KR20190036449A - 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생식샘자극 호르몬 방출 호르몬(gonadotrophin-releasing hormone; GnRH)의 신규한 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명 GnRH 유도체의 우수한 생체 이용률 및 증가한 혈중 반감기를 통해 성 호르몬-의존성 질환 치료에 있어 의약의 투약 빈도수나 투약량 감소 등에 크게 기여할 것으로 기대된다. 특히, 기존의 주사 부위의 잔존감과 통증의 부작용을 가지고 있던 GnRH 서방형 제제들의 단점을 극복할 수 있을 것이다.

Description

지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 {A long-acting form of GnRH analogue conjugated with palmitate and a pharmaceutical composition comprising thereof}
본 발명은 생식샘자극 호르몬 방출 호르몬(gonadotrophin-releasing hormone; GnRH)의 신규한 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
생식샘자극 호르몬 방출 호르몬(gonadotrophin-releasing hormone; GnRH) 또는 황체형성 호르몬 방출 호르몬은 시상하부성 신경 호르몬으로 신경내 분비 펩타이드(neurodendocrine peptide)의 일종이다. 구체적으로, GnRH는 시상하부의 신경혈관 말단에서 합성되어 뇌하수체 전엽성 성선자극 세포에 작용하고, 생식샘 자극 호르몬인 황체형성호르몬(luteinizing hormone; LH)이나 여포자극호르몬(follicle stimulating hormone; FSH)의 합성 및 방출을 촉진할 수 있다. GnRH에 의해 합성 및 방출이 조절되는 황체형성호르몬이나 여포자극호르몬은 남성 및 여성 성 호르몬을 조절하고 생식 세포를 성숙시키는 역할을 한다.
GnRH는 일상적 농도에서는 생식샘 호르몬(gonadotropin) 분비를 촉진하거나 배란을 촉진하는 효과를 가지는 한편, 고농도 임상에서는 모순적으로 길항적 저해 효과가 발생하는 것이 알려져 있다. 고농도 투여를 통해서 호르몬-의존 종양인 전립선암(Prostate cancer)이나 유방암(Breat cancer) 치료에 사용될 수 있고, 자궁 내막증(Endometriosis), 자궁 섬유양(Uterine fibroids), 진성 성조숙증(Central precocious puberty), 및 자궁선근종(Adenomyosis) 등의 치료에 사용될 수 있다. GnRH 또는 GnRH 유도체들이 각종 성 호르몬 의존성 질환에 사용될 수 있음이 널리 알려져 있다 (Kumar P. 및 Sharma A, J Hum Reprod Sci, 2014; 7(3): pp170-174).
GnRH를 포함하는 기존 치료제로는 1개월 또는 3개월마다 주사하면 되는 기존 서방형 제품이 존재하며, 이는 생분해성 다핵성 저장형 마이크로캡슐(PLGA 또는 PLA)에 GnRH 작용제를 포함시킨 형태이다. 구체적으로, Lupron® Depot이라는 GnRH 유도체 서방화 제품이 시판되고 있다. 이는 GnRH 유도체인 초산 루프로라이드(Leuprolide acetate)를 활성물질로 하여 PLGA [poly(lactic-co-glycolic acid)] 미립구를 서방성 성분으로 포함하는 제품이다. 위 Lupron®Depot는 생분해성 중합체를 사용하기 때문에 주사양도 많이 늘어나 근육 및 피하에 큰 용량으로 투여하는 특징을 가지고 있다. 이에 주사 부위에 동통이나 조직 손상이 수반되고 1개월이 지나도 생분해성 중합체가 다 흡수되지 않아 수개월 동안 덩어리(lump)가 남아있고, 때에 따라 염증까지 일어나는 문제가 발생한다.
추가로, 위 Lupron®Depot 등의 단점을 보완하기 위해 엘리가드주® 등이 추가로 개발되었으나, 초기 약물 방출 현상을 가지거나, 혼합 용액 상에서의 약물 안정성이 낮은 등 여전히 또 다른 단점을 가지고 있다. 이에, GnRH의 혈중 농도를 장기간 높게 유지하는 제제 또는 제형에 대한 개발 요구는 계속되고 있다.
기존 서방형 제품들은 GnRH 호르몬을 혈중에 서서히 방출하는 목적의 제제들로 유효 물질을 서방형으로 방출시키기 위한 추가적인 서방성 물질을 포함한다. 이에 따라 총 의약 투여량이 커지는 것에 따른 통증, 투여 조직의 잔존감, 약물 안정성이 낮아지는 등의 문제점이 발생한다. 특히, 기존 제품(Leuprolide Acetate)을 주사로 투여받은 사람들 중 23에서 30%에 달하는 환자가 주사 부위의 통증을 호소하였다(Lee PA et al., J. Clin, Endocrinol Metab, 2014).
한편, 미국등록특허 제9,694,051호는 아드레노메둘린(adrenomedullin)의 일부 펩타이드의 아미노 말단 리신(Lys)에 알킬 모이어티가 접합되어 변형되는 펩타이드 결합체가 혈청 반감기가 증가하는 것을 개시하고 있다. 알킬 모이어티를 펩타이드 아미노 말단에 접합하는 것을 통해 혈청 반감기가 증가하는 것을 보이고 있으나, GnRH와 전혀 상이한 기능과 서열의 펩타이드에 대한 것이고 알킬 모이어티를 결합하는 아미노 말단이 리신인 차이가 있다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 추가 물질이나 지속적 방출을 위한 제제 구성 등에 의한 단점들을 가진 서방형 제제와 달리 GnRH 호르몬 성분 자체의 생체 내 반감기 자체를 증가시키기 위한 지속형 제제이자 생체 이용률이 증가된 제제를 개발하고자 노력하였다. 구체적으로, GnRH 자체의 생체 내 반감기를 증가시킨 GnRH 유도체에 팔미트산을 연결하고 특정한 염 형태로 제조하여 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체를 제조하였다. 제조한 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체가 우수한 생체 이용률을 가지며 생체 반감기 및 혈중 농도 유지 효과를 확인하는 것을 통해 본 발명을 완성하였다.
이렇게 제조된 본 발명의 팔미트산 결합 지속형 GnRH 유도체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 등은 각종 성 호르몬-의존성 질환의 예방 및 치료나 피임에 사용될 수 있다.
본 발명은 위와 같은 기존 서방형 제제의 문제점을 감안하여 창출된 것으로, 순환 반감기가 2 내지 4분 정도에 불과한 GnRH 호르몬 성분 자체의 생체 내 반감기를 증가시키기 위한 지속형 제제이자 생체 이용률이 증가된 제제를 개발하고자 하였다. 이에 본 발명의 목적은 투약 용이성과 증가된 효능을 가지는 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명자는 천연형 상태에서 순환 반감기가 2 내지 4분 정도에 불과한 생식샘자극 호르몬 방출 호르몬(gonadotropin-releasing hormone; GnRH)의 생체 이용률과 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 유도체를 제조하고자 노력한 결과, GnRH 유도체에 결합된 팔미트산; 및 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체를 개발하여, 이의 증가된 효능과 생체 내 반감기를 가지는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 증가된 효능이란 천연형 GnRH와 동일한 농도에서 더 우수한 성 호르몬 관련 질환 치료 효과를 가지는 것을 의미하며, 예를 들어 천연형 GnRH와 동일한 농도로 투여되었을 때 더 우수한 전립선암 또는 유방암 사멸 효과 등을 가지는 것을 의미한다.
한편, GnRH는 일반적 농도에서는 생식샘자극 호르몬(gonadotropin) 분비를 촉진하거나 배란을 촉진하는 효과를 가지나, 고농도에서는 모순적으로 길항적 저해 효과를 가진다. 이에 위와는 반대로 성 호르몬에 의해 악화되는 질환들의 진행을 저해하거나, 나아가 성 호르몬에 의해 의존적인 질환의 개선 및 치료에 효과를 가진다.
이하에서는 본 발명의 GnRH 유도체; 상기 GnRH 유도체에 결합된 팔미트산; 및 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 대해 상세하게 설명한다.
※ 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체
본 발명에서 용어, "생식샘자극 호르몬 방출 호르몬(gonadotropin-releasing hormone; GnRH)"은 시상하부의 신경혈관 말단에서 합성되어 뇌하수체 전엽성 성선자극 세포에 작용하고, 생식샘 자극 호르몬인 황체형성호르몬(luteinizing hormone; LH)이나 여포자극호르몬(follicle stimulating hormone; FSH)의 합성 및 방출을 촉진하는 기능을 가지는 호르몬이다. GnRH로는 종별로 다른 서열을 가질 수 있고, 포유동물 천연형 GnRH는 하기 서열번호 1을 가질 수 있다.
[포유동물 GnRH 서열]
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly (서열번호 1)
본 발명에서 용어, "GnRH 유도체"는 GnRH와 구조적으로 유사하지만 체내에서 다른 방식으로 작용할 수 있다. GnRH 유도체, 특히 작용제(agonist)에 해당하는 유도체의 초기 투여시에는 GnRH 유도체가 GnRH 수용체에 결합하면서 여포 자극 호르몬(FSH) 및 황체호르몬(LH)의 체내 합성과 분비를 일정 수준 촉진하게 된다. 그러나, GnRH 유도체의 체내 농도가 지속적으로 유지되는 경우에는 생식샘자극 호르몬이 고갈되고, GnRH 수용체를 하향 조절되어 여포 자극 호르몬 및 황체 호르몬의 합성과 분비가 오히려 억제되는 모순적인 효과를 지니게 된다. 이러한 효과를 통해 성 호르몬 의존성 질환들의 예방 또는 치료에 이용될 수 있고, 피임제로도 사용이 가능하다.
본 발명의 일 양태에서, GnRH 유도체는 GnRH 작용제(agonist)이고, 이는 루프로라이드(Leuprolide), 고세레린(Goserelin), 트립토레린(Triptorelin), 나파레린(Nafarelin), 부세레린(Buserelin), 히스트레린(Histrelin), 데스로레린(Deslorelin), 메테레린(Meterelin), 고나드레린(Gonadrelin) 및 이들로부터 변형된 유도체으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에서, GnRH 유도체는 기존 존재하는 GnRH 작용제와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 것이다.
구체적으로, 본 발명의 GnRH 유도체는 GnRH, 루프로라이드, 고세레린, 트립토레린, 나파레린, 부세레린, 히스트레린, 데스로레린, 메테레린, 또는 고나드레린과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 것일 수 있고, 더욱 구체적으로 GnRH(서열번호 1) 또는 루프로라이드(서열번호 2)와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태로 GnRH 유도체는 루프로라이드의 첫 번째 아미노산인 글루탐산을 다른 아미노산으로 치환한 유도체이고, 더욱 구체적으로는 글루타민으로 치환한 유도체이다.
본 발명의 일 양태에서, GnRH 유도체는 서열번호 2, 3, 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
특히, 본 발명의 GnRH 유도체는 기존에 존재하던 GnRH나 GnRH 유도체에 추가적인 변형을 부가한 것을 의미할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 GnRH 유도체는 해당 GnRH 유도체에 결합된 팔미트산; 및 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 팔미트산은 GnRH 유도체의 아미노 말단에 결합된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "팔미트산(palmitate)"는 탄소수 16개의 노르말 사슬 포화 지방산으로 1개의 카르복시기(-COOH)를 가지는 소수성 성질을 가지는 탄화수소 사슬의 카르복실이다.
본 발명의 지속형 GnRH 유도체는 팔미트산 결합을 통해 i) 신장 재흡수 및 지방 저장 효율이 촉진; ii) 혈청 단백질과의 결합 증가에 따른 보호 효과; iii) 유사체 시리즈들의 소수성을 증진시키는 특성을 통해 신장 배출(Renal clearance)을 지연; iv) 지질막이나 생물학적 막에의 부착에 따른 방출기간 증가 및 약효 증가의 효과를 지닌다.
팔미트산이 부착된 덱사메타손 팔미테이트 에멀젼의 항-염증 효과는 동등량의 덱사메타손 단일성분에 비해 5.6배 증가함이 알려져 있다(Peng et al., Drug Development and Industrial Pharmacy, 2010: 36(12)). 지방산을 붙여 지속형 제제화되어 상업화된 제품으로 팔리페리돈에 지방산을 붙인 인베가 트린자®(INVEGA TRINZA®)가 있으며, 위 덱사메타손에 지방산을 붙인 Lipotalon®이 존재한다.
호르몬이나 효소 등에 팔미트산을 결합시킬 경우, 상기와 같은 기작에 의해 체내 반감기는 증가하는 것이 알려져 있으나, 분자의 소수성 증가에 의해 수용해도가 현저히 낮아질 수 있고, 수용성 환경에서 분자들 간에 응집(aggregation)이 일어나거나 분자 내에서 단백질의 소수성 부위와의 소수성 결합 등이 일어날 수 있다. 따라서, 제제 안정성에 문제가 생기거나, 생체 이용률이 떨어질 수 있고, 유효 성분인 단백질의 효능이 저하될 수 있다.
이러한 측면에서 팔미트산 결합을 통해 생체 내 반감기를 증가시키되, 특정 단백질의 효능을 저하시키지 않고 응집을 일으키지 않는 적절한 제제화 전략이 필요하다.
본 발명에서 용어, "약제학적으로 허용가능한 염"은 본 발명의 팔미트산 결합 GnRH 유도체의 안정성, 수용해도 증가, 생체 이용률 증가 등의 목적을 위해 사용될 수 있는 약제학적으로 허용가능한 염을 제한없이 포함한다.
본 발명의 일 양태로, 약제학적으로 허용가능한 염은 무기 산, 유기 산, 암모늄염, 알칼리 금속염, 및 알칼리 토금속염,으로 이루어진 군에서 선택되고, 다른 일 양태로, 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 메타인산염, 질산염, 황산염, 아세트산염, 설폰산염, 벤조산염, 시트르산염, 에탄설폰산염, 푸마르산염, 락트산염, 말레산염, 말산염, 석신산염, 타르타르산염, 나트륨염, 칼슘염, 칼륨염, 및 마그네슘염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 양태로, 본 발명의 팔미트산 결합 GnRH 유도체는 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 GnRH 유도체의 아미노 말단에 팔미트산이 결합하며, 상기 약제학적으로 허용가능한 염이 나트륨염 또는 아세트산염이다.
본 발명의 다른 일 양태로, 본 발명의 팔미트산 결합 GnRH 유도체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 GnRH 유도체의 아미노 말단에 팔미트산이 결합하며, 상기 약제학적으로 허용가능한 염이 아세트산 염이다.
본 발명의 또 다른 일 양태로, 본 발명의 팔미트산 결합 GnRH 유도체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 GnRH 유도체의 아미노 말단에 팔미트산이 결합하며, 상기 약제학적으로 허용가능한 염이 나트륨 염이다.
※ 팔미트산 결합 GnRH 유도체를 포함하는 약제학적 조성물
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 설명한 본 발명의 팔미트산 결합 GnRH 유도체를 포함하는 것을 제한없이 포함한다.
본 발명의 일 양태로, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 유효량의 본 발명의 팔미트산 결합 GnRH 유도체를 포함하고, 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 본 발명의 팔미트산 결합 GnRH 유도체의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 제조시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있다. 특히, 주사제 투여 경로로는 피하 주사, 근육 주사 중 어느 투여 형태도 가능하고, 투여 형태는 목적하는 체내 농도 조절 효과 등을 고려하여 선택될 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 약제학적 조성물은 주사제, 연고제, 겔제, 로션제, 캡슐제, 정제, 액제, 현탁제, 분무제, 흡입제, 점안제, 점착제, 첩부제 중에서 선택된 제형인 것이 바람직하며, 주사제가 보다 더 바람직하다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 상기 약제학적 조성물에는 본 발명의 팔미트산 결합 GnRH 유도체가 약 0.001-30 ㎎/mL 범위로 포함된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 성 호르몬-의존성 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있고, 피임을 위해 사용될 수 있다. 상기 성 호르몬-의존성 질환은 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁내막증, 자궁 유섬유종, 다낭포성 난소증, 진성 성 조숙증, 다모증, 성선자극 뇌하수체 선종, 수면 무호흡증, 과민성 대장증후군, 월경 전 증후군, 양성 전립선비대증 및 불임으로부터 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물은 추가적으로 기존에 사용하던 생분해성 중합체와 함께 사용할 경우, 현저히 우수한 생체 반감기를 가질 수 있다. 이에 본 발명의 약제학적 조성물은 생분해성 중합체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 생분해성 중합체는 약물이 신체를 통하여 장관외로 투여될 수 있도록 하거나, 본 발명의 GnRH 유도체를 함유한 중합체가 특정 부위에 국소적으로 작용할 수 있도록 투여될 수 있도록 한다. 본 발명에서 생분해성 중합체는 Chasin M 등 ("Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems", New York, Marcel Dekker, 1990) 또는 D. Wescman 등 ("Handbook of Biodegradable Polymers", Taylor & Francis, 1998)를 참고할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 본 발명에서 생분해성 중합체는 PLA(poly-lactic acid), 선형 또는 분지형 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PGA(poly-glycolic acid), 하이드로겔 등일 수 있다.
본 발명은, 본 발명의 팔미트산 결합 GnRH 유도체 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물을 인간을 포함한 포유류에게 투여함으로써 성 호르몬 관련 증상 및 질환을 예방하거나 치료하는 방법 및 용도를 추가로 제공한다.
본 발명의 신규한 지속형 팔미트산 결합 생식샘자극 호르몬 방출 호르몬(gonadotrophin-releasing hormone; GnRH) 유도체의 우수한 생체 이용률 및 증가한 혈중 반감기를 통해 성 호르몬-의존성 질환 치료에 있어 의약의 투약 빈도수나 투약량 감소 등에 크게 기여할 것으로 기대된다. 특히, 기존의 주사 부위의 잔존감과 통증의 부작용을 가지고 있던 GnRH 서방형 제제들의 단점을 극복할 수 있을 것이다.
도 1은 다양한 농도의 GnRH 또는 GnRH 유도체와 대조군 약물을 전립선암 세포주의 일종인 DU-145 세포주에 처리한 후, 세포의 생존율을 측정하였다. 음성 대조군으로 1% DMSO를 사용하였으며 양성 대조군으로 0.1% SDS를 사용하였다.
도 2는 나트륨 염과 아세트산 염화된 GnRH 유도체와 대조군 약물을 전립선암 세포주의 일종인 DU-145 세포주에 처리한 후, 세포의 생존율을 측정하였다. 음성 대조군으로 1% DMSO를 사용하였으며 양성 대조군으로 0.1% SDS를 사용하였다.
도 3은 팔미트산 결합 GnRH 유도체에 첫번째 아미노산과 포함된 염에 따른 용해도를 측정한 결과이다.
도 4는 팔미트산 결합 GnRH 유도체의 생체 반감기 증가 효과를 확인하기 위하여, 대조군 약물과 본 발명의 GnRH 유도체를 12.5 mg/kg의 양으로 단회 피하 투여하여 시간에 따른 혈중 농도를 측정한 동물(랫드) 실험 결과이다.
도 5는 팔미트산 결합 GnRH 유도체의 생체 반감기 증가 효과를 확인하기 위하여, 대조군 약물인 Leuprolide와 본 발명의 GnRH 유도체를 12.5 mg/kg의 양으로 단회 피하 투여하여 시간에 따른 혈중 농도를 측정한 동물(랫드) 실험 결과이다.
도 6은 팔미트산 결합 GnRH 유도체의 생체 반감기 증가 효과를 확인하기 위하여, 대조군 약물인 Leuprolide acetate depot 1개월 제형과 본 발명의 GnRH 유도체를 12.5 mg/kg의 양으로 단회 피하 투여하여 시간에 따른 혈중 농도를 측정한 동물(랫드) 실험 결과이다.
이하, 본 발명을 제조예 및 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 생식샘자극 호르몬 방출 호르몬( gonadotrophin -releasing hormone; GnRH ) 유도체 제조방법
천연형 포유동물 GnRH 서열은 하기와 같다.
[포유동물 GnRH 서열]
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly (서열번호 1)
위 포유동물 GnRH 서열에서 6번째 Gly를 D-Leu로 치환하였고, 10번째 Gly를 des-Gly(데스-글리신)으로 치환하고 에틸아마이드기로 전환시킨 Leuprolide®를 본 발명의 유도체 및 유도체 팔미트산 결합체의 백본(back bone)으로 사용하였다.
[Leuprolide 서열]
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-[D-Leu6]-Leu-Arg-Pro-NHEt(서열번호 2)
위 Leuprolide 서열에서 1번째 아미노산인 글루탐산을 유지한 유도체와 이를 글루타민으로 치환한 유도체를 아래와 같은 제조방법을 통해 만들었다.
(1) GnRH 유도체 펩타이드 제조 방법
유도체 펩타이드 합성은 일반적인 Fmoc/tBu 고체상 펩타이드 합성 (SPPS) 법에 의해 합성되며 아미노산의 α-아미노기가 염기에 민감한 Fmoc (Fluorenylmethyloxycarbonyl chloride) 기로 보호되어 있고 side 기는 산에 민감한 그룹으로 보호된다. 고체상 펩타이드 합성(Solid Phase Peptide Synthesis)은 다음 단계를 포함하여 Fmoc 절단 및 아미노산 결합의 반복을 통해 펩타이드 사슬을 순차적으로 붙여 나간다.
① 레진에 Fmoc 아미노산을 로딩 (Fmoc-Pro-trityl resin);
② Fmoc-AA-레진 (20% 피페리딘/DMF) 상의 Fmoc 보호기의 제거;
③ DMF 세척;
④ 활성화된 다음 아미노산의 결합 (DIC/ HOBt 사용);
⑤ DMF 세척;
⑥ ② 내지 ⑤ 단계를 반복하여 순차적으로 아미노산 결합;
⑦ 합성된 펩타이드에서 레진만 제거 (1.5 % TFA/DCM);
⑧ 레진만 제거된 펩타이드의 아미노 말단에 에탈아민(ethylamine)을 결합 (EDC·HCl/HOAt 사용); 및
⑨ 결합된 펩타이드에서 보호화된 side의 전체 절단 (92.5 % TFA / 2.5 % TIS / 2.5 % EDT / 2.5 % H2O).
상기 제조한 GnRH 유도체의 아미노 말단에 팔미트산 기를 결합하였다. 유도체의 아미노 말단에 팔미트산을 붙이는 것은 일반 아미노산을 결합하는 법과 동일하였다.
(2) GnRH 유도체 펩타이드 정제 (purification)
위 TFA 절단 후, 펩타이드를 Shimadzu HPLC 10AVP 시스템에서 C18 컬럼을 사용하여 HPLC 조건 (A 버퍼 0.05% TFA/H2O, B 버퍼 0.05 TFA/Acetonitrile, 유량율 1 mL/min, 파장 230 nm) 조건 하에 정제하였다. 아래 GnRH 유도체 P1 및 P3는 1번째 아미노산이 글루탐산인 것이고, P2 및 P4는 1번째 아미노산이 글루타민인 것이다.
GnRH 유도체 순도 (%) MS
계산값 (Da) 측정 (Da)
P1 98.2 1465.8 1465.7
P2 98.2 1464.8 1464.9
P3 98.1 1465.8 1465.5
P4 98.3 1464.8 1464.0
팔미트산은 물에서 0.04 mg/mL로 난용성이며 녹는점이 60 ℃이므로 실온에서 고체상을 띄고 있다. 따라서 팔미트산 결합 GnRH 유도체의 경우 수용액에 대한 용해도가 낮을 것으로 예측됨에 따라, 염화(Salting)을 추가로 진행하였다. 이에 따라, 나트륨 염과 아세트산 염의 두 종류의 염화를 수행하여 아래 P1 내지 P4의 팔미트산 결합 GnRH 유도체 염을 제조하였다.
유도체 백본/유도체 서열 및 염
GnRH pyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
Leuprolide pyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NHEt
P1 Palmitate-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NHEt sodium salt
(서열번호 3)
P2 Palmitate-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NHEt sodium salt
(서열번호 4)
P3 Palmitate-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NHEt acetate salt
(서열번호 5)
P4 Palmitate-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NHEt acetate salt
(서열번호 6)
상기 제조한 GnRH 유도체 및 팔미트산 결합 GnRH 유도체 염을 이용하여 이후 실험을 진행하였다.
실시예 1 : 팔미트산 결합에 따른 전립선암 세포주 사멸 효과의 변화 여부
GnRH 유도체는 유방암, 전립선암, 자궁내막증, 진성 성조숙증 등의 질환 치료 목적으로 임상에 적용된다. 따라서, 전립선암 세포주의 일종인 DU-145 세포주를 T75 플라스크 내에서 적정량의 RPIM 1640 배양액 (10 % FBS, 페니실린/스트렙토마이신, 1% non-essential amino acids 포함)으로 배양하며, 37 ℃, 5% CO2, 95% 공기 조건의 무균 세포 배양기를 이용한다. 세포주 사멸 시험은 Cell Counting Kit-8 (CCK-8, DOJINDO사 제품)를 이용하여 진행했다. DU-154 세포주를 T75 플라스크에서 트립신 처리하여 분리한 후, 1 x 104 밀도로 96 웰 플레이트(well plate)에 옮겨 1시간 정도 부착화 (attachment) 시간을 가졌다.
이후 다양한 농도의 GnRH 또는 GnRH 유도체와 대조군 약물을 세포주에 처리했다. 구체적으로 세포 사멸에 대한 음성 대조군으로 1% DMSO를 사용하였으며 양성 대조군으로 0.1% SDS를 사용하였다. 48시간 배양 후, 기존 배양액을 없앤 후, 100 μL의 새로운 배양액과 10 μL의 CCK-8 용액을 각 세포주에 처리하였다. 48 시간 배양 후, 기존 배양액을 없앤 후, 100 μL의 새로운 배양액과 10 μL의 CCK-8 용액을 각 세포주에 처리 4시간 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율 정도를 확인하였다. 측정한 결과는 아래 표 3, 도 1 및 도 2와 같다.
유도체 처리 농도 (μM) 대조군 대비 생존율 (%) 통계적 유의성
(1% DMSO 대조군과 비교)
P1 200 99.7
P2 200 30.7 < 0.0001
P3 200 25.8 < 0.0001
P4 200 98.3
Leuprolide 50 99.1
100 93.6
200 89.7
GnRH 50 90.9
100 88.7
200 93.4
1% DMSO 91.0
0.1% SDS 21.7 < 0.0001
상기 P2 및 P3 유도체는 약 10%의 전립선암 사멸율을 보이는 Leuprolide나 GnRH에 비해 약 7배 내지 7.5배의 전립선암 사멸 효과를 가지는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 1번째 아미노산의 치환과 염화의 조합에 의해 전립선암 사멸에 대한 예상치 못한 우수한 효과를 확인하였다.
유사한 GnRH 유도체임에도 불구하고 첫번째 아미노산과 염화 종류에 따라 전립선암 사멸 효과가 현저히 상이하였다.
실시예 2 : 팔미트산 결합 GnRH 유도체 염화 종류에 따른 용해도 차이
GnRH 용해도는 실험적 상황에서 물에 대해 1 mg/mL 정도이고, 실제로는 약 0.0588 mg/mL로 예측된다. 그에 반해 아세트산 염은 GnRH의 물에 대한 용해도를 10 mg/mL로 약 10배 이상 상승시키는 것으로 알려져 있다 (https://www.drugbank.ca/drugs/DB00644).
이는 염의 이온화와 함께 용매의 pH를 낮춰 용해도를 증가시키는 것으로 보인다. 시판 중인 GnRH 및 GnRH 유도체의 용해도를 높이기 위해 카르복시 말단(C 말단)에 다양한 결합을 시도하였고 그 내용을 아래 표 4로 정리하였다.
제품 이름 처리 농도 용량 (Strength) C 말단 결합체 종류
Factrel Inj.
0.5 mg/vial		 Powder, for solution 0.5 mg GnRH hydrochloride
Factrel Pws
100 mcg/vial		 Powder, for solution 100 mcg
Factrel Pws
500 mcg/vial		 Powder, for solution 500 mcg
Lutrepulse Powder, for solution 3.2 mg GnRH acetate
Lutrepulse Pws
0.8 mg/vial		 Powder, for solution 0.8 mg
제품화된 GnRH 유도체 염의 수용해도는 아래 표 5와 같다.
성분 CAS No. 평균 질량 (Da) 수용해도
GnRH 33515-09-2 1182.2901 1 mg/mL
GnRH acetate 52699-48-6 1260.378 10 mg/mL
GnRH hydrochloride 51952-41-1 1218.77 0.0498 mg/mL
추가로, 상기 네 종류의 팔미트산 결합 GnRH 유도체의 용해도 시험을 진행하였다. 먼저 실온상에서 분말 형태의 펩타이드를 미세 저울로 무게 측정하여, 유기용매인 100% DMSO에 최종 20 mM 농도로 용해 시험을 진행한 결과, 네 종류의 펩타이드 모두 매우 빠르게 완전히 용해되는 것을 유관상으로 확인하였다. 이를 Stock 용액으로 하여, PBS 완충액 또는 세포 배양액에 여러 농도로 희석시켜 그 용해도를 확인하였다.
PBS 완충액 등에 상기 펩타이드 stock 용액을 희석시킬 경우, 다시 뿌옇게 흐려지면서 내부에 응집 현상이 발생하는 것을 볼 수 있고 그 정도는 네 종류의 GnRH 유도체에서 정도가 모두 달랐다. 응집 현상의 정도를 파악하기 위해 원심분리하여 응집물을 가라앉혀 확인한 결과, 전립선암 세포주 사멸 효과가 뛰어났던 P2 및 P3 유도체에서 용해도가 매우 높음을 알 수 있었다(도 3).
두 유도체는 각각 카르복시 말단에 나트륨 염과 아세트산 염이 붙어있는 형태로 제작되었는바, 이는 본 발명의 팔미트산 결합 GnRH 유도체의 경우 펩타이드의 첫번째 아미노산 및 염의 종류에 의해 복합적으로 용해도가 영향을 받음을 확인할 수 있었다.
실시예 3 : 생체 반감기 증가율 측정
본 발명자는 위 제조한 팔미트산 결합 GnRH 유도체의 생체 반감기 증가 효과를 확인하기 위하여, 동물 실험(9주령 암컷 SD 랫드)을 진행하였다. 구체적으로 Leuprolide(n=6), Leuprolide acetate depot 1개월 제형(3.75 mg/month; n=7), 및 GnRH 유도체 P2(n=6) 또는 P4(n=6)를 각 군별 랫드에 12.5 mg/kg 양으로 단회 피하 투여하여 시간에 따른 혈중 농도를 측정하였다. 랫드에 투여 전, 투여한 후 0.5시간, 1시간, 2시간, 6시간, 1일, 3일, 7일, 10일, 14일, 21일, 및 28일차에 랫드의 꼬리 정맥으로부터 채혈하여, LC/MSMS를 이용해 혈중 Leuprolide 및 GnRH 유도체의 농도를 측정하였다. 특정 시점에 농도가 약 4 ng/mL에 이르면 그 다음 시점에 측정을 진행하지 않았다.
위 실험 결과를 정리하면 하기와 같다.
시간 비교예 1 (천연형)
Leuprolide		 비교예 2 (서방형)
Leuprolide acetate
(3.75 mg)		 P2
Pal_[Q1]GnRH		 P4
Pal_[Q1]GnRH_AcOH
평균 표준편차 평균 표준편차 평균 표준편차 평균 표준편차
0 - - - - - - - -
0.5시간 1020 177 133 54.1 11.8 4362 6.51 2.30
1시간 769 572 164 89.1 16.9 3.16 9.22 2.57
2시간 228 267 93.0 51.5 29.1 4.97 18.6 2.83
6시간 2.88 4.09 19.6 7.04 52.2 14.1 45.7 12.0
1일 - - 19.0 7.49 45.0 6.07 23.2 6.75
3일 - - 7.47 3.45 21.4 2.73 9.60 1.58
7일 - - 5.24 1.72 11.9 2.86 7.20 1.79
10일 - - 10.8 2.89 8.18 2.83 8.20 3.80
14일 - - 15.1 5.01 4.35 1.67 4.58 1.88
21일 - - 4.73 4.15 - - 1.26 0.72
28일 - - 1.47 1.77 - - - -
상기 측정 결과는 도 4 내지 도 6으로 그래프로 나타내었다. 위 측정 결과를 바탕으로 반감기(t1/2), 클리어런스율(CL), 분포 용적(Vd), 최대 농도 도달 시간(Tmax), 투여 후 최대 농도(Cmax), 및 약물에 대한 전신 노출 정도(AUCt)를 계산하여 약물동력학적 분석한 결과는 아래와 같다.
Leuprolide Leuprolide acetate
(3.75 mg)		 P2
Pal_[Q1]GnRH		 P4
Pal_[Q1]GnRH_AcOH
t1/2 [일] 0.03 4.17 4.80 4.03
CL
[(mg/kg)/(ng/ml)/일]		 0.180 0.049 0.051 0.075
Vd
[(mg/kg)/(ng/ml)]		 0.007 0.296 0.351 0.436
Tmax [일] 0.02 0.04 0.25 0.25
Cmax [ng/ml] 1020.0 164.0 52.2 45.7
AUCt [ng/ml*d] 69.21 245.22 216.24 159.51
위 결과를 통해 본 발명의 팔미트산 결합 GnRH 유도체가 Leuprolide보다 현저히 우월한 생체 반감기, 클리어런스율, 분포 용적, 전신 노출 정도(AUCt)를 가지는 것을 확인하였다. 나아가, 본 발명의 팔미트산 결합 GnRH 유도체가 생분해성 중합체를 포함하는 기존 Leuprolide 1개월 제형에 유사한 수준의 반감기, 클리어런스율, 및 전신 노출 정도(AUCt)를 가지며, 특히 우수한 분포 용적과 최대 농도 도달 시간이 늦어지고, 최대 농도가 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 팔미트산 결합 GnRH 유도체가 생체 내에서 적절한 농도로 오랜 기간 유지되는 것을 확인하였다.
위 확인한 본 발명의 팔미트산 결합 GnRH 유도체의 우수한 성질을 고려할 때, 서방성을 위해 생분해성 중합체를 사용하던 기존 제품에 비해 볼륨이 현저히 줄어들어 통증 등의 단점을 극복할 수 있고, 생분해성 중합체가 생체 내에 오랜 기간 잔존하는 부작용 등을 배제할 수 있다. 이는 특히나 소아에 사용하는 경우에 유리한 특징이다. 한편, 본 발명의 팔미트산 결합 GnRH 유도체를 기존 제품에 사용하던 생분해성 중합체와 함께 사용하게 되면 기존의 Leuprolide와 같은 약물을 사용했을 때 보다 반감기가 현저히 증가하여, implant와 같은 침습적(수술적) 방법으로 사용하는 약만큼이나 반감기가 증가하는 효과를 보일 수 있다(수개월에서 1년).
이상의 설명으로부터, 본 발명의 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> JP Bio G Inc. <120> A long-acting form of GnRH analogue conjugated with palmitate and a pharmaceutical composition comprising thereof <130> KC181063 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <221> SITE <222> (1) <223> Glu in position 1 is pyroGlu. <400> 1 Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH analog-Leuprolide <220> <221> SITE <222> (1) <223> Glu in position 1 is pyroGlu. <220> <221> SITE <222> (6) <223> Leu in position 6 is D-Leu. <220> <221> SITE <222> (9) <223> C-terminal of the peptide was modified as NHEt(des-Gly). <400> 2 Glu His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH analog <220> <221> SITE <222> (1) <223> Glu in position 1 was modified with Palmitate. <220> <221> SITE <222> (6) <223> Leu in position 6 is D-Leu. <220> <221> SITE <222> (9) <223> C-terminus of the peptide was modified as NHEt(des-Gly). <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> The petide was sallificated with sadium salt. <400> 3 Glu His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH analog <220> <221> SITE <222> (1) <223> Gln in position 1 was modified with Palmitate. <220> <221> SITE <222> (6) <223> Leu in position 6 is D-Leu. <220> <221> SITE <222> (9) <223> C-terminus of the peptide was modified as NHEt(des-Gly). <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> The petide was sallificated with sadium salt. <400> 4 Gln His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH analog <220> <221> SITE <222> (1) <223> Glu in position 1 was modified with Palmitate. <220> <221> SITE <222> (6) <223> Leu in position 6 is D-Leu. <220> <221> SITE <222> (9) <223> C-terminus of the peptide was modified as NHEt(des-Gly). <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> The petide was sallificated with acetate salt. <400> 5 Glu His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GnRH analog <220> <221> SITE <222> (1) <223> Gln in position 1 was modified with Palmitate. <220> <221> SITE <222> (6) <223> Leu in position 6 is D-Leu. <220> <221> SITE <222> (9) <223> C-terminus of the peptide was modified as NHEt(des-Gly). <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> The petide was sallificated with acetate salt. <400> 6 Gln His Trp Ser Tyr Leu Leu Arg Pro 1 5

Claims (15)

  1. 생식샘 호르몬 방출 호르몬(gonadotropin-releasing hormone; GnRH) 유도체에 결합된 팔미트산; 및 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 팔미트산은 GnRH 유도체의 아미노 말단에 결합된, 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 GnRH 유도체는 GnRH 작용제(agonist)인, 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 GnRH 작용제는 루프로라이드(Leuprolide), 고세레린(Goserelin), 트립토레린(Triptorelin), 나파레린(Nafarelin), 부세레린(Buserelin), 히스트레린(Histrelin), 데스로레린(Deslorelin), 메테레린(Meterelin), 및 고나드레린(Gonadrelin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 GnRH 유도체는 서열번호 2 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 염은 무기 산, 유기 산, 암모늄염, 알칼리 금속염, 및 알칼리 토금속염으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 염은 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 메타인산염, 질산염, 황산염, 아세트산염, 젠젤설폰산염, 벤조산염, 시트르산염, 에탄설폰산염, 푸마르산염, 락트산염, 말레산염, 말산염, 석신산염, 타르타르산염, 나트륨염, 칼슘염, 칼륨염, 및 마그네슘염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체가 서열번호 3 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체가 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체.
  10. 제8항에 있어서, 상기 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 지속형 팔미트산 결합 GnRH 유도체를 포함하는, 성 호르몬-의존성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 성 호르몬-의존성 질환은 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁내막증, 자궁 유섬유종, 다낭포성 난소증, 진성 성 조숙증, 다모증, 성선자극 뇌하수체 선종, 수면 무호흡증, 과민성 대장증후군, 월경 전 증후군, 양성 전립선비대증 및 불임으로부터 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 약제학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 생분해성 중합체를 추가로 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 GnRH 유도체 팔미트산 결합체를 포함하는, 피임용 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 생분해성 중합체를 추가로 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
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