DE2708125A1 - Mittel fuer die verhinderung der fortpflanzung von weiblichen warmbluetern - Google Patents

Description

PATENTANWALT DR. HANS-GUNTHER EGGERT, DIPLOMCHEMIKER

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Eg/Ax/Nr. 5 _ Köln, den 27. Februar 1977

Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois 6oo64 (U.S.A.)

Mittel für die Verhinderung der Fortpflanzung von weiblichen Warmblütern

In den letzten Jahren wurde die Fortpflanzung und/oder Befruchtung bei Warmblütern durch Verabreichung der verschiedensten physiologisch aktiven Präparate verhindert, die meistens .aus mehreren Komppnenten, die natürlieh in den Warmblütern vorkommen, oder deren syntheti schen Analoga bestehen. Diese Komponenten werden in einigen Fällen gleichzeitig und in anderen Fällen getrennt zu verschiedenen Zeiten während eines normalen Menstruations- oder Ovulationszyklus gegeben. Leider haben einige dieser natürlich vorhandenen Komponenten oder ihre synthetischen Analoga andere Wirkungen auf die Warmblüter, und ihre exogene Verabreichung führt zu unerwünschten Nebenwirkungen. Aus diesem Grunde ist die Verwendung dieser Präparate über lange Zeit gefährlich und ihre weit verbreitete Anwendung unmöglich.

Gegenstand der Erfindung ist ein unnatürliches, physiologisch unbedenkliches synthetisches Mittel, das die Fortpflanzung bei weiblichen Warmblütern im fortpflanzungsfähigen Alter verhindert.

Die Mittel gemäß der Erfindung sind Nonapeptide der

Formel L-pGlu-L-His-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-X-L-Leu-L-Arg-L-Pro-NH-C2H5 , worin X die optisch aktive D-Form der

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zweiwertigen Aminosäurekomponente von Tyrosin, Tryptophan oder Phenylalanin ist. Die Verhinderung der Fortpflanzung mit diesen Mitteln wird erreicht, indem den weiblichen Warmblütern im fortpflanzungsfähigen Alter oder vor dem Erreichen dieses Alters das Nonapeptid in einer Dosis zwischen 1 ug und 10 mg/kg pro Tag für wenigstens einen Tag in dem Zeitraum, bevor der weibliche Warmblüter ein oder mehrere, reife Eier ausstößt oder nachdem die Ovulation stattgefunden hat, verabreicht wird.

Der Ausdruck "Verhinderung der Fortpflanzung" bedeutet die Verhinderung der Eierbildung einschließlich vorzeitiger Ovulation, Verhinderung der Implantation von befruchteten Eiern, Verzögerung der Pubertät oder Ver hinderung der Entwicklung des Embryos. Diese verschie denen Funktionen können in Tiermodellen demonstriert werden. Diese Versuche veranschaulichen eindeutig das allgemeine Konzept der Verhinderung der Fortpflanzung entweder durch Verwendung des Nonapeptids in der Folli kular- oder Lutealphase des normalen weiblichen Fort pflanzungszyklus.

Normalerweise wird das Nonapeptid dem im Zyklus befindlichen weiblichen Warmblüter in einer Dosis von 1 ug bis 10 mg/kg pro Tag als einzelne Tagesdosis oder in 2 bis 4 Tagesdosen von entsprechend kleineren Mengen verabreicht. Wenn diese Maßnahme während der Zeitspanne durchgeführt wird, in der mit der Eibildung zu rechnen ist, findet die Ovulation nicht statt, weil die Entwicklung des Ovum unterbrochen wird. Wenn das Nonapeptid nach der Befruchtung verabreicht wird, findet die Nidation nicht statt, und wenn das Nonapeptid nach der Implantation verabreicht wird, wird das implantierte Ei ausgestoßen oder das Embryo resorbiert.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.

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Beispiel 1

Prolin, das als blockierende Gruppe den t-Butyloxycarbonylsubstituenten (an anderen Stellen hierin als Boc- bezeichnet) an der Aminogruppe enthält, wird nach der Methode, die von Stewart und Mitarbeitern in "SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS" (herausgegeben 1969 von Freeman & Company, San Francisco), Seite 1, beschrieben wird, verestert, indem es mit einem chlormethylierten Divinylbenzol-Styrol-Copolymerisat ("Merrifield-Harz", Hersteller Bio-Rad) zusammengegeben wird. In dieser Weise wird ein Harz gebildet, das nach der Aminosäure-Analyse 0,47 mMol Prolin/g Harz enthält. In einer automatischen Syntheseapparatur, die nach der genannten Merrifield-Apparatur entwickelt wurde, werden 4,6 g dieses Harz/Aminosäure-Materials für die Synthese des gewünschten Nonapeptids verwendet. Jede N-blockierte Aminosäure wird im dreifachen Überschuss zugesetzt und der Kupplung an den vorliegenden Aminosäure-Harzester dem üblichen Kupplungsprozess überlassen. Die Kupplungsreaktion wird 4,5 Stunden unter ständigem Schütteln durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend sechsmal je 1,5 Minuten mit Methanol-Chloroform (1:2) und viermal je 1,5 Minuten mit Äthanol gewaschen. In jedem Fall wird ein Gesamtvolumen von 48 ml verwendet. Die Ablasszeit nach dem Schütteln beträgt gewöhnlich etwa 1,5 Minuten.

Nach der Kupplung wird das Gemisch viermal je 1,5 Minuten mit Dioxan, zweimal mit 4n-Salzsäure/Dioxan für 5 Minuten bzw. 25 Minuten, fünfmal Je 1,5 Minuten mit Dioxan, dreimal je 3 Minuten mit Äthanol, dreimal je 1,5 Minuten mit Chloroform, dreimal je 1,5 Minuten mit 10% Triäthylamin/Chloroform, viermal je 1,5 Minuten mit Chloroform und sechsmal je 1,5 Minuten mit Dichlormethan gewaschen. Normalerweise wird als Lösungsmittel für die Kupplungsreaktion Dichlormethan

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oder, wenn die Löslichkeit der blockierten Aminosäure gering ist, ein Gemisch von Dichlormethan und Dimethylformamid verwendet. Die Kupplung erfolgt durch Zusatz einer Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid in Dichlormethan im 2,9-fachen Überschuss.

Die aufeinanderfolgenden Schritte zur Entfernung der Schutzgruppe, Neutralisation und Kupplung der nächsten Aminosäure wird in einem voll automatischen System, das vorstehend beschrieben wurde, durchgeführt. In dieser Weise wird das Peptid zusammengefügt, indem nacheinander Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-D-Trp, Boc-Tyr(Cl₂Bzl), Boc-Ser(BzI), Boc-Trp, Boc-His(DNP) und pGlu verwendet werden, worin alle Aminosäuren in der L-Form vorliegen, ausgenommen im Falle des Tryptophans.

Das Harz wird aus dem Gefäß entnommen und in 200 ml 5% Triäthylamin/Methanol suspendiert. Zur Suspension werden 100 ml destilliertes Äthylamin gegeben. Nach 24 Stunden wird das Harz abfiltriert und die Lösung eingedampft, wobei ein Feststoff erhalten wird. Der Feststoff wird in Eisessig aufgenommen und auf eine 3 χ 50 cm große Säule von Kieselgel aufgebracht, das mit 5% Methanol/Chloroform ins Gleichgewicht gebracht worden ist.

Die Säule wird mit 5% Methanol in Chloroform eluiert, bis alle Spuren von N-Äthyldinitroanilin, dem gelben Nebenprodukt der das Histidin schützenden Gruppe DNP, entfernt sind. Das Elutionsmittel wird dann gegen 33% Methanol/Chloroform ausgewechselt. Fraktionen von je 30 ml werden aufgefangen. Die Verbindung wird durch Dünnschichtchromatographie von aliquoten Teilen der Fraktionen (Kieselgel G, 33% MeOH/CHCl₃, Cl₂/Tolidin-Spray) bestimmt. Die Fraktionen, die das Produkt enthalten, werden zusammengegossen und eingedampft, wobei

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ein Feststoff erhalten wird, der aus Methanol mit Äther ausgefällt wird. Dieses dreifach geschützte Nonapeptid (Schutzgruppen bei Ser, Tyr und Arg) wird in dieser Weise in einer Menge von 1,69 g entsprechend einer Ausbeute von 43% der Theorie erhalten.

Eine Probe von 250 mg dieses Produkts wird mit 250 mg Anisol in ein Fluorwasserstoff-Reaktionsgefäß gegeben, in das etwa 5 ml wasserfreier Fluorwasserstoff destilliert werden. Nach einer Stunde bei O⁰C wird der Fluorwasserstoff unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in l%iger Essigsäure aufgenommen. Diese Lösung wird mit Äther extrahiert. Die wässrige Phase wird auf eine 1 χ 30 cm große Säule eines stark basischen Ionenaustauscherharzes ("AGl X 2 Resin", Her- steller Bio-Rad) in der Essigsäureform aufgegeben. Das Produkt wird mit Ο,ΐη-Essigsäure eluiert und durch Dünnschichtchromatographie (CHCl₃/Me0H/32% HOAc: 120/90/40, Kieselgel G, Cl₂/Tolidin) bestimmt. Die das Produkt enthaltende Lösung wird gefriergetrocknet, ^am Ionenaustauscherharz "Sephadex G-25" (Hersteller Pharmacia, Upsala, Schweden) erneut chromatographiert. Das eluierte Produkt wird aufgefangen und gefriergetrocknet, wobei ein flockiger weißer Feststoff in einer Gesamtausbeute von 25% erhalten wird.

Wenn bei der vorstehend beschriebenen Synthese das

Boc-D-Trp (das die Verbindung A ergibt) durch Boc-D-Tyr(Cl₂B₂D (das die Verbindung B ergibt) oder durch Boc-D-phenyl-alanin (das die Verbindung C ergibt) ersetzt wird, verläuft diese Synthese in der oben be- schriebenen automatischen Syntheseapparatur wieder in der gleichen Weise. In allen Fällen werden die Nonapeptide durch die Aminosäure-Analyse und das NMR-Spektrum identifiziert. Diese Analysen bestätigen die Anwesenheit der Aminosäuren in der Sequenz im erwarte ten Molverhältnis.

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Beispiel 2

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Ausgewachsene weibliche Ratten mit einem Durchschnittsgewicht von 200 g wurde gepaart und dann willkürlich in Gruppen von 8 und 9 Tieren eingeteilt. Bei allen Tieren wurde die Paarung durch die Anwesenheit von Spermien in der Vaginalöffnung bestimmt. Bei allen Tieren wurde mit der subkutanen Behandlung mit 10 ug der vorstehend genannten Verbindung in mehreren täglichen Teildosen in einem wäßrigen Träger, der 0,1% Rinderserumalbumin und 0,9% Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,02% (Gew.-Vol.) enthielt, am Tag 3 der Implantation begonnen und bis zum Tag 6 fortgesetzt. Alle Tiere wurden am Tag 13 getätet und auf Symptome von Toxizität, Feten oder lebensfähige implantierte Eier untersucht.

Die Tiere der ersten (Vergleichsgruppe) von 4 Gruppen erhielten nur den vorstehend genannten Träger. Acht von neun Tieren erwiesen sich als trächtig. Nach der Tötung wurden insgesamt 87 eingenistete Eier und drei resorbierte Stellen in den Uteri gefunden.

Eine zweite Gruppe von 9 Tieren wurden mit der Verbindung A (X = Tryptophyl) behandelt. Sieben Tiere zeigten keine Anzeichen von Implantation. Die beiden anderen zeigten insgesamt 25 Implantationsstellen, die sämtlich resorbiert waren.

Die dritte Gruppe wurde mit der Verbindung B (X ■ Tyrosyl) behandelt. Auch hier zeigten nur zwei von neun Tieren Implantationsstellen, jedoch waren alle 22 gezählten Implantationen resorbiert.

Die vierte Gruppe von acht Tieren wurde mit der Verbindung C (X = Phenylalanyl) behandelt. Nur eine einzige resorbierte Implantationsstelle wurde nach der Tötung der Tiere in allen Uteri gefunden.

Diese Versuche und ihre Ergebnisse zeigen, daß die bei dieser Untersuchung verwendeten Verbindungen entweder die Befruchtung oder die Nidation oder die Entwicklung eines lebensfähigen Fetus verhindern. Von 26 Tieren, die mit einer der vorstehend genannten Verbindung behandelt wurden, zeigten nur fünf Implantationen, und bei den insgesamt 48 Implantationen wurde nicht ein einziger lebenfähiger Fetus festgestellt.

Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die vorstehend genannte Dosis auf 1 ug durch Injektion verringert oder auf 20 ug, d.h. auf eine Menge von 5 bis 100 ug/kg Körpergewicht erhöht wurde.

Beispiel 3

Wenn eine Verbindung der vorstehend genannten Formel weiblichen Ratten, die noch nicht voll entwickelt sind, verabreicht wird, wird die Ausbildung von Uterus und Ovarien verhindert mit dem Ergebnis, daß Ovarien und Uteri in einem präpuberalen Zustand bleiben, so lange die Behandlung fortgesetzt wird. Nach dem Abbruch der Verabreichung einer der genannten Verbindungen wird die normale Entwicklung der Organe wieder aufgenommen, und die Tiere erreichen 2 bis 3 Wochen später die vollständige Geschlechtsreife.

Beispiel 4

Trächtige Kaninchen erhielten einzelne subkutane Injektionen von 12,5 ug/kg der in Beispiel 2 verwendeten Verbindungen auf dem dort genannten Wege und in dem dort genannten Träger am 14. Tag nach der Implantation. Bei einem Vergleichstier (das nur den genannten Träger erhielt) erwiesen sich sieben von acht eingenisteten Eiern als lebensfähig, während die Tiere, denen die Verbindungen A, B und C injiziert wurden, nur durchschnittlich einen lebenfähigen Fetus von sieben eingenisteten Eiern zeigten. In allen Fällen wurden die Tiere am 28.Tag nach

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der Implantation getötet.

Wie die vorstehend beschriebenen Versuche und ihre Ergebnisse zeigen, hat die Behandlung mit den Verbindungen A, B oder C in geringen Mengen zu fast jedem Zeitpunkt während des weiblichen Zyklus einen tiefgreifenden Einfluß auf die Fruchtbarkeit oder Fortpflanzung. In den meisten Fällen genügen Einzeldosen von 2 bis 100 ug/kg Körpergewicht, jedoch kann es zweckmäßig sein, die vorstehend genannten Nonapeptide täglich an mehreren Tagen in Abhängigkeit von der Länge des Zyklus des jeweiligen Warmblüters zu verabreichen.

Beim Menschen wird die orale Verabreichung aus Gründen der Einfachheit bevorzugt. Tagesdosen von 0,02 bis 10 mg/kg an mehreren Tagen nach der Menstruation verhindern die Schwangerschaft. Tabletten, die 5 bis 100 mg enthalten, stellen eine besonders gut geeignete Dosierungseinheit dar.

Tabletten dieser Art werden in üblicher Weise wie folgt hergestellt: Das aktive Ingrediens wird mit Stärke gemischt. Das Gemisch wird granuliert und nach Zusatz der notwendigen Füllstoffe, Geschmacksstoffe, Gleitmittel usw. homogenisiert und durch ein 0,59 mm-Sieb (30 mesh) gepreßt. Das homogene Gemisch wird dann zu Tabletten der gewünschten Härte mit dem üblichen Stempel gepreßt. Vorzugsweise werden mit Bruchkerbe versehene Tabletten hergestellt, um die Einnahme in mehreren über den Tag verteilten Teildosen zu erleichtern.

Bei Tieren kann die subkutane Verabreichung zweckmäßiger sein. In diesem Fall wird das aktive Ingrediens in physiologisch unbedenklicher Kochsalzlösung gelöst, die gegebenenfalls 0,05 bis 1 Gew.-% Serumalbumin in einer Konzentration zwischen 0,5 und 10 Gew.-% der vorstehend genannten Verbindung enthält. Die Lösung wird zur Verhütung der Trächtigkeit oder, falls gewünscht, zur Ab-

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Stimmung einer Herde oder Gruppe von Tieren auf einen bestimmten Zeitpunkt injiziert.

Die nachgewiesenen Wirkungen der Verbindungen gemäß der Erfindung auf den Fortpflanzungszyklus von Warmblütern basieren in erster Linie auf dem mit ihnen in den Fortpflanzungsorganen der behandelten Tiere hervorgerufenen Ungleichgewicht von Steroidhormonen. Dies kann veranschaulicht werden, indem man den in der vorstehend beschriebenen Weise behandelten Tieren exogene Östrogene verabreicht. Wenn speziell Östradiol Ratten, die mit den Verbindungen A, B oder C behandelt worden sind (am Tag 2 bis 6 der Befruchtung), subkutan an den Tagen 4 und 5 nach der Befruchtung in einer Dosis von nur 0,1 tig (gelöst in Sesamöl) verabreicht wird, findet die Implantation bei drei von acht Tieren statt, wobei im wesentlichen nur lebensfähige Embryos entstehen. Der Wirkungsmechanismus der Verbindungen gemäß der Erfindung kann somit als Prozess erklärt werden, der das richtige Gleichgewicht der Steroide in den Fortpflanzungsorganen verhindert und hierdurch die nachgewiesene Unfähigkeit zur Fortpflanzung bewirkt.

Die Verbindungen gemäß der Erfindung können somit verwendet werden, um die Ovulation bei nicht geschlechtsreifen Warmblütern zu verhindern und ihren Eintritt in den Fortpflanzungszyklus zu verzögern. Sie können verwendet werden, um die Reifung der Eier zu verzögern und hierdurch eine Herde oder Gruppe von Tieren hinsichtlich der Befruchtung und des Werfens auf einen bestimmten Zeitpunkt abzustimmen. Die Verbindungen können nach der Ovulation verwendet werden, um die Implantation zu verhindern. In beiden Fällen wird die Fortpflanzung verhindert. Die Verbindungen können auch verwendet werden, um die Befruchtung durch Auslösung vorzeitiger Ovulation zu verhindern, und um die Implantation der Eier zu hemmen, bevor sie sich in der Schleimhaut des Uterus

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eingenistet haben, oder um danach eine abortive Wirkung auf den Embryo auszuüben. Die vorstehend genannte höhere Dosierung ist nur für die orale Verabreichung erforderlich, weil nur ein verhältnismäßig geringer Teil effektiv in den Blutstrom eintritt. Die niedrigeren Dosierungen eignen sich für alle parenteralen Verabreichungen. Die Verbindungen gemäß der Erfindung sind besonders gut für die Verwendung in Suppositorien oder für die intravaginale Verabreichung geeignet.

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Claims (5)

Patentansprüche

1) Mittel für die Verhinderung der Fortpflanzung von
weiblichen Warmblütern, enthaltend das Nonapeptid
L-pGlu-L-His-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-X-L-Leu-L-Arg-L-Pro-NH-CpH₅, worin X die zweiwertige, optisch aktive
D-Form von Tryptophan, Tyrosin oder Phenylalanin ist.

2) Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X die zweiwertige, optisch aktive D-Form von Tryptophan oder Tyrosin ist.

3) Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X für D-Tryptophan steht.

4) Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X für D-Tyrosin steht.

5) Mittel nach Anspruch 1 bis 4, enthaltend zwischen 5 und 100 mg des Nonapeptids.

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