DE2705514B2

DE2705514B2 - Nonapeptide und diese enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2705514B2
Application number: DE2705514A
Authority: DE
Inventors: Edwin Samuel Antioch Johnson; John Hunter Lake Forest Seely
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1976-02-11
Filing date: 1977-02-10
Publication date: 1979-06-07
Also published as: JPS5299230A; DE2705514C3; DE2705514A1; JPS5419447B2; BE850883A; GB1557343A; US4071622A

Description

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Seit vielen Jahren wird nach Substanzen gesucht, die nach Verabreichung an Warmblüter die Rückbildung und/oder die Beseitigung von Tumoren bewirken, ohne wesentliche nachteilige Wirkungen auf das gesunde Gewebe des Empfängers auszuüben.

Es wurde nun gefunden, daß eine Reihe von eng verwandten Peptiden die Fähigkeit hat, den Stoffwechsel gewisser Tumore bis zu einem Punkt zu stören, bei dem ihr Zellwachstum drastisch geschädigt wird, was so wiederum zur Rückbildung und häufig zur vollständigen Beseitigung des Tumors führt.

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, für die Behandlung von Warmblütern, die von einem oder mehreren aktiven Tumoren oder Neoplasmen befallen sind, ein Mittel verfügbar zu machen, das bei den von diesen Tumoren befallenen Warmblütern eine chemische Behandlung ermöglicht, durch die die Größe des Tumors verringert wird, ohne den vom Tumor Befallenen zu schädigen. w

Es wurde nun gefunden, daß Nonapeptide der allgemeinen Formel

I. L-PyroGlu-L-His-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-X- L-Leu-L-Arg-L-Pro-NHQH,

worin X die optisch aktive D-Form einer Aminosäure der Formel

NH — CHR' — CO —

50

worin R' ein Benzylrest, 3-lndolylrest oder p-Hydroxybenzylrest ist, d. h. D-Phenylalanyl, D-Tryptophyl oder D-Tyrosyl bedeutet, die gewünschten Wirkungen haben, wenn «ie Warmblütern, die einen wachsenden Tumor in sich tragen, in einer effektiven Tagesdosis verabreicht werden.

Das erfindungsgemäße Mittel wird Warmblütern, die von einem Mammatumor oder von durch 7,12-Dimethylbenzanthracen induzierbaren Tumoren befallen sind, in einer parenteralen Dosis zwischen 1 und ho 200 Mg/kg pro Tag als Einzeldosis oder aufgeteilt in zwei bis vier entsprechend kleineren Tagesdosen verabreicht. Wenn die orale Verabreichung gewünscht wird, liegt die Dosis im Bereich zwischen 2 und 500 μg/kg pro Tag und kann leicht überschritten werden, da die Verbindungen der Formel I bei oralen Dosen von 100 mg/kg oder mehr keine toxischen Wirkungen zeigen. Die vorstehend genannte »parenteral« Behandlung umfaßt alle Verabreichungen außer der oralen, insbesondere die intramuskuläre, subkutane und intravenöse Injektion oder Infusion, die intravaginale Verabreichung, die Verabreichung durch Suppositorien, Nasentropfen usw. Für diese Formulierungen stellen Lösungen der Verbindungen (I) in einer Konzentration von 5 bis 100 μg/ml in 0,9%iger Kochsalzlösung eine ausgezeichnete Arzneimittelform dar. Gegebenenfalls können geringe Mengen Albumin zugesetzt werden, um die Adsorption der Verbindung (I) am Glasgefäß, in dem diese Arzneimittelform hergestellt oder gelagert wird, zu verhindern.

Die Verbindungen der Formel (I) sind sehr leicht wasserlöslich. Sie können im wesentlichen unendlich lange als Feststoff oder als Lösung in Wasser oder Kochsalzlösung gelagert werden. Natürlich können, falls gewünscht, Puffer wie Tris(hydroxyniethyl)aminomethan oder andere pharmazeutisch unbedenkliche Zusatzstoffe den Lösungen vor der Lagerung oder vor dem Gebrauch zugesetzt werden.

Für die orale Verabreichung kommen alle pharmazeutischen Zubereitungen, z.B. Sirupe, Elixiere und Suspensionen, in Frage, oder die Verbindungen können zu Oblaten, Pillen oder Tabletten formuliert werden. Da jedoch die erforderliche Dosis extrem gering ist, erfordern die üblichen Tablettierverfahren die Verwendung von Füllstoffen und anderen Hilfsstoffen zur Herstellung von Tabletten einer handgerechten Größe. Bei einer bevorzugten Ausführungsform besteht die orale Arzneimittelform aus einer Tablette, die 0,1 bis 5,0 mg eines der vorstehend genannten Peptide pro Tablette enthält Diese Tabletten können in üblicher Weise mit einem Überzug versehen werden, indem vorzugsweise ein leicht lösliches Oberzugsmaterial, z. B. Zucker, verwendet wird, oder die genannte Menge kann in Gelatinekapseln, die sich nach Einführung in den Magen sofort lösen, eingearbeitet werden. In jedem Fall können die üblichen Geschmacksstoffe und Farbstoffe ohne Einfluß auf das in dieser Weise eingearbeitete aktive Peptid verwendet werden.

Tabletten dieser Art werden in üblicher Weise hergestellt, indem das aktive Ingrediens mit Stärke gemischt, das Gemisch granuliert und nach Zugabe der notwendigen Füllstoffe, Geschmacksstoffe, Gleitmittel homogenisiert und durch ein 0,59-mm-Sieb gegeben wird. Das gleichmäßige Gemisch wird dann mit dem üblichen Stempel zu Tabletten der gewünschten Härte, vorzugsweise zu Tabletten mit Bruchkerbe zur leichteren Verabreichung in geteilten Tagesdosen, gepreßt.

Die Herstellung und Verwendung άςτ Verbindungen gemäß der Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Im Rahmen dieser Beschreibung werden die Airsdrücke »Neoplasma« und »Tumor« austauschbar gebraucht.

Beispiel 1

t-Butyloxycarbonyl-prolin wird nach der Methode, die von Stewart und Mitarbeitern in »SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS« (Verlag Freeman & Company,San Francisco 1969),Seite !,beschrieben wird, verestert, indem es mit einem chlormethylierten Divinylbenzol-Styrol-Copolymerisat (»Merrifield-Harz«,) zusammengegeben wird. In dieser Weise wird ein Harz gebildet, das nach der Aminosäure-Analyse 0,47 mMol Prolin/g Harz enthält. In einer automatischen Syntheseapparatur, die nach der genannten Merrifield-Apparatur entwickelt wurde, werden 4,6 g dieses Harz/Aminosäure-Materials für die Synthese des

gewünschten Nonapeptids verwendet. Jede N-blockierte Aminosäure wird im dreifachen Überschuß zugesetzt und der Kupplung an den vorliegenden Aminosäure-Hiirzester dem üblichen Kupplungsprozeß überlassen. Die Kupplungireaktion wird 4,5 Stunden unter ständigem Schütteln durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend sechsmal je 1,5 Minuten mit Methanol-Chloroform (1:2) und viermal je 1,5 Minuten mit Äthanol gewaschen. In jedem Fall wird ein Gesamtvolumen von 48 ml verwendet. Die Ablaßzeit nach dem Schütteln beträgt gewöhnlich etwa 1,5 Minuten.

Nach der Kupplung wird das Gemisch viermal je 1,5 Minuten mit Dioxan, zweimal mit 4n-Salzsäure/Dioxan für 5 Minuten bzw. 25 Minuten, fünfmal je 1,5 Minuten is mit Dioxan, dreimal je 3 Minuten mit Äthanol, dreimal je 1,5 Minuten mit Chloroform, dreimal je 1,5 Minuten mit 10% Triäthylamin/Chlorofonn, viermal je 1,5 Minuten mit Chloroform und sechsmal je 1,5 Minuten mit Dichlonnethan gewaschen. Normalerweise wird ais Lösungsmittel föi die Kupplungsreaktion Dichlormethan oder, wenn die Löslichkeit der blockierten Aminosäure gering ist, ein Gemisch von Dichlonnethan und Dimethylformamid verwendet Die Kupplung erfolgt durch Zusatz einer Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid in Dichlonnethan im 2^-fachen Oberschuß.

Die aufeinanderfolgenden Schritte zur Entfernung der Schutzgruppe, Neutralisation und Kupplung der nächsten Aminosäure wird in einem voll automatischen System, das vorstehend beschrieben wurde, durchgeführt in dieser Weise wird das Peptid zusammengefügt indem nacheinander

Boc-ArgfTos),

Boc-Leu,

Boc-D-Trp,

BoC-TyT(Cl₂BzI),

Boc-Ser(Bzl),

Boc-Trp,

BoC-HiS(DNP) und

PyroGlu

verwendet werden, worin alle Aminosäuren in der L-Form vorliegen, ausgenommen im Falle des Tryptophans.

Das Harz wird aus dem Gefäß entnommen und in 200 ml 5% Triäthylamin/Methanol suspendiert Zur Suspension werden 100 ml destilliertes Äthylamin gegeben. Nach 24 Stunden wird das Harz abfiltriert und die Lösung eingedampft wobei ein Feststoff erhalten wird. Der Feststoff wird in Eisessig aufgenommen und auf eine 3 χ 50 cm große Säule von Kieselgel aufgebracht, das mit 5% Methanol/Chloroform ins Gleichgewicht gebracht worden ist

Die Säule wird mit 5% Methanol in Chloroform eluiert, bis alle Spuren von N-Äthyldinitroanilin, dem gelben Nebenprodukt der das Histidin schützenden Gruppe DNP, entfernt sind. Das Elutionsmittel wird dann gegen 33% Methanol/Chloroform ausgewechselt. Fraktionen von je 30 ml werden aufgefangen. Die Verbindung wird durch Dünnschichtchromatographie von aliquoter. Teilen der Fraktionen (Kieselgel G, 33% MeOH/CHCb, Cb/Tolidin-Spray) bestimmt Die Fraktionen, die das Produkt enthalten, werden zusammengegossen und eingedampft wobei ein Feststoff erhalten wird, der aus Methanol mit Äther ausgefällt wird. Diese dreifach geschützte Nonapeptid (Schutzgruppen bei Sei', Tyr und Arg) wird in dieser Weise in einer Menge von 1,69 g entsprechend einer Ausbeute von 43% der Theorie erhalten.

Eine Probe von 250 mg dieses Produkts wird mit 250 mg Anisol in ein Fluorwasserstoff-ReaktionsgefäO gegeben, in das etwa 5 ml wasserfreier Fluorwasserstoff destilliert werden. Nach einer Stunde bei 0°C wird der Fluorwasserstoff unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in 1% Essigsäure aufgenommen. Diese Lösung wird mit Äther extrahiert Die wäßrige Phase wird auf eine 1 χ 30 cm große Säure eines stark basischen Ionenaustauscherharzes, das quarternary Ammoniumgruppen in einem mit 2% Divinylbtnzol vernetzten Styrolpolymer-Latex aufweist in der Essigsäureform aufgegeben. Das Produkt wird mit 0,In-Essigsäure eluiert und durch Dünnschichtchromatographie (CHCl3/MeOH/32% HOAc: 120/90/40 Kieselgel G, Cb/Tolidin bestimmt Die das Produkt enthaltende Lösung wird gefriergetrocknet an einem Dextrangel, das mit 6% Epichlorhydrin vernetzt ist mit einer molaren Ausschlußgrenze unterhalb 1000 bis 5000 erneut chromatographiert Das eluierte Produkt wird aufgefangen und gefriergetrocknet wobei ein flockiger weißer Feststoff in einer Gesamtausbeute von 25% erhalten wird

Wenn bei der vorstehend beschriebenen Synthese das Bic-D-Trp (das die Verbindung mit X=D-Trp ergibt) durch BoC-D-TyI-(CI₂) (das die Verbindung mit X=D-Tyr ergibt) oder durch Boc-D-phenyl-alanin (das die Verbindung mit X = D-Phe ergibt) ersetzt wird, verläuft diese Synthese in der oben beschriebenen automatischen Syntheseapparatur wieder in der gleichen Weise. In allen Fällen werden die Nonapeptide durch die Aminosäure-Analyse und das NMR-Spcktrum identifiziert Diese Analysen bestätigen die Anwesenheit der Aminosäuren in der Sequenz im erwarteten Molverhältnis.

Charakterisierung der erfindungsgemäßen
Verbindungen

1. Nonapeptid mit X = D-Trp
Ausbeute 16%

f«]i^!603° (c=0,5 in 5-prozentiger wäßriger Essigsäure)

R₁=O₁I l(a)
= 0,64(b)
= 0,62(c)

Aus 582 mg Tripeptid wurden 132 mg Endprodukt erhalten.

2. Nonapeptid mit X = D-Phe

Ausbeute 15%; [λ] ί =59,4° (c=0,5 in 5 prozentiger

wäßriger Essigsäure)

R_f=0,15 (a)

=0,65(b)

= 0,54(c)

Aus 582 mg Tripeptid wurden 150 mg Endprodukt

erhalten.

3. Nonapeptid mit X = D-Tyr
Ausbeute 44%

[α] 'ή' =62,2° (c=0,5 in 5 prozentiger wäßriger Essigsäure)
Rt = 0,13 (a)
=0,64(b)
=0,56(c)

Aus 582 mg Tripeptid wurden 720 mg Endprodukt erhalten.

Die verwendeten Lösungsmittelsysteme waren:
(a) Essigsäureäthylester/Pyridin/Essigsäure/H₂O
30:10:3:5

(b) n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/HiO
15:10:3:12

(c) n-Butanol/Essigsäureäthylester/Essigsäure/HjO
1:1:1:1

Beispiel 2

Bei drei weiblichen, 50 Tage alten Ratten wurden Tumore erzeugt, indem 20 mg 7,12-Dimethylbenzanthracen (DMBA) in 2 ml Sesamöl dem Magen zugeführt wurden. D'n. Tumore entwickelten sich bei den Tieren in 10 bis 12 Wochen. AHe Tiere erhalten während der auf die Verabreichung des DMBA folgenden 100 Tage normales Futter. Nach 100 Tagen wurde mit der Behandlung mit der Verbindung mit X = D-Trp begonnen. Hierbei wurde eine Dosis von 20 μg/Tag während einer Zeit von 11 Tagen in mehreren über den Tag verteilten Dosen subkutan als Lösung in isotonischer Kochsalzlösung, die 0,1% (Gewicht/Volumen) Rinderserumalbumin enthielt, verabreicht

Beispiel 3

Die Tiere wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 vorbereitet und vorbehandelt, jedoch wurde die Verbindung mit X = D-Tyr für die lltägige Behandlung verwendet.

Beispiel 4

Der Versuch wurde in der in den Beispielen 2 und 3 beschriebenen Weise durchgeführt, wobei jedoch die

Verbindung mit X= D-Phe verwendet wurde.

Die Gesamtvolumen der Tumore der Ratten zum Beginn, nach 3 Tagen, am 6. Tag, am 10. Tag und am 11. Tag sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt. Für die erfindungsgemäßen Verbindungen mit X = D-Trp, D-Tyr, D-Phe sind jeweils in der ersten Reihe die Gesamtvolumen der Tumoren bei drei Ratten aufgeführt, in der zweiten Reihe jeweils das Tumorvolumen eines bestimmten Einzeltieres. Die in der ersten Reihe unter D-Phe festgestellte Vergrößerung des Gesamtvolumens der Tumore war auf einen einzelnen Tumor bei einem Tier zurückzuführen. Dieser Tumor vergrößerte sich zwischen den Tagen 6 und 10 spontan von 038 auf 4,6 cm³, jedoch wurde festgestellt, daß dieser Tumor am Tag 11 auf 3,0 cm³ zurückgegangen war. Ein in der gleichen Weise behandeltes drittes Tier begann die Behandlung mit vier V umoren von 28,1 cm³, die sich bis zum Tag 6 auf 15 cm-¹ zur":ckgebildet hatten. Das Tier starb einschließend durch Ursachen, die aufgrund der Diagnose keinen Zusammenhang mit den Tumoren oder mit der Behandlung zu tun hatten (chronische murine Pneumonie).

PyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-MH-C₂H5

X	Gesamt-Volumen der Tumore, cm³	am 10. Tag	am 11.	Tag	Volumen-
	zu Beginn nach 3 Tagen am 6. Tag				venninderung
				μτη

D-Trp	39,2	26,7	18,6	8,7	8,7	67,7%
	11,65	7,5	8,1	3,8	3,76
D-Tyr	43,3	37,5	24,9	16,3	15,0	96,5%
	3,6	2,5	1,33	0,73	0,125
D-Phe	13,4	10,1	5,4	6,4	5,5
	28,1		15

Wie die vorstehenden Versuchsergobnisse zeigen, bewirkt die Behandlung mit den Verbindungen der Formel I eine starke Rückbildung von mit DMBA erzeugten Tumoren. Es ist anerkannt, daß diese Wirkung in enger Beziehung zu der Behandlung von Brüsttumoren steht, für die die mit DMBA erzeugten Tumore als Modelle dienen (siehe »Pathology of Tumours in Laboratory Animals«, Band 1, Seite 31, herausgegeben von der internationalen Gesellschaft für Krebsforschung, Lyon 1973). Die vorstehend definierte enge Klasse von Verbindungen kann somit für die Besserung von Tumoren nach länger dauernder Behandlung sowie die Verlängerung der Überlebenszeit der Erkrankten verwendet werden. Da diese Verbindungen selbst in Dosen von 100 mg/kg im wesentlichen keine Toxizität aufweisen und die für die erfolgreiche Behandlung von Warmblütern anzuwendenden Dosen im Bereich von μg/kg liegen, ist der therapeutische Index der Verbindungen äußerst hoch.

Claims

Patentansprüche:

1. Nonapeptide der allgemeinen Formel

PyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-N H- C₂H₅

in der X

D-Tyr,

D-Trpoder ι ο

D-Phe
bedeutet.

2. Arzneimittel zur Verringerung der Größe von Mammatumoren oder von durch 7,12-Dimethylbenzanthracen induzierbaren Tumoren bei Warmblütern, enthaltend ein Nonapeptid gemäß Anspruch 1.