KR20230031884A - 형태적으로 제약된 α-RGIA 유사체 - Google Patents

형태적으로 제약된 α-RGIA 유사체 Download PDF

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KR20230031884A
KR20230031884A KR1020237000012A KR20237000012A KR20230031884A KR 20230031884 A KR20230031884 A KR 20230031884A KR 1020237000012 A KR1020237000012 A KR 1020237000012A KR 20237000012 A KR20237000012 A KR 20237000012A KR 20230031884 A KR20230031884 A KR 20230031884A
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조셉 마이클 매킨토시
난 쩽
훙-취에 초우
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유타대학연구재단
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Abstract

α-RgIA4 펩타이드 유사체, 이를 사용한 조성물, 이들의 치료 및 사용 방법이 개시 및 설명되어 있다. 예를 들어, α-RgIA4 펩타이드 유사체는 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 결합하도록 구성된 인식 핑거 영역과 시스테인 간 황 링키지를 보호하는 측쇄 결합 구성을 포함할 수 있다.

Description

구조적으로 제약된 α- -RGIA 유사체
관련 출원
본 출원은 2020년 6월 3일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 63/034,395의 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
정부 이익
본 발명은 미국 국방성(Defense for Health Affairs)의 수여 번호 W81XWH-17-1-0413 및 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)의 GM048677, GM136430, GM103801 및 GM125001 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가진다.
발명의 분야
본 발명은 펩타이드 및 이의 유사체 및 이의 치료적 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 생물학, 세포 생리학, 화학, 약학, 의학 및 기타 건강 과학 분야에 관한 것이다.
배경
신경병성 통증은 신체적으로나 심리적으로 쇠약해지고 암, 당뇨병, 뇌졸중, AIDS 및 신경 손상을 비롯한 다양한 질환의 매우 흔한 합병증이다. 오피오이드는 이러한 통증을 치료하는 1차 방어선이었다. 그러나, 신경병성 통증 치료를 위한 오피오이드계 약물의 사용은 심각한 부작용, 뿐만 아니라 장기간 사용 시 강한 약물 내성 및 중독 성향 때문에 문제되어 왔다. 그 결과, 신경병성 통증 치료를 위한 비-오피오이드 치료제를 계속하여 모색 중에 있다.
원뿔 달팽이 독의 펩타이드는 니코틴 아세틸콜린 수용체(nAChR)를 비롯한 통증 관련 수용체를 표적으로 하는 것을 포함하여, 다양한 치료 용도에 귀중한 분자로 기능하여 왔다. 불행하게도,α-RgIA와 같은 천연 또는 야생형 콘 달팽이 펩타이드는 바람직하지 않은 물리화학적 특성을 거칠 수 있어, 치료 가능성을 제한하여 포유류에서 치료 효과를 갖기 위해서는 변경이 필요하다. 더욱이, 천연 펩타이드를 α-RgIA4 유사체와 같은 유사체로 변경하는 과정에는 많은 불확실성이 존재하며 이러한 유사체는 종종 약한 효능만을 달성한다. 따라서, 포유동물의 다양한 병태를 치료하는데 높은 효능을 갖는 원뿔 달팽이 독으로부터의 펩타이드 유사체를 계속 찾고 있는 중이다.
요약
한 실시형태에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체는 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 결합하도록 구성된 인식 핑거 영역과 시스테인 간 황 링키지를 보호하는 측쇄 결합 구성을 포함할 수 있다. 이러한 유사체는 α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 2.5% 이상인 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 결합 친화도를 가질 수 있다.
또 다른 실시형태에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체는 보호된 시스테인간 황 링키지에 의해 유지되는 구조(예를 들어, 구형 구조)를 가질 수 있다. 이러한 구형 구조는 α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 2.5% 이상인 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 결합 친화도를 제공할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체는 D P R을 포함하는 인식 핑거 영역; 및 CI, CII, CIII, 및 CIV를 포함하는 시스틴 잔기를 포함할 수 있다. 시스테인 잔기 CI 및 CIII는 제1 시스테인 간 황 링키지에 의해 연결될 수 있고, 시스테인 잔기 CII 및 CIV는 제2 시스테인 간 황 링키지에 의해 연결될 수 있다. 제2 시스테인 간 황 링키지는 측쇄 결합 구성에 의해 보호될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, α-RgIA4 유사체에서 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 α-RgIA4 효능을 유지하는 방법은 시스테인 간 황 링키지를 측쇄 결합 구성으로 보호하여 유사체의 인식 핑거 영역을 α-RgIA4 구성(예: 구형 α-RgIA4 구성)으로 유지시키는 것을 포함할 수 있다.
하나 이상의 실시형태에서, 조성물은 치료적 유효량의 유사체와 약학적으로 허용되는 담체의 조합을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 대상체에서 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 결합에 반응하는 병태를 치료하는 방법은 치료적 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 더 중요한 특징을 다소 광범위하게 요약하여, 이하의 발명의 상세한 설명을 더 잘 이해할 수 있도록 하고, 해당 기술 분야에 대한 본 발명의 기여를 더 잘 이해할 수 있도록 한다. 본 발명의 다른 특징은 첨부된 도면 및 청구범위와 함께, 다음의 상세한 설명으로부터 더 명확해지거나 본 발명의 실시에 의해 알 수 있다.
본 발명의 특징 및 장점은, 예를 들어, 본 발명의 특징을 예시하는 첨부된 도면과 함께 하기 발명의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1a-A는 A1(활성)과 A2(비활성) 사이의 신속한 형태 평형을 나타내고, 1a-B는 한 실시예에 따라 B1(활성)에서 B2(비활성)로의 형태 변화를 방해하는 제약된 형태를 보여준다.
도 1b는 한 실시예에 따른 락탐 가교를 포함하는 활성 형태를 나타낸다.
도 1c는 한 실시예에 따른 메틸렌 티오아세탈을 포함하는 활성 형태를 나타낸다.
도 2는 한 실시예에 따른 거대고리 α-RgIA 유사체의 합성 경로를 보여준다. a) Fmoc-SPPS. b) Boc2O, DIEA, DCM. c) 일반 티로신에 대한 방법 1 (PG1 = 알릴, PG2 = aloc): Pd(PPh3)4, DMBA, DCM; 3-아이오도-티로신에 대한 방법 2 (PG1 = Dmab, PG2 = ivDde): DMF 중 5% 하이드라진. d) PyBOP, DIEA, HOBt, DMF. e) TFA:H2O:TIPS:EDT = 95:2:2:1 (v/v) 이어서 RP-HPLC. f) 0.02 M Na2HPO4 (pH 8.0), 공기중. g) I2, AcOH, H2O.
도 3a는 A) 인간 α9α10 nAChR에 대한 합성 유사체들의 농도 반응을 보여준다. 데이터는 별도의 난모세포(n = 3-6) 측정을 나타내고 오차 막대는 SD를 나타낸다. B) 유사체 6은 냉온 플레이트 테스트에서 화학요법으로 유발된 신경병성 통증을 예방한다. 용량 = 80 μg/kg (s.c.). 값은 각 실험 결정에 대한 평균 ± SEM(n= 8-9)으로 표현된다. **p < 0.01. 한 실시에에 따라 Sal = 식염수; Ox = 옥살리플라틴; SD = 표준 편차.
도 3b는 한 실시예에 따라 인간 α9α10 대 α7 수용체에 대한 유사체 6의 용량-반응 곡선을 보여준다.
도 3c는 한 실시예에 따른 α-RgIA4에 대한 LC-크로마토그램 및 MS-스펙트럼을 보여준다.
도 3d는 한 실시예에 따른 유사체 1에 대한 LC-크로마토그램 및 MS-스펙트럼을 보여준다.
도 3d는 한 실시예에 따른 유사체 2에 대한 LC-크로마토그램 및 MS-스펙트럼을 보여준다.
도 3f는 한 실시예에 따른 유사체 3에 대한 LC-크로마토그램 및 MS-스펙트럼을 보여준다.
도 3g는 한 실시예에 따른 유사체 4에 대한 LC-크로마토그램 및 MS-스펙트럼을 보여준다.
도 3h는 한 실시예에 따른 유사체 5에 대한 LC-크로마토그램 및 MS-스펙트럼을 보여준다.
도 3i는 한 실시예에 따른 유사체 6에 대한 LC-크로마토그램 및 MS-스펙트럼을 보여준다.
도 3j는 한 실시예에 따른 유사체 6[1,4]에 대한 LC-크로마토그램 및 MS-스펙트럼을 보여준다.
도 3k는 한 실시예에 따른 RgIA4[1,4]에 대한 LC-크로마토그램 및 MS-스펙트럼을 보여준다.
도 4a는 인간 혈청에서 α-RgIA4 및 유사체 6의 안정성을 보여준다. A) 인간 혈청 안정성 비교. 값은 3회 개별 중복의 평균 ± SD이다. B) 37 oC의 인간 혈청(농도 0.1 mg/mL)에서 서로 다른 시점에서 다이설파이드 스크램블링의 대표적인 RP-HPLC 궤적. 한 실시예에 따라 **p < 0.01.
도 4b는 RP-HPLC 동시 주입에 의한 이성질체의 결정을 보여준다. 도 b-A는 합성된 RgIA4와 그 [1,4] 이성질체를 나타내고; 도 4b-B는 합성된 유사체 6과 그의 [1,4]이성질체를 나타내고; 그리고 도 4b-C는 테스트 화합물의 서열을 나타낸다.
도 5a는 α-RgIA4, 유사체 3 및 6의 NMR 연구를 보여준다. A) 이차 Hα 화학적 변위 오버레이. 잔기 0번은 Glu를 나타내고 14번은 Lys를 나타낸다. B) 한 실시예에 따른 B) α-RgIA4(검정색) 및 3(빨강색) C) α-RgIA4(검정색) 및 6(파랑색)의 대표적인 NMR 분석 구조의 중첩.
도 5b 내지 5d는 α-RgIA4에 대한 TOCSY(파랑색) 및 NOESY(빨강색)의 아마이드 영역, HSQC 지방족 영역 및 방향족 영역의 오버레이를 보여준다. 할당은 SPARKY를 사용하여 이루어졌다. 한 실시예에서 (CIR = 시트룰린, TIY = 3-아이오도-티로신).
도 5e 내지 5g는 유사체 3에 대한 TOCSY(파랑색) 및 NOESY(빨강색)의 아마이드 영역, HSQC 지방족 영역 및 방향족 영역의 오버레이를 보여준다. 한 실시예에서 (CIR =시트룰린).
도 5 h 내지 5j는 유사체 6에 대한 TOCSY(청색) 및 NOESY(적색)의 아마이드 영역, HSQC 지방족 영역 및 방향족 영역의 오버레이를 보여준다. 한 실시예에서 (CIR = 시트룰린, TIY = 3-아이오도-티로신).
도 5k-A는 RgIA4 백본 중첩을 보여주고, 5k-B는 한 실시예에 따라 측쇄 중첩을 형태적 제약, 원자 RMSD(2-12) 및 라마찬드란 플롯 별로 보여준다.
도 5l-A는 유사체 3에 대한 백본 중첩을 보여준다; 도 5k-B는 형태적 제약을 갖는 측쇄 중첩을 보여주고, 5k-C는 한 실시예에 따라 링커 중첩(녹색)을 원자 RMSD(2-12)로, 그리고 라마찬드란 플롯으로 보여준다.
도 5 m는 유사체 6에 대한 백본 중첩을 보여준다; 도 5m-B는 형태적 제약을 갖는 측쇄 중첩을 보여주고, 5m-C는 한 실시예에 따라 링커 중첩(녹색)을 원자 RMSD(2-12)로, 그리고 라마찬드란 플롯으로 보여준다.
도 6a는 유사체 6의 NMR 구조 앙상블을 RossetaDock을 사용하여 인간 (A, B) α9(+)/α9(-) 및 (C, D) α10(+)/α9(-) nAChR 인터페이스의 상동성 모델로 도킹하여 선택된 결합 모델을 보여주며, α9-ECD는 녹색, α10-ECD는 하늘색, 유사체 6은 주황색으로 표시한다. 결합 잔기를 막대 형태로 도시하며, 산소, 질소 및 황 원자는 각각 빨강색, 파랑색 및 노랑색이다. 점선은 유사체 6과 수용체 사이에 형성된 수소 결합을 나타낸다. 한 실시예에 따라 hα9-ECD 구조는 RgIA 결합 X-선 결정 구조(PDB 6HY7)로부터 생성되었고, hα10-ECD는 동일한 구조를 기반으로 이전에 보고된 상동성 모델로부터 생성되었다.
도 6b는 한 실시예에 따른 도킹 클러스터링 파일을 보여준다.
도 6c는 한 실시예에 따른 도킹 클러스터링 파일을 보여준다.
도 7a는 (A) α-Ctx RgIA, ImI, Vc1.1, PeIA, MII 및 PnIA의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 다이설파이드 연결성은 CysI-CysIII(루프 I) 및 CysII-CysIV(루프 II)이다. # = C-말단 아마이드; ^ = C-말단 카르복실레이트 산. (B) α9 nAChR 서브유닛 결정 구조(PDB 6HY7)에 결합된 RgIA의 결합 표면. 결합 잔기(Ser4, Asp5, Arg7 및 Arg9)는 검은색 글꼴로 표시하고 막대 형태로 도시되어 있으며 산소, 질소 및 황 원자는 각각 빨강색, 파랑색 및 노랑색으로 표시된다. (C) 천연 다이설파이드 및 개발된 다이설파이드 모방체의 화학 구조. Pen = L-페니실라민. (D) 본 연구에서 메틸렌 티오아세탈 RgIA 유사체의 화학적 합성. 모든 선형 펩타이드는 자동 합성기에서 Fmoc-SPPS를 통해 합성되었다. 완전히 폴딩된 펩타이드는 2-작업 절차를 통해 수득되었다. 한 실시예에서 반응 조건 a) TCEP·HCl, K2CO3, H2O; 이후 Et3N, CH2I2, THF. b) I2, AcOH, H2O.
도 7b는 RgIA-5524 폴딩의 RP-HPLC 분석을 보여준다; 도 7b-A는 선형 펩타이드에서 부분적으로 폴딩된 유사체 및 완전히 폴딩된 유사체로의 변환을 보여준다; 그리고 도 7b-B는 한 실시예에 따른 해당 펩타이드에 대한 HPLC 궤적을 보여준다.
도 7c는 한 실시예에 따른 RgIA-5617에 대한 LC-크로마토그램 및 MS-스펙트럼을 보여준다.
도 7d는 한 실시예에 따른 RgIA-5533에 대한 LC-크로마토그램 및 MS-스펙트럼을 보여준다.
도 7e는 한 실시예에 따른 RgIA-5618에 대한 LC-크로마토그램 및 MS-스펙트럼을 보여준다.
도 7f는 한 실시예에 따른 RgIA-5524에 대한 LC-크로마토그램 및 MS-스펙트럼을 보여준다.
도 7g는 한 실시예에 따른 RgIA-5573에 대한 LC-크로마토그램 및 MS-스펙트럼을 보여준다.
도 8a는 (A) hα9α10 nAChR에서 합성된 메틸렌 티오아세탈 RgIA 유사체의 아미노산 서열 및 효능을 보여준다. a모든 천연 다이설파이드 또는 메틸렌 티오아세탈은 CysI-CysIII, CysII-CysIV 구성으로 연결된다. 메틸렌 티오아세탈 대체물은 루프-I의 경우 빨강색, 루프-II의 경우 녹색으로 굵게 표시되어 있다. ^는 C-말단 카르복실산을 나타내고; Cit = L-시트룰린; iY = L-3-아이오도-티로신; bA = β-알라닌; bhY = L-β-호모티로신이다. b 농도-반응 곡선에서 계산됨. 괄호 안의 숫자는 95% 신뢰 구간이다. (B) 아프리카 발톱 개구리(Xenopus laevis) 난모세포에서 발현되는 인간 nAChR 전류에 대한 ACh-유도 전류 차단에 대한 합성 펩타이드에 의한 인간 α9α10 nAChR 억제에 대한 농도-반응 분석. (C) 아프리카 발톱 개구리 난모세포에서 발현되는 인간 nAChR 전류에 대한 ACh-유도 전류 차단에 대한, RgIA-5524 및 RgIA-5533에 의한 nAChR 하위형의 억제에 관한 IC50 . (D) RgIA-5524 및 RgIA-5533에 의한 hα9α10 대 hα7 nAChR의 억제에 대한 농도-반응 분석. 데이터 포인트는 한 실시예에 따라 3-4회의 독립 실험에서 얻은 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 8b는 한 실시예에 따라 아프리카 발톱 개구리 난모세포에서 발현된 인간 nAChR 하위형 전류에 대한 ACh 유도 전류를 차단하는 효과(100 nM 펩타이드)를 3-4회 독립 실험들로부터의 평균 ± SEM을 나타내는 데이터 포인트로 나타낸다.
도 9는 만성 화학요법으로 인한 신경병성 통증에서 RgIA-5524의 생체 내 통증 완화 효과를 나타낸다. RgIA-5524는 옥살리플라틴 반복 투여로 인한 통증을 완화한다. 마우스에게 3주 동안 화학요법제 옥살리플라틴(3.5 mg/kg, ip)을 하루에 한 번, 주 5일 주사했다. 옥살리플라틴 주사 당일, 마우스는 또한 식염수 또는 RgIA-5524(40μg/kg)를 받았다. 주 1회, 마지막 RgIA-5524 주사 후 24시간 후, 실험 섹션에 기재된 바와 같이 냉온 플레이트를 사용하여 마우스를 냉각 이질통에 대해 평가하였다. 이질통은 21일차까지 통계적 유의성에 도달했고 RgIA-5524에 의해 효과적으로 역전되었다. 데이터의 통계적 평가는 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Dunnett의 다중 비교 테스트에 의해 수행되었다. 데이터는 그룹 당 n = 8마리의 평균 ± SEM 로 표현된다. xxx P < 0.001(Ox/Sal 대 Sal/Sal 처리 마우스와의 유의한 차이); ***P < 0.001(Ox/Sal 대 Ox/RgIA-5524 처리 마우스와의 유의한 차이). 본 실시예에서 Ox, 옥살리플라틴; Sal, 0.9% 식염수; s, 초.
도 10은 α9 nAChR 서브유닛이 RgIA-5524의 진통 효과를 위해 사용됨을 보여준다. (A, B) 1일차에 RgIA 5524(40 ug/kg, sc) 또는 0.9% 식염수와 함께 옥살리플라틴 5 mg/kg ip 단회 투여가 제공되었다. 마우스를 5일차에 냉각 이질통에 대해 평가하였다. RgIA-5524는 (A) 야생형 마우스에서 이질통의 발병을 예방했지만 (B) α9 서브유닛 널 마우스(n = 12마리 마우스/그룹)에서는 그렇지 않았다. (C, D) 1일차에 마우스에게 더 많은 용량의 옥살리플라틴(10 mg/kg ip)과 RgIA-5524(40 ug/kg sc) 또는 식염수를 투여했다. 옥살리플라틴-유발된 한랭 이질통은 1일차에 (C) 야생형 마우스에 투여된 RgIA-5524의 단회 투여에 의해 예방되었지만 (D) α9-서브유닛 널 마우스에서는 그렇지 않았다(n = 8마리 마우스/그룹). 데이터의 통계적 평가는 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Dunnett의 다중 비교 테스트에 의해 수행되었다. 모든 결과는 평균 ± SEM으로 표현되며, Sal/Sal 처리된 마우스와의 유의한 차이에 대하여 *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001이다. Ox/Sal 처리된 마우스와의 유의한 차이는 0 P <0.05, 00 P <0.01, 및 000 P < 0.001이다. 한 실시예에서, Ox, 옥살리플라틴; Sal, 0.9% 식염수; s, 초. , α9-/- α9 녹아웃 마우스.
도 11a는 (A) 10 μM에서 다른 통증 관련 이온 채널 및 수용체에 대한 RgIA-5524의 결합 활성을 나타낸다. a 각 실험은 중복 웰로 수행되었다. 결합은 각 표적에 특이적인 방사성 표지된 리간드의 결합 억제 %로 계산되었고, 효소 억제 효과는 대조군 효소 활성 억제 %로 계산되었다. 2차 농도-반응 분석은 스크리닝 분석에서 ≥50% 억제를 나타낼 때 수행되었다. b 니코틴성 신경 유형. c 스트리키닌 민감성. d 트리키닌 둔감성; AR, 아데노신 수용체; AT, 안지오텐신; BK2, 브래디키닌 수용체; CB, 칸나비노이드 수용체; CCK, 콜레시스토키닌 수용체; CRF, 코르티코트로핀 방출 인자; D, 도파민; ET, 엔도텔린 수용체; GABA, γ-아미노부티르산; GAL, 갈라닌 수용체; mGluR, 대사성 글루타메이트 수용체; GlyR, 글리신 수용체(스트리키닌 민감성); H, 히스타민 수용체; CysLT, 시스테이닐 류코트리엔; M, 무스카린성 아세틸콜린 수용체; NK, 뉴로키닌 수용체; DOP, δ-오피오이드 수용체; KOP, κ오피오이드 수용체; MOP, μ-오피오이드 수용체; NOP, 노시셉틴/오르파닌 FQ 수용체; GR, 글루코코르티코이드 수용체; ER, 에스트로겐 수용체; AR, 안드로겐 수용체; PAFR, 혈소판 활성화 인자 수용체; TRH1, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬; VPAC, 혈관활성 장 펩타이드 수용체; V, 바소프레신 수용체; LTCC, L형 Ca2+ 채널; NTCC, N형 Ca2+ 채널; BZD, 벤조다이아제핀; PCP, 펜사이클리딘. (B) GABAB 수용체 및 hERG K+ 채널에 대한 RgIA-5524의 기능적 활성. e IC50 및 EC50 연구를 위해 중복 웰을 사용하여 두 번의 별도 실험을 수행했다. 세포 작용제 및 길항제 효과는 각각 대조군 반응의 % 및 공지된 참조 작용제 또는 길항제에 대한 억제 %로 계산되었고; f 100 μM의 RgIA-5524 100μM에서 측정되었다. (C) RgIA-5524의 효소 및 섭취 분석. g 각 실험은 중복 웰로 수행되었다. 길항제 효과는 측정된 성분에 대한 억제%로 계산되었다. TXA2 신타아제, 트롬복산 A2 신타아제; 항시적 NOS, 항시적 NO 신타아제; MAO, 모노아민 옥시다제. GABAB 수용체에 대한 RgIA-5524의 (D) 작용제 및 (E) 길항제 효과의 농도-반응 분석. (F) 테일 전류 억제에 의해 측정된 hERG K+ 채널 상의 RgIA-5524의 농도-반응 분석. (G) 100nM 및 10μM에서 RgIA-5524에 의한 CYP 효소 이소형의 억제. 각 농도에 대해 중복 실험을 수행했으며 데이터는 실시예에 따라 평균 ± SEM으로 표시된다.
도 11b 내지 11d는 RgIA-5533에 대한 TOCSY(파랑색) 및 NOESY(빨강색)의 아마이드 영역, HSQC 지방족 영역 및 방향족 영역의 오버레이를 보여준다. 할당은 SPARKY를 사용하여 이루어졌다. 한 실시예에 따르면 (SCS = LS-메틸렌-Cys, CIR = 시트룰린, TIY = 3-아이오도-티로신).
도 11e 내지 11g는 RgIA-5617에 대한 TOCSY(파랑색) 및 NOESY(빨강색)의 아마이드 영역, HSQC 지방족 영역 및 방향족 영역의 오버레이를 보여준다. 할당은 SPARKY를 사용하여 이루어졌다. 한 실시예에 따르면 (SCS = LS-메틸렌-Cys, CIR = 시트룰린, TIY = 3-아이오도-티로신).
도 11h 내지 11j는 RgIA-5524에 대한 TOCSY(파랑색) 및 NOESY(빨강색)의 아마이드 영역, HSQC 지방족 영역 및 방향족 영역의 오버레이를 보여준다. 한 실시예에 따르면 (SCS = LS-메틸렌-Cys, CIR = 시트룰린, TIY = 3-아이오도-티로신, BHY = L-베타-호모티로신).
도 11k는 한 실시예에 따라 RgIA-5533에 대한 A) 백본 중첩 및 B) 형태적 제약을 갖는 측쇄 중첩, 원자 RMSD(2-12), 및 라마찬드란 플롯을 보여준다.
도 11l는 한 실시예에 따라 RgIA-5617에 대한 A) 백본 중첩 및 B) 형태적 제약을 갖는 측쇄 중첩, 원자 RMSD(2-12), 및 라마찬드란 플롯을 보여준다.
도 11 m는 한 실시예에 따라 RgIA-5524에 대한 A) 백본 중첩 및 B) 형태적 제약을 갖는 측쇄 중첩, 원자 RMSD(2-12), 및 라마찬드란 플롯을 보여준다.
도 12는 (A) RgIA(검정색), RgIA4(회색), RgIA-5617(분홍색), RgIA-5533(녹색) 및 RgIA-5524(파랑색)의 2차 화학적 변위의 오버레이를 보여준다. x축은 상응하는 표준 화학적 변위에 기초하여 계산된 잔기 4, 9, 10, 13 및 14에서의 돌연변이체에 대한 치환된 잔기를 갖는 펩타이드 서열을 보여준다. 2개의 분자내 가교에서 Cα 사이의 대표적인 NMR 구조 및 거리 측정값(Å). (B) hα9 nAChR 서브유닛 결정 구조에 결합된 RgIA(PDB 6HY7); (C) RgIA(PDB 2JUQ); (D) RgIA4; (E) RgIA-5533; (F) RgIA-5617 및 (G) RgIA-5524의 대표적인 NMR 분석 구조. 구조들을 막대 표시로 보여주며 원자 산소, 질소, 황 및 아이오드는 각각 빨강색, 파랑색, 노랑색 및 보라색으로 표시된다. Cα 거리는 한 실시예에 따라 PyMOL 프로그램으로 측정되었다.
도 13은 RgIA-5524가 RgIA4에 비해 크게 향상된 안정성을 나타냄을 보여준다. (A) 완전한 다이설파이드 스크램블링 방지는 37 oC의 90% 인간 혈청에서 펩타이드 인큐베이션 후 특정 시점에서의 HPLC 궤적에 의해 표시되는 것으로 관찰되었다. 왼쪽 패널의 전면 피크는 스크램블된 이성질체 RgIA4[1,4]이다. (B) 인간 혈청에서 RgIA-5524 및 RgIA-5533 대 RgIA4의 안정성 분석. 펩타이드는 37 oC의 90% 인간 혈청 AB 유형(0.1 mg/mL)에서 인큐베이션되었다. (C) RgIA-5524 대 RgIA4의 환원성 안정성 분석. 펩타이드 샘플은 pH 7.4의 PBS에서 환원된 GSH(10 당량)의 존재하에 0.1 mg/mL로 용해되었고 37 oC에서 인큐베이션되었다. 데이터의 통계적 평가는 학생 t(비대응) 검정으로 수행되었다. 모든 결과는 한 실시예에 따라 평균 ± SD(n = 3), **P<0.01, ***P<0.001로 표현된다.
이제 설명된 예시적인 실시형태들에 대한 참조가 이루어질 것이며, 이를 설명하기 위해 특정 언어가 본원에서 사용될 것이다. 그럼에도 불구하고 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다는 것이 이해될 것이다.
상세한 설명
이들 예시적인 실시형태들은 당업자가 본 발명을 실시할 수 있을 정도로 충분히 상세하게 설명되지만, 다른 실시형태들이 구현될 수 있고 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명에 대한 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명의 실시예에 대한 이하의 보다 상세한 설명은 본 발명의 범위를 청구범위에 기재된 것들에 제한하려는 것이 아니라 단지 예시의 목적으로 제시된 것이며 본 발명의 특징 및 특성을 설명하기 위한 제한이 아니다. 본 발명의 최우수의 작동 방식을 제시하고 당업자가 본 발명을 충분히 실시할 수 있도록 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 정의되어야 한다.
정의
본 발명을 설명하고 청구함에 있어 다음과 같은 용어를 사용한다.
단수 형태 “하나(a, an)”, 및 “그것(the)”은 문맥에서 달리 분명히 지시하지 않는 한 복수 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어 “펩타이드”에 대한 언급은 이러한 구조들 중 하나 이상에 대한 언급을 포함하고 “유사체”에 대한 언급은 이러한 유사체 중 하나 이상을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 “실질적으로”는 작용, 특성, 속성, 상태, 구조, 항목 또는 결과의 완전하거나 거의 완전한 범위 또는 정도를 지칭한다. 예를 들어, “실질적으로” 둘러싸인 개체는 개체가 완전히 둘러싸여 있거나 거의 완전히 둘러싸여 있음을 의미한다. 경우에 따라 절대 완전성에서 허용되는 정확한 편차 정도는 특정 상황에 따라 달라질 수 있다. 그러나 일반적으로 거의 완전하다는 것은 마치 절대적이고 전체적으로 완전하다는 것과 동일한 전반적인 결과를 얻기 위한 것이 될 것이다. “실질적으로”의 사용은 작용, 특성, 속성, 상태, 구조, 항목 또는 결과의 완전하거나 거의 완전한 부족을 나타내기 위해 부정적인 의미로 사용될 때 동일하게 적용된다. 예를 들어, 입자가 “실질적으로 없는” 조성물은 입자가 완전히 결여되거나 입자가 거의 완전히 결여되어 효과가 마치 입자가 완전히 결여된 것과 같을 것이다. 다시 말해서, 성분 또는 요소가 “실질적으로 없는” 조성물은 측정 가능한 효과가 없는 한 이러한 항목을 여전히 실제로 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “약”은 주어진 용어, 메트릭 또는 값과 관련된 유연성 및 부정확성을 제공하기 위해 사용된다. 달리 언급되지 않는 한, 특정 숫자 또는 수치 범위에 따른 용어 “약”의 사용은 용어 “약”이 없는 이러한 수치 용어 또는 범위에 대한 뒷받침을 제공하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 편의와 간결함을 위해 “약 50 옹스트롬 내지 약 80 옹스트롬”의 수치 범위는 “50 옹스트롬 내지 80 옹스트롬” 범위에 대한 뒷받침을 제공하는 것으로 이해되어야 한다. 또한 본원에서 “약”이라는 용어가 실제 수치와 함께 사용되는 경우에도 실제 수치 값들에 대한 뒷받침이 제공된다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, “약” 30이라는 언급은 30보다 약간 높거나 약간 낮은 값에 대한 뒷받침을 제공할 뿐만 아니라 실제 수치값인 30에 대해서도 뒷받침하는 것으로 해석되어야 한다. 특정 변수에 대한 유연성 정도는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 그러나 달리 명시되지 않는 한, “약”이라는 용어는 일반적으로 2% 미만, 대부분 1% 미만, 일부 경우 0.01% 미만의 유연성을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 “치료하다”, “치료” 또는 “치료하는 것” 등은 무증상 또는 증상이 있는 대상체에 대한 치료제의 투여 또는 치료 작용을 지칭한다. 다시 말해, “치료하다”, “치료” 또는 “치료하는 것”은 병태(즉, 발현된 증상)를 감소시키거나 제거하는 행위를 지칭할 수 있거나, 예방적 치료(즉, 증상 발생을 방지하기 위해 증상을 나타내지 않는 대상체에게 투여하는 것)를 지칭할 수 있다. 이러한 예방적 치료는 병태의 예방, 예방 작용, 예방 조치 등으로도 지칭될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 “치료제”, “활성제” 등은 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 대상체에게 적절하거나 효과적인 양으로 투여될 때 대상체에 유익하거나 긍정적인 효과를 가질 수 있는 제제를 지칭한다. 한 양상에서, 치료제 또는 활성제는 α-RgIA4 펩타이드 유사체일 수 있다. “추가 활성제”, “보충 활성제”, “2차 활성제” 등의 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있으며 α-RgIA4 펩타이드 유사체 이외의 화합물, 분자 또는 물질을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 “제제” 및 “조성물”은 상호교환가능하게 사용되며 둘 이상의 화합물, 원소 또는 분자의 혼합물을 지칭한다. 일부 양상에서 용어 “제제” 및 “조성물”은 하나 이상의 활성제와 담체 또는 그 외 부형제의 혼합물을 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 용어 “투약 형태”는 대상체에 투여하기 위한 형식(예를 들어, 특정 형태, 형상, 비히클, 등)으로 제공되는 하나 이상의 제제(들) 또는 조성물(들)을 포함할 수 있다. 예를 들어, “경구 투여 형태”는 대상체의 입에 투여하기에 적합할 수 있다. “국소 투여 형태”는 문지름 등에 의해 대상체의 피부에 투여하기에 적합할 수 있다.
본원에서 사용되는 “치료 부위”는 치료가 요구되는 대상체 상의 또는 대상체 내의 위치를 의미한다. 예를 들어, 통증을 치료할 때 치료 부위가 통증 부위가 될 수 있다. 추가로, 본원에서 사용되는 “적용 부위”는 치료제가 투여되는 대상체 상의 또는 대상체 내의 위치를 지칭한다. 또한, 주입 투여 제제에 대한 적용 위치는 주입 장비가 대상체의 순환계에 유입되는 영역일 수 있다. 또한, 국소 투여 제제의 적용 부위는 국소 투여 제제가 도포되는 피부 또는 점막 부위일 수 있다. 일부 실시형태에서, 적용 부위는 치료 부위와 실질적으로 동일할 수 있다(예를 들어, 조성물 또는 제제는 치료 부위에 직접 투여됨). 다른 실시예에서, 적용 위치는 치료 위치와 상이할 수 있다(예를 들어, 치료 위치로부터 원위). 이러한 경우에 투여는 치료 위치로부터 원위에서 이루어질 수 있지만, 조성물 또는 제제는 여전히 치료 위치에서 치료 효과를 발휘한다.
본원에서 사용되는 “국소 조성물” 또는 “국소 투여” 등은 피부 또는 점막 표면에 직접 투여하기에 적합하고 유효량의 약물이 방출되는 조성물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 국소 조성물은 국부적 또는 국소적 치료 효과를 제공할 수 있다(예를 들어, 적용 부위에서 또는 그 근처에서). 예를 들어, 국소 조성물은 상처, 병변, 화상, 구내염 등(예를 들어, 치료 부위)에 적용될 때, 주로 적용 부위에서 또는 그 주변에서 치료 효과를 발휘할 수 있지만 실질적으로 그 이상의 부위에서는 그렇지 않다. 다른 실시형태에서, 국소 조성물은 일정 부위의 효과를 제공할 수 있다. 예를 들어, 손가락, 팔, 발목, 관절 등과 같은 신체 부위의 피부 표면에 투여되는 국소 조성물은 그 부위 내에서는 치료 효과를 발휘할 수 있지만 실질적으로 그 이상의 부위에서는 그렇지 않다. 예를 들어, 발목 부위에 투여되는 국소 조성물은 예를 들어, 부종, 관절 염증, 통증 등을 감소시킴으로써 발목 내 및 발목 주위에 치료 효과를 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, 국소 조성물은 전신 효과를 제공할 수 있다. 일부 양상에서, 국소 조성물은 약물 또는 활성제 자체가 치료 부위에 도달하는 작용 메카니즘을 통해 치료 효과를 제공할 수 있다. 다른 양상에서, 국소 조성물은 중간 작용 메카니즘, 예를 들어, 효소 캐스케이드와 같은 생화학적 캐스케이드 이벤트 또는 다른 신호전달(예를 들어, 세포 신호전달 또는 세포간/세포내 신호전달) 이벤트를 통해 치료 효과를 제공하여, 궁극적으로 치료 부위에서 원하는 치료 효과를 발휘하게 할 수 있다. 일부 예에서, 이러한 중간 메카니즘은 적용 부위로부터 원위에 있는 치료 부위의 치료를 가능하게 할 수 있다. 또 다른 예에서, 원위 치료 부위의 치료가 발생할 때, 활성제는 적용 부위로부터 치료 부위까지 진피 및 다른 조직을 통해 이동하여 직접적인 효과를 발휘할 수 있다.
본원에서 사용되는 “경피”는 피부 표면에 투여될 때 파손되지 않은 피부 표면을 통한 치료제의 투여 경로를 지칭한다. 경피로 투여되는 경우, 약물 또는 활성제는 적용 부위로부터 치료 부위로 이동하여 치료 효과를 발휘한다. 경피 조성물 및 투여 형태는, 예를 들어, 백킹 필름, 접착제, 저장소 등과 같이 조성물을 피부 표면에서 유지시키는 것을 돕는 구조 및/또는 장치를 포함할 수 있다. 또한, 경피 조성물은 침투 또는 투과 향상제와 같이 적용 부위로부터 치료 부위로(예를 들어, 피부를 통해 대상체의 순환계로) 활성제의 이동을 돕거나 다른 방식으로 용이하게 하는 제제를 포함할 수 있다. 이러한 침투 또는 투과 향상제는 또한 일부 실시형태에서 국소 제제와 함께 사용될 수 있다.
용어 “피부” 또는 “피부 표면”은 하나 이상의 표피층을 포함하는 대상체의 외부 피부, 뿐만 아니라 호흡기(비강 및 폐 포함), 구강(입 및 구강), 질 및 직장 강(rectal cavities)의 점막과 같은 점막 표면도 포함한다. 따라서, “경피”라는 용어는 “경점막”도 포함할 수 있다.
본원에서 사용될 때, 제1 치료제를 제2 치료제와 “공동-투여”하는 것은 적합한 시간 구간 내의 동시 투여를 포함할 수 있다. 한 예에서, 적합한 시간 구간은 1시간, 45분, 30분, 15분, 5분, 2분, 1분 또는 이들의 조합 중 하나 이상 미만일 수 있다. 동시 투여는 동일한 조성물 또는 상이한 조성물로부터 이루어질 수 있다.
본원에서 사용되는, “대상체”는 본원에 개시된 방법 또는 장치로부터 이익을 얻을 수 있는 포유동물을 지칭한다. 대상체의 예에는 인간이 포함되고, 또한 말, 돼지, 소, 개, 고양이, 토끼 및 수생 포유동물과 같은 다른 동물을 포함할 수 있다. 하나의 특정 양상에서, 대상체는 인간이다.
본원에서 사용되는, “투여 요법” 또는 “요법”, 예를 들어, “초기 투여 요법” 또는 “시작 용량” 또는 “유지 투여 요법”은 어떻게, 언제, 얼마나 많이, 얼마나 오랫동안 본 발명의 조성물의 용량이 대상체에게 투여될 수 있는지를 지칭한다. 예를 들어, 대상자에 대한 초기 또는 시작 투여 요법은 식사와 함께 매일 반복하여 30일 동안 적어도 12시간 간격으로 2회 분할 투여로(예: 아침 식사시 한 번 및 저녁 식사시 한 번) 투여하여 약 15mcg/1mL 내지 약 1500mcg/1mL의 총 일일 용량을 제공할 수 있다.
본원에서 사용되는 “일일 용량”은 24시간에 걸쳐 대상체에게 투여되는 활성제(예를 들어, α-RgIA4 펩타이드 유사체)의 양을 지칭한다. 일일 용량은 24시간 동안 2회 이상 투여될 수 있다. 한 실시형태에서, 일일 용량은 24시간 기간 동안 2회 투여를 제공한다. 이를 염두에 두고, “초기 용량” 또는 초기 일일 용량”은 초기 요법 또는 투여 요법 기간 동안 투여된 용량을 지칭한다.
본원에서 사용되는 약물의 “유효량” 또는 “치료적 유효량”은 약물이 효과적인 것으로 알려진 병태를 치료함에 있어서 치료 결과를 달성하기에 충분한 양의 약물이지만 비독성임을 지칭한다. 물질이 의도한 작업을 수행하는 능력에 다양한 생물학적 요인들이 영향을 미칠 수 있는 것으로 이해된다. 따라서 “유효량” 또는 “치료적 유효량”은 일부 경우에 이러한 생물학적 요인에 따라 달라질 수 있다. 또한, 치료 효과의 달성은 의사 또는 기타 자격을 갖춘 의료 인력이 당업계에 알려진 평가를 사용하여 측정할 수 있지만 치료에 대한 개체의 차이와 반응이 치료 효과의 달성을 다소 주관적인 결정으로 만들 수 있는 것으로 인정된다. 유효량의 결정은 약학 및 의학 분야의 통상의 기술 범위에 속한다. 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 포함된 Meiner and Tonascia, “Clinical Trials: Design, Conduct, and Analysis,” Monographs in Epidemiology and Biostatistics, Vol. 8 (1986)을 참조하라.
본원에서 사용되는 “급성” 병태는 빠르게 발전할 수 있고 긴급 또는 준긴급 치료를 필요로 하는 뚜렷한 증상을 가질 수 있는 병태를 지칭한다. 대조적으로, “만성” 병태는 일반적으로 발달 속도가 느리고 시간이 지남에 따라 지속되거나 진행되는 병태를 지칭한다. 급성 병태의 일부 예는 천식 발작, 기관지염, 심장 발작, 폐렴 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 만성 질환의 일부 예는 제한 없이 관절염, 당뇨병, 고혈압, 고콜레스테롤 등을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 “선택성”은 그룹(예를 들어, 세포 그룹) 내에서 또는 그룹들 사이에(예를 들어, 생존할 수 없는 세포 그룹과 생존 세포 그룹) 사이에 차이를 제공하는 작용을 변형하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 이러한 작용은 수용체 결합일 수 있고 그룹들은 제1 수용체 및 제2 수용체일 수 있다. 예를 들어, 제2 수용체와 비교하여 제1 수용체의 “선택적 수용체 결합”은 제1 수용체와 제2 수용체 사이에 선택성 비율의 차이를 제공할 수 있다. 한 예에서 선택성 비율은 1:1 비율과 다르다. 한 예에서, 선택성 비율은 1:1, 2:1, 3:1: 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 100:1, 등, 및 이들의 조합 중 적어도 하나보다 큰 비율일 수 있다.
본원에 사용된 “D-치환 유사체”는 D-아미노산으로 치환된 하나 이상의 L-아미노산을 갖는 본원에 개시된 RgIA 및 RgIA4 유사체를 포함한다. D-아미노산은 유사체 서열에서 발견되는 것과 동일한 아미노산 유형이거나 상이한 아미노산일 수 있다. 따라서 D-유사체도 변이체이다.
본원에 사용되는 “변이체”는 하나 이상의 아미노산이 비아미노산 성분으로 대체되거나 아미노산이 작용기에 접합되거나 작용기가 다른 방식으로 아미노산과 회합되어 있는 본원에 개시된 RgIA 유사체를 포함한다. 변형된 아미노산은, 예를 들어, 글리코실화된 아미노산, PEG화된 아미노산(폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체의 공유 및 비공유 부착 또는 아말감화), 파르네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 아실화된 아미노산, 비오틴화된 아미노산, 인산화된 아미노산, 지방산과 같은 지질 모이어티에 접합된 아미노산, 또는 유기 유도체화제에 접합된 아미노산일 수 있다. 변형된 아미노산의 존재는, 예를 들어, (a) 폴리펩타이드 혈청 반감기 및/또는 기능적 생체내 반감기 증가, (b) 폴리펩타이드 항원성 감소, (c) 폴리펩타이드 저장 안정성 증가, (d) 펩타이드 용해도 증가, (e) 순환 시간 연장, 및/또는 (f) 생체이용률 증가, 예를 들어, 곡선아래 면적(AUCsc) 증가에서 이로울 수 있다. 아미노산(들)은, 예를 들어, 재조합 생산 동안 번역과 동시에 또는 번역 후 변형되거나(예: 포유동물 세포에서 발현되는 동안 N-X-S/T 모티프에서 N-연결 글리코실화) 합성 수단에 의해 변형될 수 있다. 변형된 아미노산은 서열 내에 또는 서열의 말단에 존재할 수 있다. 변이체는 본원의 다른 곳에서 설명된 유도체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 “I-3-Y”는 3-아이오도-티로신이고, “3-R-티로신” 및 “R-3-Y”는 3-클로로-티로신, 3-플루오로-티로신, 3-아이오도-티로신 및 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 잔기이다.
본원에서 사용된 “Cit”는 시트룰린이다.
본원에 사용된 “iY”는 L-3-아이오도-티로신이다.
본원에서 사용되는 “Dap”는 L-2,3-다이아미노프로피온산이다.
본원에서 사용된 “bA” 및 “bA”는 β-알라닌이다.
본원에서 사용되는 “bhY”는 베타-호모티로신이다.
본원에서 사용되는 “Xaa”는 임의의 아미노산이다. 또한, 본 명세서에서 사용된 Xaa는 모든 아미노산에 대한 명시적인 뒷받침을 제공한다. 예를 들어, Xaa는 모든 아미노산 또는 이의 유도체에 대한 뒷받침을 제공한다. 예를 들어, Xaa는 알라닌(Ala 또는 A), 아르기닌(Arg 또는 R), 아스파라긴(Asn 또는 N), 아스파르트산(Asp 또는 D), 시스테인(Cys 또는 C), 글루탐산(Gly 또는 E), 글루타민(Gln 또는 Q), 글리신(Gly 또는 G), 히스티딘(His 또는 H), 이소류신(Ile 또는 I), 류신(Leu 또는 L), 리신(Lys 또는 K), 메티오닌(Met 또는 M) , 페닐알라닌(Phe 또는 F), 프롤린(Pro 또는 P), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 트립토판(Tyr 또는 W), 티로신(Tyr 또는 Y), 발린(Val 또는 V), 셀레노시스테인(Sec 또는 U), 피롤리신(Pyl 또는 O) 등, 또는 이들의 조합을 뒷받침한다.
본원에서 사용되는, 본원에 개시된 “RgIA 유사체의 변이체” 또는 “RgIA-4 유사체의 변이체”는 본원에 개시된 RgIA 펩타이드 또는 본원에 개시된 RgIA-4 펩타이드와 비교하여 하나 이상의 아미노산 첨가, 결실 또는 치환을 갖는 펩타이드를 포함한다.
본원에 개시된 실시형태는 본원에 기재된 RgIA 유사체, 뿐만 아니라 본원에 기재된 RgIA 유사체의 변이체, D-치환된 유사체, 변형 및 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체, D-치환 유사체, 변형 및 유도체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 서열 추가, 결실, 치환, 대체, 접합, 회합, 또는 순열을 갖는다. 본원에 개시된 각각의 유사체 펩타이드는 또한 본원에 개시된 유사 펩타이드 서열의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15를 포함하는 임의의 위치에서 추가, 결실, 치환, 대체, 접합, 회합 또는 순열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서 Xaa 위치는 유사체 펩타이드의 임의의 위치에 포함될 수 있으며, 여기서 Xaa는 추가, 결실, 치환, 교체, 접합, 회합 또는 순열을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 각각의 유사체 펩타이드는 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 중 하나 이상에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 Xaa 위치를 가진다.
유사체는 하나 이상의 변화(추가, 결실, 치환, 대체, 접합, 회합 또는 순열)를 가질 수 있으며 하나 이상의 변이체, D-치환 유사체, 변형 및/또는 유도체로서 자격이 부여된다. 즉, 유사체, 변이체, D-치환 유사체, 변형 및/또는 유도체 중 하나의 분류를 포함시키는 것은 다른 분류에 포함하는 것을 제외시키지 않으며 모두 본원에서 “유사체 펩타이드”로 총칭한다.
아미노산 치환은 보존적 또는 비보존적 치환일 수 있다. 본원에 개시된 RgIA 유사체의 변이체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 것을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 “보존적 치환”은 다음의 보존적 치환기들 중 하나에서 발견되는 치환을 포함한다: 그룹 1: 알라닌(Ala 또는 A), 글리신(Gly 또는 G), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T); 그룹 2: 아스파르트산(Asp 또는 D), 글루탐산(Glu 또는 E); 그룹 3: 아스파라긴(Asn 또는 N), 글루타민(Gln 또는 Q); 그룹 4: 아르기닌(Arg 또는 R), 리신(Lys 또는 K), 히스티딘(His 또는 H); 그룹 5: 이소류신(Ile 또는 I), 류신(Leu 또는 L), 메티오닌(Met 또는 M), 발린(Val 또는 V); 및 그룹 6: 페닐알라닌(Phe 또는 F), 티로신(Tyr 또는 Y), 트립토판(Trp 또는 W).
또한, 아미노산은 유사한 기능, 화학 구조 또는 조성(예를 들어, 산성, 염기성, 지방족, 방향족, 황 함유)에 의해 보존적 치환기로 그룹화될 수 있다. 예를 들어, 지방족 그룹화는 치환을 위해 Gly, Ala, Val, Leu 및 Ile을 포함할 수 있다. 서로에 대해 보존적 치환으로 간주되는 아미노산을 포함하는 다른 그룹에는 다음이 포함된다: Met 및 Cys; 산성: Asp, Glu, Asn 및 Gln; 소형 지방족, 비극성 또는 약간 극성인 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; 극성, 음전하 잔기 및 이의 아마이드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; 극성, 양전하 잔기: His, Arg 및 Lys; 큰 지방족 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 대형 방향족 잔기: Phe, Tyr, 및 Trp. 추가 정보는 Creighton(1984) Proteins, WH Freeman and Company에서 찾을 수 있다.
본원에서 사용되는 “양성 아미노산”은 단백질 생성 양성 아미노산 His, Arg 및 Lys 및 비단백질 생성 양성 아미노산을 포함한다.
본원에서 사용되는 “방향족 아미노산”은 단백질 생성 방향족 아미노산 Phe, Tyr 및 Trp 및 비단백질 생성 방향족 아미노산을 포함한다.
본원에 개시되거나 언급된 RgIA 유사체 또는 RgIA-4 유사체의 변이체는 또한 본원에 개시되거나 참조된 펩타이드 서열에 대해, 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95%, 적어도 96% 서열 동일성, 적어도 97% 서열 동일성, 적어도 98% 서열 동일성, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 보다 구체적으로, 본원에 개시된 RgIA 유사체 또는 RgIA-4 유사체의 변이체는 서열번호 1-13 중 어느 하나와 70% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 80% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 81% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 82% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 83% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 84% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 85% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 86% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 87% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 88% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 89% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 90% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 91% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 92% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 93% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 94% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 95% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 96% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 97% 서열 동일성; 서열번호 1-13 중 어느 하나와 98% 서열 동일성; 또는 서열번호 1-13 중 어느 하나와 99% 서열 동일성을 공유하는 펩타이드를 포함한다.
합성 진통 펩타이드의 C-말단은 카르복시산 또는 아마이드 기일 수 있다. 본 발명은 또한 (i) C-말단에 이루어진 부가, 예를 들어, 티로신, 3-아이오도-티로신, 형광 태그, 지질, 탄수화물 또는 베타-호모 아미노산, D/L-설포노-γ-AA펩타이드, L-γ-AA펩타이드, 및/또는 (ii) N-말단에 이루어진 부가, 예를 들어, 티로신, 3-아이오도-티로신, 피로글루타메이트, 형광 태그, 지질, 탄수화물 또는 베타- 호모아미노산에 의해 추가로 변형된 RgIA 유사체에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 “유전자”는 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 이 정의는, 변경이 인코딩된 펩타이드의 기능에 영향을 미치지 않는 다양한 서열 다형성, 돌연변이 및/또는 서열 변이체를 포함한다. 용어 “유전자”는 코딩 서열, 뿐만 아니라 프로모터, 인핸서 및 종결 영역과 같은 조절 영역을 포함할 수 있다. “유전자”는 대체 스플라이스 부위로부터 생성된 변이체들과 함께 mRNA 전사체로부터 스플라이싱된 모든 인트론 및 기타 DNA 서열을 추가로 포함할 수 있다. 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은 펩타이드의 발현을 지시하는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 이들 핵산 서열은 RNA로 전사되는 DNA 가닥 서열 또는 단백질로 번역되는 RNA 서열일 수 있다. 핵산 서열은 전장 핵산 서열, 뿐만 아니라 전장 단백질로부터 유래된 전장이 아닌 서열을 모두 포함한다. 서열은 또한 천연 서열 또는 특정 세포 유형에서 코돈 선호도를 제공하기 위해 도입될 수 있는 서열의 축퇴 코돈을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 펩타이드를 인코딩하는 유전자 서열들은 공개적으로 이용가능한 데이터베이스 및 간행물에서 이용가능하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 특정 아미노산의 언급은 또한 특정 아미노산 및 이의 임의의 유사체, 변이체, D-치환 유사체, 변형 및/또는 유도체에 대한 뒷받침을 포함한다. 한 예에서, 티로신의 언급은 또한 명시적으로 3-클로로-티로신, 3-플루오로-티로신, 3-아이오도-티로신, 티로신, 오르토-티로신, 3-니트로-티로신, 3-아미노-티로신, O-메틸-티로신, 2,6-디메틸-티로신, 베타-호모-티로신, Boc-Tyr(3,5-I2)-OSu, [CpRu(Fmoc-티로신)]CF3CO2, O-(2-니트로벤질)-L-티로신 하이드로클로라이드, 3-니트로-L-티로신 에틸 에스테르 하이드로클로라이드, N-(2,2,2-트리플루오로메틸)-L-티로신 에틸 에스테르, DL-o-티로신 등, 또는 이들의 조합에 대한 뒷받침을 포함한다. 한 예에서, 시스테인의 언급은 또한 명시적으로 시스테인, L-시스테익 애시드 모노하이드레이트, L-시스테인술피닉 애시드 모노하이드레이트, 셀레노-L-시스틴 등 또는 이들의 조합에 대한 뒷받침을 포함한다. 한 예에서, 리신의 언급은 또한 명시적으로 Fmoc-Lys(Me,Boc)-OH, Fmoc-Lys(Me)3-OH 클로라이드, Fmoc-L-Lys(Nvoc)-OH, Fmoc-Lys(팔미토일)-OH, Fmoc-L-포토-리신, DL-5-하이드록시리신 하이드로클로라이드, HL-포토-리신 HCl 등 또는 이들의 조합에 대한 지지를 포함한다.
본 명세서에서 “포함하다”, “포함하는 것”, “함유하는” 및 “가지는” 등은 미국에서 그들에게 부여된 의미를 가질 수 있다. 특허법은 “포함하다”, “비롯한” 등을 의미할 수 있으며 일반적으로 개방형 용어로 해석된다. “~로 구성되는” 또는 “~로 구성된다”라는 용어는 폐쇄형 용어이며, 이러한 용어와 함께 구체적으로 열거된 구성요소, 구조, 단계 등만을 포함하며 이 또한 미국 특허법에 따른다. “본질적으로 구성되는” 또는 “본질적으로 구성된다”는 미국 특허법에 의해 일반적으로 부여되는 의미를 가진다. 특히, 이러한 용어는 일반적으로 폐쇄형 용어이며, 이러한 용어와 연결하여 사용되는 항목(들)의 기본적인 그리고 새로운 특성 또는 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는, 추가 항목, 재료, 구성 요소, 단계 또는 요소들을 포함하는 것은 예외적으로 허용된다. 예를 들어, 조성물에 존재하지만 조성물의 성질이나 특성에 영향을 미치지 않는 미량 원소는 이러한 용어에 수반되는 항목들의 목록에 명시적으로 언급되지 않는다 하더라도 “본질적으로 구성되는”이라는 표현하에 존재하는 경우 허용될 것이다. 본 명세서에서 “포함하는” 또는 “비롯한”과 같은 개방형 용어를 사용하는 경우, “~로 본질적으로 구성되는” 이라는 표현, 뿐만 아니라 “~으로 구성되는”이라는 표현에도 마치 명시적으로 언급된 것처럼 직접적인 뒷받침이 제공될 수 있는 것으로 이해되며, 그 역도 그러하다.
설명 및 청구범위 (존재하는 경우)에서 “제1”, “제2”, “제3”, “제4” 등의 용어는 유사한 요소를 구별하는 데 사용되며 꼭 특정한 순차적 또는 연대적 순서를 설명하는 데 사용되는 것은 아니다. 이렇게 사용된 임의의 용어들은 적절한 상황에서 호환가능하여 본 명세서에 기재된 실시형태가 예를 들어 본원에 설명된 것 또는 다른 방식으로 본원에 기재된 것과 다른 순서로 작동할 수 있음을 이해해야 한다. 유사하게, 방법이 일련의 단계를 포함하는 것으로 본원에 기재되어 있는 경우, 본원에 제시된 이러한 단계의 순서는 반드시 그러한 단계가 수행될 수 있는 유일한 순서는 아니며, 언급된 단계 중 일부는 생략될 수 있고 및/또는 본원에 설명되지 않은 다른 특정 단계가 방법에 추가될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, “증가된”, “감소된”, “더 나은”, “나쁜”, “더 높은”, “더 낮은”, “향상된”, “개선된”, “최대화된”, “최소화된” 등과 같은 비교 용어는 주변 또는 인접 영역에 있거나 유사한 상황에 놓여있거나 단일 장치 또는 조성으로 또는 비등한 다수의 장치 또는 조성들로 존재하거나, 하나의 그룹 또는 클래스로 존재하거나, 다수의 그룹들 또는 클래스들로 존재하거나, 또는 해당 분야의 공지된 상태와 비교하여 기타 장치, 구성요소, 조성, 생물학적 반응, 생물학적 상태, 또는 활성들과 측정가능하게 상이한 장치, 구성요소, 조성, 생물학적 반응, 생물학적 상태, 또는 활성의 성질을 지칭한다. 예를 들어, 신경학적 통증을 감소시키는 “개선된” 성능을 갖는 α-RgIA4 유사체는 다른 α-RgIA4 유사체와 비교하여 안정성, 결합 효능, 효능(potency) 또는 기타 성능 관련 특성의 적어도 하나의 양상과 관련하여 개선을 나타낼 것이다.
본원에서 사용되는 복수의 항목, 구조적 요소, 구성 요소 및/또는 재료는 편의상 공통 목록으로 제시될 수 있다. 그러나 이러한 목록은 목록의 각 구성원이 개별적으로 고유한 구성원으로 식별되는 것처럼 해석되어야 한다. 따라서 이러한 목록의 어떤 개별 구성원도 반대의 언급이 없는 한 공통 그룹에서의 이들의 제시에만 기초하여 동일한 목록의 다른 구성원과 사실상 동등한 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에서 사용되는 용어 “~중 적어도 하나”는 “하나 이상의 ~”와 동의어인 것으로 한다. 예를 들어, “A, B 및 C 중 적어도 하나”는 명시적으로 A만, B만, C만 또는 이들의 조합을 포함한다.
농도, 양, 수준 및 기타 수치 데이터는 본원에서 범위 형식으로 표현되거나 제시될 수 있다. 이러한 범위 형식은 단지 편의와 간결성을 위해 사용되는 것이므로, 해당 범위의 한도값으로 명확하게 언급된 수치 값을 포함할 뿐만 아니라, 해당 범위내 포함되는 모든 개개의 수치 값들 또는 하위-범위들 또는 소수 단위가 마치 각 수치값 및 하위-범위가 명확하게 언급된 것처럼 이들을 포함하는 것으로 유연한 방식으로 해석되어야 함을 이해하여야 한다. 예를 들어, “약 1 내지 약 5”의 수치 범위는 약 1 mg 내지 약 5 mg의 명시적으로 인용된 값들 뿐만 아니라 표시된 범위 내의 개별 값 및 하위 범위도 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서 이 수치 범위에는 2, 3, 4와 같은 개별 값과 1-3, 2-4, 3-5와 같은 하위 범위, 뿐만 아니라 개별적으로 1, 2, 3, 4, 및 5를 포함한다. 이와 동일한 원칙이 최소값 또는 최대값으로 하나의 숫자 값만 언급하는 범위에 적용된다. 또한, 이러한 해석은 기술되는 범위 폭이나 특성에 관계없이 적용되어야 한다.
임의의 방법 또는 공정 청구범위에 언급된 임의의 단계는 임의의 순서로 실행될 수 있으며 청구범위에 제시된 순서로 제한되지 않는다. 기능식 제한조건들은 특정 청구항 제한에 대해 다음 조건들 모두가 해당 제한에 존재하는 경우에만 사용될 것이다: a) “~를 위한 수단” 또는 “~를 위한 단계”가 명시적으로 언급된 경우; 및 b) 해당 기능이 명시적으로 언급된 경우. 기능식 청구항을 뒷받침하는 구조, 재료 또는 작용들은 본원의 상세한 설명에서 명시적으로 언급된다. 따라서, 본 발명의 범위는 본원에 제공된 설명 및 실시예에 의해서가 아니라 첨부된 청구범위 및 법적 균등물에 의해서만 결정되어야 한다.
본원에 사용된 용어 “커플링된”은 화학적, 기계적, 전기적 또는 비전기적 방식으로 직접 또는 간접적으로 연결된 것으로 정의된다. 본원에서 서로 “인접한” 것으로 설명된 개체들은 해당 문구가 사용되는 맥락에 따라 서로 물리적으로 접촉하거나 서로 근접하거나 서로 동일한 일반 영역 또는 구역에 있을 수 있다.
본 명세서에서 “한 실시형태에서” 또는 “한 양상에서”라는 어구는 반드시 모두가 동일한 실시형태 또는 양상을 지칭하는 것은 아니다. 본 명세서 전반에 걸쳐 “한 예”라는 지칭은 해당 예과 관련하여 기재된 특정한 특징, 구조 또는 특성이 최소한 하나의 실시형태에 포함됨을 의미한다. 그러므로, 본원 전반에 걸쳐 여러 부분에서 “한 예에서”라는 어구의 사용은 반드시 모두 동일한 실시형태를 언급하는 것은 아니다.
예시 실시형태
본 발명의 실시형태의 초기 개요가 아래에 제공되고 특정 실시형태들을 더 상세히 설명한다. 이러한 처음 부분의 요약은 독자가 기술 개념을 더 빨리 이해하도록 돕기 위한 것이지만 핵심 또는 필수 기능을 식별하기 위한 것이 아니며 청구된 주제의 범위를 제한하기 위한 것도 아니다.
해양 포식 원뿔 달팽이의 독에서 파생된 코노톡신(CTxs)은 신경병성 통증과 관련된 이온 채널에 대한 높은 효능과 선택성으로 인해 비-오피오이드 진통제의 유망한 후보가 된다. 지코노타이드(Prialt®)로도 알려진 ω-코노톡신 MVIIA는 전압 개폐 칼슘 채널 하위형(Cav2.2)을 선택적으로 표적하며 2004년에 미국 FDA에서 승인되었고, 난치성 만성 통증의 치료를 위해 임상적으로 사용되어왔다.
니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR)는 말초신경계와 중추신경계 모두에 전반적으로 분포하며 빠른 시냅스 전달을 매개하고, 신경병성 통증, 파킨슨병, 정신분열증, 알코올 및 약물 중독을 비롯한 광범위한 신경계 장애에 관여하는, 막횡단 리간드 개폐 양이온 채널 그룹이다. α, β, γ, δ 및 ε을 포함한 다양한 nAChR 서브유닛들은 이러한 동종 또는 이종 5량체 수용체 내에서 다양한 조합으로 연합되어 뚜렷한 약리학적 및 생물리학적 기능을 가진 복잡하고 다양한 nAChR 하위형을 생성한다. nAChR은 이전에 진통제 발견을 위해 표적이 되었지만 좁은 치료 범위 및 무차별적인 하위형 표적화로 인한 부작용으로 인해 진행에 방해가 있었다.
최근 연구에서는 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 하위형의 억제가 화학 요법으로 유발된 신경병성 통증에 대한 잠재적인 비-오피오이드 기반 메커니즘인 것으로 확인되었다. α9α10 nAChR 길항제 중에서, 모체 서열 α-RgIA로부터 변형된 2세대 유사체 α-RgIA4는 “종 관련 친화도 격차”를 넘어 설치류(IC50 0.9 nM) 및 인간 α9α10 nAChR(IC50 1.5 nM) 모두에 대해 높은 효능을 나타내며, 다른 하위형 및 다른 통증 관련 수용체들을 억제하지 않는다(예를 들어, 선택도 > 1000배). 따라서 α-RgIA4는 비-오피오이드 진통제 개발을 위한 선도 화합물로서의 잠재력을 가지고 있다.
그러나 다이설파이드가 풍부한 다른 펩타이드 약물 분자와 마찬가지로, α-RgIA4는 프로테아제 내성이 낮고 혈장 반감기가 짧기 때문에 좋지 않은 후보이다. 이는 티올/다이설파이드 교환 반응에 의해 유도된 다이설파이드 스크램블링에 의해 유발되며, 이는 도 1b-A에서 보는 바와 같이 활성 및 비활성 형태 사이의 열역학적 안정성의 한계 차이들로 인해 형태 변화 및 효능의 실질적인 손실을 초래한다. 구조적으로, CTx는 고도로 보존된 시스테인 프레임워크에 의존하여, 수용체 인식, 효능, 및 선택성에 중요한 견고한 구조들을 유지시킨다. 불행하게도, 다이설파이드가 풍부한 다른 펩타이드들과 마찬가지로, RgIA4는 생리학적 환경을 환원시킴에 있어서 다이설파이드-스크램블링에 취약하여, 3차원 구조들의 동시 교번, 응집, 치료 효능 감소 및 면역원성 부작용 증가를 초래할 수 있다.
다이설파이드 모방체는 이 문제를 해결하고 추가 임상 개발을 위해 생체 이용가능한 화합물을 생산하고자 시도해 왔다. 그러나 다이설파이드 모방체는 구조적 교란을 일으켜 효능 손실을 가져올 수 있다. 예를 들어, 천연 다이설파이드 대신에 비환원성 다이카르바 가교를 갖는 α-RgIA 유사체는 다이설파이드 스크램블링에 영향을 받지 않지만 천연 펩타이드와 비교하여 현저하게(즉, 2배 크기) 감소된 효능을 갖는다. 가요성의 말단 프로테아제 인식 영역들을 숨겨서 CTxs 안정화하기 위한 또 다른 방법으로 “머리-꼬리(Head-to-tail)” 백본 고리화(backbone cyclization)가 시도되었다. 예를 들어, cRgIA-6는 다른 백본 고리화된 유사체와 함께 혈청 안정성의 증가를 나타냈다; 그러나 이러한 증가된 안정성은 인간 α9α10 nAChR에 대한 효능을 감소시켰다.
도 7a-C에 도시된 바와 같이, 다이카르바, 포화 다이카르바, 알카인, 티오에테르, 에테르, 다이셀레나이드(Sec) 및 트라이아졸 가교 대체를 포함하는 전략이 CTxs 변형에서 시도되었다. 그러나 이러한 전략은 모방 모이어티의 비호환성, 생체활성 감소 및 독성으로 인해 광범위한 적용 가능성이 부족하다. 머리-꼬리 백본 고리화는 분해 방지를 통해 펩타이드 안정성을 향상시키는 또 다른 전략이지만, RgIA를 적용할 때 α9α10 nAChR 결합 친화도에 있어서 효능 저하를 초래했다.
한 실시형태에서, α-RgIA에 도입된 락탐 링키지는 활성 구형 형태의 분해를 방지하고 다이설파이드 스크램블링을 억제한다. 거대고리 펩타이드의 NMR 구조는 α-RgIA4의 NMR 구조와 잘 중첩되어, 상기 고리화가 백본 및 측쇄 잔기의 전체 형태를 교란시키지 않는다는 것을 보여준다. 마지막으로, 분자 도킹 모델은 거대고리 유사체와 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 사이의 선택적 결합을 합리화할 수 있다. 생체 내 테스트는 진행 과정에서 논의된 유사체 6이 화학요법으로 유발된 신경병성 통증 모델에서 통증을 예방할 수 있음을 나타낸다. 구조적으로, 도입된 락탐 결합은 생체활성 형태를 강화하고, 다이설파이드 스크램블링을 억제하고, 인간 혈청 안정성을 증가시키는 추가적인 형태적 제약을 제공할 수 있다. 따라서 이러한 형태적 제약된 길항제는 항통각수용 치료 개입을 위한 유망한 후보이다.
또 다른 실시형태에서, RgIA 유사체는 다이설파이드 대체물인 메틸렌 티오아세탈에 의해 안정화되어 비-오피오이드 진통제로서 인간 α9α10 nAChR을 표적화할 수 있다. RgIA 골격에서 다이설파이드 루프 I[CysI-CysIII]를 메틸렌 티오아세탈로 대체하면 상당한 효능 손실이 발생할 수 있는 반면, 메틸렌 티오아세탈이 있는 가교화 루프 II[CysII-CysIV]는 수용되어 유사체의 생체활성을 유지할 수 있다. 한 분자인 RgIA-5524는 0.9 nM의 IC50으로 인간 α9α10 nAChR을 매우 선택적으로 억제한다. 더욱이, RgIA-5524는 인간 혈청에서 RgIA4에 비해 분해에 대해 크게 증가된 내성을 보였다. 마우스를 대상으로 한 생체내 연구에서 RgIA-5524가 화학 요법으로 유발된 신경병성 통증을 완화시키는 것으로 나타났다. RgIA-5524는 α9 녹아웃 마우스에서 신경병성 통증을 완화하지 못했으며, 이는 이러한 관찰된 RgIA-5524의 치료 효과에 α9-함유 nAChR이 사용됨을 입증하는 것이다. 따라서, 메틸렌 티오아세탈은 코노톡신 기반 및 다이설파이드가 풍부한 다른 펩타이드 약물 발견에서 다이설파이드 대체물로 적용될 수 있다.
α-CTxs 작용 치료 메커니즘에 관하여 논란이 지속되고 있는데 수많은 연구는 GABAB 수용체의 자극이 사용된다고 주장하고 한편 다른 연구들은 α9 nAChR의 차단이 사용됨을 나타낸다. 본원에 개시된 연구는 야생형 및 녹아웃(KO) 마우스가 선택적 α9α10 nAChR 길항제가 진통제일 뿐만 아니라 α9-nAChR 서브유닛의 존재가 진통제 활성에 사용됨을 입증한다는 것을 보여준다.
한 실시형태에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체는 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 결합하도록 구성된 인식 핑거 영역과 시스테인 간 황 링키지를 보호하는 측쇄 결합 구성을 포함할 수 있다. 이러한 유사체는 α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 2.5% 이상인 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 결합 친화도를 가질 수 있다.
또 다른 실시형태에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체는 보호된 시스테인간 황 링키지에 의해 유지되는 구조(예를 들어, 구형)를 가질 수 있다. 이러한 구조(예를 들어, 구형)는 α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 2.5% 이상인 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 결합 친화도를 제공할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체는 D P R을 포함하는 인식 핑거 영역; 및 CI, CII, CIII, 및 CIV를 포함하는 시스틴 잔기를 포함할 수 있다. 시스테인 잔기 CI 및 CIII는 제1 시스테인 간 황 링키지에 의해 연결될 수 있고, 시스테인 잔기 CII 및 CIV는 제2 시스테인 간 황 링키지에 의해 연결될 수 있다. 제2 시스테인 간 황 링키지는 측쇄 결합 구성에 의해 보호될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, α-RgIA4 유사체에서 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 α-RgIA4 효능을 유지하는 방법은 시스테인 간 황 링키지를 측쇄 결합 구성으로 보호하여 유사체의 인식 핑거 영역을 α-RgIA4 구성(예: 구형 α-RgIA4 구성)으로 유지시키는 것을 포함할 수 있다.
하나 이상의 실시형태에서, 조성물은 치료적 유효량의 유사체와 약학적으로 허용되는 담체의 조합을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 대상체에서 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 결합에 반응하는 병태를 치료하는 방법은 치료적 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
α-RgIA4 유사체
측쇄 고리화는 적용될 수 있는 한 가지 펩타이드 안정화 방법이다. 예를 들어, 제3 고리화 가교는 도 1b-B에 도시된 바와 같이 결합 활성을 유지하면서 α-RgIA 유사체의 활성 형태를 강화하기 위해 측쇄 고리화를 통해 말단에 삽입될 수 있다. 높은 효능, 수용체 선택성 및 향상된 혈청 안정성을 지닌 형태적으로 제약된 α-RgIA 유사체는 인간 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체를 표적할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 유사체 6은 α-RgIA에 도입된 락탐 링키지가 활성 구형 형태의 분해를 방지하고 다이설파이드 스크램블링을 억제할 수 있음을 입증한다.
또 다른 안정화 방법에서는 다이설파이드에 최소한의 기능성 탄소 단위(CH2)를 삽입함으로써 환원 불가능한 메틸렌 티오아세탈이 효율적인 다이설파이드 대체물이 되게 할 수 있다. 다이설파이드를 메틸렌 티오아세탈로 대체하면 RgIA 유사체의 구형 활성 구조를 안정화할 수 있다. 한 예에서, RgIA-5524는 다른 통증 관련 이온 채널 및 수용체와 비교하여 높은 선택성으로 인간 α9α10 nAChR에서 높은 효능(예: IC50 = 0.9 nM)을 나타냈다.
한 실시형태에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체는 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 결합하도록 구성된 인식 핑거 영역과 시스테인 간 황 링키지를 보호하는 측쇄 결합 구성을 포함할 수 있다. 이러한 유사체는 α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 2.5% 이상인 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 결합 친화도를 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체는 보호된 시스테인간 황 링키지에 의해 유지되는 구조(예를 들어, 구형)를 가질 수 있다. 이러한 구조(예를 들어, 구형)는 α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 2.5% 이상인 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 결합 친화도를 제공할 수 있다.
인식 링거 영역은 도 6a에 모델링된 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체, 및 도 7a-B에 모델링된 α9 서브유닛 결합하도록 구성될 수 있다. 결합이 일어나도록 인식 핑거 영역의 구조가 유지되어야 한다. 인식 핑거 영역의 구조(및 그에 따른 인식 핑거 영역의 결합 친화도)를 유지하는 한 가지 방법은 α-RgIA4 펩타이드 유사체에서 발견되는 4개의 시스테인 잔기들 사이의 시스테인 간 링키지를 보호하는 것을 포함할 수 있으며, 이는 CI, CII, CIII, 및 CIV와 같은 순서로 넘버링될 수 있다.
시스테인 간 황 링키지는 각 시스테인 상의 황들 사이의 직접적 측쇄 링키지(예: CII 상의 황은 CIV 상의 황에 연결될 수 있음) 또는 각 시스테인 상의 황들 사이의 간접적 링키지(예: CII 상의 황은 탄소와 같은 중간체를 통해 CIV의 황에 연결됨)를 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, 시스테인 간 황 링키지는 측쇄 결합 구성에 의해 보호될 수 있다. 한 양상에서, 측쇄 결합 구성은 메틸렌 티오아세탈, 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화된 N-말단 아미노산 측쇄, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
측쇄 결합 구성이 메틸렌 티오아세탈인 경우, 측쇄 결합 구성은 α-RgIA4 펩타이드 유사체에서 CII와 CIV 사이의 시스테인간 링키지를 포함할 수 있다. 이 위치에 측쇄 결합 구성(예: 메틸렌 티오아세탈)을 배치하면 α RgIA4 펩타이드와 비교할 때 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 유사체의 효능을 감소시키지 않고 상기 유사체를 구형의 활성 형태로 안정화할 수 있다. 한편, CI 및 CIII 사이의 시스테인 간 링키지로서 측쇄 결합 구성(예를 들어, 메틸렌 티오아세탈)을 배치하는 것은 α-RgIA4 펩타이드와 비교할 때 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대해 향상된 효능을 제공하지 않는다.
많은 유사체(예를 들어, 유사체 1 내지 6)는 α-RgIA4 펩타이드의 구형 형태를 유지하였다. 그러나 효능이 더 작은 RgIA-5617과 효능이 더 큰 유사체(RgIA4, RgIA-5533 및 5524) 사이의 한 가지 차이점은 시스테인 쌍들의 Cα 거리였다. RgIA-5617에서 두 시스테인 쌍들의 Cα 거리는 RgIA4, RgIA-5533 및 RgIA-5524(예를 들어, 평균 5.4-6.1Å)를 비롯한 다른 활성 분자들과 비교하여 단축되었다(예: 시스테인 루프 I 및 루프 II에서 각각 평균 4.8 및 4.7Å). 한 실시예에서 루프-I(예: cysI-cysIII)의 메틸렌 티오아세탈 대체로 인해 발생하는 효능 손실은 구조적 수축을 유발하여 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 결합 친화도를 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 알파-CTxs의 루프-I 다이설파이드는 α9(+) 표면의 C-루프 다이설파이드와 직접 접촉하여 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체를 향한 적층 상호 작용을 제공할 수 있다. 따라서 이 루프에서 메틸렌 티오아세탈 대체는 이 결합 부위를 방해함으로써 효능이 더 큰 유사체에 비해 효능 감소를 유발할 수 있다.
측쇄 결합 구성이 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화된 N-말단 아미노산 측쇄인 경우, N-말단 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고 C-말단 아미노산은 리신, 호모리신, 오르니틴, L-2,4-다이아미노부티르산 및 L-2,3-다이아미노프로피온산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 예에서, C-말단 아미노산은 리신 및 L-2,3-다이아미노프로피온산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 한 예에서, N-말단 아미노산은 글루탐산일 수 있고 C-말단 아미노산은 리신일 수 있다.
측쇄 결합 구성은 α-RgIA4 펩타이드와 비교할 때 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 향상된 결합 친화도를 갖는 각각의 α-RgIA4 유사체를 제공할 수 있다. 예를 들어, 상기 유사체는 2.5%, 5%, 7.5%, 15%, 25%, 40%, 50%, 80% 중 적어도 하나 이상이거나 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도와 동일한 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 결합 친화도를 가질 수 있다. 추가로, 상기 유사체는 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도보다 더 큰 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 결합 친화도를 가질 수 있다.
측쇄 결합 구성은 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대해 향상된 결합 친화도를 갖는 α-RgIA4 유사체를 제공할 수 있을 뿐만 아니라 α-RgIA4 펩타이드의 효능에 비해 효능의 증가를 제공할 수도 있다. 한 예에서, 상기 유사체는 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값과 실질적으로 동일한 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값을 제공할 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 유사체는 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 2.0배, 3.0배, 5.0배, 15.0배, 25.0배 중 적어도 하나 이상 이하인 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값을 제공할 수 있다. IC50 값은 값이 낮을 때 더 높은 효능을 갖는데, 이는 보다 낮은 값은 보다 낮은 농도가 억제의 50% 임계값을 달성할 수 있음을 나타내기 때문이다.
한 양상에서, 보호된 시스테인간 링키지는 CI과 CIII, CII와 CIV 사이의 시스테인간 링키지(예를 들어, 측쇄 링키지) 또는 이들의 조합 중 하나 이상일 수 있다. 보호된 시스테인간 링키지(측쇄 결합 구성에 의해 보호될 수 있음)는 α-RgIA4 펩타이드 또는 보호된 시스테인 간 황 링키지가 없는 α-RgIA4 펩타이드 유사체와 비교하여 다이설파이드 가교 스크램블링, 다이설파이드 가교 분해 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 감소시킬 수 있다. 다이설파이드 가교 스크램블링은 펩타이드의 다이설파이드 가교들이 분해된 다음 다른 구성으로 재형성될 때 발생할 수 있다. 예를 들어, 제1 구성에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체는 CI과 CIII 사이에 제1 다이설파이드 가교를 가질 수 있고 CII와 CIV 사이에 제2 다이설파이드 가교를 가질 수 있다. 스크램블링 후, CI과 CIV 사이에 제1 다이설파이드 가교와 CII와 CIII 사이에 제2 다이설파이드 가교가 존재할 수 있다. 다이설파이드 가교 스크램블링은 펩타이드를 구조적으로 변화시켜 원하는 펩타이드 기능(예: α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체의 억제)을 방해할 수 있다. 다이설파이드 가교 분해는 다이설파이드 가교가 재형성되지 않고 분해될 때 발생할 수 있다. 이러한 분해는 또한 펩타이드를 구조적으로 변화시켜 원하는 펩타이드 기능을 방해할 수 있다.
측쇄 결합 구성은 또한 시스테인간 황 링키지를 보호하여, 인간 혈청에서의 α-RgIA4 펩타이드 유사체에 대하여, 인간 혈청에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성보다 더 큰 안정성을 제공 할 수 있다. 한 양상에서, 인간 혈청에서의 안정성은 0.1 mg/mL의 α-RgIA4 펩타이드 유사체 또는 α-RgIA4 펩타이드를 90% AB형 인간 혈청에서 인큐베이션하고 37 oC에서 1, 2, 4, 8, 또는 24시간 중 적어도 하나 동안 인큐베이션 한 후 남아있는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체에 의해 측정될 수 있다.
일부 예들에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 인간 혈청에서의 안정성은 인간 혈청에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성의 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 1000% 중 적어도 하나 이상 보다 클 수 있다. 또 다른 예에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 인간 혈청에서의 안정성은 인간 혈청에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성보다 적어도 50배 더 클 수 있다. 또 다른 예에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 인간 혈청에서의 안정성은 인간 혈청에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성보다 적어도 10배 더 클 수 있다. 또 다른 예에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 인간 혈청에서의 안정성은 인간 혈청에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성보다 적어도 2배 더 클 수 있다.
α-RgIA4 펩타이드의 안정성과 비교하여 α-RgIA4 펩타이드 유사체의 안정성은 환원된 글루타티온(GSH)에서도 측정할 수 있다. 한 예에서, 보호된 시스테인간 황 링키지는 환원된 글루타티온에서의 α-RgIA4 펩타이드 유사체에 대하여 환원된 글루타티온에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성보다 더 큰 안정성을 제공할 수 있다. 한 예에서, 환원된 글루타티온의 안정성은 pH가 7.4인 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 환원된 글루타티온 10당량에서 0.1 mg/mL의 α-RgIA4 펩타이드 유사체 또는 α-RgIA4 펩타이드를 인큐베이션하고 37 oC에서 1, 2, 4, 8 또는 24시간 중 적어도 하나 동안 인큐베이션 한 후 남아있는 α-RgIA4 펩타이드 유사체 또는 α-RgIA4 펩타이드의 양에 의해 측정될 수 있다.
일부 예들에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 GSH에서의 안정성은 GSH에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성 대비 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% 중 적어도 하나 이상 보다 클 수 있다. 또 다른 예에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 GSH에서의 안정성은 GSH에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성보다 적어도 50배 더 클 수 있다. 또 다른 예에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 GSH에서의 안정성은 GSH에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성보다 적어도 10배 더 클 수 있다.
α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 α-RgIA4 펩타이드 유사체의 선택성은 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 α-RgIA4 펩타이드의 선택성과 비교될 수 있다. 한 예에서, 보호된 시스테인간 황 링키지는 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 선택성과 실질적으로 동일한 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 선택성을 제공할 수 있다. 또 다른 예에서, 보호된 시스테인간 황 링키지는 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대해 다른 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 하위형의 선택성과 비교하여 적어도 100배 더 선택적인 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 선택성을 제공할 수 있다. 상이한 nAChR 하위형은 α1β1de, α2β2, α2β4, α3β2, α3β4, α4β2, α4β4, α6/α3β2β3, α6/α3β4 등, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
α-RgIA4 펩타이드 유사체의 안전성 프로파일도 안전성 프로파일을 가질 수 있다. 한 양상에서, 보호된 시스테인간 황 링키지는 α-RgIA4 펩타이드의 안전성 프로파일과 실질적으로 동일하거나 더 큰 안전성 프로파일을 제공할 수 있다. 안전성 프로파일은 다음 중 하나 이상으로 측정할 수 있다: 100 μM 농도로 존재하는 유사체가 자동화된 전 세포 패치 클램프 분석으로부터 측정된 인간 ether-a-go-go-관련 유전자(human ether-a-go-go-related gene, hERG) K+ 채널의 25% 미만을 억제하거나; 또는 100 μM 농도로 존재하는 유사체가 모노아민 옥시다제(MAO) 분석으로 측정시 약 20% 미만의 억제 활성을 가지거나; 또는 10 μM 농도로 존재하는 유사체가 CYP 분석으로 측정시 20% 미만의 억제 활성을 가진다.
본원에 개시된 측쇄 결합 구성(예를 들어, 메틸렌 아세탈의 포함 또는 락탐 가교를 통한 측쇄 연결)은 α-RgIA4 펩타이드 유사체의 다양한 양상을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 혈청 반감기는 α-RgIA4 펩타이드의 혈청 반감기에 비해 향상될 수 있다. 또 다른 예에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 순환 시간은 α-RgIA4 펩타이드의 순환 시간과 비교할 때 향상될 수 있다. 또 다른 예에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 구강 및/또는 협측 흡수는 α-RgIA4 펩타이드의 경구 및/또는 협측 흡수와 비교할 때 향상될 수 있다. 또 다른 예에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 AUC에 의해 측정된 생체이용률은 α-RgIA4 펩타이드의 AUC에 의해 측정된 생체이용률과 비교할 때 향상될 수 있다. 또 다른 예에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 면역원성은 α-RgIA4 펩타이드의 면역원성과 비교할 때 향상될 수 있다.
또 다른 예에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 저장 안정성은 α-RgIA4 펩타이드의 저장 안정성과 비교할 때 향상될 수 있다. 한 예에서, 저장 안정성은 주위 습도 및 온도에서 선택된 저장 시간 동안 저장될 때 측정될 수 있다. 일부 경우에, 1일, 1주, 2주, 4주, 3개월, 6개월, 1년 또는 이들의 조합 중 하나 이상의 저장 시간을 측정하여 α-RgIA4 펩타이드 유사체 및 α-RgIA4 펩타이드 사이의 안정성 향상을 비교할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체는 D P R을 포함하는 인식 핑거 영역; 및 CI, CII, CIII, 및 CIV를 포함하는 시스틴 잔기를 포함할 수 있다. 시스테인 잔기 CI 및 CIII는 제1 시스테인 간 황 링키지에 의해 연결될 수 있고, 시스테인 잔기 CII 및 CIV는 제2 시스테인 간 황 링키지에 의해 연결될 수 있다. 제2 시스테인 간 황 링키지는 측쇄 결합 구성에 의해 보호될 수 있다. 한 양상에서, 제2 시스테인간 황 링키지는 메틸렌 티오아세탈을 포함할 수 있거나, N-말단 아미노산 측쇄가 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화되거나, 또는 이들의 조합일 수 있다.
한 양상에서, 제2 시스테인간 황 링키지가 메틸렌 티오아세탈을 포함하는 경우, 유사체는 아미노산 서열 Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5 C Xaa6을 포함할 수 있으며, 여기서 Xaa1-6은 C 이외의 임의의 아미노산이다.
한 예에서, 유사체가 아미노산 서열 Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5 C Xaa6을 포함하는 경우: Xaa1은 C 이외의 단백질 생성 또는 비단백질 생성 아미노산일 수 있고; Xaa2는 C 이외의 단백질 생성 또는 비단백질 생성 아미노산일 수 있으며; Xaa3은 (Cit) 또는 임의의 단백질 생성 또는 비-단백질 생성 양성 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 구성원일 수 있으며; Xaa4는 단백질 생성 또는 비단백질 생성 방향족 아미노산일 수 있고; Xaa5는 단백질 생성 또는 비단백질 생성 양성 아미노산일 수 있고; Xaa6은 단백질 생성 또는 비단백질 생성 방향족 아미노산일 수 있다.
또 다른 양상에서, 제2 시스테인간 황 링키지가 메틸렌 티오아세탈을 포함하는 경우, 유사체는 아미노산 서열 Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5 C Xaa6 Xaa7을 포함할 수 있으며, 여기서 Xaa1-7은 C 이외의 임의의 아미노산이다.
또 다른 예에서, 유사체가 아미노산 서열 Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5 C Xaa6 Xaa7을 포함하는 경우: Xaa1은 C 이외의 단백질 생성 또는 비단백질 생성 아미노산일 수 있고, Xaa2는 C 이외의 단백질 생성 또는 비단백질 생성 아미노산이고, Xaa3은 (Cit) 또는 임의의 단백질 생성 또는 비-단백질 생성 양성 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 구성원일 수 있으며, Xaa4는 단백질 생성 또는 비단백질 생성 방향족 아미노산일 수 있고, Xaa5는 단백질 생성 또는 비단백질 생성 양성 아미노산일 수 있고, Xaa6은 단백질 생성 또는 비단백질 생성 방향족 아미노산일 수 있고, 그리고 Xaa7은 C 이외의 임의의 단백질생성 또는 비단백질 생성 아미노산일 수 있다.
또 다른 양상에서, 제2 시스테인간 황 링키지가 메틸렌 티오아세탈을 포함하는 경우, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6을 포함할 수 있으며, 여기서 Xaa1은 G이고, Xaa2는 T이고, Xaa5는 Q이고, Xaa3, 4 또는 6은 C 이외의 아미노산이다.
또 다른 양상에서, 제2 시스테인간 황 링키지가 메틸렌 티오아세탈을 포함하는 경우, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6을 포함할 수 있으며, 여기서: Xaa3은 (Cit) 및 R로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고, Xaa4는 (iY) 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고, 그리고 Xaa6은 (bhY), Y, 및 bA로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이다.
또 다른 양상에서, 제2 시스테인간 황 링키지가 메틸렌 티오아세탈을 포함하는 경우, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C (Cit) (iY) Q C Y(서열번호 10)를 포함할 수 있으며, 여기서: Xaa3은 (Cit)이고, Xaa4는 (iY)이고, Xaa6은 Y이다.
또 다른 양상에서, 제2 시스테인간 황 링키지가 메틸렌 티오아세탈을 포함하는 경우, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6 Xaa7을 포함할 수 있으며, 여기서 Xaa1은 G이고, Xaa2는 T이고, Xaa5는 Q이고, Xaa3, 4, 6 또는 7은 C 이외의 아미노산이다.
또 다른 양상에서, 제2 시스테인간 황 링키지가 메틸렌 티오아세탈을 포함하는 경우, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6 Xaa7을 포함할 수 있으며, 여기서: Xaa3은 (Cit) 및 R로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고, Xaa4는 (iY) 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고, 그리고 Xaa6은 (bhY), Y, 및 bA로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고, 그리고 Xaa7은 R이다.
또 다른 양상에서, 제2 시스테인간 황 링키지가 메틸렌 티오아세탈을 포함하는 경우, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C R (iY) Q C (bhY) R(서열번호 12)를 포함할 수 있으며, 여기서: Xaa3은 R이고, Xaa4는 (iY)이고, Xaa6은 (bhY)이다.
또 다른 양상에서, 제2 시스테인간 황 링키지가 메틸렌 티오아세탈을 포함하는 경우, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C R (iY) Q C (bA) R(서열번호 13)를 포함할 수 있으며, 여기서: Xaa3은 R이고, Xaa4는 (iY)이고, Xaa6은 (bA)이다.
또 다른 양상에서, N-말단 아미노산 측쇄는 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화될 수 있다. N-말단 아미노산 측쇄가 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화될 수 있는 경우, N-말단 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 양상에서, C-말단 아미노산은 리신 및 L-2,3-다이아미노프로피온산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 예에서, C-말단 아미노산은 리신, 호모-리신, 오르니틴, L-2,4-다이아미노부티르산 및 L-2,3-다이아미노프로피온산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 양상에서, N-말단 아미노산은 글루탐산일 수 있고 C-말단 아미노산은 리신이다.
또 다른 양상에서, N-말단 아미노산 측쇄가 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화되는 경우, 유사체는 아미노산 서열 X Xaa8 Xaa9 C C Xaa10 D P R C Xaa11 Xaa12 Xaa13 C Xaa14 Xaa15를 포함할 수 있으며, 여기서 Xaa8-15는 C 이외의 아미노산이다.
또 다른 양상에서, N-말단 아미노산 측쇄가 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화되는 경우, 유사체는 아미노산 서열 X Xaa8 Xaa9 C C Xaa10 D P R C Xaa11 Xaa12 Xaa13 C Xaa14 Xaa15를 포함할 수 있으며, 여기서: Xaa8는 E 및 D로 이루어진 군에서 선택된 구성원이고, Xaa15는 K 및 (Dap)로 이루어진 군에서 선택된 구성원이며, 그리고 Xaa9-14는 C 이외의 아미노산이다.
또 다른 양상에서, N-말단 아미노산 측쇄가 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화되는 경우, 유사체는 아미노산 서열 Xaa8 Xaa9 C C T D P R C Xaa11 Xaa12 Q C Y Xaa15를 포함할 수 있으며, 여기서: Xaa8는 E 및 D로 이루어진 군에서 선택된 구성원이고, Xaa10은 T이고, Xaa13은 Q이고, Xaa14는 Y이고, Xaa15는 K 및 (Dap)로 이루어진 군에서 선택된 구성원이며, 그리고 Xaa9, 11, 또는 12는 C 이외의 아미노산이다.
또 다른 양상에서, N-말단 아미노산 측쇄가 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화되는 경우, 유사체는 아미노산 서열 Xaa8 Xaa9 C C T D P R C Xaa11 Xaa12 Q C Y Xaa15를 포함할 수 있으며, 여기서: Xaa8는 E 및 D로 이루어진 군에서 선택된 구성원이고, Xaa9는 G 또는 (bA)이고, Xaa11은 R 또는 (Cit)이고, Xaa12는 Y 또는 (iY)이고, 그리고 Xaa15는 K 및 (Dap)로 이루어진 군에서 선택된 구성원이다.
또 다른 양상에서, N-말단 아미노산 측쇄가 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화되는 경우, 유사체는 아미노산 서열 E G C C T D P R C (Cit) Y Q C Y K(서열번호 5)를 포함할 수 있고, 여기서: Xaa8은 E이고, Xaa9는 G이고, Xaa11은 (Cit)이고, Xaa12는 Y이고, Xaa15는 K이다.
또 다른 양상에서, N-말단 아미노산 측쇄가 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화되는 경우, 유사체는 아미노산 서열 E (bA) C C T D P R C (Cit) Y Q C Y K(서열번호 6)를 포함할 수 있고, 여기서: Xaa8은 E이고, Xaa9는 (bA)이고, Xaa11은 (Cit)이고, Xaa12는 Y이고, Xaa15는 K이다.
또 다른 양상에서, N-말단 아미노산 측쇄가 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화되는 경우, 유사체는 아미노산 서열 E G C C T D P R C (Cit) (iY) Q C Y K(서열번호 7)를 포함할 수 있고, 여기서: Xaa8은 E이고, Xaa9는 G이고, Xaa11은 (Cit)이고, Xaa12는 (iY)이고, Xaa15는 K이다.
또 다른 양상에서, N-말단 아미노산 측쇄가 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화되는 경우, 유사체는 아미노산 서열 E G C C T D P R C R (iY) Q C Y K(서열번호 8)를 포함할 수 있고, 여기서: Xaa8은 E이고, Xaa9는 G이고, Xaa11은 R이고, Xaa12는 (iY)이고, Xaa15는 K이다.
또 다른 실시형태에서, α-RgIA4 유사체에서 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 α-RgIA4 효능을 유지하는 방법은 시스테인 간 황 링키지를 측쇄 결합 구성으로 보호하여 유사체의 인식 핑거 영역을 α-RgIA4 구성(예: 구형 α-RgIA4 구성)으로 유지시키는 것을 포함할 수 있다.
한 양상에서, 유사체는 α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도의 2.5%, 5%, 7.5%, 15%, 25%, 40%, 50%, 80% 중 적어도 하나 이상이거나, 또는 이와 실질적으로 동일하거나, 또는 이 보다 큰 친화도로 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 결합할 수 있다.
또 다른 양상에서, 유사체는 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값과 실질적으로 동일하거나 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 2.0배, 3.0배, 5.0배, 15.0배, 25.0배 중 적어도 하나 이상과 같거나 작은 IC50 값으로 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체를 억제할 수 있다.
또 다른 양상에서, 시스테인간 황 링키지를 보호하는 것은 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대해 다른 nAChR 하위형의 선택성과 비교하여 2배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 75배, 100배, 150배, 또는 200배 중 적어도 하나 이상 더 선택적인 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 선택성을 제공할 수 있다. 또 다른 양상에서, 시스테인 간 황 링키지를 보호하는 것은 α-RgIA4 펩타이드의 인간 혈청에서의 안정성보다 적어도 100배 더 큰, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 인간 혈청에서의 안정성을 제공할 수 있다.
또 다른 양상에서, 시스테인간 링키지를 보호하는 것은 CI 및 CIII, CII 및 CIV 사이의 시스테인간 링키지 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 보호하는 것을 포함할 수 있다. 한 예에서, 시스테인간 황 링키지를 보호하는 것은 CII와 CIV 사이에 메틸렌 티오아세탈을 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 시스테인간 황 링키지를 보호하는 것은 N-말단 아미노산과 C-말단 아미노산 사이에 락탐 가교를 생성하는 것을 포함할 수 있다.
α-RgIA4 유사체의 제조 방법
한 실시형태에서, 활성 고리형 α-RgIA4 유사체가 도 2에 도시된 바와 같이 제조될 수 있다. 새로 도입된 락탐 가교는 수지에서 합성될 수 있으며, 이어서 위치선택적 다이설파이드 결합 배열을 적용하여 구형 이성질체를 유지할 수 있는 2단계 액상 산화 공정을 수행할 수 있다. 상세하게는, N-말단 Fmoc 제거 및 3차-부틸옥시카르보닐(Boc)로 재보호된 2-클로로트리틸 클로라이드(2-CTC) 수지 상에서 자동화된 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 고상 펩타이드 합성(SPPS)을 통해 측쇄 보호된 P1을 합성할 수 있다. 말단 측쇄 아민 및 산은 직교형으로 탈보호되고(예를 들어, 보호기 1(PG1) 및 보호기 2(PG2)) 추가로 고리화되어 락탐 가교 분자 복합체 P2를 형성할 수 있다. 절단, 정제를 통해 락탐 고리화 펩타이드가 생성될 수 있으며 공기중 산화를 거쳐 이고리형 생성물 P3을 생성할 수 있다. 마지막으로, 완전히 폴딩된 P4는 인시튜 요오드 산화성 탈보호-다이설파이드 형성을 통해 생성될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 활성 메틸렌 티오아세탈 α-RgIA4 유사체는 도 7a-D에 도시된 바와 같이 제조될 수 있다. RgIA 유사체의 화학적 합성은 2-클로로트리틸 클로라이드(2-CTC) 수지에서 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 고체상 펩타이드 합성(SPPS)을 사용한 다음 2단계의 위치선택적 분자내 결합 형성 반응을 사용하여 달성할 수 있다. 올바른 스캐폴드 폴딩은 CysI-CysIII, CysII-CysIV 또는 동일한 연결성을 갖는 이의 상응하는 메틸렌 티오아세탈 대체물이다. 결합은 명시적으로 1) 절단을 통한 트리틸(Trt) 제거 후 유리 Cys 상에서 메틸렌 티오아세탈 형성, 2) 인시튜 산화성 아세트아미도메틸(Acm) 탈보호-커플링 공정을 통한 다이설파이드 결합 형성, 및 3) 메틸렌 티오아세탈 형성을 반복하여 비스-메틸렌 티오아세탈 대체 유사체를 생성하는 순서로 형성되었다.
상세하게는, 2-CTC 수지로부터 조립된 펩타이드 사슬을 절단한 후, Trt 보호가 제거될 수 있으며, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP. HCl), 포타슘 카보네이트 및 트리메틸아민(Et3N)의 존재하에서 디아이오도메탄으로 처리하여 표적 메틸렌 티오아세틸 결합을 형성할 수 있다. 이러한 전환은 하나의 배치에서 최대 300mg 규모로 수행될 수 있어 표적 펩타이드를 대량으로 준비할 수 있다. 제2 다이설파이드 가교는 25% 수성 아세트산(AcOH)에서 과량의 요오드를 처리하여 Acm 탈보호 후 형성되어, 완전히 폴딩된 펩타이드를 생성할 수 있다.
조성물 및 제형
이를 염두에 두고, 하나 이상의 실시형태에서, 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 본원에 개시된 유사체의 치료적 유효량의 조합을 포함할 수 있다.
한 양상에서, 유사체는 약 0.0001중량% 내지 약 10중량%의 농도로 존재할 수 있다. 한 예에서, 유사체는 약 0.0001중량% 내지 약 1중량%의 농도로 조성물에 존재할 수 있다. 또 다른 예에서, 유사체는 약 0.001중량% 내지 약 1중량%의 농도로 조성물에 존재할 수 있다. 또 다른 예에서, 유사체는 약 0.01중량% 내지 약 0.1중량%의 농도로 조성물에 존재할 수 있다. 일부 예에서, 유사체는 약 0.005중량% 내지 약 0.05중량%의 농도로 조성물에 존재할 수 있다.
한 양상에서, 약학적으로 허용되는 담체는 하나 이상의 물, 장성제, 완충제, 방부제 등 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 담체는 장성제를 포함할 수 있다. 장성제의 비제한적 예는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 만니톨, 소르비톨, 덱스트로스, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 트레할로스, 인산염 완충 식염수(PBS), Dulbecco's PBS, Alsever 용액, TBS(Tris-완충 식염수), 물, Hank BSS, Earle BSS, Grey BSS, Puck BSS, Simm BSS, Tyrode BSS 및 BSS Plus 등과 같은 균형 염 용액(BSS) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 장성제는 조성물의 적절한 장성을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 한 양상에서, 조성물의 장성은 약 250 내지 약 350 밀리오스몰/리터(mOsm/L)일 수 있다. 또 다른 양상에서, 조성물의 장성은 약 277 내지 약 310 mOsm/L일 수 있다.
일부 예에서 담체는 pH 조절제 또는 완충제를 포함할 수 있다. pH 조절제 또는 완충제의 비제한적 예는 다수의 산, 염기 및 이들의 조합, 예를 들어, 염산, 인산, 시트르산, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 아세테이트 완충제, 시트레이트 완충제, 타르트레이트 완충제, 인산염 완충제, 트리에탄올아민(TRIS) 완충제 등 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 전형적으로, 치료 조성물의 pH는 약 5 내지 약 9, 또는 약 6 내지 약 8일 수 있다. 다른 예에서, 치료 조성물의 pH는 약 5 내지 약 6일 수 있다.
일부 예에서 담체는 방부제를 포함할 수 있다. 방부제의 비제한적 예는 아스코르브산, 아세틸시스테인, 바이설파이트, 메타바이설파이트, 모노티오글리세롤, 페놀, 메타-크레졸, 벤질 알코올, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 부틸 파라벤, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 부틸화 히드록실 톨루엔, 미리스틸 감마- 피콜리뮴 클로라이드, 2-페녹시에탄올, 페닐 수은 니트레이트, 클로로부탄올, 티메로살, 토코페롤 등 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
한 양상에서, 조성물은 추가 활성제를 추가로 포함할 수 있다. 한 양상에서, 추가 활성제는 항염증제, 마취제, 이차 진통제 펩타이드, 비펩타이드 진통제 등 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원이다.
한 예에서, 추가 활성제는 항염증제일 수 있다. 항염증제의 비제한적 예는 이부프로펜, 나프록센, 아스피린, 디클로페낙, 셀레콕시브, 술린닥, 옥사프로진, 피록시캄, 인도메타신, 멜록시캄, 페노프로펜, 디푸니살, 에토돌락, 케토롤락, 메클로페나메이트, 나부메톤, 살살레이트, 케토프로펜, 톨메틴, 플루르비프로펜, 메페남산, 파모티딘, 브롬페낙, 네파페낙, 프레드니손, 코르티손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 데플라자코트, 프레드니솔론, 플루드로코르티손, 암시노니드, 베타메타손 디프로피오네이트, 클로베타솔, 클로코르톨론, 덱사메타손, 디플로라손, 듀라스테리드, 플루메타손 피발레이트, 플루니솔리드, 플루로시노코니드, 플루로시노코니드, 플루로시노코니드, 플루티카손 프로피오네이트, 플루란드레놀리드, 하이드로플루메티아지드 등, 이들의 수화물, 이들의 산, 이들의 염기, 또는 이들의 염, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
한 예에서, 추가 활성제는 마취제일 수 있다. 마취제의 비제한적 예는 아르티카인, 부피바카인, 신코카인, 에티도카인, 레보부피바카인, 리도카인, 메피바카인, 프릴로카인, 로피바카인, 트리메카인 등 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
한 예에서, 추가 활성제는 2차 진통 펩타이드일 수 있다. 한 예에서, 추가 활성제는 비-펩타이드 진통제일 수 있다. 비-펩타이드 진통제의 비제한적 예는 아세트아미노펜, 코데인, 디하이드로코데인, 트라마돌, 메페리딘, 하이드로코돈, 옥시코돈, 모르핀, 펜타닐, 하이드로모르폰, 부프레노르핀, 메타돈, 디아모르핀, 페티딘 등, 이들의 수화물, 이들의 산, 이들의 염기, 또는 이의 염, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
한 양상에서, 추가 활성제는 약 0.0001중량% 내지 약 10중량%의 농도로 존재할 수 있다. 한 예에서, 추가 활성제는 약 0.0001중량% 내지 약 1중량%의 농도로 조성물에 존재할 수 있다. 또 다른 예에서, 추가 활성제는 약 0.001중량% 내지 약 1중량%의 농도로 조성물에 존재할 수 있다. 또 다른 예에서, 추가 활성제는 약 0.01중량% 내지 약 0.1중량%의 농도로 조성물에 존재할 수 있다. 일부 예에서, 추가 활성제는 약 0.005중량% 내지 약 0.05중량%의 농도로 조성물에 존재할 수 있다.
또 다른 양상에서, 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 겔, 하이드로겔, 열-반응성 겔, 크림, 연고, 페이스트, 접착제, 액체 저장소, 패치 또는 이들의 조합 중 하나로서 제형화될 수 있다. 일부 양상에서, 조성물은 국소, 경피, 정맥내, 피하 투여 등 또는 이들의 조합에 적합할 수 있다. 한 양상에서, 조성물은 피하 주사에 적합할 수 있다.
치료 방법
또 다른 실시형태에서, 대상체에서 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 결합에 반응하는 병태를 치료하는 방법은 치료적 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 한 양상에서, 병태는 통증일 수 있다. 또 다른 양상에서, 병태는 척추 다발근병증일 수 있다. 또 다른 양상에서, 병태는 대상포진 후 신경통일 수 있다. 또 다른 양상에서, 병태는 삼차신경통일 수 있다. 또 다른 양상에서, 병태는 복합 부위 통증 증후군일 수 있다. 또 다른 양상에서, 병태는 다발성 경화증일 수 있다.
병태가 통증인 경우, 통증은 화학유도 신경병증(CIPN), 당뇨병성 신경병증, 관절염 신경병증, 골관절염 신경병증 등 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 신경병성 통증일 수 있다. 또 다른 양상에서, 통증은 HIV 통증일 수 있다. 또 다른 양상에서, 통증은 나병과 관련된 통증일 수 있다. 또 다른 양상에서, 통증은 수술 후 통증, 외상 후 통증 등 또는 이들의 조합 중 하나 이상일 수 있다.
또 다른 양상에서, 병태는 암일 수 있다. 암은 상피암, 폐암, 유방암 등 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
또 다른 양상에서, 병태는 염증일 수 있다. 한 양상에서, 염증은 류머티즘 등과 관련된 면역 세포 또는 이들의 조합에 의해 매개될 수 있다. 치료될 수 있는 예시적인 염증 상태는 염증, 만성 염증, 류마티스 질환(관절염, 루푸스, 강직성 척추염, 섬유근육통, 건염, 활액낭염, 경피증 및 통풍 포함), 패혈증, 섬유근육통, 염증성 장 질환(궤양성 대장염 및 크론병 포함), 유육종증, 자궁내막증, 자궁근종, 염증성 피부 질환(건선 및 손상된 상처 치유 포함), 폐의 염증 상태(천식 및 만성 폐쇄성 폐질환 포함), 신경계 염증 관련 질환(다발성 경화증, 파킨슨병 및 알츠하이머 병 포함), 치주 질환 및 심혈관 질환을 포함한다.
한 양상에서, 조성물은 약 25μl 내지 약 1ml의 α-RgIA4 유사체를 갖는 투여 형태일 수 있다. 또 다른 양상에서, 조성물은 약 1ml 내지 약 5ml의 α-RgIA4 유사체를 갖는 투여 형태일 수 있다. 한 양상에서, 조성물은 약 5ml 내지 약 10ml의 α-RgIA4 유사체를 갖는 투여 형태일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 치료는 투여 후 선택된 시간 내에 증상의 감소를 제공할 수 있다. 치료적 유효량의 국소 조성물을 투여하면 병태와 관련된 증상을 감소시킬 수 있다. 또 다른 양상에서, 치료는 투여 후 선택된 시간 내에 적어도 10%의 증상 감소를 제공할 수 있다. 한 예에서, 치료는 투여 후 선택된 시간 내에 적어도 20%의 증상 감소를 제공할 수 있다. 하나 이상의 예에서, 치료는 투여 후 선택된 시간 내에 적어도 30%의 증상 감소를 제공할 수 있다. 또 다른 예에서, 치료는 투여 후 선택된 시간 내에 적어도 50%의 증상 감소를 제공할 수 있다.
투여 후 증상 감소를 달성하는 선택된 시간은 다양할 수 있다. 한 예에서, 선택된 시간은 투여 후 15초 미만일 수 있다. 다른 예에서, 선택된 시간은 투여 후 30초 미만일 수 있다. 다른 예에서, 선택된 시간은 투여 후 60초 미만일 수 있다. 다른 예에서, 선택된 시간은 투여 후 5분 미만일 수 있다. 다른 예에서, 선택된 시간은 투여 후 15분 미만일 수 있다. 다른 예에서, 선택된 시간은 투여 후 30분 미만일 수 있다.
또 다른 양상에서, 조성물의 치료적 유효량은 1일 1회 내지 10회 대상체에게 투여될 수 있다. 한 예에서, 조성물은 1일 1 내지 10회 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, 조성물은 1일 1 내지 5회 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, 조성물은 1일 3 내지 5회 대상체에게 투여될 수 있다.
하나 이상의 양상에서, 조성물의 치료적 유효량은 투여 요법에 따라 대상체에게 투여될 수 있다. 한 예에서, 조성물은 약 하루 내지 약 12개월의 기간 동안 1일 적어도 1회 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, 조성물은 약 하루 내지 약 6개월의 기간 동안 1일 적어도 1회 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, 조성물은 약 하루 내지 약 3개월의 기간 동안 1일 적어도 1회 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, 조성물은 약 하루 내지 약 1개월의 기간 동안 1일 1회 이상 투여될 수 있다.
또 다른 양상에서, 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 것은 피하 투여 형태, 경피 투여 형태, 국소 투여 형태, 정맥내 투여 형태 등 또는 이들의 조합일 수 있다.
또 다른 양상에서, α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 결합에 반응하는 대상체의 병태를 치료하는 데 사용하기 위한 조성물은 치료적 유효량의 조성물을 포함할 수 있다. 또 다른 양상에서, α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 결합에 반응하는 대상체의 병태를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 조성물의 용도는 치료학적 유효량의 조성물을 포함할 수 있다.
서열 목록
표 1은 RgIA, RgIA4 및 RgIA4 유사체의 서열을 제시한다.
표 1
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주 1: []는 첫 번째 위치 아미노산 측쇄(예: D 또는 E)의와 최종 위치의 아미노산 측쇄(예: DAP 또는 K) 사이의 락탐 가교에 의해 고리화된 펩타이드를 지칭한다.
주 2: CI, CII, CIII 및 CIV는 N-말단과 관련하여 펩타이드의 시스테인 순서를 나타낸다. 예를 들어, CI는 CII보다 N-말단에 더 가깝고, CII는 CIII보다 N-말단에 더 가깝고, CIII는 CIV보다 N-말단에 더 가깝다.
주 3: X1-X15는 본원에 언급된 Xaa를 지칭한다.
13은 CI 및 CIII의 시스테인간 황 링키지에서 메틸렌 티오아세탈을 지칭한다.
24는 CII와 CIV의 시스테인간 황 링키지에서 메틸렌 티오아세탈을 나타낸다.
실시예
한 예에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체는 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 결합하도록 구성된 인식 핑거 영역과 시스테인 간 황 링키지를 보호하는 측쇄 결합 구성을 포함할 수 있으며, 여기서 유사체는 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대하여, α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도의 2.5% 이상인 결합 친화도를 갖는다.
또 다른 예에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체는 보호된 시스테인 간 황 링키지에 의해 유지되는 구조를 가질 수 있으며, 상기 구조는 α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 2.5% 이상인 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 결합 친화도를 제공한다.
또 다른 예에서, α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 결합 친화도는 α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 5% 이상, 또는 α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 7.5% 이상, 또는 α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도의 15% 이상, 또는 α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도의 25% 이상, 또는 α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도의 40% 이상, 또는 α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도의 50% 이상, α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도의 80% 이상이거나, 또는 α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도와 실질적으로 동일하거나 α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도 보다 클 수 있다.
또 다른 예에서, 보호된 시스테인간 황 링키지는 α-RgIA4 펩타이드의 효능에 비해 효능의 증가를 제공할 수 있다.
또 다른 예에서, 유사체는 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값과 실질적으로 동일하거나, 또는 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 2.0배 이하, 또는 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 3.0배 이하 또는 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 5.0배 이하 또는 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 15.0배 이하, 또는 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 25.0배 이하인 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값을 제공할 수 있다.
또 다른 예에서, 보호된 시스테인간 황 링키지는 α-RgIA4 펩타이드 또는 보호된 시스테인 간 황 링키지가 없는 α-RgIA4 펩타이드 유사체와 비교하여 다이설파이드 가교 스크램블링, 다이설파이드 가교 분해 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 감소시킬 수 있다.
또 다른 예에서, 측쇄 결합 구성은 메틸렌 티오아세탈, 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화된 N-말단 아미노산 측쇄, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 측쇄 결합 구성은 CII와 CIV 사이에 시스테인간 결합을 포함하는 메틸렌 티오아세탈일 수 있다.
또 다른 예에서, 측쇄 결합 구성은 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화된 N-말단 아미노산 측쇄일 수 있다.
또 다른 예에서, N-말단 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 예에서, C-말단 아미노산은 리신 및 L-2,3-다이아미노프로피온산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 예에서, N-말단 아미노산은 글루탐산일 수 있고 C-말단 아미노산은 리신일 수 있다.
또 다른 예에서, 보호된 시스테인간 황 링키지는 인간 혈청에서의 α-RgIA4 펩타이드 유사체에 대하여 인간 혈청에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성보다 더 큰 안정성을 제공할 수 있고, 여기서 인간 혈청에서의 안정성은 0.1 mg/mL의 α-RgIA4 펩타이드 유사체 또는 α-RgIA4 펩타이드를 90% AB형 인간 혈청에서 인큐베이션하고 37 oC에서 1, 2, 4, 8, 24, 48 또는 72시간 중 적어도 하나 동안 인큐베이션한 후 남은 양으로 측정된다.
또 다른 예에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 인간 혈청에서의 안정성은 인간 혈청에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성 보다 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 1000% 중 적어도 하나 이상 더 클 수 있다.
또 다른 예에서, 보호된 시스테인간 황 링키지는 환원된 글루타티온에서의 α-RgIA4 펩타이드 유사체에 대하여 환원된 글루타티온에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성보다 더 큰 안정성을 제공할 수 있고, 여기서 환원된 글루타티온에서의 안정성은 0.1 mg/mL의 α-RgIA4 펩타이드 유사체 또는 α-RgIA4 펩타이드를 pH 7.4의 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 환원된 글루타티온 10당량에서 인큐베이션하고 37 oC에서 1, 2, 4, 8, 24, 48 또는 72시간 중 적어도 하나 동안 인큐베이션한 후 남은 양으로 측정된다.
또 다른 예에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 환원된 글루타티온에서의 안정성은 환원된 글루타티온에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성보다 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 1000% 중 적어도 하나 이상 더 클 수 있다.
또 다른 예에서, 보호된 시스테인간 황 링키지는 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 선택성과 실질적으로 동일한 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 선택성을 제공할 수 있다.
또 다른 예에서, 보호된 시스테인간 황 링키지는 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대해 다른 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 하위형의 선택성과 비교하여 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 또는 200배 중 적어도 하나 이상 더 선택적인 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 선택성을 제공할 수 있다.
또 다른 예에서, 상이한 nAChR 하위형은 α1β1de, α2β2, α2β4, α3β2, α3β4, α4β2, α4β4, α6/α3β2β3, 및 α6/α3β4로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 예에서, 보호된 시스테인간 황 링키지는 α-RgIA4 펩타이드의 안전성 프로파일과 실질적으로 동일하거나 더 큰 안전성 프로파일을 제공할 수 있으며, 여기서 안전성 프로파일은 다음 중 하나 이상으로 측정된다: 100 μM 농도로 존재하는 유사체가 자동화된 전 세포 패치 클램프 분석으로부터 측정된 인간 ether-a-go-go-관련 유전자(human ether-a-go-go-related gene, hERG) K+ 채널의 25% 미만을 억제하거나, 또는 100 μM 농도로 존재하는 유사체가 모노아민 옥시다제(MAO) 분석으로 측정시 약 20% 미만의 억제 활성을 가지거나, 또는 10 μM 농도로 존재하는 유사체가 CYP 분석으로 측정시 20% 미만의 억제 활성을 가진다.
또 다른 예에서, 보호된 시스테인간 링키지는 CI과 CIII, CII와 CIV 사이의 시스테인간 링키지(예를 들어, 측쇄 링키지) 또는 이들의 조합 중 하나 이상일 수 있다.
또 다른 예에서, 구조는 구형일 수 있다.
또 다른 예에서, α-RgIA4 펩타이드 유사체는 D P R을 포함하는 인식 핑거 영역; 및 CI, CII, CIII, 및 CIV를 포함하는 시스틴 잔기, 여기서: CI 및 CIII는 제1 시스테인간 황 링키지에 의해 연결되고,CII 및 CIV는 제2 시스테인간 황 링키지에 의해 연결되고; 그리고 적어도 제2 시스테인간 황 링키지는 측쇄 결합 구성에 의해 보호된다.
또 다른 예에서, 제2 시스테인간 황 링키지는 메틸렌 티오아세탈을 포함할 수 있거나, N-말단 아미노산 측쇄가 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화될 수 있거나, 또는 이들의 조합일 수 있다.
또 다른 예에서, 제2 시스테인 간 황 링키지는 메틸렌 티오아세탈을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 유사체는 아미노산 서열 Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5 C Xaa6(서열번호 13)을 포함할 수 있고, 여기서 Xaa1-6은 C 이외의 임의의 아미노산이다.
또 다른 예에서, 유사체는 아미노산 서열 Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5 C Xaa6(서열번호 14)을 포함하고, 여기서: Xaa1은 C 이외의 단백질 생성 또는 비단백질 생성 아미노산이고, Xaa2는 C 이외의 단백질 생성 또는 비단백질 생성 아미노산이고, Xaa3은 (Cit) 또는 임의의 단백질 생성 또는 비-단백질 생성 양성 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 구성원이고, Xaa4는 단백질 생성 또는 비단백질 생성 방향족 아미노산이고, Xaa5는 단백질 생성 또는 비단백질 생성 양성 아미노산이고, Xaa6은 단백질 생성 또는 비단백질 생성 방향족 아미노산이다.
또 다른 예에서, 유사체는 아미노산 서열 Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5 C Xaa6 Xaa7(서열번호 20)을 포함할 수 있고, 여기서 Xaa1-7은 C 이외의 임의의 아미노산이다.
또 다른 예에서, 유사체는 아미노산 서열 Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5 C Xaa6 Xaa7 (서열번호 21)을 포함하고, 여기서: Xaa1은 C 이외의 단백질 생성 또는 비단백질 생성 아미노산이고, Xaa2는 C 이외의 단백질 생성 또는 비단백질 생성 아미노산이고, Xaa3은 (Cit) 또는 임의의 단백질 생성 또는 비-단백질 생성 양성 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 구성원이고, Xaa4는 단백질 생성 또는 비단백질 생성 방향족 아미노산이고, Xaa5는 단백질 생성 또는 비단백질 생성 양성 아미노산이고, Xaa6은 단백질 생성 또는 비단백질 생성 방향족 아미노산이고, 그리고 Xaa7은 C 이외의 임의의 단백질생성 또는 비단백질 생성 아미노산이다.
또 다른 예에서, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6 (서열번호 15)을 포함할 수 있고, 여기서 Xaa1은 G이고, Xaa2는 T이고, Xaa5는 Q이고, Xaa3, 4, 또는 6은 C 이외의 아미노산이다.
또 다른 예에서, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6 (서열번호 16)을 포함할 수 있으며, 여기서: Xaa3은 (Cit) 및 R로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고, Xaa4는 (iY) 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고, 그리고 Xaa6은 (bhY), Y, 및 bA로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이다.
또 다른 예에서, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C (Cit) (iY) Q C Y(서열번호 18)를 포함할 수 있으며, 여기서: Xaa3은 (Cit)이고, Xaa4는 (iY)이고, Xaa6은 Y이다.
또 다른 예에서, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6 Xaa7 (서열번호 22)을 포함할 수 있고, 여기서 Xaa1은 G이고, Xaa2는 T이고, Xaa5는 Q이고, Xaa3, 4, 6, 또는 7은 C 이외의 아미노산이다.
또 다른 예에서, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6 Xaa7(서열번호 23)을 포함할 수 있으며, 여기서: Xaa3은 (Cit) 및 R로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고, Xaa4는 (iY) 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고, 그리고 Xaa6은 (bhY), Y, 및 bA로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고, 그리고 Xaa7은 R이다.
또 다른 예에서, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C R (iY) Q C (bhY) R(서열번호 24)를 포함할 수 있으며, 여기서: Xaa3은 R이고, Xaa4는 (iY)이고, Xaa6은 (bhY)이다.
또 다른 예에서, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C R (iY) Q C (bA) R(서열번호 25)을 포함할 수 있으며, 여기서: Xaa3은 R이고, Xaa4는 (iY)이고, Xaa6은 (bA)이다.
또 다른 예에서, N-말단 아미노산 측쇄는 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화될 수 있다.
또 다른 예에서, N-말단 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 예에서, C-말단 아미노산은 리신 및 L-2,3-다이아미노프로피온산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 예에서, N-말단 아미노산은 글루탐산일 수 있고 C-말단 아미노산은 리신일 수 있다.
또 다른 예에서, 유사체는 아미노산 서열 Xaa8 Xaa9 C C Xaa10 D P R C Xaa11 Xaa12 Xaa13 C Xaa14 Xaa15(서열번호 3)를 포함할 수 있고, 여기서 Xaa8-15는 C 이외의 임의의 아미노산이다.
또 다른 예에서, 유사체는 아미노산 서열 X Xaa8 Xaa9 C C Xaa10 D P R C Xaa11 Xaa12 Xaa13 C Xaa14 Xaa15(서열번호 4)를 포함할 수 있으며, 여기서: Xaa8는 E 및 D로 이루어진 군에서 선택된 구성원이고, Xaa15는 K 및 (Dap)로 이루어진 군에서 선택된 구성원이며, 그리고 Xaa9-14는 C 이외의 아미노산이다.
또 다른 예에서, 유사체는 아미노산 서열 Xaa8 Xaa9 C C T D P R C Xaa11 Xaa12 Q C Y Xaa15(서열번호 5)를 포함할 수 있으며, 여기서: Xaa8는 E 및 D로 이루어진 군에서 선택된 구성원이고, Xaa10은 T이고, Xaa13은 Q이고, Xaa14는 Y이고, Xaa15는 K 및 (Dap)로 이루어진 군에서 선택된 구성원이며, 그리고 Xaa9, 11, 또는 12는 C 이외의 아미노산이다.
또 다른 예에서, 유사체는 아미노산 서열 Xaa8 Xaa9 C C T D P R C Xaa11 Xaa12 Q C Y Xaa15(서열번호 6)를 포함할 수 있으며, 여기서: Xaa8는 E 및 D로 이루어진 군에서 선택된 구성원이고, Xaa9는 G 또는 (bA)이고, Xaa11은 R 또는 (Cit)이고, Xaa12는 Y 또는 (iY)이고, 그리고 Xaa15는 K 및 (Dap)로 이루어진 군에서 선택된 구성원이다.
또 다른 예에서, 유사체는 아미노산 서열 E G C C T D P R C (Cit) Y Q C Y K(서열번호 9)를 포함할 수 있고, 여기서: Xaa8은 E이고, Xaa9는 G이고, Xaa11은 (Cit)이고, Xaa12는 Y이고, Xaa15는 K이다.
또 다른 예에서, 유사체는 아미노산 서열 E (bA) C C T D P R C (Cit) Y Q C Y K(서열번호 10)를 포함할 수 있고, 여기서: Xaa8은 E이고, Xaa9는 (bA)이고, Xaa11은 (Cit)이고, Xaa12는 Y이고, Xaa15는 K이다.
또 다른 예에서, N-말단 아미노산 측쇄가 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화되는 경우, 유사체는 아미노산 서열 E G C C T D P R C (Cit) (iY) Q C Y K(서열번호 11)를 포함할 수 있고, 여기서: Xaa8은 E이고, Xaa9는 G이고, Xaa11은 (Cit)이고, Xaa12는 (iY)이고, Xaa15는 K이다.
또 다른 예에서, 유사체는 아미노산 서열 E G C C T D P R C R (iY) Q C Y K(서열번호 12)를 포함할 수 있고, 여기서: Xaa8은 E이고, Xaa9는 G이고, Xaa11은 R이고, Xaa12는 (iY)이고, Xaa15는 K이다.
또 다른 예에서, 조성물은 상기 언급된 유사체의 치료적 유효량과 약학적으로 허용되는 담체의 조합을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 조성물은 국소, 경피, 정맥내, 또는 피하 투여에 적합할 수 있다.
또 다른 예에서, 조성물은 추가 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 추가 활성제는 항염증제, 마취제, 이차 진통제 펩타이드, 비펩타이드 진통제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원일 수 있다.
또 다른 예에서, 추가 활성제는 약 0.0001중량% 내지 약 10중량%의 농도로 존재할 수 있다.
또 다른 예에서, 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 겔, 하이드로겔, 열-반응성 겔, 크림, 연고, 페이스트, 접착제, 액체 저장소, 패치 또는 이들의 조합 중 하나로서 제형화될 수 있다.
또 다른 예에서, 조성물은 피하 주사에 적합할 수 있다.
또 다른 예에서, 약학적으로 허용되는 담체는 하나 이상의 물, 장성제, 완충제, 방부제 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, α-RgIA4 유사체에서 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 α-RgIA4 효능을 유지하는 방법은 시스테인 간 황 링키지를 측쇄 결합 구성으로 보호하여 유사체의 인식 핑거 영역을 α-RgIA4 구성으로 유지시키는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 유사체는 α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 5% 이상, 또는 α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 7.5% 이상, 또는 α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도의 15% 이상, 또는 α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도의 25% 이상, 또는 α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도의 40% 이상, 또는 α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도의 50% 이상, α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도의 80% 이상이거나, 또는 α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도와 실질적으로 동일하거나 α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도 보다 큰 친화도로 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 결합할 수 있다.
또 다른 예에서, 유사체는 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값과 실질적으로 동일하거나, 또는 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 2.0배 이하, 또는 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 3.0배 이하 또는 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 5.0배 이하 또는 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 15.0배 이하, 또는 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 25.0배 이하인 IC50 값으로 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체를 억제할 수 있다.
또 다른 예에서, 시스테인간 황 링키지를 보호하는 것은 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대해 다른 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 하위형의 선택성과 비교하여 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 또는 200배 중 적어도 하나 이상 더 선택적인 α9α10 nAChR 선택성을 제공할 수 있다.
또 다른 예에서, 시스테인간 황 링키지를 보호하는 것은 인간 혈청에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성보다 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 1000% 중 적어도 하나 이상 더 큰, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 인간 혈청에서의 안정성을 제공할 수 있다.
또 다른 예에서, 시스테인간 링키지를 보호하는 것은 CI 및 CIII, CII 및 CIV 사이의 시스테인간 링키지 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 보호하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 시스테인간 황 링키지를 보호하는 것은 CII와 CIV 사이에 메틸렌 티오아세탈을 삽입하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 시스테인간 황 링키지를 보호하는 것은 N-말단 아미노산과 C-말단 아미노산 사이에 락탐 가교를 생성하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 대상체에서 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 결합에 반응하는 병태를 치료하는 방법은 상기 언급된 치료적 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 병태는 통증일 수 있다.
또 다른 예에서, 통증은 화학유도 신경병증(CIPN), 당뇨병성 신경병증, 관절염 신경병증, 골관절염 신경병증 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 신경병성 통증일 수 있다.
또 다른 예에서, 통증은 HIV 통증일 수 있다.
또 다른 예에서, 통증은 나병과 관련된 통증일 수 있다.
또 다른 예에서, 통증은 수술후 통증 또는 외상후 통증 중 하나 이상일 수 있다.
또 다른 예에서, 병태는 척추 다발근병증일 수 있다.
또 다른 예에서, 병태는 대상포진 후 신경통일 수 있다.
또 다른 예에서, 병태는 삼차신경통일 수 있다.
또 다른 예에서, 병태는 복합 부위 통증 증후군일 수 있다.
또 다른 예에서, 병태는 암일 수 있다.
또 다른 예에서, 암은 상피암, 폐암, 유방암 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 병태는 다발성 경화증일 수 있다.
또 다른 예에서, 병태는 염증일 수 있다.
또 다른 예에서, 염증은 류머티즘과 관련된 면역 세포 또는 이들의 조합에 의해 매개될 수 있다.
또 다른 예에서, 치료는 투여 후 선택된 시간 내에 적어도 10%의 증상 감소를 제공할 수 있다.
또 다른 예에서, 조성물의 치료적 유효량은 1일 1회 내지 5회 대상체에게 투여될 수 있다.
또 다른 예에서, 치료적 유효량의 조성물은 약 1일 내지 약 3개월의 기간 동안 1일 1회 이상의 투여 요법에 따라 대상체에게 투여될 수 있다.
또 다른 예에서, 치료적 유효량의 조성물은 피하 투여 형태, 경피 투여 형태, 국소 투여 형태, 정맥내 투여 형태 또는 이들의 조합으로 투여될 수 있다.
또 다른 예에서, α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 결합에 반응하는 대상체의 병태를 치료하는 데 사용하기 위한 조성물은 대상체에 대해 상기 언급된 치료적 유효량의 조성물을 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 결합에 반응하는 대상체의 병태를 치료하기 위한 약제의 제조에서의 조성물의 용도는 대상체에 대해 상기 언급된 치료학적 유효량의 조성물을 포함할 수 있다.
실험 실시예
다음 실시예는 본 발명의 특정 실시형태들의 보다 명확한 이해를 촉진하기 위해 제공되며, 실시형태들에 대한 제한을 의미하지 않는다.
실시예 1-A: 형태적으로 제약된 α-RgIA 유사체의 설계 및 합성
방법 :
펩타이드 합성. 합성기(Syro I)에서 자동화된 Fmoc SPPS 화학을 사용하여 펩타이드를 합성했다. 첫 번째 아미노산을 2-CTC 수지(치환 = 0.77mmol/g)에 수동으로 연결하고 수지를 MeOH로 캡핑하여 0.4mmol/g의 최종 치환을 달성했다. 간략히 말하면, 250mg의 2-CTC 수지(치환 = 0.77mmol/g)를 팽윤시키고 DCM에서 30분 동안 세척하였다. 수지를 배수시킨 후 특정 Fmoc 보호된 아미노산(Fmoc-AA-OH = 0.1mmol, DCM = 4mL 중 DIEA = 0.2mmol)의 용액에 첨가하고 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 수지를 DMF 및 DCM으로 여러 번 세척하고 16% v/v MeOH 및 8% v/v DIEA를 함유하는 5 mL의 DCM과 함께 5분 동안 인큐베이션했다. 이 작업을 5회 반복한 후 DCM 및 DMF로 철저히 세척했다. 그런 다음 수지를 자동 합성을 위해 합성기에 세팅했다. 커플링 반응은 DMF(0.1mmol 아미노산 결합 수지당 5mL) 중의 HATU(5.0 당량), DIEA(10.0 당량) 및 Fmoc-AA-OH(5.0 당량)를 사용하여 70oC(Cys, Allyl 및 Aloc 보호 아미노산의 경우 50oC)로 15분간 가열하면서 수행되었다. 탈보호 반응은 실온에서 2회 동안 DMF(4mL) 중의 20%(v/v) 피페리딘을 사용하여 5분 동안 수행되었다.
절단. 실온에서 2.5시간 동안 TFA/H2O/TIPS/EDT = 95:2:2:1로 구성된 칵테일 완충액(0.1mmol 서열 결합된 수지당 3.0mL)으로 처리하여 수지로부터 펩타이드를 절단하였다. 이후 수득된 펩타이드-TFA 용액을 여과하고 냉온 에틸 에테르에 침전시키고 원심분리하고 에틸 에테르로 2회 이상 세척한 후 진공에서 건조시켰다. 이어서 미정제 생성물을 RP-HPLC로 정제하였다.
LC/MS 분석. Agilent 6120 Quadrupole LC/MS 시스템에서 0.1% FA의 H2O/ACN 구배로 0.4 mL/분으로 Xbridge C18 5 μm(50 x 2.1 mm) 컬럼의 LC/MS에 의해 펩타이드 특성화를 수행했다. HPLC 실행에서 수집한 분획들도 LC/MS로 분석했다.
HPLC 정제 방법 및 순도 확인. 달리 명시되지 않는 한 모든 샘플은 다음 조건으로 분석되었다. 미정제 펩타이드의 반분취 역상 HPLC는 Jupiter 5μ C18 300Å(250 x 10mm) 컬럼에서 3.0mL/분으로, 5% 내지 35%의 ACN의 0.1% TFA를 함유하는 H2O/ACN 구배로 Agilent 1260 HPLC 시스템에서 45분에 걸쳐 수행되었다. 표적 생성물을 함유하는 정제된 분획을 수집하고 Labconco 동결 건조기를 사용하여 동결건조시켰다. 모든 순도 평가, 이성질체 공동 주입 및 안정성 검정 분석은 Phenomenex Gemini C18 3μm(110Å 150 x 3mm) 컬럼에서 HPLC로 수행되었다.
수지 직교성 탈보호 및 락탐화에 대해. 방법 1: DCM 중의 Pd(PPh3)4 (0.1 당량) 및 DMBA (4.0 당량)를 사용하여 2시간 동안 알릴 에스테르(OAll) 및 알릴 카바메이트(NHAloc)를 수지 상에서 제거하고 이 반응을 2회 반복하였다. 방법 2: Pd 매개 탈보호는 3-아이오도-Tyr 함유 서열과 양립할 수 없다(아마도 Pd 삽입 및 환원으로 인해 탈아이오도 생성물이 대부분이었다). 따라서, O(Dmab) 및 NH(ivDde)는 직교 보호 쌍으로 사용되었다. 로딩된 수지를 DMF 중의 5% 하이드라진에서 4시간 동안 인큐베이션하고 작업을 한 번 반복했다. 락탐 고리화는 DMF에서 PyBOP/HOBt/DIEA(2:2:2.4 당량)의 고리화 조건 및 완료를 위해 사용된 회전장치에서 > 6시간 교반 하에 수지상에서 수행되었다. 반응 전환을 미세절단으로 모니터링하고 LC/MS로 확인했다.
공기중 산화 다이설파이드 결합 형성. 2개의 유리 시스테인이 있는 펩타이드는 실온에서 > 48시간 동안 5% DMSO를 함유하는 0.01M Na2HPO4 완충액(pH = 8.0)에서 통기하여 산화되었다. 반응 진행을 LC/MS로 모니터링하였다. 완료시, 상기 언급된 방법을 사용하여 반응 혼합물을 RP-HPLC로 정제하였다.
I 2 매개 다이설파이드 결합 형성. AcOH: H2O (80%:20% v/v, 1.00 mM)에서 교반된 Bis-Acm 보호된 펩타이드 용액에 AcOH에 용해시킨 I2 (10.0 당량)를 적가 방식으로 첨가하였다. 반응을 실온에서 10분 동안 교반하고 LC/MS로 모니터링하였다. 과량의 I2는 혼합물이 무색이 될 때까지 아스코르브산 용액(1.0M)을 첨가하여 퀀칭시켰다. 그런 다음 혼합물을 H2O(반응 혼합물과 동일한 부피)로 희석하고 RP-HPLC로 정제했다.
결과 및 결론:
완전히 활성화된 고리형 α-RgIA4 유사체를 조작하려는 목표를 바탕으로, NMR 구조(PDB 2JUQ)와 α-RgIA의 최근 수용체 공동-결정화 구조(PDB 6HY7)를 검사했다. 약 11.6Å의 거리를 유지하면서 α-RgIA의 N-말단과 C-말단은 모두 약물작용 발생단으로부터 멀어진다. 기존 백본 구조를 수용하기 위해, 이 거리를 확장시켜 이상적인 링커가 백본을 최소한으로 교란시켜 효능을 유지하도록 하기 위해 양쪽 단부 모두에 추가 아미노산이 사용된다. 따라서, 반응식 1에 도시된 설계된 합성 경로에 따라 일련의 측쇄 고리화 펩타이드가 합성되었다. 새로 도입된 락탐 가교가 수지상에서 합성된 후 위치선택적 다이설파이드 결합 배열을 적용하여 구형 이성질체를 제공하는 2단계 액상 산화 공정을 수행했다. 구체적으로, 도 2에 도시된 바와 같이, 측쇄 보호된 P1은 2-클로로트리틸 클로라이드(2-CTC) 수지 상에서 자동 Fmoc 고상 펩타이드 합성(SPPS)을 통해 합성되었으며 N-말단 Fmoc가 제거되고 Boc로 재보호되었다. 말단 측쇄 아민 및 산은 이어서 직교형으로 탈보호되고(PG1 및 PG2) 추가로 고리화되어 락탐 가교 분자 복합체 P2를 형성한다. 절단, 정제를 통해 락탐 고리화 펩타이드가 생성된 후 공기중 산화를 거쳐 이고리형 생성물 P3을 생성하였다. 마지막으로, 완전히 폴딩된 P4는 인시튜 요오드 산화성 탈보호-다이설파이드 형성을 통해 생성되었다.
실시예 1-B: 합성된 펩타이드의 시험관내 및 생체내 생물학적 평가
방법 :
화합물 특성화. 본 연구에서 합성 및 연구된 모든 유사체는 HPLC에 의해 순도 ≥ 95%로 결정되었다. 분자량은 ESI-MS로 측정하였다. [M+H]+ M/Z (Da): RgIA4, 계산 1691.6, 측정 1691.4; 유사체 1: 계산 1749.1, 측정 1749.6; 유사체 2, 계산 1791.0, 측정 1791.5; 유사체 3, 계산 1804.1, 측정 1804.6; 유사체 4, 계산 1819.1, 측정 1819.6; 유사체 5, 계산 1931.0, 측정 1931.5; 유사체 6, 계산 1929.0, 측정 1929.8; RgIA4[1,4], 계산 1691.6, 측정 1691.4; 유사체 6[1,4], 계산 1929.0, 측정 1929.6. 각각의 정제된 펩타이드에 대한 LC-크로마토그램 및 MS-스펙트럼을 도 3C 내지 3K에 나타내며 표 1B-1에 요약한다.
표 1B-1
Figure pct00002
난모세포 수용체 발현. 아프리카 발톱개구리(X. laevis) 난모세포에 선택된 nAChR 서브유닛을 인코딩하는 cRNA를 마이크로-주입했다. 모든 인간 이종 nAChRs 난모세포에 각 서브유닛의 15-25ng 등분을 주입했고, 동종 인간 α7 난모세포에는 50ng의 α7 인코딩 cRNA를 주입했다. 난모세포는 사용하기 전에 ND96에서 1-3일 동안 17 oC에서 인큐베이션되었다.
전기생리학적 기록. 주입된 난모세포를 30 μL 기록 챔버에 넣고 전압을 -70 mV의 막 전위로 고정하였다. ND96(96.0mM NaCl, 2.0mM KCl, 1.8mM CaCl2, 1.0mM MgCl2, 5mM HEPES, pH 7.5)과 0.1mg/mL BSA를 기록 챔버를 통해 ~2mL/분으로 중력 관류시켰다. 매 분마다 펄스를 발생시키면서 1초의 ACh 펄스를 적용하여 수용체 반응을 측정하였다. ACh는 모든 하위형에 대해 100μM의 농도로 적용되었으며, 예외적으로 α7의 경우 200μM, 근육 하위형의 경우 10μM로 적용되었다. 기준선 ACh 반응이 확립된 후, ND96 대조군 용액을 다양한 농도의 테스트 펩타이드를 함유하는 ND96 용액으로 전환하였다. 펩타이드 함유 용액을 관류시키는 동안, ACh 유도 반응의 차단을 평가하기 위해 ACh 펄스를 분당 1회로 지속시켰다. 반응이 정상 상태에 도달할 때까지 펩타이드 농도의 존재하에서 ACh 반응을 측정하였으며; 기준선 반응과 비교하여 이들 반응 중 평균 3개를 사용하여 반응 백분율을 결정하였다. 제한된 재료로 인해, 10μM 농도 테스트를 위해, ND96 흐름을 중지시킨 상태에서 3μl의 100μM 펩타이드를 30μl 기록 챔버에 도입하였다. 인큐베이션 5분 후, 펩타이드별로 임의의 블록을 측정하기 위해 ND96 흐름 및 ACh 펄스를 재개시켰다. 모든 농도-반응 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어로 수행되었으며; 결과 IC50을 포함한 값들을 비선형 회귀(곡선 적합) S자형 용량-반응(가변-기울기)을 사용하여 계산했다.
옥살리플라틴-유발 냉각 이질통. 옥살리플라틴을 0.9% 멸균 식염수에 0.875μg/μl로 용해시켰다. 유사체 6을 0.9% 멸균 식염수에 0.02μg/μl로 용해시켰다. CBA/CaJ 마우스에 옥살리플라틴(3.5mg/kg) 또는 0.9% 식염수(비히클)를 매일(주말 제외) ip 주사했다. 또한 대조군으로 유사체 6(80μg/kg) 또는 0.9% 식염수를 마우스에 매일 피하 주사했다. 본 연구에서 모든 화합물은 실험자에게 눈가림되었다. 수요일에 초기 기준선 냉온 민감도로 연구를 시작하였으며, 수요일, 목요일, 및 금요일에 첫번째 주 동안 주사를 투여하였다. 주사를 월요일에서 금요일까지 2주 더 지속하였고, 이전 일차의 주사 후 24시간 후 수요일에 테스트하였다. 마지막 주에는, 월요일과 화요일에 주사하였고, 24시간 후 최종 테스트 하였다.
냉온 플레이트 테스트. IITC Life Science사에서 구입한 고온/냉온 플레이트 기기를 사용하여 테스트를 수행하였다. 연구 행동이 가라앉을 때까지 플레이트를 실온(23 oC)으로 유지시키면서 테스트 마우스가 테스트 챔버에 적응될 수 있게 하였다. 이후 선형 램프의 온도를 분 당 10 oC의 속도로 낮추었다. 마우스가 양쪽 앞발을 들어 세게 흔들거나 반복적으로 발바닥을 핥았을 때 테스트를 중단하였다. 한 번에 하나의 앞발을 들어 올리거나 두 발을 앞뒤로 교대로 들어올리면 채점하지 않고 테스트를 계속했다. 최종 시간과 온도를 기록하고 Graphpad Prism을 사용하여 결과 데이터를 플롯했다. Dunnett의 다중 비교 검정과 함께 일원 ANOVA를 사용하여 데이터를 분석했다. 옥살리플라틴/식염수 대조군과의 유의한 차이에 대한 P-값은 * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001이었다.
결과 및 결론:
일부 α-CTx 기반 약물 후보들의 임상 시험에서의 이전의 실패로부터 인간 대 설치류 nAChR의 서로 다른 민감도를 극복하는 것이 CTx 기반 진통제 개발에서 중요한 장애물이자 교란 요인임이 입증되었다. 이를 해결하기 위해 합성된 유사체를 아프리카 발톱 원숭이 난모세포를 발현하는 인간 α9α10 nAChR의 2-전극 전압-클램프 전기생리학으로 테스트했다. 각 농도-반응 곡선에서 생성된 IC50 값을 도 3a-A 및 도 3a-B에 도시하고 표 1B-2에 열거한다([ ]는 고리화를 나타내고 ^는 C 말단을 나타냄).
표 1B-2:
Figure pct00003
최적의 링커 구성을 식별하기 위해 유사체 1 내지 4를 합성했다. 말단 [Glu-Lys] 측쇄로 고리화된 가장 효능있는 유사체 3은 α-RgIA4에 비해 효능이 10배 더 작다. 더 짧은 링커가 생성될 때 유사체 1[Asp-Dap] 및 2[Asp-Lys]에서 생체활성이 크게 떨어지며, 이는 백본에서의 긴장과 동요로 인해 유발될 가능성이 있다. 분자의 N-말단 잔기에서 Gly1을 βAla1로 교체하여 하나의 CH2 단위가 연장된 링커를 갖는 유사체 4 또한, 더 짧은 링커를 갖는 유사체들만큼 급격하지는 않지만 효능을 저하시켰다. [Glu-Lys]로 식별된 우수한 링커를 사용하여, 인간 α9α10 nAChR의 효능을 증가시킬 수 있는 잔기인 3-아이오도-티로신 돌연변이를 사용하여 유사체 5를 합성하였다. 유사체 5의 효능은 5.9 nM에 도달했고 Cit9가 Arg9로 다시 돌연변이되었을 때(α-RgIA5에 따라) 3.4 nM(유사체 6)로 추가로 감소했다. 다른 인간 nAChR 하위형에 대한 유사체 6을 이의 선택도를 측정하기 위해 테스트한 결과, 도 3b에서 보는 바와 같이, 통증 관련 nAChR 하위형이기도 한 α7(IC50 = 504.0 nM, 150배 감소)을 제외한 모든 하위형들에서 > 10 μM 효능을 보였다. 이 결과는 표 1B-3에서 보는 바와 같이 현재의 고리화 전략이 효능을 유지하면서도 수용체 선택성이 우수한 유사체 6을 생성함을 나타낸다.
표 1B-3
Figure pct00004
옥살리플라틴-유도된 말초 신경병성 통증 설치류 모델에서 유사체 6의 생체내 통증 완화 효과를 평가하였다. 도 3a-B에 도시된 바와 같이, 마우스에서 옥살리플라틴 투여는 냉각 이질통을 유발하여 냉온 플레이트 테스트에서 잠복기를 점진적으로 감소시키는 반면, 유사체 6의 매일의 공동-투여는 냉각 이질통을 유의하게 예방하였다.
실시예 1-C: RgIA4 및 유사체 6의 인간 혈청 안정성
방법 :
시험관내 인간 혈청 안정성 테스트. 펩타이드(RgIA4 및 유사체 6)를 H2O(1.0 mg/mL)에 용해시키고, 이 용액 100 μL를, 먼저 해동시키고 멸균 여과하고 13,000 rpm에서 15분 동안 사전 원심분리하여 지질을 제거한 인간 남성 AB 혈장의 인간 혈청 900 μL에 첨가하였다. 최종 펩타이드 농도는 0.1mg/mL였다. 그런 다음 용액을 37 oC 수조에서 인큐베이션하고 개개의 100 μL의 용액을 예정된 특정 시점에 채취하고 300 μL ACN으로 처리하고 얼음에서 30분 동안 냉각시켰다. 현탁액을 실온에서 5분 동안 13,000rpm에서 원심분리하였다. 그런 다음 10 μL의 상층액을 취하여 10 μL의 완충액 A(H2O 중 0.1% TFA)에 용해시켜 HPLC 샘플을 만들었다. 샘플을 HPLC(주입 부피 = 15μL; 컬럼: Phenomenex, 150mm x 4.6mm, 100Å, 5μ로 8분에 걸쳐 5-50% B의 선형 구배(A = H2O + 0.1% FA 및 B = ACN + 0.1% FA, 0.4mL/분 유속)로 분석했다. 220 nm에서 펩타이드 피크 면적을 적분하고, 시간에 대하여 초기와 비교하여 남아있는 펩타이드의 %를 그래프로 나타내었다. 혈청 안정성 실험을 각 펩타이드에 대해 독립적으로 3회 반복하였다. 데이터 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어로 수행되었다.
결과 및 결론:
인간 혈장에서 티올-유도된 다이설파이드 스크램블링 및 단백질 분해는 다이설파이드가 풍부한 펩타이드 약물에 대한 두 가지 주요한 위협이 된다. 새로 도입된 형태적 제약이 대사 안정성에 어떻게 영향을 미치는지 확인하기 위해 α-RgIA4와 비교하여 가장 효능있는 유사체 6에 대해 시험관 내 인간 혈청 안정성 분석을 수행했다. 도 4a-A에서 보는 바와 같이, 유사체 6은 α-RgIA4에 비해 극적으로 증가된 안정성을 나타냈다. 또한, 도 4a-B에 도시된 바와 같이 HPLC 분석에 의해 현저한 다이설파이드 스크램블링 억제가 관찰되었다. 전면 피크들은 스크램블된 생성물[1,4]이며, 이는 도 4b-A, 도 4b-B 및 도 4b-C에 도시된 바와 같이 이성질체 동시 주입에 의해 식별되었다. α-RgIA4의 절반 이상이 그의 리본 이성질체 α-RgIA4[1,4]로 스크램블링된 반면, 유사체 6의 10% 미만은 도 4a-A에 도시된 바와 같이 스크램블링되었다. 종합하면, 이들 데이터는 유사체 6의 측쇄 고리화가 단백질 분해 및 다이설파이드 스크램블링을 크게 억제함을 나타낸다.
실시예 1-D: NMR 분석 및 구조 결정
방법 :
NMR 분광법. 펩타이드 샘플들을 2.0 mM에서 10% D2O를 함유하는 (20 mM Na2HPO4, 50 mM NaCl, 50 μM NaN3 및 0.1 mM EDTA)로 구성된 pH 3.5 완충액에서 준비하였다(동위원소 효과에 대해 보정되지 않음). Inova 500 및 298K의 600MHz 분광계에서 스펙트럼을 기록하였다. 분광계는 VnmrJ4.0으로 설정되었다. TOCSY(80ms), gCOSY, NOESY(200ms), g11-NOESY 및 13C-HSQC를 포함한 2D 실험이 생성되었다. 데이터 수집을 위해 샘플들을 Shigemi 튜브에 로딩하고 농도구배된 여기 조각(excitation sculpting)을 사용하여 수분을 억제하였다. α-RgIA4의 경우 표 1D-1, 유사체 3의 경우 표 1D-2, 유사체 6의 경우 표 1D-3에서 보는 바와 같이 스펙트럼들을 소프트웨어 NMRPipe로 처리하고 화학적 변위를 SPARKY를 사용하여 할당했다. TOCSY(파랑색) 및 NOESY(빨강색)의 아마이드 영역과 HSQC 지방족 영역 및 방향족 영역의 오버레이. 할당은 SPARKY를 사용하여 이루어졌다. 예를 들어, 도 5b 내지 5j를 참조하라.
표 1D-1: α-RgIA4
Figure pct00005
표 1D-2: 유사체 3
Figure pct00006
표 1D-3: 유사체 6
Figure pct00007
구조 계산. 본 연구의 3D 구조는 CYANA 3.0을 사용하여 NOESY(200ms) 및 g11-NOESY 스펙트럼의 교차 피크들의 강도로부터 양성자 간 거리 제한을 도출하여 계산되었다. 특정 아미노산 라이브러리들(3-아이오도Tyr, 연결된 Glu 및 Lys)는 천연 아미노산을 기반으로 측쇄에서 변형되었다. 위형-원자 교정(Pseudo-atom corrections)은 비-입체특이적으로 할당된 양성자에 적용되었다.
Figure pct00008
Figure pct00009
, ψ 및 χ1 백본 이면각에 대한 제약 조건을 Hα, Cα, Cβ 및 HN 화학적 변위를 기반으로 TALOS에서 생성하였다. 구조들을 PyMOL 프로그램을 사용하여 시연하였으며 Rosseta로 정제하였다. 20개의 가장 낮은 에너지 구조의 앙상블을 수소를 생략시킨 막대로 도시한 백본 원자(N, O, Cα 및 Hα)에 중첩시키고 도 5k 내지 5m에 도시된 바와 같이 계산 통계를 제공한다.
결과 및 결론:
전체 구조에 대한 측쇄 고리화의 효과를 더 잘 이해하기 위해 유사체 3 및 6과 함께 α-RgIA4의 NMR 연구를 수행했다. 특히 Pro6에서 Gln11까지의 나선 영역에서, 밀접하게 관련된 2차 Hα 화학적 변위는, 도 5a-A에 도시된 바와 같이, 이들 3개 분자들 사이의 고도의 구조적 유사성을 나타냈다. α-RgIA4와 3 사이의 C 말단 영역에서 약간의 변화가 관찰되었지만 α-RgIA4와 6은 더 유사했다. α-RgIA4, 3 및 6의 전체 3차원 분석 NMR 구조는 CYANA3.0을 사용하여 계산되었다. 200개의 계산된 구조에서 20개의 가장 낮은 에너지 구조가 낮은 백본 RMSD로 생성되었다. 고리화-제약이 있는 말단의 차이와 측쇄 링커들의 교란에도 불구하고 유사체 3과 유사체 6은, 특히, 수용체 결합에 사용되는 Asp5-Pro6-Arg7 “인식 핑거” 영역에서 α-RgIA4와 높은 구조적 유사성을 공유한다(도 5a-B 및 5a-C). 전반적으로, 추가적인 [Glu-Lys] 측쇄 고리화는 펩타이드의 코어에 대한 구조적 교란을 가져오지 않는다.
실시예 1-E: 도킹 모델
방법 :
도킹 연구. NMR 데이터로부터 20개의 가장 낮은 에너지 앙상블에서 유사체 6 형태체(conformer)의 두 가지 일반 분류가 표시되었다. 이 두 분류 모두 Rosetta에서 분석되었지만 한 분류(20개의 앙상블 구조 중 17개 포함)가 도킹된 좌표를 생성했으며, 이는 α9 서브유닛(PDB 6HY7)이 있는 RgIA의 결정 구조에서 분해된 공지된 상호작용을 성공적으로 재현했다. Rosetta를 사용하여 α9/α10 nAChR 서브유닛 인터페이스들에서 유사체 6에 대한 가상 결합 모델을 생성하기 위해 해당 분류로부터 가장 낮은 에너지 형태체를 선택했다. α9의 구조는 PDB 항목 6HY7 및 4D01에서 가져왔고 α10에 대한 상동성 모델링 좌표는 이전 보고서에서 가져왔다. 시험관 내 돌연변이 실험에 따르면 α-RgIA는 α9(+)/α10(-) 인터페이스보다 α9(+)/α9(-) 및 α10(+)/α9(-) 인터페이스에 우선적으로 결합할 가능성이 있으므로 α9( +)/α9(-) 및 α10(+)/α9(-)를 Rosetta에서 모델링하기 위해 선택하였다. 수용체 서브유닛 인터페이스에 대한 유사체 6의 초기 도킹 실행은 Rosetta 도킹 프로토콜을 사용하여 수행되었으며, 아세틸콜린 결합 부위에서 유사체 6의 시작 위치를 3Å 및 8° 만큼 무작위 번역 및 회전 교란시켰다. 생성된 1000개의 좌표 파일들에 대한 Rosetta 도킹 메트릭 I_sc 및 rms를 2D 산점도에 플롯하였으며, 이는 아세틸콜린 결합 부위(PDB 파일 6HY7에서 RgIA에 정렬됨)에서 유사체 6의 위치가 가장 유리한 I_sc 점수를 제공했음을 나타낸다. I_sc와 rms 사이에는 상당한 상관관계가 있었는데, 이는 초기 도킹 작업 중의 수렴을 나타낸다. 인터페이스 상호 작용의 추가 정제는 [-docking_local_refine 플래그]를 사용하여 수행되었다. 높은 채점 결과가 아웃라이어가 아님을 보장하기 위해 로컬 정제 결과를 I_rms 및 I_sc를 사용하여 클러스터링하고 최종 최소화 작업은 도 6b 및 6c에 도시된 바와 같이 Rosetta Relax를 사용하여 수행되었다.
결과 및 결론:
마지막으로 SAR 노력을 알리기 위해 Rosseta 단백질-단백질 도킹 계산을 기반으로 수용체에 대한 유사체 6의 도킹 모델을 생성하였다. 우리는 α-RgIA/α9(+) 결정 구조(PDB 6HY7)에 의해 밝혀진 결합 상호작용이 α9/α10 nAChR과 결합하는 유사체 6의 경우에도 존재할 것으로 Rosetta에 의해 예측되었음을 발견했다. 구체적으로, 도 6a-A 및 6a-C2에 도시된 바와 같이, 유사체 6 잔기 Asp5 및 Arg7은 분자내 염다리를 형성하고, Arg7에 남아 있는 아민은 α9(+) 및 α10(+) 표면 모두에서 수용체 잔기 Pro200의 백본 카르보닐에 수소 결합하며, 상호작용은 상기 보고된 결정 구조와 거의 동일하다. 또한 유사체 6의 Pro6은 루프 B에서 Trp151과 CH2-π 상호 작용을 형성한다. 또 다른 상호작용들은 본 실시예에서 연구된 두 수용체 표면들 사이에 약간 상이함을 보여주지만, (일부 잠재적인 상호작용 짝들을 간신히 수소 결합 컷오프 거리 이상에 배치하는) 이러한 명백한 차이점들은 이러한 모델에 의해 과장될 수 있는데, 이는 리간드 결합 시 수용체 백본 위치에 있어서 잠재적으로 유발되어 핏된 적합한 형태 변화를 고려하지 않기 때문이다. 우리의 결과는 α9(+)/α9(-) 인터페이스의 경우 Arg9와 Thr152의 백본 산소 사이의 추가 상호 작용을 나타낸다. 수용체 잔기 Arg59는 α10(+)/α9(-) 및 α9(+)/α9(-) 모두의 경우 유사체 6 잔기 Cys3 그리고 α10(+)/α9(-)의 경우 Cys8의 백본 산소와 수소 결합을 형성한다. 마지막으로, 잔기 Thr4는 도 6a-B 및 6a-D에 도시된 바와 같이, Asp171과 수소 결합을 형성할 것으로 예상된다. 보고된 α-RgIA 및 인간 α9(+) 표면의 공동 복합체와 이러한 가상 모델의 일치는 이러한 예측의 근거를 뒷받침한다. 그러나 α-RgIA 및 α9α10 nAChR을 사용하여 (-) 표면에 대해 직접적이고 경험적으로 유도된 구조 데이터가 부족하다는 점을 감안할 때, 전체 수용체 ECD와 복합체를 이루는 α-RgIA 및 관련 유사체들의 구조 결정은 향후 연구의 목표로 남아 있다.
실시예 1-F: 재료 및 방법
재료. 시중에서 구할 수 있는 모든 화학 물질을 구매하여 추가 정제 없이 바로 사용했다. 표준 Fmoc 보호 아미노산은 Protein Technologies Inc.사에서 구입했다. Fmoc-L-Cys(SAcm)-OH, Fmoc-L-Cit-OH, Fmoc-L-3-Iodo-Tyr-OH, Fmoc-beta-Ala-OH, Fmoc-L-Glu(OAll)-OH, Fmoc-L-Lys(NAloc)-OH, Fmoc-L-Asp(OAllyl)=OH, Fmoc-L-Glu(ODmab)-OH, Fmoc-L-Dap(NAloc)-OH, Fmoc-L-Lys(ivDde)-OH를 포함한 특정한 보호된 아미노산 및 HATU, HOBt, PyBOP를 비롯한 화학물질들은 Chemimpex Inc사로부터 구입했다. 2-CTC 수지는 ChemPep에서 구입했다. EDT, DIEA, DCM, TIPS, DMBA, Pd(PPh3)4, 요오드, 피페리딘, ACh, 포타슘 클로라이드, 인간 혈청 및 BSA는 Sigma Aldrich사에서 구입했다. DMF, TFA, 아세트산, ACN 및 에틸 에테르는 Fisher Scientific사에서 구입했다. 옥살리플라틴은 MedChem Express사에서 구입했다.
동물. 동물에 대한 모든 실험 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침에 따라 수행되었으며 유타 대학의 동물실험 윤희 위원회(IACUC)가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다. 2-전극 전압 클램프 실험에 사용된 아프리카 발톱개구리 난모세포는 Xenopus One에서 구입했다. 옥살리플라틴 실험용 마우스는 Jackson Laboratory에서 구입가능한 CBA/CaJ 근친교계였다. 사용되는 동물의 수를 줄이고 시술 중 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였다.
실시예 2-A: RgIA 메틸렌 티오아세탈 유사체의 화학적 합성 및 특성화
방법 :
코노톡신 유사체 합성. 고상 펩타이드 합성. 선형 펩타이드는 2-CTC 수지를 사용하여 이전에 기술된 바와 같이 합성기(Syzo I)에서 자동화된 Fmoc-SPPS 화학을 사용하여 합성되었다.
절단 및 정제. 칵테일 완충액(TFA:H2O:TIPS:EDT = 95:2:2:1, 3.0mL/0.1mmol)으로 2.5시간 동안 처리하여 수지로부터 펩타이드를 절단했다. 수득된 펩타이드-TFA 용액을 플라스틱 필터를 통해 여과시키고 냉온 에테르(40mL)로 침전시키고 -20oC에서 30분 동안 냉각한 다음 원심분리하여 펠릿화시켰다. 미정제 펩타이드를 냉온 에테르(30mL)로 세척하여 잔류 TFA를 제거하고 진공에서 건조시켰다. 그런 다음 미정제 생성물을 Agilent 1260 HPLC 시스템에서 5% 내지 45% ACN의 0.1% TFA를 포함하는 H2O/ACN 구배로 수행된 RP-HPLC로 Jupiter 5μ C18 300Å(250 x 10mm) 컬럼에서 3.0mL/분으로 40분 동안 정제했다. 표적 생성물을 함유하는 정제된 분획을 수집하고 동결건조기(Labconco)에 의해 동결건조시켰다.
LC/MS 분석. Agilent 1260 Quadrupole LC/MS 시스템에서 0.1% 포름산을 함유한 H2O/ACN 구배를 사용하여 0.4 mL/분의 유속으로 Phenomenex Gemini C18 3.0 μm(110 Å 150 x 3 mm) 컬럼에서 LC/MS로 펩타이드 특성화를 수행했다. HPLC 정제 분획, 최종 생성물에 대한 순도 확인, 안정성 분석도 LC/MS로 분석했다.
메틸렌 티오아세탈 형성. 반응은 크래머가 보고한 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 정제된 선형 펩타이드를 H2O에 용해시키고 H2O(19.0 mM) 중에 사전 혼합된 TCEP.HCl(2.0 당량) 및 K2CO3(4.0 당량)로 처리하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하였다. 이어서 Et3N (THF 중 10.0 당량 380 mM)을 혼합물에 첨가한 다음 CH2I2 (THF에 용해된 6.0 당량 230 mM)를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 약 6시간 내에 선형 펩타이드가 완전히 전환될 때까지 반응하도록 두었다(참고: 반응 시간이 길어지면 RP-HPLC에서 넓은 피크가 나타날 수 있는데, 이는 아미노산 라세미화에 의해 유발될 가능성이 있으며; 대규모 제조에 5% DMSO를 추가할 수 있다). I 2 매개된 다이설파이드 형성. AcOH(수용액 25%, 1.0mM) 중의 상기 교반된 bis-Acm-보호된 펩타이드 용액에 AcOH(5.0mg/mL) 중 I2(10.0당량)를 첨가하였다. 반응을 실온에서 10분 동안 교반하고 LC-MS로 모니터링하였다. 과량의 I2를 무색이 될 때까지 1.0M 아스코르브산 용액을 첨가하여 퀀칭한 다음 혼합물을 RP-HPLC로 정제하여 펩타이드를 얻었다. 완전히 폴딩된 모든 펩타이드는 NMR 분석 및 생물학적 분석 전에 RP-HPLC하여 ≥ 95% 순도인 것으로 확인되었다.
펩타이드 특성화. 분자량은 ESI-MS [M+H]+ 및 [M+2H]2+로 다음과 같이 측정되었다: RgIA-5617:계산 1705.6 853.3, 측정 1705.4 853.2; RgIA-5533: Calc Calc 1705.6 853.3, 측정 1705.4 853.4; RgIA-5618, Calc 1719.7 860.4, 측정 1719.6 860.4; RgIA-5524, Calc 1874.9 937.9, 측정 1874.4, 937.5; RgIA-5573, Calc 1768.8 884.9, 측정 1768.5 884.9.
결과 및 결론:
도 7a-A, 7a-B, 7a-C, 7a-D에서 보는 바와 같이, RgIA 유사체의 화학적 합성은 2-클로로트리틸 클로라이드(2-CTC) 수지에서 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 고체상 펩타이드 합성(SPPS)을 사용한 다음 2단계의 위치선택적 분자내 결합 형성 반응을 사용하여 달성되었다. 올바른 스캐폴드 폴딩은 CysI-CysIII, CysII-CysIV 또는 동일한 연결성을 갖는 이의 상응하는 메틸렌 티오아세탈 대체물이다. 결합은 명시적으로 1) 절단을 통한 트리틸(Trt) 제거 후 유리 Cys 상에서 메틸렌 티오아세탈 형성, 2) 인시튜 산화성 아세트아미도메틸(Acm) 탈보호-커플링 공정을 통한 다이설파이드 결합 형성, 및 3) 메틸렌 티오아세탈 형성을 반복하여 비스-메틸렌 티오아세탈 대체 유사체를 생성하는 순서로 형성되었다. 상세하게는, 2-CTC 수지로부터 조립된 펩타이드 사슬을 절단한 후, Trt 보호가 제거되었으며, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP. HCl), 포타슘 카보네이트 및 트리메틸아민(Et3N)의 존재하에서 디아이오도메탄으로 처리하여 표적 메틸렌 티오아세틸 결합을 형성하였다. 이 작업 변환은 하나의 배치에서 최대 300mg 규모로 수행될 수 있으므로 추가 연구를 위해 표적 펩타이드를 대량으로 준비할 수 있다. 제2 다이설파이드 가교는 25% 수성 아세트산(AcOH)에서 과량의 요오드를 처리하여 Acm 탈보호 후 형성되어, 완전히 폴딩된 펩타이드를 생성하였다. RgIA 및 RgIA4는 본원에 기재된 바와 같이 합성되었다. 모든 펩타이드는 ≥ 95% 순도로 정제하여 RP-HPLC로 나타내었고 최종 생성물을 NMR 연구 및 생물학적 검정 전에 도 7B-a 및 7B-b, 표 2A-1에서 보는 바와 같이 ESI-MS로, 그리고 도 7c 내지 7g에서 보는 바와 같이 LC 크로마토그래피로 분석하였다.
표 2A-1
Figure pct00010
실시예 2-B: RgIA 메틸렌 티오아세탈 유사체의 시험관내 생물학적 평가
방법 :
2-전극 전압-클램프(TEVC) 기록. 우리는 다음과 같은 방법을 따랐다. 간략히 말하면, 아프리카 발톱 원숭이 난모세포를 사용하여 복제된 래트 또는 인간 nAChR 하위형들을 이종적으로 발현시켰다. 주사 후 1-3일차에 기록을 수행하였다. 0.1 mg/mL BSA를 함유하는 ND-96 완충액으로 2-4 mL/분의 유속으로 중력 관류되는 30 μL 난모세포 챔버에서 난모세포를 -70 mV의 막 전위에서 전압 고정하였다. 분 당 1s ACh(모든 하위형에 대해 100μM, 예외적으로, α7의 경우 200μM 및 근육 하위형의 경우 10μM) 펄스를 적용하여 기준선을 설정했다. 그런 다음 다양한 농도의 테스트 펩타이드를 포함하는 ND96 용액을 전환시키고 정상 상태에 도달할 때까지 ACh 반응을 측정했다. 모든 기록은 실온에서 생성되었으며 3 내지 6번의 독립 실험으로 반복되었다. GraphPad Prism 소프트웨어로 데이터 분석을 수행하고 결과 IC50을 포함한 값을 비선형 회귀 S자형 용량-반응을 사용하여 계산했다.
결과 및 결론:
아프리카 발톱 원숭이 난모세포에서 이종적으로 발현된 인간 α9α10 nAChR에 대한 모든 합성된 유사체의 생체활성을 2-전극-전압-클램프(TEVC) 전기생리학으로 테스트하였다. RgIA 시리즈에서 다이설파이드 대용물로서 메틸렌 티오아세탈의 호환성을 결정하기 위해, 도 8a-A에 도시된 바와 같은, 메틸렌 티오아세탈 치환체가 서로 다른 유사체들의 모음을 합성하고 테스트하였다. 농도-반응 분석에 의해 결정된 IC50 값은 도 8a-B에 도시되어 있다. 이에 비해 천연 RgIA는 인간 수용체에 대한 친화도가 낮기 때문에 510nM의 IC50 값으로 인간 α9α10 nAChR에 의해 매개되는 ACh 유발 전류를 억제한다.
메틸렌 티오아세탈이 변형된 RgIA 유사체인 RgIA4의 서열에 도입되었을 때 차등적인 효과가 생성되었다. 구체적으로, 메틸렌 티오아세탈에 대하여 교환된 루프 II [CysII-CysIV] 다이설파이드를 가지는 RgIA-5533은 낮은 나노몰 효능(IC50 = 6.1 nM)을 가졌다. 대조적으로, 유사체 RgIA-5617의 경우, 메틸렌 티오아세탈 작용기가 루프 I[CysI-CysIII]로 이동하면서 효능이 엄청나게 감소했다(IC50 = 880 nM). 두 다이설파이드 모두가 RgIA-5618에서 대체되었을 때 활성이 추가로 제거되었다(IC50 > 10μM). 이러한 데이터는 RgIA의 루프 II 다이설파이드[CysII-CysIV]는 메틸렌 티오아세탈로 변형될 수 있는 반면, 다른 위치[CysI-CysIII]에서의 치환은 인간 α9α10 nAChR에 대한 활성을 제거한다는 것을 보여준다. 결과는 RgIA의 다이카르바 변형 유사체에 대한 선행 연구들과 일치하는데, [CysII-CysIV]-다이카르바 RgIA의 트랜스/시스 이성질체 모두가 α9α10 nAChR에 대해 훨씬 감소된 활성을 유지하는 반면 [CysI-CysIII]-다이카르바 유사체는 완전히 비활성 상태였다. 유사하게, 구조 및 활성에 대한 [CysI-CysIII] 다이설파이드의 효과는 다이설파이드-결핍 유사체를 분석함으로써 또 다른 α-4/3-CTxs ImI에서도 입증되었다. IC50 값이 0.9nM인 효능있는 유사체 RgIA-5524를 제공하기 위해, RgIA-5533은 RgIA5뿐만 아니라 비정규 아미노산인 β-호모티로신(bhTyr)에 기초한 돌연변이로 변형되었다. β-알라닌(bAla)에 의한 bhTyr의 단일 잔기 돌연변이는 효능이 더 작은(IC50 = 2.9 nM)유사체 RgIA-5573을 생성하였는데, 이는 잔기 위치 13에서 페놀 모이어티의 효과를 나타낸다.
RgIA-5533 및 RgIA-5524의 하위형 선택성을 조사하였다. 도 8a-C 및 도 8b에서 보는 바와 같이, 2-전극-전압-클램프(TEVC) 전기생리학은 두 유사체들 모두가 α1β1, α2β2, α2β4, α3β2, α3β4 α4β2, α4β4, α6/α3β2β3 및 α6/α3β4를 비롯한 광범위한 nAChR 하위형들을 10 μM (IC50 > 10 μM)에서 억제하지 못하였음을 보여주었다. 도 8a-D에 도시된 바와 같이, 농도-반응 분석은 RgIA-5533 및 RgIA-5524 둘 모두 α7 nAChR에 대해 나노몰 IC50을 나타냈지만 여전히 hα9α10 nAChR에 대해 200배 이상 선택적임을 나타내었다. 도 8a-C 및 8a-D에 도시된 바와 같이, 방사성 리간드로서 [125I]α-붕가로톡신(α-Btx)을 사용한 경쟁 결합 분석을 통해 RgIA-5524를 테스트한 결과, RgIA-5524가 10μM 수준에서 41% 억제를 생성하였음을 나타내었으며, 이는 hα7 nAChR 하위형에 대한 낮은 효능과 일치한다.
실시예 2-C: RgIA-5524의 생체내 통증 완화 효능
방법 :
생체내 항통각수용 활성 평가. 신경병성 통증 모델. 동물에 대한 모든 실험 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침에 따라 수행되었으며 유타 대학의 동물실험 윤희 위원회(IACUC)가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다. 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였다. 수컷 CBA/CaJ 마우스(생후 2-3개월)에 옥살리플라틴을 주사하였다. 만성 투여 그룹의 경우 옥살리플라틴을 21일의 기간에 걸쳐 주 당 5일 3.5 mg/kg으로 복강내 투여했다. 급성 투여 그룹의 경우 5.0 mg/kg 옥살리플라틴 또는 10.0 mg/kg 옥살리플라틴을 단회 용량으로 제공하였다. 0.9% 식염수가 비히클 대조군으로 사용되었다.
냉온 플레이트 테스트. 냉온 플레이트 테스트는 고온/냉온 플레이트(IITC Life Science)를 이용하여 수행되었다. 연구 행동이 가라앉을 때까지 마우스를 테스트 챔버에 적응하게 하였다. 그런 다음 선형 램프를 사용하여 플레이트 온도를 실온으로부터 낮추었다(10 oC/분). 1차 통증 관련 행동(뒷발 들어올리기 및 핥기)의 시간과 온도를 기록했다. 평가자는 약물 및 마우스 유전자형에 대해 눈가림되었다. 데이터의 통계적 평가는 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Dunnett의 다중 비교 테스트에 의해 수행되었다. 모든 결과를 평균 ± SEM(n = 8-12)으로 표현한다. P 값은 유의도 차이에 대해 * P <0.05, ** P <0.01, 및 *** P < 0.001이었다.
결과 및 결론:
화학 요법으로 유발된 신경병성 통증은 플라틴 기반 약물의 주요 용량 제한 부작용이다. 현재 옥살리플라틴 유발 신경병성 통증의 병리생리학은 제대로 연구되지 않았으며 이러한 용량 제한 부작용을 예방하기 위해 승인된 약물은 없다. 도 9에서 보는 바와 같이 RgIA-5524의 생체내 진통 활성을 마우스에서 옥살리플라틴-유도된 말초 신경병성 통증 모델을 사용하여 평가하였다. 냉각 이질통은 옥살리플라틴의 무력화 부작용이다. 이러한 부작용의 크기와 시간 경과는 용량에 따라 다르다. RgIA-5524를 매일 반복 주사하면 화학 요법으로 인한 신경병증성 통증이 발생하는 것을 예방할 수 있다. 옥살리플라틴(i.p. 3.5 mg/kg, 매주 5일)은 냉온 플레이트에서 현저하게 감소된 발 움츠림 잠복기에 의해 나타난 바와 같이 치료 21일차까지 상당한 냉각 이질통을 생성했다. 대조적으로, 40μg/kg의 RgIA-5524를 투여받은 옥살리플라틴 처리된 마우스는 이질통이 발생하지 않았다.
우리는 다음으로 야생형 및 α9 KO 마우스 모두에서 단회 주사 옥살리플라틴 치료 연구를 수행했다. 도 10A 및 10C에서 보는 바와 같이, 결과는 옥살리플라틴 치료 (s.c. 5.0 mg/kg 및 10.0 mg/kg) 후 5일차에 급성 냉각 이질통을 역전시킴에 RgIA-5524가 효과적이었음을 보여주며, 이는 Sal/Sal vs Ox/Sal의 WT 그룹과 Ox/RgIA-5524 vs Ox/Sal 간의 유의한 차이로 나타났다. 그러나, 이러한 효과는 α9 KO 마우스 그룹에서는 발생하지 않았으며, 도 10B 및 10D에서 보는 바와 같이 Ox/RgIA-5524 대 Ox/Sal의 α9 KO 그룹 사이에 유의도가 관찰되지 않았다. 이러한 KO 실험은 RgIA-5524에 의한 α9α10 nAChR의 차단이 화학 요법으로 유발된 신경병성 통증의 예방 또는 약화를 가능하게 한다는 것을 입증했다.
실시예 2-D: RgIA-5524의 시험관내 약리학, 독성 및 대사 분석
방법 :
시험관내 약리학 분석. 일반적으로, RgIA-5524는 처음에 분석에서 기본 농도 10μM에서 4중으로 테스트되었다. RgIA-5524가 방사성 리간드 결합의 50% 이상을 차단했을 때 농도-반응 곡선을 결정하기 위해 2차 분석을 수행했다.
경쟁 결합 및 효소 분석. 세포막 균질물을 RgIA-5524의 부재 또는 존재하에 방사성 리간드와 함께 인큐베이션하였다. 비특이적 결합은 표적에서 특이적 작용제 또는 길항제의 존재하에 결정되었다. 인큐베이션 후, 샘플을 완충액에 미리 적신 유리 섬유 필터들을 통해 진공하에서 빠르게 여과시키고 48-샘플 또는 96-샘플 세포 채취기를 사용하여 얼음처럼 차가운 완충액으로 여러 번 헹구었다. 그런 다음 섬광 칵테일을 사용하여 섬광 계수기에서 필터의 방사능을 계수했다.
hERG K + 채널 억제 분석. 인간 hERG 형질감염된 CHO-K1 세포에 대한 자동화된 전 세포 패치-클램프(Qpatch 16)를 사용하여 외부 칼륨 전류를 기록했다. 전 세포 구성이 22°C에서 달성된 후, 세포를 -80 mV에서 유지시켰다. 누출 전류를 측정하기 위해 50ms 펄스를 -40mV까지 전달하였다. 그런 다음 hERG K+ 꼬리 전류를 나타내기 위해 세포를 +20 mV까지 2초간, 이후 -40 mV까지 1초간의 펄스로 탈분극시켰다. 이러한 패러다임은 현재 진폭을 모니터링하기 위해 5초마다 전달된다. 세포외 용액을 먼저 적용한 다음 RgIA-5524 용액을 동일한 세포에 순차적으로 적용한다. E-4031은 참조 리간드로서 테스트되었다.
GABA B1b 수용체에서 RgIA-5524의 기능적 연구. 세포를 DMEM 완충액에 현탁시킨 다음 마이크로플레이트에 분배하였다. 20mM Hepes(pH 7.4)로 보충된 HBSS 완충액에서 프로베니시드와 혼합된 Fluo4 NW를 각 웰에 첨가하고 37°C에서 60분 동안, 다음으로 22°C에서 15분 동안 세포들로 평형화시킨다. 그 후, 분석 플레이트를 마이크로플레이트 판독기에 위치시키고, 하나의 농도(자극 대조군) 또는 다양한 농도(EC50 또는 IC50 결정)의 참조 작용제 또는 길항제(3-APMPA)를 첨가하고, 유리 세포질 Ca2+ 이온 농도에 비례하여 변화하는 형광 강도의 변화를 측정하였다.
CYP 효소 이소형 억제 분석. RgIA-5524는 37°C 건조 인큐베이터에서 5분 동안 PBS 7.4의 NADPH 생성 시스템을 사용하여 사전 인큐베이션된다. 반응은 CYP 효소 이소형, 기질 및 BSA의 혼합물을 첨가함으로써 개시된다. 인큐베이션 기간 전후에 각 웰의 형광을 판독한다. 억제 퍼센트는 대조군의 백분율을 빼서 계산한다.
결과 및 결론:
우리는 또한 가장 효능있는 유사체 RgIA-5524가 광범위한 시험관내 약리학 분석을 통해 유망한 비-오피오이드 진통제 후보였음을 입증했다. 먼저 다양한 통증 관련 수용체 및 이온 채널에 대해 RgIA-5524를 테스트했다. 도 11a-A에 요약된 바와 같이, 10 μM 수준에서 RgIA-5524는 오피오이드 수용체, NMDAR, BZD, OCT 수용체 및 다양한 전압 개폐 이온 채널(Na+, K+ & Ca2+)을 포함하는 이러한 잠재적 표적들에 대해 낮은 활성을 보이거나 전혀 활성을 나타내지 않았다(< 50% 억제). N형 Ca2+ 채널에서 RgIA-5524를 테스트하면 10μM에서 58.4% 억제로 낮은 효능을 보인 반면, 추가 농도-반응 분석에서는 진통 활성을 설명하기에는 너무 낮은 마이크로몰 친화도가 입증되었다. 세포 유전체 분광법 분석을 이용하여, 우리는 또한 RgIA-5524가, 도 11a-B, 11a-D 및 11a-E에서 보는 바와 같이, RgIA 진통에 대한 가정된 메카니즘인 GABAB1b 수용체에서의 임의의 농도 의존적 작용제 또는 길항제 효과를 나타내지 못함을 입증하였다. 위의 생체 내 α9 KO 마우스 연구와 종합할 때, 상기 결과는 관찰된 RgIA-5524 진통 효과의 지배적인 메커니즘이 길항적 α9 함유 nAChR임을 확실히 입증한다.
약물 유발성 심장독성은 지난 수십 년 동안 약물 중단을 초래하는 주요 원인 중 하나가 되었으며, 이는 인간 ether-a-go-go-관련 유전자(hERG) K+ 채널 차단과 밀접한 관련이 있다. 도 11a-B 및 11a-F에서 보는 바와 같이, 자동화된 전세포 패치-클램프 분석으로부터 심혈관 질환에 대한 어떠한 증거도 나타나지 않았는데, 이 분석에서 RgIA-5524는 100 μM의 고농도에서 <25%의 억제를 유발하였다 . 한편, 도 11a-C에서 보는 바와 같이, RgIA-5524는 여러 신경퇴행성 질환에 사용될 수 있는, 아세틸콜린에스테라제 및 MAO를 포함하는 일련의 효소 및 흡수 분석에서 비활성이다. 마지막으로, 우리는 RgIA-5524가 약물-약물 상호작용에 영향을 미칠 가능성을 평가했으며, 도 11a-C에서 보는 바와 같이, 10 μM에서 CYP 효소 이소형의 넓은 패널에 대해 어떠한 억제도 관찰되지 않았다.
실시예 2-E: NMR 분광학 및 구조 분석
방법 :
구조 분석. NMR 분광법. 펩타이드 샘플(20mM Na2HPO4, 50mM NaCl, 50μM NaN3 및 0.1mM EDTA와 함께 pH 3.5의 10% D2O 함유 완충액에 용해된 2.0mM의 농도로 제조됨, 동위원소 효과에 대해 보정되지 않음)은 Inova 600MHz 분광계에서 298K에서 기록되었다. 2차 구조는 TOCSY(80ms), NOESY(200ms), g11-NOESY, gCOSY 및 HSQC를 사용하여 결정되었다. 물 억제를 위해 여기 조각 전략(Excitation sculpting scheme)을 사용하였다. NMRPipe 및 SPARKY를 사용하여 스펙트럼을 분석하였다. 분자 표현은 PyMOL 프로그램을 사용하여 준비되었다. TOCSY(파랑색) 및 NOESY(빨강색)의 아마이드 영역과 HSQC 지방족 영역 및 방향족 영역을 오버레이한다. 할당은 SPARKY를 사용하여 이루어졌다. 예를 들어, 도 11b 내지 11j, 및 표 2E-1, 2E-2, 및 2E-3 (Scs = L-S-메틸렌-시스테인; Cit = L-시트룰린, Tiy = L-3-아이오도-티로신).
표 2E-1: RgIA-5533
Figure pct00011
표 2E-2: RgIA-5617
Figure pct00012
표 2E-3: RgIA-5524
Figure pct00013
구조 계산. 3차원 구조는 CYANA 3.0을 사용하여 2차원 스펙트럼으로부터 계산되었으며 백본 이면각 제약은 TALOS 프로그램에 의해 예측되었다. 비-표준 아미노산(L-시트룰린, L-3-아이오도-티로신, LS-메틸렌-시스테인 및 L-β-호모티로신)은 이전에 설명한 바와 같이 CYANA 3.0을 사용하여 해당 천연 아미노산을 기반으로 제작되었다. 계산된 총 200개의 구조 중 20개의 가장 낮은 에너지 앙상블이 Cα 거리 측정을 추가 분석하기 위해 선택되었다. 20개의 가장 낮은 에너지 구조의 앙상블을 수소를 생략시킨 막대로 도시한 백본 원자(N, O, Cα 및 Hα)에 중첩시키고 도 11j 내지 11m에 도시된 바와 같이 계산 통계를 제공한다.
결과 및 결론:
변형된 유사체의 NMR 연구를 수행하여 구조적 특징을 비교하고 대조했다. RgIA-5533, RgIA-5617 및 RgIA-5524를 포함하는 유사체를 TOCSY, NOESY, COZY 및 HSQC를 포함하는 동핵 2D 1H-NMR 분광법으로 분석하였다. N-말단 Gly1 1차 아민을 제외한 모든 잔기에 대한 할당이 이루어졌다. 연구된 모든 분자에서, Pro4는 Asp5 Hα에서 Pro6 Hδ까지 관찰된 강한 NOE에 의해 트랜스 형태로 확인되었다. Hα 2차 변위 분석을 사용하여 2차 구조 요소들의 변화를 평가했다. 일반적으로, 2차 Hα 변위는 RgIA-5533, 5524 및 5617이 모두 구형 형태를 유지하였음을 확인했다. Asp5-Pro6-Arg7 및 Arg/Cit9-Tyr/iTyr10-Gln/Arg11 세그먼트를 포함하는 잔기에서 미묘한 변화가 관찰되었다. RHa 2차 화학적 변위로부터, gIA 및 RgIA4가 결합된 천연 다이설파이드와 비교하여, 효능있는 유사체 RgIA-5533, RgIA-5524, 또는 비활성 RgIA-5617 간에 명백한 차이는 관찰되지 않았다. 도 12A에서 보는 바와 같이, 주로, 말단 가요성으로 인해 개별 펩타이드의 C-말단에 약간의 편차가 존재하였다.
이러한 유사체들의 3차원 NMR 분석 구조는 CYANA 3.0을 사용하여 계산되었으며, g11-NOESY 및 NOESY(200ms) 스펙트럼으로부터 원자 거리 및 이면각 제한이 생성되었다.
Figure pct00014
, ψ 및 χ1을 포함한 백본 이면각 제한은 Hα, Cα, Cβ 및 아마이드 수소(HN) 화학적 변위를 기반으로 TALOS 프로그램에 의해 예측되었다. 20개의 가장 낮은 에너지 상태 앙상블을 낮은 RMSD에서 얻었다. 이전에 보고된 RgIA(NMR 분석 구조 PDB 2JUQ 및 공결정 추출물 PDB 6HY7) 및 RgIA4의 구조와 종합하여, “가장 평균에 가까운” 에너지 상태를 선택하여 각 펩타이드를 도 12B, 12C, 12D, 12E, 12F, 및 12G에서 보는 바와 같이 PyMOL 프로그램으로 측정한 시스테인 쌍들의 평균 Cα 거리와 함께 표시하였다. 모든 메틸렌 티오아세탈 변형 펩타이드는 RgIA 및 RgIA4와 매우 유사한 구형 형태를 유지했다. RgIA-5617과 효능있는 유사체(RgIA4, RgIA-5533 및 5524) 간의 가장 중요한 차이점은 시스테인 쌍들의 Cα 거리였다. RgIA-5617에서 두 시스테인 쌍들의 Cα 거리는 다른 활성 분자들(평균 5.4-6.1Å)과 비교하여 명백하게 단축된다(예: 시스테인 루프 I 및 루프 II에서 각각 평균 4.8 및 4.7Å). 유사체 RgIA-5617 및 RgIA-5618의 효능 손실에 대한 한 가지 가능성 있는 이유는 루프 I 다이설파이드[CysI-CysIII]에 CH2기를 삽입하면 상기 이면체 및 비틀림 각도 변화를 수용할 수 있도록 이러한 루프 I 변형 유사체들에서 형태 “수축”이 강제되고, 이는 결합 친화도를 감소시키기 때문이라는 것이다. 또한 RgIA 유사체의 루프 I 다이설파이드가 α9(+) 표면의 C-루프 다이설파이드와 직접 접촉하여 수용체를 향한 적층 상호 작용을 제공할 수 있다는 것이 MD 자극에 의해 제안되었다. 따라서, 이 루프에서 메틸렌 티오아세탈 대체는 이 결합 부위를 방해함으로써 효능 손실을 유발할 수 있으며, 이는 비록 미미한 2차 구조 교란이라 하더라도 또 다른 원인 요인이 될 수 있다.
실시예 2-F: 시험관내 안정성 분석
방법 :
안정성 분석. 테스트 펩타이드를 스톡 용액을 위해 1.0 mg/mL의 농도로 PBS 7.4에 용해시키고 인간 혈청(AB형, Sigma-Aldrich) 또는 환원된 글루타티온(10 당량)을 함유하는 PBS 7.4로 최종 0.1 mg/mL의 농도의 테스트 펩타이드로 추가 희석시켰다. 그런 다음 희석된 용액을 37 oC에서 배양하고 혼합물의 일부를 RP-HPLC 분석을 위해 예정된 시점에서 채취했다. 동일 부피의 ACN을 첨가하여 변성시켜 혈청 단백질을 제거하고 얼음 위에서 10분 동안 냉각시킨 후 13,000g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 수집하고 RP-HPLC로 분석하였다. 각 시점에서의 안정성은 RP-HPLC에서 처리된 펩타이드 피크들(220nm)의 면적으로서 0시간에서 처리된 펩타이드들의 면적 백분율로 계산했다. 각 실험은 삼중으로 수행되었다. 데이터는 스튜던트 t(비대응) 검정으로 분석되었다. 각 시점에서 유의한 차이에 대한 P 값은 **P < 0.01, *** P < 0.001이었다.
결과 및 결론:
일반적으로, 다이설파이드-폴딩된 펩타이드 및 단백질은 프로테아제에 대한 안정성을 상대적으로 향상시키는 단단한 구조를 갖는다. 그러나 인간 혈청의 유리 환원 티올은 스크램블링에 의해 시스테인이 풍부한 펩타이드의 다이설파이드 연결성을 방해하여 효소 분해 및 효능 손실을 초래할 수 있다. 메틸렌 티오아세탈이 RgIA4의 대사 안정성에 미치는 영향을 확인하기 위해 RgIA-5544 및 RgIA-5533의 시험관내 인간 혈청 안정성 분석을 수행했다. 펩타이드(90% 인간 혈청 AB형 중 0.1 mg/mL)를 37 oC에서 24시간 동안 인간 혈청에서 지속적으로 인큐베이션하고 남은 펩타이드의 양을 배양 후 0, 1, 2, 4, 8 및 24시간 시점에서 RP-HPLC로 결정했다. 도 13A에서 보는 바와 같이, RgIA4는 이성질체 RgIA4[1,4]에 빠르게 스크램블되어, 구형 RgIA4의 25% 미만이 남았으며, 이는 우리의 이전 관찰결과과 일치한다. RgIA-5533은 RgIA4보다 훨씬 더 안정적이었는데, 24시간 인큐베이션 후에도 펩타이드의 70% 이상이 손상되지 않았다. RgIA-5524는 RgIA-5533과 비교하여 약간 덜 안정적이었는데, 이는 아마도 도 13B에서 보는 바와 같이, 트립신에 의해 절단될 수 있는 아르기닌이 풍부한 서열이 더 많기 때문일 것이다. 또한, 완전한 다이설파이드 스크램블링 억제는 메틸렌 티오아세탈이 도입되었을 때 달성되었다. 우리는 또한 생리적 pH에서 환원된 글루타티온(GSH)의 존재하에서 RgIA4에 대한 RgIA-5524의 안정성을 평가했다. 인간 혈청 분해 결과와 유사하게, RgIA-5524에서의 단일 메틸렌 티오아세탈 대체는 도 13C에서 보는 바와 같이, 다이설파이드 스크램블링을 많이 억제할 수 있었다. 전반적으로 RgIA-5524는 유의하게 향상된 안정성을 보여, 추가 개발을 위한 더 매력적이고 유망한 후보가 되게 하였다.
실시예 2-G: 재료 및 방법
화학물질 . 모든 화학 물질은 구매하여 추가 정제 없이 바로 사용했다. Fmoc 보호된 아미노산 및 시약들은 Chemimpex, Thermal Fischer 및 Sigma Aldrich에서 구입했다. 난모세포. 2-전극 전압 클램프 실험에 사용된 아프리카 발톱 개구리 난모세포는 Xenopus One에서 구입했다. 마우스. 생체 내 분석에 사용된 CBA/CaJ 근친교계 마우스(2-3주, 수컷)는 Jackson Laboratory에서 구입했다.
본 기술에 대해 제시된 순서도는 특정 실행 순서를 암시할 수 있지만 실행 순서는 설명된 것과 다를 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 블록들의 순서는 표시된 순서와 비교하여 재배열될 수 있다. 또한, 연속적으로 도시된 2개 이상의 블록은 병렬로 또는 부분적으로 병렬화되어 실행될 수 있다. 일부 구성에서는 순서도에 도시된 하나 이상의 블록들이 생략되거나 건너뛰어 질 수 있다. 향상된 유틸리티, 회계, 성능, 측정, 문제 해결을 위해 또는 유사한 이유로 임의의 수의 카운터, 상태 변수, 경고 세마포어 또는 메시지가 논리 흐름에 추가될 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐 “한 예”라는 지칭은 해당 예과 관련하여 기재된 특정한 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 최소한 하나의 실시형태에 포함됨을 의미한다. 그러므로, 본원 전반에 걸쳐 여러 부분에서 “한 예에서”라는 어구의 사용은 반드시 모두 동일한 실시형태를 언급하는 것은 아니다.
도면에 예시된 예들을 참조하였으며, 이를 설명하기 위해 본원에서 특정 언어를 사용하였다. 그럼에도 불구하고 본 기술의 범위를 제한하려는 의도는 없다는 것이 이해될 것이다. 본원에 예시된 특징들의 변경 및 추가 변형 그리고 본원에 예시된 실시예들의 추가 응용들은 본 발며의 상세한 설명의 범위에 속하는 것으로 고려되어야 한다.
또한, 설명된 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 예에서 임의의 적절한 방식으로 결합될 수 있다. 앞선 설명에서, 설명된 기술의 실시예에 대한 철저한 이해를 제공하기 위해 다양한 구성의 예와 같은 많은 구체적인 세부 사항들이 제공되었다. 그러나 하나 이상의 특정 세부 사항 없이 또는 다른 방법, 구성 요소, 장치 등을 사용하여 기술을 실행할 수 있음을 이해하여야 한다. 다른 경우에, 잘 알려진 구조나 작동은 기술의 모호한 양상을 피하기 위해 자세히 표시되거나 설명되지 않는다.
본 발명은 구조적 특징 및/또는 작동에 대한 구체적인 언어들로 설명되었지만 첨부된 청구범위에서 정의된 발명이 반드시 위에서 설명한 구체적인 특징 및 작동에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 오히려, 전술한 구체적인 특징 및 작동들은 청구범위를 구현하는 예시적인 형태로서 개시된다. 상기 설명된 기술의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 수많은 변형 및 대안적인 배열들이 고안될 수 있다.
전술한 상세한 설명은 특정한 예시적인 실시형태들을 참조하여 본 발명을 설명한다. 그러나 첨부된 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형 및 변경이 가능함을 이해할 것이다. 상세한 설명 및 첨부된 도면은 제한적이 아닌, 단지 예시적인 것으로 간주되어야 하며, 이러한 모든 변형 또는 변경이 있는 경우 본원에 설명되고 제시된 본 발명의 범위에 속하는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> University of Utah Research Foundation <120> CONFORMATIONALLY-CONSTRAINED Alpha-RGIA ANALOGUES <130> 00846-U6996.PCT <150> 63/034,395 <151> 2020-06-03 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Gly Cys Cys Ser Asp Pro Arg Cys Arg Tyr Arg Cys Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Citrulline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> 3-Iodo-tyrosine <400> 2 Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> Any Amino acid other than Cysteine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Any Amino acid other than Cysteine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(12) <223> Any Amino acid other than Cysteine <220> <221> MISC_FEATURE <222> 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Claims (85)

  1. 다음을 포함하는 α-RgIA4 펩타이드 유사체로서:
    α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 결합하도록 구성된 인식 핑거 영역; 그리고
    시스테인 간 황 링키지를 보호하는 측쇄 결합 구성,
    여기서 유사체는 α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 2.5% 이상인 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 결합 친화도를 가지는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  2. 보호된 시스테인 간 황 링키지에 의해 유지되는 구조를 갖는 α-RgIA4 펩타이드 유사체로서, 상기 구조는 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대하여 α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 2.5% 이상인 결합 친화도를 제공하는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 결합 친화도는:
    α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 5% 이상, 또는
    α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 7.5% 이상, 또는
    α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 15% 이상, 또는
    α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 25% 이상, 또는
    α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 40% 이상, 또는
    α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 50% 이상, 또는
    α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 80% 이상, 또는
    α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도와 실질적으로 동일하거나, 또는
    α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도보다 큰, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보호된 시스테인간 황 링키지는 α-RgIA4 펩타이드의 효능에 비해 효능의 증가를 제공하는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유사체는 다음과 같은 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값을 제공하는, α-RgIA4 펩타이드 유사체:
    α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값과 실질적으로 동일하거나, 또는
    α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 2.0배 이하이거나, 또는
    α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 3.0배 이하이거나, 또는
    α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 5.0배 이하이거나, 또는
    α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 15.0배 이하이거나, 또는
    α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 25.0배 이하임.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보호된 시스테인간 황 링키지는 α-RgIA4 펩타이드 또는 보호된 시스테인 간 황 링키지가 없는 α-RgIA4 펩타이드 유사체와 비교하여 다이설파이드 가교 스크램블링, 다이설파이드 가교 분해 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 감소시키는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  7. 제1항에 있어서, 측쇄 결합 구성은 메틸렌 티오아세탈, 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화된 N-말단 아미노산 측쇄, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  8. 제7항에 있어서, 측쇄 결합 구성은 CII와 CIV 사이에 시스테인간 결합을 포함하는 메틸렌 티오아세탈인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  9. 제7항에 있어서, 측쇄 결합 구성은 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화된 N-말단 아미노산 측쇄인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  10. 제9항에 있어서, N-말단 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택되는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  11. 제9항에 있어서, C-말단 아미노산은 리신 및 L-2,3-다이아미노프로피온산으로 이루어진 군으로부터 선택되는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  12. 제9항에 있어서, N-말단 아미노산은 글루탐산이고 C-말단 아미노산은 리신인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보호된 시스테인간 황 링키지는 인간 혈청에서의 α-RgIA4 펩타이드 유사체에 대하여 인간 혈청에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성보다 더 큰 안정성을 제공하고, 여기서 인간 혈청에서의 안정성은 0.1 mg/mL의 α-RgIA4 펩타이드 유사체 또는 α-RgIA4 펩타이드를 90% AB형 인간 혈청에서 인큐베이션하고 37 oC에서 1, 2, 4, 8, 24, 48 또는 72시간 중 적어도 하나 동안 인큐베이션한 후 남은 양으로 측정되는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  14. 제13항에 있어서, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 인간 혈청에서의 안정성은 인간 혈청에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성보다 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 1000% 중 적어도 하나 이상 더 큰, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보호된 시스테인간 황 링키지는 환원된 글루타티온에서의 α-RgIA4 펩타이드 유사체에 대하여 환원된 글루타티온에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성보다 더 큰 안정성을 제공하고, 여기서 환원된 글루타티온에서의 안정성은 0.1 mg/mL의 α-RgIA4 펩타이드 유사체 또는 α-RgIA4 펩타이드를 pH 7.4의 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 환원된 글루타티온 10당량에서 인큐베이션하고 37 oC에서 1, 2, 4, 8, 24, 48 또는 72시간 중 적어도 하나 동안 인큐베이션한 후 남은 양으로 측정되는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  16. 제15항에 있어서, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 환원된 글루타티온에서의 안정성은 환원된 글루타티온에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성보다 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 1000% 중 적어도 하나 이상 더 큰, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보호된 시스테인간 황 링키지는 α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 선택성과 실질적으로 동일한 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 선택성을 제공하는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보호된 시스테인간 황 링키지는 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대해 다른 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 하위형의 선택성과 비교하여 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 또는 200배 중 적어도 하나 이상 더 선택적인 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 선택성을 제공하는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  19. 제18항에 있어서, 상이한 nAChR 하위형은 α1β1de, α2β2, α2β4, α3β2, α3β4, α4β2, α4β4, α6/α3β2β3 및 α6/α3β4로 이루어진 군으로부터 선택되는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보호된 시스테인간 황 링키지는 α-RgIA4 펩타이드의 안전성 프로파일과 실질적으로 동일하거나 더 큰 안전성 프로파일을 제공하고, 여기서 안전성 프로파일은 다음 중 하나 이상에 의해 측정되는, α-RgIA4 펩타이드 유사체:
    100 μM의 농도로 존재하는 유사체는 자동화된 전 세포 패치-클램프 분석에서 측정시 인간 ether-a-go-go-관련 유전자(hERG) K+ 채널의 25% 미만을 억제하거나,
    100 μM의 농도로 존재하는 유사체는 모노아민 옥시다제(MAO) 분석으로 측정시 약 20% 미만의 억제 활성을 갖거나, 또는
    10 μM의 농도로 존재하는 유사체는 CYP 분석으로 측정시 20% 미만의 억제 활성을 가짐.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서, 보호된 시스테인간 링키지는 CI 및 CIII, CII 및 CIV 사이의 시스테인간 링키지 또는 이들의 조합 중 하나 이상인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  22. 제2항에 있어서, 상기 구조는 구형인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  23. 다음을 포함하는 α-RgIA4 펩타이드 유사체로서:
    D P R을 포함하는 인식 핑거 영역(recognition finger region); 및
    CI, CII, CIII, 및 CIV를 포함하는 시스틴 잔기, 여기서:
    CI 및 CIII은 제1 시스테인 간 황 링키지에 의해 연결되며, 그리고
    CII 및 CIV는 제2 시스테인 간 황 링키지에 의해 연결되고; 그리고
    여기서 적어도 제2 시스테인간 황 링키지는 측쇄 결합 구성에 의해 보호되는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  24. 제23항에 있어서,
    제2 시스테인 간 황 링키지는 메틸렌 티오아세탈을 포함하거나,
    N-말단 아미노산 측쇄는 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화되거나, 또는
    이들의 조합인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  25. 제23항에 있어서, 제2 시스테인간 황 링키지는 메틸렌 티오아세탈을 포함하는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  26. 제25항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5 C Xaa6(서열번호 13)을 포함하고, 여기서 Xaa1-6은 C 이외의 임의의 아미노산인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  27. 제26항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5 C Xaa6(서열번호 14)을 포함하고, 여기서:
    Xaa1은 C 이외의 단백질 생성(proteinogenic) 또는 비단백질(non-proteinogenic) 생성 아미노산이며,
    Xaa2는 C 이외의 단백질 생성 또는 비단백질 생성 아미노산이며,
    Xaa3은 (Cit) 또는 임의의 단백질 생성 또는 비단백질 생성 양성 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고,
    Xaa4는 단백질 생성 또는 비단백질 생성 방향족 아미노산이며,
    Xaa5는 단백질 생성 또는 비단백질 생성 양성 아미노산이고, 그리고
    Xaa6은 단백질 생성 또는 비단백질 생성 방향족 아미노산인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  28. 제25항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5 C Xaa6 Xaa7(서열번호 20)을 포함하고, 여기서 Xaa1-7은 C 이외의 임의의 아미노산인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  29. 제28항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5 C Xaa6 Xaa7(서열번호 21)을 포함하고, 여기서:
    Xaa1은 C 이외의 단백질 생성 또는 비단백질 생성 아미노산이며,
    Xaa2는 C 이외의 단백질 생성 또는 비단백질 생성 아미노산이며,
    Xaa3은 (Cit) 또는 임의의 단백질 생성 또는 비단백질 생성 양성 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고,
    Xaa4는 단백질 생성 또는 비단백질 생성 방향족 아미노산이며,
    Xaa5는 단백질 생성 또는 비단백질 생성 양성 아미노산이고,
    Xaa6은 단백질 생성 또는 비단백질 생성 방향족 아미노산이고, 그리고
    Xaa7은 C 이외의 단백질 생성 또는 비단백질 생성 아미노산인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  30. 제26항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6 (서열번호 15)을 포함하고, 여기서 Xaa1은 G이고, Xaa2는 T이고, Xaa5는 Q이고, Xaa3, 4, 또는 6은 C 이외의 아미노산인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  31. 제26항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6 (서열번호 16)을 포함하고, 여기서:
    Xaa3은 (Cit) 및 R로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고,
    Xaa4는 (iY) 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고,
    Xaa6은 (bhY), Y 및 bA로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  32. 제26항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C (Cit) (iY) Q C Y (서열번호 18)을 포함하고, 여기서:
    Xaa3은 (Cit)이고,
    Xaa4는 (iY)이고, 그리고
    Xaa6은 Y인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  33. 제28항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6 Xaa7 (서열번호 22)을 포함하고, 여기서 Xaa1은 G이고, Xaa2는 T이고, Xaa5는 Q이고, Xaa3, 4, 6, 또는 7은 C 이외의 아미노산인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  34. 제28항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6 Xaa7 (서열번호 23)을 포함하고, 여기서:
    Xaa3은 (Cit) 및 R로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고,
    Xaa4는 (iY) 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고,
    Xaa6은 (bhY), Y 및 bA로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고, 그리고
    Xaa7은 R인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  35. 제28항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C R (iY) Q C (bhY) R (서열번호 24)을 포함하고, 여기서:
    Xaa3은 R이고,
    Xaa4는 (iY)이고, 그리고
    Xaa6은 (bhY)인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  36. 제28항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C R (iY) Q C (bA) R (서열번호 25)을 포함하고, 여기서:
    Xaa3은 R이고,
    Xaa4는 (iY)이고, 그리고
    Xaa6은 (bA)인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  37. 제23항에 있어서, 락탐 가교에 의해 C-말단 아미노산 측쇄에 고리화된 N-말단 아미노산 측쇄를 추가로 포함하는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  38. 제37항에 있어서, N-말단 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산으로 이루어진 군으로부터 선택되는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  39. 제37항에 있어서, C-말단 아미노산은 리신 및 L-2,3-다이아미노프로피온산으로 이루어진 군으로부터 선택되는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  40. 제37항에 있어서, N-말단 아미노산은 글루탐산이고 C-말단 아미노산은 리신인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  41. 제37항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 Xaa8 Xaa9 C C Xaa10 D P R C Xaa11 Xaa12 Xaa13 C Xaa14 Xaa15(서열번호 3)를 포함하고, 여기서 Xaa8-15는 C 이외의 아미노산인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  42. 제41항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 Xaa8 Xaa9 C C Xaa10 D P R C Xaa11 Xaa12 Xaa13 C Xaa14 Xaa15(서열번호 4)를 포함하고, 여기서:
    Xaa8은 E 및 D로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고,
    Xaa15는 K와 (Dap)으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고, 그리고
    Xaa9-14는 C 이외의 아미노산인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  43. 제41항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 Xaa8 Xaa9 C C T D P R C Xaa11 Xaa12 Q C Y Xaa15(서열번호 5)를 포함하고, 여기서:
    Xaa8은 E 및 D로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고,
    Xaa10은 T이고,
    Xaa13은 Q이고,
    Xaa14는 Y이고,
    Xaa15는 K와 (Dap)으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고, 그리고
    Xaa9, 11 또는 12는 C 이외의 아미노산인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  44. 제41항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 Xaa8 Xaa9 C C T D P R C Xaa11 Xaa12 Q C Y Xaa15(서열번호 6)를 포함하고, 여기서:
    Xaa8은 E 및 D로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고,
    Xaa9는 G 또는 (bA)이고,
    Xaa11은 R 또는 (Cit)이고,
    Xaa12는 Y 또는 (iY)이고, 그리고
    Xaa15는 K와 (Dap)으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  45. 제41항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 E G C C T D P R C (Cit) Y Q C Y K (서열번호 9)를 포함하고, 여기서:
    Xaa8은 E이고,
    Xaa9는 G이고,
    Xaa11은 (Cit)이고,
    Xaa12는 Y이고, 그리고
    Xaa15는 K인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  46. 제41항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 E (bA) C C T D P R C (Cit) Y Q C Y K (서열번호 10)를 포함하고, 여기서:
    Xaa8은 E이고,
    Xaa9는 (bA)이고,
    Xaa11은 (Cit)이고,
    Xaa12는 Y이고, 그리고
    Xaa15는 K인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  47. 제41항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 G C C T D P R C (Cit) (iY) Q C Y K (서열번호 11)을 포함하고, 여기서:
    Xaa8은 E이고,
    Xaa9는 G이고,
    Xaa11은 (Cit)이고,
    Xaa12는 (iY)이고, 그리고
    Xaa15는 K인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  48. 제41항에 있어서, 유사체는 아미노산 서열 E G C C T D P R C R (iY) Q C Y K (서열번호 12)를 포함하고, 여기서:
    Xaa8은 E이고,
    Xaa9는 G이고,
    Xaa11은 R이고,
    Xaa12는 (iY)이고, 그리고
    Xaa15는 K인, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  49. 다음을 포함하는 조성물:
    제1항, 제2항 또는 제23항 중 어느 한 항에 기재된 유사체의 치료적 유효량과 약학적으로 허용되는 담체의 조합물.
  50. 제49항에 있어서, 국소, 경피, 정맥내 또는 피하 투여에 적합한, 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 추가 활성제를 추가로 포함하는, 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 추가 활성제는 항염증제, 마취제, 이차 진통제 펩타이드, 비펩타이드 진통제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원인, 조성물.
  53. 제49항에 있어서, 추가 활성제는 약 0.0001중량% 내지 약 10중량%의 농도로 존재하는, 조성물.
  54. 제49항에 있어서, 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 겔, 하이드로겔, 열-반응성 겔, 크림, 연고, 페이스트, 접착제, 액체 저장소, 패치 또는 이들의 조합 중 하나로 제형화되는, 조성물.
  55. 제50항에 있어서, 피하 주사에 적합한, 조성물.
  56. 제55항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체는 물, 장성제, 완충제, 방부제 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는, 조성물.
  57. α-RgIA4 유사체에서 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 대한 α-RgIA4 효능을 유지하는 방법으로서, 다음을 포함하는 방법:
    상기 유사체의 인식 핑거 영역을 α-RgIA4 구성으로 유지시키는 측쇄 결합 구성에 의해 시스테인간 황 링키지를 보호하는 것.
  58. 제57항에 있어서, 유사체는 다음과 같은 친화도로 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체에 결합하는, 방법:
    α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 5% 이상, 또는
    α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 7.5% 이상, 또는
    α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 15% 이상, 또는
    α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 25% 이상, 또는
    α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 40% 이상, 또는
    α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 50% 이상, 또는
    α-RgIA4 펩타이드 결합 친화도의 80% 이상, 또는
    α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도와 실질적으로 동일, 또는
    α-RgIA4 펩타이드의 결합 친화도보다 큼.
  59. 제57항에 있어서, 유사체는 다음과 같은 IC50 값으로 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체를 억제하는, 방법:
    α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값과 실질적으로 동일하거나, 또는
    α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 2.0배 이하이거나, 또는
    α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 3.0배 이하이거나, 또는
    α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 5.0배 이하이거나, 또는
    α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 15.0배 이하이거나, 또는
    α-RgIA4 펩타이드의 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 IC50 값의 25.0배 이하임.
  60. 제57항에 있어서, 시스테인간 황 링키지를 보호하는 것은 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR)에 대해 다른 nAChR 하위형의 선택성과 비교하여 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 또는 200배 중 적어도 하나 이상 더 선택적인 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 선택성을 제공하는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  61. 제57항에 있어서, 시스테인간 황 링키지를 보호하는 것은 인간 혈청에서의 α-RgIA4 펩타이드의 안정성보다 10%, 20%, 40%, 60%, 80%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 1000% 중 적어도 하나 이상 더 큰, α-RgIA4 펩타이드 유사체의 인간 혈청에서의 안정성을 제공하는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  62. 제57항에 있어서, 시스테인간 링키지를 보호하는 것은 CI 및 CIII, CII 및 CIV 사이의 시스테인간 링키지 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 보호하는 것을 포함하는, α-RgIA4 펩타이드 유사체.
  63. 제62항에 있어서, 시스테인간 황 링키지를 보호하는 것은 CII와 CIV 사이에 메틸렌 티오아세탈을 삽입하는 것을 포함하는, 방법.
  64. 제57항에 있어서, 시스테인간 황 링키지를 보호하는 것은 N-말단 아미노산과 C-말단 아미노산 사이에 락탐 가교를 생성하는 것을 포함하는, 방법.
  65. 대상체에서 α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 결합에 반응하는 병태를 치료하는 방법으로서, 다음을 포함하는, 방법:
    제48항에 기재된 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것.
  66. 제65항에 있어서, 병태는 통증인, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 통증은 화학-유도 신경병증(CIPN), 당뇨병성 신경병증, 관절염 신경병증, 골관절염 신경병증 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 신경병성 통증인, 방법.
  68. 제66항에 있어서, 통증은 HIV 통증인, 방법.
  69. 제66항에 있어서, 통증은 나병과 관련된 통증인, 방법.
  70. 제66항에 있어서, 통증은 수술후 통증 또는 외상후 통증 중 하나 이상인, 방법.
  71. 제65항에 있어서, 병태는 척추 다발근병증인, 방법.
  72. 제65항에 있어서, 병태는 대상포진 후 신경통인, 방법.
  73. 제65항에 있어서, 병태는 삼차 신경통인, 방법.
  74. 제65항에 있어서, 병태는 복합 부위 통증 증후군인, 방법.
  75. 제65항에 있어서, 병태는 암인, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 암은 상피암, 폐암, 유방암 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  77. 제65항에 있어서, 병태는 다발성 경화증인, 방법.
  78. 제65항에 있어서, 병태는 염증인, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 염증은 류머티즘과 관련된 면역 세포들, 또는 이들의 조합에 의해 매개되는, 방법.
  80. 제65항에 있어서, 치료는 투여 후 선택된 양의 시간 내에 적어도 10%의 증상 감소를 제공하는, 방법.
  81. 청구항 65에 있어서, 다음을 추가로 포함하는 방법:
    치료적 유효량의 조성물을 대상체에게 1일 1 내지 5회 투여하는 것.
  82. 청구항 65에 있어서, 다음을 추가로 포함하는 방법:
    약 1일 내지 약 3개월의 기간 동안 1일 1회 이상의 투여 요법에 따라 대상체에게 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 것.
  83. 제65항에 있어서, 치료적 유효량의 조성물을 피하 투여 형태, 경피 투여 형태, 국소 투여 형태, 정맥내 투여 형태 또는 이들의 조합으로서 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  84. α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 결합에 반응하는 대상자의 병태 치료에 사용하기 위한, 다음을 포함하는 조성물:
    치료적 유효량의 제49항에 기재된 조성물.
  85. α9α10 니코틴성 아세틸콜린 수용체 결합에 반응하는 대상자의 병태 치료용 약제의 제조에 있어서 다음을 포함하는 조성물의 용도:
    치료적 유효량의 제49항에 기재된 조성물.
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