NL8101191A

NL8101191A - Oxytocine derivaat; farmaceutisch preparaat; werkwijze voor het tegengaan van spiercontracties van de uterus.

Info

Publication number: NL8101191A
Application number: NL8101191A
Authority: NL
Original assignee: Ferring Ab
Priority date: 1980-03-24
Filing date: 1981-03-11
Publication date: 1981-10-16
Also published as: US4402942A; FR2482093B1; GB2074582A; SE8002222L; DE3108323C2; CH646139A5; BE887970A; DE3108323A1; IT1136574B; SE430885B; GB2074582B; JPS56150050A; FR2482093A1; IT8120684A0

Description

$ * % VO 1700

Oxytocine derivaat; farmaceutisch preparaat; Werkwijze voor het tegengaan van snier contract! es van de uterus.__—

De uitvinding heeft betrekking op nieuwe oxytocine derivaten, namelijk 1 -deamino-(2-0-alkyl-tyrosine)-oxytocine, welke een inhibitoire werking op de uterus-eonir acties hebben. Meer in het bijzonder hebben deze nieuwe oxytocine derivaten een inhibitdre werking op vasopressine 5 en oxytocine geïnduceerde uterus-contracties in vitro en in vivo (mens en rat) alsmede op het spontane contractie patroon van de uterus.

De oxytocine derivaten volgens de uitvinding verschillen van het natuurlijke hormoon oxytocine doordat de waterstof in de hydroxylgroep van het tyrogine vervangen is door alkyl en dat het cysteine op positie 10 1 gedeamineerd is .De betrokken oxytocine derivaten hebben derhalve de formule:

Mpa - Tyr(X)-Ile - Gin - Asn - Cys - Pro - Leu- Gly - HH_ 1 - I _ *- waarin Mpa een 3-mercaptopropionyl groep (-S-CHg-CHg-CO-) is en X een alkylgroep is, die de waterstof in de hydroxylgroep / \

15 HöH

van het tyrosine vervangt, in welk geval X een lage alkylgroep met 2 - b koolstofatomen, bij voorkeur ethyl is. De alkylgroep kan derhalve ethyl, propyl of butyl zijn. Alkylgroepen met 5 of 6 koolstof atomen zijn ook denkbaar, maar verminderen vermoedelijk de inhibitie.

20 De volgende structureel nauw verwante oxytocine derivaten zijn beschreven en hebben naar verluid een antagonistische werking op oxytocine geïnduceerde uterus contracties: 2-0-methyltyrosine-oxytocine en 2-0-ethyltyrosine-oxytocine (Rudinger, J. & Krejci, I. Antagonists of the Heurohypophysical Hormones, Handbook 25 of Experimental Pharmacology, Vol. 23, (1968), biz. 7½ - 801. Ed.B.

Berde, Berlin, Heidelberg & Hew York: Springer Verlag), Ha-acety1-2-0--methyltyrosine-oxytocine (Zweeds octrooi 7713/70 publikatie Ho. 353.531), en [l-deaminopenicillamine, 2-0-methyltyrosine]oxytocine (J. Lowbridge et al, Journal of Medicinal Chemistry 22, (1979), biz. 5Ö5 - 569)· 30 Opgemerkt wordt, dat deze eerdere studie*s alleen voor ratten zijn uitgevoerd. Voor zover bekend heeft nog niemand oxytocine derivaten op menselijk materiaal met betrekking tot inhibitore werkingen onderzocht. Bij het doen van de onderhavige uitvinding zijn inhibitore werkingen van peptiden op het uterus-spierstelsel van een zwangere respec-35 tievelijk een niet-zwangere vrouw beproefd en gevonden. Het was opmerkelijk dat de oxytocine derivaten volgens de uitvinding ook vasopressine geïnduceerde contracties konden inhiberen wanneer proeven werden uitge- 8101 191 ί * voerd met veefsel van een niet-zwangere vrouw. Van bijzonder groot belang is dat de oxytocine derivaten volgens de uitvinding het spontane contractie patroon van de uterus ihhiberen, iets wat nog niet eerder is beschreven.

5 Tot op heden bestond geen medicijn dat vrij was van secondaire effecten en in staat was om overmatige spiercontracties in de uterus tegen te gaan. Heden ten dage bekend zijnde therapeutica met deze werking zijn 3-receptoragonisten, prostaglandine synthese inhibitoren,calcium antagonisten en ethanol. Al deze middelen hebben niet specifieke wer-10 kingen en geven derhalve secondaire effecten.

De verbindingen volgens de uitvinding zijn daarom van aanzienlijke klinische betekenis in gevallen van voortijdige weeën of buitensporige spasmen in de uterus in verband met bevalling en menstruatie (partus praematurus, dysmenorrhoea).

15 Doel van de uitvinding is een oxytocine derivaat met de formule

Mpa - Tyr(x) - lie - Gin - Asn - Cys - Pro-Leu -Gly - NH,, waarin Mpa eën 3-mercaptopropionyl groep en X een alkylgroep met 2 - k koolstofatomen die de waterstof in de hydroxylgroep van het tyrosine vervangt, voorstellen, te verschaffen.

20 In het oxytocine derivaat met bovenstaande formule kan X ethyl zijn.

Een ander doel van de uitvinding is om een farmaceutisch preparaat te verschaffen, dat tenminste een oxytocine derivaat als actieve ingrediënt bevat in combinatie met farmaceutisch aanvaardbare toevoegingen 25 en/of verdunningsmiddelen.

Weer een ander doel van de uitvinding is om een farmaceutisch preparaat te verschaffen, dat een fysiologische zoutoplossing als farmaceutisch aanvaardbaar verdunningsmiddel en mannitol als toevoeging omvat.

Weer een ander doel van de uitvinding is om oxytocine derivaten 30 te gebruiken bij de bereiding van medicijnen.

Een ander doel van de uitvinding is om een werkwijze te verschaffen voor het tegengaan van buitensporige spiercontracties van de uterus, waarbij een farmaceutisch preparaat werd' toegediend, dat een effectieve hoeveelheid van tenminste een oxytocine derivaat bevat.

35 Een ander doel van de uitvinding is om een werkwijze te verschaf fen waarbij de effectieve hoeveelheid oxytocine derivaat 5-25^ug is.

De oxytocine derivaten volgens de uitvinding kunnen bij voorkeur worden toegediend opgelost in een fysiologische zoutoplossing door injectie, infusie of inhalering.

8101191 __ ΐ * -3-

De verbindingen volgens de uitvinding kunnen worden "bereid op een wijze, die analoog is aan op zichzelf "bekende werkwijzen. In de volgende voorbeelden is een representatieve verbinding volgens de uitvinding namelijk 1-deamino-2-0-ethyltyrosine-oxytocine, bereid overeenkomstig 5 wat beschreven is door Law, H.B. & Du Vigneaud, V. in Journal of the American Chemical Society 82, (i960) 1*579 - 1+581, Zhuze, A.L., Jost, K, . Kasafirek, E. & Rudinger, J. in Collection of Czechoslovak Chemical Communications 2£, (1963), 261*8 - 2662, en gemodificeerd door Larsson, L. -E., Lindeberg, G., Melin, P. & Pliska, V. in Journal of Medicinal 10 Chemistry 21, (1978), 352 - 356. Deze publikaties worden hierin begrepen geacht.

In het volgende voorbeeld is gebruik gemaakt van de volgende afkortingen:

Cbz = carbobenzyloxygroep 15 Bzl * benzylgroep

Mpa * 2-mercaptopropionylgroep ONp = p-nitrofenylestergroep DMF = dimethylf ormami de 20 Voorbeeld.

1,0 g Cbz-Ile-Gln-Asn-Cys-Bzl-Pro-Leu-Gly-NHp (van Ferring AB, 3 ^3

Malmo, Sweden }werd gedeblokkeerd met 30 cm Hbr en 20 cm HOAc en gedu-

O

rende 1*8 uur gekoppeld met 1*77 mg Cbz-Tyr-(ethyl)-0Bp in 7 cm DMF, bij aanwezigheid van N-ethyl-diisopropylamine. Het produkt werd met water 25 geprecipiteerd. Het precipitaat werd met water, ethanol, aceton en ethyl-acetaat gewassen en uit azijnzuur/ethanol herkristalliseerd. Aldus werd 0,93 g(79 %) Cbz-Tyr(ethyl)-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-KH^verkregen, dat een homogene dunne laag vertoonde in de systemen n-butanol/azijnzuur/ water 1* : 1 : 1 en n-butanol/azijnzuur /pyridine /water 15 : 3 : 10 : 6.

30 0,1*1* g van deze verbinding werd gedeblokkeerd zoals boven beschre ven en gekoppeld met 0,12 g Mpa(Bzl)-0Hp. pit leverde 0,337 g (75 %)

Mpa(Bzl)-^rr(ethyl)-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-ïïïïg dat een homogene dunne laag vertoonde in het zelfde systeem als boven.

0,3 g van de laatst vermelde verbinding werd gedeblokkeerd met na-3 35 trium in 1*00 cm gecondenseerd, natrium-gedroogd ammoniak en opgelost in 2 350 cm water (aangezuurd met azijnzuur). Dit gaf een troebele oplossing 3

die gefiltreerd werd en met 2 x 100 cm ether werd geëxtraheerd. De pH

o werd op 7,1* ingesteld en 15 cm 0,01 M K^FeiCIi)^ werd toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 20 minuten geroerd en aangezuurd, waarna het ont- 8101 191 -Μ -4- kleurd werd op chloride-i onenuitwi s s elaar Dowex- van Dow Chemical Company, The Midland, Michigan, USA) en werd gevriesdroogd.

Het gevriesdroogde materiaal werd ontzout op Sephadex G-15® (kolom 1,4 x 140 cm) in 50 vol/vol % azijnzuur/wat er. De hoofdfractie werd ver-5 dund met water en gevriesdroogd. De Sephadex-materialen waren dextran-gelen, geleverd door Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Zweden.

De hoofdcomponent werd gelfiltreerd op Sephadex G- 2|P^ (Superfine) (1,6 x 90 cm) in 0,05 M ammoniumacetaat, pH 5,0. De hoofdfractie werd uitgespoeld en gevriesdroogd.

10 De rest werd opgelost in n-hutanol/azijnzuur/water 4:1:1 CÈ?) en chromatografisch "behandeld op Sephadex 111-20^ in dit systeem. Het materiaal werd verdampt, opgelost in water en gevriesdroogd.

Het gevriesdroogde materiaal werd uiteindelijk nog een keer op dezelfde wijze als hoven beschreven gelfiltreerd.

15 Aldus werd 8 mg 1-deamino-2-0-ethyltyrosine-oxytocine verkregen.

De zuiverheid van het produkt werd gecontroleerd met de dunnelaagchroma-tografie op celluloseplatai in de systemen n-hutanol/azijnzuur/water 4:1:5 (bovenste fase) en n-butanol/azijnzuur/pyridine/water 15 : 3 : 10 : 12.

20 Het produkt was ook homogeen op een HPCL-kolom^u-Bondapak C-18 in 45 % ethanol en 55 % 5®M trifluorazijnzuur in water. Deze kolom werd geleverd door Waters Associates, Inc., Millford, Mass., USA. Aminozuur-analyse: Asp: 1,02, Glu: 1,03, Gly: 0,98, Ile: 0,97, Leu: 0,99, Tyr: 0,75; Tyr(ethyl) gaf geen volledige hydrolyse tot Tyr.

25 De bekende verbindingen 2-0-methyltyrosine-oxytocine en 2-0-ethyl- tyrosine-oxytocine en een representatieve verbinding volgens de uitvinding, namelijk 1-deamino-(2-0-ethyltyrosine)-oxytocine, werden onderzocht op uterotonische sterkte bij geïsoleerde ratuterus onder toepassing van oxytocine als standaard. De antagonistische eigenschappen van de ver-30 bindingen werden eveneens geëvalueerd met behulp van genoemd preparaat, maar ook in vivo onder toepassing van oxytocine als agonist. Bovendien werd de inhibitie van oxytocine-werking op geïsoleerd menselijk myometrium onderzocht.

In vitro experimenten.

35 Sprague Dawley ratten (lichaamsgewicht ongeveer 250 g) in natuur lijke bronst werden door vaginale strijkjes geselecteerd. Een segment met een lengte van ongeveer 20 mm werd gesneden uit het midden van een 3 - .

uterushoorn en geplaatst in een orgaanbad dat 10 cm van een gemodificeerde Locke-oplossing met de volgende samenstelling bevatte (mM:NaCl 153, &101 191 -5- KC1 5,63, CaClg 0,541, KaHC03 5,95 en glucose 2,78). De oplossing werd begasd met 5 % COg in zuurstof bij 30°C. De uteruscontracties liet men gedurende 30 minuten stabiliseren. De contracties werden isometrisch opgenomen bij een rustspanning van 1,5 ë onder toepassing van Grass 5 force transducers (Ft. 03). De antagonistische sterkte van de analoga werd berekend als pA^-waarden (Rudinger, J.& Krejci, X. Experientia 18, (1962), 585 - 588) -pAg is een maat voor de inhibitie-eigenschap van het peptide en werd gedefinieerd door Schild (Schild, H.O., British Journal of Pharmacology, 2, (1947), 189 - 20β) als de negatieve logarithme van 10 de molaire concentratie van een antagonist, die de invloed van een dosis agonist tot die van de halve dosis vermindert.

Van 17 patiënten die een keizersnede ondergingen (wéét 37 - 4o) werd een dwarssegment van uterusweefsel gesneden uit het isthmisch gedeelte van de uterus. Weefselstukken werden ook gesneden uit de centrale 15 kant van de uterus van 21 niet-zvangere vrouwen van vruchtbare leeftijd die hysterectomy ondergingen. De weefselstukken werden onmiddellijk in een Krebs-Ringer oplossing geplaatst (mM: NaCl 118, KC1 4,6, CaCl^ 2,5,

MgSO^ 1,15, NaHCO^ 24,9, KHgPO^ 1,15 en glucose 5,5) "bij 0°C en binnen twee uur na de operatie gebruikt. Segmentstukken met sfldetingen yan 25 x 3 3 20 x 3 mm werden gebracht in een orgaanbad, dat 10 cm Krebs-Rmger-oplos-sing bij 37°C bevatte en begasd met 5 % 00^ in zuurstof. Na een aampas-singsperiode van 30 minuten, werden contracties isometrisch opgenomen bij een rustspanning van 1,25 g· In experimenten bij zwangere vrouwen

Q

werd oxytocine (0,013 - 1,3,ug/cm ) als agonist gebruikt. Lysine-vaso- 3/ 25 pressine (0,07 - 1,3^ug/cm ) werd als agonist gebruikt wanneer niet-zwanger weefsel werd onderzocht. Een geschikte dosis agonist werd geselecteerd, die een effect gaf dat overeenstemde met ongeveer 40 % van het maximale effect. De antagonist werd gebruikt in een concentratie van 0,33 - 1,32yUg/cm . De responsie van het myometriale weefsel op de ago-30 nist werd steeds aan het begin en aan het einde van een experiment gecontroleerd. Wanneer de effecten van het peptide waren verdwenen, werd o het weefsel met 3x10 cm bufferoplossing gewassen. De inhibit ore werking van de antagonist werd door planimetrie gedurende 15 minuten na de toevoeging van het peptide van het totale oppervlak van de opgenomen 35 kromme gemeten. De inhibitie werd uitgedrukt als percentage van het effect, dat verkregen werd met de agonist alleen.

In vivo experimenten.

Sprague Dawley ratten (250 g) in natuurlijke bronst werden ver- 8101 191 __

V

-6- doofd met inactine (0,5 mg/100 g lichaamsgewicht intraperitoneaal). De myometriale activiteit werd opgenomen met "behulp van een catheter die bevestigd was in de uterusholte en gevuld was met gemodificeerde Locke-oplossing. De catheter werd verbonden met een Statham P23d transducer 5 en contracties werden opgenomen op een Grass polygraaf (model 7D). Oxy-tocine werd door intraveneuze infusie toegediend (0,05^ug/min/100 g lichaamsgewicht). Wanneer een regelmatig contractiepatroon verkregen was, werd de antagonist (0,8 - 8,0/Ug/100 g lichaamsgewicht) intraveneus toe-gediend m een volume van 0,2 cm . De opgenomen kromme werd over mter-10 vallen van 10 minuten onmiddellijk voor en na de injectie van de antagonist geïntegreerd.

Resultaten.

Met de rat in vitro experimenten kon worden vastgesteld, dat 2-0-methyItyro s ine-oxyt o cine en 2-0-ethyltyrosine-oxytocine een uterotonische T5 sterkte in de orde van grootte van 1-2 IU/mg vertoonden. Anderzijds hadden de respectievelijke 1-deamineerde analoga geen meetbare anagonis-tische activiteit.

Alle onderzochte derivaten veroorzaakten een competitieve inhibitie van het oxytocine effect, beoordeeld naar hun pA^-waarden volgens 20 onderstaande tabel, (in dit verband kan worden opgemerkt, dat in verschillende laboratoria verkregen pAg-waarden niet vergelijkbaar zijn vanwege de nooit equivalente proefomstandigheden.) TABEL.

Oxytocine derivaat werd onderzocht met betrekking tot antagonistische 25 activiteit op ratuterus-preparaten (in vitro) gestimuleerd met oxytocine.

Derivaat pA^ (gemiddelde aantal + gemiddelde fout) experimenten 30 2-0-methyltyrosine-oxytocine 6,68 0,12 (12) 2-0-ethyltyrosine-oxytocine 7,13 i 0,09 (8) 1-deamino-2-0-ethyltyrosine- -oxytocine 7,19 + 0,10 (5) 35 Bovenstaande tabel toont dat de onderzochte verbindingen verge lijkbare en nogal hoge pA^-waarden bezitten. Het is duidelijk dat de deaminering op positie 1 van de peptideketen de 'ijhitifcor activiteit in proeven aan geïsoleerde ratuterus-preparaten niet significant verandert, 8101191 -7- * wifts-r anderzijds - zoals bovenstaand vermeld - verdwijnen van het agonist-effect veroorzaakt.

Uit de in vitro experimenten aan uterusweefsel van zwangere vrouwen is gebleken dat het oxytocine derivaat volgens de uitvinding in hoge 5 mate oxytocine geïnduceerde contracties belemmerde. Een dergelijk effect werd verkregen bij een dosis-verhouding antagonist : agonist van 3 tot 5» dat wil zeggen inhibitie van de oxytocine gestimuleerde contracties trad op wanneer de concentratie van de inhibitor 3 tot 5 keer zo groot was als die van oxytocine. De inhibitie verscheen hoofdzakelijk als een ver-10 mindering van de spiertonus en contractiefrequentie van de uterus. Een complete blokkering van de oxytocine en vasopressine-effecten bij een zwangere respectievelijk niet-zwangere menselijke uterus trad op bij een dosis van het oxytocine derivaat, die ongeveer 5 keer zo hoog was als de agonist dosis. Met 2-0-ethyltyrosine-oxytocine werd een signifi-15 cante inhibitie verkregen, die echter aanzienlijk lager was dan bij gebruik van de verbinding volgens de uitvinding. De effecten waren reversibel. Yastgesteld werd voor de bekende verbinding Na-acetyl-2-0-methyl-tyrosine-oxytocine dat een volledige inhibitie van oxytocine optrad bij een hoeveelhedenverhouding van 15 J 1 tot 20 : 1, derhalve bij een vele 20 malen hogere concentratie dan die volgens de uitvinding.

Bij de rat in vivo experimenten met het oxytocine derivaat volgens de uitvinding, 2-0-methyltyrosine-oxytocine en 2-0- ethyltyrosine-oxy-tocine trad een dosis afhankelijke reversibele inhibitie van de toename van de sterkte van de uterus contracties op, welke veroorzaakt waren door 25 infusie van oxytocine (0,05^ug/min/100 g lichaamsgewicht). Vastgesteld kon worden, dat het gebruikte analogon aanzienlijk actiever was als inhibitor dan de twee bekende analoga. Het was opmerkelijk, dat het oxytocine derivaat in een dosis van 2^ug het uteruscontractiepatroon volledig kon blokkeren (in tegenstelling tot 2-0-ethyltyrosine-oxytocine 30 en-2-0-methyltyrosine-oxytocine die dit vermogen ontbeerden), derhalve niet alleen de contracties die door oxytocine werden geïnitieerd, maar ook de spontane spieractiviteit van het orgaan. Deze laatste waarneming is naar alle waarschijnlijkheid niet gekoppeld aan enig effect op de circulatie , omdat het analogon in een zo hoge dosis als 30^ug intraveneus 35 geen enkele invloed op de bloeddruk had. Dit resultaat is buitengewoon verrassend, wanneer men bedenkt dat men er niet eerder toe in staat is geweest om de spontane contracties van de uterus te belemmeren. In het bovenvermelde Zweedse octrooi 7713/70 is uitdrukkelijk vermeld dat N -acetyl-2-0-methyltyrosine-oxytocine geen invloed heeft op de spontane 8101 191 __ -8- uterusfunctie.

Klinische experimenten o~p vier vrouweli.ike vrijwilligers.

Het effect van 1-deamino-(2-Q-ethyltyrosine)-oxytocine (dEtOx) op het uteruscontractiepatroon van vier vrouwen werd onderzocht volgens de 5 methode, die beschreven is door Skerlund M., Bengtson L.P. en Ulmsten U. in "Recording of myometric action in the non-pregnant human uterus by en micro transducer". Acta Obstet. Gynecol. Scand., Vol 57» blz. lj-29 - ^33, 1978, welke publikatie hierin begrepen wordt geacht.

In vier verschillende proeven bij drie normale vrouwen onder 10 vroege menstruatie werd de druk in de uterus continu opgetekend met een micro transducer (PC 350, Millar Instruments, Houston, USA) die in de uterusholte was bevestigd. De vrouwen werd continu een infuus toegediend met lysine vasopressine, 0,08^ug/min, om de spiercontracties van de uterus te stimuleren. Daarna werd een enkelvoudige dosis van 5 - 25^ug 15 dEtOx intraveneus aan elke vrouw toegediend. De amplitude en frequentie van het uteruscontractiepatroon werden geïnhibeerd tot over het geheel dezelfde waarde als voor het lysine vasopressine infuus. Dit effect varieerde tussen de verschillende vrouwen en duurde U5 - 180 minuten.

Een enkele injectie van dEtOx werd onderzocht bij een vrouw, die 20 leed aan een hevige spontane menstruatiepijn. Eerdere studie’s hebben een verhoogde plasmaconcentratie van vasopressine getoond in vrouwen, die aan dergelijke pijnen leden.(Skerlund M, ForslirgM., Stromberg P, "Primary dysmenorrhoea and vasopressin", Br. J. Obstet. Gynecol. 86 : U85, 1979, en Stromberg P, Forsling M, Skerlund M. "Vasopressin levels in 25 women with primary dysmenorrhoea before and after treatment with a prostaglandin synthesis inhibitor", Obstet. Gynecol., nog te publiceren. Na intraveneuze toevoer van 10^ug dEtOx voelde de vrouw een uitgesproken verlichting van de pijn, terwijl tegelijkertijd haar normale kleur terugkwam en ze er minder gekweld uitzag, 30 Bereiding van farmaceutische •preparaten.

1 mg oxytocine derivaat en 10 mg mannitol werden gevriesdroogd en in een ampul gebracht, die werd afgesloten. Voor intraveneuze toediening werd de inhoud van de ampul verdund met een isotonische zoutoplossing . . . 3 tot een concentratie van 10^ug oxytocine derivaat per 1 cm oplossing.

8101191

Claims

1. Oxytocine derivaat met de formule Mpa - Tyr(X) - lie - Gin - Asn - Cys - Pro - Leu- Gly - NH^ vaarin Mpa een 3-mercaptopropionylgroep is en X een alkylgroep is met 2 - k koolstof atomen, die de waterstof in de hydroxylgroep van het tyro-5 sine vervangt. 2. ' Oxytocine derivaat volgens conclusie 1, waarin X ethyl is.

3. Farmaceutisch preparaat, dat tenminste een derivaat volgens conclusie 1 als actieve ingredient omvat in combinatie met farmaceutisch aanvaardbare toevoegingen en/of vefrdunningsmiddelen.

10 Farmaceutisch preparaat volgens conclusie 3, dat een fysiologische zoutoplossing als farmaceutisch aanvaardbaar verdunningsmiddel en mannitol als toevoeging omvat.

5· Toepassing van oxytocine derivaat volgens conclusie 1 of 2 bij de bereiding van medicijnen.

6. Werkwijze voor het tegengaan van buitensporige spiercontracties van de uterus, waarbij een farmaceutisch preparaat dat een effectieve hoeveelheid van tenminste 1 derivaat volgens conclusie 1 bevat, wordt toegediend.

7· Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij de effectieve hoeveelheid 20 5 - 25yUg bedraagt. 8101 191