DE2725734A1

DE2725734A1 - Nonapeptide mit claudogen-interceptiver wirkung

Info

Publication number: DE2725734A1
Application number: DE19772725734
Authority: DE
Inventors: Theodore John Foell; Richard Wilhelm Rees
Original assignee: American Home Products Corp
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1976-06-07
Filing date: 1977-06-07
Publication date: 1977-12-15
Also published as: US4089946A; BE855471A; NL188472B; DE2725734C2; DK250077A; IN146030B; NL188472C; CA1090786A; FR2358382B1; NL7706218A; CH624924A5; JPS6111240B2; LU77491A1; JPS52151167A; DK149202B; FR2358382A1; DK149202C

Description

PROF. DR. DR. J. REITST UTVER DR.-ING. WOLFRAM BUNT DR. WERNER KINZEBACH

ROF. DR. DR.-ING. WOLFRAM BUNTE ?72 57

D-SOOO MÜNCHEN 4O. BAUERSTRASSE 22 · FERNRUF ΙΟββΙ »7 68 S3 - TiLEX B21S2OS ISAR D POSTANSCHRIFT: POSTFACH TO. D-SOOO MÜNCHEN 43

München, den 7. Juni 1977 M/18 152

AMERICAN HOME PRODUCTS CORPORATION

685 Third Avenue

New York, New York, 10017, USA

Nonapeptide mit claudogen-interceptiver Wirkung

Die Erfindung betrifft Nonapeptidanaloge von LRH, Methoden zu ihrer Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel.

In jüngerer Zeit wurden zahlreiche Analoge von LRH hergestellt und als Mittel zur Ovulationsauslösung getestet. Am vorteilhaftesten hat sich bisher die Abwandlung der Aminosäurefolge von LRH unter Abspaltung der GIy -Gruppe und Bildung der Pro-NHC₂Hc-Endgruppe erwiesen, wobei eine Verbindung

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erhalten wird, welche die fünffache Aktivität von LRH selbst aufweisen soll; vgl. Fujino et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 49 (1972), Seite 863. Später wurde von Monahan et al., Biochemistry 12 (1973), Seite U616 gezeigt, daß D-AIa-LRH eine höhere Wirksamkeit als LRH besitzt. Verschiedene andere D-Aminosäuren wurden in 6-Stellung von LRH und des-Gly -PrO-NHC₂H₅-LRH eingeführt, wobei Verbindungen mit verbesserten ovulationsauslösenden Eigenschaften erhalten wurden; vgl. US-PS 3 913 412 und Vilchez-Martinez et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 59 (197¹O* Seite 1226. D-AIa⁶, des-Gly¹⁰-LRH-äthylaraid besitzt nach Coy et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 57 (197¹I), Seite 335 etwa die doppelte Wirksamkeit von D-AIa -LRH hinsichtlich der Stimulierung der LH-Sekretion. Ling et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 63 (1975), Seite 8OI, berichten über die Synthese und biologische Aktivität von D-AIa⁶, (N^a-Me)Leu⁷-LRH hinsichtlich der Stimulierung der LH-Sekretion; die Autoren stellten fest, daß diese Aktivität 56Ο % der Wirkung von LRH beträgt, und reihten die Verbindung in denselben Wirksamkeitsbereich wie D-Ala⁶-LRH ein.

Gegenstand der Erfindung ist eine Gruppe von neuen Nonapeptiden der allgemeinen Formel I:

L-p-Glu-L-His-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-X-Y-L-Arg-L-Pro-NHC₂H₅

(D

worin X D-Trp oder D-2-(l,'l-Cyclohexadienyl)-Gly und Y L-(N-Methyl)-Leu oder L-(N-Methyl)-Ile

sind, sowie deren nicht-toxische Säureadditionssalze. Von diesen Verbindungen wird [D-Trp⁶, L-(N-Methyl)-Leu⁷, des-Gly-NH₂ ¹⁰, Pro-äthylamid]LRH aufgrund seiner Aktivität bevorzugt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen lösen die Ovulation bei Warmblütern aus und stellen claudogen-interceptive Mittel dar, die sich zur Verhinderung oder zum Abbruch der Schwangerschaft eignen. Die

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Verbindungen entfalten eine claudogen-interceptive Wirkung, wenn sie post-koital weiblichen Warmblütern nach der Ovulation verabreicht werden. Diese Wirkung beruht darauf, daß die Verbindungen die normalen physiologischen Prozesse unterbrechen, welche für die Implantation und/oder Zurückhaltung einer befruchteten Eizelle erforderlich sind.

Die Erfindung betrifft ferner die bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Nonapeptide anfallenden Zwischenprodukte. Diese Zwischenprodukte sind das vollständig oder teilweise geschützte Polypeptidharz sowie die vollständig oder teilweise geschützten Polypeptid-äthylamide der allgemeinen Formel II:

p-Glu-His(R)-Trp-Ser(R¹)-Tyr(R²)-X-Y-Arg(R³)-Pro-Z

(ID

in der Z eine Hydroxylgruppe oder ein acylierendes Derivat davon, wie einen Ester, z.B. einen Nieder-alkylester, Benzylester oder einen Ester der Formel -OCH₂(Polystyrolharzträger), oder -NHC₂H₁- darstellt, X und Y jeweils die vorstehend angegebene Bedeutung haben, wobei vorzugsweise X D-Trp und Y L-(N-Hethyl)-Leu sind, R ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe für den Iminostickstoff des Histidylanteils ist und R^ ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe für die Guanylfunktion des Arginylanteils, beispielsweise eine Tosyl-, Acetyl-, Benzoyl-, tert.-Butyl-, Trityl-, Benzyl-, Benzyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl- oder Nitrogruppe, bedeutet. Die Tosylgruppe wird als Schutzgruppe sowohl für R als auch für R^ bevorzugt. Die Guanylgruppe des Arginylanteils kann jedoch über das N^- oder N Stickstoffatom durch die Nitro- oder Tosylgruppe und über das N^-Stickstoffatom oder entweder das N^a- oder N^£jl-Stickstoffatom durch die Benzyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl- oder

1 2

Tritylgruppe geschützt sein. R und R stellen jeweils ein Wasserstoff atom oder eine Schutzgruppe für die Hydroxylgruppen von

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Serin und Tyrosin dar. Die üblicherweise für diesen Zweck verwendeten Hydroxyl-Schutzgruppen sind die Acetyl-, Tosyl-, Benzoyl-, tert.-Butyl-, Trityl-, Benzyl-, Benzyloxycarbonyl- und 2,6-Dichlorbenzylgruppe; die Benzyl- und 2,6-Dichlorbenzylgruppe werden dabei bevorzugt. Die obigen Definitionen gelten t der Maßgabe, daß mindestens e:

kein Wasserstoffatom darstellt.

1 2 mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Reste R, R , R und

Die Reste R und R·^ stellen vorzugsweise jeweils eine Tosyl-

1 2

gruppe dar. Insbesondere ist R eine Benzylgruppe, während R eine 2,6-Dichlorbenzylgruppe darstellt.

Die Erfindung betrifft ferner Methoden zur Herstellung der Nonapeptide der Formeln I und II. Ein solches Verfahren zur Herstellung der Nonapeptide der Formel I gemäß obiger Definition besteht darin, daß man von einem entsprechenden Nonapeptid der allgemeinen Formel Ha:

p-Glu-His(R)-Trp-Ser(R¹)-Tyr(R²)-X-Y-Arg(R⁵)-Pro-NHÄt (Ha)

12 3

in der R, R , R , R , X und Y jeweils die vorstehend angegebene Bedeutung haben, die Schutzgruppe(n) abspaltet. Die Schutzgruppenentfernung kann nach herkömmlichen Methoden durchgeführt werden, vorzugsweise in einer einzigen Stufe unter Verwendung von flüssigem Fluorwasserstoff in Gegenwart von Anisol.

Die geschützten Peptide der Formel Ha können durch Acylierung von Äthylamin mit einem in geeigneter Weise geschützten Nonapeptid der allgemeinen Formel Hb:

p-Glu-His(R)-Trp-Ser(R¹)-Tyr(R²)-X-Y-Arg(R³)-Pro-Z¹

(Hb)

in der R, R , R , R³, Y und Y jeweils die vorstehend angegebene

- 4 -7098S0/1180

Bedeutung haben und Z eine Hydroxylgruppe oder ein acylierendes funktionelles Derivat davon darstellt, hergestellt werden. Beispiele für acylierende Derivate sind Ester, wie Nieder-alkyl-oder

Benzylester oder ein mit einem Karzträger gebildeter Ester, in welu

chem Falle Z -OCH5(Polystyrolharzträger) ist. Die Acylierung kann nach herkömmlichen Methoden vorgenommen werden; wenn Z z.B. eine Hydroxylgruppe ist, wird ein Kondensationsmittel, wie Dicyclohexylcarbodiimid, verwendet.

Die Verbindungen der Formel Hb, bei denen Z eine Hydroxylgruppe oder ein acyliertes funktionelles Derivat davon ist, können nach bekannten Methoden zum Aufbau einer Aminosäurensequenz hergestellt werden; vgl. die Standardlehrbücher über die Peptidsynthese. Wenn ein Nonapeptid benötigt wird, bei dem Z -OCH_(Polystyrolharzträger) ist, kann diese Verbindung in der festen Phase nach herkömmlichen Methoden zum Aufbau einer Aminosäurensequenz aus einer einen Harzträger aufweisenden Ausgangsaminosäure hergestellt werden. Merrified, J.A.C.S. 85 (1963), Seite 2149, erläutert die betreffende Methode in allgemeiner Form.

Als Harzträger kann ein beliebiges geeignetes Harz eingesetzt werden, wie es üblicherweise für die Festphasensynthese von Polypeptiden verwendet wird (bevorzugt wird Polystyrol, das mit 0,5 bis 3 % Divinylbenzol vernetzt wurde), welches zur Schaffung von Ansatzpunkten für die Esterbildung mit der anfänglich zugeführten geschützten Aminosäure chlormethyliert wurde. Das an der Aminogruppe geschützte Prolin kann nach der Methode von Gisin, HeIv. Chim. Acta., 56 (1973), Seite 1476, mit dem chlormethylierten Harz verknüpft werden. Nach der Kupplung des an der Aminogruppe geschützten Prolins mit dem Harzträger kann die Anino-Schutzgruppe nach herkömmlichen Methoden mit Hilfe von Trifluoressigsäure in Methylendichlorid, Trifluoressigsäure allein oder HCl in Dioxan abgespalten werden. Die Schutzgruppenentfernung kann bei einer Temperatur von

vorger

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etwa 0 C bis Raumtemperatur vorgenommen werden. Nach der Ab-

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spaltung der Amino-Schutzgruppe werden die restlichen, an den «-Aminogruppen und nötigenfalls an den Seitenketten geschützten Aminosäuren nacheinander in der gewünschten Reihenfolge zur Herstellung des Produkts gekuppelt. Nach einer Alternativmethode kann man mehrere Aminosäuregruppen nach der Lösungsmethode kuppeln, bevor man die Verknüpfung mit der den Harzträger aufweisenden Aminosäurensequenz vornimmt. Die Wahl eines geeigneten Kupplungsreagens kann in routinemäßiger Weise erfolgen. Ein besonders gut geeignetes Kupplungsmittel ist Ν,Ν'-Diisopropylcarbodiimid. N,N¹-Dicyclohexylcarbodiimid stellt ein weiteres verwendbares Kupplungsmittel dar.

Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäurensequenz bzw. -kette wird in zwei- bis sechsfachem Überschuß in den Festphasenreaktor eingespeist. Die Kupplung wird in einem Medium von Dimethylformamid/Methylendichlorid, Dimethylformamid allein oder Methylendichlorid allein durchgeführt. Wenn eine unvollständige Verknüpfung erfolgt, wiederholt man den Kupplungsvorgang vor der Abspaltung der ^a-Amino-Schutzgruppe, bevor man die nächste Aminosäure in den Festphasenreaktor einspeist. Der erfolgreiche Verlauf der Kupplungsreaktion wird in jeder Synthesestufe mit Hilfe der Ninhydrinreaktion überwacht; vgl. E. Kaiser et al., Analyt. Biochem, 3¹» (1970), Seite 595.

Die für jede in das Polypeptid eingebaute Aminosäure benötigte a-Amino-Schutzgruppe ist vorzugsweise eine tert.-Eutyloxycarbonylgruppe. Man kann jedoch eine beliebige entsprechende Schutzgruppe verwenden, sofern sie unter den Kupplungsbedingungen nicht abgespalten wird und sich andererseits im Verhältnis zu den Übrigen im Molekül befindlichen Schutzgruppen unter Bedingungen, welche das gebildete Molekül ansonsten nicht angreifen, leicht selektiv abspalten läßt. Weitere Beispiele für solche af-Aninoschutzgruppen, welche unter Berücksichtigung des Restes des Polypeptidmoleküls ausgewählt werden können, sind die Trityl-, Phthalyl-, Tosyl-, Allyloxycarbonyl-, Cyclopentyloxy-

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carbonyl-, tert.-Amyloxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl- sowie ο- und p-Nitrobenzyloxycarbonylgruppe.

Die für die Auswahl der Schutzgruppen für die Reste R bis R^ maßgeblichen Kriterien sind:

(a) Die Schutzgruppe muß gegenüber dem Reagens und unter den Reaktionsbedingungen, die für die Abspaltung der cc-Anino-Schutzgruppe in jeder Stufe der Synthese gewählt werden, beständig sein;

(b) die Schutzgruppe muß ihre schützenden Eigenschaften bewahren (d.h. sie darf unter den Kupplungsbedingungen nicht abgespalten werden); und

(c) die Schutzgruppe muß sich nach Abschluß der Polypeptidsynthese unter Bedingungen leicht abspalten lassen, welche die Polypeptidstruktur ansonsten nicht beeinflussen.

Die vollständig geschützten, einen Harzträger aufweisenden Nonapeptide weisen die Aminosäurensequenz lic auf:

p-Glu-His(R)-Trp-Ser(R¹)-Tyr(R²)-X-Y-Arg(R³)-Pro-0-CHp-(Polystyrolharzträger)

(lic)

worin die Gruppe -O-CHp-(Polystyrolharzträger) den Esteranteil einer der zahlreichen funktioneilen Gruppen im Polystyrolharz darstellt.

Die vollständig geschützten Nonapeptide werden von ihrem Harzträger vorzugsweise durch Behandlung mit Äthylamin bei Raumtemperatur abgetrennt, wobei anschließend jegliches überschüssiges Äthylamin entfernt wird. Auf diese Weise erhält man die Zwischenprodukte der Formel Ha:

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p-Gly-His(R)-Trp-Ser(R¹)-Tyr(R²)-X-Y-Arg(R⁵)-PrO-NHC₃H₅

(Ha)

Das vorstehend beschriebene, vollständig geschützte Zwischenprodukt wird vorzugsweise mit flüssigem Fluorwasserstoff in Gegenwart von Anisol von der (den) Schutzgruppe(n) befreit. Dabei erhält man die erfindungsgemäßen claudogen-interceptiven Mittel.

Wahlweise kann das einen Harzträger aufweisende Nonapeptid der Formel lic durch Umesterung unter Bildung eines Esters gespalten werden. Zum Beispiel kann ein Nieder-alkylester oder Benzylester durch Umesterung mit einem niederen Alkanol oder Benzylalkohol in Gegenwart einer Base (wie Triäthylamin) erzeugt werden. Diese Esterderivate der Formel Hb können in der vorstehend beschriebenen Weise zur Herstellung der Zwischenprodukte der Formel Ha verwendet werden.

Eine weitere Methode zur Herstellung der geschützten Nonapeptide der Formel Ua besteht in der Verknüpfung der erforderlichen Aminosäuren, die nötigenfalls in geeigneter Weise geschützt und/oder aktiviert sind, und Xthylamin in beliebiger Reihenfolge, welche die gewünschte Peptidfolge ergibt.

Die Kupplung bzw. Verknüpfung der Aminosäuren und von Äthylamin im vorgenannten Verfahren kann nach den in der Peptidchemie üblichen Standardmethoden vorgenommen werden. Solche Methoden sind beispielsweise in Standard-Lehrbüchern über die Peptidsynthese beschrieben; vgl. z.B. Schröder und Lübke, "The Peptides", Academic Press I965, sowie Greenstein und Winitz, "Chemistry of the Amino Acids", Band 2 (196I), John Wiley and Sons, Inc. Ein Beispiel eines Verfahrens zur Herstellung einer Verbindung der Formel Ha, das von den Aminosäurebausteinen und Äthylamin ausgeht, wird durch das nachstehende Reaktionsschema veran-

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schaulicht. In diesem Schema werden die Standardabkürzungen für die Aminosäuren, Schutzgruppen und Kupplungsmittel verwendet; vgl. z.B. Schröder und Lübke (a.a.O.), Seiten XIII bis XXIX. Der Ausdruck "Azid" im Schema bezieht sich auf die Azidmethode zur Kupplung der Aminosäuren. Die erste Stufe besteht somit in der Bildung des Dipeptids p-Glu-His-OMe durch Kondensation von p-GluOH und His-OMe mit Hilfe von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC). Das Dipeptid wird mit Hydrazin zum Hydrazid p-Glu-His-NHNH_p umgesetzt, das nach der Azidmethode mit H-Trp-OBzl zum Tripeptid p-Glu-His-Trp-OBzl gekuppelt wird. Durch Verknüpfung weiterer Peptidfragmente entsteht das NO~-geschützte Peptid der Formel Ha, welches - wie in der letzten Stufe gezeigt wird - durch Abspaltung der Schutzgruppe zu einer Verbindung der Formel I umgewandelt wird.

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ORIGINAL

Die Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Nonapeptide werden nach bekannten Methoden aus anorganischen oder organischen Säuren hergestellt, welche bekanntermaßen pharmakologisch verträgliche, nicht-toxische Additionssalze ergeben. Spezielle Beispiele für geeignete Säuren sind Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Kaiein-, Essig-, Zitronen-, Benzoe-, Bernstein-, Äpfel- und Ascorbinsäure.

Wenn man die claudogen-interceptiven Mittel der Erfindung weiblichen Warmblütern post-koital während mindestens drei Tagen in Form von täglichen Dosen von mindestens etwa 3 ,ug/kg Körpergewicht verabreicht, läßt sich dadurch eine Schwangerschaft vollständig verhindern.

Obwohl keinerlei Bindung an eine spezielle Theorie des Wirkungsmechanismus beabsichtigt ist, wird aufgrund der Ergebnisse verschiedener Tierversuche angenommen, daß die erfindungsgemäßen Nonapeptide die claudogen-interceptive Wirkung über eine Stimulierung der hypophysär-ovarialen Steroidachse bzw. -Wechselwirkung entfalten.

Unabhängig von dem zum Endresultat führenden physiologischen Prozeß ermöglichen die erfindungsgemäßen Nonapeptide bei postkoitaler Verabreichung eine wirksame Schwangerschaftsverhütung.

Die Nonapeptide der Erfindung können daher als "Danach"-Kontraceptiva zur Verhinderung oder zum Abbruch der Schwangerschaft eingesetzt werden. Auf dieser Wirkung beruht die Eignung der Nonapeptide als fortpflanzungsverhindernde Mittel im Rahmen der Nagetierbekämpfung, wobei auf den Einsatz von Rodenticiden, die unerwünschte Auswirkungen auf andere in der Nähe befindliche Tiere haben können, verzichtet werden kann.

Bei Tierversuchen wurde eine Trächtigkeitsverhinderung bei täglicher Verabreichung eines erfindungsgeraaßen Nonapeptids inner-

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halb des Zeitraums vom 1. bis 7. Tag nach dein Koitus sowie bei täglicher Verabreichung innerhalb des Zeitraums vom 7. bis 12. Tag nach dem Koitus erzielt. Somit wurde soiiohl eine claudogene (vor der Implantation) als auch eine interceptive bzw. unterbrechende (nach der Implantation) Beeinflussung der Gravidität nachgewiesen.

Zur Bestimmung der Antigraviditätswirkung der erfindungsgemässen Nonapeptide wurde folgendes Verfahren angewendet:

Ausgewachsene weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Körpergewicht von jeweils 350 * 30 g, die unter einem 1*1:10-Hell/-Dunkel-Stundenplan gehalten wurden, wurden an Abend des Proöstrus zusammen mit fruchtbaren männlichen Ratten in Käfige gesperrt. Beim Vorhandensein von vaginalem Sperma am nächsten Morgen wurde der betreffende Tag als erster Tag der Trächtigkeit angesehen. Das in den nachstehenden Beispielen hergestellte Nonapeptid-äthylamid wurde als Stellvertreter für die gesamte Gruppe der erfindungsgemäßen Verbindungen subkutan in einem Maisölmedium am 1. bis 7. bzw. 7. bis 12. Tag der Trächtigkeit in einer Dosis von lediglich 1-ug/Ratte/Tag verabreicht. Die Tagesdosen wurden jeweils zur Hälfte um 9 Uhr bzw. 15 Uhr verabfolgt. Die Tiere, denen die Verbindungen am 1. bis 7. Tag verabreicht worden waren, wurden am 14. Tag der Trächtigkeit autopsiert. Die Autopsie der Tiere, bei denen die Verabreichung am 7. bis 12. Tag stattgefunden hatte, erfolgte am 18. Tag der Trächtigkeit. Die Wirksamkeit des Äthylamids und seine effektive Dosis wurden aufgrund der Abwesenheit von Uterusimplantationsstellen und Feten festgestellt. Die Gegenwart mindestens eines normalen Fetus wurde als Kriterium für die Trächtigkeit angesehen. Die claudogen-interceptive Wirkung der erfindungsgemäßen Nonapeptide wurde auf diese Weise bei einer täglichen Dosis von lediglich etwa 3/Ug/kg Körpergewicht nachgewiesen, wobei sich die Behandlung an einer Gruppe von fünf Ratten für den Zeitraum vom 1. bis zum 7. Tag bei einer Dosis von l,ug/ Ratte/Tag und für den Zeitraum vom 7. bis zum 12. Tag bei einer

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Dosis von 10»ug/Ratte/Tag als 100%ig wirksam erwies.

Um die post-koitalen Trächtigkeitsstufen an Ratten zu definieren, wurde das folgende Schema zur Festlegung der post-koitalen contraceptiven Aktivität, welche für den vorliegenden Zweck sowohl die claudogene (vor der Implantation) als auch die interceptive (nach der Implantation) contraceptive Aktivität einschließt, aufgestellt: 1. Tag - vaginales Sperma; 1. bi3 3. Tag - Eitransport in den Eileitern, Befruchtung; 3. bi3 5. Tag - Blastocyst (Blastula) frei in der Uterushöhle; 5. bis 7. Tag - Implantation (Einbettung) in die Uterusschleimhaut; nach dem 7. Tag - nach der Implantation.

Aufgrund der beim Rattenversuch festgestellten trächtigkeitsverhindernden Wirkung sowie der Tatsache, daß die vorliegenden wissenschaftlichen Erkenntnisse darauf hindeuten, daß die hormonale Situation bezüglich des Fortpflanzungszyklus bis zur und einschließlich der Ovulation bei sämtlichen Wirbeltieren im Prinzip gleich ist (der menschliche Fortpflanzungszyklus ist z.B. jenem der Ratte in physiologischer Hinsicht analog), wird durch die Aktivität der erfindungsgemäBen Nonapeptide die Entwicklung der Blastula (Blastocyst) vor und nach der Einbettung in die UterusSchleimhaut bei sämtlichen Warmblütern (unter Einschluß des Menschen) wirksam unterbrochen.

Erfindungsgemäß kann somit die Schwangerschaft bzw. ■Trächtigkeit der Warmblüter dadurch verhindert werden, daß man postkoital während einer zum Graviditätsabbruch ausreichenden Zeitspanne täglich mindestens etwa 3/Ug/kg Körpergewicht einer Verbindung der Formel I, vorzugsweise von L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-L-(N-methyl)-leucyl-L-arginyl-L-prolyläthylamid, L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-2-(l,l»-cyclohexadieny1)-glycyl-L-(N-methy1)-leucy1-L-arginyl-L-prolyläthylamid oder des (N-MethyD-isoleucyl' -Analogen einer dieser Verbindungen, verabreicht.

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Die erfindungsgemäßen Verbindungen stören den Graviditätsmechanismus, wobei diese Einwirkung entweder nach einem frühen post-koitalen, contraceptiven (vor der Implantation) oder nach einem interceptiven (nach der Implantation) Wirkungsmechanismus erfolgt. In der Humanmedizin erfolgt somit eine
wirksame tägliche Verabreichung vom 1. Tag der Ovulation/Befruchtung bis etwa zum 6. Tag zur Erzielung einer claudogenen Reaktion oder vom 6. bis etwa zum I¹J. Tag nach der Ovulation/ Befruchtung zur Erzielung einer interceptiven Reaktion während der Graviditätsperiode. Die in der Humanmedizin anzuwendende Dosis beträgt aufgrund der Dosiologie beim Tierversuch etwa
1,5 mg/Tag (für eine 50 kg schwere Frau). Für praktische Zwecke beträgt die anwendbare subkutane Dosis in der Humanmedizin etwa 50,ug/kg/Tag (2,5 mg/Tag für eine 50 kg schwere Frau) zur Erzielung eines claudogenen Effekts sowie etwa 500 ,ug/kg/Tag (25 mg/Tag für eine 50 kg schwere Frau) zur Erzielung eines
interceptiven Effekts.

Die erfindungsgemäßen Nonapeptide können in einer beliebigen zweckmäßigen Form oral oder parenteral sowie mit oder ohne
die üblichen, bekannten pharmakclogischen Hilfsstoffe verabreicht werden. Außerdem können herkömmliche Addukte der Nonapeptide zur Verlängerung ihrer Wirksamkeit verwendet werden, beispielsweise Protamin-Zink- oder -Aluminiumaddukte, welche nach herkömmlichen Methoden erzeugt werden.

Für einen Schwangerschaftsabbruch werden die erfindungsgemäßen Nonapeptide vorzugsweise oral oder parenteral verabfolgt, wobei man die Verabreichung täglich mit Beginn am
1. Tag nach dem Koitus und während etwa der ersten acht Tage nach der Implantation oder bis etwa zum 7. Tag nach dem Koitus vornimmt.

Die ovulationsauslösenden Eigenschaften der erfindungsgemäßen Nonapeptide wurden an der bevorzugten Verbindung, d.h.

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[D-Trp⁶, (N-Methyl)-Leu⁷, des-Gly-NH₂ ¹⁰, Pro-äthylamid]LRH wie folgt bestimmt:

Beim Proöstrus befindlichen weiblichen Sprague-Dawley-Ratten wurde um 13-30 Uhr eine hypnotische Dosis von Nembutal (50 mg/kg) intraperitoneal injiziert. Zwischen 13.^0 Uhr und 13.50 Uhr wurde den Ratten die Testsubstanz durch die Drosselader verabreicht. Am folgenden Morgen wurden die Tiere getötet, und die Muttertuben wurden unter einem Präpariermikroskop auf vorhandene Eizellen untersucht. Der Test ergab bei einer Dosis von 0,1 mg/Ratte eine ovulationsauslösende Wirkung an 100 % der Ratten. Im Vergleich dazu erfordert LRH für eine lOOiige Ovulationsauslosung eine Dosis von etwa 3 mg/Ratte, während [D-AIa⁶, des-Gly-NH₂ ¹⁰, Pro-äthylamidJLRH für dieselbe Reaktion etwa 1 mg/Ratte erfordert. Die bevorzugte Verbindung der Erfindung weist somit hinsichtlich der Ovulationsauslosung etwa die zehnfache Aktivität ihrer nächsten Strukturanalogen auf.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Herstellung von p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-(N-methy1)-Leu-Arg-Pro-NHC H welches das bevorzugte claudogen-interceptive Kittel der Erfindung darstellt. Es wird festgestellt, daß die übrigen hier beschriebenen Nonapeptide in derselben Weise hergestellt werden können, wobei man lediglich die betreffende spezielle Aminosäure an der richtigen Stelle der Synthesefolge ersatzweise verwenden muß.

Beispiel

Herstellung von tert.-Butyloxycarbonylprolinharz (Verfahren von Gisin, Helv.Chim.Acta, 56 (1973), Seite

18,56 g (86,3 mMol) tert.-Butyloxycarbonylprolin in einem Gemisch aus 112 ml Äthanol und 48 ml Wasser wird mit konzentrier-

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ter wäßriger Caesiumhydrogencarbonatlösung versetzt, bis der pH-Wert der Lösung 7 erreicht. Anschließend wird das Reaktionsgemisch abgestreift und getrocknet, wobei man eine wiederholte Abstreifung mit Äthanol, Äthanol/Benzol und Benzol (dreimal) vornimmt. Der Rückstand wird über Nacht bei Raumtemperatur über Phosphorpentoxid vakuumgetrocknet.

Das gesamte Produkt wird in Dimethylformamid (880 ml) über Nacht unter Stickstoff bei 50°C mit 80 g Bio-Beads S.X. 1-Harz (chloromethylierte Kapazität O,89^mäQ/g) gerührt. Anschließend filtriert man das Harz ab und wäscht es gründlich mit Dimethylformamid (zweimal), Dimethylformamid/10 % Wasser (zweimal), Dimethylformamid (zweimal), Methanol (zweimal) und Chloroform (dreimal) und trocknet es über P_o0_c. Die Amino-Säurenanalyse ergibt eine Substitution am Harz von O,56niäq/g.

Beispiel

L-Pyroglutamyl-N^lm-tosyl-L-histidyl-L-tryptophyl-0-benzyl-L-seryl-0-(2,6-dichlorbenzyl)-L-tyrosyl-D-tryptophyl-N-methyl-L-leucyl-NS-tosyl-L-arginyl-L-prolylacy!harzester

0,2,6-diClBzl

N^lmTos _Hg

I OBzI ,

p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-N-Me-Leu-Arg-Pro-O-Harz

Das tert.-Butyloxycarbonylprolinharz (4,725 g) von Beispiel 1 wird in eine Beckman 990-Peptidsynthesevorrichtung gegeben und wie folgt behandelt:

1) Wäsche mit Methanol;

2) Wäsche mit Methylendichlorid;

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3) Wäsche mit Methanol (zweimal);

4) Wäsche mit Methylendichlorid (zweimal);

5) Vorwäsche mit lrl-Trifluoressigsäure/Methylchlorid (Vol./Vol.) mit einem Gehalt von 0,5 % Dithioerythrit;

6) Schutzgruppenabspaltung mit dem Lösungsmittel von Stufe 5) (zweimal jeweils 15 Min.);

7) Wäsche mit Methylendichlorid;

8) Wäsche mit Dimethylformamid;

9) 10 Min. Wäsche mit 12,5 % Triäthylamin in Dimethylformamid (Vol./Vol.) (zweimal);

10) Wäsche mit Dimethylformamid;

11) Wäsche mit Methylendichlorid (zweimal);

12) Wäsche mit Methanol (zweimal);

13) Wäsche mit Methylendichlorid (dreimal);

14) Gelindes Rühren des Peptidharzes mit 9 Mol der gewünschten tert.-Butyloxycarbonylaminosäure in etwa 30 ml l:l-Dimethylformamid/Methylendichlorid (Vol./Vol.) als Lösungsmittel;

15) Zugabe von 1 m Diisopropylcarbodiimid in Methylendichlorid (10 mMol) während 30 Min. in Form von zwei Teilmengen;

16) 7 Std. langes Rühren des Reaktionsgemisches.

Sofern es nicht anders angegeben ist, beträgt die Kontaktdauer in jeder Stufe 1,5 Minuten.

Die vorgenannten Stufen werden bis zur Einführung sämtlicher ge-

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wünschter Aminosäuren wiederholt.

Anschließend werden folgende Aminosäurereste nacheinander eingeführt: t-Boc-N^s-tosyl-L-arginin (9 mMol), t-Boc-N-methyl-L-leucin (9 mMol), t-Boc-D-tryptophan (9 mMol), wonach man ohne Schutzgruppenabspaltung einen zweiten Anteil von t-Boc-D-tryptophan (9 mMol) reagieren läßt. Unter Wiederaufnahme der normalen Sequenz werden dann t-Boc-2,6-dichlorbenzyl-L-tyrosin (9 mMol), t-Boc,0-benzyl-L-serin (9 mMol), t-Boc-L-tryptophan (9 mMol), t-Boc-im-tosyl-L-histidin (9 mMol) und L-2-Pyrrolidon-5-carbonsäure (9 mMol) eingeführt. Anschließend wird das Peptidharz gewaschen, im Vakuum getrocknet und gewogen (8,422 g).

B e i s ρ i e 1

L-Pyroglutamyl-N^im-L-histidyl-L-tryptophyl-0-benzyl-L-seryl-0-

(2,6-dichlorbenzyl)-L-tyrosyl-D-tryptophyl-N-methyl-L-leucyl-NS-tosyl-L-arginyl-prolinäthylamid

8,Hb g des geschützten Peptidharzes von Beispiel 2 und 120 ml Äthylamin werden über Nacht in einer Glasdruckflasche gerührt. Anschließend wird das überschüssige Äthylamin unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand mit Methanol/Dimethylformamid (viermal), Methanol und Methylendichlorid gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum unterhalb 35°C eingedampft, wobei man 3,277 g der gewünschten Verbindung erhält.

Beispiel

L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-N-methyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolinäthylamid

Das Produkt von Beispiel 3 wird im Vakuum während 50 Min. bei 0⁰C mit 120 ml wasserfreiem, flüssigem HP und 35 ml Anisol be-

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handelt. Anschließend dampft man den Fluorwasserstoff unter vermindertem Druck ab und verteilt den Rückstand zwischen Diäthylather und lOjiger wäßriger Essisäure. Durch Gefriertrocknung der Säureschicht erhält man die rohe, gewünschte Verbindung (2,404 g).

Beispiel

Reinigung und Charakterisierung von L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-N-methyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolinäthylamid

Das rohe Peptid (2,¹IOU g) wird in einem Mindestvolumen von 0,2n Essigsäure auf eine Säule von Bio Gel P-2 aufgegeben, welche zuvor mit 0,2n Essigsäure ins Gleichgewicht gebracht wurde. Anschließend eluiert man mit demselben Lösungsmittel und fängt Fraktionen von jeweils 9 ml auf. Das Peptidmaterial wird durch den Ehrlich-Flecktest und die UV-Analyse bestimmt. Es wird eine Hauptfraktion erhalten (34 bis 50; 2,234 g). Eine zweite Säule mit Bio Gel P-2 liefert 1,928 g des gewünschten Materials. Dieses Material wird an einer Trennsäule von Sephadex G-25 fein (2,5 χ 100 cn), die durch Gleichgewichtseinstellung mit der unteren Phase und anschließend der oberen Phase des BAW-Systems (n-Butanol/Essigsäure/Wasser, 4:1:5) präpariert wurde, rechromatographiert. Durch Elution mit der oberen Phase erhält man Fraktionen A (36 bis 48; 820 mg) und B (49 bis 64; 633 mg). Die Fraktion A wird unter Verwendung desselben Systems rechromatographiert, wobei man 295 mg des gewünschten Peptids erhält.

Der R_-Wert des Peptids (aufgegebene Menge 30 Aig) beim Dünnschichtsystem (SiOp-Platten; Brinkman) n-Butanol/Essigsäure/ Wasser (4:1:5, obere Phase) beträgt 0,21, beim System n-Butanol/Essigsäure/Äthylacetat/Wasser (1:1:1:1) 0,57.

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Die mit Hilfe eines photoelektrischen Präzisionspolarimeters °cL beträgt -80,91° (c 0,98, liige Essigsäure).

Eine 20 Std. lange Hydrolyse des Peptide in Methansulfonsäure (0,2 ml/1 mg Peptid) bei 110⁰C in einem geschlossenen,evakuierten System ergibt, daß sämtliche erforderlichen Aminosäuren vorhanden sind.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

1. Verbindungen der allgemeinen Formeln 1 und II

L-p-Glu-L-His-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-X-Y-L-Arg-L-Pro-NHC₂H₅

(D

p-Glu-His(R)-Trp-Ser(R¹)-Tyr(R²)-X-Y-Arg(R³)-Pro-Z

(II)

sowie deren nicht-toxische Säureadditionssalze, wobei X D-Trp oder D-2-(l,4-Cyclohexadienyl)-Gly, Y L-(N-Methyl)-Leu oder L-(N-Methyl)-Ile, R ein Wasserstoffatora oder eine Schutzgruppe für

den Iminostickstoff des Histidylanteils, R ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe für

die Hydroxylgruppe des Serylanteils, ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgn die Hydroxylgruppe dee Tyrosylanteils,

R ein Wasserstoffatom oder eine oder mehrere . Schutzgruppen für die U^(f-_i N°- und N^ol-Stick-

stoffatome des Arginylanteils und Z eine Hydroxylgruppe, einen Nieder-alkoxyrest, eine Benzylaxygruppe, -OCH₂(Polystyrolharzträger) oder -NHC₅Hj- sind,

mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Reste R, R , R und R^ ein von einem Wasserstoffatom verschiedener Rest ist.

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ORIGINAL INSPECTED

2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R eine Tosylgruppe ist.

3. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß R eine Benzylgruppe ist.

4. Verbindungen nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß R eine 2,6-Dichlorbenzylgruppe ist.

5. Verbindungen nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß R eine Tosylgruppe ist.

6. Verbindungen nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Z -NHC₂H₅ ist.

7. Verbindungen nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Polystyrolharzträger aus mit 0,5 bis 3 % Divinylbenzol vernetztem Polystyrol besteht.

8. L-Pyroglutamyl-N^im-tosyl-L-histidyl-L-tryptophyl-O-benzyl-L-seryl-0-(2,6-dichlorbenzyl)-L-tyrosyl-D-tryptophyl-N-methyl-L-leucyl-N^ß-tosyl-L-arginyl-L-prolinäthylamid.

9. L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-N-methyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolinäthylamid und dessen Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Maleinat, Acetat, Citrat, Benzoat, Succinat, Malat und Ascorbat.

10. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch mit der Formel I oder ihrer nicht-toxischen Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, daß man die Schutzgruppe oder -gruppen von einer Verbindung der Formel II gemäß Anspruch abspaltet und gegebenenfalls die erhaltene Verbindung in ein nicht-toxisches Säureadditionssalz überführt.

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11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abspaltung der Schutzgruppe(n) mit wasserfreiem Fluorwasserstoff durchführt.

12. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1 mit der Formel I oder ihrer nicht-toxischen Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel II gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, wobei Z die Gruppe -OCHpCPolystyrolharzträger) darstellt, spaltet und von der (den) Schutzgruppe(n) befreit, und gegebenenfalls die erhaltene Verbindung in ein nicht-toxisches Säureadditionssalz überführt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polystyrolharzträger ein mit 0,5 bis 3 % Divinylbenzol vernetztes Polystyrol verwendet.

m. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß man es mit Hilfe von Fluorwasserstoff durchführt.

15. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der*Formel II nach Anspruch 1, wobei Z -NHCpH₁- ist, dadurch gekennzeichnet, daß man eine entsprechende Verbindung der Formel II, wobei Z -OCHp(Polystyrolharzträger) darstellt, mit Äthylamin spaltet.

16. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden mit claudogeninterceptiver Aktivität der Formel I

L-p-Glu-L-His-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-Y-Y-L-Arg-L-Pro-NHC₂H₅

(D

worin X D-Trp oder D-2-(l ,J|-Cyclohexadienyl)-Gly und Y L-(N-Methyl)-Leu oder L-(N-Methyl)-Ile sind, dadurch gekennzeichnet, daß man die zur Bildung des PoIy-

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peptids erforderlichen Aminosäuren oder deren aktivierte Derivate unter Bildung von Peptidbindungen in beliebiger gewünschter Reihenfolge kondensiert, wobei man reaktive Gruppen, die nicht an der Umsetzung teilnehmen sollen,
vorübergehend schützt.

17. Arzneimittel, bestehend aus mindestens einer Verbindung nach Anspruch 1 zusammen mit einem pharnakologisch verträglichen Träger.

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