DE2517512A1

DE2517512A1 - Peptide und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2517512A1
Application number: DE19752517512
Authority: DE
Inventors: Yoshihiko Baba; Hiroyoshi Horikoshi; Yutaka Okada; Yuichiro Yabe
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1974-04-26
Filing date: 1975-04-21
Publication date: 1975-11-13
Also published as: FR2322610A1; JPS50142563A; FR2322610B1; US4010149A; GB1473795A; CH595328A5

Description

Priorität: 26. April 1974, Japan , Nr. 48174/1974

Peptide und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft eine neue Klasse von Peptiden und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Seit die Aminosäuresequenz von natürlichem luteinisierungshormon Releasing-Hormon (als "IH-RH" bezeichnet) als I-Pyroglutamyl-I-histidyl-I-tryptophyl-I-seryl-I-tyrosylglycyl-I-leucyl-I-arginyl-I-prolylglycinainid identifiziert worden ist (Science, H2, 1036 (1971)) wurden zahlreiche analoge Verbindungen hergestellt. Es wurde berichtet, daß unter diesen Verbindungen die analoge Verbindung, in der das Glycin der sechsten Aminosäure durch D-Alanin ersetzt ist und die Nonapeptidverbindung, in der das Glycin der zehnten Aminosäure durch Äthylamin oder n-Propylamin ersetzt ist, bessere physiologische Aktivität haben als natürliches IH-RH (The Endocrine Society (USA), the 55th annual meeting, Chicago, USA, Juni, 1973 und Biochemical and Biophysical Research Communications, 49, 863 (1972)).

Der Erfindung zugrunde liegende Untersuchungen über Peptide mit IH-RH-ähnlicher Aktivität haben nun gezeigt, daß bestimmte Peptide, in denen die N-endständige Gruppe (I-Pyroglutaminsäurerest), der

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Glycinrest in 6-Stellung und die C-endständige Gruppe (Glyinamidgruppe) des natürlichen IH-RH durch andere Gruppen ersetzt sind, stärkere physiologische Aktivität haben als das natürliche IH-RH. Die Erfindung basiert auf diesen Feststellungen.

Der Erfindung liegt demnach die Aufgabe zugrunde, eine neue Gruppe von Peptiden zur Verfügung zu stellen, die starke IH-RH-ähnliche Aktivität aufweisen.

Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Peptide zugänglich zu machen. Diese und andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung sind aus der nachstehenden Beschreibung ersichtlich.

Gegenstand der Erfindung sind demnach eine neue Klasse von Pep.tiden mit hoher IH-RH-ähnlicher Aktivität der Formel (I)

(I) N-Acetyl-N-methylglycyl-L-histidyl-I-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-Y-L-leucyl-I-arginyl-I-prolyl-Z

in der Y eine D-06-Alkylglyciiigs: ΐρρέ der Formel -HH-CH-CO-bedeutet, in der η eine ganze Zahl vors 0 Isis einschließlich 3 darstellt und Z eine Äthylaminogruppe oder eine mit 1 bis 3 Fluoratoasen in 2-Stellung substituierte Ithylaminogruppe darstellt, sowie pharmazeutisch geeignete Salze dieser Peptide.

C -.·-—- _i der Erfindung ist auSer-dem ein Terfabrea zur Herstellu^; ■"■\ ? p-jiden der Formel (I), das? ciMuroB gelcefinselobiiet ist_s äsß t-Flr "l'IyZ-Ii-tryptophyl-I-eerylCööer L-esrjl mit gsschützter- T r-f r;7lgruppe)-L-tyrosyl(oier I—tyrosrl aiit gesstltster Ey jri*p' ·'■™X»I;-leucyl»L-argirt;^rli'oässⁱ ^ϊ,Ζλ^ι^Ζ. mi ΐ gesobützi

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J- , üblicher ^τίϊ Γ: ·:%« ic fl·::; >il· ■"■£-:.-■/'. I νίτ-αί;·":,...; ^l·

für die Gruppe Y ein D-Alanin- oder D-Norleucinrest vorliegen und Z kann "beispielsweise eine Ä'thylamino-, (3 -Fluoräthylamino-, 2,2-Difluoräthylamino- oder 2,2,2-Trifluoräthylaminogruppe sein.

Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen neuen Peptide her-, vorragende Aktivität wie das luteinisierungshormon Releasing-Hormon (häufig als "LH-RH" bezeichnet) zeigen, welches als eines der vom Hypothalamus freigesetzten Hormone bekannt ist. Wenn das erfindungsgemäße Peptid an Menschen verabreicht wird, wird die Dosierung in Abhängigkeit hauptsächlich vom Alter, dem Körpergewicht, dem Zustand und anderen Faktoren des Patienten festgelegt. Im allgemeinen kann bei Erwachsenen eine Einzeldosis von 1 jug bis 500 yug, vorzugsweise 10 yug bis 100 jug, angewendet werden. Praktisch kann die parenterale Verabreichung bevorzugt werden, insbesondere die hypotherme Injektion, endotherme Injektion, intramuskuläre Injektion usw.

Unter den erfindungsgemäßen Peptiden (I) stellen im Hinblick auf ihre physiologischen Wirkungen Peptide der Formel (I) eine bevorzugte Gruppe dar, in denen Z eine Ä'thylaminogruppe oder 2-Fluoräthylaminogruppe bedeutet.

Repräsentative Beispiele und erfindungsgemäß bevorzugte Peptide der Verbindungsgruppe der Formel (I) sind nachstehend aufgeführt.

Verbindung, Nr. . Chemische Bezeichnung

1. N-Acetyl-N-methylglycyl-I-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-leucyl-L-arginyl-I-prolinäthylamid.

2. N-Acetyl-N-methylglycyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-I-tyrosyl-D-alanyl-L-leueyl-I~arginyl-L-prolin-2,2,2-trifluoräthylamid.

3. N-Acetyl-N-methylglycyl-I-histidyl-I-tryptophyl-L-seryl-1-tyrosyl-D-norleucyl-Ir-leucyl-L-arginyl-L-prolinäthylamid.

4. N-Acetyl-N-me thylgly cyl-L-histidy 1-L-tryptophy 1-I-seryl-Irtyrosyl-D-norleucyl-L-leucyl-l-arginyl-L-prolin-β-fluoräthylamid.

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5. N-Acetyl-N-methylglycyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-norleucyl-l-leucyl-l-arginyl-L-prolin^,2,2-trifluoräthylamid.

Wie vorstehend erklärt wurde, zeigen auch pharmazeutisch geeignete Salze der Peptide (I) starke LH-RH-ähnliche Wirkungen.

Bevorzugte Säuren, die zur Ausbildung eines Additionssalzes "befähigt sind, sind Säuren, die allgemein für Arzneimittel in Form von Additionssalzen verwendet werden. Beispiele dafür sind Mineralsäuren, wie Chlorwasserstoffsäure und Schwefelsäure, und organische Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Benzoesäure und Weinsäure.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der Peptide der Formel (i) wird ein Peptid der Formel I-Histidyl-L-tryptophyl-I-seryl (oder L-seryl mit geschützter Hydroxylgruppe) -L-tyrosyl (oder L-tyrosyl mit geschützter Hydroxylgruppe)-Y-L-leucyl-L-arginyl (oder L-arginyl mit .geschützter Guanidylgruppe)-L-prolyl-Z (II) worin Y und Z die vorstehend gegebene Definition haben, mit einem reaktiven Derivat von N-Acetyl-N-methylglycin (III) umgesetzt, falls eine Schutzgruppe vorliegt, die Schutzgruppe danach entfernt und die erhaltene Verbindung gegebenenfalls in üblicher Weise in ein geeignetes Säureadditionssalz übergeführt.

Die Schutzgruppen oder die funktioneilen Gruppen von Seitenketten der Aminosäuren, welche die vorstehend angegebene Verbindung (II) bilden, die als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet wird, können Schutzgruppen sein, wie sie allgemein bei bekannten Verfahren zur Herstellung von Peptiden angewendet werden und sie unterliegen keiner anderen Beschränkung. Zu Beispielen für üblicherweise verwendete Schutzgruppen gehören Benzyl-, tert.-Butyl-, Tetrahydropyranylgruppen und dergleichen für die Hydroxylgruppe von Serin; tert.-Butyl-, Acetylgruppen und dergleichen für die Hydroxylgruppe von Tyrosin; Nitro-, Tosyl-,

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Benzyloxycarbonylgruppen und dergleichen für die Guanidylgruppe des Arginine. Zum Abspalten dieser Schutzgruppen können ebenfalls ohne jegliche spezielle Beschränkung Methoden angewendet werden, wie sie allgemein bei bekannten Verfahren zur Herstellung von Peptiden bekannt sind. Beispiele für solche Methoden sind folgende: die Hydrolyse eines Esters oder eines Äthers mit Säuren oder Alkalien; die reduktive. Entfernung einer Benzyl-, Benzyloxycarbonyl-, Nitro- oder Tosylgruppe mit flüssigem Ammoniak und metallischem Natrium oder durch katalytische Reduktion; die Entfernung einer tert.-Butyl-, Benzyl-, Benzyloxycarbonyl-, Nitro- oder Tosylgruppe mit Fluorwasserstoff. Am häufigsten werden folgende Schutzgruppen verwendet: die tert.-Butylgruppe für die Hydroxylgruppe und die Nitro- oder Tosylgruppe für die Guanidylgruppe.

Es ist wünschenswert, die vorstehend genannte Verbindung der Formel (II) so rasch wie möglich einzusetzen, nachdem sie durch Entfernen der Schutzgruppe von der Verbindung, die vorher am endständigen N-Atom geschützt war, in dem erfindungsgemäßen Reaktionssystem oder außerhalb des Reaktionssystems hergestellt wurde, bevor das erfindungsgemäße Verfahren vorgenommen ,wird. Geeignete Schutzgruppen für das.endständige Stickstoffatom sind Schutzgruppen, wie sie üblicherweise bei der Herstellung von Peptiden verwendet werden. Beispiele dafür sind die Benzyloxycarbonyl-, tert.-/Butoxycarbonyl-, tert.-Amyloxycarbonyl-, Trityl-, Formyl-, Tosyl-, ,Trifluoracetylgruppe und dergleichen. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Anwendung dieser beispielhaft genannten Gruppen beschränkt. Das Verfahren der Abspaltung wird in üblicher Weise durchgeführt, beispielsweise durch katalytische Reduktion, Hydrolyse mit Säuren oder Alkalien, Reduktion mit flüssigem Ammoniak und metallischem Natrium und dergleichen.

Geeignete reaktive Derivate der Verbindung deT Formel (III), die sich für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen, sind reaktive Gruppen, die üblicherweise zur Herstellung von Peptiden eingesetzt werden und diese Gruppen unterliegen keiner Beschränkung im Hinblick auf das Derivat. So können beispielsweise aktive Eater, Säureazide, Säurehalogenide, gemischte Säureanhydride,

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Säureanhydride und dergleichen eingesetzt werden* Die reaktive Gruppe kann gewünschtenfalls in folgender Weise eingeführt werden: die Verbindung der Formel (ΊΙΙ) wird mit Ν,Ν-Dicyclohexylcarbodiimid, Carbonyldiimidazol und dergleichen umgesetzt und die Umsetzung mit der Verbindung (II) erfolgt dann gleichzeitig oder in beliebiger Reihenfolge.

Das anr stärksten bevorzugte reaktive Derivat ist ein aktiver Ester und es können ohne jegliche Beschränkung alle aktiven Ester eingesetzt werden, die üblicherweise bei der Herstellung von Peptiden verwendet werden. Zu solchen aktiven Estern gehören Ester eines Phenols mit elektronenanziehenden Substituenten am Benzolring, wie p-Nitrophenylester und Polyhalogenphenylester, z. B. 2,3»5-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester und Pentafluorphenylester; Ester von Hydroxychinolin oder Hydroxypyridin, wie 8-Chinolylester und 2-Pyridylester; Ester von Thiophenols Ester von N-Hydroxyimiden, wie Succinimidester, Phthalimidester und dergleichen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ?~ann in einfacher Weise durchgeführt werden, indem die Verbimv::;-■ der Formel (II) in einem geeigneten lösungsmittel mit einem reaktiven Derivat der Verbindung CIII) in Berührung gebracht wird.

Das zu verwendende Lösungsmittel unterliegt keiner speziellen BeschräBlcuiig, solange es nicht an der erfindungsgemäßen Reaktion teilnimmt. Geeignete lösungsmittel sind vorzugsweise solche, welche starkes Lösungsvermögen für die Ausgangsverbindungen zeigen, beispielsweise Dimethylformamid, Biiaethylacetßjnid und Acetonitril. Auch olle Reaktionstemperatur unterliegt keiner speziellen Beurig. Um jedoch Nebenreaktionen su vermeiden und die ge-Q Verbindung in guter Ausbeute s,'i erhalten, kann vors^gsweis© siae relativ niedere Eomp^rstu?? asgc^jsndet wcsrdea, die Im

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Nach Beendigung der Reaktion wird die gewünschte Verbindung in üblicher Weise aus dem Reaktionsgemisch gewonnen. So kann beispielsweise die gewünschte Verbindung durch Zugabe eines Lösungsmittels, welches die gewünschte Verbindung nicht löst, zu dem Reaktionsgemisch ausgefällt werden. Außerdem kann die so erhaltene Verbindung mit Hilfe eines üblichen Verfahrens gereinigt werden, beispielsweise durch Gelfiltration, Säulenchromatographie und Umfällung.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die nachstehenden Beispiele konkreter veranschaulicht. Die Erfindung soll jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt sein.

In den Beispielen wurde die Dünnschichtchromatographie mit Hilfe von Dünnschicht-Kieselgelfertigplatten 6OF254 der Merck ds Co. (Dicke 0,25 mm) durchgeführt.
Es wurden folgende Entwicklungsmittel verwendet:

I n-Butanol-Essigsäure-Wasser (60:15:25)

II n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (15:10:3:12)

III Chloroform-Methan01-32 #ige Essigsäure (60:45:20)

Die gewünschten Verbindungen wurden durch Bestrahlung mit UV-Licht, durch die Farbreaktion nach Ehrlich, die Farbreaktion nach Pauly und die Farbreaktion nach Sakaguchi identifiziert. Die R_f-Werte des Standard-LH-RH in.den vorstehend angegebenen Lösungsmitteln I, II und III betrugen O,33_f 0,52 bzw. 0,63.

Die Aminosäureanalyse wurde mit Hilfe einer automatischen Analysenvorrichtung durchgeführt, nachdem die Hydrolyse 24 Stunden bei 110° C mit Chlorwasserstoffsäure mit konstantem Siedepunkt (mit einem Gehalt an 4 # Ihioglycölsäure) in einem zugeschmolzenen evakuierten Rohr durchgeführt worden war.

Beispiel 1

N-Acetyl-N-methylglycyl-L-histidyl-L-tryptophyl-Ir-seryl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolinäthylamid

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In 0,5 ml trockenem Pyridin wurden 40 mg N-Acetyl-N-methylglycin (F. 139 - 140° C) und 140 mg p-Nitrophenyltrifluoracetat gelöst und die Lösung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Beendigung der Reaktion der Bildung von N-Acetyl-N-methylglycin-p-nitrophenylester wurde durch Dünnschichtchromatographie bestätigt und das lösungsmittel wurde danach unter vermindertem Druck abdestilliert. Zu dem Rückstand wurden 5 ml Wasser gegeben und es wurde mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde wiederholte Male mit Wasser gewaschen, bis der wässrige Anteil neutral wurde. Der Extrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, wobei Acetyl-N-methylglycin-p-nitrophenylester in Form eines Öls zurückblieb.

In einem Gemisch aus 5 ml Essigsäure, 20 ml Methanol und 10 ml Wasser wurden gesondert 160 mg N^-Benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolinäthylamid-acetat (R--Wert bei der Dünnschichtchromatographie: I, 0,52; II, 0,80; III, 0,81) gelöst und die erhaltene lösung wurde bei Raumtemperatur während 9 Stunden in Gegenwart von 100 mg 10 # Palladium-Kohle-Katalysator der kataly-, tischen Reduktion unterworfen. Der Katalysator wurde dann aus dem Reaktionsgemisch durch Filtration entfernt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand wurde im Vakuum getrocknet. Der Rückstand wurde in 1 ml Dimethylformamid gelöst und nach der Zugabe des vorher erhaltenen aktiven Esters wurde das Gemisch 15 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Zu dem Reaktionsgemisch wurden 30 ml Äthylacetat zugefügt und der gebildete Niederschlag wurde durch Filtration, gewonnen und mit Äthylacetat gewaschen. Der Niederschlag wurde dann in 3 ml Methanol gelöst und durch Zugabe von 30 ml Äthylacetat wieder ausgefällt. Der so gebildete Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen und unter vermindertem Drück getrocknet, wobei 143 mg des gewünschten Produkts in roher Form erhalten wurden.

Das Rohprodukt (50 mg) wurde dann mit Hilfe von Verteilungschromatographie gereinigt (Träger: Sephadex G-25, Grosse der Kolonne 2,7 x 90 cm, Laufmittel: n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:5)). Es

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wurden Fraktionen von jeweils IO al entnommen und sowohl UV-spektrographisch (bei 280 mn) als durch Dünnschichtchromatographie überprüft, um die Fraktionen festzustellen, welche das gewünschte Produkt enthielten. Die Fraktionen von der 31. bis zur 35· Fraktion wurden dann kombiniert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in einer geringen Menge 1 #iger Essigsäure gelöst und nach der Zugabe einer geringen Menge Aktivkohle wurde das Gemisch geschüttelt und filtriert. Das Filtrat wurde gefriergetrocknet, wobei 22,1 mg der gewünschten Verbindung in reiner Acetatform erhalten wurden.

Optische Drehung : f^J^⁰ -49,5 (c=0,19,

0,1 η Essigsäure) R--Wert bei Dünnschichtchromatographie:

I₁ 0,37; II, 0,58; III, 0,69.

Aminosäureanalysis (Relativwert bezogen auf einen leucinwert von

Aminosäure	Theoretischer Wert	Gefundener Wert
Serin ,	1	0,83
Prolin	1	0,94
Alanin	1	1,06
Leucin	1	1,00
Tyrosin	1	0,99
Tryptophan	1	0,90
Histidin	1	0,99
Arginin	1	0,95
N-Methylglycin	1	0,91

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Beispiel 2

N-Acetyl-N-methylglycyl-L-hl8tidyl-L-tryptophyl-l·-seryl-l·-tyrosyl-D-alanyl-L-leucyl-L-arglnyl-L-prolin^ ₁2,2-trifluoräthylamid

200 mg N^-Benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-tryptophyl-l-seryl-Irtyrosyl-D-alanyl-L-leucyl-I-arginyl-I-prolin-2,2,2-trifluoräthylamid (R~-Werte bei der Dünnschichtchromatographie : I, 0,48; II, 0,73; III, 0,82; optische Drehung ßxjjf - 22° (c = 0,3, Essigsäure)) wurden in Gegenwart von 0,15 ml Mercaptoäthanol, 0,1 ml Anisol und 5 ml Fluorwasserstoff unter Eiskühlung 30 Minuten gerührt. Der Fluorwasserstoff wurde unter vermindertem Druck abdestilliert und 10 ml Wasser wurden dem Rückstand zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde mit Triäthylamin auf einen pH-Wert von 9 eingestellt, mit 3 Anteilen von 10 ml Äthylacetat geschüttelt und unlösliche Bestandteile wurden abfiltriert. Die erhaltene wässrige lösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 1 ml Dimethylformamid gelöst und 20 mg N-Acetyl-N-methylglycin-2_!i3_f 5-trichlorphenylester (F. 70 bis 73 C, Nadeln) wurden zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann wurden 10 ml Äthylacetat zugesetzt, wobei eine Ausfällung abgeschieden wurde, die dann durch Zentrifugieren gewonnen wurde (2000 Upm, 5 Minuten). Dieser abgetrennte Niederschlag wurde durch Verteilungschromatographie gereinigt (Träger : Sephadex G-25, Grosse der Säule 2,7 x 90 cm, Laufmittel: n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:5)). Es wurden Fraktionen von je 10 ml aufgefangen und sowohl durch UV-Spektrographie (bei 280 nyi) als auch durch Dünnschichtchromatographie geprüft, um die Fraktionen festzustellen, welche das gewünschte Produkt enthielten. Die Fraktionen von der 55. biß zur 59. Fraktion wurden dann kombiniert, unter vermindertem Druck eingedampft und Ia Vakuum getrocknet, Der iltiokstaM wurde in einer kleinen Menge Wasser gelöst und der SS^leiiohromatographie unterworfen (SP-Sepadex C-25 (ΚΗΪ- fora* £t.mlöiig2?8c3si 1 ~ 7.0- ©m». 50 ml 9i-BtE 3_s0S molaren Ai2B;QriJumMea?-:'^i:EiIq3riEg msi-sa durch die Säule geleitet,» Durch Erhöhung üev K:yßaöiitr-atlG3 'lsi¹ "ferwendeten Ammo- . slmafeiearbonatlösung Über O₅Oa sois,i? auf ö_s0i Eiolas? wurden die ge-

- li -

wünschten Fraktionen eluiert. Diese Fraktionen wurden aufgefangen, durch Absaugen filtriert und gefriergetrocknet. Die so erhaltene pulverförmige Substanz wurde in 5 ml 0,5 n-EsBigsäure gelöst und erneut gefriergetrocknet, wobei die gewünschte Verbindung in der reinen Acetatform erhalten wurde. Ausbeute 43 mg. Optische Drehung Z"<^/^° -40,6° ( c = 0,3, 0,1 η Essigsäure)

R_f-Wert bei der Dünnschichtchromatographie : I, 0,36; II, 0,56;

III, 0,69

Aminosäureanalyse (Relativwert, bezogen auf einen leucinwert yon I) :

Aminosäure	Theoretischer Wert	Gefundener Wert
Serin	1	0,86
Prolin	1	1,04
Alanin	1	1,02
Leucin	1	1,00
Tyrosin	1	1,03
Tryptophan	1	0,96
Histdin	1	1,02
Arginin	1	1,02
N-Methy!glycin	1	0,97

Beispiel 3

N-Aeetyl-N-methylglycyl-l·-hiBtidyl-l·-tryptophyl-l·-seryl-L-tyrosyl-D-norleucyl-I-leucyl-L-arginyl-I-prolinäthylamid

80 mg N^-Benzyloxycarbonyl-L-histidyl-I-tryptophyl-L-seryl^I-tyrosyl-D-norleucyl-Ir-leucyl-I-arginyl-I-prolinäthylamid (R_f-Werte bei der Dünnschichtchromatographie : I, 0,56; II, 0,75; III, 0,90; Optische Drehung ZW^⁷ -22° (c = 0,3, Eisessig)) wurden in Gegenwart von 0,15 ml Mercaptoäthanol, 0,1 ml Anisol

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und 5ml Fluorwasserstoff unter Eiskühlung 30 Minuten gerührt. Der Fluorwasserstoff wurde unter vermindertem Druck abdestilliert, 10 ml Wasser wurden zu dem Rückstand gegeben und das erhaltene Gemisch wurde mit Triäthylamin auf einen pH-Wert von 9 eingestellt. Das Gemisch wurde dreimal mit Äthylacetat gewaschen und unlösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugalabscheidung entfernt. Die erhaltene wässrige Lösung wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 1 ml Dimethylformamid gelöst und 15 ml N-Acetyl-N-methylglycin-2,3,5-trichlorphenylester wurden zugesetzt. Nachdem das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen worden war, wurden 10 ml Äthylacetat zugesetzt, um einen Niederschlag auszufällen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugalabscheidung (2000 Upm, 5 Minuten) gewonnen und in gleicher Weise wie in Beispiel 2 der Verteilungschromatographie unterworfen. Die Fraktionen von der 29. bis zur 34. Fraktion wurden aufgefangen und in gleicher Weise wie in Beispiel 2 der Säulenchromatographie unterworfen und anschliessend gefriergetrocknet. Ausbeute 31 mg.

Optische Drehung : C⁰⁶J^ -31,1° (c = 0,3, 0,1 η Essigsäure)

R_f-Wert bei der Dünnschichtchromatographie : I, 0,40; II,

0,69; III, 0,83;

Aminosäureanalyse (Relativwert, bezogen auf einen Leucin-

wert von 1):

Aminosäure "	Theoretischer Wert	Gefundener Wert
Serin	1	0,85
Prolin	1	0,96
leucin	1	1,00
Norleucin	1	0,98
Tyrosin	1	1,00
Tryptophan	• 1	0,87

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Histidin Arginin N-Methy!glycin

1
1

0,98 0,97 G,88

Beispiel 4

N-Acet.γl-N-meth.yl/3:lyc₁yl-L-histid_τyl-·l·-tr.yptoph.yl-^l·-seryl-I--tyrosyl^ D-norleucyl-I-leucyl-L-arginyl-L-prolin^-fluoräthylaraid

In gleicher Weise wie in Beispielen 2 und 3 wurde das gewünschte Produkt aus 50 mg N^-Benzyloxycarbonyl-I-histidyl-Ir-tryptophyl-lseryl-I-tyrosyl-D-norleucyl-I-leucyl-I-arginyl-I-prolinß-fluoräthylamid erhalten. (R_f-Werte bei der Dünnschichtchromatographie:

I, 0,56j II, 0,72; III, 0,89; Optische Drehung [°cft£ -23,0° (c = 0,3, Eisessig)). Ausbeute 17 mg.

Die erhaltene Verbindung hatte folgende Daten:

Optische Drehung'>ß*7^ -29,5° (c = 0,3, 0,1 η Essigsäure) R_f-Wert bei der Dünnschichtchromatographie:

I, 0,43; II, 0,68; III, 0,83

Aminosäureanalyse (Relativwert bezogen auf einen leucinwert ^y von 1) :

Aminosäure	Theoretischer Wert	Gefundener Wert
Serin	1	0,82
Prolin	1	1,00
leucin	1	1,00
Norleucin	1	1,02
Tyrosin	1	1,01
Tryptophan	1	0,82
Histidin	1	0,99

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Arginin

N-Me thy!glycin

Γ
1

1,04 0,88

Beispiel 5

N-Acetyl-N-methyl^ycyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyro-8yl-I)-norleucyl-l·-leuc.yl-L-argin.yl-l·-prolin-2,2,2-trif luoräthylamid

In gleicher Weise wie in den Beispielen 2, 3 und 4 wurde das gewünschte Produkt aus 50 mg N^-Benzyloxycarbonyl-L-histidyl-I-tryptophyl-Ir-seryl-Ir-tyrosyl-D-norleucyl-I-leucyl-I-arginyl-I-prolin-2,2,2-trifluoräthylamid (R_f-Werte bei der Dünnschichtchromatographie : I, 0,52; II, 0,75; III, 0,85; Optische Drehung ' -15° ( c = 0,3, Eisessig)) in einer Asubeute von 11,1 mg

/p&7r
erhalten.

Optische Drehung :

-32,5°. (c = 0,3, 0,1 η Essigsäure)

R»-Werte bei der Dünnschichtchromatographie :

I, 0,39; II, 0,61; III, 0,76

Aminosäureanalyse (Relativwert bezogen auf einen Leucinwert

von 1) :

Aminosäure	Theoretischer Wert	Gefundener Wert
Serin	1	0,80
Prolin	1	1,07
leucin	1	1,00
Norleucin	1	1,03
Tyrosin	1	0,98
Tryptophan	1	0,71
Histidin	1	0,90
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Arginin
N-Methylglycin

1
1

0,98 0,98

Um die ausgezeichnete biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Peptide nachzuweisen, wurden folgende Versuche durchgeführt.

Versuch 1

P. Wistar - Imamichi-Ratten mit einem Körpergewicht von etwa 250 g wurden bei Raumtemperatur (23 - 1° C) unter künstlichem Licht(von 5°° Uhr am Morgen bis 7°° Uhr am Abend) aufgezogen. Un ter diesen Ratten wurden die Tiere ausgewählt, die mehr als drei mal einen viertägigen Genitalzyklus hatten, und dem Test unterworfen.

Um I⁰⁰ Uhr am Vorbrunst-Tag (Proestrus-Tag) wurde Pentobarbitalnatriumsalz jeder der Ratten in einer Menge von 30 mg/kg intraperitoneal verabreicht. Danach wurde am gleichen Tag um 4°° Uhr nsxihmittags eine in 0,1 ml isotonischer Natriumchloridlösung geloste Probe subkutan injiziert. Zwischen 12⁰⁰ Uhr mittags und I⁰⁰ Uhr nachmittags des nächsten Tages wurden die Ratten getötet und der Eileiter wurde sofort entnommen. Der Eileiter wurde dann zwischen zwei Objektträger gelegt und mit Hilfe eines Mikroskops auf Eizellen überprüft. Bei der Durchführung des Tests wurden je weils fünf Ratten für eine bestimmte Dosierung der Testproben angewendet. Die Ergebnisse sind nachstehend anhand des Wertes angegeben.

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Testprobe	ED₁-Q ^g/Körpergewicht
LH-RH natürlicher Struktur (synthetisch)	0,134
Verbindung A '	0,018
2) Verbindung B '	0,0125

Anmerkungen^

1)" : N-Acetyl-N-methylglycyl-I-histidyl-I-tryptophyl-I-seryl ■ I-tyrosyl-D-alanyl-L-leucyl-I-arginyl-l-prolinäthylamid

2) : N-Acetyl-N-methylglycyl-I-histidyl-I-tryptophyl-I-seryl-I-tyrosyl-D-norleucyl-L-leucyl-L-arginyl-I-prolin-2-fluoräthylamid

Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß die erfin dungsgemäßen Peptide einen weit höheren ovulationsauslösenden Effekt haben, als natürliches IH-RH.

Versuch 2

(I) 2,5.ug IH-RH des natürlichen Typs und der erfindungsgemäßen Verbindung (nachstehend als Verbindung A bezeichnet), N-Acetyl-N-nnethylglycyl-I-histidyl-I-tryptophyl-I-seryl-I-tyrosyl-D-alanyl-I-leucyl-I-arginyl-Ir-prolinäthylamid, wurden in 0,5 ml Salzlösung gelöst und der Ovarialexstirpation unterworfenen Östrogen-Progesteron-vorbehandelten Ratten entsprechend den Angaben von V.D. Ramirez et al. in Endocrinology, 73, 193 (1963) subkutan injiziert.

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Blutproben wurden aus der Jugularvene 15, 30, 60, 90 und 120 Minuten nach der Injektion entnommen und nach der Abtrennung des Serums wurden die Konzentrationen von Serum-LH mit Hilfe des Radioimmun-Tests nach der Methode von G.D. Niswender et al. in the Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 128, 807 (1968) bestimmt.

Die Serum-LH-Spiegel der zu prüfenden Verbindungen sind graphisch in Figur 1 dargestellt, in der ein Serum-LH-Spiegel der Verbindung A durch eine ausgezogene linie und der entsprechende Wert von LH-RH des natürlichen Typs durch eine gestrichelte Linie dargestellt ist.

(II) Je 50 ^ig LH-RH des natürlichen Typs und einer erfindungsgemäßen Verbindung (nachstehend als Verbindung B bezeichnet), N-Acetyl-N-metbylglycyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-norleucyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolin-2-fluoräthylamid, wurden in 0,5 ml Kochsalzlösung gelöst und in gleicher Weise wie vorstehend unter (I) der gleichen Gruppe von erwachsenen Ziegenböcken in zweiwöchigen Abständen injiziert.

Blutproben wurden aus der Jugularvene 151 30, 60, 120, 180, 24Ο und 300 Minuten nach der Injektion entnommen und danach wurden die Konzentrationen des Serum-LH mit Hilfe des Radioimmuntests in gleicher Weise' wie vorstehend unter (I) bestimmt.

Die Serum-LH-Spiegel der zu prüfenden Verbindung sind graphisch' in Figur 2 dargestellt, in welcher der Serum-LH-Spiegel der Verbindung B durch eine ausgezogene Linie und der von LH-RH des natürlichen Typs durch eine gestrichelte Linie gezeigt ist.

Aus den in Figuren 1 und 2 gezeigten Ergebnissen ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Peptide die Ausschüttung von LH weit stärker stimulieren, als LH-RH des natürlichen Typs und daß bei den erfindungsgemäßen Peptiden höhere Serum-LH-Spiegel merklich länger anhalten. ^

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Claims

Patentansprüche

1.) Peptid der Formel

. N-Acetyl-N-methylglyeyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-Ir-tyrosyl-Y-L-leucyl-I-arginyl-l-prolyl-Z

in der Y einen D-pc-Alkylglycinrest der Formel

_2n3
-NH-CH-CO-

bedeutet, in der η eine ganze Zahl von 0 bis einschließlich 3 darstellt, und Z eine Ithylaminogruppe oder eine mit 1 bis 3 Fluoratomen in 2-Stellung substituierte Äthylaminogruppe bedeutet.

2. Peptid nach Anspruch 1, in welchem Z eine Äthylamino- oder 2-Fluoräthylaminogruppe bedeutet.

3. N-Acetyl-N-methylglycyl-I-histidyl-L-tryptophyl-I-seryl-L-tyrosyl-D-alanyl-L-leucyl-I-arginyl-L-prolinäthylamid.

4. N-Acetyl-N-methylglycyl-I-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-Irtyrosyl-3)-alanyl-L-leucyl-L-arginyl-Ir-prolin-2,2,2-trif luoräthylamid.

5. N-Acetyl-N-methylglycyl-Ir-his t idy l-L-tryptophyl-l-seryl-ltyroeyl-JD-norleucyl-L-leucyl-L-arginyl-I-prolinäthylamid.

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6. N-Acetyl-N-methylglycyl-L-histidyl-L-tryptopbyl-L-seryl-ltyrosyl-D-norleucyl-l-leucyl-L-arginyl-l-prolin-(3-f luoräthylamid.

7. N-Acetyl-N-methylglycyl-Ir-histidyl-Ir-tryptophyl-I-seryl-I-tyrosyl-D-norleucyl-I-leucyl-L-arginyl-L-prolin^,2,2-trif luoräthy lamid.

8. Verfahren zur Herstellung eines Peptide der Formel

!T-Acetyl-N-methylglycyl-l-histidyl-L-tryptophyl-Iiseryl-L-tyrosyl-Y-L-leucyl-I-arginyl-l-prolyl-Z

in der Y und Z die bereits gegebene Definition haben, dadurch gekennzeichnet , daß man

L-Histidyl-L-tryptophyl-L-serylCoder'L-seryl mit geschützter Hydroxylgruppe)-I-tyrosyl( oder L-tyrosyl mit geschützter Hydroxylgruppe)-Y-I-leucyl-L-arginyl (oder L-arginyl mit geschützter Guanidylgruppe)-L-prolyl-Z

in der Y und Z die vorstehend gegebene Definition haben, mit einem reaktiven Derivat von N-Acetyl-N-methylglycin umsetzt, falls Schutzgruppen vorliegen, diese entfernt und gegebenenfalls die erhaltene Verbindung in üblicher Weise in ein Säureadditionssalz überführt.

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