HU180539B - Process for producing calcitonone-like new polypeptide containing alpha-amino-suberinic acid - Google Patents

Description

Sakakibara Shumpei vegyész, Suita, Morikawa Toyo Jozo Kabushiki Kaisha, Mifuku, Japán Tadanori vegyész, Kadoma, Nakagawa Yasuo vegyész, Nishinomiya, Japán

Eljárás α-amino-szuberinsavat tartalmazó, kalcitoninszerű új polipeptid előállítására

A találmány tárgya eljárás a

I-------------(CH₂)₃L-CO-Gly-Ans-Leu-Ser-Thr-NHCHCO-MetLeu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-PheHis-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Cly-Val-Gly-AlaPro-NH,

I képletü új polipeptid és savaddíciós sói előállítására.

Az (I) képletü pepiidnek szérum-kalciumszintet csökkentő hatása van.

A kalcitonin jól ismert polipeptid, amely emlősök szérum-kalciumszintjét csökkenti, és emlősök pajzsmirigyéből vagy madarak kopoltyúmaradványából vagy halak kopoltyútestéből különíthető el. A kalcitonin aminosavszekvenciája függ a faj eredetétől, és a szintetikus kalcitoninok a természetes eredetűek jelenleg ismert felépítéséhez hasonló kémiai szerkezettel rendelkeznek.

A természetes eredetű kalcitoninok, így az angolna,- lazac-, vagy humán-kalcitonin 32 aminosavból álló polipetidek, amelyekben az első és hetedik aminosav L-cisztein, és ezek merkaptocsoportja diszulfidhidat képezve összekapcsolódik, és a karboxil-terminális csoport prolin-amid. Ezek a kalcitoninok különböző aminosavszckvenciájúak és különböző hatásúak.

A humán-kalcitonin aminosavszekvenciája az alábbi:

Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-ThrTyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-PhePro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH,

A kalcitonin diszulfid kötése kémiailag nagyon instabil, és könnyen felbomlik vagy polimerizálódik, és ezért a humán-kalcitonin kémiai szintézise nagyon nehéz. Gyógyászati készítményként 10 stabilitása igen gyenge.

A jelen találmány szerinti polipeptid sem első, sem hetedik aminosavként nem tartalmaz L-ciszteint, hanem az L-cisztint a-amino-szuberinsav helyettesíti, amelynek képlete az alábbi:

CH_a—CH_a—CH_a—CH_a

CH_a—COOH HN_a—CH—COOH

Az ω-helyzetű karboxilcsoport glicinnel kapcso’ódva képez gyűrűs szerkezetet.

A jelen találmány szerinti (I) képletü polipeptid tízszer erősebb biológiai hatással rendelkezik, mint a természetes humán-kalcitonin, és kémiailag na25 gyón stabil. Az (I) képletü polipeptid ugyanolyan aminosavszek véne iával rendelkezik, mint a humán-kalcitonin N-terminálistól számított 11—32 fragmense, amely antigén determináns kalcitoninantiszérummal történő keresztreakció esetében. 30 [Europ. J. Clin. Invest., 4, 213—222 (1974)]. En

1805,39 nélfogva az (I) képletü polipeptid immunológiailag azonos anyag a természetes humán-kalcitoninnal, és ebből következőleg gyógyászatilag nagyon biztonságos, és nem rendelkezik keresztimmunitással sertés- vagy lazac-kalcitoninnal szemben.

Az (I) képletü vegyület szintézise a szokásos peptidszintézis-módszerekkel oldható meg, azaz α-amino-szuberinsavat, egy aminosavat és/vagy 2—4 aminosavbój. álló_j)eptidet kondenzálunk az (I) képlet aminos&vszekVenciájának megfelelő sorrendben, és az alábbi képletnek megfelelő szerkezeti részegységet (CH₂)₅COOR

H-Gly-Ans-Leu-Ser-Thr-NHCHCO— ahol R jelentése reakcióképes észtercsoport — a peptidegység felépítésének valamely szakaszában gyűrűzárásra késztetjük, és a reakcióképes csoportok védőcsoportjait a reakciósorozat valamely szakaszában eltávolítjuk. Kívánt esetben a termék savaddíciós sójává alakítható.

A szintézis kiindulási anyagainál vagy köztitermékeinél alkalmazott védőcsoportok peptidszintézisnél szokásos védőcsoportok, és könnyen eltávolíthatók hidrolízissel, savas hasítással, redukcióval, aminolízissel vagy hidrazinolízissel.

Az aminocsoport védhető szokás szerint például valamilyen acilcsoporttal, így formil-, trifluoracetil-, ftaloil-, benzolszulfonil-, p-toluolszulfonil-, o-nitro-fenil-szulfenil-vagy 2,4-dinitro-fenil-szulfenil-scporttal; valamilyen aralkil-csoporttal, így benzil-, difenil-metil- vagy trifenil-metil-csoporttal (ezek a csoportok tetszés szerint valamilyen rövidszénláncú alkoxi-, például o-metoxi- vagy p-metoxi-csoporttal lehetnek szubsztituálva); valamilyen benziloxi-karbonil-csoporttal, így benziloxi-karbonil-, (o-bróm-benziloxi)-karbonil-, (p-bróm-benziloxi)-karbonil-, (o-klór-benziloxi)-karbonil-, (p-nitro-benziloxi)-karbonil-, (p-metoxi-benziloxi)-karbonil-, (p-fenilazo-benziloxi)-karbonil- vagy [p-/p’-metoxi-fenilazo)-benziloxi]-karbonil-csoporttal; valamilyen alifás oxikarbonilcsoporttal, így ciklopentiloxi-karbonil-, (triklór-etoxij-karbonil-, terc-amiloxi-karbonil-, terc-butoxi-karbonil- vagy (diizopropil-metoxi)-karbonil-csoporttal; vagy valamilyen aral-kiloxi-karbonil-csoporttal, így (2-fenil-izopropoxi)-karbonil-, (2-tozil-izopropoxi)-karbonil- vagy [2-/p-difenil)izopropoxij-karbonil-csoporttal. Áz aminocsoportok enamin-képzéssel is védhetők 1,3-diketonokkal, így benzoil-acetonnal, acetil-acetonnái vagy dimedonnal reagáltatva.

A karboxilcsoport amidképzéssel, hidrazidképzéssel vagy észterképzéssel védhető. Az amid-csoport 3,4-dimetoxi-benzil- vagy bisz/p-metoxi-fenil)metilesoporttal szubsztituálható. A hidrazid-csoport benziloxi-karbonil-, (triklór-etoxi)-karbonil-, trifluor-acetil-, terc-butoxi-karbonil-, tritil- vagy [2-/p-difenil/izopropoxi]-karbonil-csoporttal szubsztituálható. Az észtercsoport valamilyen alkanollal, például metanollal, etanollal, terc-butanollal vagy ciano-metanollal; valamilyen aralkanollal, például benzil-alkohollal, (p-bróm-benzil)

-alkohollal, (p-klór-benzil)-alkohollal, (p-metoxibenzilj-alkohollal, (p-nitro-benzil)-alkohollal, (2, 4,6-trimetil-benzil)-alkohollal, benzhidril-alkohollal, (benzoil-metil)-alkohollal,[p-bróm-benzoil)metilj-alkohollal vagy [p-klór-benzoil)-metil]-alkohollal; valamilyen fenollal, például 2,4,6-triklór-fenollal, 2,4-5-triklór-fenollal, pentaklór-fenollal, p-nitro-fenollal, 2,4-dinitro-fenollal, p-ciano-fenollal vagy p-metánszulfonil-fenollal; vagy valamilyen tiofenollal, például tiofenollal, tiokrezollal 'vagy p-nitro-tiofenollal képezhető. A szerinben, treoninban vagy tirozinban lévő hidroxilcsoport tetszés szerint észtcrezéssel vagy étcrképzcsscl védhető. Észterező védőcsoport például valamilyen rövidszénláncú alkanoilcsoport, így az acetilcsoport; valamilyen aroilcsoport, így a benzoilcsoport; vagy karbonilcsoportból levezethető valamilyen csoport, így benziloxi-karbonil- vagy etoxi-karbonil-csoport. Éterképző védőcsoport például benzil-, tetrahidropiranil- vagy terc-butil-csoport. A hidroxilcsoport védése 2,2,2-trifluor-l-(terc-butoxi-karbonil-amino)-etil- vagy 2,2,2-trifluor-l(benziloxi-karbonil-amino)-etil-csoporttal is megoldható. A hidroxiesoportokat nem mindig kell azonban védeni.

A hisztidinben levő iminocsoport benzil-, tritil-, benziloxi-karbonil-, tozil-, adamantiloxi-karbonil-, 2,2,2 - tr ifluor-1- (tere - butoxi -karbonil - amino) -etilvagy 2,2,2,-trifluor-l-(benziloxi-karbonil-amino)-etil-csoporttal védhető, bár az iminocsoportot nem mindig szükséges védeni.

A kiindulási vagy köztitermék peptideket aminosavaknak vagy — előnyösen 2—4 aminosavból álló — peptideknek az (I) képlet aminosavszekvenciájának megfelelő sorrendben végzett kondenzációjával szintetizáljuk. Például egy védett aaminocsoporttal és aktivált terminális karboxilcsoporttal rendelkező aminosavat vagy pepiidet reagáltatunk egy szabad α-aminoesoporttal és védett terminális karboxilcsoporttal rendelkező aminosavval vagy peptiddel. Másrészt egy aktivált α-aminocsoporttal és védett terminális karboxilcsoporttal rendelkező aminosavat vagy pepiidet reagáltatunk szabad terminális karboxilcsoporttal és védett α-aminocsoporttal rendelkező aminosavval vagy peptiddel (176. 623. számú magyar szabadalmi leírás).

A karboxilcsoport például savazidként, savanhidridként, sav-imidazolidként vagy aktív észterként aktiválható, így ciano-metil-észterré, tiofenil-észterré, p-nitro-fenilészterré, p-nitro-tiofenilészterré, p-metánszulfonil-fenilészterré, tiodilészterré, 2,4-dinitro-fenilészterré, 2,4,5-triklór-fenil-észterré, 2,4,6-triklór-fenilészterré, pentaklór-fenilészterré, N-hidroxi-szukcinimid-észterré, N-hidroxi - ftálimid - észterré, 8 - hidroxi - konolil -észterré vagy N-hidroxi-piperidil-észterré alakítva, karbodümiddel, Ν,Ν’-karbonil-diimidazollal vagy valamilyen izoxazólium sóval, így Woodward-reagenssel.

A karboxilcsoport szokásos módon, például savazidként, savanhidridként, aktív észterként vagy karbodiimiddel aktiválható.

Előnyös kondenzációs reakció a Wünsch-módszer, az azidos módszer, az aktív észteres módszer

180509 vagy a Geiger-módszer. A kondenzációs reakcióban a racemizáció gondosan kerülendő.

Az így kapott pepiidben az alábbi szerkezeti egységet tartalmazó részt (CH₂)—COOR

I

H—G1 y-Ans-Leu-Ser-Thr-NHCHCO— amelyben R az előbbivel azonos jelentésű — gyűrűzárásra késztetjük. A gyűrűzárási reakció az a-aminoszuberinsavban levő aktivált ω-karboxilcsoport és az N-terminális aminosavban levő szabad aminocsoport közti kondenzációs reakció útján megy végbe. A kondenzációs reakcióban a szerin és a treonin hidroxilcsoportja alkalmasan védendő.

A találmány szerinti előnyös eljárás kivitelezése egy α-amino-szuberinsavat tartalmazó (tetszés szerint védett aktív csoportokkal rendelkező) peptidgyűrű és a tetszés szerint védett aktív csoportokat tartalmazó fennmaradó másik peptidrész kondenzációs reakciója útján történik. Vagyis az 1-től 6—9-ig terjedő aminosavat tartalmazó N-tenninális fragmenst kondenzáljuk a fennmaradó 7—10től 31-ig terjedő anúnosavakat tartalmazó pepiiddel. A. két fragmens reaktivitásának fokozása és a kondenzáció során a racemizáció elkerülése céljából előnyösen glicint alkalmazunk C-terminális aminosavként.

A jelen találmányban előnyös, hogy az 1—9. aminosavig terjedő szekvenciarészt tartalmazó pepiidet reagáltatjuk a 10—31. aminosavig terjedő szekvenciarészt tartalmazó pepiiddel.

Az említett kondenzációs reakció kivitelezhető szabad terminális karboxilcsoportot tartalmazó peptidből kiindulva az úgynevezett Wünsch-féle módszerrel vagy aktív észteres módszerekkel. Kivitelezhető előnyösen terminális azid- vagy hidrazid-csoportot tartalmazó peptidből kiindulva az azidos módszerrel is, vagy a vegyes anhidrides módszerrel is.

Az N-tcrminális fragmens, azaz az 1-től 9-ig terjedő aminosavszekvencia-részt tartalmazó nonapeptid szintézisét részletesen bemutatjuk a következőkben, azonban az 1—6 hexapeptid, az 1—7 heptapeptid vagy az 1—8 oktapeptid is lényegében hasonló eljárással állítható elő.

A nonapeptid szekvenciarész a C-terminális aminosavtól kiindulva az egyes aminosavaknak 2—4 aminosavból álló kisebb peptiddel az aminosavszekvencia sorrendjében történő kapcsolásával állítható elő. Az aminosavat, például glicint, leucint, α-amino-szuberinsavat, treonint, metionint, szerint vagy aszparagint előnyösen az aktív észteres módszerrel kondenzáljuk. A kisebb pepiidet, például a 2—4-tripeptidet előnyösen a Geigermódszerrel vagy a Wünsch-módszerrel kondenzáljuk.

Az azidos, az aktív észteres vagy a savanhidrides módszerrel végzett kondenzációs reakcióban nem szükséges védeni a terminális karboxilcsoportot a nonapeptidben. A karboxilcsoport azonban védhető alkoholokkal, így metanollal, benzil-alkoholJal vagy más alkoholokkal történő észterezéssel is.

Az észtercsoport, például a metilészter híg nátriumhidroxid oldattal vagy hidraziddá történő átalakítással távolítható el, míg a benzilészter csoport katalitikus hidrogénezéssel. A köztitermék ami5 nocsoportja valamilyen szokásos védőcsoporttal, például benziloxi-karbonil-, tritil-, terc-butoxikarbonil-, vagy 2-(p-difenil)-izopropoxi-karbonilcsoporttal védhető. A karboxilcsoport szükség esetén szokásos észterezéssel védhető. A szerinben 10 és treoninban levő hidroxilcsoport szükség esetén éterképzéssel védhető, például terc-butil-, benzilvagy egyéb csoporttal.

A benziloxi-karbonil-, p-nitro-benzil-észter és benzil-észter csoportok katalitikus hidrogénezés15 sel hasíthatok palládiumosszén katalizátor jelenlétében. Az N-tritil-csoport vizes ecetsavval, a terc-butoxi-karbonil-csoport trifluor-ecetsavval hasítható le. Az o-nitro-fenil-szulfenil-csoport szerves oldószerben hidrogén-kloriddal, hidrogén-ci20 aniddal vagy kénessavval hasítható le. A difenilizopropoxi-karbonil-csoport ecetsav: hangyasav: víz (7:1:2) eleggyel hasad le. A metil-észter, etilészter vagy p-nitro-benzil-észter hidrazin-hidráttal hidraziddá alakítható. A metil-észter csoport 25 híg nátrium-hidroxid oldattal távolítható, el, míg a terc-butil-észter trifluor-ecetsavval hasítható.

A 7—10-től 31-ig terjedő aminosavszekvenciát tartalmazó C-terminális pepiidet, amelyet az előbbi N-terminális peptiddel kondenzálunk, elő30 nyösen a C-terminális aminosavnak (a 31. aminoss.vnak) vagy a C-terminális fragmensnek, például a 30—31., 28—31., 25—31., 24—31. vagy 23—31. aminosavszekvenciát tartalmazó peptidnek egyes aminosavakkal vagy 2—1 aminosavból álló kisebb 35 peptidekkel az előbb megadott aminosavszekvencia szerinti sorrendben történő kapcsolásával szintetizáljuk. A 10—31. C-terminális fragmens például aminosavak és kisebb peptidek, így a 30—31. vagy a 28—29. dipeptid, a 25—27. tripeptid, a 40 23—24. dipeptid, a 21—23. tripeptid, a 16—19. tetrapeptid és a 10—15. hexapeptid a C-terminálistól kiindulva az aminosavszekvencia sorrendjében végzett kondenzációjával építhető fel. Előnyös védőcsoportok az egyes csoportok részére: a-ami45 nocsoporthoz terc-butoxi-karbonil-csoport; glutarr insav oldalláncban lévő karboxilcsoport] ához benzilcsoport f lízin e-aininőcsoportjához o-klór-benziloxi-karbonil-csoport; szerin és treonin hidroxilcsoportjához benzilcsoport; tirozin hidroxilcsoport50 jához diklór-benzilcsSpört; hisztidin iminocsoportjához tozilcsoportZ '

Az előbbiekben említett valamely védett a-aminocsoporttal rendelkező 7—10-től 31-ig terjedő C-terminális fragmens, például a 10—31. szekven55 ciának megfelelő dokozapeptid-amid védőcsoportját alkalmas módszerrel eltávolítjuk. A tritilcsoportot például vizes ecet savval hasítjuk le. A difenil-izopropoxi-karbonil-, benziloxi-karbonil- és terc-butoxi-karbonil-csoportokat ecetsav, hangva60 sav, és víz elegyével; hidrogénezéssel illetve trifluor-ecetsavval távolítjuk el.

így a védett ε-ammocsoporttal, védett a-aminocsoporttal, tetszés szerint védett karboxil-oldallánccal és/vagy hidroxil-oldallánccal rendelkező 65 hentriakontapeptid-amidot kapjuk. Erről a védő

180589 csoportokat az előbbiekben leírt módszerrel, előnyösen savas bontással, például hidrogén-fluoriddal hasítjuk le, és így kapjuk végül az (I) képletü peptidet.

A jelen találmány szerinti új polipeptidnek a Merrifield-féle szilárdfázisú peptidszintézis-módszerrel végzett szintézisében a szerinben és treoninban levő hidroxicsoportot például benzilcsoporttal védhetj ük, és a tirozinban levő hidroxicsoportot diklór-benzilcsoporttal; a hisztidinben levő iminocsoport például l-(benziloxi-karbonil-amino)-2,2,2-trifluor-etilcsoporttal védhető; és a glutaminsav oldallánca például benzilészter. csoporttal Az α-aminocsoport védőcsoportja például terc-butoxi-karbonil-, o-klór-benziloxi-karbonil- vagy o-bróm-benziloxi-karbonil-csoport.

A védett peptidet a hordozó gyantáról és a védőcsoportot vízmentes hidrogén-fluoriddal távolítjuk el.

Az összes védőcsoport trifluor-ecetsavval végzett hidrolízis útján történő egylépéses eltávolítása akkor alkalmazható, ha aminocsoport védésére tercbutoxi-karbonilcsoportot, az oldallánc karboxilcsoport védésére terc-butil-észter csoportot, a szerinben, treoninban és tirozinban lévő hidroxilcsoport védésére terc-butil-éter csoportot és a hisztidinben levő imino-csoport védésére 2,2,2-trifluor-l(terc-butoxi-karbonil-amino)-etilcsoportot használunk.

A jelen talulmány szerinti (I) képletü új polipeptid szabad bázis formájában vagy valamilyen sóként nyerhető. A szabad bázis szokás szerint sójából is megkapható. A szabad bázis gyógyszerészetileg elfogadható savaddíciós sóvá alakítható valamilyen szervetlen savval, így sósavval, brómliidrogénsavval, kénsavval vagy foszforsavval, vagy valamilyen szervetlen savval, például hangyasavval, ecetsavval, propionsavval, glikolsavval, tejsavval, piroszőlősavval, oxilsavval, borostyánkősavval, almasavval, citromsavval, borkősavval, benzoesavval, szalicilsavval, valamilyen rövidszénláncú alkánszulfonsavval, benzoesavval vagy toluolszulfonsavval reagáltatva.

Az új polipeptid különböző szervetlen vagy szerves anyagok hozzáadásával valamilyen komplexévé alakítható. Az illető komplex forma valamilyen fajta szervetlen vagy szerves anyagnak a hosszéi láncú polipeptidhez történő hozzáadásával képződik, és a komplex adagolásakor hosszú ideig tartó hatást eredményez. Az említett komplexképző anyagokra példák kalcium, magnézium vagy cink szervetlen vegyületei, különösen az illető fémek foszfátja, pirofoszfátja vagy polifoszfátja. Az említett komplexképző szerves anyagokra további példák a nem-antigén hatású zselatin, karboximetil-cellulóz, alginsav szulfonsav-észtere vagy foszforsav-észtere, dextrán, polialkoholok, poliglutaminsav, protamin vagy hasonlók.

A találmány leírása során használt rövidítések jelentése az alábbi:

BOC: terc-butoxi-kar- AOC: terc-amiloxibonil csoport, -karbonilcsoport,

Cbz:	benziloxi-karbonilcsoport,	CICbz:	o-klór-benziloxi-karbonilcsoport,
Bzl:	benzilcsoport,	Tos:	tozilcsoport,
Bzl(Cla)	idiklór- benzilcsoport,	OEt:	etoxicsoport,
OBu:	terc-butoxicsoport,	OBzl:	benziloxicsoport,
ONP:	p-nitro-fenoxicsoport,	OSU:	N-hidroxiszukcinimidocsoport,
Ser:	L-szerin,	Asn:	L-aszparagin,
Leu:	L-leucin,	Thr:	L-treonin,
Val:	L-valin,	Pro:	L-prolin,
Arg:	L-arginin,	Asp:	L-aszparaginsav,
Alá:	L-alanin,	Gly:	glicin,
Lys:	L-lizin,	Gin:	L-glutamin,
Glu:	L-glutaminsav,	His:	L-hisztidin,
Tyr:	L-tirozin,	Met:	L-metionin,
Phe:	L-fenilalanin,	Ile:	L-izoleucin,
TFA:	trifluor-ecetsav,	TosOH:	p-toluolszulfon- sav,
CHA:	ciklohexilamin,	DCHA:	diciklohexilamin,
THF:	tetrahidrofurán,	DMF:	dimetil-formamid,
AcOEt: WSC:	etil-acetát, N-etil-N’-(dime-	DCC:	diciklohexilkarbodiimid,

til-amino-propil) karbodiimid,

HOSU: N-hidroxi-szuk- HOBT: 1-hidroxicinimid, benztriazol,

MeOH: metanol, EtOH: etanol,

AcOH: ecetsav, BuOH: butanol,

HMPA: hexametil-foszforsav-triamid.

A következő példák szemléltetik a találmányt, de nem korlátozzák annak oltalmi körét az igénypontokban meghatározott oltalmi körhöz képest.

A szérum kalciumszint csökkentő hatás meghatározására szolgáló módszer, a vékonyrétegkromatográfia hordozó és a kifejlesztő rendszer, valamint az aminosavanalizis körülményei az alábbiak:

Meghatározási módszer:

A mintát 0,1% albumint tartalmazó 0,1 n nátrium-acetát oldattal hígítjuk. Az illető hígított oldatokból 0,2 ml-es adagokat adunk intravénás injekcióként hím patkányoknak. Egy óra elteltével valamennyi patkányt leöljük, megfelelően kinyerjük vérüket, és az egyes vérminták szérum kalcium-szintjét atomabszorpciós spektrofotometriával meghatározzuk. Standard görbe felvételére standard lazac-kalcitonint használunk, amelyet a National Institute fór Biological Standard and Control bocsát rendelkezésünkre. A megfelelő standard hatásából határozzuk meg a mintában levő kalcitonin hatásosságát.

Aminosavanalizis:

A mintát 6 n sósavoldatban (amelyhez néhány csepp anizolt adunk) 110 °C-on 45 órát hidrolizáíjuk, és csökkentett nyomáson megszárítjuk, majd ezután vetjük alá aminosavanalízisnek.

g

Példa:

,----(ch₂)₅----!

CO-Gly-Asn-Leu - Ser-Thr - NHCHCO-Met-Leu- Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe- Asn - Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro - Gin -Thr - Ala-Ile - Gly - Val - Gly - Alá -Pro-NH₂ előállítása.

2,0 g (0,6mmól) BOC-Thr(Bzl)-Tyr[Bzl(Cl₂)]-Thr (Bzl)-Gln-Asp (OBzl) -Phe-Asn (ClCbz)-Phe-His-Thr (Bzl) - Phe-Pro- Gln-Thr (Bzl) - Ala-Ile - Gly-Val - Gly-Ala-Pro-NH₂-t feloldunk 10 ml TFA-ban —5 °Con. Szobahőmérsékleten 30 percig keverjük, majd az oldatot vákuumban bepároljuk, éa etil-acetátot adunk hozzá, amitől csapadék keletkezik. A csapadékot nátrium-hidroxid felett szárítjuk. A megszárított csapadékot feloldjuk 10 ml DMF-ban, és hűtés közben trietil-amin hozzáadásával 9-re állítjuk a pH-t. Az oldathoz vizet adunk, amelytől csapadék válik ki. A csapadékot foszfor-pentoxid felett megszárítjuk, így a BOC-mentesvegyületet nyerjük szabad bázisként.

0,8 g (0,71 mmól) !-------(ch₂)₃-----1 —CO-Gly-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HNCHCOMet-Leu-Gly-OH-t feloldunk 5 ml DMF: Nmetil-pirrolidon (1:1) elegyben. Hozzáadunk 0,122 g HOSU-t és ezt követően hűtés közben 0,146 g DCC-t 3 ml DMF-ban oldva, majd éjszakán át keverjük. A reagáltatás után a csapadékot eltávolítjuk, és a kapott oldathoz hozzáadjuk az előbbiekben nyert BOC-mentes szabad bázist és 0,100 g HOBT-t, és 5 napig 30 °C-on keverjük. A reagáltatás után vizet adunk hozzá. A keletkezett csapadékot kiszűrjük, vízzel mossuk, majd megszárítjuk, így 2,6 g

I------------------(CH₂)₅--------i

CO-Gly-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr-(Bzl)HNCHCO-MetLeu-Gly-Thr(Bzl)-Tyr[Bzl(Cl₂)]-Thr(Bzl)-Gln-Asp (OBzl)-Phe-Ans-Lys(ClCbz)-Phe-His-Thr(Bzl)-PhePro-Gln-Thr(Bzl)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-ProNH₂-t kaptunk nyerstermékként.

A fenti nyerstermék 1,0 g-ját 25 ml hidrogénfluoriddal, 0,1 g metioninnal és 2 ml anizollal elegyítjük —5 °C-on, és 60 percig szárazjég-metanol hűtőfürdőben tartjuk csökkentett nyomáson dimetil-szulfid jelenlétében. A hidrogén-fluorid eldesztillálása után a maradékot dietil-éterrel mossuk, és a csapadékot háromszori dekantálással tisztítjuk, majd 30 ml ecetsav és 10 ml víz elegyében oldjuk. Az oldatot átengedjük acetát-formájú Dowex 1 χ2 ioncserélő gyantával töltött 2,5 X8 cm méretű oszlopon, 200 ml vízzel mossuk, és az eluátumot ismét átengedjük egy 2,5x7 cm méretű HP—20 oszlopon. Az oszlopon 80%-os etanol oldatot engedünk át, és az eluátumból eldesztilláljuk az etanolt, majd az oldat liofilizálásával 0,440 g port kapunk. Ezt a 0,440 g port 0,01 mólos vizes ammónium-acetát oldatban oldjuk, és egy 2,2 χ25 cm méretű CM-cellulózzal töltött oszlopra töltjük, és 0,01—0,2 mólos ammónium-acetát oldattal (750—750 ml) (pH 4,5) lineár gradiens módszerrel eluáljuk. Az eluálásnál 10 g-os frakciókat szedünk, és a hatóanyagtartalmú frakciókat (67—70. frakciók) egyesítjük, és fagyasztva szárítással kapjuk a hatóanyagtartalmú port. A liofilizátumot 1 mólos ecetsavban oldjuk, és egy 2,2x137 cm méretű Sephadex LH—20 töltetű oszlopon kromatografáljuk 1 mólos ecetsavval eluálva. Az eluátumot 6 g-os részletekben szedjük, majd a hatóanyagot tartalmazó frakciókat (28—37.) egyesítjük, és liofilizáljuk.

A liofilizátumot feloldjuk butanol: ecetsav: víz (4:1:5) elegy felső fázisában, és az oldatot átengedjük egy 2,7 Χ52 cm méretű oszlopon, amely az előbbi oldószerelegy alsó fázisával nedvesített Sephadex G—25-tel van töltve, és utána az illető elegy felső fázisával van átmosva. Az eluálást ugyanezen oldószerelegy felső fázisával végezzük, és 6 g-os frakciókat szedünk, majd a hatóanyagot tartalmazó frakciókat (5—14,) egyesítjük, és liofilizáljuk. Az így kapott port hasonló körülmények között Sephadex G—25-ön újra kromatografáljuk, és liofilizáljuk. A liofilizált port 1 mólos ecetsavban oldjuk, egy 2,2x137 cm méretű, Sephadex LH—20 töltetű oszlopra töltjük, és 1 mólos ecetsavval eluálva 5 g-os frakciókat szedünk. A hatóanyagot tartalmazó frakciókat egyesítjük, és liofilizálva 29,7 mg terméket kapunk acetát alakjában (1000 MRC egység/mg). Rf = 0,82 [hordozó: Merek cellulóz; eluálószer; n-butanol: :ecetsav:víz (4:1:5) (felső fázis)].

[α]ξ^β =—69,6° (c = 0,72; 1 mólos ecetsav).

Az aminosavanalízis eredményei [talált (számított)]:

Lys	1,15	(1),	His	1,01	(1),	Asp	2,94	(3),
Thr	4,80	(5),	Ser	1,06	(1),	Glu	2,14	(2),
Pro	1,96	(2),	Gly	4,00	(4),	Alá	2,00	(2),
Val	0,95	(1),	Met	0,87	(1),	Ile	0,96	(1),
Leu	1,84	(2),	Tyr	0,96	(1).	Phe	3,18	(3),

a-amino-szuberinsav 1,02 ((1).

A gyűrűzárást a következő módon végezzük:

2,8 g BOC-Gly-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-NH- (CH₂)₅—COOH

-CHCOOH_a ml vízmentes piridinnel készült oldatához 5 g trifluor-ecetsav-o- nitro-fenilésztert (TFA—ONP) adunk, és 3 óra hosszat 45 °C-on keverjük. A reakció befejeződése után az elegyet vákuumban bepároljuk, a maradékhoz dietilétert adunk, a csapadékot kiszűrjük, és dietiléterrel mosva 2,8 g pnitro-fenilésztert kapunk barna por alakjában.

A kapott porszerű termékhez hűtés közben 15 ml trifluorecet savat adunk, 30 percig szobahőmérsékleten keverjük, majd a trifluorecetsavat ledesztilláljuk. A maradékot 20 ml dimetilformamidban feloldjuk, hozzácsepegtetjük 3,0 liter vízmentes piridinhez, és 1 óra hosszat 45 °C-on keverjük. Ezután a reakcióelegyet 8 óra hosszat 50 °C-on, majd éjszakán át 40 °C-on keverjük. A reakcióelegyet vákuumban 200 ml-re bepároljuk, 3 óra hoszszat 40 °C-on keverjük, majd vákuumban 50 ml-re

-511

180589 bepároljuk, és 600 ml kloroformban oldjuk. Az oldatot telített nátrium-klorid oldattal mossuk, és a kloroformos réteget 10 ml-re bepároljuk. A bepárolt oldathoz dietilétert adunk, a csapadékot kiszűrjük, dietiléterrel mossuk, és szárítva 1,5 g (60%) j----(CH.A--------CO-Gly-Asn-Leu-8er(Bzl)-Thr(Bzl)-NHCHCOOCH₃ -t kaptunk.

Claims (3)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás a i--------(ch₂)₃------i —CO-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-NHCHCO-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-HisThr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂ (I) képletü, szérum kalciumszintet csökkentő hatású polipeptid és gyógyszerészetileg elfogadható savaddíciós sói előállítására, amelyben az aminosavak L-konfigurációban vannak, azzal jellemezve, hogy α-amino-szuberinsavat és az (I) képlet szerinti aminosavakat vagy peptideket a képlet szerinti aminosavszekvencia sorrendjében adott esetben védett alakban kondenzáljuk, és a (CH₂)₅COOR 30

   H-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-HN-CH-COáltalános képletü peptidegységet magába foglaló részt — ahol R jelentése reakcióképes észtercsoport — a szintézis bármely szakaszában gyűrűzárásnak vetjük alá, a jelenlevő védőcsoportokat lehasítjuk, és a kapott (I) képletü polipeptidet kí5 vánt esetben gyógyszerészetileg elfogadható savarldiciós sójává átalakítjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy az a-amino-szuberinsavat és az (I) képletnek megfelelő aminosavakát hidrogénfluoriddal lehasítható védőcsoporttal védett alakban kondenzáljuk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy az a-amino-szube-

   15 rinsavat és az (I) képletnek megfelelő aminosavakat hidrogénfluoriddal lehasitható védőcsoporttal védett alakban kondenzáljuk, miközben a (CH₂)₅COOR)

   H-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-HNCHCO- általános képlett! peptid-egységet — R p-nitro-fenilcsoport — kialakítása után gyűrűzárásnak vetjük alá, és a

   I----(CH₂)₅---------J

   CO-Gly- Asn-Leu - Ser-Thr-HNCHCO-Met-Leu - Gly képletnek megfelelő védett peptidrészt a -Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe - Asn - Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro -Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂ képletnek megfelelő peptidrésszel kondenzáljuk, és a jelenlevő védőcsoportokat hidrogénfluoriddal lehasítjuk.