KR102417762B1 - 펜타펩타이드 및 그 용도 - Google Patents

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KR102417762B1
KR102417762B1 KR1020210158732A KR20210158732A KR102417762B1 KR 102417762 B1 KR102417762 B1 KR 102417762B1 KR 1020210158732 A KR1020210158732 A KR 1020210158732A KR 20210158732 A KR20210158732 A KR 20210158732A KR 102417762 B1 KR102417762 B1 KR 102417762B1
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pentapeptide
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KR1020210158732A
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김해진
문은정
이철민
한윤희
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주식회사 엔솔바이오사이언스
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Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N-말단이 아세틸화되어 이루어진 펜타펩타이드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염과 그 용도를 제공한다. 본 발명에 의한 펜타펩타이드는 안정하고, 항암제 내성 억제, 종양세포에서 자가포식 억제, 면역증진, 면역세포활성화, 항-종양 면역 반응 촉진, 및/또는 항암에 효과적이다.

Description

펜타펩타이드 및 그 용도{A penta-peptide and use thereof}
본 발명은 펜타펩타이드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 개량된 펜타펩타이드와 그 용도에 관한 것이다.
펩타이드로 암과 같은 질병을 치료하는 기술에 관한 연구가 이루어지고 있다(국제특허출원공개공보 제WO 2017/014604 A1호 등 참조). 본 발명자들은 이와 같은 펩타이드에 대한 연구를 진행하던 중 예상할 수 없었던 개량의 필요성에 대해 인식하게 되었다.
국제특허출원공개공보 제WO 2017/014604 A1호, 2017.1.26, 명세서
본 발명이 해결하고자 하는 하나의 과제는 개량된 펜타펩타이드를 제공하고자 하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 하나의 과제는 개량된 펜타펩타이드의 신규 용도를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명자들은 서열번호 1의 아미노산 서열(QLHLD)로 이루어진 펩타이드에 대하여 안정성 면에서 개량의 필요성에 대해 인식하고 연구한 결과, 안정성 면에서 우수할 뿐만 아니라, 놀랍게도 종래 예상할 수 없던 활용성을 갖는 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열(QLHLD)로 이루어진 펩타이드의 N-말단이 아세틸화되어 이루어진 펜타펩타이드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 제공한다.
상기 아미노산 서열의 Q는 글루타민(Glutamine; Gln), L은 류신(Leucine; Leu), H는 히스티딘(Histidine; His), D는 아스파르트산(Aspartate; Asp)을 나타낸다.
상기 펩타이드를 구성하는 아미노산에는 L-체, D-체, DL-체가 존재하며, 본 발명의 펩타이드를 구성하는 아미노산은 이들을 모두 포함한다.
상기 펩타이드는 변이체를 포함하는 것으로, 자연적 변이 또는 인공적 변이에 의하여 주요 활성에 변화를 주지 않으면서 상기 펩타이드 구조의 일부가 변이된 것을 포함한다.
상기 약학적으로 허용가능한 염은 예를 들어, 염산염, 황산염, 인산염, 초산염, 트리플루오로아세트산염, 구연산염, 주석산염, 숙신산염, 젖산염, 말레산염, 푸마르산염, 옥살산염, 메탄술폰산염, 파라톨루엔술폰산염, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 또는 칼슘염 등을 들 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염의 의약 용도, 바람직하게는 항암제 내성 억제용도, 종양세포에서 자가포식 억제 용도, 면역증진용도, 면역세포활성화 용도, 항-종양 면역 반응 촉진용도, 및/또는 항암용도를 제공한다. 항암용도는 암 치료 또는 예방 용도를 포함하는 의미이며, 치료는 증상의 개선, 경감 등을 포괄하는 의미이고, 예방은 질병 이전 단계에서 질병으로 발전되는 것의 억제를 포괄하는 의미이다.
상기 암은 전이성 암일 수 있다.
상기 암은 유방암, 전립선암, 림프종 및 폐암 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 항암은 다른 항암제 내성 억제, 다른 항암제 항암작용 보조, 종양세포에서 자가포식 억제, 면역증진, 면역세포활성화, 항-종양 면역 반응 촉진, 종양세포 사멸 촉진, 또는 종양세포 증식억제 중에서 선택된 하나 이상에 의할 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는, 항암제 내성 억제용 약학조성물을 제공한다.
상기 항암제 내성은 항암제 민감성 감소를 포함한다.
상기 항암제는 상기 유효성분을 제외한 다른 항암제일 수 있다.
상기 항암제는 항암화학요법제 또는 면역항암제일 수 있다.
상기 항암제 내성 억제는 암에 대한 항암제 내성 억제를 포함한다.
상기 항암제 내성 억제는 종양세포에서 자가포식 활성 억제 또는 면역세포 활성화에 의할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는, 종양세포에서 자가포식 억제용 약학조성물을 제공한다.
상기 약학조성물은 암세포의 자가포식 활성을 억제하는 자가포식 억제제(autophagy inhibiting agent)일 수 있다.
상기 자가포식 억제는 세포보호성 오토파지(protective autophagy) 억제를 포함한다.
상기 자가포식 억제는 LC3-II 단백질 발현 억제에 의할 수 있다.
상기 유효성분은 암세포에서 활성화된 자가포식을 억제하여, 암 진행을 억제할 수 있다.
항암제 투여시, 암세포 내에서 세포내 자가소화작용인 오토파지가 활성화된 결과, 항암제에 의해 손상된 세포소기관과 분해산물들이 활성화된 오토파지에 의해 암세포의 대사산물로 재사용됨으로써, 오히려 세포사멸을 막고 암세포의 증식을 가져와 항암제에 대한 내성을 얻게 될 수 있으므로, 상기 유효성분에 의한 자가포식 억제에 의해 항암제 내성 억제도 가능하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는, 면역증진용 약학 조성물을 제공한다.
상기 면역증진은 종양세포 내 면역세포활성화에 의할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는, 면역세포활성화용 약학조성물을 제공한다.
상기 면역세포는 자연살생세포 또는 세포독성 T 세포일 수 있다.
상기 약학조성물은 면역세포활성화제(immune cell activator)일 수 있다.
상기 약학조성물은 자연살생세포활성화제(natural killer cell activator)일 수 있다.
상기 면역세포활성화에 의해, 종양세포 내 세포살해인자 발현 촉진, 종양세포 내 면역세포(예, 자연살생세포) 매개 라이시스 촉진, 종양세포사멸, 및/또는 항종양이 가능하다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는, 항-종양 면역 반응 촉진용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는, 항암용 약학조성물을 제공한다.
상기 유효성분은 다른 항암제와 병용투여용일 수 있다.
상기 다른 항암제는 항암화학요법제 또는 면역항암제일 수 있다.
상기 항암화학요법제(anti-cancer chemotherapeutics)는 파클리탁셀 또는 독소루비신 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 면역항암제(cancer immunotherapy)는 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor)일 수 있다.
상기 면역관문억제제는 항-PD-L1(anti-PD-L1) 또는 항-PD-1(anti-PD-1) 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 유효성분은 상기 다른 항암제와 동시 또는 순차로 투여할 수 있다.
상기 유효성분은 상기 다른 항암제 투여 후 24시간 이후 투여할 수 있다.
상기 유효성분은 상기 다른 항암제 투여 후 48±12시간 이내 투여될 수 있다.
상기 유효성분은 0.8~2000mg/kg 함량으로 투여될 수 있다.
상기 유효성분은 1주에 1~7회 투여될 수 있다.
상기 유효성분은 주사로 투여될 수 있다.
상기 다른 항암제는 2~20mg/kg 함량으로 투여할 수 있다.
상기 항암용 약학 조성물은 다른 항암제의 항암작용을 보조하기 위한 항암용 약학 조성물일 수 있다.
상기 보조는 상기 다른 항암제로 인한 내성 또는 부작용을 억제하거나 상기 항암제의 항암작용을 촉진하는 것일 수 있다.
상기 항암용 약학 조성물은 다른 항암제로 인한 자가포식을 억제하거나 면역세포의 면역 활성 증진을 위한 항암용 약학조성물일 수 있다.
상기 면역세포의 면역 활성 증진은 상기 유효성분에 의한 면역세포의 그랜자임 발현 증진일 수 있다.
상기 약학조성물은, 약제학적으로 허용되는 첨가제를 더 포함하고, 본 발명의 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염 및 상기 첨가제로 이루어질 수 있다.
본 발명의 펜타펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드의 N-말단을 아세틸화하여 제조할 수 있다. 우선, 서열번호 1의 펩타이드는 펩타이드 결합을 형성하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 용액상 합성 또는 고체상 합성 등의 방법에 의해 제조할 수 있다. 펩타이드 결합을 형성하기 위한 방법의 예는 아실아지드법 , 아실하라이드법, 아실이미다졸법, 카르보디이미드 법, 포스포니움법, 무수물법, 혼합무수물법, 산화-환원법, 및 Woodward 시약 K 를 사용하는 방법 등이 있다. 축합 반응을 수행하기 전에, 반응에 관여하지 않은 카르복실기, 아미노기 등을 보호시킬 수 있고, 축합 반응에 관여하는 카르복실기 등을 당 분야에 공지된 방법으로 활성화시킬 수 있다. 카르복실기를 보호하는 기의 예는 메틸, 티-부틸, 아릴, 펜타플루오로페닐, 벤질, 파라-메톡시벤질, 또는 메톡시에톡시메틸 같은 에스테르-형성기를 들 수 있다. 아미노기를 보호하는 기의 예는 트리틸카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 시클로헥실옥시카르보닐, 트리클로로에틸옥시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 티-부톡시카르보닐, 및/또는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 등을 들 수 있다. 카르복실기의 활성 형태의 예는 혼합무수물, 아지드, 아실클로라이드 또는 활성 에스테르[알코올 (예를 들어, 펜타클로로페놀, 2,4-디니트로페놀, 시아노메틸알코올, p-니트로페놀, N-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복실이미드, N-히드록시숙신이미드, N-히드로옥시프탈아미드, 또는 1-히드록시벤조트리아졸)과의 에스테르] 등을 들수 있다. 펩타이드 결합을 형성하기 위한 축합 반응에 사용할 수 있는 용매는 벤젠, 톨루엔, 헥산, 아세톤, 니트로 메탄, 시클로 헥산, 에테르, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸슬폭시드, 피리딘, 디옥산, 테트라히드로푸란, 물, 메탄올, 또는 에탄올 등의 단일 용매 또는 이들의 혼합용매일 수 있다.반응 온도는 반응에 일반적으로 사용되는 약 -70℃~100℃의 범위일 수 있고, 보다 바람직하게는 -30℃~30℃의 범위일 수 있다. 펩타이드 보호기를 제거하는 반응은 보호기의 종류에 따라 다르지만, 펩타이드 결합에 아무런 영향을 주지 않고 보호기를 이탈시킬 수 있는 산화합물, 염기화합물, 또는 전이금속 등을 이용하여 제거할 수 있다. 보호기를 산처리 예를 들어, 염화 수소, 브롬화수소, 플루오르화수소, 아세트산, 메탄술폰산, 트리플루오로메탄 술폰산, 트리플루오로아세트산, 트리메틸클로로실란, 또는 이들의 혼합물로 처리함으로써 제거시킬 수 있다. 상기 산처리로 보호기를 제거하는 반응을 수행할 때, 아니솔, 페놀 및 티오아니솔 등을 보조제로 첨가하여 반응을 촉진시킬 수 있다. 보호기를 염기처리 예를 들어, 암모니아, 디에틸아민, 히드라진, 몰포린, 엔-메틸피롤리딘, 피페리딘, 탄산나트륨, 또는 이들 염기의 혼합물을 이용하여 제거할 수 있다. 또한, 보호기를 전이금속처리 예를 들어, 아연, 수은, 팔라듐/수소 등을 이용하여 제거할 수 있다.
한편, 펩타이드의 N-말단 아실치환체는 활성 아실유도체를 사용하여 알려진 방법으로 형성할 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1의 펩타이드의 N-말단을 아세틸화하기 위한 아세틸화 반응 시약을 이용할 수 있다. 아세틸화 반응 시약은 아세트산 무수물, 아실할라이드 류(예, 아세틸클로라이드, 아세틸브로마이드, 아세틸아이오다이드) 등이다. 또한, 아세트산과 직접 축합하여 아세틸기를 펩타이드의 N-말단에 도입할 수 있음은 물론이다.
또한, 통상적인 펩타이드 정제 방법 예를 들어, 추출, 층 분리, 고체침전, 재결정 또는 컬럼 크로마트그래피에 의해 펩타이드를 정제할 수도 있다.
본 발명의 펜타펩타이드, 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염의 투여량은 비경구 투여시 대상이나 상태에 따라 달라질 수 있으나, 예를 들어 0.8~2000mg/kg일 수 있다. 그와 같은 범위에서, 종에 따라 투여량은 달라질 수 있다. 예를 들어, 마우스(체중 20g)에 대해 10 ~ 100mg/kg, 랫(체중 250g)에 대해 500 ~ 2000mg/kg, 개(체중 7kg)에 대해 40 ~ 400mg/kg, 사람(체중 60kg)에 대해 0.8 ~ 324.3mg/kg, 보다 구체적으로 2 ~ 8mg/kg의 투여량일 수 있다. 이와 같은 투여량에서 보다 안전하게 효과를 나타낼 수 있다. 이와 같은 투여량은 1회 기준일 수 있으며, 대상에 따라 1주 1 내지 7회 투여될 수 있다. 경구투여의 경우, 투여량은 비경구 투여량의 2 ~ 5배이다. 본 발명의 펜타펩타이드를 주로 비경구적인 방법으로, 예를 들면 국소주사, 정맥 또는 피하주사, 대뇌실내 또는 척수강내 투여, 혹은 경비투여 또는 직장내 투여로 투여한다. 또한, 경우에 따라 경구적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 펜타펩타이드 또는 조성물은 약학적으로 허용되는 첨가제와 함께 제제화하여 주사제, 좌제, 분말, 점비제, 과립, 정제 등의 형태로 만들 수 있다.
약학적으로 허용되는 첨가제는 당업자에게 잘 알려진 여러 가지 인자에 따라 적용될 수 있는데, 예를 들면 이용된 특정 생리활성물질, 이의 농도, 안정성 및 의도된 생체이용성; 치료하고자 하는 질환 및 질병 또는 상태; 치료받을 개체, 나이, 크기 및 일반적인 상태; 조성물을 투여하는데 이용되는 경로, 예를 들어 비강, 구강, 안구, 국소, 경피 및 근육 등의 요인을 고려해야 하나, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로 경구 투여 경로 이외의 생리활성물질 투여에 이용되는 약제학적으로 이용가능한 첨가제에는 D5W(물 중에서 5% 포도당), 덱스트로즈 및 생리학적 염을 용적의 5% 이내로 포함하는 수용액 등을 포함하며, 병소 내 국소주사의 경우 치료 효과를 증진시키고 지속시간을 증가시키기 위하여 여러 가지 주사가능한 하이드로겔(hydrogel)을 사용할 수 있다. 또한 약학적으로 이용가능한 첨가제는 보존제 및 항산화제와 같은 활성 성분들의 안정성을 보강시킬 수 있는 추가 성분들을 포함할 수 있다. 본 발명의 펜타펩타이드 또는 조성물은 해당분야의 적절한 방법으로 제조할 수 있으며, 널리 알려진 제제학 분야 서적 등에 개시되어 있는 방법을 참조하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 펜타펩타이드를 생리 식염수 용액으로 보관할 수 있고, 만니톨 또는 소르비톨의 첨가 후 앰플(ample)에 동결 건조시킬 수 있으며, 이것을 투여하기 위해 사용할 때는 생리 식염수, 주사용수 등에 용해시킬 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 개체에 투여하는, 항암제 내성 억제방법, 종양세포에서 자가포식 억제방법, 면역증진방법, 면역세포활성화 방법, 항-종양 면역 반응 촉진법, 및/또는 암 치료 및/또는 예방법을 제공한다. 상기 개체는 본 발명의 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 필요로 할 수 있다. 상기 개체는 인간을 포함하거나 인간을 제외할 수 있다. 상기 개체는 포유류일 수 있다. 상기 개체에 투여되는 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염은 유효량의 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염일 수 있다. 상기 투여는 다른 항암제와 동시 또는 순차 실시될 수 있다. 상기 개체는 항암제 내성이 발생한 개체일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염의 자가포식 억제제, 면역증진제, 면역세포활성화제, 항-종양 면역 반응 촉진제, 및/또는 항암제 제제 제조를 위한 용도를 제공한다.
별도의 언급이 없는 한, 본 발명의 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 염, 용도, 조성물, 방법에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일성 범위에서 서로 동일하게 적용된다.
본 발명에 의한 펜타펩타이드는 안정하고, 항암제 내성 억제, 종양세포에서 자가포식 억제, 면역증진, 면역세포활성화, 항-종양 면역 반응 촉진, 및/또는 항암에 효과적이다.
도 1은 보관온도 25℃에서, 실시예와 비교예에 대한 안정성 실험결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 보관온도 25℃에서, 실시예와 비교예에 대한 안정성 실험결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 보관온도 40℃에서, 실시예와 비교예에 대한 안정성 실험결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 보관온도 40℃에서, 실시예와 비교예에 대한 안정성 실험결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 동물실험에서 치료 후 경과일수에 따른 종양부피측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 동물실험에서 세포사멸 마커인 cleaved PARP 발현량 변화를 처리군별로 나타낸 그래프이다.
도 7은 동물실험에서 자가포식 마커인 LC3-II의 발현량 변화를 처리군별로 나타낸 그래프이다.
도 8은 동물실험에서 시료투여 후 시간에 따른 종양 부피 변화를 나타낸 그래프이다.
도 9는 동물실험에서 실험군별로 종양무게를 나타낸 그래프이다.
도 10은 동물실험에서 시료투여 후 시간에 따른 마우스 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 11은 항암효과 확인 실험에서 암세포 생존율을 실험군별로 나타낸 그래프이다.
도 12는 항암효과 확인 실험에서 실험군별로 Granzyme B 발현세기를 나타낸 그래프이다.
도 13은 항암효과 확인 실험에서 실험군별로 PARP대비 cleaved PARP 발현량 비율을 나타낸 그래프이다.
도 14는 항암효과 확인 실험에서 실험군별로 액틴대비 LC3II 발현정도를 나타낸 그래프이다.
도 15는 항암효과 확인 실험에서 배양시간에 따른 PC3 세포 생존율을 실험군별로 나타낸 그래프이다.
도 16은 항암효과 확인 실험에서 배양시간에 따른 A549 세포 생존율을 실험군별로 나타낸 그래프이다.
도 17은 항암효과 확인 실험에서 배양시간에 따른 MDA-MB-231 세포 생존율을 실험군별로 나타낸 그래프이다.
도 18은 항암효과 확인 실험에서 배양시간에 따른 PC3 세포 생존율을 실험군별로 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예 및 제조예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하나, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐으로 본 발명의 내용이 하기 실시예나 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예 등에서 사용한 시약, 재료는 시중에서 구할 수 있는 것으로, 최상품을 사용하였으며, 별도의 언급이 없는 한, Sigma-aldrich사에서 구입한 것을 사용하였다.
<실시예 1> N-말단이 아세틸화되어 이루어진 펜타펩타이드 제조
서열번호 1의 아미노산 서열(QLHLD)로 이루어진 펩타이드의 N-말단이 아세틸화되어 이루어진 펜타펩타이드를 Shanghai AmbioPharm, Inc (중국)에 의뢰하여 제조하였다. 구체적으로, 출발물질 H-Asp(OtBu)-2-ClTrt 고체레진(치환율: 0.63 내지 0.67 mmol/g)를 사용하여 표준 플로오레닐메틸옥시카르보닐 고체상 펩타이드 합성(Fmoc-SPPS) 방법으로 제조하였다.
우선, 잘 건조된 반응기에 출발물질인 H-Asp(OtBu)-2-ClTrt 펩타이드 레진 12.50g을 투입하고 엔,엔 디메틸포름아미드(DMF, 125ml, 10mL/g레진)를 투입하여 20분 동안 교반 하면서 레진을 팽윤시킨 다음, 여과하여 여과용액은 버리고 레진을 엔,엔 디메틸포름아미드(DMF, 75ml, 6mL/g 레진)로 두 번 세척 하였다.
또 다른 반응기에 Fmoc-Leu-OH(출발물질 당량대비 1.5당량) 및 하이드록시벤조트리아졸(HOBt, 출발물질 당량대비 1.5당량)를 투입하고 엔,엔 디메틸포름아미드(DMF, 출발물질 그램당 4.5mL)를 투입하여 용해 시킨 다음 디이소프로필에틸아민 (DIPEA, 출발물질 당량대비 1.5당량)를 첨가하였다. 반응 용액을 0-5℃로 냉각시킨 다음, 오-(벤조트리아졸-1일)-엔,엔,엔',엔'-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(HBTU, 출발물질 당량대비 1.5당량)를 첨가하여 아미노산 유도체를 활성화시켰다.
출발물질 펩타이드 레진이 포함된 반응기에 디클로로메탄(출발물질 1g당 1.5 mL)을 첨가, 교반하면서 다른 반응기에서 제조된 활성화된 아미노산 유도체 용액을 천천히 투입하였고 반응액 온도 10-30℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응확인은 닌히드린(Kaiser) 시험법을 사용하였다. 반응완료 후, 펩타이드 레진을 여과하였고 용매 엔,엔 디메틸포름아미드(DMF) 및, 메틸 티-부틸 에테르 (MTBE)로 각각 1회 세척후 다시 엔,엔 디메틸포름아미드(DMF)로 레진반응물을 2회 세척하였다. (75 ml, 6 mL/g 레진)
다음 플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc) 탈보호반응은 펩타이드 반응레진에 5% 피페리딘 혼합용액 (v/v/w/v:5% 피페리딘/1.25% DBU/1% HOBt/DMF)을 2회 (75ml, 6mL/g 레진, 10분 동안 교반 후 여과) 처리하여 탈보호 반응을 진행한 후, 여과하였고 여과된 펩타이드 반응레진을 용매 엔,엔 디메틸포름아미드(DMF) x 2회, 메틸 티-부틸 에테르 (MTBE) x 2회 및 엔,엔 디메틸포름아미드(DMF) x 2회(6 mL/g 레진)로 세척하였다. 플로오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 탈보호반응 확인은 닌히드린(Kaiser) 테스트로 확인하였다.
#3, #4, #5 아미노산 유도체에 대한 커플링 및 플로오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 탈보호 반응, 즉 #3 반응 Fmoc-His(Trt)-OH, #4 반응 Fmoc-Leu-OH, #5 반응 Fmoc-Gln(Trt)-OH를 사용하여 아미노산을 순차적으로 펩타이드 레진에 붙여서 커플링 및 플로오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 탈보호반응 사이클을 반복하여 Fmoc-Gln(Trt)1-Leu2-His(Trt)3-Leu4-Asp(OtBu)5-2-ClTrt 펩타이드 레진을 합성하였다. 단 #3 Fmoc-His(Trt)-OH 반응의 경우 엔,엔-디메틸포름아미드/디클로로메탄 (DCM/DMF) 에서 엔-히드록시벤조트리아졸/엔,엔-디이소프로필카르보디이미드로 커플링 반응을 실시하였다.
Fmoc-Gln(Trt)1-Leu2-His(Trt)3-Leu4-Asp(OtBu)5-2-ClTrt 펩타이드 레진의 엔-말단 플로오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)-기는 5% 피레리딘 혼합용매(v/v/w/v:5% 피페리딘/1.25% DBU/1% HOBt/DMF)를 첨가, 교반, 여과 및 세척 하여 플로오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)이 제거된 펩타이드 레진, H-Gln(Trt)1-Leu2-His(Trt)3-Leu4-Asp(OtBu)5-2-ClTrt 펩타이드 레진을 합성하였다.
이 후, 합성된 펩타이드 레진에 대해 N-말단 아세틸화 반응을 진행하였다. 구체적으로, 합성된 펩타이드 레진과 디클로로메탄/엔,엔 디메틸포름아미드(DCM/DMF) 용매(레진 그램당 1/3, v/v, 4-6mL), 초산무수물 (출발물질 당량 대비 1당량) 및 피리딘(출발물질 당량대비 10당량)의 용액을 투입하여 실온에서 2시간 동안 교반하여 아세틸화 반응을 실시하였다. 반응확인은 닌히드린(Kaiser) 시험법을 이용하여 아세틸화 반응이 완료된 것을 확인하였다. 반응 완료된 Ac-H-Gln(Trt)1-Leu2-His(Trt)3-Leu4-Asp(OtBu)5-2-ClTrt 펩타이드 레진을 용매 엔,엔-디메틸포름아미드(DMF) x 1회, 메틸 티-부틸 에테르(MTBE) x 1회, 엔,엔-디메틸포름아미드(DMF) x 3회, 메틸 티-부틸 에테르(MTBE) x 3회(6ml/레진 그램당) 세척하였고, 26℃에서 약 44.8시간 동안 진공 건조하여 21.42 그램의 펩타이드 레진을 수득 하였다. 수율은 출발물질 H-Asp(OtBu)-2-ClTrt 레진에 대한 중량 증가를 기준으로 109.5% 수득하였다.
또 다른 반응기에 탈보호기혼합용액 트리플루오르아세트산/트리이소프로필실란/디클로로메탄 (TFA/TIS/DCM: 55/5/40, v/v/v, 45ml, 펩타이드 레진 1g당 10mL) 혼합용액을 투입하고 온도를 0-5℃로 냉각시켰다. 냉각된 용액에 수득된 펩타이드 레진을 천천히 첨가하면서 반응액 온도를 17℃미만(최고 온도, 13.8 ~ 14.6℃)으로 유지하였다. 이어서, 반응액을 23-27℃로 승온하고 동 온도에서 90분 동안 교반하였다. 반응액은 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE) 필터를 이용하여 고체레진을 여과하고 트리플로오로아세트산(TFA)로 2회(펩타이드 수지 그램당 1.0 mL x 2회) 세척하여 여과액을 모두 취합한 다음, 취합된 여과액은 30℃ 이하에서 감압 하, 진공 농축하여 용매의 70~80%를 제거하였다. 농축 잔류물에 미리 냉각된 메틸 티-부틸 에테르(MTBE)용매(증발 잔류물의 부피에 대해 약 10배)를 첨가하여 조 펩타이드를 고체 침전물로 생성시켰다. 생성된 고체 침전물을 실온에서 1시간 동안 교반, 여과하고 냉각된 메틸 티-부틸 에테르(MTBE) (침전을 위한 MTBE의 50%) 용매로 5회 세척하였다. 여과된 조펩타이드를 24℃에서 약 30시간 동안 진공 건조하여 98.4% 탈보호 펩타이드 수율 및 91.3-97.5% HPLC 순도를 갖는 5.74g의 조펩타이드를 합성하였다.
정제를 위해, 조펩타이드 5.74g을 20ml의 정제수에 첨가하고 암모니아수 (NH3·H2O, 50 mL)를 천천히 적가하여 pH를 9.00 ±0.10으로 맞춰 조펩타이드를 용해 시켰고, 용액을 필터를 통해 여과하여 불용성 물질을 제거하였다. 조펩타이드 여과액을 C18 역상 수지로 패킹된 Prep RP-HPLC 컬럼에 로딩하였고, 물 아세토니트릴 혼합액을 사용하여 정제를 실시하였다.
정제 분획물의 용매를 제거하기 위해 온도 35-40℃ 에서 감압 하 농축하여 대부분의 아세토니트릴(AN) 용매를 제거하였다. 농축된 용액을 교반기로 교반하면서 실온에서 초산(AcOH)을 천천히 적가하여 pH를 4.00 ±0.10으로 조정 하였고 동온도에서 16시간 동안 교반하여 목적 펩타이드를 고체 침전물로 결정화시켰다. 결정화된 침전물은 여과하여 초산/물(AcOH/H2O, pH4.0) 용액으로 세척하였다. 세척된 고체를 정제수 50ml에 투입하여 균질한 슬러리를 제조하였고 동결건조기 트레이에 로딩하여 동결건조를 수행, 결과적으로 HPLC 순도 99.6%, 2.8g의 아세틸-큐엘에이치엘디(Acetyl-QLHLD) 펜타펩타이드를 백색 또는 미백색의 동결건조 형태의 화합물로 수득하였다. 합성된 펜타펩타이드의 분자량은 666.71이었다.
<비교예 1> 펩타이드 제조
국제특허출원공개공보 제WO 2017/014604 A1호에 개시된 펩타이드를 비교예 1로 준비하였다. 즉, 비교예 1의 펩타이드(QLHLD)를 애니젠㈜ (AnyGen Co., Ltd., 대한민국)에 의뢰하여 제조하였다. 구체적으로 플로오레닐메틸옥시카르보닐 고체상 펩타이드 합성법(Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis)에 의해 합성되었다. 보다 구체적으로, 고상수지(Wang레진; Sigma-aldrich사, 치환율 0.55 mmol/g)를 이용하여 아미노산의 C-말단을 고상 수지에 결합하는 방법으로 펩타이드를 합성하였다.
아미노산유도체 커플링(coupling) 반응은 오-(벤조트리아졸-1일)-엔,엔,엔',엔'-테트라메틸우로니움 헥사플루오로포스페이트(O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphate, HBTU)를 사용하였고 티-부틸(tert-butyl)과 티-부틸옥시카르보닐 그룹(tert-butyloxycarbonyl group)으로 보호된 아미노산 유도체들을 사용하였다. 반응완료 후, 보호기 제거(Deprotection)와 레진(resin)에서의 절단은 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)과 물을 95:5 (v/v) 비율로 혼합한 용액을 사용하여 실온에서 3시간 동안 실시하였다. 절단된 용액은 글래스 필터를 이용하여 여과하였고 여과액에 디에틸에테르 용매를 첨가하여 조펩타이드 침전물을 결정화 시켰다. 조(Crude)펩타이드 침전물을 여과하여 디에틸에테르(diethylether)로 반복하여 세척한 후 진공 건조하였다. 건조된 조펩타이드는 소량의 정제수에 녹인 후, C18 column (20 x 250 mm) 역상 고속액체 크로마토그래피(reverse-phase HPLC; RP-HPLC) 방법으로 정제를 실시 하였다. 정제 분리된 펩타이드 용액은 HPLC 순도를 확인하였고 목표 순도에 도달한 여액은 동결건조기를 사용하여 펩타이드 QLHLD를 합성하였다. 합성된 펩타이드(비교예 1)의 HPLC 순도는 97.6%, 분자량은 624.67이었다.
<실험예 1> 안정성 시험
실시예 1과 비교예 1에 대하여, 온도별 pH에 따른 안정성 시험을 실시하였다.
각 시료의 보관 조건은 표 1에 기재된 바와 같다. 표 1에서 액체 상태는 펩타이드가 버퍼에 완전히 용해된 상태(1mg/ml)인 것을 나타낸다.
보관상태 보관온도/습도 보관기간
비교예 1
액체상태
(pH2, pH5, pH7, pH9)
25±2℃/60±5%
40±2℃/75±5%
24시간, 130시간
실시예 1
각각의 펩타이드에 대한 안정성 시험은 분석 시점(초기, 24시간, 130시간)에 따라 온도 및 pH별로 액체크로마토그래피법 순도 분석에 의해 수행하였다. HPLC 분석조건은 표 2와 같고, 이동상은 0.1몰 인산이수소나트륨(0.1M NaH2PO4) 완충용액과 아세토나이트릴을 사용하였다. 샘플은 자동시료주입기를 사용하여 20ul를 주입해서 분석했고, 분석 칼럼은 Dikma사의 Inspire C18 (4.6×250mm, 5 μm, 12 nm), 분석온도는 40℃, UV 파장은 215 nm이었다.
Gradient
시간(분) 완충용액(0.1M NaH2PO4, %) 아세토니트릴(%)
0.0 88 12
30.0 68 32
30.5 20 80
35.0 20 80
35.5 88 12
40.0 88 12
HPLC 분석 결과로부터, 비교예 1과 실시예 1에 대해 보관조건별로 상대 순도(Relative Purity)를 산출하였다. 상대 순도는 각 시료에 대해 초기 순도를 100%로 설정한 후, 보관기간에 따른 상대적인 순도를 백분율로 구한 것이다. 그 결과를 표 3과, 도 1 내지 도 4에 나타내었다. 도 1과 도 2는 보관온도 25℃에서, 실시예와 비교예에 대한 안정성 실험결과를 나타내는 그래프{24시간 보관시 실험결과 그래프(도 1), 130시간 보관시 실험결과 그래프(도 2)}이고, 도 3과 도 4는 보관온도 40℃에서, 실시예와 비교예에 대한 안정성 실험결과를 나타내는 그래프{24시간 보관시 실험결과 그래프(도 3), 130시간 보관시 실험결과 그래프(도 4)}이다. 각 그래프에서 x축은 pH별 실험군을 나타내고, y축은 상대순도(%)를 나타낸다.
상대 순도(%)
보관조건: 25±2℃, RH 60±5% 보관기간(시간)
pH 시료 0 24 130
2 비교예 1 100.0 79.0 25.0
실시예 1 100.0 99.7 99.9
5 비교예 1 100.0 77.9 21.7
실시예 1 100.0 100.0 100.0
7 비교예 1 100.0 28.5 0.1
실시예 1 100.0 100.0 100.0
9 비교예 1 100.0 50.2 2.4
실시예 1 100.0 100.0 100.0
보관조건: 40±2℃, RH 75±5% 보관기간(시간)
pH 시료 0 24 130
2 비교예 1 100.0 27.6 0.3
실시예 1 100.0 99.4 95.8
5 비교예 1 100.0 21.8 0.1
실시예 1 100.0 100.0 100.0
7 비교예 1 100.0 0.2 0.0
실시예 1 100.0 100.0 100.0
9 비교예 1 100.0 8.5 0.0
실시예 1 100.0 99.9 99.8
표 3과, 도 1 내지 도 4에서와 같이, 비교예 1은 보관조건에 따라 안정성이 변동되고, 경우에 따라서는 안정성 확보가 쉽지 않은 것으로 나타났다. 그러나, 실시예 1은 보관조건에 관계 없이 대단히 안정한 것으로 나타났다. 특히, 고온에서 장시간 보관하는 경우, 비교예 1과 달리 실시예 1은 pH에 무관하게 높은 순도를 유지하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 펜타펩타이드는 적어도 비교예 1로부터 예상할 수 없는 현저한 효과를 나타내는 것으로 볼 수 있다.
<실험예 2> 항암화학요법제 내성 억제 및 항암 효과 확인
항암화학요법제 중 하나인 파클리탁셀에 내성을 나타내는 4T1세포를 이용하여, 실시예 1 펩타이드가 항암제 내성 억제를 나타내는지 여부를 확인하였다. 또한, 실시예 1 펩타이드가 항암 효과를 나타내는지 여부를 확인하였다.
2-1. 항암제 내성억제 효과 확인
파클리탁셀 내성을 나타내는 마우스 삼중음성유방암 종양세포인 4T1(ATCC, American Type Culture Collection)을 이식한 syngeneic 모델을 이용하여 세포사멸과 자가포식 마커 변화를 Western blot 방법으로 확인하였다. Balb/c 마우스(6주령, 암컷)의 팻패드(fat pad)에 4T1 세포 1 x 106 cell/head를 이식 후 종양부피가 70mm3가 되었을 때 약물투여를 시작하였다. 파클리탁셀 20mg/kg을 1일과 2일째 각각 투여하고 실시예 1의 펩타이드 (10, 100 mg/kg)를 3일, 5일, 7일에 각각 병용투여하는 방식으로, 1주차 진행하였다. 또한, 1주차와 연속된 2주차와 3주차 각각에 대해서도 1주차와 동일하게 진행하였다(n=3). 종양이 매우 빨리 자라기 때문에 매일 종양부피를 측정하였고 3주차 투여가 끝나는 다음날 부검 후 종양에서 세포사멸 마커인 cleaved PARP와 자가포식 마커인 LC3-II의 변화를 웨스턴 블롯을 이용해서 비교분석 하였다.
종양부피측정결과를 도 5에 나타내었다. 도 5는 동물실험에서 치료 후 경과일수에 따른 종양부피측정결과를 나타낸 그래프이다. 도 5에서 x축은 치료 후 경과일수를 나타내고, y축은 종양 부피 변화(mm3)를 나타낸다.
도 5에 나타난 바와 같이, 대조군 대비 파클리탁셀 단독군에서는 종양부피 감소는 미약했다. 실시예 1의 펩타이드 10mg/kg 병용투여군은 파클리탁셀 단독군 대비 20%의 종양부피 감소를 나타냈고, 100mg/kg 병용투여군은 파클리탁셀 단독군 대비 40%의 종양부피 감소를 보였다.
또한, 세포사멸 마커인 cleaved PARP 변화를 도 6에 나타내고, 자가포식 마커인 LC3-II의 변화를 도 7에 나타내었다. 도 6은 동물실험에서 세포사멸 마커인 cleaved PARP 발현량 변화를 처리군 별로 나타낸 그래프이고, 도 7은 동물실험에서 자가포식 마커인 LC3-II의 발현량 변화를 처리군 별로 나타낸 그래프이다.
도 6에 나타난 바와 같이, Cleaved PARP 발현량 비교 결과, 파클리탁셀 투여군 대비 실시예 1의 펩타이드 10, 100mg/kg 병용투여군에서 각각 2배, 3배 증가를 나타냈으며, 실시예 1의 펩타이드 100mg/kg 병용투여군에서 통계적 유의성을 나타냈다(p<0.05). 또한, 도 7에 나타난 바와 같이, LC3-II 발현량 비교 결과, 대조군 대비 파클리탁셀 단독군에서 2.4배 증가했고, 파클리탁셀 단독군 대비 실시예 1의 펩타이드 10, 100mg/kg 병용투여군에서 각각 30%, 86% 감소 했으며, 실시예 1의 펩타이드 100mg/kg 병용투여군에서 통계적 유의성을 나타냈다(p<0.05).
이와 같은 결과로부터, 항암제 내성을 나타내는 종양세포에 항암제와 실시예 1의 펩타이드를 병용투여시, 자가포식은 감소시키면서 항암제에 대한 내성은 억제됨을 알 수 있다. 또한, 실시예 1의 펩타이드 병용투여에 의해, 항암제의 세포사멸 효능을 증가시키고, 종양 성장을 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
2-2. 항암 효과 확인 I
파클리탁셀 투여 후 실시예 1의 펩타이드 병용투여 시 파클리탁셀 단독투여군보다 종양 성장을 더 저해할 수 있을지 여부를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다. 인간 삼중음성유방암 세포주 MDA-MB-231(ATCC, American Type Culture Collection) 5 x 106 cell/head를 마트리겔과 PBS를 1:1로 섞어서 100ul을 흉선누드마우스 암컷 7주령의 우측 3번째 팻패드에 이식하고 평균 종양크기 80mm3부터 약물 투여를 시작한다. 파클리탁셀 20mg/kg을 0, 1일째 각각 투여하여, 총 2회투여하고, 실시예 1의 펩타이드 100mg/kg을 2, 4, 6일째 각각 투여하여, 총 3회 투여한다. 종양부피는 주 3회 측정하고 첫 투여 후 3주간 측정하고, 실험종료 후 부검해서 종양무게를 측정한다. 각 군별 마우스는 10마리를 사용하였다.
개체별 종양부피 측정결과, 파클리탁셀 단독투여군은 2개체를 제외하고 투여 1주 후부터 꾸준히 종양부피가 증가하였고, 1개체는 16일째 종양이 사라졌다(CR=10%). 파클리탁셀과 실시예 1의 펩타이드 병용투여군은 첫 투여 후 2주차까지 종양부피 감소 또는 유지였고, 2개체는 14 일째 종양이 사라졌다(CR=20%).
또한, 각 군별로 시간에 따른 종양부피변화를 도 8에 나타내었고, 각 군별로 첫 투여 후 18일째 종양무게를 도 9에 나타내었다. 도 8은 동물실험에서 시료투여 후 시간에 따른 종양 부피 변화를 나타낸 그래프이다. 도 8의 x축은 투여 후 시간(일)을 나타내고, y축은 종양 부피(mm3)를 나타낸다. 도 9는 동물실험에서 실험군 별로 종양무게를 나타낸 그래프이다. 도 9의 x축은 실험군을 나타내고, y축은 종양무게(mg)를 나타낸다.
도 8에 나타난 바와 같이, 첫 투여 후 18 일째 종양부피 측정결과, 대조군 대비 파클리탁셀 단독투여군은 33% 감소했고, 파클리탁셀과 실시예 1의 펩타이드 병용투여군은 48% 감소하였다. 또한, 도 9에 나타난 바와 같이, 첫 투여 후 18 일째 종양무게 측정결과, 대조군 대비 파클리탁셀 단독투여군은 34.5% 감소했고, 파클리탁셀과 실시예 1의 펩타이드 병용투여군은 51% 감소하였다.
결론적으로, 파클리탁셀과 실시예 1의 펩타이드 병용투여에 의한 항암 효과를 확인 했으며, 1싸이클 약물처리의 지속효과는 최대 2주 정도 지속 되는 것으로 볼 수 있다.
2-3. 항암 효과 확인 II
파클리탁셀 단독투여군 대비 파클리탁셀과 실시예 1의 펩타이드 병용투여에 의한 생존율을 조사하기 위해 다음과 같이 실험하였다. 인간삼중음성유방암 세포주 MDA-MB-231 5 x 106 cell/head를 마트리겔과 PBS를 1:1로 섞어서 100ul을 Balb/c nude 마우스 암컷 7주령의 우측 3번째 팻패드에 이식하고 평균 종양크기가 70mm3부터 약물 투여를 시작한다. 파클리탁셀 20mg/kg을 주 1회투여하되, 파크리탁셀 투여 후 48시간 경과시 실시예 1의 펩타이드 100mg/kg을 48시간 간격으로 주 3회 피하투여한다. 각 실험군들은 12주간 투여하고 매일 실험동물의 생존을 관찰하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10은 동물실험에서 시료투여 후 시간에 따른 생존율을 나타내는 그래프이다. 도 10에서 x축은 투여 후 경과시간(일)을 나타내고, y축은 생존율(%)을 나타낸다. 도 10에서와 같이, 투여 21일에 파클리탁셀 단독 투여군에서 첫 사망 개체가 발생했고, 실시예 1의 펩타이드 병용투여군은 투여 60일에 첫 사망개체가 발생했다. 실험 종료 후, 파클리탁셀 단독 투여군은 30%, 실시예 1의 펩타이드 병용투여군은 50%의 생존율을 나타냈다.
이와 같은 결과로부터, 파클리탁셀 단독투여군 대비 파클리탁셀과 실시예 1의 펩타이드 병용투여에 의해, 암에 걸린 개체가 높은 생존율을 나타냄을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드에 의해 항암효과를 나타냄을 알 수 있다.
또한, 파크리탁셀과 같은 항암제 투여 후, 실시예 1의 펩타이드를 순차 투여하는 방식에 의해, 효과적으로 항암효과를 나타냄을 알 수 있다.
2-4. 항암 효과 확인 III
항암화학요법제인 독소루비신 단독투여군 대비 독소루비신과 실시예 1의 펩타이드 병용투여에 의한 세포생존율을 조사하기 위해 다음과 같이 실험하였다. 마우스 림프종 세포주 EL4 (ATCC) 8 x 103 cell을 96 well에 seeding하고 독소루비신 20nM, 실시예 1의 펩타이드 300 uM을 각 조건 별로 병용처리하였다. 배양 24시간 후, CCK-8 첨가를 통해 EL4 세포의 생존율를 측정하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11은 항암효과 확인 실험에서 배양시간에 따른 EL4 세포 생존율을 실험군별로 나타낸 그래프이다. 도 11에서 x축은 배양시간을 나타내고, y축은 세포 생존율(%)을 나타낸다.
도 11에 나타난 바와 같이, 독소루비신 단독 처리 대비 실시예 1의 펩타이드 병용처리 군에서 암 세포 생존율이 유의성 있게 감소하는 것을 보여준다(24시간, p<0.05). 이와 같은 실험 결과로부터, 실시예 1 펜타펩타이드가 종양 세포 사멸을 촉진하여, 항암 효과를 나타냄을 알 수 있다.
또한, 독소루비신과 같은 항암제와 실시예 1의 펩타이드를 동시 투여하는 방식에 의해, 효과적으로 항암효과를 나타냄을 알 수 있다.
<실험예 3> 면역항암제 내성 억제 및 항암 효과 확인
면역항암활성을 나타내는 면역관문억제제를 이용하여, 실시예 1 펩타이드가 면역항암제 내성 억제를 나타내는지 여부를 확인하였다. 또한, 실시예 1 펩타이드가 항암 효과를 나타내는지 여부를 확인하였다.
3-1. 면역항암제 내성억제 효과 확인
면역관문억제제 anti-PD-L1과 실시예 1의 펩타이드 병용 처리에 의한 종양 억제 효과의 작용 기전 확인을 위해 다음과 같이 실험하였다. 우선, 전립선암 세포주 PC3(ATCC)와 NK92 세포(한국생명공학연구원 면역치료제 연구센터)를 co-culture 하였다. PC3 세포 7.8 x 104 cell을 4 well chamber에 seeding하고 O/N(overnight) 배양하여 안정화 시켰고, 동일 수의 NK92 세포를 추가 seeding 하면서 anti-PD-L1 10 ug/ml, 실시예 1의 펩타이드 300 uM을 각 조건 별로 처리하였다. 12시간 후에 washing을 통해 NK92 세포를 제거하고 종양 세포만을 고정하고 immuno-fluorescence staining을 활용하여 Granzyme B 발현량을 확인하였다. Granzyme B 발현량을 대조군에 대해 상대적인 비율로 산출하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12는 항암효과 확인 실험에서 실험군별로 Granzyme B 발현세기를 나타낸 그래프이고, x축은 실험군, y축은 대조군 대비 Granzyme B 발현 세기(%)를 나타낸다.
도 12에 나타난 바와 같이, anti-PD-L1 단독 처리 대비 실시예 1의 펩타이드 병용처리 군에서 종양 세포 내의 Granzyme B 발현이 유의성 있게 증가하였다. 이와 같은 결과로부터, 실시예 1의 펩타이드는 NK92세포와 같은 면역세포를 활성화시켜 Granzyme B의 발현을 증가시키고, 종양세포내 자가포식의 감소를 유도하여 종양세포로 침투된 Granzyme B의 분해를 억제함으로써, 종양내 세포사멸을 증가시킬 수 있는 것으로 보인다.
또한, western blot 방법을 통해서도 자가포식 마커인 LC3II와 세포사멸 마커인 cleaved PARP 발현을 확인하였다. PC3 세포 1 x 106 cell을 6 well에 seeding하고 O/N 배양하여 안정화 시켰고, 동일 수의 NK92 세포를 추가 seeding 하면서 anti-PD-L1 10 ug/ml, 실시예 1의 펩타이드 300 uM를 각 조건 별로 처리하였다. 일정 시간 처리 후, washing을 통해 NK92 세포를 제거하고 종양 세포에서 단백질을 분리하여 LC3II (12h)와 PARP (24h) 발현 변화를 확인하였다. 각각의 발현량을 대조군에 대해 상대적인 비율로 산출하였다. 그 결과를 도 13과 도 14에 나타내었다. 도 13은 항암효과 확인 실험에서 실험군 별로 PARP대비 cleaved PARP 발현량을 나타낸 그래프이고, x축은 실험군, y축은 PARP대비 cleaved PARP 발현량(%)을 나타낸다. 도 14는 항암효과 확인 실험에서 실험군 별로 액틴대비 LC3II 발현량을 나타낸 그래프이고, x축은 실험군, y축은 액틴대비 LC3II 발현량(%)을 나타낸다.
도 13과 도 14에 나타난 바와 같이, anti-PD-L1 단독 처리 대비 실시예 1의 펜타펩타이드 병용처리 군에서 LC3II 발현이 유의성 있게 감소하였고(P<0.001), Cleaved PARP 발현은 유의성 있게 증가하였다(P<0.05). 이를 통해, 실시예 1의 펜타펩타이드 병용 처리에 의해 면역세포 매개 라이시스{예, 자연살생세포 매개 라이시스(NK-mediated lysis)}가 촉진되고 종양 세포의 자가포식 작용을 억제함으로써, 면역항암제내성 억제 작용을 나타내고 종양 세포사멸을 촉진할 것으로 보인다.
3-2. 항암효과 확인 I
면역관문억제제 anti-PD-L1과 실시예 1의 펩타이드 병용 처리에 의한 종양 세포 증식 억제 효과 확인을 위해 다음과 같이 실험하였다. 우선, 인간 전립선암 세포주(PC3) 5 x 103 cell, 인간 폐암 세포주{A549(한국세포주은행)} 5 x 103 cell, 인간삼중음성유방암 세포주{MDA-MB-231(ATCC)} 1 x 104 cell을 각각 96 well에 seeding하고 O/N 배양하여 안정화 시켰다. 그 후, 5 x 103 cell(in PC3, MDA-MB-231 각각)과 2.5 x 103 cell(in A549)의 NK92세포를 추가 시딩(seeding)하면서 anti-PD-L1 10ug/ml, 실시예 1의 펩타이드 300 uM을 각 조건 별로 처리하였다. Co-culture 배양{24/48/72시간(PC3, MDA-MB-231인 경우), 24/48시간(A549인 경우)} 후, washing을 통해 NK92 세포를 제거하고 CCK-8 첨가를 통해 cancer cell viability를 측정하였다. 그 결과를 도 15 내지 도 17에 나타내었다. 도 15는 항암효과 확인 실험에서 배양시간에 따른 PC3 세포 생존율을 실험군 별로 나타낸 그래프이다. 도 15에서 x축은 배양시간을 나타내고, y축은 세포 생존율(%)을 나타낸다. 도 16은 항암효과 확인 실험에서 배양시간에 따른 A549 세포 생존율을 실험군 별로 나타낸 그래프이다. 도 16에서 x축은 배양시간을 나타내고, y축은 세포 생존율(%)을 나타낸다. 도 17은 항암효과 확인 실험에서 배양시간에 따른 MDA-MB-231 세포 생존율을 실험군 별로 나타낸 그래프이다. 도 17에서 x축은 배양시간을 나타내고, y축은 세포 생존율(%)을 나타낸다.
도 15 내지 도 17에 나타난 바와 같이, co-culture 배양 시간이 늘어남에 따라 anti-PD-L1 단독 처리 대비 실시예 1의 펩타이드 병용처리 군에서 암 세포 생존율이 유의성 있게 감소하는 것을 보여준다. 이와 같은 실험결과로부터, 실시예 1 펜타펩타이드가 종양 세포사멸을 촉진하여, 항암효과를 나타냄을 알 수 있다.
3-3. 항암효과 확인 II
또 다른 면역관문억제제 anti-PD-1과 실시예 1의 펩타이드 병용 처리에 의한 종양 세포 증식 억제 효과 확인을 위해 다음과 같이 실험하였다. 우선, 인간 전립선암 세포주인 PC3 5 x 103 cell을 96 well에 seeding하고 O/N 배양하여 안정화 시켰다. 그 후, 5 x 103 cell의 NK92 세포를 추가 seeding 하면서 anti-PD-1 10 ug/ml, 실시예 1의 펩타이드 100, 300 uM을 각 조건 별로 처리하였다. Co-culture 배양 48/72시간 후, washing을 통해 NK92 세포를 제거하고 CCK-8 첨가를 통해 PC3 세포의 생존율를 측정하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었다. 도 18은 항암효과 확인 실험에서 배양시간에 따른 PC3 세포 생존율을 실험군 별로 나타낸 그래프이다. 도 18에서 x축은 배양시간을 나타내고, y축은 세포 생존율(%)을 나타낸다.
도 18에 나타난 바와 같이, co-culture 배양 시간이 늘어남에 따라 anti-PD-1 단독 처리 대비 실시예 1의 펩타이드 300uM 병용처리 군에서 암 세포 생존율이 유의성 있게 감소하는 것을 보여준다 (P<0.05). 이와 같은 실험 결과로부터, 실시예 1 펜타펩타이드가 종양 세포 사멸을 촉진하여, 항암 효과를 나타냄을 알 수 있다.
또한, 면역항암제와 실시예 1의 펩타이드를 동시 투여하는 방식에 의해, 효과적으로 항암효과를 나타냄을 알 수 있다.
이상의 실험결과로부터, 실시예 1의 펜타펩타이드는 종양세포에서 자가포식 억제, 면역증진, 면역세포 활성화, 항-종양 면역 반응 촉진 등에 의해, 종양에 대한 다른 항암제(예, 항암화학요법제, 면역항암제)로 인한 내성을 억제하고, 항암 효과를 나타냄을 알 수 있다.
<실험예 4> 독성시험
암수 10마리의 랫드에 실시예 1의 펜타펩타이드를 500, 1000, 2000mg/kg으로 매일 4주간 피하투여해서 독성을 조사하고, 안전성평가실험을 실시하였다. 구체적으로, 일반증상관찰, 체중측정, 사료소비량 측정, 안과학적 검사 및 뇨검사를 실시하였고, 관찰기간 종료 후 혈액학적 및 혈액생화학적 검사, 장기의 중량, 부검 시 육안적 검사 및 조직병리학적 검사를 수행하였다. 그 결과 모든 시험군에서 사망동물은 발생하지 않았고, 실시예 1의 펜타펩타이드와 관련된 이상소견은 관찰되지 않았다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때, 실시예 1의 펜타펩타이드를 랫드에 4주간 반복 피하 투여 하였을 때, 무독성량(No Observed Adverse Effect Level, NOEAL)은 암수 2,000 mg/kg/day 이상으로 판단하였다.
또한, 군당 암수 3마리의 비글견을 이용해서 실시예 1의 펜타펩타이드를 40, 120, 400mg/kg의 용량으로 매일 4주간 반복 피하투여하고, 시험기간 동안, 일반증상 관찰, 체중 및 사료섭취량 측정, 안과학적 검사, 심전도 검사, 뇨 검사, 혈액학적 및 혈액생화학적 검사, 독성동태시험을 실시하였으며, 부검 시 장기중량 측정과 육안 검사 및 부검개체에 대한 조직병리학적 검사가 이루어졌다. 시험기간 중, 대조군을 포함한 암수 모든 동물에서 사망례는 관찰되지 않았다. 체중, 사료섭취량, 안과학적 검사, 심전도 검사, 뇨 검사, 혈액학적 및 혈액생화학적 검사, 부검 시 육안검사, 장기중량에서 실시예 1의 펜타펩타이드 투여에 따른 이상변화는 관찰되지 않았다. 독성동태시험 결과, 투여 1 일 및 28 일의 전신노출도(AUClast,Cmax)는 투여용량과 대체적으로 비례하여 증가하였고, 실시예 1의 펜타펩타이드 축적은 관찰되지 않았다. 따라서, 본 시험 조건하에 실시예 1의 펜타펩타이드의 암수 비글견에 대한 무독성량 (NOAEL)은 400 mg/kg/day 로 판단된다.
위의 결과를 바탕으로 인체동등용량 (HED, human equivalent dose)을 체표면적 기준으로 환산하였고(J Basic Clin Pharm. 2016 Mar;7(2):27-31 참조), 그 결과를 표 4에 나타냈다. 표 4에서와 같이, 실시예 1의 펜타펩타이드 인체동등용량은 마우스 기준으로 0.8~8.1mg/kg, 랫드 기준으로 81~324.3mg/kg, 개(비글견)기준으로 21.6~216mg/kg으로 환산되었다. 따라서, 실시예 1의 펜타펩타이드는 인간에 대해 0.8~324.3mg/kg으로 투여할 수 있다.
최소투여용량(mg/kg) 최대투여용량(mg/kg) 인체동등용량(mg/kg)
마우스 10 100 0.8~8.1
랫드 500 2000 81~324.3
개(비글) 40 400 21.6~216
이상의 실험결과로부터, 실시예 1의 펜타펩타이드는 대상에 따라 1회 0.8~2000mg/kg 함량으로 비경구(예, 주사) 투여되어 안전하게 효과를 나타냄을 알 수 있다. 구체적으로, 마우스(체중 20g)에 대해 10 ~ 100mg/kg, 랫(체중 250g)에 대해 500 ~ 2000mg/kg, 개(체중 7kg)에 대해 40 ~ 400mg/kg, 사람(체중 60kg)에 대해 0.8 ~ 324.3mg/kg 용량으로 1회 주사로 투여될 수 있다.
이 때, 대상에 따라 1주 1 내지 7회 투여될 수 있다. 또한, 다른 항암제는 주 1회 유효량(예, 2~20mg/kg) 함량으로 투여될 수 있음을 알 수 있다. 또한, 이상의 실험결과로부터, 실시예 1의 펜타펩타이드는 다른 항암제 투여와 동시 또는 순차 투여되어 효과를 나타냄을 알 수 있다. 구체적으로, 인간을 대상으로, 실시예 1의 펜타펩타이드를 파클리탁셀 투여 이후 비경구(예, 주사) 투여하거나, 면역항암제 또는 파클리탁셀을 제외한 항암화학요법제와 동시 투여할 수 있다. 예를 들어, 실시예 1의 펩타이드를 인간에 대해 파클리탁셀과 병용투여시, 파클리탁셀 2~20mg/kg을 투여 후 실시예 1 펩타이드를 24시간 이후(바람직하게는, 48±12시간 이내) 0.8~324.3mg/kg 함량으로 비경구(예, 주사) 투여하는 방식에 의할 수 있다. 이 때, 파클리탁셀과 실시예 1 펩타이드 각각은 주 1회 투여빈도로 투여될 수 있다. 이와 같이 실시예 1의 펜타펩타이드를 투여함으로써, 다른 항암제로 인한 항암제 내성을 보다 효과적으로 억제하고, 항암효과를 나타낸다 할 수 있다.
<제조예 1> 주사제 제조
실시예 1에서 제조한 펩타이드(원료의약품)를 주사용수 5배(원료의약품 무게 대비 w/w)에 희석 후, 2N NaOH(원료의약품 당량 대비 2당량)을 첨가하고 pH 7.0으로 조정하여 녹인 후 필터(0.22um)를 통해 무균 여과 후 동결 건조하여 완제의약품(600mg/vial)을 제조한다.
<110> ENSOL BIOSCIENCES, INC. <120> A penta-peptide and use thereof <130> GP21076 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 1 Gln Leu His Leu Asp 1 5

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 N-말단이 아세틸화되어 이루어진 펜타펩타이드, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염.
  2. 제1항의 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는, 항암제 내성 억제용 약학조성물.
  3. 제1항의 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는, 종양세포에서 자가포식 억제용 약학조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항의 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는, 항-종양 면역 반응 촉진용 약학조성물.
  7. 제1항의 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 유효성분으로 포함하는, 항암용 약학조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 유효성분은 다른 항암제와 병용투여용인 항암용 약학조성물.
  9. 제1항의 펜타펩타이드 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 인간을 제외한 개체에 투여하는, 항암제 내성 억제방법.
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