DE2515495A1 - Neue dekapeptide, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel - Google Patents

Description

PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTER DR.-ING. WOLFRAM BUNTE DR. WERNER KINZEBACH

D-eOOO MÜNCHEN ΛΟ. BAUERSTRASSE 22 · FERNRUF (OSS) 37 63 83 · TELEX 0218208 ISAR D POSTANSCHRIFT: D-BOOO MÜNCHEN 43. POSTFACH 78O

München, 9. April 1975 j M/16 065

AMERICAN HOME PRODUCTS CORPORATION

685 Third Avenue New York, New York 10017/USA

Neue Dekapeptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende Arzneimittel

Die Erfindung betrifft das neue Dekapeptid p-Glu-l)-Phe-Trp-Ser-Tyr-D-Pgl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (J)-Phe²-JD-Pgl⁶-LRF) und hiermit verwandte Verbindungen, deren Herstellungsverfahren und sie enthaltende Arzneimittel.

Der Releasing-Faktor für das luteinisierende Hormon (nachfolgend LRF bezeichnet) ist daa Dekapeptid L-(5-0xoprolyl)-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid. Vergleiche Matsuo et al. Biochem. & Biophy. Res. Comm. £6, Seiten 1334 bis 1339.(1971). Dieses Dekapeptid wird durch den Hypothalamus freigesetzt und zur

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Adenohypophyse getragen, wo es die Freisetzung des luteinisierenden Hormons und des FoI1ikel-stimulierenden Hormons stimuliert. Die vorliegende Erfindung betrifft strukturelle Modifikationen des LRF, worin die Aminosäure in der 2-Position (d.h. His) durch D-Phe und das Glycin in der 6-Position der Peptidkette durch J)-Pheny 1 glyci η ersetzt sind.

Die neuen erfindungsgemäßen Peptide sind durch die Verbindungen der Formel I:

p-Gl U-J)-Phe-Trp-Ser-Tyr-D-Pgl-Leu-Arg-Pro-GIy-NH

; und deren nicht-toxische Säureadditionssalze dargestellt. Die j Abkürzung "PgI" steht für C-Phe-Gly oder C-Phenyl glycin. Alle in der obigen Formel I und in den nachfolgenden anderen Formeln angegebenen chiralen Aminosäurereste weisen die natürliche oder L-Konfiguration auf, falls nicht anders angegeben.

j In den Bereich der vorliegenden Erfindung fallen auch die Zwischenprodukte der Formel II:

R⁴-p-Glu-£-Phe-Trp-Ser(R³)-Tyr(R²)-£-Pgl-Leu-Arg(N^G-R¹)-

Pro-Gly-X

(II)

worin:

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N die Seitenketten-Stickstoffatome von Arginin bedeutet;

R¹ eine Schutzgruppe für die N⁰" , Ν^ω und N^ -Stickstoffatome von Arginin darstellt, die ausgewählt ist unter Nitro, ' Tosyl , Benzyloxycarbonyl , Adamantyloxycarbonyl und tert.-Butyloxycarbonyl, oder R stellt Wasserstoff dar, was bedeutet, daß sich an den Seitenketten-Stickstoffatomen des Arginins keine Schutzgruppen befinden. Wo die Schutzgruppe Nitro oder Tosyl darstellt, erfolgt das Schlitzen an einem der Ν^ω , f\^u Stickstoffe und im Falle von Benzyloxycarbonyl oder Adamantyloxycarbonyl erfolgt das Schützen am N" -Stickstoff und an einem der H^u , Ν^ω' -Stickstoffatome;

2
R eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe des Tyrosins darstellt, die ausgewählt ist unter Tetrahydropyranyl, tert.-Butyl, Trityl, Benzyl, 2,6-Di chiorbenzyl, Benzyloxycarbonyl und 4-Brombenzyloxycarbonyl. Die bevorzugte Schutz-

2 gruppe ist 2,6-Dichlorbenzyl oder Benzyl; oder R bedeutet Wasserstoff, was bedeutet, daß sich an der phenolischen Hydroxylfunktion keine Schutzgruppe befindet;

3
R eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe des Serins darstellt und ausgewählt ist unter Acetyl, Benzoyl , Tetrahydropyranyl, tert.-Butyl, Trityl, Benzyl, 2,6-Dichlor-

3
benzyl, oder R steht für Wasserstoff, was bedeutet, daß sich an dem alkoholischen Sauerstoffatom keine Schutzgruppe be-

3
findet. Vorzugsweise stellt R Benzyl dar;

4
R vorzugsweise Wasserstoff bedeutet, jedoch auch eine a-Amino-schützende Gruppe sein kann. Zu den von R umfaßten oi-Annno-schützenden Gruppen gehören diejenigen, von denen aus dem Stand der Technik bei der stufenweisen Synthese von Polypeptiden bekannt ist, daß sie brauchbar sind. Zu den von

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R umfaßten Klassen von oC-Amino-schlitzenden Gruppen gehören

1. Schutzgruppen des Acyl-Typs, die durch die folgenden Gruppen erläutert werden: Formyl, Trif1uoracety1 , ToIuolsulfony1 (Tosyl), Nitrophenylsulfenyl, etc.;

2. aromatische Schutzgruppen des Urethan-Typs, die durch Benzyl· oxycarbonyl und substituiertes Benzyloxycarbonyl , wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl , p-Brombenzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl erläutert werden;

3. aliphatische Schutzgruppen des Urethan-Typs, die durch tert.-Butyloxycarbonyl, Diisopropylmethoxycarbony1 , Isopropyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl erläutert werden;

4. Schutzgruppen des Cycloalkylurethan-Typs, die durch Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbony1 , Cyclohexyloxycarbonyl und d-Isobornyloxycarbonyl erläutert werden;

5. Schutzgruppen des Thiourethan-Typs, wie Phenylthiocarbonyl ;

6. Schutzgruppen des Alkyl-Typs, die durch Triphenylmethy1 (Trityl), Benzyl, erläutert werden;

7. Trialkylsilan-Gruppen, wie Trimethylsi 1 an .

4 Die bevorzugten c^-Amino-schützenden Gruppen, die durch R definiert werden, sind ausgewählt unter Benzyloxycarbonyl , tert.-Butyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl und d-Isobornyloxycarbonyl; in Formel II stellt mindestens einer der Reste

12 3

R , R oder R eine Schutzgruppe dar.

X ist ausgewählt unter NH₂, OH, 0-(niedrig)Alkyl , worin (niedrig)Alkyl für C₁ bis C_g steht (beispielsweise Methyl,

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Äthyl, Pentyl, Isopropyl, Hexyl und dergleichen), O-Benzyl und einer bei der Festphasen-Peptidsynthese gebrauchten Bindung an einen festen Polystyrolharzträger, der durch eine der nachfolgenden Formeln III und IV dargestellt ist:

und

0 - CH,

styrol harzsträger/

III

IV

Der Polystyrolharzträger ist vorzugsweise ein Copolymeres von Styrol mit ungefähr 1 bis 2 % Divinylbenzol als Vernetzungsr mittel, das dazu führt, daß das Polystyrolpolymere in den meisten organischen Lösungsmitteln völlig unlöslich wird. Das Polystyrolpolymere besteht aus langen Alkylketten, die an jedem zweiten Kohlenstoffatom einen Phenylring tragen, und der terminale Aminosäurerest (GIy) ist über eine kovalente Kohlenstoff an Stickstoff- oder Sauerstoffbindung an diese Phenylringe gebunden. Die Alkylketten sind bei angenähert jedem fünfzigsten Kohlenstoff durch p-substituierte Phenylreste, die sich vom Divinylbenzol ableiten, vernetzt. In der Formel III bedeutet das Symbol ^ die Phenylgruppe.

Bei der Auswahl einer bestimmten Seitenkettenschutzgruppe, die bei der Synthese der Peptide der Formeln I und II verwendet werden soll, sollte man die nachfolgenden Regeln befolgen:

(a) die Schutzgruppe muß gegenüber dem Reagenz und unter den zur Entfernung der ex-Amino-schützenden Gruppe bei jeder Stufe der Synthese gewählten Bedingungen stabil sein;

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(b) die Schutzgruppe muß ihre schützenden Eigenschaften behalten (d.h. sie darf nicht unter Kupplungsbedingungen
abgespalten werden), und

(c) die Seitenkettenschutzgruppe muß nach Beendigung der
Synthese, welche zur gewünschten Aminosäuresequenz geführt hat, unter Reaktionsbedingungen entfernbar sein,

die die Peptidkette nicht verändern. I

Zur Erläuterung der pharmazeutisch verträglichen, nicht-toxi- i

sehen Salze der Formel I seien genannt das Hydrochlorid, Hydro- !

bromid, Sulfat, Phosphat, Maleat, Acetat, Citrat, Benzoat, :

Succinat, Malat, Ascorbat und dergleichen. j

I Die Dekapeptide der Formeln I und II werden unter Anwendung

der Festphasen-Synthese'hergestellt. Die Synthese wird vom
C-terminalen Ende des Peptids unter Verwendung eines oi-Amino- | geschützten Harzes begonnen. Ein derartiges Ausgangsmaterial j kann hergestellt werden, indem man ein of-Amino-geschütztes , Glycin an ein Benzhydrylaminharz, ein chlormethyliertes Harz ; oder ein Hydroxymethylharz anhängt, wobei das erstere Harz j bevorzugt ist. Die Herstellung von Benzhydrylaminharz ist von I P. Rivaille et al., HeIv. j>4, 2772 (1971) beschrieben und die j Herstellung des Hydroxymethylharzes ist von Bodanszky et al.,
Chem. Ind. (London) J38, 1597-98 (1966) beschrieben. Ein
chlormethyliertes Harz ist von Bio Rad Laboratories Richmond,
California im Handel "erhältlich und die Herstellung eines solchen Harzes ist von Stewart et al., "Solid Phase Peptide
Synthesis" (Freeman & Co. San Francisco 1969), Kapitel 1,
Seiten 1 bis 6, beschrieben. Bei Verwendung des Benzhydryl-
aminharzes wird eine Amid-verknüpfende Bindung mit dem
oC-Amino-geschützten Glycin wie folgt gebildet:

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H⁰H - H „ H

R-N-CH₂-C-NH-C

Dies erlaubt es, daß man die C-terminale Amidfunktion erhält, direkt nachdem die Aminosäuresequenz bei der Synthese vollständig ist, indem man den Harzträger abspaltet, wobei sich am C-terminalen Teil des gewünschten Peptids der Formel I das Glycinamid bildet. Wenn die anderen Harze verwendet werden, stellt die oben in Formel IV definierte Benzylestergruppe die verankernde Bindung dar, die nach dem Abspalten des Peptids vom Harzträger in das C-terminale Amid überführt werden muß. Die bevorzugte Arbeitsweise ist die Ammonolyse zur Entfernung des geschützten Peptids vom Harz und die anschließende Entfernung der Schutzgruppe durch Hydrogenolyse oder durch Spaltung mit Fluorwasserstoff. Eine alternative Arbeitsweise stellt die Spaltung durch Umesterung mit Methanol/(Et)₃N und anschließende Überführung des erhaltenen Esters in ein Amid und nachfolgendes Entschützen wie oben beschrieben, dar. Vergleiche hierzu J.M.Stewart "Solid Phase Peptide Synthesis" Seiten 42 bis 46 (Freeman & Co. San Francisco 1969).

Das oi-Amino-geschützte Glycin wird an das BenzhydryTaminharz mil: Hilfe einer Carboxylgruppen-aktivierenden Verbindung, wie dem Isopropylcarbodiimid, gekuppelt. Nach der Kupplung des cx-Amino-geschützten Glycins an den Harzträger wird die £*-Aminoschützende Gruppe entfernt, indem man beispielsweise Trifluoressigsäure in Dichlormethan, Trifluoressigsäure alleine oder HCl in Dioxan verwendet. Das Entfernen der Schutzgruppe wird bei einer Temperatur zwischen ungefähr O⁰C und Raumtemperatur durchgeführt. Es können auch andere Standard-Spaltungsreagenzien und Bedingungen zur Entfernung spezifischer oi-Amino-schützen-

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der Gruppen verwendet werden; diese sind beispielsweise in Schroder & Lubke, "The Peptides", .J., 72 bis 75 (Academic Press 1965) beschrieben. Nach dem Enfernen der cx-Aminoschützenden Gruppe werden die verbleibenden oi- -Amino-geschUtzter Aminosäuren stufenweise in der gewünschten Reihenfolge gekuppelt, wobei man eine Verbindung der Formel I erhält. Als Alternative zur jeweils getrennten Zugabe jeder Aminosäure zur Reaktion können einige von ihnen vor der Zugabe zum Festphasenreaktor gekuppelt werden. Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in den Festphasenreaktor in einem ungefähr vierfachen Überschuß eingegeben und das Kuppeln wird in einem Medium von Dimethylformamid: Dichlormethan (1:1) oder in Dimethylformamid oder Dichlormethan alleine, durchgeführt. In den Fällen, in denen eine unvollständige Kupplung erfolgte, wird die Kupplungsmethode vor dem Entfernen der oü-Aminoschützenden Gruppe wiederholt und zwar vor dem Kuppeln der nächsten Aminosäure an den Festphasenreaktor. Der Erfolg der Kupplungsreaktion bei jeder Stufe der Synthese wird durch die Ninhydrinreaktion, beschrieben von E.Kaiser et al., Analyt. Biochem. J34, 595 (1970) überwacht.

Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz synthetisiert ist, wird das Peptid vom Harzträger durch Behandeln mit einem Reagenz, wie Fluorwasserstoff, das nicht nur das Peptid vom Harz abspaltet, sondern auch alle verbleibenden Seitenketten-Schutzgruppen und die cX-Amino-schützende Gruppe (falls anwesend) auf der Pyroglutaminsäure abspaltet, entfernt, wobei man direkt eine Verbindung der Formel I in dem Fall erhält, in dem das Benzhydrylaminharz verwendet wurde. In den Fällen, in denen ein chlormethyliertes Harz verwendet wird, kann das Peptid vom Harz durch Methanolyse abgetrennt werden, worauf das gewonnene Produkt auf Silikagel chromatographiert und die aufgefangene Fraktion einer Ammonolyse unterworfen wird, um den Methylester in das C-terminale Amid zu überführen. Eine

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seitenkettenschützende Gruppe kann dann, wie zuvor beschrieben oder nach anderen Arbeitsweisen, wie katalytische Reduktion (beispielsweise Pd auf C) unter Bedingungen erfolgen, die die Trp-Einheit intakt lassen. Bei Verwendung von Fluorwasserstoff zum Spalten wird Anisol in das Reaktionsgefäß eingebracht, um die Oxydation der labilen Aminosäure (beispielsweise Tryptophan) zu verhindern.

-Arbeitsweise Die oben diskutierte Festphasensynthesen/ ist aus dem stand der Technik wohl bekannt und ist im wesentlichen von M.Monahan et al., CR. Acad. Sei., Paris, 273, 508 (1971) beschrieben.

Die für die Peptide gebrauchte Nomenklatur ist von Schroder & Lubke, oben, Seiten viii bis xxix und in Biochemistry 11, 1726 bis 1732 (1972) beschrieben.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Herstellung der Verbindungen der Formeln I und II.

Beispiel

L-Pyroglutamyl-D-phenylalanyl-L-tryptophyl-O-benzyl-L-seryl-O-E^-dichlorbenzyl-L-tyrosyl-Ji-phenylglycyl-L-leucyl-N tosy1-L-arginy1 -L-prolyl-glycyl-benzhydrylaminharz

3 g Benzhydrylaminhydrochloridharz in einem Merrifield-Reaktionsgefäß wird zweimal jeweilsi5 Minuten mit Trifluoressigsäure behandelt, zweimal mit Methylenchlorid und zweimal mit Dimethylformamid gewaschen, zweimal jeweils 10 Minuten mit 15 % Triäthylamin in Dimethylformamid neutralisiert und viermal mit Methylenchlorid, dreimal mit Methanol und wiederum dreimal mit Methylenchlorid gewaschen. Man gibt eine Lösung von 0,79 g (4,5 mMol) t-Boc-Glycin in Methylenchlorid/Dimethyl

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formamid (1-0:1) in das Reaktionsgefäß und schüttelt 15 Minuten. Anschließend werden 0,72 ml (4,5 mMol) Diisopropylcarbodiimid zugesetzt und die Mischung wird 5 Stunden bei Umgebungstemperatur geschüttelt. Man filtriert die Reaktionsmischung, wäscht mit Methylenchlorid und belädt das Reaktionsgefäß auf die obige Weise wiederum mit t-Boc-Glycin und Diisopropylcarbodiimid. 20 Stunden später wird die Reaktionsmischung filtriert, mit Methylenchlorid, Dimethylformamid, 15 % Triäthylamin in Dimethylformamid, Dimethylformamid, dreimal mit Methylenchlorid, zwei- i mal mit Methanol und dreimal mit Methylenchlorid gewaschen i und eine Probe wird im Vakuum getrocknet. Man stellt fest, daß das Harz mit bis zu 0,30 mMol t-Boc-Glycin pro Gramm Harz substituiert ist.

Die nachfolgenden Aminos'äurereste werden nacheinander in das obige Harz eingeführt: 4,5 mMol t-Boc-L-Prolin, 2,3 mMol t-Boc-N^G-Tosyl-L-arginin, 2,3 mMol t-Boc-L-Leucin, 3,0 mMol t-Boc-D-Phenylglycin, 3,0 mMol t-Boc-0-2,6-Di chiorbenzy1-L-tyrosin, 3,0 mMol t-Boc-O-Benzy1-L-serin, 3,0 mMol t-Boc-L-Tryptophan, 4,0 mMol t-Boc-D-Pheny1 alanin und 4,0 mMol L-Pyroglutaminsäure. Alle Kupplungen werden in einer Mischung von Methylenchlorid und Dimethylformamid (3:1) während 18 Stunden bei Umgebungstemperatur unter Verwendung eines 10 %-igen Überschusses an Di isopropyl carbodi imi d , das in zwei Portionen ini Verlauf von einer Stunde zugesetzt wird, durchgeführt. Jede Kupplung wird dann ein zweites Mal nach Filtrieren und Waschen mit Methylenchlorid unter Verwendung der Hälfte der ursprünglichen Mengen an Reaktionspartnern und bei einer Reaktionszeit von 3 Stunden, durchgeführt. Das Waschen zwischen den Kupplungen ist dasselbe wie oben nach der Kupplung des t-Boc-Glycins beschrieben. Das Entschützen und Neutralisieren wird wie folgt durchgeführt: a) 1:1 Methylenchlorid und Trif1uoressigsäure (zweimal jeweils 7 Minuten); b) Methylenchlorid; c) Dimethylformamid; d) 15,% Triäthylamin in Dimethylformamid (zweimal während jeweils 7 Minuten); e) Dimethylformamid

- 10 -

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(zweimal); f) Methylenchlorid; g) Methanol (zweimal); h) Methylenchlorid (dreimal). Die einzige Ausnahme stellt die Verwendung von 5 % Äthandithiol in der Methylenchlorid- und Trifluoressigsäure-Entschützungsmischung vom EntschUtzen der Tyrosineinheit bis zu den restlichen EntschUtzungen dar.

Das gewaschene Harz wird über Nacht im Vakuum getrocknet.

Beispiel

L-Pyrogl utamyl -J)-phenyl alanyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-JD-pheny 1 gly cy 1-L-leucyl-L-arginyl-L-pro Iy 1-g Iy ei namid

Das in Beispiel 1 erhaltene, oben beschriebene Präparat wird im Vakuum mit 30 ml wasserfreiem, flüssigem Fluorwasserstoff und 10 ml Anisol 45 Minuten bei O⁰C und 15 Minuten bei Umgebungstemperatur behandelt. Man entfernt den Fluorwasserstoff so schnell wie möglich unter vermindertem Druck und extrahiert den Rückstand mit Äther. Den verbleibenden Rückstand extrahiert man mit 0,5 η Essigsäure und lyophi1isiert, wobei 1,37 g des obigen Titelprodukts zurückbleiben.

Beispiel

Reinigung und Charakterisierung von L-Pyrogl u tamyl-J)-pheny 1-alanyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-JD-phenylglycyl-L-leucyl- L-arginyl-L-prolyl-glycinamid

Das oben aufgeführte rohe Produkt aus Beispiel 2 wird wie folgt gereinigt und charakterisiert:

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1,37 g dieses Produkts in 5 ml 0,5 η Essigsäure wird auf eine Säule (2,5 cm Durchmesser und 90 em Höhe) mit einem Bett aus Sephadex G-25F, das zuvor mit 0,5 η Essigsäure äquilibriert wurde, aufgebracht und mit diesem Lösungsmittel eluiert. Jeweils Fraktionen von 4 ml werden aufgenommen und die Analyse des Säulenausflusses wird unter Verwendung der FoIin-Lowry-Farbreaktion bei jeder dritten Fraktion durchgeführt. Man erhält flini Peptid-enthaltende Hauptfraktionen: A) 110 bis 124 (42 mg),

B) 125 bis 139 (44 mg), C) 140 bis 159 (37 mg), D) 160 bis 179 (19 mg), E) 180 bis 200 (16 mg). Durch das DUnnschicht chromatographiesystem BWAP (4:1:1:1) (n-Butanol:Wasser:Essig-

säure:Pyridin) wird gezeigt, daß die Fraktionen B, C, D und E (116 mg) dasselbe Hauptmaterial enthalten. Sie werden ver-

j einigt und in 1 ml der oberen Phase von n-Butanol :0,1 m Ammonium*· acetat (1:1) auf eine Säule (1,9 cm Durchmesser und 30 cm Höhe) mit einem Bett aus Sephadex LH-20, das zuvor zuerst mit der

j unteren Phase von n-Butanol:0,1 m Ammoniumacetat (1:1) und

j anschließend mit der oberen Phase dieses Systems äquilibriert wurde, aufgebracht. Man eluiert die Säule mit der oberen Phase

j und nimmt Fraktionen von jeweils 0,5 ml ab. Der Säulenausfluß wird wie zuvor beschrieben überwacht. Man erhält 4 Hauptfraktionen: A) 35 bis 49 (12 mg), B) 50 bis 64 (21 mg),

C) 65 bis 79 (26 mg), D) 80 bis 100 (23 mg). Fraktion A ist nach dem Dünnschichtchromatographiesystem BWAP (4:2:1:1) auf Silikagel (R~ = 0,68) homogen. Die Dünnschichtchromatogramme werden durch das Chlorpeptidreagenz, Sacaguchi's Reagenz und Pauly's Reagenz entwickelt.

Nach 20 stündiger Hydrolyse des Peptids bei HO⁰C in einem geschlossenen System unter Stickstoff in 6 η HCl, die 4 % Thioglykolsäure enthält, werden die folgenden Werte für die Aminosäurereste erhalten: GIu 1,06; Phe 0,98; Trp 0,24; Ser 0,06; Tyr 1,11; PgI 0,96; Leu 0,94; Arg 1,04; Pro 0,94; GIy 1,00.

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Es wurden in vivo Tests mit weiblichen Ratten (225 bis 250 g Körpergewicht) durchgeführt. Bei den untersuchten Ratten wurde • eine Ovulationsinhibierung bei einer Dosis von ungefähr 24 mg/kg erreicht. Der Test wurde mit reifen, nicht anästhesierten, vorbrünstigen Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt. Am Nachmittag der Vorbrunst erhielt jede Ratte in der Testgruppe sechs subkutane Injektionen des Acetatsalzes der Verbindung der Formel I in Maisöl, wobei jede Injektion eine halbe Stunde nach der vorhergehenden Injektion verabreicht wurde. Die Ratten wurden am nächsten Morgen getötet und die Anzahl Tiere, die ovulierten und die Anzahl gelieferter Eier werden gemäß der von E.S.France, Neuroendocrinology £, Seiten 77 bis 89 (1970) beschriebenen Arbeitsweise aufgezeichnet. Die Abwesenheit oder eine signifikante Abnahme der Anzahl Eier ist das Kriterium für einen Anti-Ovulationseffekt. Bei einer Dosis von 1 mg pro Injektion wurde eine vollständige Inhibierung der Ovulation erreicht.

Die Verbindungen der Formel I können an Säugetiere intravenös, subkutan, intramuskulär oder oral zur Fruchtbarkeitsinhibierung und zur Ovulationskontrolle verabreicht werden. Die wirksame Dosis hängt von der Art der Verabreichung und der jeweiligen Species von zu behandelndem Säugetier ab. Eine typische Dosierung ist eine zu verabreichende physiologische Kochsalzlösung, die eine Verbindung der Formel I in einem Dosisbereich von zwischen ungefähr 20 bis 30 mg/kg Körpergewicht enthält.

Die orale Verabreichung kann entweder in fester oder flüssiger Form erfolgen. Wenn der aktive Bestandteil in Tablettenform verabreicht wird, kann die Tablette enthalten: ein Bindemittel, wie Tragantgummi, Maisstärkej Gelatine,.einen Excipienten, wie Dical ciumphospfi at, ein Desintegriermittel wie Maisstärke, Alginsäure und dergleichen, ein Schmiermittel, wie Magnesiumstearat und ein Süß- und/oder Geschmacksmittel, wie Sucrose, Lactose, Wintergrün und dergleichen.

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Claims (9)

1. ■Μ/16 065

   Patentansprüche

   . 1. Verfahren zur Herstellung eines Dekapeptids der Formel:

   R⁴-L-p-Glu-L-J3-Phe-L-Trp-L-Ser(R³)-L-Tyr(R²)-J)-Pgl-L-Leu-L-Arg (N^R¹J-L-PrO-GIy-X

   worin:

   R¹ eine Schutzgruppe für die N^, N^u und N^w'-Stickstof fatome des Arginins, ausgewählt unter Nitro, Tosyl , Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und tert.-Butyloxycarbonyl darstellt oder worin R Wasserstoff bedeutet;

   R eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe des Tyrosins, ausgewählt unter tert.-Butyl, Tetrahydropyranyl, Trityl, Benzyl, 2 ,6-Dichlorbenzyl , p-Brombenzy1-oxycarbonyl und Benzyloxycarbonyl darstellt, oder worin R Wasserstoff bedeutet;

   R eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe des Serins bedeutet und ausgewählt ist unter Acetyl, Benzoyl , Tetrahydropyranyl, tert.-Butyl, Trityl, 2,6-Di-

   chlorbenzyl und Benzyl, oder worin R Wasserstoff darstellt;

   R ausgewählt ist unter Wasserstoff oder einer oi-Aminoschützenden Gruppe;

   X ausgewählt ist unter NH₂, OH, O-(niedrig)Alkyl , O-Benzyl und einer verknüpfenden Bindung, die an ein festes Polystyrolharz gebunden ist und durch eine der Formeln

   - 14 -

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   und — 0 - CH.

   'Polystyrol harzsträger/

   dargestellt ist, worin das Polystyrolharz durch die Phenylgruppe an jedem zweiten Kohlenstoffatom der Alkylkette des Polystyrols vernetzt ist, unter der Voraussetzung, daß mindestens eine der Gruppen R von Wasserstoff verschieden ist,

   R² und R³

   dadurch gekennzeichnet, daß man die Aminosäuren in der gewünschten Sequenz entweder getrennt und nacheinander oder unter Bildung eines oder mehrerer Fragmente, die mindestens zwei Aminosäuren enthalten unter Kupplung derartiger Fragmente in der richtigen Sequenz kuppelt, wenn X für

   und

   0 - CH,

   steht, das Kuppeln durch Festphasensynthese mit einem od-Amino-geschützten Glycin, das an den Harzträger gekuppelt ist, durchführt.
2. 2. Verfahren zur Herstellung des Dekapeptids der Formel

   L-p-Gl U-J)-Phe-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-J)-Pgl-L-Leu-L-Arg-L-Pro-

   GIy-Y

   - 15 -

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   worin Y ausgewählt ist unter NH^» OH, O-(niedrig)Alkyl und O-Benzyl, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aminosäuren in der gewünschten Reihenfolge entweder getrennt und nacheinander.oder unter Bildung eines oder mehrerer Fragmente, die mindestens zwei Aminosäuren enthalten und Kuppeln derartiger Fragmente in der richtigen Sequenz kuppel wobei man die Verbindungen der Formel

   R⁴-L-P-Glu-L-£-Phe-L-Trp-L-Ser( R³ J-L-Ty r( R²)-C)-Pg 1-L-Leu-L-

   Arg-(N^G-R¹)-L-Pro-Gly-X

   erhält, worin R eine Schutzgruppe für die N^, N^ und N^ Stickstoffatome des Arginins, ausgewählt unter Nitro, Tosyl, Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und tert.-Butyloxycarbonyl darstellt oder worin R Wasserstoff bedeutet;

   ρ
   R eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe des Tyrosins, ausgewählt unter tert.-Butyl, Tetrahydropyranyl, Trityl, Benzyl, 2,6-Dichlorbenzyl , p-Brombenzyl-

   2 oxycarbonyl und Benzyloxycarbonyl darstellt oder worin R Wasserstoff bedeutet;

   R eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe des Serins darstellt und ausgewählt ist unter Acetyl, Benzoyl, Tetrahydropyranyl, tert.-Butyl, Trityl, 2,6-Dichlorbenzyl und Benzyl oder worin R Wasserstoff bedeutet;

   R ausgewählt ist unter Wasserstoff oder einer 6£-Aminoschützenden Gruppe;

   X ausgewählt ist unter NH₂> OH, O-(niedrig)Alkyl , O-Benzyl und einer verankernden Bindung, die an ein festes Polystyrolharz gebunden ist, das durch eine der Formeln

   - 16 509844/11-21

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   und — 0 - CH.

   dargestellt ist, worin das Polystyrolharz über die Phenyl gruppe an jedem zweiten Kohlenstoffatom der Alkylgruppe des Polystyrols vernetzt ist, unter der Voraussetzung,

   ,1

   daß mindestens einer der Reste R , stoff verschieden ist und, wenn X für

   ρ 3 R und R von Wasser-

   H H ι ι N-C

   und — 0 - CH.

   steht, das Kuppeln durch Festphasensynthese mit einem rt-Amino-geschützten Glycin, das an den Harzträger gekuppelt ist, durchführt, Seitenketten-schützende Gruppen abspaltet und, falls vorhanden, die c* -Amino-schützende Gruppe an der Peptidkette abspaltet, und wenn X für

   oder — 0 - CH,

   steht, das Dekapeptid vom Harzträger abspaltet und gegebenenfalls, wenn X für OH, O-Benzyl oder 0-(niedrig)Alkyl steht, eine Ammonolyse durchführt.

   - 17 -

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3. 3. Verfahren zur Herstellung des Dekapeptids der Formel

   L-p-Glu-ID-Phe-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-J)-Pgl-L-Leu-L-Arg-L-Pro-

   GIy-NH₂

   und seiner pharmakologisch verträglichen Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung eines Benzhydry1aminharzträgers durchführt und in diesen geeignet blockierte Aminosäuren in der richtigen Sequerrz einführt, wobei man eine Verbindung der Formel:

   L-p-Gl u-L-J)-Phe-L-Trp-L-Ser(O-benzy I)-L-Ty r(0-2,6-di chi οr-

   H η /Poiy-^

   benzyl)-D-PgI-L-Leu-L-Arg(N^G-tosy1)-L-Pro-Gly-N-C

   erhält, worin das Polystyrolharz durch die Phenylgruppe an jedem zweiten Kohlenstoffatom der Alkylkette des Polystyrols vernetzt ist, Seitenketten-schützende Gruppen abspaltet, das Dekapeptid vom Harzträger abspaltet und gewünschtenfal Is ein pharmakologisch verträgliches Säureadditionssalz herstellt, in dem man das Dekapeptid mit einer pharmakologisch verträglichen Säure umsetzt.
4. 4./ Verbindungen, ausgewählt unter:

   L- p-Gl u-J3-Ph e- L-T rp- L-S er-L-Tyr-JD-Pgl- L- Leu- L- Arg- L-P ro-

   GIy-NH₂

   - 18 -

   509844/1 121

   M/16 065

   R⁴-L-p-Glu-L-J)-Phe-L-Trp-L-Ser (R³)-L-Ty r (R²)-J)-PgI-L-LeU-

   L-Arg^-R¹ )-L-Pro- GIy-X

   (II)

   und nicht-toxische Säureadditionssalze davon, worin:

   R¹ eine Schutzgruppe für die N<^, N^u und N^u'-Stickstoffatome des Arginins, ausgewählt unter Nitro, Tosyl , Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und tert.-Butoxycarbonyl darstellt oder worin R Wasserstoff bedeutet;

   ρ
   R eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe des Tyrosins, ausgewählt unter tert.-Butyl, Tetrahydropyranyl, Trityl, Benzyl, 2 ,6-Di chiorbenzyl , p-Brombenzyloxycarbonyl und Benzyloxycarbony1 darstellt, oder worin R² Wasserstoff bedeutet;

   R eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe des Serins bedeutet und ausgewählt ist unter Acetyl, Benzoyl , Tetrahydropyranyl, tert.-Butyl , Trityl, 2,6-Dichlorbenzyl und Benzyl, oder worin R Wasserstoff bedeutet;

   4
   R ausgewählt .ist unter Wasserstoff oder einer «-Amino-

   schützenden Gruppe;

   X ausgewählt ist unter NH₂, OH, 0-(niedrig)Alkyl, O-Benzyl und einer verankernden Bindung, die an ein festes Polystyrolharz geknüpft ist, welches durch eine der Formeln

   Polystyrol harzträgen

   und

   — 0 - CH.

   Polystyrol harz-

   - 19 -

   509844/112

   M/16 065

   dargestellt ist, worin das Polystyrolharz durch die Phenylgruppe an jedem zweiten Kohlenstoffatom der Alkyl kette des Polystyrols vernetzt ist, mit der Ausnahme, daß mindestens einer d<
   stoff verschieden ist.

   1 ? 3 daß mindestens einer der Reste R , R und R von Wasser-
5. 5. Verbindung gemäß Formel II nach Anspruch 4, worin X für NH₂ steht.
6. 6. Verbindung gemäß Formel II nach Anspruch 4, worin R

   Wasserstoff darstellt und X für

   steht.
7. 7. Verbindung gemäß Anspruch 6, worin R Tosyl bedeutet, R für 2,6-Dichlorbenzyl steht und R^J die Bedeutung Benzyl besitzt.
8. 8. L-Pyrogl utamyl -J)-phenyl al any! -L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosy1-^)-C-phenylglycyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolylglycinamid und seine nicht-toxischen Additionssalze.
9. 9. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an p-L-Glu-ü-Phe-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-JD-Pgl-L-Leu-L-Arg-L-Pro-GIy-NH₂ oder einem seiner nicht-toxischen Säureadditi ons· salze zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder üblichen Hilfsmitteln.

   21/V. _ - 20 -

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