DE3108323A1

DE3108323A1 - Oxytocin-derivat

Info

Publication number: DE3108323A1
Application number: DE19813108323
Authority: DE
Inventors: Per Olof Ragnar 21621 Malmö Melin
Original assignee: Ferring AB
Current assignee: Ferring AB
Priority date: 1980-03-24
Filing date: 1981-03-05
Publication date: 1981-12-24
Also published as: FR2482093A1; CH646139A5; GB2074582A; SE8002222L; US4402942A; GB2074582B; IT8120684A0; DE3108323C2; NL8101191A; BE887970A; FR2482093B1; IT1136574B; JPS56150050A; SE430885B

Description

Die Erfindung bezieht sich auf neue Oxytocin-Derivate, und zwar 1-Desamino-(2-O-alkyltyrosin)-oxytocin, mit inhibierender Wirkung auf Gebärmutterkontraktionen. Diese neuen Oxytocin-Derivate haben eine inhibierende Wirkung auf vasopressin- und oxytocininduzierte Gebärmutterkontraktionen in vitro und in vivo (Mensch und Ratte) und auch auf das spontane Kontraktionsmuster der Gebärmutter.

Die erfindungsmässigen Oxytocin-Derivate unterscheiden sich von dem natürlichen Hormon Oxytocin dadurch, dass der Wasserstoff in der Hydroxylgruppe des Tyrosins durch Alkyl ersetzt ist, und dass das Cystein in Stellung 1 desaminiert ist. Somit haben die vorliegenden Oxytocin-Derivate die Formel

Mpa - Tyr(X)-Ile - GIn - Asn - Cys - Pro - Leu - GIy - NH_?

ι , _j

wo Mpa ein 3-Mercaptopropionylrest (-S-CH₂-CH₂-CO-) und X eine Alkylgruppe ist, die den Wasserstoff in der

Hydroxylgruppe (—(( )}—OX) des Tyrosins ersetzt, wobei

X eine niedrige Alkylgruppe mit 2-4 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Äthyl, ist. Die Alkylgruppe kann also aus Äthyl, Propyl oder Butyl bestehen. Alkylgruppen mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen können ebenfalls in Frage kommen, dürften aber die Inhibierung vermindern.

Die folgenden strukturell naheliegenden Oxytocin-Derivate sind beschrieben worden und besitzen angeblich eine antagonistische Wirkung gegenüber oxytocininduzierte Gebärmutterkontraktionen:
2-O-Methyltyrosin-oxytocin und 2-O-Xthyltyrosin-oxytocin

(J. Rudinger & I. Krejci, Antagonists of the Neurohypophysical Hormones. Handbook of Experimental Pharmacology,

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Vol. .23, (1968), S. 748-301. Ed B. Berde, Berlin, Heidelberg & New York: Springer Verlag), Na-Acetyl-2-O-methyltyrosin-oxytocin (SE-PS 7 007713) und /Ί-Desaminopenicillamin,2-O-methyltyrosin/oxytocin (j. Lowbridge et al. Journal of Medicinal Chemistry, 22:, (1979), S. 565-569.

Es sei betont, dass diese früheren Versuche nur an Ratten ausgeführt wurden. Soweit bekannt ist, sind keine Versuche mit Oxytocin-Derivaten an Menschen bezüglich inhibierende Wirkungen ausgeführt worden. Es konnte nun festgestellt werden, dass die Peptide gemäss der vorliegenden Erfindung eine inhibierende Wirkung auf die Gebärmuttermuskulatur schwangerer bzw. nichtschwangerer Frauen haben. Versuche mit Geweben nichtschwangerer Frauen haben überraschenderweise gezeigt, dass die erfindungsmässigen Oxytocin-Derivate auch imstande sind, vasopressininduzierte Kontraktionen zu inhibieren. Von besonderem Interesse ist, dass die vorliegenden Oxytocin-Derivate das spontane Kontraktionsmuster der Gebärmutter inhibieren, worüber früher niemals berichtet worden ist.

Bis jetzt hat ein von Nebenwirkungen freies Arzneimittel gefehlt, welches imstande ist, exzessiven Muskelkontraktionen in der Gebärmutter entgegenzuwirken. Die heute bekannten Therapeutika mit dieser Wirkung sind ß-Rezeptor-Agonisten, Prostaglandin-Synthese-Inhibitoren, Calcium-Antagonisten und Äthanol. Sämtliche diese Mittel haben nichtspezifische Wirkungen und erzeugen somit Nebenwirkungen.

Die erfindungsmässigen Verbindungen sind deshalb von grossem klinischem Interesse in Fällen von zu frühen Wehen oder exzessiven Krampfzuständen in der Gebärmutter bei Geburten und Menstruationen (partus praeinaturus, dysmenorrhoea) ·

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Die die Erfindung kennzeichnenden Merkmale sind in den Patentansprüchen angeführt.

Die erfindungsmässigen Oxytocin-Derivate können zweckdienlicherweise in physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst durch Injektion, Infusion oder Inhalierung verabreicht werden.

Die erfindungsmässigen Verbindungen können in Analogie mit in der Technik wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. Im folgenden Beispiel ist eine repräsentative Verbindung gemäss der Erfindung, und zwar l-Üesamino-2-0-äthyltyrosin-oxytocin, gemäss den Angaben von H.B. Law & V. Du Vigneaud, Journal of the American Chemical Society, 8i2, (1960), S. 4579-4581, und den Angaben von A.L. Zhuze, K. Jolt, E. Kasafirek & J. Rudinger, Collection of Czechoslovak Chemical Communications, !29_, (1963), S. 2648-2662, abgeändert gemäss L.-E. Larsson, G. Lindeberg, P. Melin & V. Pli"§ka, Journal of Medicinal Chemistry, 2J₁, (1978) , S. 352-356, hergestellt worden. Diese Arbeiten sind hier durch Hinweis einbezogen.

Im Beispiel werden die folgenden Abkürzungen gebraucht:

Cbz = Carbobenzyloxygruppe

BzI = Benzylgruppe

Mpa = 2-Mercaptopropionylgruppe

ONp = p-Nitrophenylestergruppe

DMF = Dimethylformamid
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BEISPIEL

1,0 g Cbz-IIe-Gln-Asn-Cys-Bzl-Pro-Leu-Gly-NH₂ (von Ferring AB, Malmö, Schweden) wurde mit 30 ml HBr und 20 ml HOAc deblockiert und während 48 h mit 477 mg Cbz-Tyr-(A'thyl)-ONp in 7 ml DMF in Gegenwart von N-Äthyldiisopropylamin gekuppelt. Das Produkt wurde mit Wasser

gefällt. Die Fällung wurde mit Wasser, Äthanol, Aceton sowie Äthylacetat gewaschen und aus Essigsäure/Äthanol umkristallisiert. Somit erhielt man 0,93 g (79%) Cbz-Tyr(Äthyl)-Ile-Gln-Asn-Cys(BzI)-Pro-Leu-Gly-NH₂, welches eine homogene Dünnschicht in den Systemen n-Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:1 und n-Butanol/Essigsäure/ Pyridin/Wasser 15:3:10:6 aufwies.

0,44 g dieser Verbindung wurde wie oben deblockiert und mit 0,12 g Mpa(BzI)-ONp gekuppelt. Dies ergab 0,337 g (75%) Mpa(Bzl-Tyr(Ätyl)-Ile-Gln-Asn-Cys(BzI)-Pro-Leu-Gly-NH₂/ welches eine homogene Dünnschicht in denselben Systemen wie oben aufwies.

0,3 g der letztgenannten Verbindung wurde mit Natrium in 400 ml kondensierten, natriumgetrockneten Ammoniaks deblockiert und in 350 ml Wasser (angesäuert mit Essigsäure) gelöst. Dies ergab eine trübe Lösung, die filtriert und mit Äther (2 χ 100 ml) extrahiert wurde. Das pH wurde auf 7,4 eingeregelt, und 0,01 M K₃Fe(CN)₆ (15 ml) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde während 20 min umgerührt und angesäuert, wonach es auf Chloridionenaustauscher Dowex-50 (von Dow Chemical Co, The Midland, Mich., USA) entfärbt und schliesslich gefriergetrocknet wurde.

Das gefriergetrocknete Material wurde auf Sephadex G-15^ (1,4 χ 140 cm Kolonne) in 50% (Vol/Vol) Essigsäure/Wasser entsalzt. Das Material in der Hauptfraktion wurde mit Wasser verdünnt und gefriergetrocknet. Die Sephadex-Materialien sind Dextrangele, die von Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden, erhältlich sind.

Die Hauptkomponente wurde auf Sephadex G-25^V (Superfine) (1,6 χ 90 cm) in 0,05 M Ammoniumacetat pH 5,0 gelfiltriert. Die Hauptfraktion wurde gespült und gefriergetrocknet.

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Der Rest wurde in n-Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:1 gelöst und auf Sephadex LH-20^ in diesem System chromatographiert. Das Material wurde eingedämpft, in Wasser gelöst und gefriergetrocknet.
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Dieses gefriergetrocknete Material wurde schliesslich noch ein weiteres Mal in derselben Weise wie oben gelfiltriert.

Somit erhielt man 8 mg l-Desamino-2-O-äthyltyrosin-oxytocin. Die Reinheit des Produkts wurde durch Dünnschichtchromatographie auf Zelluloseplatten in den Systemen n-Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:5 (obere Phase) und n-Butanol/Essigsäure/Pyridin/Wasser 15:3:10:12 kontrolliert.

Das Produkt war auch homogen auf HPLC Kolonne ja-Bondapak C-18 in 45% Äthanol und 55% 5mM Trifluoressigsäure in Wasser. Die genannte Kolonne wurde von Waters Associates, Inc., Millford, Mass., USA, geliefert. Aminosäureanalyse:

Asp: 1,02, GIu: 1,03, GIy: 0,98, He: 0,97, Leu: 0,99, Tyr: 0,75; Tyr(Äthyl) gibt keine vollständige Hydrolyse zu Tyr.

Die bekannten Verbindungen 2-0-Methyltyrosin-oxytocin und 2-0-Äthyltyrosin-oxytocin sowie eine repräsentative Verbindung gemäss der Erfindung, und zwar 1-Desamino-(2-0-äthyltyrosin)-oxytocin, wurden in bezug auf utero-.tonische Potenz auf isoliertem Rattenuterus unter Verwendung von Oxytocin als Standard untersucht. Auch die antagonistischen Eigenschaften der Verbindungen wurden mit Hilfe von diesem Präparat ausgewertet, jedoch auch in vivo unter Verwendung von Oxytocin als Agonist. Ausserdem wurde die Inhibierung der Oxytocin-Einwirkung auf isoliertes Human-Myometrium \mter sucht.

In vitro Versuche

Sprague Dawley Ratten (Körpergewicht etwa 250 g) in natürlichem Oestrus wurden mit Hilfe von Vaginalausstrichen gewählt. Ein etwa 20 mm langes Segment wurde vom Mittelteil eines Uterushorns entfernt und in einem Organbad montiert, das 10 ml einer modifizierten Locke's Lösung der Zusammensetzung mM:NaCl 153, KCl 5,63, CaCl₂ 0,541, NaHCO₃ 5,95 und Glucose 2,78 enthielt. Die Lösung wurde mit 5% CO₂ in Sauerstoffgas bei 30°C gegast. Die Uteruskontraktionen durften sich während 30 min stabilisieren. Die Kontraktionen wurden isometrisch bei einer Belastung von 1,5 g mit Hilfe eines Grass-Spannungsgebers (Ft. 03) registriert. Die antagonistische Potenz der Analoge wurde als deren pA_- Werte bestimmt (J. Rudinger & I. KrejTSi, Experientia 18, (1962), S. 585-588). pA₂ ist ein Mass der inhibierenden Eigenschaft des Peptids und wird von Schild (H.0. Schild, British Journal of Pharmacology, 2, (1947), S. 189-206) als der negative Logarithmus der molaren Konzentration eines Antagonisten definiert, der die Wirkung einer Agonistendosis um die Hälfte reduziert.

Von 17 Patienten, an denen Kaiserschnitte ausgeführt worden waren (Woche 37-40) erhielt man ein transversales Segment des Uterusgewebes vom Isthmusteil der Gebärmutter. Gewebestücke wurden auch von der ventralen Seite des Uterus von 21 nichtschwangeren Frauen im fertilen Alter zubereitet, die wegen Hysterektomie operiert waren. Gewebestücke wurden sofort in die Krebs-Ringer-Lösung (mM: NaCl 118, KCl 4,6, CaCl₀ 2,5, MgSO. 1,15, NaHCO, 24,9, ο KH₂PO₄ 1,15 und Glucose 5,5) bei 0 C gelegt und innerhalb von 2 h nach der Operation benutzt. Segmentstücke 25 χ 3 χ 3 mm wurden in einem 10 ml Krebs-Ringer-Lösung enthaltenden Organbad bei 37°C angebracht und mit 5% CO₂ in Sauerstoffgas gegast. Nach einer Adaptionszeit von 30 min wurden die Kontraktionen isometrisch bei einer

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Belastung von 1,25 g registriert. Bei den an schwangeren Frauen angestellten Versuchen wurde Oxytocin (0,013-1,3 ug/ml) als Agonist benutzt. Für die Gewebeproben von nichtschwangeren Frauen wurde Lysin-Vasopressin (0,07-1,3 ug/ml) als Agonist benutzt. Eine geeignete Dosis Agonist wurde gewählt, die eine Wirkung entsprechend etwa 40% der maximalen Dosis ergab. Der Antagonist wurde in einer Konzentration von 0,33-1,32 pg/ml benutzt. Die Wirkung auf das Myometriumgewebe im Verhältnis zum Agonisten wurde stets am Anfang und am Ende eines Versuchs kontrolliert. Nachdem die Wirkungen des Peptids abgeklingt waren, wurde das Gewebe mit 3 χ 10 ml Pufferlösung gewaschen. Die inhibitorische Wirkung des Antagonisten wurde während 15 min nach Zusatz des Peptids planimetrisch als die Gesamtfläche unter der registrierten Kurve gemessen. Die Inhibierung wurde als Prozent der ausschliesslich mittels des Agonisten erhaltenen Wirkung ausgedrückt.

In vivo Versuche

Sprague Dawley Ratten (250 g) in natürlichem Oestrus wurden mit Inaktin (0,5 mg/100 g Körpergewicht i.p.) betäubt. Die Aktivität des Myometriums wurde mit Hilfe eines in der üteruskavität fixierten und mit modifizierter Locke's Lösung gefüllten Katheters gemessen. Der Katheter wurde an einen Statham P23d Druckgeber angeschlossen, und die Kontraktionen wurden an einem Grass-Polygraphen (Modell 7D) registriert. Oxytocin wurde intravenös infundiert (0,05 ^g/min/100 g Körpergewicht). Nachdem ein regelmässiges Kontraktionsmuster erhalten worden war, wurde der Antagonist (0,8-8,0 )ig/100 g Körpergewicht) intravenös in einem Volumen von 0,2 ml verabreicht. Die gemessene Kurve wurde während 10 min unmittelbar vor und nach.der Injektion des Antagonisten integriert.

Versuchsergebnisse

An den in vitro Versuchen mit Ratten konnte festgestellt

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werden, dass 2-O-Methyltyrosin-oxytocin und 2-O-Äthyltyrosin-oxytocin eine uterotonische Potenz der Grössenordnung 1-2 ΙΕ/mg aufwiesen. Dagegen hatte das vorliegende 1-desaminierte Analog keine messbare agonistische Aktivität.

Sämtliche untersuchten Derivate führten zu einer konkurrierenden Inhibierung der Oxytocinwirkung, berechnet anhand von deren pA~-Werten gemäss der untenstehenden Tafel. (Es sei hier erwähnt, dass in verschiedenen Labors erhaltene pA~-Werte nicht vergleichbar sind, weil die Versuchsbedingungen niemals äquivalent sind.)

TAFEL

Oxytocin-Derivate wurden hinsichtlich der antagonistischen Aktivität an Uteruspräparaten (in vitro) von Ratten getestet. Die Präparate waren mit Oxytocin stimuliert.

	pA₀ (Mittel	Anzahl
. Derivat	+ mittlerer	Versuche
	Fehler)
; 2-O-Methyltyrosin-oxytocin	; 6,68+0,12	(12)
2-O-A'thyltyrosin-oxytocin	7,13 + 0,09	( 8)
• l-Desamino-2-O-A'thyltyrosin-
oxytocin	I 7,19 + 0,10 I t »	( 5)

Aus dieser Tafel geht hervor, dass die getesteten Verbindungen ähnliche und ziemlich hohe Werte von pA«, aufweisen. Es leuchtet ein, dass die Desaminierungin Stellung 1 der Peptidkette die Inhibitoraktivität bei Versuchen mit isoliertem Rattenuteruspräparat nicht signifikant verändert, jedoch - wie oben erwähnt - die Agonistenwirkung

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verschwinden lässt.

Die in vitro Versuche mit Uterusgewebe von schwangeren Frauen haben gezeigt, dass das erfindungsmässige Oxytocin-Derivat oxytocininduzierte Kontraktionen stark hemmt. Eine solche Wirkung wurde bei einem Dosisverhältnis Antagonist : Agonist von zwischen 3 und 5 erreicht, d.h. es trat eine Inhibierung der oxytocinstimulierenden Kontraktionen ein, als die Konzentration des Inhibitors im Vergleich mit Oxytocin um 3-5 Male grosser war. Die Hemmung zeigte sich vor allem in einer Minderung des Tonus und der Kontraktionsfrequenz der Gebärmuttermuskulatur. Eine vollständige Blockierung der Oxytocin- und Vasopressinwirkungen auf schwangere bzw. nicht schwangere Human- Gebärmutter trat bei einer Dosis des Oxytocin-Derivats ein, die etwa um 5 Male höher war als die Agonistendosis. Mit 2-O-Äthyltyrosin-oxytocin erhielt man eine signifikante Hemmung, die jedoch bedeutend niedriger war als für die erf indungsmässige Verbindung. Die Wirkungen waren reversibel. Für die bekannte Verbindung N^a-Acetyl-2-O-methyl-tyrosin-oxytocin trat bei einem Mengenverhältnis von 15:1 bis 20:1 eine vollständige Inhibierung von Oxytocin ein, also eine um ein vielfaches höhere Konzentration als bei der vorliegenden Erfindung«

Bei den in vivo Versuchen an Ratten mit den erfindungsmässigen Oxytocin-Derivaten, 2-O-Methyltyrosin-oxytocin und 2-O-Äthyltyrosin-oxytocin erfolgte eine dosisabhängige, reversible Hemmung derjenigen Steigerung der Gebärmutterkontraktionen, die durch die Infusion von Oxytocin (0,05 ug/min/100 g Körpergewicht) verursacht worden ist. Dabei konnte festgestellt werden, dass das vorliegende Analog ein bedeutend wirksamerer Inhibitor als die beiden bekannten Analoge war. Bemerkenswert war, dass das Oxytocin-Derivat in einer Dosis von 2 ug imstande war, das Kontraktionsmuster der Gebärmutter völlig zu blockieren (im

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Gegensatz zu 2-O-Äthyltyrosin-oxytocin und 2-O-Methyltyrosin-oxytocin, welche diese Fähigkeit nicht besassen), und also nicht nur die von Oxytocin initiierten Kontraktionen, sondern auch die spontane Muskeltätigkeit des Organs. Letztere Beobachtung ist mit aller Wahrscheinlichkeit nicht mit einer Wirkung auf den Kreislauf verbunden, da das Analog in einer so hohen Dosis wie 30 ug intravenös überhaupt keine Wirkung auf den Blutdruck hatte. Dieses Ergebnis ist ausserordentlich überraschend, da man früher nicht imstande gewesen ist> die spontanen Kontraktionen der Gebärmutter zu hemmen. In der obengenannten SE-PS 7007713 ist ausdrücklich gesagt, dass N^a-Acetyl-2-O-methyltyrosin-oxytocin keine Einwirkung auf die spontane Gebärmutterfunktion hat.

Klinische Versuche an vier freiwilligen Frauen Die Einwirkung von 1-Desamino-(2-O-äthyltyrosin)-oxytocin (dEtOx) auf das Gebärmutterkontraktionsmuster von vier Frauen wurde gemäss der von M. j&kerlund, L.P. Bengtson und U. Ulmsten in "Recording of myometric action in the non-pregnant human uterus by a micro transducer", Acta Obstet. Gynecol. Scand., Vol. 57, S. 429-433, 1978, beschriebenen Methode studiert, welche Arbeit hier durch Hinweis einbezogen wird. In vier verschiedenen Versuchen an drei normalen Frauen bei früher Menstruation wurde der Druck in der Gebärmutter mittels eines in der Gebärmutterkavität fixierten Mikroumwandlers (PC 350, Millar Instruments, Huston, USA) kontinuierlich registriert. Die Frauen erhielten eine kontinuierliche Infusion von Lysinvasopressin, 0,08 ug/min, um die Kontraktionen der Gebärmuttermuskel zu stimulieren. Dann wurden einmalige Dosen von 5-25 ug dEtOx pro Frau intravenös verabreicht. -Amplitude und Frequenz des Gebärmutterkontraktionsmusters wurden zu im wesentlichen denselben Werten wie vor der Infusion von 5 Lysinvasopressin gehemmt. Diese Wirkung schwankte zwischen den verschiedenen Frauen und war von der Grössenordnung

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45-180 min.

An einer Frau mit starken spontanen Menstruationsschmerzen wurde eine einmalige Injektion von dEtOx probiert. Frühere Studien haben eine erhöhte Plasmakonzentration von Vasopressin bei Frauen mit diesen Beschwerden gezeigt (M. Äkerlund, M.L. Forsling, P. Strömberg "Primary dismenorrhoea and vasopressin", Br. J. Obstet. Gynecol. 86:485, 1979 und P. Strömberg, M.L. Forsling,

M. Äkerlund "Vasopressin levels in women with primary dismenorrhoea before and after treatment with a prostaglandin synthesis inhibitor", Obstet. Gynecol, in press). Nach intravenöser Zufuhr von 10 ug dEtOx empfand die Frau eine ausgesprochene Schmerzlinderung, gleichzeitig wie ihre normale Gesichtsfarbe zurückkehrte und sie weniger geplagt aussah.

Herstellung einer pharmazeutischen Komposition 1 mg Oxytocin-Derivat und 10 mg Mannitol wurden gefriergetrocknet und in eine Ampulle eingebracht, die versiegelt wurde. Zur intravenösen Verabreichung wurde der Ampulleninhalt mit isotonischer, physiologischer Kochsalzlösung zur Konzentration 10 ug Oxytocin-Derivat pro 1 ml Lösung verdünnt.

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Claims

Ferring AB
Soldattorpsvägen 5
S-216 13 MALMÖ
Schweden

Oxytoc in-Derivat

Patentansprüche :

(1.1 Oxytocin-Derivat, gekennzeichnet durch die Formel

Mpa - Tyr(X)-Ile - GIn - Asn - Cys - Pro - Leu - GIy - NH₂

wo Mpa ein 3-Mercaptopropionylrest und X eine Alkylgruppe mit 2-4 Kohlenstoffatomen ist, die den Wasserstoff in der Hydroxylgruppe des Tyrosins ersetzt.
2. Oxytocin-Derivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass X üthyl ist.
3. Pharmazeutische Komposition, dadurch gekennzeichnet, dass sie zumindest ein Derivat nach Anspruch 1 als aktiven Bestandteil in Kombination mit

pharmazeutisch annehmbaren Zusatzmitteln und/oder Ver-JB/BS dünnungsmitteln umfasst.

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4. Pharmazeutische Komposition nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie physiologische Kochsalzlösung als pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel und Mannitol als Zusatzmittel umfasst.
5. Anwendung eines Oxytocin-Derivats nach Anspruch 1 oder 2 bei der Herstellung von Arzneimitteln.
6. Verfahren zur Entgegenwirkung exzessiver Muskel-

kontraktionen in der Gebärmutter, dadurch gekennzeichnet, dass eine pharmazeutische Komposition, die eine wirksame Menge von zumindest einem Derivat nach Anspruch 1 enthält, verabreicht wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die wirksame Menge 5-25 ug beträgt.