JP7390031B2

JP7390031B2 - オキシトシン誘導体及びその使用

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Publication number: JP7390031B2
Application number: JP2020563200A
Authority: JP
Inventors: 陽博東田; 茂横山; スタニスラフミハイロヴィチチェレパノフ; 智周東; 亘一ノ瀬
Original assignee: Kanazawa University NUC
Current assignee: Kanazawa University NUC
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2023-12-01
Anticipated expiration: 2039-12-20
Also published as: WO2020137880A1; JPWO2020137880A1

Description

本発明は、オキシトシン誘導体及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、新規オキシトシン誘導体、オキシトシン受容体作動薬、オキシトシン受容体作動用医薬組成物に関する。本願は、２０１８年１２月２７日に、日本に出願された特願２０１８－２４６１４１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

オキシトシン（ＣＡＳ番号：５０－５６－６）は、下記式（Ａ）で表される化合物であり、下垂体後葉から分泌されるペプチドホルモンである。

オキシトシンは、子宮、乳腺等の末梢器官及び中枢神経系に存在し、子宮収縮や、乳分泌を誘発することが知られている。オキシトシンはまた、ヒトを含む哺乳動物における、社会的ふるまい、認識、記憶等の社会的コミュニケーションを増強することが知られている。

ところで、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）は、社会的コミュニケーション、社会的相互作用、反復性行動、制限された関心等を特徴とする先天性疾患である。ＡＳＤの治療法が検討されているが、まだ有効な治療薬が存在しないのが現状である。

オキシトシンは、ＡＳＤ患者の異常な社会的コミュニケーション行動に関連している可能性がある。例えば、ＡＳＤ患者は、血液又は唾液腺におけるオキシトシン濃度が低いことが報告されている。また、ＡＳＤ患者ではオキシトシン受容体のコード領域及び非コード領域に高頻度の遺伝子変異が検出されることが報告されている。また、オキシトシンシグナル伝達に関連する膜貫通タンパク質であるＣＤ３８の遺伝子変異は、マウスに自閉症様症状を引き起こすことが知られている。また、ＣＤ３８の一塩基多型はＡＳＤと関連していることが知られている。これらの事象は、社会的行動におけるオキシトシンシグナル伝達の重要性を示唆している。

したがって、オキシトシンは、神経発達障害若しくは精神疾患を有する患者における正常な社会的行動を回復させる新薬の開発のための有益なリード化合物であり得る。

カルベトシン（ＣＡＳ番号：３７０２５－５５－１）は、オキシトシンの誘導体であり、オキシトシンとともに子宮収縮剤等として利用されている。しかしながら、オキシトシンやカルベトシンは、バソプレシン受容体、特にＶ_２受容体に対する選択性が欠如していることが知られている。このため、オキシトシンやカルベトシンの投与中に、抗利尿、低ナトリウム血症等の副作用が観察される場合がある。

オキシトシンの薬理学的特性を改善するため、様々なオキシトシン誘導体が合成されてきた（例えば、特許文献１を参照）。

特許第５５３９３１０号公報

このような背景のもと、本発明は新規オキシトシン誘導体を提供することを目的とする。

本発明は以下の態様を含む。
［１］下記式（１）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物（下記式（１）中、Ｘは硫黄原子又はメチレン基であり、Ｒ^３は下記式（２）又は下記式（３）で表される基である。）。

［２］［１］に記載の化合物若しくはその薬理学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物を有効成分とする、オキシトシン受容体作動薬。
［３］神経発達障害若しくは精神疾患の治療剤又は子宮収縮剤である、［２］に記載のオキシトシン受容体作動薬。
［４］［２］又は［３］に記載のオキシトシン受容体作動薬と、薬理学的に許容される担体とを含む、オキシトシン受容体作動用医薬組成物。

本発明によれば、新規オキシトシン誘導体を提供することができる。

実験例２における放射線競合アッセイの結果を示すグラフである。（ａ）～（ｄ）は、実験例３における細胞内カルシウムイオン濃度の測定結果を示すグラフである。実験例５における尾懸垂試験の結果を示すグラフである。（ａ）及び（ｂ）は、実験例６において、水及びショ糖溶液の消費量を定量した結果を示すグラフである。（ａ）～（ｃ）は、実験例７において、各化合物の血漿中濃度を測定した結果を示すグラフである。実験例８において、各化合物の血漿中濃度の測定結果を示すグラフである。（ａ）～（ｃ）は、実験例９において測定した運動競合曲線を示すグラフである。実験例１０において、各化合物の子宮筋縮誘導効果を測定した結果を示すグラフである。

［オキシトシン誘導体］
１実施形態において、本発明は、下記式（１）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物を提供する。下記式（１）中、Ｘは硫黄原子又はメチレン基であり、Ｒ^３は下記式（２）又は下記式（３）で表される基である。

上記式（１）において、Ｘは硫黄原子であることが好ましい。実施例において後述するように、発明者らは、上記式（１）において、Ｘが硫黄原子であり、Ｒ^３が上記式（２）で表される基である化合物（以下、「化合物２」という場合がある。）が、オキシトシン受容体のスーパーアゴニスト活性を有することを明らかにした。ここで、スーパーアゴニスト活性を有するとは、オキシトシン受容体に対する天然のリガンドであるオキシトシンよりもオキシトシン受容体活性化能が高いアゴニスト活性を有することを意味する。下記式（４）に化合物２の化学式を示す。

また、発明者らは、上記式（１）において、Ｘが硫黄原子であり、Ｒ^３が上記式（３）で表される基である化合物（以下、「化合物５」という場合がある。）が、オキシトシン受容体に対して長期間持続的な活性化効果を示すアゴニストであることを明らかにした。ここで、長期間とは、オキシトシン受容体に対する天然のリガンドであるオキシトシンよりもオキシトシン受容体活性化の持続時間が長いことを意味し、例えば、オキシトシン受容体に作用させてから２４時間後においてもオキシトシン受容体の活性化効果を維持していることであってもよい。下記式（５）に化合物５の化学式を示す。

本明細書において、薬学的に許容される塩としては、薬学的に通常用いられる塩が挙げられ、例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等であることができる。より具体的には、例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、メシル酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩等の有機酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等の金属塩、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアンモニウム塩、モルホリン、ピペリジン等の有機アミン付加塩、グリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸付加塩等が挙げられる。

また、式（１）で表される化合物の溶媒和物、式（１）で表される化合物の塩の溶媒和物としては、薬学的に許容される溶媒和物であれば特に制限されず、例えば、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。

［オキシトシン受容体作動薬］
１実施形態において、本発明は、上記式（１）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物を有効成分とする、オキシトシン受容体作動薬を提供する。

実施例において後述するように、発明者らは、上記式（１）で表される化合物が、オキシトシン受容体に対するアゴニスト活性を有することを明らかにした。なかでも、上記式（４）で表される化合物２は、オキシトシン受容体に対するスーパーアゴニスト活性を示す。また、上記式（５）で表される化合物５は、オキシトシン受容体に対して長期間持続的な活性化効果を示すアゴニストである。

本実施形態のオキシトシン受容体作動薬において、塩、溶媒和物については上述したものと同様である。オキシトシン受容体作動薬は、神経発達障害又は精神疾患の治療剤であってもよいし、子宮収縮剤であってもよい。

神経発達障害又は精神疾患としては、自閉スペクトラム症（ＡＳＤ；アスペルガー症候群、高機能自閉症、カナー症候群を含む自閉症）、統合失調症、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、パーキンソン病に伴う精神疾患等が挙げられる。

子宮収縮剤は、分娩誘発、分娩促進、分娩後の子宮からの失血を予防する止血剤（子宮収縮止血剤）等として用いることができる。

［オキシトシン受容体作動用医薬組成物］
１実施形態において、上述したオキシトシン受容体作動薬は、薬理学的に許容される担体を含むオキシトシン受容体作動用医薬組成物として製剤化されていてもよい。

上記の医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態で非経口的に投与することができる。皮膚外用剤としては、より具体的には、軟膏剤、貼付剤等の剤型が挙げられる。

薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。

医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。

医薬組成物は、上述したオキシトシン受容体作動薬と、上述した薬学的に許容される担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。

医薬組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、例えば、投与単位形態あたり０．１～１００μｇ／ｋｇ体重の有効成分（オキシトシン受容体作動薬）を投与すればよい。また、注射剤の場合には、例えば、投与単位形態あたり０．０１～５０μｇ／ｋｇ体重の有効成分を投与すればよい。

また、医薬組成物の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、例えば、成人１日あたり０．１～１００μｇ／ｋｇ体重の有効成分を１日１回又は２～４回程度に分けて投与すればよい。

［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、医薬としての使用のための上記式（１）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物（上記式（１）中、Ｘは硫黄原子又はメチレン基であり、Ｒ^３は上記式（２）又は上記式（３）で表される基である。）を提供する。

１実施形態において、本発明は、神経発達障害又は精神疾患の治療のための上記式（１）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物（上記式（１）中、Ｘは硫黄原子又はメチレン基であり、Ｒ^３は上記式（２）又は上記式（３）で表される基である。）を提供する。

１実施形態において、本発明は、子宮からの失血の治療のための上記式（１）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物（上記式（１）中、Ｘは硫黄原子又はメチレン基であり、Ｒ^３は上記式（２）又は上記式（３）で表される基である。）を提供する。

１実施形態において、本発明は、神経発達障害若しくは精神疾患の治療剤又は子宮収縮剤を製造するための上記式（１）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物（上記式（１）中、Ｘは硫黄原子又はメチレン基であり、Ｒ^３は上記式（２）又は上記式（３）で表される基である。）の使用を提供する。

１実施形態において、本発明は、上記式（１）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物（上記式（１）中、Ｘは硫黄原子又はメチレン基であり、Ｒ^３は上記式（２）又は上記式（３）で表される基である。）の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、神経発達障害又は精神疾患の治療方法を提供する。

１実施形態において、本発明は、上記式（１）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物（上記式（１）中、Ｘは硫黄原子又はメチレン基であり、Ｒ^３は上記式（２）又は上記式（３）で表される基である。）の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、子宮からの失血の治療方法を提供する。

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実験例１］
（オキシトシン誘導体の合成）
下記式（Ｆ）で表される化合物において、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｘが下記表１の化合物１～６である化合物をそれぞれ合成した。化合物２、３、５、６は新規化合物である。

化合物２、３、５及び６は、下記スキーム１に要約されるように合成した。また、後述する実験例における比較のために、既知化合物である化合物１及び４も合成した。

まず、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）を保護基に用いた一般的な固相ペプチド合成法により、樹脂上に線状ペプチドを合成した。化合物２及び化合物５の合成には、保護アミノ酸として、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨを用いた。また、化合物３及び化合物６の合成には、保護アミノ酸として、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（（ＣＨ_２）_２ＣＨ（ＮＨ－ｐＮＺ）ＣＯ_２Ａｌｌｙｌ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨを用いた。

アミノ酸の縮合反応には、Ｆｍｏｃ－アミノ酸（３当量）、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド、３当量）、ＨＯＡｔ（１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール、３当量）、溶媒としてＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）を用いた。但し、Ｎ－アルキルグリシン残基については、ブロモ酢酸（４当量）、ＤＩＣ（４当量）、ＨＯＡｔ（４当量）を用いてＮＭＰ（Ｎ－メチルピロリドン）中でＮ－アシル化を行い、続いてｐ－フルオロベンジルアミン（１０当量）又は３－ｔ－ブトキシプロピルアミン（１０当量）によってＮＭＰ中で処理することにより結合させた。Ｆｍｏｃ基の除去には、ピペリジン／ＤＭＦ（１：４）溶液を用いた。樹脂からの保護ペプチドの切出しには、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）／水（９９：２：２）の混合液を用いた。

化合物２及び５の合成では、樹脂上でのペプチド合成の後、末端Ｆｍｏｃ基を除去し、化合物２及び５の鎖状前駆体を樹脂から切断し、水／アセトニトリル（１：４）混合液に溶解後、Ｉ_２－メタノール溶液（０．１Ｍ）を加えて環化反応を行い、逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡを含有する水－アセトニトリル溶媒）で精製後、所望の化合物２及び５をトリフルオロ酢酸塩として得た。化合物２の化学式は上記式（４）に示した。また、化合物５の化学式は上記式（５）に示した。

化合物２：
ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝１１．１ｍｉｎ，ｓｏｌｖｅｎｔＡ／Ｂ＝７５／２５；Ｐｕｒｉｔｙ：９７．８％；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ１０７５．４５［（Ｍ＋Ｈ）^＋］，１０９７．４３［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｃａｌｃｄｆｏｒＣ_４７Ｈ_６７ＦＮ_１２Ｏ_１２Ｓ_２Ｎａ：１０９７．４３１９［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］，ｆｏｕｎｄ：１０９７．４３２１．

化合物５：
ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝５．６１ｍｉｎ，ｓｏｌｖｅｎｔＡ／Ｂ＝８０／２０；Ｐｕｒｉｔｙ：９８．８％；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ１０２５．４５［（Ｍ＋Ｈ）^＋］，１０４７．４４［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｃａｌｃｄｆｏｒＣ_４３Ｈ_６９Ｎ_１２Ｏ_１３Ｓ_２Ｎａ：１０２５．４５４３［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］，ｆｏｕｎｄ：１０２５．４５４０．

化合物３及び６の合成では、樹脂上でのペプチド合成の後、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４（パラジウムテトラキストリフェニルホスフィン、３当量）を含むクロロホルム／Ｎ－メチルモルホリン／酢酸（３７：１：２）混合液で処理してアリル基を除去し、続いてピペラジンによって末端Ｆｍｏｃ基を除去した。さらに、ＰｙＢｏｐ（ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム、５当量）、ＨＯＡｔ（５当量）、ジイソプロピルエチルアミン（１０当量）でＤＭＦ中処理することにより環化反応を行った。続いて、樹脂からペプチドを切断後、得られた環状ペプチドを１０％Ｐｄ－Ｃ（０．１当量）と１気圧の水素によるエタノール／メタノール混合溶媒中での接触水素化反応に付し、逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡを含有する水－アセトニトリル溶媒）で精製後、脱保護された所望の化合物３及び６をトリフルオロ酢酸塩として得た。下記式（６）に化合物３の化学式を示す。また、下記式（７）に化合物６の化学式を示す。

化合物３：
ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝５．４ｍｉｎ，ｓｏｌｖｅｎｔＡ／Ｂ＝７０／３０；Ｐｕｒｉｔｙ：９７．４％；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ１０５７．５０［（Ｍ＋Ｈ）^＋］，１０７９．４８［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｃａｌｃｄｆｏｒＣ_４８Ｈ_６９ＦＮ_１２Ｏ_１２ＳＮａ：１０７９．４７５５［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］，ｆｏｕｎｄ：１０７９．４７７３．

化合物６：
ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝４．９ｍｉｎ，ｓｏｌｖｅｎｔＡ／Ｂ＝８０／２０；Ｐｕｒｉｔｙ：９６．１％；ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ１００７．５０［（Ｍ＋Ｈ）^＋］，１０２９．４８［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｃａｌｃｄｆｏｒＣ_４４Ｈ_７０Ｎ_１２Ｏ_１３ＳＮａ：１０２９．４７９８［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］，ｆｏｕｎｄ：１０２９．４８１２．

［実験例２］
（受容体結合アッセイ）
まず、ヒトオキシトシン受容体（ｈＯＴＲ）に対するオキシトシンの結合を検討した。具体的には、まず、ヒト胎児腎細胞であるＨＥＫ－２９３細胞にｈＯＴＲを強制発現させた。続いて、ｈＯＴＲを発現するＨＥＫ－２９３細胞の粗膜画分中のｈＯＴＲへの［^３Ｈ］オキシトシンの結合を検討した。その結果、［^３Ｈ］オキシトシンは、Ｋｄ値０．３±０．０６ｎＭで特異的かつ可逆的にｈＯＴＲに結合することが明らかとなった。非特異的結合は１μＭ非標識オキシトシンの存在下で測定した。

続いて、放射線競合アッセイにより、オキシトシン、バソプレッシン、カルベトシン、化合物１～６のｈＯＴＲへの結合親和性を測定した。具体的には、１ｐＭから１μＭの各化合物の存在下における、ｈＯＴＲに結合した［^３Ｈ］オキシトシンの置換を測定した。

図１は、放射線競合アッセイの結果を示すグラフである。図１中、「ＯＴ」はオキシトシンを示し、「ＡＶＰ」はバソプレッシンを示し、「１」～「６」はそれぞれ化合物１～６を示す。図１の横軸は各化合物の濃度を示し、縦軸は残存した［^３Ｈ］オキシトシンの割合（％）を示す。表２にも、放射線結合アッセイの結果を示す。

その結果、バソプレッシン及び化合物１～６は、いずれもｈＯＴＲに対する強い結合親和性を示すことが明らかとなった（Ｋｉ≦３．０ｎＭ）。特に、化合物２は、ｈＯＴＲに対する高い結合親和性を示し（Ｋｉ＝０．５１ｎＭ）、これはオキシトシンのｈＯＴＲに対する結合親和性（Ｋｉ＝０．５８ｎＭ）と同等であった。化合物２以外の化合物は、オキシトシンのｈＯＴＲに対する結合親和性と比較するとわずかに低い結合親和性を示した。

化合物２及び３は、化合物５及び６と比較してより高い結合親和性を示した。測定されたカルベトシンのｈＯＴＲに対する結合親和性（Ｋｉ＝１．８１ｎＭ）は、報告された値と一致した。

［実験例３］
（細胞内カルシウムイオン濃度の測定）
オキシトシン、バソプレッシン、カルベトシン、化合物１～６のｈＯＴＲアゴニスト活性を測定した。具体的には、受容体活性化に続く、細胞内イノシトール－１，４，５－トリスリン酸感受性Ｃａ^２＋貯蔵細胞小器官からのＣａ^２＋の動員を、ｈＯＴＲを強制発現させたＨＥＫ－２９３細胞、ヒトバソプレシン１ａ受容体（ｈＶ_１ａＲ）を強制発現させたＨＥＫ－２９３細胞、ヒトバソプレシン１ｂ受容体（ｈＶ_１ｂＲ）を強制発現させたＨＥＫ－２９３細胞中の遊離Ｃａ^２＋イオン濃度を測定することにより測定した。遊離Ｃａ^２＋イオン濃度は、蛍光プローブであるｆｕｒａ－２／ＡＭ及び蛍光顕微鏡を用いて測定した。遊離Ｃａ^２＋イオン濃度の測定結果を図２（ａ）～（ｄ）に示す。また、遊離Ｃａ^２＋イオン濃度の測定結果に基づいて算出した、各化合物のＥＣ_５０、選択性及びＥ_ｍａｘを表３に示す。

図２（ａ）は、化合物２のｈＯＴＲ、ｈＶ_１ａＲ、ｈＶ_１ｂＲに対するアゴニスト活性の測定結果を示すグラフである。図２（ｂ）は、化合物５のｈＯＴＲ、ｈＶ_１ａＲ、ｈＶ_１ｂＲに対するアゴニスト活性の測定結果を示すグラフである。

図２（ａ）及び（ｂ）中、「ＯＴＲ」はｈＯＴＲを示し、「Ｖ_１Ａ」はｈＶ_１ａＲを示し、「Ｖ_１Ｂ」はｈＶ_１ｂＲを示し、横軸は各化合物の濃度を示し、縦軸はオキシトシンを添加した場合の遊離Ｃａ^２＋イオン濃度を１００％とした場合の遊離Ｃａ^２＋イオン濃度の割合（％）を示す。

図２（ｃ）は、オキシトシン、バソプレッシン、化合物２、化合物５によるｈＯＴＲの活性化の測定結果を示すグラフである。図２（ｃ）中、「ＯＴ」はオキシトシンを示し、「ＡＶＰ」はバソプレッシンを示し、「２」は化合物２を示し、「５」は化合物５を示し、横軸は各化合物の濃度を示し、縦軸はオキシトシンを添加した場合の遊離Ｃａ^２＋イオン濃度を１００％とした場合の遊離Ｃａ^２＋イオン濃度の割合（％）を示す。

図２（ｄ）は、オキシトシン、バソプレッシン、化合物２、化合物５によるｈＶ_１ａＲの活性化の測定結果を示すグラフである。図２（ｄ）中、「ＯＴ」はオキシトシンを示し、「ＡＶＰ」はバソプレッシンを示し、「２」は化合物２を示し、「５」は化合物５を示し、横軸は各化合物の濃度を示し、縦軸はバソプレッシンを添加した場合の遊離Ｃａ^２＋イオン濃度を１００％とした場合の遊離Ｃａ^２＋イオン濃度の割合（％）を示す。

その結果、オキシトシン、カルベトシン及びバソプレッシンは、ｈＯＴＲ、ｈＶ_１ａＲ、ｈＶ_１ｂＲを全て活性化することが明らかとなった。ＥＣ_５０に基づいてランク付けしたこれらの化合物のｈＯＴＲに対するアゴニスト活性は、オキシトシン（０．０１０ｎＭ）＝カルベトシン（０．０１０ｎＭ）＞化合物１（０．０２５ｎＭ）≒化合物２（０．０２８ｎＭ）≒化合物５（０．０３１ｎＭ）＞化合物３（０．０８９ｎＭ）≒バソプレッシン（０．１０ｎＭ）≒化合物６（０．１５ｎＭ）＞化合物４（０．２７ｎＭ）であった。

ｈＶ_１ａＲ及びｈＶ_１ｂＲに対するｈＯＴＲ選択性はわずかに異なっていた。オキシトシン、化合物２及び３は、ｈＶ_１ａＲと比較して約２０～７５倍のｈＯＴＲに対する選択性の増加を示した。カルベトシンは、ｈＶ_１ａＲと比較して約２００倍のｈＯＴＲに対する選択性の増加を示した。化合物１、４、５及び６は、ｈＶ_１ａＲと比較して＞１０００倍のｈＯＴＲに対する選択性の増加を示した。化合物１及び４のデータ（表２）は、報告された値とよく一致していた。化合物４のｈＶ_１ａＲに対するｈＯＴＲの選択性は高かったが、ｈＶ_１ｂＲに対するｈＯＴＲの選択性は高くはなかった。

化合物１、３、４、６は、ｈＯＴＲの部分的なアゴニスト活性を維持していることが明らかとなった。化合物１のＥ_ｍａｘは６１％であり、化合物３のＥ_ｍａｘは８２％であり、化合物４のＥ_ｍａｘは５７％であり、化合物６のＥ_ｍａｘは５０％であった。

化合物５はｈＯＴＲのほぼ完全なアゴニスト活性を維持していることが明らかとなった。化合物５のＥ_ｍａｘは８８％であった。

驚くべきことに、化合物２はｈＯＴＲのスーパーアゴニスト活性を有していることが明らかとなった。オキシトシンのＥ_ｍａｘを１００％とした場合の化合物２のＥ_ｍａｘは１３１％であった。

［実験例４］
（ＣＤ３８ＫＯＣＣマウスの作製）
すべての動物実験は、文部科学省の管轄下にある学術研究機関における動物実験および関連活動の適切な実施のための基本ガイドラインにしたがって実施され、金沢大学動物実験委員会によって承認された（倫理認証コードＡＰ－１７３８２４）。

まず、ゲノム編集によりＣＤ３８をノックアウトしたマウス（以下、「ＣＤ３８ＫＯＣＣマウス」という場合がある。）を作製した。ｓｇＲＮＡは、Ｃｄ３８遺伝子座のエクソン２を標的とするように設計した。ｈＣａｓ９ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを、インビトロＲＮＡ転写キット（商品名「ｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥＴ７ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を使用して合成し、エレクトロポレーター（型式「ＮＥＰＡ２１」、ＮＥＰＡＧＥＮＥ社）を用いてマウスの卵に導入した。

Ｆ_０世代のマウス尾からＤＮＡを単離し、ＰＣＲを用いてｓｇＲＮＡ結合部位にまたがるゲノム領域を増幅し、Ｃｄ３８遺伝子に変異を有する個体をスクリーニングした。その後、市販のキット（商品名「Ｇｕｉｄｅ－ｉｔＭｕｔａｔｉｏｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔ」、タカラバイオ社）を用いて３０匹以上の仔をスクリーニングした。その結果、Ｃｄ３８遺伝子に２塩基対の挿入を有する仔を同定した。この挿入は、Ｃｄ３８遺伝子のオープンリーディングフレーム内に終止コドンを形成し、Ｃｄ３８遺伝子の機能喪失突然変異をもたらす。

ＣＤ３８ＫＯＣＣマウスの仔は２１～２８日齢で離乳し、５匹ずつの同性グループで、２４℃、明／暗サイクル１２時間、午前８時に点灯する標準条件で飼育し、後述する実験に用いた。

［実験例５］
（尾懸垂試験）
尾懸垂試験（ＴａｉｌＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎＴｅｓｔ、ＴＳＴ）とは、逆さ向きに吊されたマウスのもがく時間を測定する試験であり、一般にはうつ様行動を評価する試験の一種である。吊されたマウスは脱出しようと動き回るが、次第に動かない時間（無動時間）が増える。抗うつ薬を投与したマウスでは尾懸垂試験における無動時間が減少することが知られている。無動時間が長くなることはうつ様行動の増加を示し、無動時間の短縮はうつ様行動の減少を示すと解釈されている。また、無働時間が短いことは注意欠陥多動性障害様行動を反映していると解釈することもでき、無働時間の長さにより注意欠陥多動性障害への効果を試験することもできる。

本実験例においては、高さ５５ｃｍ、幅６０ｃｍ奥行き１１．５ｃｍのプラステック製の懸垂箱内の懸垂バーにマウスの尾をテープで固定した。試験時間は６分間とし、最後の４分間における無動時間の合計時間を測定した。

尾懸垂試験の結果、ＣＤ３８ＫＯＣＣマウスは、野生型のＩＣＲマウスよりも無働時間が短く、注意欠陥多動性障害様行動を示すことが明らかとなった。

オキシトシン、化合物２及び５をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１００ｎｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ溶解し、０．３ｍＬ／マウスの投与量でそれぞれＣＤ３８ＫＯＣＣ雄マウスに腹腔内単回投与した。対照としてＰＢＳのみを投与した群も用意した。続いて、投与から３０分後及び２４時間後に微懸垂試験を行った。

図３は尾懸垂試験の結果を示すグラフである。図３中「ＯＴ」はオキシトシンを示し、「２」は化合物２を示し、「５」は化合物５を示す。また、縦軸は無働時間の長さ（秒）を示す。また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。

その結果、ＰＢＳを投与したＣＤ３８ＫＯＣＣマウスでは、投与３０分後の無動時間は７４．２±２．９秒であった（ｎ＝５）。これに対し、オキシトシン、化合物２、化合物５を投与したＣＤ３８ＫＯＣＣマウスでは、投与３０分後の無動時間は、それぞれ１７１±１３．４６秒（ｎ＝５、ｐ＝０．０１２）、１４９．５±１３．８秒（ｎ＝８、ｐ＝０．０２９）、１５１．８３±２１．３秒（ｎ＝６）であり、顕著な増加を示し、野生型への回復が見られた。

また、投与２４時間後では、ＰＢＳを投与したＣＤ３８ＫＯＣＣマウスの無動時間は５６．５±１８．８秒であった（ｎ＝５、ｐ＝０．０１３５）。これに対し、化合物５を投与したＣＤ３８ＫＯＣＣマウスの無動時間は１５７．３±２１．４秒（ｎ＝５、ｐ＝０．０３９）であり、化合物５を投与した群のみがＰＢＳを投与した群と比較して顕著な無働時間の増加を示し、野生型への回復を示した。

２方向ＡＮＯＶＡによる統計解析の結果、時間の有意性（Ｆ_１，３１＝７．１０３、Ｐ＝０．０１２１）及び処置の有意性（Ｆ_３，３１＝１０．５５、ｐ＝０．０００１）が認められた。一方、投与２４時間後では、ＰＢＳと比較してオキシトシン又は化合物２を投与したＣＤ３８ＫＯＣＣマウスについて統計的に有意な差は認められなかった。

［実験例６］
（ショ糖嗜好試験）
ショ糖嗜好試験は、ヒトのうつ病又はパーキンソン病のうつ状態や社会性交流への意欲（ＱＯＬ）の低下で認められる無欲（無快感）、他への無関心症状を反映するものと考えられている。過剰なストレスを負荷したマウスでは、元来好むショ糖水を摂取しなくなるという行動変化が見られる。またこの反応は抗うつ薬の処置により改善されることが知られている。

本実験例では、まず、野生型マウス及びＣＤ３８ＫＯＣＣ雄マウスを、水と１％ショ糖溶液との間で自由に選択することができる状態に置いた。その結果、ショ糖溶液の消費は、野生型マウスよりもＣＤ３８ＫＯＣＣ雄マウスで有意に低いことが明らかとなった。

続いて、オキシトシン、化合物２及び５をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に１００ｎｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ溶解し、０．３ｍＬ／マウスの投与量でそれぞれＣＤ３８ＫＯＣＣ雄マウスに腹腔内単回投与した。対照としてＰＢＳのみを投与した群も用意した。

続いて、各群のマウスを水及び１％ショ糖溶液との間で自由に選択することができる状態に置き、投与から１時間後及び２４時間後の水及びショ糖溶液の消費量を定量した。

図４（ａ）及び（ｂ）は、水及びショ糖溶液の消費量を定量した結果を示すグラフである。図４（ａ）は、各化合物の投与から１時間後の結果を示すグラフであり、図４（ｂ）は、各化合物の投与から２４時間後の結果を示すグラフである。図４（ａ）及び（ｂ）中、「ＯＴ」はオキシトシンを示し、「２」は化合物２を示し、「５」は化合物５を示し、縦軸は、水又はショ糖溶液の消費量の割合を示す。また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。

その結果、ＰＢＳを投与したＣＤ３８ＫＯＣＣマウスはスクロース選好を示さなかった（０．５４±０．０４、ｐ＝０．２１、ｎ＝８）。これに対し、オキシトシンを投与したＣＤ３８ＫＯＣＣマウスは、投与から１時間後に、有意にスクロース選好の回復を示した（０．２１±０．０２から０．８０±０．０２、ｐ＝０．０００１、ｎ＝５）。また、化合物２を投与したＣＤ３８ＫＯＣＣマウスは、投与から１時間後に、有意にスクロース選好の回復を示した（０．２０±０．０２から０．７９±０．０２、ｐ＝０．０００１、ｎ＝５）。また、化合物５を投与したＣＤ３８ＫＯＣＣマウスは、投与から１時間後に、有意にスクロース選好の回復を示した（０．２９±０．０５から０．７２±０．０５、ｐ＝０．００１、ｎ＝５）。

また、各化合物の投与から２４時間後には、化合物５を投与したＣＤ３８ＫＯＣＣマウスのみが、有意にスクロース選好の回復を示した（０．４１±０．０３から０．５９±０．０３、ｐ＝０．００４、ｎ＝５）。一方、オキシトシン、化合物２の投与は、投与から２４時間後にはスクロース選好の回復の効果を示さないことが明らかとなった。この結果から、化合物５が持続的な効果を有することが明らかとなった。

［実験例７］
（薬物動態の検討）
オキシトシン、化合物２、化合物５の薬理学的効力及び持続時間を理解するために、これらの化合物の薬物動態を試験した。具体的には、まず、オキシトシン、化合物２、化合物５を、体重３０ｇの雄のＩＣＲマウスに、それぞれ３μｇ／マウスずつ尾静脈投与した。続いて、各マウスを、投与直後、５分後、１５分後、３０分後にと殺し、血液を採取した。また、投与３０分後及び１２時間後に脳脊髄液を採取した。血漿中及び脳脊髄液中の各化合物の濃度はＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法より測定した。

図５（ａ）～（ｃ）は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法により測定した、オキシトシン、化合物２及び化合物５の血漿中濃度の測定結果を示すグラフである。図５（ａ）はオキシトシンの測定結果を示し、図５（ｂ）は化合物２の測定結果を示し、図５（ｃ）は化合物５の測定結果を示す。化合物２及び５の測定においては、同時に内在性のオキシトシンの濃度も測定した。

図５（ａ）～（ｃ）中、「ＯＴ」はオキシトシンを示し、「２」は化合物２を示し、「５」は化合物５を示す。また、横軸は投与後の時間（分）を示し、縦軸は各化合物の血漿中濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。

また、下記表４に薬物動態パラメータの測定結果を示す。表４中、「高速期」は化合物の投与から１５分後の測定値に基づいて計算したことを示し、「低速期」は化合物の投与から１５～６０分後の測定値に基づいて計算したことを示し、「ＣＳＦ」は脳脊髄液を示す。

その結果、投与直後の血漿中のオキシトシン濃度は、３３４±１５５ｎｇ／ｍＬ（ｎ＝５）であった。また、投与直後の血漿中の化合物２の濃度は、１１８±６０ｎｇ／ｍＬ（ｎ＝３）であった。また、投与直後の血漿中の化合物５の濃度は、１０８±３５ｎｇ／ｍＬ（ｎ＝３）であった。これらの３つの化合物は、血漿から急速に消失し、半減期はほぼ１０分であった。オキシトシン、化合物２及び化合物５の高速期のｔ_１／２は、それぞれ２．９１分、２．８４分及び３．１分であった。

また、化合物２は、オキシトシン及び化合物５よりも迅速に血液から除去されたことが明らかとなった。また、投与から３０分後の脳脊髄液中の化合物２の濃度は１００ｐｇ／ｍＬであった。驚いたことに、投与から１２時間後の脳脊髄液中の化合物２の濃度は、より高くなり、３８０ｐｇ／ｍＬとなった。また、脳脊髄液中の化合物５の濃度は、検出限界以下であったため測定できなかった。

［実験例８］
（血漿中安定性の検討）
オキシトシン、化合物２、化合物５の血漿中安定性を検討した。具体的には、プールしたマウス血漿１００μＬに、オキシトシン、化合物２又は化合物５をそれぞれ終濃度５０ｎｇ／ｍＬで添加し、１、５、１５、３０、６０、１２０分間３７℃でインキュベートした。その後、内部標準を含有するアセトニトリル／メタノール＝１：１（ｖ／ｖ）４００μＬを加え、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法により各化合物の濃度を測定した。

図６は各化合物の血漿中濃度の測定結果を示すグラフである。図６中、「ＯＴ」はオキシトシンを示し、「２」は化合物２を示し、「５」は化合物５を示す。また、横軸は時間（分）を示し、縦軸は、初期濃度に対する割合（％）を示す。

その結果、全ての化合物の濃度は、初期濃度に対して８５～１１５％の範囲内であり、血漿中３７℃で２時間インキュベート後においても安定であると考えられた。この結果は、血液中のオキシトシン、化合物２、化合物５の消失が、酵素的消化による分解によるものではなく、様々な組織及び器官へのクリアランス又は吸着によるものであることを示す。

［実験例９］
（反応速度論的解析）
ＭｏｔｕｌｓｋｙとＭａｈａｎの方程式を用いて、オキシトシン、化合物２及び化合物５の反応速度論的パラメータを計算した。

まず、［^３Ｈ］オキシトシンの反応速度論的パラメータを決定した。具体的には、３つの異なる［^３Ｈ］オキシトシン濃度の範囲を使用して、関連動態曲線を作成した。結果を下記表５に示す。

続いて、オキシトシン、化合物２、化合物５について、それぞれ３つの濃度（Ｋｉの近く、５倍のＫｉ、１０倍のＫｉ）で運動競合曲線を測定した。具体的には、ｈＯＴＲを強制発現させたＨＥＫ－２９３細胞の粗膜画分に５００ｐＭの［^３Ｈ］オキシトシン及び様々な濃度の競合化合物を添加し、様々な時間インキュベートした後に、［^３Ｈ］オキシトシンの結合量を測定した。非特異的結合は１μＭ非標識オキシトシンの存在下で測定した。

図７（ａ）～（ｃ）は、測定した運動競合曲線を示すグラフである。図７（ａ）はオキシトシンの結果を示し、図７（ｂ）は化合物２の結果を示し、図７（ｃ）は化合物５の結果を示す。また、下記表５に、各化合物の反応速度論的パラメータの測定結果を示す。

その結果、化合物２は［^３Ｈ］オキシトシンの約１／２のｔ_１／２を示した。また、化合物２は化合物５の約１／６のｔ_１／２を示した。また、化合物５は、［^３Ｈ］オキシトシンと比較して、より速い会合速度及び解離速度を示した。

なお、本実験例の結果からは、上述した実験例５、実験例６において、ＣＤ３８ＫＯＣＣマウスへの化合物５の投与が長期的な効果を示した理由を説明することができない。この点からも、ＣＤ３８ＫＯＣＣマウスへの化合物５の投与が長期的な効果を示すことは意外な効果である。

［実験例１０］
（子宮収縮誘発能の検討）
等尺力測定により、オキシトシン、バソプレッシン、カルベトシン、化合物１～６によるマウスの子宮収縮誘発効果をＥｘｖｉｖｏで評価した。まず、マウス子宮内膜を除去した後、子宮角を縦方向に切断して１ｍｍ幅の子宮筋層にした。続いて、子宮筋層を、９５％Ｏ_２－５％ＣＯ_２環境下、３７℃に維持したＰＢＳで満たした培養槽中の２本のタングステンワイヤの間に取り付けた。一方のワイヤは静止しており、他方のワイヤはトランスデューサ（ＡＤｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）に接続した。

続いて、子宮筋層を一定の応答が得られるまで６０ｍＭのカリウムイオンで１５分ごとに刺激した。オキシトシン、バソプレッシン、カルベトシン、化合物１～６を培養層中に添加して子宮筋縮を誘発し、ＬａｂＣｈａｔソフトウェア（ＡＤｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）で力の面積（曲線下面積）を計算した。測定した応答は、各化合物を適用する前に測定した一定の自発収縮のデータで正規化した。表６に、各化合物による子宮筋縮誘導効果の評価結果を示す。また、図８は、オキシトシン、カルベトシン、化合物２、化合物５の子宮筋縮誘導効果の測定結果を示すグラフである。図８中、横軸は各化合物の濃度を示し、縦軸は自発収縮の値を１００％とした割合（％）を示す。

その結果、化合物２のＥＣ_５０が５５．５ｐＭであり、これは天然のオキシトシン（２３８．８ｐＭ）、カルベトシン（２．７ｎＭ）、化合物１（１８２．３ｐＭ）及び化合物５（３．１ｎＭ）の中で最も高いことが明らかとなった。また、化合物３のＥＣ_５０は＞１０ｎＭであり、化合物６のＥＣ_５０は８．１ｎＭであった。

この結果は、化合物２が天然オキシトシンに近い親和性を有しており、ｈＯＴＲに対するスーパーアゴニスト活性を示すという上述した結果を更に支持するものである。

Claims

下記式（５）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物。
請求項１に記載の化合物若しくはその薬理学的に許容される塩又はそれらの溶媒和物を有効成分とする、オキシトシン受容体作動薬。
神経発達障害若しくは精神疾患の治療剤又は子宮収縮剤である、請求項２に記載のオキシトシン受容体作動薬。
請求項２又は３に記載のオキシトシン受容体作動薬と、薬理学的に許容される担体とを含む、オキシトシン受容体作動用医薬組成物。