DE2734628A1

DE2734628A1 - Fuer die erhoehung der futterausnutzung geeignete cyclische hexapeptide

Info

Publication number: DE2734628A1
Application number: DE19772734628
Authority: DE
Inventors: Stephen Francis Brady; Sandor Lajos Varga; Daniel Frank Veber
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1976-08-02
Filing date: 1977-08-01
Publication date: 1978-02-09
Also published as: ZA774628B; DK319977A; SE7708136L; FR2360562A1; NL7707868A; GB1530560A; PL199942A1; JPS5318592A; AU2723777A; US4108987A; BE857376A; AU508632B2; NZ184690A; CA1101843A

Description

Dr. ;. :i! ,C-- r. M ort Dipt.-, .iy.:. i\. _- iicJineder 8 München 86, Pienzenauerstr. 28

1. August 1977 15894

MERCK & CO., INC. Rahway, New Jersey 07065, V.St.A.

Für die Erhöhung der Futterausnutzung geeignete cyclische Hexapeptide

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Die Erfindung betrifft synthetische neue cyclische Hexapeptide der Struktur:

cyclo-CD-Pro-Ala),, cyclo-iD-Pro-Phe),, cyclo-CPro-D-Phe),, cyclo-CSar-Ala),, cyclo-(Pro-D-Ala),, cyclo-(Sar-Leu),, cyclo-(Sar-D-Phe) (Pro-D-Phe)₂, cyclo-(Pro-D-Leu), und cyclo-(D-Pro-Leu),

und Verfahren zu ihrer Herstellung. Durch die orale Verabreichung dieser cyclischen Peptide wird die Verdauungswirksamkeit bestimmter, pflanzenfressender Säugetiere verbessert.

Die Wirksamkeit bzw. die Ausbeute bei der Kohlenhydrat-Verwertung (Kohlenhydrate sind der Hauptnährteil von Futter für Wiederkäuer) kann durch Behandlungen verbessert v/erden, durch die das Tier angeregt wird, aus den Kohlenhydraten Propionat und Butyrat anstelle von Acetat zu bilden. Die Wirksamkeit von Futter kann wirksam festgestellt werden, indem man die Produktion und Konzentration von Propionatverbindungen im Pansen mißt bzw. verfolgt. Bildet das Tier mehr Propionate,so stellt man fest, daß sein Futter besser ausgenutzt wird.

Die Wirksamkeit bei der Futterverwertung eines Säugetiers kann leicht durch chemische Analyse des Acetats und Propionate bestimmt werden, die durch Fermentation gebildet werden, die im Pansen stattfindet, oder, besser, durch chemische Analyse auf Acetat und Propionat des Panseninhalts unter Verwendung eines in vitro Pansen-Fermentationstests.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue cyclische Hexapeptide zu schaffen.

Gegenstand der Erfindung sind neue cyclische Hexapeptide der Struktur

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cyclo-[ (N-Alkylaminosäure)-X-(N-Alkylaminosäure) ■ -X-(N-Alkylaminosäure)"-X]

worin (N-Alkylaminosäure), (N-Alkylaminosäure)' und (N-Alkyl· aminosäure)" die Struktur

R¹	R²	0
t	I	Il
-N-	CH	-C-

besitzen, in der

R eine niedrige Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeutet und
2

R Wasserstoff oder eine Methylgruppe bedeutet oder

1 2
R und R zusammen {CH-^ bedeuten, worin η für

_2n

eine ganze Zahl von 3 oder 4 steht, und einen 5- oder 6-gliedrigen Ring bilden, und

X D- oder L-AIa, D- oder L-Phe oder D- oder L-Leu bedeutet.

Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen sind für die Verbesserung bei der Ausnutzung von Wiederkäuerfutter nützlich.

Bevorzugte erfindungsgemäße cyclische Hexapeptide sind solche, worin (N-Alkylaminosäure), (N-Alkylaminosäure)¹ und (N-Alkylaminosäure)" ausgewählt werden aus der Gruppe Sar, D- oder L-Pro und/oder D- oder L-N-Methyl-Ala; und X D- oder L-AIa, D- oder L-Phe oder D- oder L-Leu bedeutet, worin, wenn Pro und N-Methyl-Ala D bedeuten, X L-AIa, L-Phe oder L-Leu bedeutet, und wenn Pro und N-Methyl-Ala L bedeuten, X für D-AIa, D-Phe oder D-Leu steht.

Weitere bevorzugte erfindungsgemäße cyclische Hexapeptide sind solche der Struktur:

cyclo-(D-Pro-Ala),, cyclo-(D-Pro-Phe),, cyclo-(Pro-D-Phe),, cyclo-(Sar-Ala),, cyclo-(Pro-D-Ala)^, cyclo-(Sar-Leu),, cyclo-(Sar-D-Phe) (Pro-D-Phe^» cyclo-(Pro-D-Leu), und cyclo-(D-Pro-Leu),,

von diesen sind

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Peptide der Strukturen

D-Pro-Ala-D-Pro-Ala-D-Pro-Ala « »

D-Pro-Phe-D-Pro-Phe-D-Pro-Phe Pro-D-Phe-Pro-D-Phe-Pro-D-Phe

Verbindungen, die zur Verbesserung der Wiederkäuer-Futterausnutzung am meisten bevorzugt sind.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Futtermittel bzw. Futtermittelzusammensetzungen, durch die die Futterausnutzung verbessert wird. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Verbesserung der Futterausnutzung bei Wiederkäuern mit einer entwickelten Pansenfunktion, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Wiederkäuern eine wirksame VFA-erhöhende Menge der oben erwähnten, neuen cyclischen Hexapeptide verabreicht. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren für die synthetische Herstellung der neuen, erfindungsgemäßen cyclischen Hexapeptide.

Die vorliegende Erfindung kann bei allen Wiederkäuern verwendet bzw. ausgenutzt werden, d.h. bei Tieren, die mehrere Nagen, von denen einer ein Pansen ist, besitzen. Die wirtschaftlich wichtigen Wiederkäuer sind Rinder, Schafe und Ziegen.

Erfindungsgemäß werden die neuen cyclischen Hexapeptide durch Cyclisierung der entsprechenden linearen Hexapeptide hergestellt. Die linearen Hexapeptide werden unter Verwendung aufeinanderfolgender Syntheseverfahren in fester Phase erzeugt. Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen cyclischen Hexapeptide umfaßt somit (a) die Herstellung des entsprechenden, maskierten, linearen Hexapeptids, das an ein Harz in fester Phase gebunden ist; (b) die Entfernung des

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maskierten, linearen Hexapeptids aus dem Harz und die Demaskierung; und (c) die Behandlung des demaskierten, linearen Hexapeptids mit einem Cyclisierungsmittel unter Herstellung des cyclischen Hexapeptids.

Wird das lineare Hexapeptid auf bzw. an dem Harz hergestellt, so ist es nicht kritisch, welche Aminosäure an der endständigen C-Stellung ausgewählt wird, vorausgesetzt, daß die Sequenz der Aminosäuren in dem linearen Hexapeptid gleich ist wie die in dem gewünschten cyclischen Hexapeptid. Nachdem das lineare Hexapeptid einmal cyclisiert ist, kann man nicht langer feststellen, welche Aminosäure am endständigen C des linearen Hexapeptids gebunden war. Als Beispiel zur Erläuterung sei ausgeführt, daß beide die folgenden linearen Hexapeptide nach der Cyclisierung identische cyclische Hexapeptide ergeben:

D-Phe-Pro-D-Phe-Pro-D-Phe-Pro oder

Pro-D-Phe-Pro-D-Phe-Pro-D-Phe -l· Cyclisierung

D-Phe-Pro-D-Phe-Pro-D-Phe-Pro

Im folgenden und bei der weiteren Beschreibung der Synthese der Peptide werden die verwendeten Reagentien zuerst mit ihrem chemischen Namen angegeben, und die übliche Abkürzung wird in Klammern angegeben. Die Reagentien werden dann mit den üblichen Abkürzungen bezeichnet werden.

Aus Zweckdienlichkeitsgründen wird im folgenden eine Tabelle für die üblichen Abkürzungen gegeben:

Abgekürzte Bezeichnung Aminosäure

Pro L-Prolin

Sar , Sarcosin

AIa L-Alanin

D-AIa D-Alanin

- Λ -709886/0823

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Abgekürzte Bezeichnung

CMW DMF THF

Aminosäure

N-MeAIa	L-N-Methylalanin
D-N-MeAIa	D-N-Methylalanin
Phe	L-Phenylalanin
D-Phe	D-Phenylalanin
Leu	D-Leucin
D-Leu	D-Leucin
Abgekürzte Bezeichnung	Schutzgrupp en
BOC	tert.-Butyloxycarbonyl
OMe	Methylester
tBu	tert.-Butyl
CBZ	Benzyloxycarbonyl
Abgekürzte Bezeichnung	Aktivierende Gruppen
NPE	p-Nitrophenylester
HSE oder NHS	N-Hydroxysue cinimide s ter
HBT	1-Hydroxybenzotriazol
Abgekürzte Bezeichnung	Kondensationsmittel
DCCI	Dicyclohexyl-carbodiimid
Abgekürzte Bezeichnung	Reagentien
TFA	Trifluoressigsäure
TEA	Triäthylamin
Abgekürzte Bezeichnung	Lösungsmittel

Chloroform-Methanol-Wasser Dimethylformamid Tetrahydrofuran

Die Synthese der linearen Hexapeptide nach dem Festphasen-Verfahren wird stufenweise an chlormethyliertem Harz durchgeführt. Als Harz werden feine Kügelchen (Durchmesser von 20 bis 70 Mikron) eines synthetischen Harzes verwendet, das

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durch Copolymerisation von Styrol mit 1 bis 2% Divinylbenzol erzeugt wird. Die Benzolringe in dem Harz werden nach einer Friedel-Crafts-Reaktion mit Chlormethyl-methyläther und Zinn(IV)-Chlorid chlormethyliert. Das Chlor im Benzylchlorid ist durch eine reaktivierte Bindung gebunden. Die Friedel-Crafts-Reaktion wird fortgeführt, bis das Harz 0,5 bis 5 mMol Chlor/g Harz enthält.

Die ausgewählte Aminosäure, die die Aminosäure mit dem endständigen C-Atom des linearen Hexapeptids sein soll, wird in ihr an der Aminogruppe geschütztes Derivat überführt. Die Carboxylgruppe der ausgewählten Aminosäure mit dem endständigen C-Atom wird kovalent an den unlöslichen, polymeren Harzträger gebunden, z.B. als Carbonsäureester des an das Harz gebundenen Benzylchlorids, das in dem Chlormethyl-subst.-polystyrol-Divinylbenzolharz vorhanden ist. Nach Entfernung der Amino-Schutzgruppe wird das an der Aminogruppe geschützte Derivat der nächsten Aminosäure in der Sequenz zusammen mit dem Kupplungsmittel, wie Dicyclohexyl-carbodiimid, aufgebracht bzw. gebunden. Die als Reakt ions teilnehmer verwendete Aminosäure kann in Form einer an der Carboxylgruppe aktivierten Aminosäure, wie dem NHS-Ester, einem Aminosäureazid u.a., verwendet werden. Die Abspaltung der Schutzgruppe und die Addition der nachfolgenden Aminosäuren erfolgen auf gleiche Weise, bis das gewünschte, lineare Hexapeptid gebildet ist.

Die üblicherweise verwendeten Aminoschutzgruppen sind die, die an sich gut bekannt sind, z.B. Urethan-Schutzsubstituenten, wie Benzyloxycarbonyl (Carbobenzoxy), p-Methoxycarbobenzoxy, p-Nitrocarbobenzoxy, t-Butyloxycarbonyl u.a. Es ist bevorzugt, t-Butyloxycarbonyl (BOC) zum Schutz der a-Aminogruppe in den Aminosäuren zu verwenden, die an dem Carboxylende der Aminosäure umgesetzt werden. Die BOC-Schutzgruppe wird nach der Kupplungsreaktion und vor der folgenden Stufe leicht

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entfernt, durch die Einwirkung relativ milder Säuren (d.h. Trifluoressigsäure oder Chlorwasserstoff in Äthylacetat).

Die Auswahl der Schutzgruppe wird teilweise durch die besonderen Kupplungsbedingungen, teilweise durch die Aminosäure und die Peptidkomponenten, die bei der Umsetzung verwendet werden, bestimmt.

Nachdem das lineare Hexapeptid an dem Harz in fester Phase gebildet wurde, kann es nach einer Vielzahl von Verfahren, die an sich gut bekannt sind, entfernt werden. Beispielsweise kann das Peptid von dem Harz mit Hydrazin abgespalten werden und so direkt das Peptidhydrazid bilden, das anschließend über das Azid zu der dem gewünschten cyclischen Hexapeptid cyclisiert wird. Alternativ kann das Peptid aus dem Harz durch Behandlung mit einem niedrigen Alkanol, wie Methanol, in Anwesenheit einer organischen Base, wie Triäthylamin entfernt werden, wobei der entsprechende niedrige Alkoholester des linearen Hexapeptids gebildet wird. Wenn der Ester der Methylester ist, kann die entstehende Verbindung in das Azid über das Hydrazid überführt werden, das dann zu dem gewünschten cyclischen Hexapeptid nach an sich bekannten Verfahren cyclisiert werden kann. Alternativ kann der Methylester bei milden Bedingungen, wie einem pH-Wert von 11 bis 12, verseift werden; die BOC-Gruppe kann durch die Einwirkung einer relativ milden Säure, Chlorwasserstoff in Äthylacetat, entfernt werden, und das entstehende lineare, demaskierte Hexapeptid kann zu dem gewünschten cyclischen Hexapeptid nach an sich bekannten Verfahren, wie durch Behandlung mit Diphenylphosphorylazid, cyclisiert werden. Das bevorzugte Verfahren zur Entfernung des maskierten, linearen Hexapeptids aus dem Harz ist die Behandlung mit wasserfreiem Bromwasserstoffgas in einem geeigneten Lösungsmittel. Das entstehende, lineare, entmaskierte Hexapeptid kann zu dem gewünschten cyclischen Hexapeptid unter Verwendung irgend-

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eines Reagens, das die Carboxylgruppen aktiviert und das für die Kupplung von Carbonsäuren an Aminen bekannt ist, eyeIisiert werden, z.B. einem aktivierten Ester, wie NHS oder NPE oder Carboxyl aktivierenden Reagentien, wie Dicyclohexyl-carbodiimid, Triphenylpho sphin/2,2·-Pyridyldisulfid (Mukaiyama's Reagens), Diäthylphosphorylcvanid, Isobutylchlorformiat und Woodward's Reagens K. Bei dem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren wird Diphenylphosphorylazid verwendet.

Tabelle I Allgemeines Schema für die Herstellung von cyclo-(Pro-D-Phe),

Cl-CH₂-flf-Harz

BOC-Pro

BOC-Pro-O-CH₂-0-Harz

Verfahren in fester Phase

1. BOC-D-Phe

2. BOC-Pro

3. BOC-D-Phe

4. BOC-Pro

Ψ 5. BOC-D-Phe

BOC-D-Phe-Pro-D-Phe-Pro-D-Phe-Pro-O-CHg-tf-Harz

I HBr/CH₂Cl₂-Anisol

D-Phe-Pro-D-Phe-Pro-D-Phe-Pro.HBr

0 Et₃N; (0-O)₂-P-N₅

D-Phe-Pro-D-Phe-Pro-D-Phe-Pro

J I

Wie aus Tabelle I hervorgeht, besteht ein bevorzugtes Gesamtverfahren für die Herstellung der gewünschten erfindungsgemäßen cyclischen Hexapeptide darin, daß man das lineare Hexapeptid an einem Harz in fester Phase stufenweise synthetisiert. Insbesondere wird bei dem Verfahren zur Herstellung von cyclo-(Pro-D-Phe), das Carboxylende des N-maskierten

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Aminosäure-prolin kovalent an den unlöslichen, polymeren Harzträger als Carbonsäureester des an das Harz gebundenen Benzylchlorid gebunden. Die Aminogruppe von Pro wird durch die BOC-Gruppe geschützt. Nachdem die Bindung von Pro an das Harz beendigt ist, v/ird die Schutzgruppe BOC durch Behandlung mit HCl in Äthylacetat entfernt. Die darauffolgenden Aminosäuren werden in Form der BOC-Aminosäure unter Verwendung von DCCI als Kondensationsmittel gebunden. Nachdem das gewünschte, lineare Hexapeptid hergestellt ist, wird es von dem Harz durch Behandlung mit wasserfreiem Bromwasserstoff gas in Methylenchlorid-Anisol (10:1) entfernt. Das entstehende, lineare Hexapeptid, das die Aminosäure-Sequenz D-Phe-Pro-D-Phe-Pro-D-Phe-Pro.HBr besitzt, wird mit Diphenylphosphorylazid in Anwesenheit von Triäthylamin unter Bildung des gewünschten cyclischen Hexapeptids cyclo-(Pro-D-Phe)·, behandelt.

Zur Herstellung des gewünschten cyclischen Hexapeptids in reiner Form wird irgendein in dem Reaktionsgemisch unlösliches Material durch Filtration entfernt und das Filtrat wird zur Trockene eingedampft. Der das rohe cyclische Hexapeptid enthaltende Rückstand wird in einem geeigneten Lösungsmittel, wie 1Obiges wäßriges DMF, gelöst. Zu dieser Lösung gibt man ein Mischbett-Ionenaustauschharz zur Entfernung von irgendwelchen Verbindungen, die freie Amino-, saure Hydroxyl- oder Carboxylgruppen enthalten. Das Mischbett-Ionenaustauschharz mit den Verbindungen mit freien Amino-, sauren Hydroxyl- oder Carboxylgruppen daran adsorbiert wird abfiltriert und das Filtrat wird erneut zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird erneut in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Chloroform, gelöst. Zu dieser Lösung gibt man langsam ein mischbares Lösungsmittel, in dem das gewünschte cyclische Hexapeptid unlöslich ist. Dabei findet eine Kristallisation des cyclischen Hexapeptids statt. Das Endprodukt wird dann abfiltriert und im Vakuum getrocknet.

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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung von BOC-(D-Phe-Pro)₅-O-CH₂-0-Harz

775,9 g (2,04 Mol) Chlormethylharz mit 2,64 mÄqu.Chlor/g und 439,4 g (2,04 Mol, 1 Äqu.) BOC-Pro werden zu 3713 ml peroxidfreiem Tetrahydrofuran gegeben. Das Gemisch wird in einem Ölbad 45 min bei einer Badtemperatur vn 80⁰C gerührt. 267,3 ml Triäthylamin werden zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird 94 h bei 80°C Badtemperatur gerührt, auf 25°C abgekühlt und in eine feste Phasen-Reaktionssäule, die gerührt wird, mit 2276 ml Tetrahydrofuran gegeben. Nach Entfernung des Lösungsmittels wird das Harz unter Verwendung einer Rührsäule gewaschen mit:

3 χ 1485 ml Tetrahydrofuran

4 χ 4460 ml Äthanol

1 χ 4460 ml Essigsäure

3 χ 4460 ml Wasser

3 χ 4460 ml Methanol

3 x 4460 ml Chloroform.

Das BOC-Pro-O-CH₂-0-Harz wird 16 h im Vakuum bei 25°C getrocknet; man erhält 1071 g BOC-Pro-O-CH₂-0-Harz, das 1,14/uMol Prolin/mg Harz enthält.

20 g (15,6 mMol) BOC-Pro-O-CH₂-0-Harz werden gemäß dem Verfahren von Beispiel II unter Verwendung von zwei Demaskierungen (2 min und 15 min) mit HCl in Äthylacetat und 1,8 Äqu. BOC-C-Phe und 1,8 Äqu. BOC-Pro in alternierender Sequenz, bis das gewünschte BOC-Hexapeptid-O-CH₂-0-Harz erhalten wird, behandelt.

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	EtAc(I) MeOH(I) CH₂Cl₂(I)	Tabelle II	CH₂Cl₂	BOC AA in CH₂Cl₂	DCCI in CH₂Cl₂	DMF(I) MeOH(I)
	150 15 2	NEt₃- CH₂Cl₂	150 2	40 2	13 15	150 2
	150 2 und 2
EtAc- 4n HCl
Volumen, ml 300 Zeit, min 2 und

Das BOC-Hexapeptid-O-CH₂-0-Harz wird gewaschen mit: 3 x 250 ml Äthanol
3 x 150 ml Essigsäure
5 x 250 ml Äthanol
3 x 250 ml Methylenchlorid.

Das Produkt wird mehrere Tage im Vakuum getrocknet; es wiegt 26,7 g. Durch die Gewichtszunahme enthält es 0,581 mMol Peptid/g. Nach der Spinco-Aminosäure-Analyse enthält es 0,338 bis 0,42 mMol Peptid/g. Die Aminosäure-Analyse nach der Hydrolyse ergibt die folgenden Ergebnisse: Pro 1,53 /üMol/mg

D-Phe 1,58/uMol/mg

Beispiel 2

Herstellung von cyclo-(Pro-D-Phe),

75 mMol BOC-D-Phe-Pro-D-Phe-Pro-D-Phe-Pro-O-CH.p-flf-Harz, bezogen auf die an das Harz gebundene Anfangsaminosäure, werden in 1000 ml Methylenchlorid suspendiert; dazu gibt man 100 ml Anisol. Wasserfreies Bromwasserstoffgas wird durch die Suspension 1 h bei Zimmertemperatur unter Rühren geleitet. Die Hauptmenge des überschüssigen Bromwasserstoffgases und etwas Methylenchlorid werden an einer Wasserstrahlpumpe entfernt, wobei der Kolben in einem lauwarmen Wasserbad 1 h gehalten wird. Der Kolben wird vor Feuchtigkeit unter

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Verwendung eines CaClg-Trockenrohrs geschützt. Zu der entstehenden Aufschlämmung gibt man 1000 ml niedrigsiedenden Petroläther. Das Harz und die Feststoffe werden abfiltriert und mit 3x11 Äther gewaschen und 2 h im Vakuum getrocknet.

Das Peptid-Harz-Gemisch wird mit 4 χ 1000 ml entgastem Dimethylformamid (DMF) extrahiert. Die DMF-Lösung wird auf 5,0 1 durch zusätzliches, entgastes DMF verdünnt. Der pH-Wert der Lösung wird durch Zugabe von 35 ml Triäthylamin auf 6,8 eingestellt. Die Lösung wird auf -25°C gekühlt und 20,6 g (75 mMol) Diphenylphosphorylazid werden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 48 h bei -25⁰C aufbewahrt. Anschließend kann sich das Reaktionsgemisch auf Zimmertemperatur erwärmen. Die Reaktionslösung wird zur Entfernung unlöslicher Materialien filtriert, .,und das Filtrat wird im Vakuum eingedampft.

Der Rückstand wird mit 2x11 Wasser gewaschen. Zu dem Rückstand gibt man 500 ml Chloroform und anschließend 1000 ml Methanol-Wasser (9:1). Ausreichend Mischbett-Harz, AG-501-X(8)D, wird unter Rühren zugegeben, so daß die blaue Farbe des Harzes während einer halben Stunde bestehenbleibt. Das Harz wird abfiltriert und mit 150 ml Chloroform gewaschen. Die Waschlösungen und Filtrate werden vereinigt und im Vakuum eingedampft.

Nach dem wiederholten Eindampfen zur Trockene mit Äthanol wird der Rückstand in 150 ml Chloroform gelöst, und das cyclische Peptid wird durch langsame Zugabe von 500 ml Äther ausgefällt. Das kristalline Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet; Ausbeute 32,8 g.

Die Mutterlauge wird im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird in 50 ml Chloroform gelöst, und eine zweite Charge des cyclischen Peptlds wird durch langsame Zugabe von 375 ml

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Äther ausgefällt. Das Produkt wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet; man erhält 6,24 g einer zweiten Charge.

Die Peptide, cyclo-(D-Pro-Ala),, cyclo-(D-Pro-Phe)^, cyclo-(Sar-AlaK, cyclo-(Pro-D-AIa),, cyclo-(Sar-Leu),, cyclo-(Sar-D-Phe) (Pro-D-Phe)₂» cyclo-(Pro-D-Leu), und cyclo-(D-Pro-Leu)·,, werden auf gleiche Weise, wie für das cyclo-(Pro-D-Phe), beschrieben, hergestellt.

Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen cyclischen Hexapeptide bei der Modifizierung des Verhältnisses der flüchtigen, gebildeten Fettsäuren im Pansen wird zuerst durch in vitro-Versuche erläutert. Das verwendete Testverfahren wird im folgenden angegeben.

Beispiel 3

in vitro-Pansen-Fermentationstest von cyclo-(Pro-D-Phe),

Fluides Pansenmaterial, das Methan liefernde Bakterien und andere Pansenbakterien enthält, wird in einer Fermentationsvorrichtung erzeugt, die so eingestellt und betrieben wird, daß die Bedingungen in einem Pansen simuliert werden.

Der Versuch wird in einem Rohr mit Schraubverschluß durchgeführt, das mit einem Butylkautschukstopfen verschlossen ist. Das Rohr enthält ein Inkubationsgemisch aus 100 mg vermahlenem Futter, 0,5 mg Salz-Pufferlösung, 3,5 ml fluides Pansenmaterial, das durch vier Schichten von absorbierendem Mull filtriert wurde, und 1 mg der Verbindung cyclo-(Pro-D-Phe),· Die Luft in dem Rohr wird durch ein Gasgemisch aus 9756 Stickstofi-3% Wasserstoff, das durch Durchgang durch eine katalytische Reinigungsvorrichtung von Sauerstoff befreit wurde, ersetzt. Nach 18stündiger Inkubierung auf einer WasserbadschUttelvorrichtung bei 39°C werden 0,5 ml Gas durch den Stopfen in eine Probenschleife eines Fisher Gas Partitioners entfernt. Die Gasprobe wird verteilt, und

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das gebildete Methan wird mit einem Standardgasgemisch verglichen, das eine bekannte Menge an Methan enthält. Das Inkubationsgemisch wird mit 4 ml 10biger Metaphosphorsäure angesäuert und zentrifugiert. 1/ul des überstehenden Materials wird durch Gas-Flüssigkeits-Chromatographie analysiert. Die flüchtigen Fettsäuren werden mit einem Standardgemisch aus flüchtigen Fettsäuren, die bekannte Mengen an Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure und Valeriansäure enthalten, verglichen. Geeignete Vergleichsproben werden durchgeführt. Bei einer Menge von 250 /ug/ml der geprüften Verbindung ist CH^. im wesentlichen eliminiert. Es tritt eine wesentliche Verschiebung in den Verhältnissen an flüchtigen Fettsäuren (VFA) auf, wobei die längerkettigen Säuren begünstigt werden.

Vergleich

	yuMol %	/uMol
Essigsäure Propionsäure Buttersäure Valeriansäure	58,5 28,5 10,5	39,9 19,5 7,1 1.8
insgesamt	100,5%	68,3
Behandelt 16/ug/ml	yuMol %	/uMol
	31,0	18,8
Essigsäure	37,0	23,0
Propionsäure	25,0	15,3
Buttersäure	7,0	4.5
Valeriansäure	100,0?ό	61,6
insgesamt

Die in der obigen Tabelle zusammengefaßten Werte zeigen, daß das cyclische Hexapeptid cyclo-(Pro-D-Phe), wirksam ist und die Bildung von VFA, Propionsäure, Buttersäure und Valeriansäure auf Kosten von Methan und Acetat erhöht. (VFA = flüchtige Fettsäuren)

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Durch die Verabreichung der erfindungsgemäßen cyclischen Hexapeptide wird die Ketose verhindert und behandelt, und gleichzeitig wird die Futterausnutzung verbessert.

Der einfachste Weg für die Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen an Tiere besteht darin, daß man die Verbindungen mit dem Tierfutter vermischt. Die Verbindungen können Jedoch auch auf anderen Wegen nützlich verabreicht werden. Beispielsweise können sie in Tabletten, einen Arzneitrank, Salz-oder Melasseblöcken für Weidelandzwecke, Pasten, In große Pillen oder Kapseln eingearbeitet und den Tieren in Dosiseinheiten verabreicht werden. Die Zubereitung der Verbindungen in solchen Dosisformen kann nach Verfahren erfolgen, die auf dem veterinär-pharmazeutischen Gebiet gut bekannt sind. Jede Einzeldosiseinheit sollte eine Menge an Verbindung zur Verbesserung der Futterausnutzung enthalten, die in direkter Beziehung zu der richtigen täglichen Dosis für das zu behandelnde Tier steht.

Ein Arzneimitteltrank der Verbindungen wird am einfachsten hergestellt, indem man eine wasserlösliche Form der Verbindung verwendet. Soll aus irgendwelchen Gründen eine unlösliche Form verwendet werden, so kann man eine Suspension herstellen. Alternativ kann ein Arzneimitteltrank als Lösung in einem physiologisch annehmbaren Lösungsmittel, wie einem Polyäthylenglykol, formuliert werden. Diese Verbindungen können den Wiederkäuern ebenfalls im Trinkwasser verabreicht werden.

Verfahren zur Zubereitung von Arzneimitteln in Tierfutter sind gut bekannt. Normalerweise wird man eine konzentrierte Arzneimittel-Vormischung als Rohmaterial für mit den Medikamenten versehenes Futter herstellen; z.B. können typische Arzneimittel-Vormischungen etwa 0,1 bis 50 Gew.% aktive Verbindung enthalten. Besonders bevorzugt sind Vormischungen, die 2 bis 25 Gew.% aktive Verbindung enthalten. Der weite Bereich

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ergibt sich aus dem weiten Bereich der Konzentration der Verbindung, der in dem Endprodukt gewünscht sein kann. Die Vormischungen können entweder flüssig oder fest sein.

Die Zubereitung von Wiederkäuer-Futter, das die geeigneten Mengen an Verbindungen enthält, die für die Behandlung nützlich sind, ist hauptsächlich eine Frage einfacher Berechnungen. Es ist nur erforderlich, die Menge zu berechnen, die jedem Tier verabreicht werden soll, die Futtermenge pro Tag in Betracht zu ziehen, die das Tier frißt,und die Konzentration der Verbindung in der verwendeten Vormischung und die geeignete Menge an Vormischung zu berechnen, die mit dem Endfutter vermischt werden soll. Im allgemeinen werden gute Ergebnisse mit den erfindungsgemäßen cyclischen Peptiden bei oraler Verabreichung erhalten, wenn das Futter etwa 0,00005 bis etwa 0,596 der cyclischen Hexapeptide enthält, wobei der bevorzugte Bereich etwa 0,00025 bis etwa 0,196 beträgt. Mit dem bevorzugten erfindungsgemäßen cyclischen Hexapeptid, cyclo-(Pro-D-Phe),, wird eine ausgezeichnete Verbesserung in der Nahrungsmittelverwertung bei Rindern und Schafen erhalten, wenn man Futter verabreicht, das etwa 0,0025 bis etwa 0,0196 aktiven Bestandteil enthält.

Alle Zubereitungs-, Misch- und Pelletisierverfahren für Futter, die normalerweise bei Wiederkäuerfutter verwendet werden, sind zur Herstellung von Futter, das erfindungsgemäße Verbindungen enthält, gut geeignet.

Die vorliegende Erfindung soll nicht durch irgendwelche besonderen Zubereitungs- oder Verabreichungsverfahren nicht beschränkt werden. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Erhöhung der Futterverwertung von Säugetieren durch orale Verabreichung bestimmter Verbindungen, unabhängig von dem Verabreichungsverfahren der Verbindungen.

Ende der Beschreibung.

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Claims

Merck & Co., Inc. 15894

(i J Peptide der Struktur:

cyclo-[(N-Alkylaminosäure)-X-(N-Alkylaminosäure)'-X-(N-Alkylamlnosäure)^M-X]

worin (N-Alkylaminosäure), (N-Alkylaminosäure)· und (N-Alkylamino säure)" die Struktur

R¹ R² 0 I t Il -N- CH - C -

besitzen, in der

R eine niedrige Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen und

ρ
R Wasserstoff oder eine Methylgruppe bedeuten,oder

R und R zusammen 4CH₂^_n bedeuten, worin η für eine ganze Zahl von 3 oder 4 steht, und einen 5- oder 6-gliedrigen Ring bilden, und

X D- oder L-AIa, D- oder L-Phe oder D- oder L-Leu bedeutet.
2. Peptide nach Anspruch 1, worin (N-Alkylaminosäure), (N-Alkylaminosäure)' und (N-Alkylaminosäure)" ausgewählt werden aus der Gruppe: Sar, D- oder L-Pro und/oder D- oder L-N-Methyl-Ala; und X D- oder L-AIa, D- oder L-Phe oder D- oder L-Leu bedeutet, und worin, wenn Pro und N-Methyl-AIa D bedeuten, X für L-AIa, L-Phe oder L-Leu steht; und, wenn Pro und N-Methyl- Ala L bedeuten, X für D-AIa, D-Phe oder D-Leu steht.
3· Peptide nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgende Struktur

cyclo-(D-Pro-Ala),, cyclo-(D-Pro-Phe),, cyclo-(Pro-D-Phe),, cyclo-(Sar-AIa)2» eyeIo-(Pro-D-AIa),, cyclo-(Sar-Leu),, cyclo-(Sar-D-Phe) (Pro-D-Phe)₂, cyclo-(Pro-D-Leu), und cyclo-(D-Pro-Leu),

besitzen.

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ORIGINAL INSPECTED

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4. Peptide nach Anspruch 3 der Struktur

D-Pro-Ala-D-Pro-Ala-D-Pro-Ala. J }
5. Peptide nach Anspruch 3 der Struktur

D-Pro-Phe-D-Pro-Phe-D-Pro-Phe. I I
6. Peptide nach Anspruch 3 der Struktur

Pro-D-Phe-Pro-D-Phe-Pro-D-Phe. J I
7. Verfahren zur Herstellung von Peptiden der Struktur

cyclo-[(N-Alkylaminosäure)-X-(N-Alkylaminosäure)'-X-(N-Alkylaminosäure)"-X]

worin (N-Alkylaminosäure), (N-Alkylaminosäure)¹ und (N-Alkylaminosäure)" die Struktur

R¹ R² 0 I Il -N- CH - C -

besitzen, in der

R eine niedrige Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen und

2
R Wasserstoff oder eine Methylgruppe bedeuten oder R und R zusammen {C^^ bedeuten, worin η für

eine ganze Zahl von 3 oder 4 steht, und einen 5- oder 6-gliedrigen Ring bilden, und

X D- oder L-AIa, D- oder L-Phe oder D- oder L-Leu bedeutet,
dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) das entsprechende, maskierte, lineare Hexapeptid, gebunden an ein Harz mit fester Phase, herstellt,

(b) das maskierte, lineare Hexapeptid von dem Harz entfernt und demaskiert, und

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(c) das demaskierte, lineare Hexapeptid mit einem Cyclisierdungsmittel behandelt.
8. Verfahren zur Herstellung von Peptiden der Struktur

cyclo-[(N-Alkyiaminosäure)-X-(N-Alkylaminosäure)'-X-(N-Alkylaminosäure)"-X]

worin (N-Akylaminosäure), (N-Alkylaminosäure)· und (N-Alkylaminosäure)ⁿ ausgewählt werden aus der Gruppe: Sar, D- oder L-Pro und/oder D- oder L-N-Methyl-Ala; und X D- oder L-AIa, D- oder L-Phe oder D- oder L-Leu bedeutet; und worin, wenn Pro und N-Methyl-Ala D bedeuten, X für L-AIa, L-Phe oder L-Leu steht; und, wenn Pro und N-Methyl-Ala L bedeuten, X für D-AIa, D-Phe oder D-Leu steht,
dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) das entsprechende, maskierte, lineare Hexapeptid, gebunden an ein Harz in fester Phase, herstellt,

(b) das maskierte, lineare Hexapeptid von dem Harz entfernt und demaskiert,

(c) das demaskierte, lineare Hexapeptid mit einem Cyclisierungsmittel behandelt.
9. Verfahren zur Herstellung von Peptiden der Struktur cyclo-(D-Pro-Ala),, cyclo-(D-Pro-Phe),, cyclo-(Pro-D-Phe),, cyclo-(Sar-Ala),, cyclo-(Pro-D-Ala),, cyclo-(Sar-Leu)₅, cyclo-(Sar-D-Phe) (Pro-D-Phe)₂» cyclo-(Pro-D-Leu)₅ und cyclo- (D-Pro-Leu) -,

dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) das entsprechende, maskierte, lineare Hexapeptid, gebunden an ein Harz in fester Phase, herstellt, wobei die Maskierungsgruppe BOC ist,

(b) das maskierte, lineare, an das Harz gebundene Hexapeptid mit wasserfreiem Bromwasserstoff in Methylenchlorid unter Bildung des entsprechenden, demaskierten, linearen Hexapeptids behandelt und

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(c) das demaskierte, lineare Hexapeptid mit Diphenylphosphorylazid in Anwesenheit von Triäthylamin unter Bildung des entsprechenden, cyclischen Hexapeptids behandelt.
10. Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Struktur

D-Phe-Pro-D-Phe-Pro-D-Phe-Pro J I

dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) ein maskiertes, lineares Hexapeptid, das an ein Harz in fester Phase gebunden ist, der Struktur

BOC-D-Phe-Pro-D-Phe-Pro-D-Phe-Pro-O-CHg-tf-Harz

herstellt,

(b) das an das Harz gebundene, maskierte, lineare Hexapeptid mit wasserfreiem Bromwasserstoff in Methylenchlorid unter Herstellung des demaskierten, linearen Hexapeptids der Struktur

D-Phe-Pro-D-Phe-Pro-D-Phe-Pro.HBr

behandelt,

(c) das demaskierte, lineare Hexapeptid mit Diphenylphosphorylazid in Anwesenheit von Triäthylamin unter Herstellung des cyclischen Hexapeptids der Struktur

D-Phe-Pro-D-Phe-Pro-D-Phe-Pro I I

behandelt.
11. Zusammensetzung, die zur Erhöhung der Ausbeute der Futterverwertung bei Wiederkäuern nützlich ist, die eine entwickelte Pansenfunktion haben, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen inerten Träger und ein Peptid in einer Menge, durch die der Gehalt an flüchtigen Fettsäuren erhöht wird, der Struktur

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cyclo-[(N-Alkylaminosäure)-X-(N-Alkylaminosäure J»-X-(N-Alkylaminosäure)"-X]

enthält, worin (N-Alkylaminosäure), (N-Alkylaminosäure)' und (N-Alkylaminosäure)" die Struktur

R¹ R² 0

ι ι η

- N - CH - C -

besitzen, in der

R eine niedrige Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen und

2
R Wasserstoff oder eine Methylgruppe bedeuten oder

R und R zusammen 4CHg^_n bedeuten, worin η für eine ganze Zahl von 3 oder 4 steht, und einen 5- oder 6-gliedrigen Ring bilden, und

X D- oder L-AIa, D- oder L-Phe oder D- oder L-Leu bedeutet.
12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung etwa 0,00005 bis etwa 0,5 Gew.% Peptid enthält.
13· Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung etwa 0,00025 bis etwa 0,1 Gew.% Peptid enthält.
14. Konzentrierte Vormischungs-Zusammensetzung für die Zugabe zu Wiederkäuerfutter, die zur Erhöhung der Verwertung nützlich ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie etwa 0,1 bis etwa 50 Gew.% Peptide nach Anspruch 11 und einen inerten Träger enthält.
15· Konzentrierte Vormischungs-Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie etwa 2 bis etwa 25 Gew.% des Peptide nach Anspruch 11 enthält.

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16. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die für die Erhöhung der Wirksamkeit bei der Futterverwertung bei Wiederkäuern mit entwickelter Pansenfunktion wirksam ist, dadurch gekennzeichnet, daß man einen inerten Träger und ein Peptid in einer Menge, durch die der Gehalt an flüchtigen Fettsäuren erhöht wird, vermischt, wobei das Peptid die Struktur

cyclo-[(N-Alkylaminosäure)-X-(N-Alkylaminosäure) '-X-(N-Alkylaminosäure)"-X]

besitzt, worin (N-Alkylaminosäure), (N-Alkylaminosäure)· und (N-Alkylaminosäure)" die Struktur

R¹ R² 0 I Il -N- CH - C

besitzen, in der

R eine niedrige Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen und
ρ

R Wasserstoff oder eine Methylgruppe bedeuten oder

12
R und R zusammen tCH₂} bedeuten, worin η für

eine ganze Zahl von 3 oder 4 steht, und einen 5- oder 6-gliedrigen Ring bilden, und

X D- oder L-AIa, D- oder L-Phe oder D- oder L-Leu bedeutet.
17· Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung etwa 0,00005 bis etwa 0,5 Gew.% Peptid enthält.
18. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung etwa 0,00025 bis etwa 0,1 Gew.# Peptid enthält.
19· Verfahren zur Herstellung einer konzentrierten Vormischungs-Zusammensetzung für die Zugabe zu Wiederkäuerfutter, wobei die Zusammensetzung die Verwertung des Futters

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erhöht, dadurch gekennzeichnet, daß man etwa 0,1 bis. eiva 50 Gew.% der Peptide nach Anspruch 16 und einen inerten Träger vermischt.
20. Verfahren zur Herstellung einer konzentrierten Vormischungs-Zusammensetzung nach Anspruch 19t dadurch gekennzeichnet, daß man etwa 2 bis etwa 25 Gevr.% des Peptids nach Anspruch 16 und einen inerten Träger vermischt.

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