27, das Dipeptid 23 —24, das Tripeptid 21—23, das Tetrapeptid 16—19 und das Hexapeptid 10—15 in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz vom C-Ende her. Bevorzugte Schutzgruppen für jede Gruppe sind: a-Aminogruppe durch t-Butoxycarbonylgruppe; Seitenket-tencarboxylgruppe von Glutaminsäure durch Benzylester-gruppe; e-Aminogruppe von Lysin durch o-Chlorbenzyloxycar-bonylgruppe ; Hydroxylgruppe von Serin und Threonin durch Benzylgruppe; Hydroxygruppe von Tyrosin durch Dichlorbenz-ylgruppe und Iminogruppe von Histidin durch Tosylgruppe.

Die Schutzgruppe des C-endständigen Fragmentes 7—10 bis 31 mit geschützten a-Aminogruppen, z. B. das Docosapeptida-mid der 10—31 Sequenz, wird mit einer geeigneten Methode entfernt. Zum Beispiel wird die Tritylgruppe durch wässrige Essigsäure abgespalten. Diphenylisopropoxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl- und t-Butoxycarbonylgruppen werden durch ein Gemisch von Eisessig, Ameisensäure und Wasser beziehungsweise durch Hydrierung und mit Trifluoressigsäure entfernt.

Auf diese Weise wird das Hentriacontapeptidamid mit geschützter a-Aminogruppe, geschützter e-Aminogruppe, gegebenenfalls geschützter Seitenkettencarboxylgruppe und/oder Hydroxylgruppe erhalten. Diese Schutzgruppen werden wie oben beschrieben, abgespalten, vorzugsweise durch Säurezersetzung, z. B. mittels Fluorwasserstoff, und schliesslich kann das Produkt der Formel I erhalten werden.

Bei der Synthese des neuen, Polypeptides nach der Merri-field-Festphasenpeptidsynthesen-Methode kann die Hydroxygruppe in Serin und Threonin z. B. durch die Benzylgruppe geschützt werden und die Hydroxygruppe in Tyrosin wird mit der Dichlorbenzylgruppe geschützt; die Iminogruppe in Histidin kannz. B. durch l-Benzyloxycarbonylamino-2,2,2-trifluoräthyl-gruppe und die die Seitenkette in Glutaminsäure z. B. mit einer 65 Benzylestergruppe geschützt werden. Die Schutzgruppe für die a-Aminogruppe ist z. B. einet-Butyloxycarbonyl-, o-Chlor-benzyloxycarbonyl- oder o-Brombenzyloxycarbonylgruppe.

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Das geschützte Peptid wird vom Trägerharz entfernt und die Schutzgruppe wird durch wasserfreien Fluorwasserstoff entfernt.

Eine einstufige Entfernung aller Schutzgruppen durch Hydrolyse unter Verwendung von Trifluoressigsäure kann durchgeführt werden, wenn die t-Butoxycarbonylgruppe zum Schutz der Aminogruppe verwendet wird, der t-Butylester für die Seitenkettencarboxylgruppe, der t-Butyläther für die Hydroxylgruppe in Serin, Threonin und Tyrosin und die 2,2,2-Trifluor-1-t-butoxycarbonylaminoäthylgruppe für den Schutz der Iminogruppe in Histidin.

Das neue Polypeptid der Formel I kann in Form einer freien Base oder eines Salzes erhalten werden. Die freie Base kann auf übliche Weise aus den Salzen erhalten werden. Die freie Base kann in ihre pharmakologisch annehmbaren Salze übergeführt werden durch Umsetzung mit einer organischen Säure, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, oder mit einer organischen Säure, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Niederalkansul-fonsäure, Benzolsulfonsäure oder Toluolsulfonsäure.

Das neue Polypeptid kann in einen Komplex übergeführt werden durch Zusatz von verschiedenen anorganischen oder organischen Substanzen. Ein solcher Komplex wird erhalten durch Zusatz einer Art anorganischer oder organischer Substanzen zu einem langkettigen Polypeptid, und der Komplex weist eine Langzeitwirkung auf, wenn er verabreicht wird. Beispiele derartiger komplexbildender Substanzen sind anorganische Verbindungen, abgeleitet von Metallen wie Calcium, Magnesium oder Zink, insbesondere das Phosphat, Pyrophosphat oderPoly-phosphat dieser Metalle. Weitere Beispiele derartiger komplexbildender organischer Substanzen sind nicht-antigene Gelatine, Carboxymethylcellulose, Sulfonsäureester oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextran, Polyalkohol, Glutaminsäure, Protamin oder dergleichen.

Die Abkürzungen in der vorliegenden Beschreibung weisen die folgende Bedeutung auf:

BOC: t-Butoxycarbonyl

Cbz: Benzyloxycarbonyl

Bzl: Benzyl

Bzl (Cli): Dichlorbenzyl OEt: Äthylester

OBzl: Benzylester

OSU: N-Hydroxysuccinylimidester

Ser: L-Serin

Leu: L-Leucin

Val: L-Valin

Arg: L-Argin

Ala: L-Alanin

Lys: L-Lysin

Glu: L-Glutaminsäure

Tyr: L-Tyrosin

Phe: L-Phenylalanin

TFA: Trifluoressigsäure

CHA: Cyclohexylamin

THF: Tetrahydrofuran

AcOET: Äthylacetat

WSC: N-Äthyl-N'-dimethylaminopropyl-carbodiimid

HOSU: N-Hydroxysuccinylimid

MeOH: Methanol

AcOH: Essigsäure

HMPA: Hexamethyl-phosphorsäure-triamid

AOC: t-Amyloxycarbonyl

CICbz: o-Chlorbenzyloxycarbonyl

Tos: Tosyl

OBu: t-Butylester

ONP: p-Nitrophenylester

Asn: L-Asparagin

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Thr:

L-Threonin

Pro:

L-Prolin

Asp:

L-Aspartinsäure

Gly:

Glycin

Gin:

L-Glutamin

His:

L-Histidin

Met:

L-Methionin

Ile:

L-Isoleucin

TosOH:

p-Toluolsulfonsäure

DCHA:

Dicyclohexylamin

DMF:

Dimethylformamid

DCC:

Dicyclohexylcarbodiimid

HOBT:

1-Hydroxybenzotriazol

EtOH:

Äthanol

BuOH:

Butanol

(CH9)

2J 5

-CO-GIy-Asn-Leu-Ser(BzI)-Thr(BzI)-HNCHCO-Met-Leu-Gly-OH

5

wurden in 5 ml DMF:N-Methylpyrrolidon (1:1) gelöst. HOSU (122 mg) wurden zugesetzt und ferner DCC (146 mg) gelöst in DMF (3 ml) unter Kühlen zugesetzt, und anschliessend über Nacht gerührt. Nach der Umsetzung wurde der Niederschlag io entfernt und zu der derart erhaltenen Lösung wurde die oben erhaltene freie de-BOC-Base zugesetzt und HOBT (100 mg) zugegeben und während 5 Tagen bei 30° C gerührt. Nach der Reaktion wurde Wasser zugesetzt. Der derart erhaltene Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen 15 und getrocknet, um 2,6 g

Die Bestimmungsmethode für die Serumcalcium reduzierende Wirksamkeit, der Träger und das Entwicklersystem für die Dünnschichtchromatographie sowie die Bedingungen für die Aminosäureanalyse sind die folgenden:

Bestimmungsmethode :

Die Probe wird mit 0,1N Natriumacetat- 0,1 % Eiweisslö-sung verdünnt. Männliche Ratten werden einzeln mit 0,2 ml der jeweiligen verdünnten Lösung intravenös injiziert. Nach 1 h werden alle Ratten getötet, um ihr Blut zu erhalten, und die Serumcalciumwerte von jeder Blutprobe wird durch Atomab-sorptionsspektrophotometrie bestimmt. Andererseits wird ein Standard-Salm-Calcitonin, welches vom National Institute for Biological Standard and Control vertrieben wird, als Standardkurve verwendet. Durch Vergleich mit der Wirksamkeit des entsprechenden Research Standard's wird die Wirksamkeit des Calcitonins in der Probe bestimmt.

Aminosäureanalyse:

Eine Probe wird mit 6n HCl unter Zusatz einiger Tropfen Anisolbei 110° C während 45 h hydrolysiert, dann unter vermindertem Druck getrocknet und schliesslich der Aminosäureanalyse unterworfen.

(CH,)

20

25

35

Herstellung von

Beispiel:

(CH7)

2J b

-CO-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-NHCHCO-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHi :

2,0 g (0,6 m Mol)

BOC-Thr(Bzl)-Tyr[Bzl(Cl2)]-Thr(Bzl)-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Asn-Lys(ClCbz)-Phe-His-Thr(Bzl)-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Asn-Lys(ClCbz)-Phe-His-Thr(Bzl)-Phe-Pro-Gln-Thr(Bzl)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-AIa-Pro-NH2

wurden in 10 ml TFA bei —5° C gelöst. Nach 30 min Rühren bei Zimmertemperatur wurde die Lösung im Vakuum konzentriert und mit Äthyläther versetzt, um einen Niederschlag zu bilden. Der Niederschlag wurde über Natriumhydroxid getrocknet. Der trockene Niederschlag wurde in 10 ml DMF gelöst und mit Triäthylamin unter Kühlung auf pH 9 gebracht. Zu dieser Lösung wurde Wasser zugesetzt, um einen Niederschlag zu erzeugen. Der Niederschlag wurde über p2Os getrocknet, um die BOC-Verbindung in Form ihrer freien Base zu erhalten.

0,8 g (0,71 mMol)

2 J 5J

-CO-Gly-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCHCO-Met-Leu-Gly-Thr(Bzl)-Tyr/Bzl(CI2)/-Thr(Bzl)-Gln-Asp(OBzl)-Phe-Asn-Lys(ClCbz)-Phe-His-Thr(Bzl)-Phe-Prp-Gln-Thr(Bzl)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2

als rohes Produkt zu erhalten.

1,0 g des derart erhaltenen rohen Materials wurde mit Fluorwasserstoff (25 ml), Methionin (0,1g) und Anisol (2 ml) bei —5° C während 60 min unter Kühlung mit Trockeneis-Methanol und unter vermindertem Druck in Gegenwart von Dimethyl-thioäther umgesetzt. Nach dem Abdestillieren des Fluorwasserstoffes wurde der Rückstand mit Diäthyläther gewaschen und der 30 gebildete Niederschlag durch Dekantieren gewonnen, dieses Dekantieren dreimal wiederholt und der Niederschlag schliesslich in einer Lösung von Essigsäure (30 ml) und Wasser (10 ml) gelöst. Die Lösung wurde über eine Säule aus «Dowex» 1x2 (Acetatform) (2,5 x8 cm) geleitet, mit Wasser 6200 ml) gewaschen und das Eluat wiederum über eine Säule aus HP-20 (2,5x7 cm) geleitet, Eine 80%ige Äthanollösung wurde sodann durch die Säulen geleitet und nach dem Abdestillieren des Eluates zwecks Entfernung des Äthanols wurde die Lösung lyophilisiert, wobei 440 mg des Pulvers erhalten wurden. 440 mg dieses 40 Pulvers, gelöst in 0,01 M wässrigem Ammoniumacetat wurden in eine mit CM-Cellulose gepackte Säule (2,2x25 cm) eingeführt und mit je 750 ml einer 0,01 bis 0,2 Mol Ammoniumacetatlösung (pH 4,5) in linear steigender Konzentration eluiert. Fraktionen von je 10 g wurden gesammelt und die aktiven Fraktionen 45 (Fraktionen Nr. 67—70) wurden vereint und gefriergetrocknet, um das aktive Pulver zu erhalten. Das Lyophilisat wurde in 1M Essigsäure gelöst und über eine Säule von «Sephadex» LH-20 (2,2x 137 cm) Chromatographien und mit 1M AcOH eluiert. Das Eluat (6 g) wurde fraktioniert und die aktiven Fraktionen (Nr. 50 28—37) gesammelt und lyophilisiert.

Das Lyophilisat wurde in der oberen Schicht eines Gemisches von ButanohEssigsäure: Wasser (4:1:5) gelöst und die Lösung über eine Säule von «Sephadex» G-25 (2,7 X 52 cm) geleitet, welche mit der unteren Schicht des oben genannten Lösungsmit-55 telgemisches gepackt war und anschliessend durch die obere Schicht des genannten Lösungsmittelgemisches ersetzt wurde. Die Eluierung erfolgte mit demselben Oberschichtlösungsmittel, um Fraktionen von je 6 g zu erhalten und die aktiven Fraktionen (Nr. 5—14) wurden gesammelt und lyophilisiert. Das derart 60 erhaltene Pulver wurde wiederum unter denselben Bedingungen über «Sephadex» G-25 chromatographiert und lyophilisiert. Das lyophilsierte aktive Pulver wurde in 1 Mol Essigsäure gelöst, über eine Säule aus «Sephadex» LH-20 (2,2 X137 cm) geleitet und mit 1 Mol Essigsäure für 5 g der Fraktionen eluiert. Die aktiven 65 Fraktionen wurden vereint und lyophilisiert und ergaben 29,7 mg des Produktes (1000 MRC u/mg).

Rf = 0,82 [Träger: Merck-Cellulose, Entwickler: n-Buta-nol:Essigsäure:Wasser:Pyridin (15:3:12:10)].

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Rf = 0,43 [Träger: Merck-Cellulose, Entwickler: n-Buta-nol:Essigsäure:Wasser (obere Schicht) (4:1:5)]. [afo = —69,6 (c = 0,72, 1 M Essigsäure). Aminosäure-Analyse :

Lys 1,15(1), His 1,01(1), Asp 2,94(3), Thr 4,80(5), Ser 1,05(1), Glu 2,14(2), Pro 1,96(2), Gly 4,00(4), Ala 2,00(2), Val 9,95( 1), Met 0,87(1), Ile 0,96(1), Leu 1,84(2), Tyr 0,96(1), Phe 3,18(3) a-Aminokorksäure 1,02(1).

m

Claims

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2

PATENTANSPRÜCHE Die Calcitonine natürlichen Ursprungs, wie Aal-, Salm-, oder menschliches Calcitonin sind Polypeptide, welche aus 32 Amino-1. Verfahren zur Herstellung eines neuen Polypeptides mit säuren bestehen, wobei die erste und siebte Aminosäure L-Serumcalcium herabsetzender Wirksamkeit der Formel I Cystein ist und die Mercaptogruppe davon unter Bildung einer

Disulfidbrücke gebunden ist, und wobei die endständige Carbo-

/•pn i utAcgcuuiiuciiim, uiiu wuueiuiceuuMaiiuigev^aruu-

2 57 xylgruppe Prolinamid ist. Diese Calcitonine weisen eine andere

-CO-Glv-Asn-Leu-Ser-Thr-NH-CH-CO-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr- Ammosaurefolge und eine Wirksamkeit auf. Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-GIn-Thr-Ala- Die Aminosäurefolge von menschlichem Calcitonin ist die Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHi [I]J0 folgende:

oder dessen pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssal- ^ ~ ^

zen, dadurch gekennzeichnet, dass man aus den in der Verbin- Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-dung der Formel I in Erscheinung tretenden Aminosäuren und/ Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-oder Peptiden aus mindestens 2 bis 4 Aminosäuren in der Val-Gly-Ala-Pro-NHi

Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel I ein Peptid 15 ^'e Disulfidbindung in diesem Calcitonin ist chemisch sehr aufbaut und die Peptideinheit, welche die Gruppe unstabil und kann leicht zersetzt oder polymerisiert werden, und aus diesem Grunde ist die chemische Synthese von diesem , 2 5 natürlichen menschlichen Calcitonin sehr schwierig. Auch ist die

I Stabilität als pharmazeutische Verbindung sehr gering.

H-Gly-Asn-Leu-Set-Thr-NH-CH-CO- 20 Das neue Polypeptid der Formel I weist weder als erste noch als siebte Aminosäure L-Cystein auf und das L-Cystein ist ersetzt enthält, in welcher Reinen reaktionsfähigen Esterrest darstellt, durch a-Aminosuberinsäure (a- Aminokorksäure) der Formel:

in jeder beliebigen Stufe der Reaktion einer Ringschlussreaktion çpj qjj QH —- CH

unterwirft. __ 1 2 2 2 0
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptideinheit, welche die Gruppe

25

Cch2)scoor ch2cooh h2n-ch-cooh

I Die Carboxylgruppe in co-Stellung ist mit Glycin zu einer

H-Gly-Asil-Leu-Ser-Thr-NH-CH-CO- 30 Ringstruktur verbunden.

Das Polypeptid der Formel I weist eine zehnmal höhere enthält, in welcher R dieselbe Bedeutung wie oben aufweist, biologische Wirksamkeit als das natürliche menschliche Calcito-

während der Bildung der Peptideinheit, welche die a- Amino- nin auf und ist chemisch sehr stabil. Das Polypeptid I weist ferner korksäureeinheit enthält, der Ringschlussreaktion unterwirft. dieselbe Aminosäure-Sequenz wie das menschliche Calcitonin an 3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeich- den Fragmenten 11 bis 32 auf, eine antigene Determinante für die net, dass die Peptideinheit, welche die Gruppe Gegenreaktion mit Antiserum von Calcitonin [Europ. J.Clin. In-

fCH 1 rOOR vest- ' 4,213 bis 222 (1974)]. Das Polypeptid I ist daher immunlo-I 2 5 gisch identisch mit dem natürlichen menschlichen Calcitonin und

I ist daher pharmazeutisch sehr sicher und weist keine Gegenim-

H-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-NH-CH-CO- 40 munität mit Calcitonin von Schweinen oder Salm auf.

enthält, in welcher R dieselbe Bedeutung wie oben aufweist. Die Verbindung der Formel I wird hergestellt, indem man aus während der Bildung der Peptideinheit, welche die a-Amino- den m der Verbindung der Formel I in Erscheinung tretenden korksäureeinheit enthält, der Ringschlussreaktion unterwirft, Aminosäuren und/oder Peptiden aus mindestens 2 bis 4 Amino-wobei mindestens eine Aminogruppe oder Carboxylgruppe in 45 saui?n lnder Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel I der Verbindung durch eine Schutzgruppe geschützt ist, und diese ein P aufbaut und die Peptideinheit, welche die Gruppe Schutzgruppe entfernt wird. (CH.,) ,-COOR

I 2 5

H-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-NH-CO-CO-