CN116528884A - 构象受限的α-RGIA类似物 - Google Patents

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Abstract

公开和描述了α‑RgIA4肽类似物、与其组合物及其治疗的方法和用途。例如，α‑RgIA4肽类似物可包含被配置以结合α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的识别指区域，以及保护半胱氨酸间硫键的侧链键合构型。

Description

构象受限的α-RGIA类似物
相关申请
本申请要求2020年6月3日提交的美国临时专利申请序列号63/034,395的权益，其全部内容通过引用并入本文。
政府利益
本发明是在政府支持下，在国防卫生事务部(Defense for Health Affairs)授予号W81XWH-17-1-0413基金(grant)和美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)GM048677、GM136430、GM103801和GM125001基金的资助下进行的。政府对本发明享有某些权利。
技术领域
本公开涉及肽和其类似物以及其治疗用途。因此，本公开一般涉及生物学、细胞生理学、化学、药学、医学和其他健康科学领域。
背景技术
神经性疼痛使人身心俱疲，并且是包括癌症、糖尿病、中风、AIDS和神经损伤在内的多种疾病的非常普遍存在的并发症。阿片样物质已经是治疗此类疼痛的第一道防线。然而，使用基于阿片样物质的药物治疗神经性疼痛具有挑战性，不仅因为严重的副作用，而且还因为长期使用具有很强的耐药性和成瘾倾向。因此，继续寻求用于治疗神经性疼痛的非阿片样物质疗法。
来自芋螺(cone snail)毒液的肽已充当用于各种治疗用途包括靶向疼痛相关受体(包括烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR))的宝贵分子。不幸的是，天然或野生型芋螺肽如α-RgIA)可能具有不利的物理化学特性，这限制了它们的治疗潜力并且需要改变以在哺乳动物中具有治疗效果。此外，将天然肽转化为类似物如α-RgIA4类似物的过程具有许多不确定性，并且此类类似物通常仅实现温和的效力。因此，继续寻找在治疗哺乳动物的各种状况方面具有高效力的来自芋螺毒液的肽类似物。
发明内容
在一个实施方式中，α-RgIA4肽类似物可以包括被配置以结合α9α10烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor)的识别指区域，和保护半胱氨酸间硫键(inter-cysteine sulfur linkage)的侧链键合构型(side chain bondingconfiguration)。该类似物可具有对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的结合亲和力，其为α-RgIA4肽的结合亲和力的至少2.5％。
在另一实施方式中，α-RgIA4肽类似物可具有由受保护的半胱氨酸间硫键维持的结构(例如，球状结构)。球状结构可提供对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的结合亲和力，其为α-RgIA4肽的结合亲和力的至少2.5％。
在又一实施方式中，α-RgIA4肽类似物可包括识别指区域，该识别指区域包含D PR；和包含CI、CII、CIII和CIV的胱氨酸残基。半胱氨酸残基CI和CIII可通过第一半胱氨酸间硫键连接，并且半胱氨酸残基CII和CIV可通过第二半胱氨酸间硫键连接。第二半胱氨酸间硫键可以通过侧链键合构型来保护。
在另一实施方式中，维持α-RgIA4类似物中对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的α-RgIA4效力的方法可以包括用维持处于α-RgIA4构型(例如，球状α-RgIA4构型)的类似物的识别指区域的侧链键合构型来保护半胱氨酸间硫键。
在另一实施方式中，组合物可以包括治疗有效量的类似物与药学上可接受的载体的组合。在另一实施方式中，用于治疗受试者中对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体结合有应答的状况的方法可以包括向受试者施用治疗有效量的组合物。
因此，已经相当广泛地概述了本公开的更重要的特征，以便可以更好地理解下面的详细描述，并且可以更好地理解当前对本领域的贡献。本公开的其他特征将从以下结合附图和权利要求的详细描述中变得更加清楚，或者可以通过公开的实践获知。
附图说明
本公开的特征和优点将从以下结合附图的详细描述中变得明显，附图以实例的方式一起示例本公开的特征。
图1a-A显示A1(活性)和A2(非活性)之间的快速构象平衡，并且图1a-B显示根据实例受限构象不利于从B1(活性)到B2(非活性)的构象变化。
图1b显示根据实例的包括内酰胺桥的活性构象。
图1c显示根据示例的包括亚甲基硫缩醛(methylene thioacetal)的活性构象。
图2显示大环α-RgIA类似物的合成路线。a)Fmoc-SPPS。b)Boc2O、DIEA、DCM。c)正常酪氨酸(PG1＝烯丙基，PG2＝aloc)的方法1：Pd(PPh3)4、DMBA、DCM；3-碘-酪氨酸(PG1＝Dmab，PG2＝ivDde)的方法2：DMF中的5％肼。d)PyBOP、DIEA、HOBt、DMF。e)TFA:H2O:TIPS:EDT＝95:2:2:1(v/v)然后RP-HPLC。f)0.02M Na2HPO4(pH 8.0)，空气。g)根据实例的I2、AcOH、H2O。
图3a显示A)合成的类似物对人α9α10 nAChRs的浓度响应。数据代表单独的卵母细胞(n＝3-6)测量，并且误差条代表SD。B)类似物6防止冷板试验中化疗引起的神经性疼痛。剂量＝80μg/kg(s.c.)。每个实验测定的值表示为平均值±SEM(n＝8-9)。**p<0.01。Sal＝生理盐水；Ox＝奥沙利铂；SD＝根据实例的标准偏差。
图3b显示根据实例，类似物6对人α9α10相对于α7受体的剂量反应曲线。
图3c显示根据实例的α-RgIA4的LC-色谱图和MS-质谱。
图3d显示根据实例的类似物1的LC-色谱图和MS-质谱。
图3e显示根据实例的类似物2的LC-色谱图和MS-质谱。
图3f显示根据实例的类似物3的LC-色谱图和MS-质谱。
图3g显示根据实例的类似物4的LC-色谱图和MS-质谱。
图3h显示根据实例的类似物5的LC-色谱图和MS-质谱。
图3i显示根据实例的类似物6的LC-色谱图和MS-质谱。
图3j显示根据实例的类似物6[1,4]的LC-色谱图和MS-质谱。
图3k显示根据实例的RgIA4[1,4]的LC-色谱图和MS-质谱。
图4a显示α-RgIA4和类似物6在人血清中的稳定性。A)人血清稳定性比较。值是3个独立重复的平均值±SD。B)在37℃(Conc.0.1mg/mL)下，人血清在不同时间点的二硫化物加扰(置乱，scrambling)的代表性RP-HPLC痕迹。根据实例**p<0.01。
图4b显示通过RP-HPLC共注射确定异构体。图b-A显示合成的RgIA4及其[1,4]异构体；图4b-B显示合成的类似物6及其[1,4]异构体；以及图4b-C显示根据实例测试的化合物的序列表示。
图5a显示α-RgIA4、类似物3和6的NMR研究。A)二级Hα化学位移重叠(覆盖，overlay)。0号残基代表Glu，并且14号代表Lys。B)根据示例，B)α-RgIA4(黑色)和3(红色)C)α-RgIA4(黑色)和6(蓝色)的代表性NMR溶液结构的叠加。
图5b至图5d显示α-RgIA4的TOCSY(蓝色)和NOESY(红色)的酰胺区域、HSQC脂肪族区域和芳香族区域的重叠。使用SPARKY进行分配。根据实例(CIR＝瓜氨酸，TIY＝3-碘-酪氨酸)。
图5e至图5g显示类似物3的TOCSY(蓝色)和NOESY(红色)的酰胺区域、HSQC脂族区域和芳族区域的重叠。根据实例(CIR＝瓜氨酸)。
图5h至图5j显示类似物6的TOCSY(蓝色)和NOESY(红色)的酰胺区域、HSQC脂族区域和芳族区域的重叠。根据实例(CIR＝瓜氨酸，TIY＝3-碘-酪氨酸)。
图5k-A显示RgIA4主链叠加，并且图5k-B显示侧链叠加，具有根据实例的构象限制、原子RMSD(2-12)和拉氏图(Ramachandran plot)。
图5l-A显示类似物3的主链叠加；图5k-B显示了具有构象限制的侧链叠加，并且图5k-C显示连接体叠加(绿色)，以及根据实例的原子RMSD(2-12)和拉氏图。
图5m显示类似物6的主链叠加；图5m-B显示具有构象限制的侧链叠加，并且图5m-C显示连接体叠加(绿色)，以及根据实例的原子RMSD(2-12)和拉氏图。
图6a显示使用RossetaDock从类似物6的NMR结构系综(集合，ensemble)到人(A,B)α9(+)/α9(-)和(C,D)α10(+)/α9(-)nAChR界面的同源模型的对接中选择的结合模型。α9-ECD显示为绿色，α10-ECD显示为浅蓝色，并且类似物6显示为橙色。结合残基显示为棒状表示，其中氧、氮和硫原子分别显示为红色、蓝色和黄色。虚线表示类似物6和受体之间形成的氢键。hα9-ECD结构是从RgIA结合X射线晶体结构(PDB 6HY7)生成的，以及hα10-ECD是根据实例从先前报告的基于相同结构的同源模型生成的。
图6b显示根据实例的对接聚类文件。
图6c显示根据实例的对接聚类文件。
图7a显示(A)α-Ctx RgIA、ImI、Vc1.1、PeIA、MII和PnIA的氨基酸序列比对。二硫化物连接是CysI-CysIII(环I)和CysII-CysIV(环II)。#＝C-末端酰胺；^＝C-末端羧酸。(B)与α9nAChR亚基晶体结构(PDB 6HY7)结合的RgIA的结合表面。结合残基(Ser4、Asp5、Arg7和Arg9)以黑色字体标记，并且显示为棒状表示，其中氧、氮和硫原子分别以红色、蓝色和黄色表示。(C)天然二硫化物和开发的二硫化物模拟物的化学结构。Pen＝L-青霉胺。(D)本研究中亚甲基硫缩醛RgIA类似物的化学合成。所有线性肽均通过Fmoc-SPPS在自动合成仪上合成。完全折叠的肽是经由两步操作程序获得的。反应条件根据实例a)TCEP.HCl、K2CO3、H2O；然后Et3N、CH2I2、THF。b)I2、AcOH、H2O。
图7b显示RgIA-5524折叠的RP-HPLC分析；图7b-A显示线性肽向部分折叠和完全折叠类似物的转化；图7b-B显示根据实例的相应肽的HPLC迹线。
图7c显示根据实例的RgIA-5617的LC-色谱图和MS-质谱。
图7d显示根据实例的RgIA-5533的LC-色谱图和MS-质谱。
图7e显示根据实例的RgIA-5618的LC-色谱图和MS-质谱。
图7f显示根据实例的RgIA-5524的LC-色谱图和MS-质谱。
图7g显示根据实例的RgIA-5573的LC-色谱图和MS-质谱。
图8a显示(A)合成的亚甲基硫缩醛RgIA类似物的氨基酸序列和对hα9α10 nAChRs上的效力。a所有天然二硫化物或亚甲基硫缩醛以CysI-CysIII、CysII-CysIV构型连接。亚甲基硫缩醛替代物以粗体颜色标记，其中环I为红色和环II为绿色。^代表C-末端羧酸；Cit＝L-瓜氨酸；iY＝L-3-碘-酪氨酸；bA＝β-丙氨酸；bhY＝L-β-高酪氨酸。b从浓度-反应曲线计算。括号中的数字是95％置信区间。(B)通过合成肽阻断对非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞中表达的人类nAChR电流的ACh诱发电流而抑制人类α9α10 nAChR的浓度响应分析。(C)通过RgIA-5524和RgIA-5533阻断对非洲爪蟾卵母细胞中表达的人类nAChR电流的ACh诱发电流而抑制nAChR亚型的IC50。(D)通过RgIA-5524和RgIA-5533对hα9α10与hα7 nAChR的抑制作用的浓度响应分析。数据点代表根据实例的来自3-4次独立实验的平均值±SEM。
图8b显示(100nM肽)对非洲爪蟾卵母细胞中表达的人nAChR亚型电流的ACh诱发电流的阻断作用，其中数据点代表根据实例的来自3-4次独立实验的平均值±SEM。
图9显示了RgIA-5524在慢性化疗引起的神经性疼痛中的体内疼痛缓解(pain-relieving)作用。RgIA-5524减轻由奥沙利铂重复给药引起的疼痛。在三周的时间内，每周5天每天一次给小鼠注射化学治疗剂奥沙利铂(3.5mg/kg，i.p.)。在注射奥沙利铂的日子里，小鼠还接受生理盐水或RgIA-5524(40μg/kg)。每周一次，在最后一次注射RgIA-5524后24小时，如实验部分中所述的使用冷板评估小鼠的冷痛觉超敏(cold allodynia)。痛觉超敏在第21天达到统计学显著性，并且被RgIA-5524有效逆转。通过单向方差分析(ANOVA)进行数据的统计评估，然后进行Dunnett的多重比较检验。数据表示为平均值±SEM n＝每组8只小鼠。xxxP<0.001表示Ox/Sal vs Sal/Sal处理小鼠的显著性差异；***P<0.001表示Ox/Sal vsOx/RgIA-5524处理小鼠的显著性差异。按照实例，Ox，奥沙利铂；盐，0.9％生理盐水；s，秒数。
图10显示α9 nAChR亚基用于RgIA-5524的镇痛作用。(A,B)第1天，单剂量奥沙利铂5mg/kg i.p.与RgIA5524(40ug/kg，s.c.)或0.9％生理盐水一起施用。在第5天评估小鼠的冷痛觉超敏。RgIA-5524在(A)野生型小鼠中阻止了痛觉超敏的发展，但在(B)α9-亚基缺失小鼠(n＝12只小鼠/组)中没有阻止。(C,D)第1天，给小鼠施用更高剂量的奥沙利铂(10mg/kg i.p.)和RgIA-5524(40ug/kg s.c.)或生理盐水。第1天在(C)野生型小鼠中施用单剂量RgIA-5524可阻止奥沙利铂诱导的冷痛觉超敏，但在(D)α9-亚基缺失小鼠(n＝8只小鼠/组)中没有阻止。数据的统计评估通过单向方差分析(ANOVA)进行，然后进行Dunnett的多重比较检验。所有结果均表示为平均值±SEM*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001用于与Sal/Sal处理小鼠的显著差异。0P<0.05、00P<0.01和000P<0.001用于与Ox/Sal处理小鼠的显著差异。根据实例，Ox，奥沙利铂；盐，0.9％生理盐水；s，秒数，α9-/-，α9敲除小鼠。
图11a显示(A)RgIA-5524在10μM时对其他疼痛相关离子通道和受体的结合活性。a每个实验都用重复孔进行。结合计算为对每个靶标特异的放射性标记配体的结合的抑制％，并且酶抑制作用计算为对照酶活性的抑制％。当筛选测定表明≥50％抑制时，进行二次浓度响应分析。b烟碱神经元型。c马钱子碱(士的宁，strychnine)敏感。d马钱子碱不敏感；AR，腺苷受体；AT，血管紧张素；BK2，缓激肽受体；CB，大麻素受体；CCK，胆囊收缩素受体；CRF，促肾上腺皮质激素释放因子；D、多巴胺；ET，内皮素受体；GABA，γ-氨基丁酸；GAL，甘丙肽受体；mGluR，代谢型谷氨酸受体；GlyR，甘氨酸受体(马钱子碱敏感)；H，组胺受体；CysLT，半胱氨酰白三烯；M，毒蕈碱型乙酰胆碱受体；NK，神经激肽受体；DOP，δ-阿片样物质受体；KOP，κ-阿片样物质受体；MOP，μ-阿片样物质受体；NOP，痛敏素/孤啡肽FQ受体；GR，糖皮质激素受体；ER，雌激素受体；AR，雄激素受体；PAFR，血小板活化因子受体；TRH1，促甲状腺激素释放激素；VPAC，血管活性肠肽受体；V，血管加压素(vasopressin)受体；LTCC，L型Ca2+通道；NTCC，N型Ca2+通道；BZD，苯并二氮PCP，苯环利定。(B)RgIA-5524对GABAB受体和hERG K+通道的功能活性。e针对IC50和EC50研究用重复孔进行了两个单独的实验。细胞激动剂和拮抗剂效应分别计算为对照反应的百分比(％)和对已知参考激动剂或拮抗剂的抑制％；f在100μM的RgIA-5524下测量。(C)RgIA-5524的酶和摄取测定。g每个实验均使用重复孔进行。拮抗作用计算为对测量组分的抑制％。TXA2合成酶，血栓素A2合成酶；组成型NOS，组成型NO合酶；MAO，单胺氧化酶。RgIA-5524对GABAB受体的(D)激动剂和(E)拮抗剂作用的浓度响应分析。(F)通过尾电流抑制测量的RgIA-5524对hERG K+通道的浓度响应分析。(G)在100nM和10μM下RgIA-5524对CYP酶同工型的抑制。对每个浓度进行重复实验，并且根据实例将数据表示为平均值±SEM。
图11b至图11d显示RgIA-5533的TOCSY(蓝色)和NOESY(红色)的酰胺区域、HSQC脂肪族区域和芳香族区域的重叠。使用SPARKY进行分配(assignments)。根据实例(SCS＝L-S-亚甲基-Cys、CIR＝瓜氨酸、TIY＝3-碘-酪氨酸)。
图11e至图11g显示RgIA-5617的TOCSY(蓝色)和NOESY(红色)的酰胺区域、HSQC脂肪族区域和芳香族区域的重叠。使用SPARKY进行分配。根据实例(SCS＝L-S-亚甲基-Cys、CIR＝瓜氨酸、TIY＝3-碘-酪氨酸)。
图11h至11j显示RgIA-5524的TOCSY(蓝色)和NOESY(红色)的酰胺区域、HSQC脂肪族区域和芳香族区域的重叠。根据实例(SCS＝L-S-亚甲基-Cys、CIR＝瓜氨酸、TIY＝3-碘-酪氨酸、BHY＝L-β-高酪氨酸)。
图11k显示RgIA-5533的A)主链叠加和B)侧链叠加，具有根据实例的构象限制、原子RMSD(2-12)和拉氏图。
图11l显示RgIA-5617的A)主链叠加和B)侧链叠加，具有根据实例的构象限制、原子RMSD(2-12)和拉氏图。
图11m显示RgIA-5524的A)主链叠加和B)侧链叠加、具有根据实例的构象限制、原子RMSD(2-12)和拉氏图。
图12显示(A)RgIA(黑色)、RgIA4(灰色)、RgIA-5617(粉色)、RgIA-5533(绿色)和RgIA-5524(蓝色)的二次化学位移的叠加。x轴显示突变体的肽序列，在基于其相应的标准化学位移计算的残基4、9、10、13和14处具有取代残基。两个分子内桥中Cα之间的代表性NMR结构和距离测量值(B)RgIA结合到hα9 nAChR亚基晶体结构(PDB 6HY7)；(C)RgIA(PDB2JUQ)；(D)RgIA4；(E)RgIA-5533；(F)RgIA-5617和(G)RgIA-5524的代表性NMR溶液结构。结构显示为棒状表示，其中原子氧、氮、硫和碘分别以红色、蓝色、黄色和紫色着色。根据实例，Cα距离由PyMOL程序测量。
图13显示RgIA-5524与RgIA4相比表现出极大增强的稳定性。(A)在37℃下的90％人血清中进行肽温育后的特定时间点，通过HPLC迹线标记，观察到完全的二硫化物加扰阻止。左图中的前峰是加扰异构体RgIA4[1,4]。(B)人血清中的RgIA-5524和RgIA-5533vs.RgIA4的稳定性测定。将肽在37℃下90％人血清AB型(0.1mg/mL)中温育。(C)RgIA-5524vs.RgIA4的还原稳定性测定。在还原的GSH(10当量)存在下，将肽样品以0.1mg/mL溶解在pH7.4PBS中，并且在37℃下温育。通过学生t(非配对)检验进行数据的统计评估。根据实例，所有结果均表示为平均值±SD(n＝3)，**P<0.01，***P<0.001。
现在将参考所示例的示例性实施方式，并且在本文将使用特定的语言来描述相同的内容。尽管如此，应当理解，并不因此意在限制本公开的范围。
具体实施方式
虽然足够详细地描述了这些示例性实施方式以使本领域技术人员能够实践本公开，但是应该理解可以实现其他实施方式并且可以在不脱离本公开的精神和范围的情况下对本公开进行各种改变。因此，以下对本公开的实施方式的更详细的描述并非意在限制本公开的范围，如所要求的，而是仅出于说明的目的而不是限制描述本公开的特征和特性，以阐明本公开的最佳操作模式，并且足以使本领域技术人员能够实践本公开。因此，本公开的范围仅由所附权利要求限定。
定义
在描述和要求保护本公开时，将使用以下术语。
单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“肽”包括提及这样的结构中的一种或多种并且提及“类似物”是指这样的类似物中的一种或多种。
如本文所用，术语“基本上”是指动作、特性、性质、状态、结构、项目或结果的完整或接近完整的范围或程度。例如，“基本上”封入(enclosed)的对象将意味着该对象被完全封入或几乎完全封入。在某些情况下，与绝对完整性的确切允许偏差程度可能取决于具体情况。然而，一般来说，接近完成将具有与获得绝对和完全完成相同的总体结果。“基本上”的使用同样适用于当在否定含义中使用时，是指完全或几乎完全没有动作、特性、性质、状态、结构、项目或结果。例如，“基本上不含”颗粒的组合物要么完全不含颗粒，要么几乎完全不含颗粒，以至于效果是就跟完全没有粒子一样。换句话说，“基本上不含”成分或元素的组合物可能实际上仍含有此类物质，只要没有其可测量的效果。
如本文所用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。除非另有说明，根据特定数字或数值范围使用术语“约”也应理解为给没有术语“约”的此类数字术语或范围提供支持。例如，为了方便和简洁起见，“约50埃至约80埃”的数值范围也应被理解为给“50埃至80埃”的范围提供支持。此外，应当理解，在该书面描述中，即使在使用术语“约”时，也提供对实际数值的支持。例如，“约”30的表述应被解释为不仅给略高于和略低于30的值提供支持，而且还给支持30的实际数值提供支持。本领域技术人员可以容易地确定特定变量的灵活性程度。然而，除非另有说明，否则术语“约”通常表示弹性小于2％，并且最常见的是小于1％，并且在某些情况下小于0.01％。
如本文所用，术语“治疗(treat,treatment,treating)”等是指对无症状或有症状的受试者施用治疗剂或治疗作用。换句话说，“治疗(treat,treatment,treating)”可以指减少或消除状况(即，表现出的症状)的行为，或者它可以指预防性治疗(即，对未表现出症状的受试者施用，以预防它们的发生)。这种预防性治疗也可称为状况的预防、预防作用、预防措施等。
如本文所用，术语“治疗剂”、“活性剂”等可以互换使用并且指当以适当或有效量施用于受试者时，可以对受试者具有有益或积极作用的药剂。一方面，治疗剂或活性剂可以是α-RgIA4肽类似物。术语“其他活性剂”、“补充活性剂”、“辅助(第二，secondary)活性剂”等可以互换使用并且指除α-RgIA4肽类似物之外的化合物、分子或材料。
如本文所用，术语“制剂”和“组合物”可互换使用并且指两种或更多种化合物、元素或分子的混合物。在一些方面，术语“制剂”和“组合物”可用于指一种或多种活性剂与载体或其他赋形剂的混合物。此外，术语“剂型”可以包括以用于向受试者施用的形式(例如特定形式、形状、运载体等)提供的一种或多种制剂(一种或多种)或组合物(一种或多种)。例如，“口服剂型”可以适合于施用于受试者的口腔。“局部剂型”可适合通过摩擦等方式施用于受试者的皮肤。
如本文所用，“治疗部位(situs)”是指期望治疗的受试者上或受试者内的位置。例如，当治疗疼痛时，治疗部位可以是疼痛区域。此外，如本文所用，“施加部位”是指施用治疗的受试者上或内的位置。进一步，输液剂型的施加部位可以是输液设备进入受试者循环系统的区域。此外，局部剂量制剂的施用部位可以是局部剂量制剂所施加的皮肤或粘膜区域。在一些实施方式中，施加部位可与治疗部位基本上相同(例如，将组合物或制剂直接施用至治疗部位)。在其他实施方式中，施加部位可以不同于(例如，远离)治疗部位。在这种情况下，即使施用可能远离治疗部位，组合物或制剂仍然在治疗部位发挥治疗作用。
如本文所用，“局部组合物”或“局部施用”等是指适合直接施用至皮肤或粘膜表面并且从中释放有效量的药物的组合物。在一些实施方式中，局部组合物可提供局部或局域化的治疗效果(例如在施加部位处或接近施加部位)。例如，当局部组合物施加于伤口、损伤、烧伤、口腔溃疡等(例如治疗部位)时，可能主要在施加部位处或其周围发挥治疗作用，但基本上不超过它。在其他实施方式中，局部组合物可以提供区域效果。例如，施用于身体区域如手指、手臂、脚踝、关节等上的皮肤表面的局部组合物可以在该区域内发挥治疗效果，但基本上不会超出该区域。例如，施用到脚踝区域的局部组合物可以通过例如减轻水肿、关节炎症、疼痛等在脚踝内和脚踝周围具有治疗效果。在其他实施方式中，局部组合物可提供全身效果。在一些方面，局部组合物可以通过药物或活性剂本身到达治疗部位的作用机制提供治疗效果。在其他方面，局部组合物可以通过中间作用机制如生化级联事件，如最终在治疗部位发挥期望的治疗作用的酶级联或其他信号传导(例如细胞信号传导或细胞间/细胞内信号传导)事件提供治疗效果。在一些实例中，这样的中间机制可以允许远离施加部位的治疗部位的治疗。在另外的其他实例中，当远侧治疗部位的治疗发生时，活性剂可以从施加部位穿过皮肤和其他组织行进至治疗部位并且发挥直接作用。
如本文所用，“经皮”是指当施用至皮肤表面时，通过未破损的皮肤表面施用治疗剂的途径。当经皮施用时，药物或活性剂从施加部位迁移到治疗部位并且发挥治疗作用。经皮组合物和剂型可以包括有助于将组合物保持在皮肤表面上的结构和/或装置，如背衬膜、粘合剂、储器等。此外，经皮组合物可以包括有助于或以其他方式促进活性剂从施加部位移动到治疗部位(例如，通过皮肤并且进入受试者的循环系统)的试剂，如渗透剂或渗透增强剂。在一些实施方式中，此类渗透或渗透增强剂也可与局部制剂一起使用。
术语“皮肤”或“皮肤表面”不仅包括受试者的包含一层或多层表皮层的外层皮肤，还包括粘膜表面，如呼吸道粘膜(包括鼻和肺的)、口腔粘膜(口腔和颊)、阴道和直肠腔。因此，术语“经皮”也可以涵盖“经粘膜”。
如本文所用，将第一治疗剂与第二治疗剂“共同施用”可包括在合适的时间窗内伴随施用。在一个实例中，合适的时间窗可以小于以下中的一项或多项：1小时、45分钟、30分钟、15分钟、5分钟、2分钟、1分钟或其组合。伴随施用可以来自相同的组合物或来自不同的组合物。
如本文所用，“受试者”是指可受益于本文公开的方法或装置的哺乳动物。受试者的实例包括人类，也可能包括其他动物，如马、猪、牛、狗、猫、兔子和水生哺乳动物。在一个具体方面，受试者是人。
如本文所用，“施用方案”或“方案”例如“初始施用方案”或“起始剂量”或“维持施用方案”是指如何、何时、多少和持续多长时间可以将本公开的组合物的剂量施用于受试者。例如，受试者的初始或起始剂量方案可以提供约15mcg/1mL至约1500mcg/1mL的总日剂量，分两次剂量施用，与进餐一起间隔至少12小时(例如，一次与早餐和一次与晚餐)，每天重复，持续30天。
如本文所用，“日剂量”是指在24小时的时间段内施用给受试者的活性剂(例如，α-RgIA4肽类似物)的量。施用日剂量可以在24小时期间两次或更多次施用。在一个实施方式中，日剂量提供在24小时期间的两次施用。考虑到这一点，“初始剂量”或“初始日剂量”是指在初始方案或施用方案期间施用的剂量。
如本文所用，药物的“有效量”或“治疗有效量”是指无毒但足够量的药物，以在治疗已知该药物有效的状况时实现治疗效果。据了解，各种生物学因素可能影响物质执行其预期任务的能力。因此，“有效量”或“治疗有效量”在某些情况下可能取决于此类生物学因素。进一步，虽然治疗效果的实现可由医生或其他合格的医疗人员使用本领域已知的评估来测量，但认识到个体差异和对治疗的反应可能使治疗效果的实现成为某种主观决定。有效量的确定完全在制药科学和医学领域的普通技术范围内。参见，例如，Meiner andTonascia,“Clinical Trials:Design,Conduct,and Analysis,”Monographs in Epidemiology and Biostatistics,Vol.8(1986)，通过引用并入本文。
如本文所用，“急性”状况是指可迅速发展并且具有需要紧急或半紧急护理的明显症状的状况。相比之下，“慢性”状况是指通常发展较慢并且随着时间缓慢消失或以其他方式进展的状况。急性状况的一些实例可包括但不限于哮喘发作、支气管炎、心脏病发作、肺炎等。慢性状况的一些实例可包括但不限于关节炎、糖尿病、高血压、高胆固醇等。
如本文所用，“选择性”是指在组(例如，一组细胞)内或组(例如，一组非活细胞和一组活细胞)间修饰提供差异的作用。例如，作用可以是受体结合，并且所述组可以是第一受体和第二受体。例如，与第二受体相比第一受体的“选择性受体结合”可以在选择性比率上提供第一受体和第二受体之间的差异。在一个实例中，选择性比率不同于1:1的比率。在一个实例中，选择性比率可以是大于以下中的至少一个的比率：1:1、2:1、3:1:4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、100:1等，以及其组合。
如本文所用，“D-取代的类似物”包括本文公开的具有一个或多个被D-氨基酸取代的L-氨基酸的RgIA和RgIA4类似物。D-氨基酸可以是与在类似物序列中发现的相同的氨基酸类型或可以是不同的氨基酸。因此，D-类似物也是变体。
如本文所用，“变体”包括本文公开的RgIA类似物，其中一个或多个氨基酸已被非氨基酸组分取代，或其中氨基酸已缀合至官能团或官能团已以其他方式与氨基酸结合。修饰的氨基酸可以是例如糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸(聚乙二醇(PEG)聚合物的共价和非共价连接或合并)、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、酰化氨基酸、生物素化氨基酸、磷酸化氨基酸、缀合至脂质部分如脂肪酸的氨基酸，或缀合至有机衍生剂的氨基酸。修饰氨基酸的存在可能有利于，例如，(a)增加多肽血清半衰期和/或功能性体内半衰期，(b)降低多肽抗原性，(c)增加多肽储存稳定性，(d)增加肽溶解度，(e)延长循环时间，和/或(f)增加生物利用度，例如增加曲线下面积(AUCsc)。氨基酸(一个或多个)可以被修饰，例如，在重组生产期间共翻译或翻译后修饰(例如，在哺乳动物细胞中表达期间在N-X-S/T基序上的N-连接糖基化)或通过合成方式修饰。修饰的氨基酸可以在序列内或在序列的末端。变体可以包括如本文其他地方所述的衍生物。
如本文所用，“I-3-Y”是3-碘-酪氨酸，“3-R-酪氨酸”和“R-3-Y”是选自3-氯-酪氨酸、3-氟-酪氨酸、3-碘-酪氨酸和酪氨酸的肽残基。
如本文所用，“Cit”是瓜氨酸。
如本文所用，“iY”是L-3-碘-酪氨酸。
如本文所用，“Dap”是L-2,3-二氨基丙酸。
如本文所用，“bA”和“bA”是β-丙氨酸。
如本文所用，“bhY”是β-高酪氨酸。
如本文所用，“Xaa”是任何氨基酸。此外，如本书面说明中所用，Xaa为任何氨基酸提供表达支持。例如，Xaa为任何氨基酸或其衍生物提供表达支持。例如，Xaa为以下提供支持：丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酸(Gly或E)、谷氨酰胺(Gln或Q)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Tyr或W)、酪氨酸(Tyr或Y)、缬氨酸(Val或V)、硒代半胱氨酸(Sec或U)、吡咯赖氨酸(Pyl或O)等，或其组合。
如本文所用，本文公开的“RgIA类似物的变体”或“RgIA-4类似物的变体”包括与本文公开的RgIA肽或本文公开的RgIA-4肽相比，具有一个或多个氨基酸添加、缺失或取代的肽。
本文公开的实施方式包括本文描述的RgIA类似物以及本文描述的RgIA类似物的变体、D-取代的类似物、修饰和衍生物。在一些实施方式中，变体、D-取代的类似物、修饰和衍生物具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个序列添加、缺失、取代、置换、缀合、结合或排列(组合，permutations)。本文公开的每个类似物肽还可以包括在任何位置(包括本文公开的类似物肽序列的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)的添加、缺失、取代、置换、缀合、结合或排列。
在一些实施方式中，Xaa位置可以包括在类似物肽的任何位置中，其中Xaa表示添加、缺失、取代、置换、缀合、结合或排列。在特定实施方式中，每个类似物肽在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15中的一个或多个处具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个Xaa位置。
类似物可以具有不止一种变化(添加、缺失、取代、置换、缀合、结合或排列)并且有资格作为变体、D-取代的类似物、修饰和/或衍生物中的一种或多种。也就是说，包括类似物、变体、D-取代的类似物、修饰和/或衍生物的一个类别并不排他性地包括在其他类别中并且所有这些在本文中统称为“类似物肽”。
氨基酸取代可以是保守或非保守取代。本文公开的RgIA类似物的变体可包括具有一个或多个保守氨基酸取代的变体。如本文所用，“保守取代”涉及在以下保守取代组中的一个中发现的取代：第1组：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)；第2组：天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)；第3组：天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)；第4组：精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、组氨酸(His或H)；第5组：异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、缬氨酸(Val或V)；和第6组：苯丙氨酸(Phe或F)、酪氨酸(Tyr或Y)、色氨酸(Trp或W)。
此外，可以按相似的功能、化学结构或组成(例如，酸性、碱性、脂肪族、芳香族、含硫)将氨基酸分组为保守取代组。例如，为了取代的目的，脂肪族基团可包括Gly、Ala、Val、Leu和Ile。含有认为是彼此保守取代的氨基酸的其他组包括：含硫：Met和Cys；酸性：Asp、Glu、Asn和Gln；小的脂肪族、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；极性、带负电荷的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；极性、带正电荷的残基：His、Arg和Lys；大的脂肪族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和大的芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。其他信息参见Creighton(1984)Proteins,W.H.Freeman and Company。
如本文所用，“阳性(正的，positive)氨基酸”包括蛋白原性(proteinogenic)阳性氨基酸His、Arg和Lys以及非蛋白原性阳性氨基酸。
如本文所用，“芳香族氨基酸”包括蛋白原性芳香族氨基酸Phe、Tyr和Trp以及非蛋白质芳香族氨基酸。
本文公开或提及的RgIA类似物或RgIA-4类似物的变体还包括与本文公开或提及的肽序列具有至少70％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％的序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性的序列。更具体地，本文公开的RgIA类似物或RgIA-4类似物的变体包括以下肽，其：与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有70％序列同一性；与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有80％的序列同一性；与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有81％序列同一性；与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有82％序列同一性；与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有83％序列同一性；与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有84％序列同一性；与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有85％序列同一性；与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有86％序列同一性；与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有87％序列同一性；与SEQID NO:1-13中的任何一个共有88％序列同一性；与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有89％序列同一性；与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有90％序列同一性；与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有91％序列同一性；与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有92％序列同一性；与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有93％序列同一性；与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有94％序列同一性；与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有95％序列同一性；与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有96％序列同一性；与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有97％序列同一性；与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有98％序列同一性；或与SEQ ID NO:1-13中的任何一个共有99％序列同一性。
合成镇痛肽的C-末端可以是羧酸或酰胺基。本公开还涉及通过(i)在C-末端添加如酪氨酸、3-碘-酪氨酸、荧光标签、脂质、碳水化合物或β-高氨基酸、D/L-磺基-γ-AA肽、L-γ-AA肽，和/或(ii)在N-末端添加，如酪氨酸、3-碘-酪氨酸、焦谷氨酸、荧光标签、脂质、碳水化合物或β-高氨基酸，而进一步修饰的RgIA类似物。
如本文所用，术语“基因”是指编码肽的核酸序列。该定义包括各种序列多态性、突变和/或序列变体，其中此类改变不影响编码肽的功能。术语“基因”不仅可以包括编码序列，还可以包括调节区，如启动子、增强子和终止区。“基因”进一步可以包括所有内含子和从mRNA转录物剪接的其他DNA序列，以及由可选剪接位点产生的变体。核酸序列编码肽可以是指导肽表达的DNA或RNA。这些核酸序列可以是转录成RNA的DNA链序列或翻译成蛋白质的RNA序列。核酸序列包括全长核酸序列以及源自全长蛋白质的非全长序列。序列还可以包括天然序列的简并密码子或可以被引入以在特定细胞类型中提供密码子偏好的序列。编码本文公开的肽的基因序列可在公开可用的数据库和出版物中获得。
如本文所用，特定氨基酸的叙述还包括对特定氨基酸及其任何类似物、变体、D-取代的类似物、修饰和/或衍生物的支持。在一个实例中，酪氨酸的叙述还明确包括支持3-氯-酪氨酸、3-氟-酪氨酸、3-碘-酪氨酸、酪氨酸、邻-酪氨酸、3-硝基-酪氨酸、3-氨基-酪氨酸、O-甲基酪氨酸、2,6-二甲基酪氨酸、β-高酪氨酸、Boc-Tyr(3,5-I2)-OSu、[CpRu(Fmoc-酪氨酸)]CF3CO2、O-(2-硝基苄基)-L-酪氨酸盐酸盐、3-硝基-L-酪氨酸乙酯盐酸盐、N-(2,2,2-三氟甲基)-L-酪氨酸乙酯、DL-o-酪氨酸等，或其组合。在一个实例中，半胱氨酸的叙述还明确包括对半胱氨酸、L-半胱氨酸一水合物、L-半胱氨酸亚磺酸一水合物、硒代-L-胱氨酸等或其组合的支持。在一个实例中，赖氨酸的叙述还明确包括对Fmoc-Lys(Me,Boc)-OH、Fmoc-Lys(Me)3-OH氯化物、Fmoc-L-Lys(Nvoc)-OH、Fmoc-Lys(棕榈酰基)-OH、Fmoc-L-光-赖氨酸、DL-5-羟赖氨酸盐酸盐、H-L-光-赖氨酸盐酸盐等，或其组合的支持。
在本公开中，“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(containg)”和“具有(having)”等可具有美国专利法中赋予它们的含义，并且可表示“包括(“includes”，“including”)等，并且是通常被解释为开放式条款。术语“由……组成(“consisting of”或“consists of”)是封闭式术语，并且仅包括与此类术语一起具体列出的组分、结构、步骤等，以及符合美国专利法的内容。“基本上由……组成(“consisting essentially of”或“consists essentially of”)”具有美国专利法通常赋予它们的含义。特别是，此类术语通常是封闭式术语，但允许包含不实质性影响与此相关使用的项目(一个或多个)的基本和新颖特征或功能的附加项目、材料、组分、步骤或元素。例如，即使没有在遵循此类术语的项目列表中明确列举，如果出现“基本上由……组成”语言的情况下，则允许存在于组合物中但不影响组合物性质或特征的微量元素。当在书面描述中使用如“包含”或“包括”的开放式术语时，应理解，如明确说明地，也应直接支持“基本上由……组成”的语言以及“由……组成”的语言，反之亦然。
说明书和权利要求中的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等(如果有的话)用于区分相似的元素，而并不一定用于描述特定的顺序或时间顺序。应当理解，如此使用的任何术语在适当的情况下是可互换的，使得本文描述的实施方式例如能够按不同于本文示例或以其他方式描述的顺序操作。类似地，如果本文将方法描述为包括一系列步骤，则本文所呈现的这些步骤的顺序不一定是可以执行这些步骤的唯一顺序，并且可能省略所述步骤中的某些和/或本文未描述的某些其他步骤可能被添加到方法中。
如本文所用，比较术语如“增加的”、“减少的”、“更好的”、“更差的”、“更高的”、“更低的”、“增强的”、“改善的”、“最大化的”、“最小化的”等是指装置、组分、组合物、生物反应、生物状态或活性的特性，与周围或邻近区域中，处于相似位置的，在单个装置或组合物中或在多个可比较的装置或组合物中，在一个组或类别中，在多个组或类别中的其他装置、组分、组合物、生物反应、生物状态或活性，或与原始(例如未处理的)或基线状态相比，或已知技术状态有可测量的不同。例如，与其他α-RgIA4类似物相比，在减少神经性疼痛方面具有“改善“特性的α-RgIA4类似物将在稳定性、结合功效、效力或其他性能相关特性的至少一个方面呈现出改善。
如本文所用，为了方便，可以在通用列表中呈现多个项目、结构元素、组成元素和/或材料。但是，这些列表应被解释为好像列表中的每个成员都被单独标识为单独且唯一的成员。因此，在没有相反指示的情况下，不应仅根据它们在共同组中的介绍将此类列表中的任何单个成员解释为事实上(de facto)等同于同一列表中的任何其他成员。
如本文所用，术语“至少一个”意在与“一个或多个”同义。例如，“A、B和C中的至少一个”明确包括仅A、仅B、仅C或各自的组合。
浓度、量、水平和其他数值数据可以在本文中以范围格式表达或呈现。应当理解，使用这样的范围格式仅仅是为了方便和简洁，因此应该被灵活地解释为不仅包括明确列举为范围限制的数值，而且还包括涵盖在该范围内的所有单独的数值或子范围或十进制单位，如同每个数值和子范围都被明确列举。作为示例，“约1至约5”的数值范围应被解释为不仅包括明确列举的约1至约5的值，而且还包括指定范围内的单个值和子范围。因此，包括在这个数值范围内的是单独的值如2、3和4，以及子范围如1-3、2-4和3-5等，以及单个1、2、3、4和5。这一相同的原则适用于仅列举一个数值作为最小值或最大值的范围。此外，无论范围的宽度或所描述的特征如何，这种解释都应该适用。
任何方法或过程权利要求中记载的任何步骤可以任何顺序执行并且不限于权利要求中呈现的顺序。手段加功能或步骤加功能限制将仅在特定权利要求限制中存在以下所有条件时才被采用，限制为：a)明确叙述了“手段”或“步骤”；以及b)明确叙述了相应的功能。因此，支持手段加功能的结构、材料或行为是本文描述中明确叙述的。因此，本发明的范围应仅由所附权利要求及其法律等同物确定，而不是由本文给出的描述和实例确定。
如本文所用，术语“耦接”被定义为以化学、机械、电或非电方式直接或间接连接。本文描述为彼此“相邻”的对象可能彼此物理接触、彼此靠近或彼此处于相同的一般区或区域中，视使用该短语的上下文而定。
本文出现的短语“在一个实施方式中”或“在一个方面中”不一定都指代相同的实施方式或方面。本说明书中对“实例”的提及意味着结合实例描述的特定的特征、结构或特性包括在至少一个实施方式中。因此，在本说明书各处出现的短语“在实例中”不一定都指代相同的实施方式。
实施方式
下面提供公开实施方式的初步概述，以及然后更详细地描述具体实施方式。此初步概述意在帮助读者更快地理解技术概念，但并非意在识别其关键或基本特征，也并非意在限制要求保护的主题的范围。
芋螺毒素(Conotoxins)(CTxs)源自海洋掠食性芋螺的毒液，由于其对与神经性疼痛有关的离子通道的高效力和选择性，因此有望成为非阿片样物质镇痛剂的候选物。ω-芋螺毒素MVIIA，也称齐考诺肽(Ziconotide)，选择性靶向电压门控钙通道亚型(Cav2.2)，于2004年获得美国FDA批准，并且临床用于治疗顽固性慢性疼痛。
烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)分布在周围和中枢神经系统中，是一组跨膜配体门控阳离子通道，介导快速突触传递，并且参与广泛的神经系统障碍，包括神经性疼痛、帕金森病、精神分裂症、酒精和药物成瘾。包括α、β、γ、δ和ε在内的不同nAChR亚基在这些同型或异型五聚体受体中以各种组合结合，导致具有不同药理学和生物物理学功能的各种复杂的nAChR亚型。nAChRs以前曾被用于镇痛药物的发现，尽管进展受到治疗窗口狭窄和不加区分的亚型靶向引起的副作用的阻碍。
最近的研究已经确定α9α10烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)亚型的抑制是用于化疗引起的神经性疼痛的潜在基于非阿片样物质的机制。在α9α10 nAChR拮抗剂中，第二代类似物α-RgIA4，由亲本序列α-RgIA修饰而来，跨越“物种相关亲和力间隙(species-relatedaffinity gap)”，并且对啮齿类动物(IC50 0.9nM)和人类α9α10 nAChR(IC50 1.5nM)均表现出高效力，而不抑制其他亚型和其他疼痛相关受体(例如，选择性>1000倍)。因此，α-RgIA4具有作为非阿片样物质镇痛剂开发的先导化合物的潜力。
然而，与其他富含二硫化物的肽类药物分子一样，α-RgIA4因其低蛋白酶抗性和短的血浆半衰期而是差的候选物。这是由硫醇/二硫化物交换反应诱导的二硫化物加扰引起的，由于活性构象和非活性构象之间热力学稳定性的边际差异，导致构象变化和效力的显著损失，如图1b-A所示。在结构上，CTx依赖于高度保守的半胱氨酸框架来维持刚性结构，这对于受体识别、效力和选择性至关重要。不幸的是，与其他富含二硫化物的肽一样，RgIA4在还原性生理环境中容易受到二硫化物加扰的影响，这可导致三维结构的伴随改变、聚集、疗效下降和免疫原性副作用增加。
二硫化物模拟物试图解决这个问题并且生产生物可利用的化合物以用于进一步的临床开发。然而，二硫化物模拟物可能引起结构扰动并且因此导致效力损失。例如，具有不可还原的二碳(diacarba)桥代替天然二硫化物的α-RgIA类似物不受二硫化物加扰，但与天然肽相比具有显著(即，两个数量级)降低的效力。通过隐藏灵活的末端蛋白酶识别区域，已经尝试将“头对尾”骨架环化作为另一种用于CTx稳定的方法。例如，cRgIA-6与其他主链环化类似物一起已经显示血清稳定性增加；然而，这种增加的稳定性导致人类α9α10 nAChR的效力降低。
如图7a-C所示，在CTxs修饰中已经尝试了包括二碳、饱和二碳、炔烃、硫醚、醚、二硒化物(Sec)和三唑桥置换的策略。然而，由于模拟部分的不相容性、生物活性降低和毒性，此类策略缺乏广泛的适用性。头对尾骨架环化是通过防止降解来增强肽稳定性的另一种策略，但在应用RgIA时，已经导致α9α10nAChR结合亲和力的效力下降。
在一个实施方式中，α-RgIA中引入的内酰胺键可防止活性球状构象的降解并且抑制二硫键加扰。大环肽的NMR结构与α-RgIA4的结构重叠良好，表明环化不扰乱主链和侧链残基的整体构象。最后，分子对接模型可以合理化大环类似物与α9α10烟碱型乙酰胆碱受体之间的选择性结合。体内测试表明，如过程中所讨论的类似物6可以预防化疗引起的神经性疼痛模型中的疼痛。在结构上，引入的内酰胺键可以提供附加的构象约束，以加固(rigidify)生物活性构象，抑制二硫键加扰，并且增加人血清稳定性。因此，这些构象受限的拮抗剂是抗伤害性治疗干预的有前途的候选者。
在另一实施方式中，RgIA类似物可通过二硫化物替代物亚甲基硫缩醛稳定，以作为非阿片样物质镇痛剂靶向人α9α10 nAChR。在RgIA骨架中用亚甲基硫缩醛取代二硫环I[CysI-CysIII]导致显著的效力损失，而桥接环II[CysII-CysIV]与亚甲基硫缩醛可以被容纳并且保留类似物的生物活性。一种分子RgIA-5524对人α9α10 nAChRs表现高度选择性抑制作用，其中IC50为0.9nM。此外，与RgIA4相比，RgIA-5524显示了对人血清中的降解显著增加的抵抗。小鼠体内研究显示，RgIA-5524减轻化疗引起的神经性疼痛。RgIA-5524没有减轻α9敲除小鼠的神经性疼痛，从而证明含有α9的nAChRs用于RgIA-5524的观察到的治疗效果。因此，亚甲基硫缩醛可用作在基于芋螺毒素和其他富含二硫化物的肽药物发现中的二硫化物替代物。
关于α-CTxs的治疗作用机制一直存在争议，其中许多研究断言使用了GABAB受体的刺激，而其他研究表明使用了α9 nAChRs的阻断。本文公开的研究显示，野生型和基因敲除(KO)小鼠不仅证明选择性α9α10 nAChR拮抗剂是镇痛的，而且还表明α9-nAChR亚基的存在用于镇痛活性。
在一个实施方式中，α-RgIA4肽类似物可以包括被配置以结合α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的识别指区域，和保护半胱氨酸间硫键的侧链键合构型。类似物具有的对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的结合亲和力可为α-RgIA4肽的结合亲和力的至少2.5％。
在另一实施方式中，α-RgIA4肽类似物可具有由受保护的半胱氨酸间硫键维持的结构(例如，球状的)。结构(例如，球状的)可以提供对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的结合亲和力，其为α-RgIA4肽的结合亲和力的至少2.5％。
在又一实施方式中，α-RgIA4肽类似物可包括识别指区域，该识别指区域包含D PR；和包含CI、CII、CIII和CIV的胱氨酸残基。半胱氨酸残基CI和CIII可通过第一半胱氨酸间硫键连接，并且半胱氨酸残基CII和CIV可通过第二半胱氨酸间硫键连接。第二半胱氨酸间硫键可以通过侧链键合构型来保护。
在另一实施方式中，维持α-RgIA4类似物中对于α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的α-RgIA4效力的方法可以包括用维持处于α-RgIA4构型(例如，球状α-RgIA4构型)的类似物的识别指区域的侧链键合构型来保护半胱氨酸间硫键。
在另一实施方式中，组合物可以包括治疗有效量的类似物与药学上可接受的载体的组合。在另一实施方式中，用于治疗受试者中对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体结合有应答的状况的方法可以包括向受试者施用治疗有效量的组合物。
α-RgIA4的类似物
侧链环化是可以应用的一种肽稳定方法。例如，可以通过侧链环化在末端插入第三环化桥以加固α-RgIA类似物的活性构象，同时保留结合活性，如图1b-B中所示。具有高效力、受体选择性和增强的血清稳定性的构象受限的α-RgIA类似物可以靶向人α9α10烟碱型乙酰胆碱受体。如本文所公开的，类似物6显示了在α-RgIA中引入的内酰胺键可以防止活性球状构象的降解并且抑制二硫键加扰。
在另一种稳定方法中，通过将最小功能碳单元(CH2)插入二硫化物中，不可还原的亚甲基硫缩醛可以成为有效的二硫化物替代物。用亚甲基硫缩醛代替二硫化物可以稳定RgIA类似物的球状活性构象。在一个实例中，RgIA-5524对人α9α10 nAChRs表现出高效力(例如，IC50＝0.9nM)，其中与其他疼痛相关离子通道和受体相比选择性高。
在一个实施方式中，α-RgIA4肽类似物可以包括被配置以结合α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的识别指区域，和保护半胱氨酸间硫键的侧链键合构型。该类似物可具有对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的结合亲和力，其为α-RgIA4肽的结合亲和力的至少2.5％。在另一实施方式中，α-RgIA4肽类似物可具有由受保护的半胱氨酸间硫键维持的结构(例如，球状的)。该结构(例如，球状的)可提供对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的结合亲和力，其为α-RgIA4肽的结合亲和力的至少2.5％。
识别指区域可以被配置以结合如图6a中建模的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体，和如图7a-B中建模的α9亚基。应保持识别指区域的结构以允许发生结合。维持识别指区域结构的一种方法(以及因此识别指区域的结合亲和力)可以包括保护在α-RgIA4肽类似物中发现的四个半胱氨酸残基之间的半胱氨酸间键，其可以序列顺序CI、CII、CIII和CIV编号。
半胱氨酸间硫键可以包括每个半胱氨酸上的硫之间的直接侧链键(例如，CII上的硫可以连接到CIV上的硫)或每个半胱氨酸上的硫之间的间接键(例如，CII上的硫可以经由中间体(如碳)连接到在CIV上的硫)。
在一个实施方式中，半胱氨酸间硫键可以通过侧链键合构型来保护。一方面，侧链键合构型可包含亚甲基硫缩醛、用内酰胺桥环化至C-末端氨基酸侧链的N-末端氨基酸侧链或其组合中的一种或多种。
当侧链键合构型是亚甲基硫缩醛时，侧链键合构型可包含α-RgIA4肽类似物中CII和CIV之间的半胱氨酸间键。将侧链键合构型(例如，亚甲基硫缩醛)定位在该位置可以将类似物稳定在球状活性构象中，而与α-RgIA4肽相比不降低类似物相对于α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的效力。另一方面，与α-RgIA4肽相比，将侧链键合构型(例如，亚甲基硫缩醛)定位为CI和CIII之间的半胱氨酸间键不提供相对于α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的增强效力。
类似物中许多(例如，类似物1至6)维持了α-RgIA4肽的球状构象。然而，效力较低的RgIA-5617和效力较高的类似物(RgIA4、RgIA-5533和5524)之间的一个区别是半胱氨酸对的Cα距离。与其他活性分子(包括RgIA4、RgIA-5533和RgIA-5524(例如，平均))相比，RgIA-5617中两个半胱氨酸对的Cα距离均缩短(例如，半胱氨酸环I和环II中的平均距离分别为4.8和/>)。在一个实例中，环-I(例如，cysI-cysIII)中的亚甲基硫缩醛替代引起的效力损失可导致结构收缩，其可降低与α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的结合亲和力。在另一实例中，α-CTxs中的环-I二硫化物可以通过直接接触α9(+)表面的C-环二硫化物，为α9α10烟碱型乙酰胆碱受体提供堆积相互作用。因此，通过干扰该结合位点，该环上的亚甲基硫缩醛替代物可导致与更有效力的类似物相比的效力降低。
当侧链键合构型是用内酰胺桥环化到C-末端氨基酸侧链的N-末端氨基酸侧链时，N-末端氨基酸可选自谷氨酸和天冬氨酸并且C-末端氨基酸可选自赖氨酸、高赖氨酸、鸟氨酸、L-2,4-二氨基丁酸和L-2,3-二氨基丙酸。在另一实例中，C-末端氨基酸可以选自赖氨酸和L-2,3-二氨基丙酸。在一个实例中，N-末端氨基酸可为谷氨酸并且C-末端氨基酸可为赖氨酸。
与α-RgIA4肽相比，侧链键合构型可为相应的α-RgIA4类似物提供对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体增强的结合亲和力。例如，类似物可以具有对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的结合亲和力，为α-RgIA4肽对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的结合亲和力的2.5％、5％、7.5％、15％、25％、40％、50％、80％中的至少一个或多个，或基本上等于-RgIA4肽对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的结合亲和力。此外，类似物可具有对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的结合亲和力，其大于α-RgIA4肽对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的结合亲和力。
侧链键合构型不仅可以为α-RgIA4类似物提供对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体增强的结合亲和力，而且还可以提供与α-RgIA4肽的效力相比增加的效力。在一个实例中，类似物可提供α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值，其基本上等于α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值。在另一个实例中，类似物可提供α9α10烟碱乙酰胆碱受体IC50值，其不大于α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的2.0倍(x)、3.0倍、5.0倍、15.0倍、25.0倍中的至少一个或多个。当IC50值较低时，IC50值具有较高的效力，因为较低的值表明较低的浓度可以达到50％的抑制阈值。
一方面，受保护的半胱氨酸间键可以是CII与CIII、CII与CIV之间的半胱氨酸间键(例如侧链键)中的一个或多个，或其组合。与α-RgIA4肽或没有受保护的半胱氨酸间硫键的α-RgIA4肽类似物相比，受保护的半胱氨酸间键(其可通过侧链键合构型保护)可减少二硫键(二硫桥，disulfide bridge)加扰、二硫键降解中的一个或多个，或其组合。当肽中的二硫键降解然后以不同的构型重新形成时，就可发生二硫键加扰。例如，在第一种构型中，α-RgIA4肽类似物可以在CII和CIII之间具有第一二硫键，并且在CII和CIV之间具有第二二硫键。加扰后，CI和CIV之间可以有第一二硫键，并且CII和CIII之间可以有第二二硫键。二硫键加扰可导致肽的结构变化，从而阻碍期望的肽功能(例如，抑制α9α10烟碱型乙酰胆碱受体)。当二硫键降解而不重新形成时，可发生二硫键降解。这种降解也可导致肽的结构变化，其可阻碍期望的肽功能。
侧链键合构型还可以保护半胱氨酸间硫键，以为人血清中的α-RgIA4肽类似物提供稳定性，其大于人血清中的α-RgIA4肽的稳定性。一方面，可以通过在90％人血清AB型中温育0.1mg/mL的α-RgIA4肽类似物或α-RgIA4肽并且在37℃下温育1、2、4、8或24小时中的至少一个后剩余的肽或肽类似物的量，来测量在人血清中的稳定性。
在一些实例中，在人血清中α-RgIA4肽类似物的稳定性可以大于在人血清中α-RgIA4肽的稳定性的10％、20％、40％、60％、80％、100％、200％、300％、400％、500％或1000％中的至少一个或多个。在另一实例中，在人血清中的α-RgIA4肽类似物的稳定性可以比在人血清中的α-RgIA4肽的稳定性高至少50倍。在另一实例中，在人血清中的α-RgIA4肽类似物的稳定性可以比在人血清中的α-RgIA4肽的稳定性高至少10倍。在另一实例中，在人血清中α-RgIA4肽类似物的稳定性可以比在人血清中的α-RgIA4肽的稳定性高至少2倍。
与α-RgIA4肽的稳定性相比，也可以测量在还原型谷胱甘肽(GSH)中的α-RgIA4肽类似物的稳定性。在一个实例中，受保护的半胱氨酸间硫键可为还原型谷胱甘肽中的α-RgIA4肽类似物提供稳定性，其比还原型谷胱甘肽中的α-RgIA4肽的稳定性更高。在一个实例中，可以通过在pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的10当量还原型谷胱甘肽中，温育0.1mg/mL的α-RgIA4肽类似物或α-RgIA4肽并且在37℃下温育1、2、4、8或24小时中的至少一个后剩余的α-RgIA4肽类似物或α-RgIA4肽的量，来测量在还原型谷胱甘肽中的稳定性。
在一些实例中，与在GSH中α-RgIA4肽的稳定性相比，在GSH中α-RgIA4肽类似物的稳定性可以大于10％、20％、40％、60％、80％、100％、200％、300％、400％、500％、1000％中的至少一个或多个。在另一个实例中，在GSH中α-RgIA4肽类似物的稳定性可比在GSH中α-RgIA4肽的稳定性高至少50倍。在另一个实例中，在GSH中α-RgIA4肽类似物的稳定性可比在GSH中α-RgIA4肽的稳定性高至少10倍。
α-RgIA4肽类似物对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的选择性可与α-RgIA4肽对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的选择性相比较。在一个实例中，受保护的半胱氨酸间硫键可提供α9α10烟碱型乙酰胆碱受体选择性，其基本上等于α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体选择性。在另一实例中，受保护的半胱氨酸间硫键可提供α9α10烟碱型乙酰胆碱受体选择性，其与不同的烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)亚型的选择性相比，对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的选择性至少高100倍。不同的nAChR亚型可以选自：α1β1δε、α2β2、α2β4、α3β2、α3β4、α4β2、α4β4、α6/α3β2β3、α6/α3β4等，或其组合。
α-RgIA4肽类似物的安全性(safety profile)也可以具有安全性。一方面，受保护的半胱氨酸间硫键可提供安全性，其基本上等于或大于α-RgIA4肽的安全性。安全性可以通过以下的一项或多项来测量：如自动化全细胞膜片钳测定所测量的，以浓度100μM存在的类似物抑制低于25％的人类ether-a-go-go相关基因(hERG)K+通道；或如通过单胺氧化酶(MAO)测定所测量的，以浓度100μM存在的类似物具有小于约20％的抑制活性；或如在CYP测定中测量的，以浓度10μM存在的类似物具有小于20％的抑制活性。
本文公开的侧链键合构型(例如，包含亚甲基硫缩醛或经由内酰胺桥连接侧链)可以增强α-RgIA4肽类似物的各个方面。例如，当与α-RgIA4肽的血清半衰期相比，α-RgIA4肽类似物的血清半衰期可增强。在另一实例中，当与α-RgIA4肽的循环时间相比，α-RgIA4肽类似物的循环时间可增强。在另一实例中，当与α-RgIA4肽的口服和/或口腔吸收相比，α-RgIA4肽类似物的口服和/或口腔吸收可增强。在另一实例中，当与通过α-RgIA4肽的AUC测量的生物利用度相比，通过α-RgIA4肽类似物的AUC测量的生物利用度可增强。在另一实例中，当与α-RgIA4肽的免疫原性相比，α-RgIA4肽类似物的免疫原性可增强。
在另一实例中，当与α-RgIA4肽的储存稳定性相比，α-RgIA4肽类似物的储存稳定性可增强。在一个实例中，当在环境湿度和温度下储存选定的储存时间时，可以测量储存稳定性。在一些情况下，可以测量大于1天、1周、2周、4周、3个月、6个月、一年中的一个或多个或其组合的储存时间，以比较α-RgIA4肽类似物和α-RgIA4肽之间的稳定性增强。
在又一实施方式中，α-RgIA4肽类似物可包括识别指区域，该识别指区域包含D PR；和包含CI、CII、CIII和CIV的胱氨酸残基。半胱氨酸残基CI和CIII可通过第一半胱氨酸间硫键连接，并且半胱氨酸残基CII和CIV可通过第二半胱氨酸间硫键连接。第二半胱氨酸间硫键可以通过侧链键合构型来保护。一方面，第二半胱氨酸间硫键可包含亚甲基硫缩醛、通过内酰胺桥环化至C-末端氨基酸侧链的N-末端氨基酸侧链，或其组合。
一方面，当第二半胱氨酸间硫键包含亚甲基硫缩醛时，类似物可包含氨基酸序列Xaa1C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5 C Xaa6，其中Xaa1-6是除C之外的任何氨基酸。
在一个实例中，当类似物包含氨基酸序列Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5C Xaa6，则：Xaa1可以是除C以外的任何蛋白源性或非蛋白源性氨基酸；Xaa2可以是除C之外的任何蛋白源性或非蛋白源性氨基酸；Xaa3可以是选自以下的成员：(Cit)或任何蛋白原性或非蛋白原性阳性氨基酸；Xaa4可以是任何蛋白源性或非蛋白源性芳香族氨基酸；Xaa5可以是任何蛋白源性或非蛋白源性阳性氨基酸；并且Xaa6可以是任何蛋白源性或非蛋白源性芳香族氨基酸。
在另一方面，当第二半胱氨酸间硫键包含亚甲基硫缩醛时，类似物可包含氨基酸序列Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5 C Xaa6 Xaa7，其中Xaa1-7是除C之外的任何氨基酸。
在另一实例中，当类似物包含氨基酸序列Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5C Xaa6Xaa7，则：Xaa1可以是除C之外的任何蛋白源性或非蛋白源性氨基酸，Xaa2是除C之外的任何蛋白源性或非蛋白源性氨基酸，Xaa3可以是选自以下的成员：(Cit)或任何蛋白源性或非蛋白源性阳性氨基酸，Xaa4可以是任何蛋白源性或非蛋白源性芳香族氨基酸，Xaa5可以是任何蛋白源性或非蛋白源性阳性氨基酸，Xaa6可以是任何蛋白源性或非蛋白源性芳香族氨基酸，并且Xaa7可以是除C之外的任何蛋白源性或非蛋白源性氨基酸。
在另一方面，当第二半胱氨酸间硫键包含亚甲基硫缩醛，该类似物可以包含氨基酸序列G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6，其中Xaa1是G，Xaa2是T，Xaa5是Q，并且Xaa3、Xaa4或Xaa6是除C之外的任何氨基酸。
在另一方面，当第二半胱氨酸间硫键包含亚甲基硫缩醛，类似物可包含氨基酸序列G CC T D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6，其中：Xaa3是选自(Cit)和R的成员，Xaa4是选自(iY)和Y的成员，并且Xaa6是选自(bhY)、Y和bA的成员。
在另一方面，当第二半胱氨酸间硫键包含亚甲基硫缩醛时，类似物可包含氨基酸序列G C C T D P R C(Cit)(iY)Q C Y(SEQ ID NO:10)，其中：Xaa3是(Cit)，Xaa4是(iY)，和Xaa6是Y。
在另一方面，当第二半胱氨酸间硫键包含亚甲基硫缩醛时，类似物可包含氨基酸序列G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6 Xaa7，其中Xaa1是G，Xaa2是T，Xaa5是Q，并且Xaa3、Xaa4、Xaa6或Xaa7是除C之外的任何氨基酸。
在另一方面，当第二半胱氨酸间硫键包含亚甲基硫缩醛时，类似物可包含氨基酸序列G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6 Xaa7，其中：Xaa3是选自(Cit)和R的成员，Xaa4是选自(iY)和Y的成员，Xaa6是选自(bhY)、Y和bA的成员，并且Xaa7是R。
在另一方面，当第二半胱氨酸间硫键包含亚甲基硫缩醛时，类似物可包含氨基酸序列G C C T D P R C R(iY)Q C(bhY)R(SEQ ID NO:12)，其中：Xaa3是R，Xaa4是(iY)，并且Xaa6是(bhY)。
在另一方面，当第二半胱氨酸间硫键包含亚甲基硫缩醛时，类似物可包含氨基酸序列G C C T D P R C R(iY)Q C(bA)R(SEQ ID NO:13)，其中：Xaa3是R，Xaa4是(iY)，并且Xaa6是(bA)。
在另一方面，N-末端氨基酸侧链可以通过内酰胺桥环化至C-末端氨基酸侧链。当N-末端氨基酸侧链可以通过内酰胺桥环化到C-末端氨基酸侧链时，N-末端氨基酸可以选自谷氨酸和天冬氨酸。在另一方面，C-末端氨基酸可以选自赖氨酸和L-2,3-二氨基丙酸。在另一实例中，C-末端氨基酸可选自赖氨酸、高赖氨酸、鸟氨酸、L-2,4-二氨基丁酸和L-2,3-二氨基丙酸。在另一方面，N-末端氨基酸可以是谷氨酸，并且C端氨基酸是赖氨酸。
在另一方面，当N-末端氨基酸侧链通过内酰胺桥环化至C-末端氨基酸侧链时，类似物可包含氨基酸序列Xaa8 Xaa9 C C Xaa10 D P R C Xaa11 Xaa12 Xaa13 C Xaa14 Xaa15，其中Xaa8-15是除C之外的任何氨基酸。
在另一方面，当N-末端氨基酸侧链通过内酰胺桥环化至C-末端氨基酸侧链时，类似物可包含氨基酸序列Xaa8 Xaa9 C C Xaa10 D P R C Xaa11 Xaa12 Xaa13 C Xaa14 Xaa15，其中：Xaa8是选自E和D的成员，Xaa15是选自K和(Dap)的成员，并且Xaa9-14是除C之外的任何氨基酸。
在另一方面，当N-末端氨基酸侧链通过内酰胺桥环化至C-末端氨基酸侧链时，类似物可包含氨基酸序列Xaa8 Xaa9 C C T D P R C Xaa11 Xaa12 Q C Y Xaa15，其中：Xaa8是选自E和D的成员，Xaa10是T，Xaa13是Q，Xaa14是Y，Xaa15是选自K和(Dap)的成员，并且Xaa9、Xaa11或Xaa12是除C之外的任何氨基酸。
在另一方面，当N-末端氨基酸侧链通过内酰胺桥环化至C-末端氨基酸侧链时，类似物可包含氨基酸序列Xaa8 Xaa9 C C T D P R C Xaa11 Xaa12 Q C Y Xaa15，其中：Xaa8是选自E和D的成员，Xaa9是G或(bA)，Xaa11是R或(Cit)，Xaa12是Y或(iY)，并且Xaa15是选自K和(Dap)的成员。
在另一方面，当N-末端氨基酸侧链通过内酰胺桥环化到C-末端氨基酸侧链时，类似物可以包含氨基酸序列E G C C T D P R C(Cit)Y Q C Y K(SEQ ID NO:5)，其中：Xaa8是E，Xaa9是G，Xaa11是(Cit)，Xaa12是Y，并且Xaa15是K。
在另一方面，当N-末端氨基酸侧链通过内酰胺桥环化到C-末端氨基酸侧链时，类似物可包含氨基酸序列E(bA)C C T D P R C(Cit)Y Q C Y K(SEQ ID NO:6)，其中：Xaa8是E，Xaa9是(bA)，Xaa11是(Cit)，Xaa12是Y，并且Xaa15是K。
在另一方面，当N-末端氨基酸侧链通过内酰胺桥环化到C-末端氨基酸侧链时，类似物可以包含氨基酸序列E G C C T D P R C(Cit)(iY)Q C Y K(SEQ ID NO:7)，其中：Xaa8是E，Xaa9是G，Xaa11是(Cit)，Xaa12是(iY)，并且Xaa15是K。
在另一方面，当N端氨基酸侧链通过内酰胺桥环化至C-末端氨基酸侧链，类似物可包含氨基酸序列E G C C T D P R C R(iY)Q C Y K(SEQ ID NO:8)，其中：Xaa8是E，Xaa9是G，Xaa11是R，Xaa12是(iY)，并Xaa15是K。
在另一实施方式中，维持α-RgIA4类似物中α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的α-RgIA4效力的方法可以包括用侧链键合构型保护半胱氨酸间硫键，该侧链键合构型维持α-RgIA4构型中类似物的识别指区域(例如，球状α-RgIA4构型)。
在一方面，类似物可以结合α9α10烟碱型乙酰胆碱受体，其亲和力为：α-RgIA4肽的结合亲和力的2.5％、5％、7.5％、15％、25％、40％、50％、80％中的至少一个或多个，或基本上等于α-RgIA4肽的结合亲和力，或大于α-RgIA4肽的结合亲和力。
在另一方面，类似物可以抑制α9α10烟碱型乙酰胆碱受体，其中IC50值是：基本上等于α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值，或不大于α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的2.0倍、3.0倍、5.0倍、15.0倍、25.0倍中的至少一个或多个。
在另一方面，保护半胱氨酸间硫键可以提供α9α10烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)选择性，其与不同nAChR亚型的选择性相比，对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的选择性高2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、150倍或200倍中的至少一个或多个。在另一方面，保护半胱氨酸间硫键可以提供α-RgIA4肽类似物在人血清中的稳定性，其比α-RgIA4肽在人血清中的稳定性高至少100倍。
在另一方面，保护半胱氨酸间键可以包括保护CII和CIII、CII和CIV之间的半胱氨酸间键中的一个或多个，或其组合。在一个实例中，保护半胱氨酸间硫键可以包括在CII和CIV之间插入亚甲基硫缩醛。在另一个实例中，保护半胱氨酸间硫键可包括在N-末端氨基酸和C-末端氨基酸之间产生内酰胺桥。
制备α-RgIA4类似物的方法
在一个实施方式中，可以如图2所示制备活性的环状α-RgIA4类似物。新引入的内酰胺桥可以在树脂上合成，然后是双操作液相氧化过程，其中可以应用区域选择性二硫键排列来维持球状异构体。详细地，可以通过自动9-芴基甲氧羰基(Fmoc)固相肽合成(SPPS)在2-氯代三苯甲基氯(2-chlorotrityl chloride)(2-CTC)树脂上合成侧链保护的P1，其中去除N-末端Fmoc并且用叔丁氧羰基(Boc)重新保护。末端侧链胺和酸可以正交脱保护(例如，保护基1(PG1)和保护基2(PG2))，并且进一步环化以形成内酰胺桥接的分子复合物P2。内酰胺环化肽可通过裂解、纯化产生，并且可进行空气氧化以产生双环产物P3。最后，完全折叠的P4可以通过原位碘氧化脱保护——二硫化物形成来生成。
在另一实施方式中，活性亚甲基硫缩醛α-RgIA4类似物可如图7a-D中所示制备。RgIA类似物的化学合成可以通过在2-氯代三苯甲基氯(2-CTC)树脂上使用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)固相肽合成(SPPS)，然后进行双操作和区域选择性分子内键形成反应来实现。正确的支架折叠是CysI-CysIII、CysII-CysIV或其相应的具有相同连接度的亚甲基硫缩醛替代物。键明确地按如下顺序形成：1)通过裂解去除三苯甲基(Trt)后在游离Cys上形成亚甲基硫缩醛，2)经由原位氧化乙酰氨基甲基(Acm)脱保护偶联过程形成二硫键，以及3)重复亚甲基硫缩醛形成以生成双-亚甲基硫缩醛取代的类似物。
详细地，在从2-CTC树脂上裂解组装的肽链后，可以通过在三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP.HCl)、碳酸钾和三甲胺(Et3N)的存在下用二碘甲烷处理来去除Trt保护并且形成目标亚甲基硫缩醛键。这种转化可以在一个批次中以大至300mg的规模进行，从而能够大量制备目标肽。第二二硫键可以在Acm脱保护后通过在25％乙酸水溶液(AcOH)中处理过量碘而形成，以产生完全折叠的肽。
组合物和剂型
考虑到这一点，在另一实施方式中，组合物可以包括治疗有效量的本文公开的类似物与药学上可接受的载体的组合。
在一方面，类似物可以约0.0001wt％至约10wt％的浓度存在。在一个实例中，类似物可以约0.0001wt％至约1wt％的浓度存在于组合物中。在另一实例中，类似物可以约0.001wt％至约1wt％的浓度存在于组合物中。在另一实例中，类似物可以约0.01wt％至约0.1wt％的浓度存在于组合物中。在一些实例中，类似物可以约0.005wt％至约0.05wt％的浓度存在于组合物中。
在一方面，药学上可接受的载体可包括水、张度剂(tonicity)、缓冲剂、防腐剂等中的一种或多种，或其组合。
在一些实例中，载体可以包括张度剂。张度剂的非限制性实例可包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、甘露醇、山梨糖醇、葡萄糖、甘油、丙二醇、乙醇、海藻糖、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Dulbecco’s PBS、Alsever's溶液，Tris缓冲盐水(TBS)、水、平衡盐溶液(BSS)，如Hank’s BSS、Earle’s BSS、Grey’s BSS、Puck’s BSS、Simm’s BSS、Tyrode’s BSS和BSSPlus等，或其组合。张度剂可用于提供适当的组合物张度。在一方面，组合物张度可为约250至约350毫渗摩尔/升(mOsm/L)。在另一方面，组合物的张度可为约277至约310mOsm/L。
在一些实例中，载体可以包括pH调节剂或缓冲剂。pH调节剂或缓冲剂的非限制性实例可包括多种酸、碱及其组合，如盐酸、磷酸、柠檬酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、醋酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、三乙醇胺(TRIS)缓冲剂等或其组合。通常，治疗组合物的pH可为约5至约9，或约6至约8。在另一实例中，治疗组合物的pH可以是约5至约6。
在一些实例中，载体可以包括防腐剂。防腐剂的非限制性实例可包括抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、亚硫酸氢盐、偏亚硫酸氢盐、单硫代甘油、苯酚、间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、苯扎氯铵、苄索氯铵、丁基化羟基甲苯、肉豆蔻基γ-吡啶氯胺、2-苯氧乙醇、硝酸苯汞、氯丁醇、硫柳汞、生育酚等，或其组合。
在一方面，该组合物可进一步包含其他的活性剂。在一方面，其他的活性剂是选自以下的成员：抗炎剂、麻醉剂、二级镇痛肽、非肽镇痛剂等，或其组合。
在一个实例中，其他的活性剂可以是抗炎剂。抗炎剂的非限制性实例可包括布洛芬、萘普生、阿司匹林、双氯芬酸、塞来昔布、舒林酸、奥沙普秦、吡罗昔康、吲哚美辛、美洛昔康、非诺洛芬、二呋尼柳、依托度酸、酮咯酸、甲氯芬酯、萘丁美酮、双水杨酸酯、酮洛芬、托美汀、氟比洛芬、甲芬那酸、法莫替丁、溴芬酸、奈帕芬胺、强的松、可的松、氢化可的松、甲基强的松龙、地氟可特、泼尼松龙、氟氢可的松、安西奈德、倍他米松、二丙酸酯、氯倍他索、氯可托龙、地塞米松、双氟拉松、度他雄胺、新戊酸氟米松、氟尼缩松、醋酸氟轻松、氟轻松、氟美童、丙酸氟替卡松、氟氢缩松、氢氟噻嗪等，其水合物，其酸，其碱，或其盐，或其组合。
在一个实实例中，其他的活性剂可以是麻醉剂。麻醉剂的非限制性实例可包括阿替卡因、布比卡因、辛可卡因、依替卡因、左布比卡因、利多卡因、甲哌卡因、丙胺卡因、罗哌卡因、三甲卡因等，或其组合。
在一个实例中，其他的活性剂可以是二级镇痛肽。在一个实例中，其他的活性剂可以是非肽镇痛剂。非肽镇痛剂的非限制性实例可包括对乙酰氨基酚、可待因、双氢可待因、曲马多、哌替啶、氢可酮、羟考酮、吗啡、芬太尼、氢吗啡酮、丁丙诺啡、美沙酮、二乙酰吗啡、杜冷丁等，其水合物、其酸、其碱，或其盐，或其组合。
在一方面，其他的活性剂可以约0.0001wt％至约10wt％的浓度存在。在一个实例中，其他的活性剂可以约0.0001wt％至约1wt％的浓度存在于组合物中。在另一实例中，其他的活性剂可以约0.001wt％至约1wt％的浓度存在于组合物中。在另一实例中，其他的活性剂可以约0.01wt％至约0.1wt％的浓度存在于组合物中。在一些实例中，其他的活性剂可以约0.005wt％至约0.05wt％的浓度存在于组合物中。
在另一方面，组合物可以配制为以下之一：溶液、悬浮液、乳液、凝胶、水凝胶、热敏凝胶、乳膏、软膏、糊剂、粘合剂、储液库、贴剂、或其组合。在一些方面，组合物可适用于局部、经皮、静脉内、皮下施用等、或其组合。在一方面，该组合物可适用于皮下注射。
治疗方法
在又一实施方式中，用于治疗受试者中对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体结合有应答的状况的方法可以包括向受试者施用治疗有效量的组合物。在一方面，状况可以是疼痛。在另一方面，状况可以是脊柱多发性神经根病。另一方面，状况可以是带状疱疹后遗神经痛。另一方面，状况可以是三叉神经痛。另一方面，状况可以是复杂的局部疼痛综合征。另一方面，状况可以是多发性硬化症。
当状况是疼痛时，疼痛可以是神经性疼痛，包括以下的一种或多种：化学诱导的神经病(CIPN)、糖尿病性神经病、关节炎性神经病，骨关节炎神经病等，或其组合。在另一方面，疼痛可以是HIV疼痛。另一方面，疼痛可以是与麻风病相关的疼痛。在另一方面，疼痛可以是手术后疼痛、创伤后疼痛等中的一种或多种，或其组合。
在另一方面，状况可以是癌症。癌症可包括以下一种或多种：上皮癌、肺癌、乳腺癌等，或其组合。
在另一方面，状况可以是炎症。在一方面，炎症可由免疫细胞介导，与风湿病等相关等，或其组合。可以治疗的示例性炎性状况包括炎症、慢性炎症、风湿性疾病(包括关节炎、狼疮、强直性脊柱炎、纤维肌痛、肌腱炎、滑囊炎、硬皮病和痛风)、败血症、纤维肌痛、炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、结节病、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、炎症性皮肤病(包括银屑病和伤口愈合不良)、肺部炎症状况(包括哮喘和慢性阻塞性肺病)、与神经系统炎症相关的疾病(包括多发性硬化症、帕金森病病和阿尔茨海默病)、牙周病和心血管疾病。
在一方面，组合物可以是具有约25μl至约1ml的α-RgIA4类似物的剂型。在另一方面，组合物可以是具有约1ml至约5ml的α-RgIA4类似物的剂型。在一方面，组合物可以是具有约5ml至约10ml的α-RgIA4类似物的剂型。
在另一实施方式中，治疗可以在施用后选定的时间量内提供症状减轻。施用治疗有效量的局部组合物可以减轻与状况相关的症状。在另一方面，治疗可以在施用后选定的时间量内通过提供症状减轻至少10％。在一个实例中，治疗可以在施用后选定的时间量内提供症状减轻至少20％。在另一个实例中，治疗可以在施用后选定的时间量内提供症状减轻至少30％。在又一实例中，治疗可以在施用后选定的时间量内提供症状减轻至少50％。
实现症状减轻的施用后选择的时间可以变化。在一个实例中，选定的时间量可以在施用后少于15秒。在另一实例中，选定的时间量可以在施用后少于30秒。在另一实例中，选定的时间量可以在施用后少于60秒。在另一实例中，选定的时间量可以在施用后少于5分钟。在另一实例中，选定的时间量可以在施用后少于15分钟。在另一实例中，选定的时间量可以在施用后少于30分钟。
在另一方面，治疗有效量的组合物可以每天1至10次施用于受试者。在一个实例中，组合物可以每天1至10次施用于受试者。在另一个实例中，组合物可以每天1至5次施用于受试者。在又一实例中，组合物可以每天3至5次施用于受试者。
在另一方面，可以根据给药方案将治疗有效量的组合物施用受试者。在一个实例中，组合物可以每天至少施用一次持续约一天至约12个月。在另一个实例中，组合物可以每天至少施用一次持续约一天至约6个月。在另一个实例中，组合物可以每天至少施用一次持续约一天至约3个月。在又一实例中，组合物可以每天至少施用一次持续约一天至约1个月。
在另一方面，施用治疗有效量的组合物可以是如皮下剂型、经皮剂型、局部剂型、静脉内剂型等，或其组合。
在另一方面，用于治疗对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体结合有应答的受试者中的状况的组合物可包含治疗有效量的组合物。在另一方面，组合物在制备用于治疗对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体结合有应答的受试者中状况的药物中的用途可以包含治疗有效量的组合物。
序列表
表1列出了RgIA、RgIA4和RgIA4类似物的序列。
表1
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注1：[]是指由第一个位置(例如，D或E)的氨基酸侧链和最后一个位置(例如，Dap或K)的氨基酸侧链之间的内酰胺桥环化而成的肽。
注2：CI、CII、CIII和CIV是指肽中半胱氨酸相对于N-末端的顺序。例如，CI比CII更接近N-末端，CII比CIII更接近N-末端，而CIII比CIV更接近N-末端。
注3：X1-X15指本文中引用的Xaa。
13指CI和CIII的半胱氨酸间硫键中的亚甲基硫缩醛。
24指CII和CIV的半胱氨酸间硫键中的亚甲基硫缩醛。
实施例
在一个实施例中，α-RgIA4肽类似物可包含：被配置以结合α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的识别指区域；和保护半胱氨酸间硫键的侧链键合构型，其中类似物具有对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的结合亲和力，其是α-RgIA4肽结合亲和力的至少2.5％。
在另一实施例中，α-RgIA4肽类似物可具有由受保护的半胱氨酸间硫键维持的结构，所述结构提供对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的结合亲和力，其为α-RgIA4肽的结合亲和力至少2.5％。
在另一实施例中，对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的结合亲和力可以是：α-RgIA4肽结合亲和力的至少5％，或α-RgIA4肽结合亲和力的至少7.5％，或α-RgIA4肽的结合亲和力的至少15％，或α-RgIA4肽的结合亲和力的至少25％，或α-RgIA4肽的结合亲和力的至少40％，或在α-RgIA4肽的结合亲和力的至少50％，或α-RgIA4肽的结合亲和力的至少80％，或基本上等于α-RgIA4肽的结合亲和力，或大于α-RgIA4肽的结合亲和力。
在另一实施例中，与α-RgIA4肽的效力相比，受保护的半胱氨酸间硫键可以提供效力的增加。
在另一实施例中，类似物可提供α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值：其基本上等于α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值，或不大于α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的2.0倍，或不大于α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的3.0倍，或不大于α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的5.0倍，或不大于α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的15.0倍，或不大于α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的25.0倍。
在另一实施例中，与α-RgIA4肽或没有受保护的半胱氨酸间硫键的α-RgIA4肽类似物相比，受保护的半胱氨酸间硫键可减少二硫键加扰、二硫键降解中的一种或多种，或其组合。
在另一实施例中，侧链键合构型可包含亚甲基硫缩醛、通过内酰胺桥环化至C-末端氨基酸侧链的N-末端氨基酸侧链中的一种或多种，或其组合。
在另一实施例中，侧链键合构型可以是包含CII和CIV之间的半胱氨酸间键的亚甲基硫缩醛。
在另一实施例中，侧链键合构型可以是通过内酰胺桥环化到C-末端氨基酸侧链的N-末端氨基酸侧链。
在另一实施例中，N-末端氨基酸可以选自谷氨酸和天冬氨酸。
在另一实施例中，C-末端氨基酸可以选自赖氨酸和L-2,3-二氨基丙酸。
在另一实施例中，N-末端氨基酸可以是谷氨酸并且C-末端氨基酸可以是赖氨酸。
在另一实施例中，受保护的半胱氨酸间硫键可为在人血清中的α-RgIA4肽类似物提供稳定性，其大于在人血清中的α-RgIA4肽的稳定性，其中通过在90％人血清AB型中温育0.1mg/mL的α-RgIA4肽类似物或α-RgIA4肽并且在37℃下温育1、2、4、8、24、48或72小时中的至少一个后剩余的量，来测量在人血清中的稳定性。
在另一实施例中，在人血清中α-RgIA4肽类似物的稳定性可以大于在人血清中α-RgIA4肽的稳定性的10％、20％、40％、60％、80％、100％、200％、300％、400％、500％或1000％中的至少一个或多个。
在另一实施例中，受保护的半胱氨酸间硫键可为在还原型谷胱甘肽中的α-RgIA4肽类似物提供稳定性，其大于在还原型谷胱甘肽中α-RgIA4肽的稳定性，其中通过在pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的10当量还原型谷胱甘肽中，温育0.1mg/mL的α-RgIA4肽类似物或α-RgIA4肽并且在37℃下温育1、2、4、8、24、48或72小时中的至少一个后剩余的量，来测量在还原型谷胱甘肽中的稳定性。
在另一实施例中，在还原型谷胱甘肽中α-RgIA4肽类似物的稳定性可以大于在还原型谷胱甘肽中α-RgIA4肽的稳定性的10％、20％、40％、60％、80％、100％、200％、300％、400％、500％、或1000％中的至少一个或多个。
在另一实施例中，受保护的半胱氨酸间硫键可提供α9α10烟碱型乙酰胆碱受体选择性，其基本上等于α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体选择性。
在另一实施例中，受保护的半胱氨酸间硫键可提供α9α10烟碱型乙酰胆碱受体选择性，其与不同烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)亚型的选择性相比对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的选择性高5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或200倍中的至少一个或多个。
在另一实施例中，不同的nAChR亚型可以选自：α1β1δε、α2β2、α2β4、α3β2、α3β4α4β2、α4β4、α6/α3β2β3和α6/α3β4。
在另一实施例中，受保护的半胱氨酸间硫键可提供安全性，其基本上等于或大于α-RgIA4肽的安全性，其中安全性通过以下一项或多项来测量：如自动化全细胞膜片钳测定所测量的，以浓度100μM存在的类似物抑制低于25％的人类ether-a-go-go相关基因(hERG)K+通道，如通过单胺氧化酶(MAO)测定所测量的，以浓度100μM存在的类似物具有小于约20％的抑制活性，或如在CYP测定中测量的，以浓度10μM存在的类似物具有小于20％的抑制活性。
在另一实施例中，受保护的半胱氨酸间键可以是CI和CII、CIII和CIV之间的半胱氨酸间键中的一个或多个，或其组合。
在另一实施例中，结构可以是球状的。
在另一实施例中，α-RgIA4肽类似物可包含：包含D P R的识别指区域；和包含CI、CII、CIII和CIV的胱氨酸残基，其中：CI和CIII通过第一半胱氨酸间硫键连接，并且CII和CIV通过第二半胱氨酸间硫键连接；并且其中至少第二半胱氨酸间硫键被侧链键合构型保护。
在另一实施例中，第二半胱氨酸间硫键可包含亚甲基硫缩醛，可通过内酰胺桥环化至C-末端氨基酸侧链的N-末端氨基酸侧链，或其组合。
在另一实施例中，第二半胱氨酸间硫键可以包含亚甲基硫缩醛。
在另一实施例中，类似物可包含氨基酸序列Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4Xaa5 C Xaa6(SEQ ID NO:13)，其中Xaa1-6是除C之外的任何氨基酸。
在另一实施例中，类似物可包含氨基酸序列Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4Xaa5 C Xaa6(SEQ ID NO:14)，其中：Xaa1是除C之外的任何蛋白源性或非蛋白源性氨基酸，Xaa2是除C之外的任何蛋白源性或非蛋白源性氨基酸，Xaa3是选自以下的成员：(Cit)或任何蛋白原性或非蛋白原性阳性氨基酸；Xaa4是任何蛋白源性或非蛋白源性芳香族氨基酸；Xaa5是任何蛋白源性或非蛋白源性阳性氨基酸；并且Xaa6是任何蛋白源性或非蛋白源性芳香族氨基酸。
在另一实施例中，类似物可包含氨基酸序列Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4Xaa5 C Xaa6 Xaa7(SEQ ID NO:20)，其中Xaa1-7是除C之外的任何氨基酸。
在另一实施例中，类似物可包含氨基酸序列Xaa1 C C Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4Xaa5 C Xaa6 Xaa7(SEQ ID NO:21)，其中：Xaa1是除C之外的任何蛋白源性或非蛋白源性氨基酸，Xaa2是除C之外的任何蛋白源性或非蛋白源性氨基酸，Xaa3是选自以下的成员：(Cit)或任何蛋白源性或非蛋白源性阳性氨基酸，Xaa4是任何蛋白源性或非蛋白源性芳香族氨基酸，Xaa5是任何蛋白源性或非蛋白源性阳性氨基酸，Xaa6是任何蛋白源性或非蛋白源性芳香族氨基酸，并且Xaa7是除C之外的任何蛋白源性或非蛋白源性氨基酸。
在另一实施例中，类似物可以包含氨基酸序列G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q CXaa6(SEQ ID NO:15)，其中Xaa1是G，Xaa2是T，Xaa5是Q，并且Xaa3、Xaa4或Xaa6是除C之外的任何氨基酸。
在另一实施例中，类似物可包含氨基酸序列G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q CXaa6(SEQ ID NO:16)，其中：Xaa3是选自(Cit)和R的成员，Xaa4是选自(iY)和Y的成员，并且Xaa6是选自(bhY)、Y和bA的成员。
在另一实施例中，类似物可包含氨基酸序列G C C T D P R C(Cit)(iY)Q C Y(SEQ ID NO:18)，其中：Xaa3是(Cit)，Xaa4是(iY)，并且Xaa6是Y。
在另一实施例中，类似物可包含氨基酸序列G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q CXaa6 Xaa7(SEQ ID NO:22)，其中Xaa1是G，Xaa2是T，Xaa5是Q，并且Xaa3、Xaa4、Xaa6或Xaa7是除C之外的任何氨基酸。
在另一实施例中，类似物可包含氨基酸序列G C C T D P R C Xaa3 Xaa4 Q CXaa6 Xaa7(SEQ ID NO:23)，其中：Xaa3是选自(Cit)和R的成员，Xaa4是选自(iY)和Y的成员，Xaa6是选自(bhY)、Y和bA的成员，并且Xaa7是R。
在另一实施例中，类似物可包含氨基酸序列G C C T D P R C R(iY)Q C(bhY)R(SEQ ID NO:24)，其中：Xaa3是R，Xaa4是(iY)，并且Xaa6是(bhY)。
在另一实施例中，类似物可包含氨基酸序列G C C T D P R C R(iY)Q C(bA)R(SEQ ID NO:25)，其中：Xaa3是R，Xaa4是(iY)，并且Xaa6是(bA)。
在另一实施例中，N-末端氨基酸侧链可以通过内酰胺桥环化至C-末端氨基酸侧链。
在另一实施例中，N-末端氨基酸可以选自谷氨酸和天冬氨酸。
在另一实施例中，C-末端氨基酸可以选自赖氨酸和L-2,3-二氨基丙酸。
在另一实施例中，N-末端氨基酸可以是谷氨酸并且C-末端氨基酸可以是赖氨酸。
在另一实施例中，类似物可包含氨基酸序列Xaa8 Xaa9 C C Xaa10 D P R C Xaa11Xaa12 Xaa13 C Xaa14 Xaa15(SEQ ID NO:3)，其中Xaa8-15是除C之外的任何氨基酸。
在另一实施例中，类似物可包含氨基酸序列Xaa8 Xaa9 C C Xaa10 D P R C Xaa11Xaa12 Xaa13 C Xaa14 Xaa15(SEQ ID NO:4)，其中：Xaa8是选自E和D的成员，Xaa15是选自K和(Dap)的成员，并且Xaa9-14是除C之外的任何氨基酸。
在另一实施例中，类似物可以包含氨基酸序列Xaa8 Xaa9 C C T D P R C Xaa11Xaa12 Q C Y Xaa15(SEQ ID NO:5)，其中：Xaa8是选自E和D的成员，Xaa10是T，Xaa13是Q，Xaa14是Y，Xaa15是选自K和(Dap)的成员，并且Xaa9、Xaa11或Xaa12是除C之外的任何氨基酸。
在另一实施例中，类似物可包含氨基酸序列Xaa8 Xaa9 C C T D P R C Xaa11Xaa12 Q C Y Xaa15(SEQ ID NO:6)，其中：Xaa8是选自E和D的成员，Xaa9是G或(bA)，Xaa11是R或(Cit)，Xaa12是Y或(iY)，并且Xaa15是选自K和(Dap)的成员。
在另一实施例中，类似物可包含氨基酸序列E G C C T D P R C(Cit)Y Q C Y K(SEQ ID NO:9)，其中：Xaa8是E，Xaa9是G，Xaa11是(Cit)，Xaa12是Y，并且Xaa15是K。
在另一实施例中，类似物可包含氨基酸序列E(bA)C C T D P R C(Cit)Y Q C Y K(SEQ ID NO:10)，其中：Xaa8是E，Xaa9是(bA)，Xaa11是(Cit)，Xaa12是Y，并且Xaa15是K。
在另一实施例中，类似物可包含氨基酸序列E G C C T D P R C(Cit)(iY)Q C YK(SEQ ID NO:11)，其中：Xaa8是E，Xaa9是G，Xaa11是(Cit)，Xaa12是(iY)，并且Xaa15是K。
在另一实施例中，该类似物可以包含氨基酸序列E G C C T D P R C R(iY)Q C YK(SEQ ID NO:12)，其中：Xaa8是E，Xaa9是G，Xaa11是R，Xaa12是(iY)，并且Xaa15是K。
在另一实施例中，组合物可以包含治疗有效量的所述类似物与药学上可接受的载体的组合。
在另一实施例中，组合物可以适用于局部、经皮、静脉内或皮下施用。
在另一实施例中，组合物可以进一步包含其他的活性剂。
在另一实施例中，其他的活性剂可以是选自以下的成员：抗炎剂、麻醉剂、二级镇痛肽、非肽镇痛剂、及其组合。
在另一实施例中，其他的活性剂可以约0.0001wt％至约10wt％的浓度存在。
在另一实施例中，组合物可以配制为以下之一：溶液、悬浮液、乳液、凝胶、水凝胶、热敏凝胶、乳膏、软膏、糊剂、粘合剂、储液库、贴剂、或其组合。
在另一实施例中，组合物可以适用于皮下注射。
在另一实施例中，药学上可接受的载体可以包括水、张度剂、缓冲剂、防腐剂中的一种或多种，或其组合。
在另一实施例中，维持α-RgIA4类似物中用于α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的α-RgIA4效力的方法可以包括：用维持处于α-RgIA4构型的类似物的识别指区域的侧链键合构型来保护半胱氨酸间硫键。
在另一实施例中，类似物可以结合α9α10烟碱型乙酰胆碱受体，亲和力为：α-RgIA4肽结合亲和力的至少5％，或α-RgIA4肽结合亲和力的至少7.5％，或α-RgIA4肽结合亲和力的至少15％，或α-RgIA4肽结合亲和力的至少25％，或α-RgIA4肽结合亲和力的至少40％，或α-RgIA4肽结合亲和力的至少50％，或α-RgIA4肽结合亲和力的至少80％，或基本上等于α-RgIA4肽的结合亲和力，或大于α-RgIA4肽结合亲和力。
在另一实施例中，类似物可以抑制α9α10烟碱型乙酰胆碱受体，其IC50值是：基本上等于α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值，或不大于α-RgIA4肽的9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的2.0倍，或不大于α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的3.0倍，或不大于α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的5.0倍，或不大于α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的15.0倍，或不大于α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的IC50值的25.0倍。
在另一实施例中，保护半胱氨酸间硫键可以提供α9α10烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)选择性，其与不同nAChR亚型的选择性相比对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的选择性多5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或200倍中的至少一个或多个。
在另一实施例中，保护半胱氨酸间硫键可以提供的α-RgIA4肽类似物在人血清中的稳定性与α-RgIA4肽在人血清中的稳定性相比，高10％、20％、40％、60％、80％、100％、200％、300％、400％、500％或1000％中的至少一个或多个。
在另一实施例中，保护半胱氨酸间键可包括保护CII与CIII、CII与CIV之间的半胱氨酸间键中的一个或多个，或其组合。
在另一实施例中，保护半胱氨酸间硫键可包括在CII和CIV之间插入亚甲基硫缩醛。
在另一实施例中，保护半胱氨酸间硫键可包括在N-末端氨基酸和C-末端氨基酸之间产生内酰胺桥。
在另一实施例中，用于治疗受试者中对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体结合有应答的状况的方法可以包括向受试者施用治疗有效量的组合物。
在另一实施例中，状况可以是疼痛。
在另一实施例中，疼痛可以是神经性疼痛，包括以下的一种或多种：化学诱导的神经病(CIPN)、糖尿病性神经病、关节炎性神经病、骨关节炎性神经病或其组合。
在另一实施例中，疼痛可以是HIV疼痛。
在另一实施例中，疼痛可以是与麻风病相关的疼痛。
在另一实施例中，疼痛可以是手术后疼痛或创伤后疼痛中的一种或多种。
在另一实施例中，状况可以是脊柱多发性神经根病。
在另一实施例中，状况可以是带状疱疹后遗神经痛。
在另一实施例中，状况可以是三叉神经痛。
在另一实施例中，状况可以是复杂的局部疼痛综合症。
在另一实施例中，状况可以是癌症。
在另一实施例中，癌症可以包括以下一种或多种：上皮癌、肺癌、乳腺癌或其组合。
在另一实施例中，病症可以是多发性硬化症。
在另一实施例中，病症可以是炎症。
在另一实施例中，炎症可以由免疫细胞介导，与风湿病相关，或其组合。
在另一实施例中，治疗可以在施用后选定的时间量内提供症状减轻至少10％。
在另一实施例中，治疗有效量的组合物可以每天1至5次施用于受试者。
在另一实施例中，治疗有效量的组合物可以根据每天至少一次的给药方案施用于受试者，持续约一天至约3个月。
在另一实施例中，治疗有效量的组合物可以皮下剂型、经皮剂型、局部剂型、静脉内剂型或其组合施用。
在另一实施例中，用于治疗受试者中对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体结合有应答的状况的组合物可包含治疗有效量的如所述给予受试者的组合物。
在另一实施例中，组合物在制备用于治疗受试者中对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体结合有应答的状况的药物中的用途可以包括：治疗有效量的如所述的组合物给予受试者。
实验示例：
提供以下实施例是为了促进对本公开的某些实施方式的更清楚的理解，并且决不意味着对其的限制。
实施例1-A：构象受限的α-RgIA类似物的设计和合成
方法：
肽合成。在合成仪(SyroI)上使用自动Fmoc SPPS化学合成肽。第一个氨基酸手动偶联到2-CTC树脂上(取代＝0.77mmol/g)，并且树脂用MeOH封端至最终取代为0.4mmol/g。简言之，将250mg的2-CTC树脂(取代＝0.77mmol/g)溶胀并且在DCM中洗涤30min。将树脂排干，然后加入特定Fmoc保护的氨基酸溶液(Fmoc-AA-OH＝0.1mmol，DIEA＝0.2mmol，在DCM＝4mL中)，并且在室温下温育1.5h。然后将树脂用DMF和DCM洗涤多次，并且与含有16％v/vMeOH和8％v/v DIEA的5mL DCM一起温育5min。重复此动作5次，然后用DCM和DMF彻底洗涤。然后将树脂设置到用于自动合成的合成仪中。使用HATU(5.0eq.)、DIEA(10.0eq.)和Fmoc-AA-OH(5.0eq.)在DMF(5mL每0.1mmol氨基酸键合树脂)中加热15分钟至70℃(Cys和烯丙基以及Aloc保护的氨基酸为50℃)进行偶联反应。使用DMF(4mL)中的20％(v/v)哌啶进行脱保护反应，在室温下进行5min持续2轮。
裂解。通过用由TFA/H2O/TIPS/EDT＝95:2:2:1组成的混合物(cocktail)缓冲液在室温下处理2.5h(3.0mL每0.1mmol序列键合树脂)，从树脂上切下肽。然后将获得的肽-TFA溶液过滤并且在冷乙醚中沉淀出来，离心，并且用乙醚洗涤至少2次，然后在真空中干燥。然后通过RP-HPLC纯化粗产物。
LC/MS分析。在Agilent 6120Quadrupole LC/MS系统上，使用0.1％FA中的H2O/ACN梯度，以0.4mL/min在Xbridge C18 5μm(50x2.1mm)柱上，通过LC/MS对肽进行表征。从HPLC运行中收集的级分也通过LC/MS进行分析。
HPLC纯化方法和纯度检查。除非另有说明，否则所有样品均按以下条件进行分析：在Agilent 1260HPLC系统上，用含有0.1％TFA的H2O/ACN梯度，在45分钟内从5％ACN到35％ACN，以3.0mL/min在Jupiter 5μC18(250x10mm)柱上进行了粗肽的半制备反相HPLC。使用Labconco冷冻干燥机(Freeze Dryer)收集并且冻干含有目标产物的纯化级分。所有纯度评估、异构体共进样和稳定性测定分析均通过HPLC在Phenomenex Gemini C18 3μm(150x3mm)柱上进行。
树脂正交脱保护和内酰胺化。方法1：使用Pd(PPh3)4(0.1eq.)和DMBA(4.0eq.)在DCM中去除树脂上的烯丙酯(OAll)和烯丙基氨基甲酸酯(NHAloc)2h，并且将该反应重复2轮。方法2：Pd介导的脱保护与含3-碘(iodo)-Tyr的序列不相容(脱碘产物是主要的，可能是因为Pd的插入和还原)。因此，O(Dmab)和NH(ivDde)被用作正交保护对。将加载的树脂在DMF中的5％肼中温育4h，并且重复该动作一次。在DMF中的PyBOP/HOBt/DIEA(2:2:2.4eq.)环化条件下，在树脂上进行内酰胺环化，并且在用于完成的旋转器上搅拌>6h。通过微裂解监测反应转化并且通过LC/MS检查。
空气氧化二硫键形成。通过在室温下在含有5％DMSO的0.01M Na2HPO4缓冲液(pH＝8.0)中通气>48h，使具有两个游离半胱氨酸的肽氧化。通过LC/MS监测反应进程。完成后，使用上述方法通过RP-HPLC纯化反应混合物。
I2介导的二硫键形成。向AcOH:H2O(80％:20％v/v，1.00mM)中搅拌的Bis-Acm-保护肽溶液以滴加的方式添加溶解在AcOH中的I2(10.0eq.)。将反应在室温下搅拌10min并且通过LC/MS监测。通过添加抗坏血酸溶液(1.0M)淬灭过量的I2，直至混合物变为无色。然后将混合物用H2O(与反应混合物等体积)稀释并且通过RP-HPLC纯化。
结果和讨论：
基于设计完全活性的环状α-RgIA4类似物的目标，检查了NMR结构(PDB 2JUQ)和最近的α-RgIA的受体共结晶结构(PDB 6HY7)。保持约的距离，α-RgIA的N-末端和C-末端都从药效团伸出。为了适应现有的主链几何结构，将在两端使用其他的氨基酸来跨越这个距离，从而理想的连接体最低程度地扰乱主链以维持效力。因此，按照方案1中描述的设计合成路线合成了一系列侧链环化肽。新引入的内酰胺桥是在树脂上合成的，然后是双操作液相氧化过程，其中应用区域选择性二硫键排列以提供球状异构体。详细地，如图2中示例的，通过自动化Fmoc固相肽合成(SPPS)在2-氯代三苯甲基氯(2-CTC)树脂上合成侧链保护的P1，其中去除N-末端Fmoc并且用Boc重新保护。然后将末端侧链胺和酸正交脱保护(PG1和PG2)并且进一步环化以形成内酰胺桥接分子复合物P2。内酰胺环化肽通过裂解、纯化产生，然后进行空气氧化以得到双环产物P3。最后，通过原位碘氧化脱保护-二硫化物形成而生成完全折叠的P4。
实施例1-B：合成肽的体外和体内生物学评价
方法：
化合物表征。本研究中合成和研究的所有类似物均通过HPLC测定纯度≥95％。分子量通过ESI-MS测量。[M+H]+M/Z(Da)：RgIA4，计算值(Calc)1691.6，实测值(Found)1691.4；类似物1：计算值1749.1，实测值1749.6；类似物2，计算值1791.0，实测值1791.5；类似物3，计算值1804.1，实测值1804.6；类似物4，计算值1819.1，实测值1819.6；类似物5，计算值1931.0，实测值1931.5；类似物6，计算值1929.0，实测值1929.8；RgIA4[1,4]，计算值1691.6，实测值1691.4；类似物6[1,4]，计算值1929.0，实测值1929.6。纯化的肽中的每个的LC-色谱图和MS-质谱图显示在图3C至图3K中，如表1B-1中总结的。
表1B-1
a通过ESI质谱确定。 b通过RP-HPLC确定。
卵母细胞受体表达。非洲爪蟾(X.laevis)细胞被显微注射了编码选定nAChR亚基的cRNA。用15-25ng等份的每种亚基注射所有人类异源nAChRs卵母细胞，并且用50ng的α7编码cRNA注射了同源人类α7卵母细胞。使用前，卵母细胞在ND96中在17℃下温育1-3天。
电生理记录。注射的卵母细胞被放置在30μL记录室中，并且电压被钳制到-70mV的膜电位。ND96(96.0mM NaCl、2.0mM KCl、1.8mM CaCl2、1.0mM MgCl2、5mM HEPES、pH 7.5)和0.1mg/mL BSA以约2mL/min进行重力灌注通过记录室。施加一秒钟的ACh脉冲以测量受体应答，其中脉冲每分钟发生一次。ACh以100μM的浓度应用于所有亚型，除了200μM的α7和10μM的肌肉亚型。建立基线Ach应答，然后将ND96对照溶液切换为含有不同浓度测试肽的ND96溶液。在含肽溶液的灌注期间，ACh脉冲持续每分钟一次以评估ACh诱导应答的阻断。在肽浓度存在的情况下测量Ach应答，直到应答达到稳态；与基线应答相比，这些应答中的三个的平均值用于确定应答百分比。由于材料有限，对于10μM浓度测试，将3μl的100μM肽引入30μl记录室中，ND96流量停止。温育5分钟后，ND96流量和ACh脉冲恢复以测量由于肽的任何阻断。所有浓度应答分析均使用GraphPad Prism软件进行；使用非线性回归(曲线拟合)S形剂量应答(可变斜率)计算值，包括所得IC50。
奥沙利铂诱导的冷痛觉超敏。奥沙利铂以0.875μg/μl溶解在0.9％无菌盐水中。类似物6以0.02μg/μl溶解在0.9％无菌盐水中。CBA/CaJ小鼠每天(不包括周末)用奥沙利铂(3.5mg/kg)或0.9％盐水(运载体)i.p.注射。小鼠也每天用类似物6(80μg/kg)或0.9％盐水作为对照s.c.注射。在这项研究中，所有化合物对于实验者均是不知情的。该研究从周三的初始基线冷敏感性测试开始，并且在第一周期间的周三、周四和周五进行注射。周一至周五继续注射两周，在前一天注射后24小时的星期三进行测试。最后一周，注射发生在周一和周二，并且最后的测试日发生在24小时后。
冷板测试。使用购自IITC Life Science的热/冷板机进行测试。测试小鼠被允许适应测试室，其中板保持在室温(23℃)，直到调查行为平息。然后以每分钟10℃的速率在线性斜坡上降低温度。当小鼠抬起两只前爪并用力摇晃它们或反复舔脚垫时，测试就停止。一次抬起一个前爪或在爪子之间来回交替不计分，并且测试继续。记录最终时间和温度，并且使用Graphpad Prism绘制所得数据。使用单因素AVOVA分析和Dunnett多重比较检验分析数据。P值是，*P<0.05，**P<0.01，和***P<0.001与奥沙利铂/盐水对照有显著差异。
结果与讨论：
之前一些基于α-CTx的候选药物临床试验的失败表明，克服人类与啮齿动物nAChRs的不同敏感性是开发基于CTx的镇痛剂的重要障碍和混杂因素。为了解决这个问题，通过表达人α9α10 nAChR的非洲爪蟾卵母细胞的双电极电压钳电生理学测试了合成的类似物。从每个浓度-应答曲线产生的IC50值，如图3a-A中和图3a-B中所示，列于表1B-2中(其中[]表示环化，^表示C末端)。
表1B-2：
合成了类似物1至4以确定最佳连接体构型。最有效力的类似物3，与末端[Glu-Lys]侧链环化，与α-RgIA4相比效力低10倍。当生成较短的连接体时，类似物1[Asp-Dap]和2[Asp-Lys]的生物活性显著下降，这可能是由骨架中的应变和扰动引起的。通过在分子的N-末端残基处用βAla1替换Gly1，具有一个CH2单元加长连接体的类似物4也导致效力下降，尽管不如具有较短连接体的类似物那么剧烈。使用鉴定为[Glu-Lys]的良好连接体，合成了具有3-碘-酪氨酸突变的类似物5，该突变是可以增加对人α9α10 nAChR效力的残基。当Cit9突变回Arg9(根据α-RgIA5)时，类似物5的效力达到5.9nM，并且进一步降低至3.4nM(类似物6)。在其他人nAChR亚型上测试类似物6以测量其选择性，显示除α7(IC50＝504.0nM，减少150倍)之外的所有亚型均大于10μM效力，α7也是疼痛相关的nAChR亚型，如图3b所示。该结果表明当前的环化策略产生的类似物6具有保留的效力和良好的受体选择性，如表1B-3所示。
表1B-3
a所有受体是人类型。 b在10μM时，抑制＜50％.c括号内数字是95％置信区间。
在奥沙利铂诱导的周围神经性疼痛啮齿动物模型中评估了类似物6的体内镇痛作用。如图3a-B所示，奥沙利铂在小鼠中的施用产生冷痛觉超敏，其导致在冷板测试上的逐渐减少的延迟，同时每天共同施用类似物6显著预防冷痛觉超敏。
实施例1-C：RgIA4和类似物6的人血清稳定性
方法：
体外人血清稳定性测试。将肽(RgIA4和类似物6)溶解在H2O(1.0mg/mL)中，并且将100μL该溶液添加到来自人类男性AB血浆的900μL人血清中，该血浆经过首次解冻、无菌过滤并在13,000rpm下预离心15min以去除脂质。最终肽浓度为0.1mg/mL。然后将溶液在37℃水浴中温育，并且在特定的预定时间点分别取出单独的100μL溶液，并且用300μL ACN处理并在冰上冷却30min。将悬浮液在室温下以13,000rpm离心5min。然后取10μL的上清液并且溶解在10μL的缓冲液A(在H2O中0.1％ TFA)中，以制成HPLC样品。通过HPLC(注射体积＝15μL；柱：Phenomenex，150mm x 4.6mm，5μm)在8min内以5-50％B的线性梯度(A＝H2O+0.1％FA并且B＝ACN+0.1％FA；0.4mL/min流速)分析样品。肽峰面积在220nm处积分(合并，integrate)，并且将与初始肽相比，剩余肽的百分比随时间作图。每种肽的血清稳定性实验独立重复3次。使用GraphPad Prism软件进行数据分析。
结果与讨论：
人血浆中硫醇诱导的二硫化物加扰和蛋白水解降解是对富含二硫化物的肽类药物的两大威胁。为了确定新引入的构象约束如何影响代谢稳定性，我们对与α-RgIA4相比最有效力的类似物6进行了体外人血清稳定性测定。如图4a-A所示，类似物6表现出比α-RgIA4显著增加的稳定性。此外，如图4a-B所示，通过HPLC分析观察到显著的二硫化物加扰抑制。如图4b-A、图4b-B和图4b-C所示，前峰为加扰产物[1,4]，其用异构体共注射鉴定。如图4a-A所示，超过一半的α-RgIA4被加扰成其带状异构体α-RgIA4[1,4]，而少于10％的类似物6被加扰。总之，该数据表明类似物6中的侧链环化极大地抑制了蛋白水解降解和二硫化物加扰。
实施例1-D：NMR分析和结构确定
方法：
NMR光谱。肽样品以2.0mM(未校正同位素效应)在pH 3.5缓冲液中制备，缓冲液由含(20mM Na2HPO4、50mM NaCl、50μM NaN3和0.1mM EDTA)的10％D2O组成。光谱记录在298K的Inova 500和600MHz光谱仪上。光谱仪设置为VnmrJ4.0。生成了包括TOCSY(80ms)、gCOSY、NOESY(200ms)、g11-NOESY和13C-HSQC在内的二维实验。将样品装入Shigemi管中进行数据收集，并且使用梯度激发塑型(excitation sculpting)实现水抑制。使用软件NMRPipe处理光谱，并且使用SPARKY分配化学位移，如表1D-1所示的α-RgIA4、表1D-2所示的类似物3和表1D-3所示的类似物6。TOCSY(蓝色)和NOESY(红色)的酰胺区域与HSQC脂肪族区域和芳香族区域的叠加。使用SPARKY进行分配。参见例如图5b至5j。
表1D-1：α-RgIA4
表1D-2：类似物3
表1D-3：类似物6
结构计算。通过使用CYANA 3.0从NOESY(200ms)和g11-NOESY光谱中的交叉峰强度，推导质子间距离限制，来计算本研究中的3D结构。特殊氨基酸库(3-碘Tyr、连接的(Linked)Glu和Lys)在天然氨基酸的基础上在侧链上进行了修饰。伪原子校正被应用于非立体特定分配的质子。基于Hα、Cα、Cβ和HN化学位移，从TALOS生成了ψ和χ1主链二面角的约束。结构使用程序PyMOL进行了显示，并且使用Rosseta进行了改进。如图5k至图5m所示，20个最低能量结构的系综叠加在主链原子(N、O、Cα和Hα)上显示为棒状，其中省略了氢并且显示了计算统计数据。
结果与讨论：
为了更好地了解侧链环化对整个结构的影响，对α-RgIA4以及类似物3和6进行了NMR研究。密切相关的次级Hα化学位移，特别是在从Pro6到Gln11的螺旋区域，表明这三个分子之间的高度结构相似性，如图5a-A所示。在α-RgIA4和3之间的C-末端区域上观察到轻微变化，而α-RgIA4和6更相似。然后使用CYANA3.0计算α-RgIA4、3和6的全三维溶液NMR结构。来自200个计算结构的20个最低能量结构是用低主链RMSD生成的。尽管环化约束的末端和侧链连接体上的扰动存在差异，但类似物3和类似物6与α-RgIA4共有高度结构相似性(图5a-B和图5a-C)，特别是在用于受体结合的Asp5-Pro6-Arg7“识别指”区域。总的来说，其他的[Glu-Lys]侧链环化不导致肽核心的结构扰动。
示例1-E：对接模型
方法：
对接研究。在来自NMR数据的20个最低能量整体中代表了两类通用的类似物6构象异构体。这两个类别都在Rosetta中进行了分析，然而一个类别(含有20个整体结构中的17个)生成了对接坐标，其成功地再现了在RgIA晶体结构中与α9亚基(PDB 6HY7)分解(解析，resolved)的已知相互作用。从该类别中选择能量最低的构象异构体，以使用Rosetta在α9/α10 nAChR亚基界面生成类似物6的假设结合模型。α9的结构取自PDB条目6HY7和4D01，并且α10的同源模型坐标取自之前的报告。体外突变实验表明，α-RgIA可能优先结合α9(+)/α9(-)和α10(+)/α9(-)界面，而不是α9(+)/α10(-)界面，因此选择α9(+)/α9(-)和α10(+)/α9(-)在Rosetta中建模。使用Rosetta对接程序(Docking Protocol)完成类似物6与受体亚基接口的初始对接运行，并且允许类似物6在乙酰胆碱结合位点处的起始位置以和8°随机平移和旋转扰动。将产生的1000个坐标文件的Rosetta对接指标I_sc和rms绘制在二维散点图上，表明类似物6在乙酰胆碱结合位点的定位(与PDB文件6HY7中的RgIA对准)提供了最有利的I_sc分数。I_sc和rms之间存在显著相关性，表明在初始对接操作期间收敛(趋同，convergence)。使用[-docking_local_refine flag]进一步完善界面交互。使用I_rms和I_sc对局部细化结果进行聚类，以确保高分结果不是异常值(outlier)，并且使用RosettaRelax完成最终的最小化操作，如图6b和6c所示。
结果与讨论：
最后，生成了基于Rosseta蛋白质-蛋白质对接计算的类似物6与受体的对接模型，以帮助为SAR工作提供信息。我们发现，在类似物6与α9/α10 nAChR结合的情况下，通过Rosetta预测了通过α-RgIA/α9(+)晶体结构(PDB 6HY7)揭示的结合相互作用也是存在的。具体地，如图6a-A和6a-C所示，类似物6残基Asp5和Arg7形成分子内盐桥，其中在Arg7上剩余的胺与α9(+)和α10(+)表面上受体残基Pro200的主链羰基氢键结合，这种相互作用几乎与报道的晶体结构相同。此外，类似物6中的Pro6与环B上的Trp151形成CH2-π相互作用。进一步的相互作用显示这里研究的两个受体表面之间存在一些差异，但是使一些潜在的相互作用伙伴几乎不超过氢键截止距离的这些明显差异可能被这个模型夸大了，因为它没有考虑在配体结合后受体主链位置中的任何潜在诱导-适应构象变化。我们的结果表明，在α9(+)/α9(-)界面的情况下，Arg9与Thr152的主链氧之间存在其他的相互作用。受体残基Arg59与α10(+)/α9(-)和α9(+)/α9(-)的类似物6残基Cys3和α10(+)/α9(-)的Cys8的主链氧形成氢键。最后，如图6a-B和6a-D所示，预测残基Thr4与Asp171形成氢键。这些假设模型与报道的α-RgIA和人类α9(+)表面的共复合物的一致性支持这些预测的基础。然而，鉴于缺乏具有α-RgIA和α9α10 nAChR的(-)表面的直接、经验来源的结构数据，与完整受体ECD复合的α-RgIA和相关类似物的结构测定仍然是未来研究的目标。
示例1-F：材料和方法
材料。所有市售化学品均购买并直接使用，无需进一步纯化。标准Fmoc保护氨基酸获自Protein Technologies Inc.。包括Fmoc-L-Cys(SAcm)-OH、Fmoc-L-Cit-OH、Fmoc-L-3-碘-Tyr-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OAll)-OH、Fmoc-L-Lys(NAloc)-OH、Fmoc-L-Asp(OAllyl)＝OH、Fmoc-L-Glu(ODmab)-OH、Fmoc-L-Dap(NAloc)-OH、Fmoc-L-Lys(ivDde)-OH的特定保护氨基酸和包括HATU、HOBt、PyBOP在内的化学品购自Chemimpex Inc.。2-CTC树脂购自ChemPep。EDT、DIEA、DCM、TIPS、DMBA、Pd(PPh3)4、碘、哌啶、ACh、氯化钾、人血清和BSA购自Sigma Aldrich。DMF、TFA、乙酸、ACN和乙醚购自Fisher Scientific。奥沙利铂购自MedChemExpress。
动物。对动物的所有实验程序均按照NIH实验室动物护理和使用指南进行，并且根据犹他大学的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittees)(IACUC)批准的协议进行。用于两个电极电压钳实验的非洲爪蟾卵母细胞获自非洲爪蟾一号(Xenopus One)。用于奥沙利铂实验的小鼠是CBA/CaJ近交系，可从JacksonLaboratory获得。所有努力都是为了减少使用的动物数量并且尽量减少程序期间的痛苦。
实施例2-A：RgIA亚甲基硫缩醛类似物的化学合成和表征
方法：
芋螺毒素类似物的合成。固相肽合成。使用2-CTC树脂，如前所述通过在合成仪(Syzo I)上使用自动Fmoc-SPPS化学合成线性肽。
裂解和纯化。通过用混合物(鸡尾酒，cocktail)缓冲液(TFA:H2O:TIPS:EDT＝95:2:2:1，3.0mL/0.1mmol)处理2.5h，将肽从树脂上切下。然后将获得的肽-TFA溶液经由塑料过滤器过滤并沉淀到冷乙醚(40mL)中并在-20℃下冷却30min，然后通过离心成团(pelleted，沉淀)。粗肽用冷乙醚(30mL)洗涤以除去残留的TFA并在真空中干燥。然后在Agilent 1260HPLC系统上，用含0.1％TFA的H2O/ACN梯度，在40分钟内从5％到45％ACN，以3.0mL/min在Jupiter 5μC18(250x10mm)柱上进行RP-HPLC，将粗产物纯化。收集含有目标产物的纯化级分并且通过冷冻干燥机(Labconco)冻干。
LC/MS分析。在Agilent 1260Quadrupole LC/MS系统上，用含0.1％甲酸的H2O/ACN梯度，以0.4mL/min流速在Phenomenex Gemini C18 3.0μm(150x3mm)柱上，通过LC/MS对肽进行表征。HPLC纯化级分、最终产品的纯度检查、稳定性测定也通过LC/MS进行分析。
亚甲基硫缩醛形成。使用Cramer报道的方案进行反应。将纯化的线性肽溶解在H2O中，并且用在H2O(19.0mM)中预先混合的TCEP.HCl(2.0eq.)和K2CO3(4.0eq.)处理。将混合物在室温下轻轻搅拌2h。然后将Et3N(10.0eq.380mM在THF溶液中)添加到混合物，然后添加CH2I2(6.0eq.230mM溶解在THF中)。使该混合物在室温下反应直至线性肽在约6h内完全转化(注意：较长的反应时间可能导致RP-HPLC上的宽峰，这可能是由氨基酸消旋化引起的；在大规模准备中可以添加5％DMSO)。I2介导的二硫化物形成。向AcOH中的搅拌的bis-Acm-保护肽溶液(aq.25％，1.0mM)添加AcOH(5.0mg/mL)中的I2(10.0eq.)。将反应在室温下搅拌10min并且通过LC-MS监测。通过添加1.0M抗坏血酸溶液来淬灭过量的I2直至无色，然后通过RP-HPLC纯化混合物以提供肽。在NMR分析和生物测定之前，所有完全折叠的肽都通过RP-HPLC鉴定为≥95％的纯度。
肽表征。分子量通过ESI-MS[M+H]+和[M+2H]2+测量，RgIA-5617：计算值1705.6853.3，实测值1705.4 853.2；RgIA-5533：计算值1705.6 853.3，实测值1705.4 853.4；RgIA-5618，计算值1719.7 860.4，实测值1719.6 860.4；RgIA-5524，计算值1874.9 937.9，实测值1874.4，937.5；RgIA-5573，计算值1768.8 884.9，实测值1768.5 884.9。
结果与讨论：
如图7a-A、7a-B、7a-C、7a-D所示，通过在2-氯代三苯甲基氯(2-CTC)树脂上使用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)固相肽合成(SPPS)，然后通过双操作和区域选择性分子内键形成反应，实现RgIA类似物的化学合成。正确的支架折叠是CysI-CysIII、CysII-CysIV或其相应的具有相同连接性的亚甲基硫缩醛替代物。键明确地按如下顺序形成：1)通过裂解去除三苯甲基(Trt)后在游离Cys上形成亚甲基硫缩醛，2)经由原位氧化乙酰氨基甲基(Acm)脱保护偶联过程形成二硫键，以及3)重复亚甲基硫缩醛形成以生成双-亚甲基硫缩醛取代的类似物。详细地，在从2-CTC树脂上裂解组装的肽链后，可以通过在三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP.HCl)、碳酸钾和三甲胺(Et3N)的存在下用二碘甲烷处理来去除Trt保护并且形成目标亚甲基硫缩醛键。这种操作转化可以在一个批次中以大至300mg的规模进行，从而允许大量制备目标肽用于进一步研究。第二二硫键可以在Acm脱保护后通过在25％乙酸水溶液(AcOH)中的过量碘处理而形成，以产生完全折叠的肽。如本文所述合成RgIA和RgIA4。所有肽均纯化为RP-HPLC指示的≥95％纯度，并且如图7B-a和7B-b、表2A-1所示的NMR研究和生物测定和如图7c至7g所示的LC色谱图之前，通过ESI-MS分析最终产物。
表2A-1
a通过ESI质谱确定的。b通过RP-HPLC确定的。
实施例2-B：RgIA亚甲基硫缩醛类似物的体外生物学评估
方法：
双电极电压钳(TEVC)记录。我们遵循以下方法。简而言之，非洲爪蟾卵母细胞用于异源表达克隆的大鼠或人nAChR亚型。注射后1-3天进行记录。在30μL卵母细胞室中，卵母细胞被电压钳制在-70mV的膜电位，卵母细胞室用含有0.1mg/mL BSA的ND-96缓冲液，以2-4mL/min的流速重力灌注。应用每分钟1s ACh(所有亚型100μM，除了200μM的α7和10μM的肌肉亚型)脉冲以建立基线。然后切换含有不同浓度测试肽的ND96溶液并且测量Ach应答，直到达到稳定状态。所有记录均在室温下生成，并且重复进行3-6次独立实验。使用GraphPadPrism软件进行数据分析，并且使用非线性回归S形剂量应答计算包括所得IC50在内的值。
结果与讨论：
通过双电极电压钳(TEVC)电生理学对非洲爪蟾卵母细胞中异源表达的人α9α10nAChRs测试了所有合成类似物的生物活性。为了确定亚甲基硫缩醛作为RgIA系列中二硫化物替代物的相容性，合成并测试了如图8a-A中描绘的具有不同亚甲基硫缩醛替代物的一组类似物。IC50值通过浓度应答分析确定，如图8a-B所示。相比之下，由于对人类受体的低亲和力，天然RgIA抑制由人类α9α10 nAChRs介导的ACh诱发电流，其中IC50值为510nM。
当将亚甲基硫缩醛引入到经过修饰的RgIA类似物RgIA4的序列中时，产生不同的影响。具体地，环II[CysII-CysIV]二硫化物被亚甲基硫缩醛交换的RgIA-5533具有低纳摩尔效力(IC50＝6.1nM)。相反，对于类似物RgIA-5617，随着亚甲基硫缩醛功能移动到环I[CysI-CysIII]，效力显著降低(IC50＝880nM)。当RgIA-5618中的两种二硫化物被替换时，活性进一步被消除(IC50>10μM)。这些数据表明，RgIA中的环II二硫化物[CysII-CysIV]可以用亚甲基硫缩醛进行修饰，而另一个位置[CysI-CysIII]的取代则消除了对人α9α10nAChRs的活性。结果与联咔唑(dicarba)修饰的RgIA类似物的开创性研究一致，其中[CysII-CysIV]-联咔唑(dicarba)RgIA的反式/顺式异构体维持大大降低的对α9α10 nAChR的活性，而[CysI-CysIII]-联咔唑(dicarba)类似物完全不具活性。同样，[CysI-CysIII]二硫化物对结构和活性的影响也通过分析缺乏二硫化物的类似物在另一个α-4/3-CTxs ImI中得到证实。RgIA-5533用基于RgIA5的突变体以及非规范氨基酸β-高酪氨酸(bhTyr)进行了修饰，以提供有效力的类似物RgIA-5524，其中IC50值为0.9nM。bhTyr与β-丙氨酸(bAla)的单残基突变产生了类似物RgIA-5573，其效力较弱(IC50＝2.9nM)，表明13位残基上的酚类部分的作用。
研究了RgIA-5533和RgIA-5524的亚型选择性。双电极电压钳(TEVC)电生理学显示，两种类似物在10μM(IC50>10μM)时均无法抑制多种nAChR亚型，包括α1β1δε、α2β2、α2β4、α3β2、α3β4α4β2、α4β4、α6/α3β2β3和α6/α3β4，如图8a-C和图8b所示。浓度应答分析表明，RgIA-5533和RgIA-5524均对α7 nAChR表现出纳摩尔IC50S，但仍对hα9α10nAChR的选择性大于200倍，如图8a-D所示。使用[125I]α-银环蛇毒素(α-Btx)作为放射配体经由竞争结合测定测试RgIA-5524，表明RgIA-5524在10μM水平下产生41％的抑制，与其对hα7 nAChR亚型的低效力一致，如图8a-C和图8a-D中所示。
实施例2-C：RgIA-5524的体内缓解疼痛功效
方法：
体内镇痛活性评价。神经性疼痛模型。对所有动物实验程序均按照NIH实验室动物护理和使用指南进行，并且根据犹他大学的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的协议进行。一切努力都是为了最小化痛苦。雄性CBA/CaJ小鼠(2-3个月大)注射奥沙利铂。对于慢性施用组，以3.5mg/kg每周5天i.p.施用奥沙利铂，持续21天的周期。对于急性施用组，以单次剂量给予5.0mg/kg奥沙利铂或10.0mg/kg奥沙利铂。0.9％盐水用作运载体对照。
冷板测试。使用热/冷板(IITC Life Science)进行冷板测试。小鼠被允许适应测试室，直到调查行为平息。然后使用线性斜坡(10℃/min)将板温度从室温降低。记录第一次疼痛相关行为(抬起和舔后爪)的时间和温度。评分者对药物和小鼠基因型是未知的(blind)。数据的统计评估通过单向方差分析(ANOVA)进行，然后进行Dunnett的多重比较检验。所有结果表示为平均值±SEM(n＝8-12)。P值为*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001，差异显著。
结果与讨论：
化疗诱导的神经性疼痛是铂基药物的主要剂量限制性副作用。目前，奥沙利铂诱导的神经性疼痛的病理生理学研究仍很少，并且没有批准的药物用于预防这种剂量限制性不良后果。使用奥沙利铂诱导的小鼠外周神经性疼痛模型评估RgIA-5524的体内镇痛活性，如图9所示。冷痛觉超敏是奥沙利铂的致残副作用。这种副作用的大小和时间过程是剂量依赖性的。每天重复注射RgIA-5524防止化疗引起的神经性疼痛的发展。奥沙利铂(i.p.3.5mg/kg，每周5天)在治疗第21天时产生显著的冷痛觉超敏，如在冷板上显著减少缩爪延迟所示。相比之下，接受40μg/kg RgIA-5524的奥沙利铂治疗小鼠没有出现痛觉超敏。
我们接下来在野生型和α9KO小鼠中进行了单次注射奥沙利铂治疗研究。结果表明，如Sal/Sal vs Ox/Sal和Ox/RgIA-5524 vs Ox/Sal的WT组之间的显著差异所指示的，RgIA-5524在奥沙利铂治疗(s.c.5.0mg/kg和10.0mg/kg)后5天有效地逆转急性冷痛觉超敏，如图10A和图10C所示。然而，这种效应并未发生在α9KO小鼠组中，其中在Ox/RgIA-5524vs Ox/Sal的α9KO组之间没有观察到显著性，如图10B和图10D所示。该KO实验表明，RgIA-5524对α9α10 nAChR的阻断能够预防或减轻化疗诱导的神经性疼痛。
实施例2-D：RgIA-5524的体外药理学、毒性和代谢测定
方法：
体外药理学测定。通常，RgIA-5524最初在测定中以10μM的默认浓度一式四份进行测试。当RgIA-5524阻断高于50％的放射性配体结合时，进行二次测定以确定浓度-应答曲线。
竞争结合和酶分析。在不存在或存在RgIA-5524的情况下，将细胞膜匀浆与放射性配体一起温育。非特异性结合是在目标处存在特定激动剂或拮抗剂的情况下确定的。温育后，样品在真空下通过预先浸泡在缓冲液中的玻璃纤维过滤器快速过滤，并且使用48样品或96样品细胞收集器用冰冷缓冲液冲洗几次。然后使用闪烁混合物在闪烁计数器中计数过滤器的放射性。
hERG K+通道抑制测定。在人类hERG转染的CHO-K1细胞上的自动全细胞膜片钳(Qpatch 16)被用于记录外向钾电流。在22℃下实现全细胞配置后，细胞保持在-80mV。递送50ms的脉冲至-40mV以测量泄漏电流。然后将细胞去极化至+20mV持续2s，然后是1s脉冲至-40mV以显示hERG K+尾电流。该范例每5s递送一次，以监测当前振幅。首先应用细胞外溶液，然后依次在同一细胞上应用RgIA-5524溶液。E-4031作为参考配体进行了测试。
RgIA-5524在GABAB1b受体上的功能研究。细胞悬浮在DMEM缓冲液中，然后被分配在微孔板中。Fluo4 NW与丙磺舒(probenicid)在补充有20mM Hepes的HBSS缓冲液(pH7.4)中混合，然后将其添加到每个孔中，并且在37℃下与细胞平衡60min，然后在22℃下平衡15min。此后，将测定板置于酶标仪中，加入一种浓度(刺激对照)或多种浓度(EC50或IC50测定)下的参考激动剂或拮抗剂(3-APMPA)，并且测量根据游离细胞溶质Ca2+离子浓度按比例变化的荧光强度变化。
CYP酶异构体抑制测定。RgIA-5524在PBS 7.4中与NADPH生成系统在37℃干燥培养箱中预温育5min。通过添加CYP酶亚型、底物和BSA的混合物来启动反应。在温育期之前和之后读取每个孔中的荧光。通过减去对照的百分比来计算抑制百分比。
结果和讨论：
我们经由广泛的体外药理学测定进一步证明了最有效力的类似物RgIA-5524是有前途的非阿片样物质镇痛剂候选物。首先，我们在广泛范围的各种疼痛相关受体和离子通道上测试了RgIA-5524。如图11a-A中总结的，在10μM水平，RgIA-5524对这些潜在目标，包括阿片样物质受体、NMDAR、BZD、OCT受体和各种电压门控离子通道(Na+、K+和Ca2+)，显示了低活性或无活性(<50％抑制)。对N型Ca2+通道测试RgIA-5524显示在10μM时具有58.4％抑制的低效力，而进一步的浓度应答分析表明微摩尔亲和力太低而无法解释镇痛活性。利用细胞介电光谱测定，我们还证明RgIA-5524没有在GABAB1b受体上显示任何浓度依赖性激动剂或拮抗剂作用，这已成为RgIA镇痛的假定机制，如图11a-B、图11a-D和图11a-E所示。结合上述体内α9KO小鼠研究，结果有力地证明，拮抗含α9的nAChRs是观察到的RgIA-5524镇痛作用的主导机制。
药物诱导的心脏毒性已成为近几十年来导致停药的主要原因之一，这与人体ether-a-go-go相关基因(hERG)K+通道的阻断密切相关。自动化全细胞膜片钳测定没有显示心血管易感性的证据，其中RgIA-5524在100μM的高浓度下引起<25％的抑制，如图11a-B和图11a-F所示。同时，RgIA-5524在一组酶和摄取测定——包括乙酰胆碱酯酶和MAO——中无活性，乙酰胆碱酯酶和MAO可用于多种神经退行性障碍，如图11a-C所示。最后，我们评估了RgIA-5524影响药物-药物相互作用的潜力；在10μM下没有观察到针对大量CYP酶同工型的抑制，如图11a-G所示。
实施例2-E：NMR光谱和结构分析
方法：
结构分析。NMR光谱。肽样品(以2.0mM的浓度制备，溶解在具有20mM Na2HPO4、50mMNaCl、50μM NaN3和0.1mM EDTA的含10％D2O的缓冲液pH 3.5中，未校正同位素效应)在Inova600MHz光谱仪上在298K下记录。使用TOCSY(80ms)、NOESY(200ms)、g11-NOESY、gCOSY和HSQC实现二级结构测定。激发塑型方案用于水抑制。使用NMRPipe和SPARKY分析光谱。使用PyMOL程序准备分子表示(representation)。TOCSY(蓝色)和NOESY(红色)的酰胺区域与HSQC脂肪族区域和芳香族区域的叠加。使用SPARKY进行分配。参见例如图11b至图11j和表2E-1、表2E-2和表2E-3(其中Scs＝L-S-亚甲基-半胱氨酸；Cit＝L-瓜氨酸，Tiy＝L-3-碘-酪氨酸)。
表2E-1：RgIA-5533
表2E-2：RgIA-5617
表2E-3：RgIA-5524
结构计算。使用CYANA 3.0和TALOS程序预测的主链二面角约束，从二维光谱计算三维结构。非典型氨基酸(L-瓜氨酸、L-3-碘-酪氨酸、L-S-亚甲基-半胱氨酸和L-β-高酪氨酸)是使用如前所述CYANA 3.0基于它们相应的天然氨基酸构建的。从总共200个计算结构中选择了20个最低的能量系综(ensemble)来进一步分析Cα距离测量。20个最低能量结构的系综叠加在骨架原子(N、O、Cα和Hα)上，显示为棒状，其中省略了氢并且显示了计算统计数据，如图11j至图11m所示。
结果和讨论：
对修饰的类似物进行NMR研究以比较和对比结构特征。包括RgIA-5533、RgIA-5617和RgIA-5524在内的类似物通过包括TOCSY、NOESY、COSY和HSQC的同核2D 1H-NMR光谱进行分析。实现了除N-末端Gly1伯胺外的所有残基的分配。在所有研究的分子中，根据从Asp5 Hα到Pro6 Hδ观察到的强NOE，Pro4被鉴定为反式构象。Hα二次位移分析用于评估二级结构元素中的任何变化。一般地，二次Hα位移证实RgIA-5533、5524和5617都维持了球状构象。在包括Asp5-Pro6-Arg7和Arg/Cit9-Tyr/iTyr10-Gln/Arg11片段在内的残基中观察到细微的变化。从Ha二次化学位移观察到，与天然二硫化物键合的RgIA和RgIA4相比，有效力的类似物RgIA-5533、RgIA-5524或无活性RgIA-5617之间没有明显差异。主要由于末端柔韧性，单个肽的C-末端存在轻微偏差，如图12A所示。
这些类似物的三维NMR溶液结构是使用CYANA 3.0计算的，其中原子距离和二面角限制从g11-NOESY和NOESY(200ms)光谱生成。基于Hα、Cα、Cβ和酰胺氢(HN)化学位移通过TALOS程序预测了包括ψ和χ1的主链二面角限制。以低RMSD获得了20个最低能态系综(energy state ensemble)。与先前报道的RgIA结构(NMR溶液结构PDB2JUQ和共晶提取物PDB 6HY7)和RgIA4一起，选择“最接近平均值”的能态来代表每个肽，并且如图12B、图12C、图12D、图12E、图12F和图12G所示，其中通过PyMOL程序测量半胱氨酸对的平均Cα距离。所有亚甲基硫缩醛修饰的肽都维持与RgIA和RgIA4非常相似的球形构象。RgIA-5617和有效力的类似物(RgIA4、RgIA-5533和5524)之间的最显著的区别是半胱氨酸对的Cα距离。与其他分子(平均/>)相比，RgIA-5617中两个半胱氨酸对的Cα距离明显缩短(在半胱氨酸环I和环II中平均值分别为4.8和/>)。类似物RgIA-5617和RgIA-5618效力丧失的一个潜在原因是在环I二硫化物[CysI-CysIII]中插入CH2基团，迫使这些环I修饰类似物中的构象“收缩”以适应二面角和扭转角度变化，其降低了它们的结合亲和力。MD刺激还提出，RgIA类似物中的环I二硫化物可能通过与α9(+)表面的C-环二硫化物直接接触，为受体提供堆积相互作用。因此，该环上的亚甲基硫缩醛替代可能通过干扰该结合位点而导致效力损失，这可能是另一个促成因素，尽管它们的二级结构扰动很小。
实施例2-F：体外稳定性测定
方法：
稳定性测定。将测试肽以1.0mg/mL的浓度溶解在PBS 7.4中作为储备液，并且用人血清(AB型，Sigma-Aldrich)或含有还原型谷胱甘肽(10当量)的PBS 7.4进一步稀释成最终测试肽浓度为0.1mg/mL。然后将稀释的溶液在37℃下温育，并且在预定时间点取出部分混合物用于RP-HPLC分析。通过加入等体积的ACN变性去除血清蛋白，在冰上冷却10min，然后以13,000g离心10min。收集上清液并通过RP-HPLC进行分析。每个时间点的稳定性计算为RP-HPLC上处理过的肽峰(220nm)的面积作为0h处理过的肽面积的百分比。每个实验一式三份进行。通过学生t(未配对)测试分析数据。对于每个时间点的显著差异，P值为**P<0.01，***P<0.001。
结果和讨论：
通常，二硫键折叠的肽和蛋白质具有刚性结构，其导致对蛋白酶的稳定性相对增强。然而，人血清中的游离还原硫醇可以通过加扰而干扰富含半胱氨酸的肽的二硫键连接，从而导致酶促降解和效力丧失。为了确定亚甲基硫缩醛如何影响RgIA4的代谢稳定性，进行了RgIA-5544和RgIA-5533的体外人血清稳定性测定。肽(0.1mg/mL在90％人血清AB型中)在人血清中在37℃下连续温育24小时，并且在温育后时间点0、1、2、4、8和24h通过RP-HPLC测定剩余肽的量。如图13A所示，RgIA4迅速加扰进入其异构体RgIA4[1,4]，并且以小于25％的球状RgIA4结束，这与我们之前的观察结果一致。RgIA-5533明显比RgIA4更稳定，其中超过70％的肽即使在温育24h后也是完整的。与RgIA-5533相比，RgIA-5524的稳定性稍差，这可能是由于其可被胰蛋白酶切割的较高富含精氨酸的序列，如图13B所示。此外，当引入亚甲基硫缩醛时，实现了完全的二硫化物加扰抑制。我们还评估了在生理pH下存在还原型谷胱甘肽(GSH)的情况下，RgIA-5524对RgIA4的稳定性。与人血清降解结果相似，RgIA-5524中的单一亚甲基硫缩醛替代能够很大程度上抑制二硫化物加扰，如图13C所示。总体上，RgIA-5524表现出显著增强的稳定性，这使其成为更具吸引力和有前途的候选者用于进一步开发。
实施例2-G：材料和方法
化学品。所有化学品均购入并且直接使用，无需进一步纯化。Fmoc保护的氨基酸和试剂购自Chemimpex、Thermal Fischer和Sigma Aldrich。卵母细胞。用于双电极电压钳实验的非洲爪蟾卵母细胞购自非洲爪蟾一号。小鼠。用于体内测定的CBA/CaJ近交系小鼠(2-3周，雄性)获自杰克逊实验室。
虽然为该技术呈现的流程图可能暗示了特定的执行顺序，但执行顺序可能不同于所示例的。例如，可以相对于所示顺序重新排列另外两个方框的顺序。进一步，可以并行或部分并行地执行连续显示的两个或更多方框。在一些配置中，可以省略或跳过流程图中所示的一个或多个方框。出于增强实用程序、计数、性能、测量、故障排除或出于类似原因的目的，可以将任意数量的计数器、状态变量、警告信号量或消息添加到逻辑流。
贯穿本说明书对“实例”的引用意味着结合该实例描述的特定特征、结构或特性被包括在本公开的至少一个实施方式中。因此，贯穿本说明书各处出现的短语“在实例中”不一定都指代相同的实施方式。
参考了附图中示例的实例并且本文使用特定的语言来描述相同的内容。然而应当理解，并不因此意在限制本技术的范围。本文示例的特征的改变和进一步修改以及本文示例的实例的附加应用将被认为在描述的范围内。
此外，所描述的特征、结构或特性可以在一个或多个实例中以任何合适的方式组合。在前面的描述中，提供了许多具体细节，如各种构型的实例以提供对所描述技术的实例的透彻理解。然而，将认识到，可以在没有具体细节中的一个或多个的情况下，或使用其他方法、组件、装置等来实践该技术。在其他情况下，未详细显示或描述众所周知的结构或操作，以避免混淆该技术的方面。
尽管已经用针对结构特征和/或操作的语言描述了主题，但是应当理解，所附权利要求中定义的主题不一定限于上述特定特征和操作。相反，上述具体特征和行为是作为实施权利要求的实例形式公开的。在不脱离所描述技术的精神和范围的情况下，可以设计出许多修改和替代布置。
上述详细描述参考具体示例性实施方式描述了本公开。然而，应当理解，在不脱离如所附权利要求中阐述的本公开的范围的情况下，可以进行各种修改和改变。详细描述和附图应被视为仅仅是示例性的，而不是限制性的，并且所有这样的修改或改变，如果有的话，意在落入本文描述和阐述的本公开的范围内。
序列表
<110> 犹他大学研究基金会
<120> 构象受限的α-RGIA类似物
<130> 00846-U6996.PCT
<150> 63/034,395
<151> 2020-06-03
<160> 25
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<400> 1
Gly Cys Cys Ser Asp Pro Arg Cys Arg Tyr Arg Cys Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 瓜氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 3-碘-酪氨酸
<400> 2
Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Tyr
1 5 10
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(2)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(12)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(15)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<400> 3
Xaa Xaa Cys Cys Xaa Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> E或D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(12)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> K 或 Dap
<400> 4
Xaa Xaa Cys Cys Xaa Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> E 或 D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(11)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> K 或 Dap
<400> 5
Xaa Xaa Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Tyr Xaa
1 5 10 15
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> E 或 D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> G 或 bA
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> R 或 (Cit)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Y 或 (iY)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> K 或 Dap
<400> 6
Xaa Xaa Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Tyr Xaa
1 5 10 15
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 瓜氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> L-2,3-二氨基丙酸
<400> 7
Asp Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Tyr Gln Cys Tyr Xaa
1 5 10 15
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 瓜氨酸
<400> 8
Asp Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Tyr Gln Cys Tyr Lys
1 5 10 15
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 瓜氨酸
<400> 9
Glu Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Tyr Gln Cys Tyr Lys
1 5 10 15
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> β-丙氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 瓜氨酸
<400> 10
Glu Xaa Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Tyr Gln Cys Tyr Lys
1 5 10 15
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 瓜氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> 3-碘-酪氨酸
<400> 11
Glu Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Tyr Lys
1 5 10 15
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> 3-碘-酪氨酸
<400> 12
Glu Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Arg Xaa Gln Cys Tyr Lys
1 5 10 15
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(11)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<400> 13
Xaa Cys Cys Xaa Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa
1 5 10
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> (Cit) 或阳性氨基酸 (His、Arg、或Lys)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 芳香族氨基酸 (Phe、Tyr、或Trp)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> 阳性氨基酸 (His、Arg、或Lys)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 芳香族氨基酸 (Phe、Tyr、或Trp)
<400> 14
Xaa Cys Cys Xaa Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa
1 5 10
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(10)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<400> 15
Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Xaa
1 5 10
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 瓜氨酸 或 Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> iY 或 Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> bhY, Y, 或 bA
<400> 16
Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Xaa
1 5 10
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 瓜氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 3-碘-酪氨酸
<400> 17
Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 瓜氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 3-碘-酪氨酸
<400> 18
Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Tyr
1 5 10
<210> 19
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 瓜氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 3-碘-酪氨酸
<400> 19
Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Tyr
1 5 10
<210> 20
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(11)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(14)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<400> 20
Xaa Cys Cys Xaa Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa
1 5 10
<210> 21
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> (Cit) 或 阳性氨基酸 (His、Arg、或Lys)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 芳香族氨基酸 (Phe、Tyr、或Trp)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> 阳性氨基酸 (His、Arg、或Lys)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> 芳香族氨基酸 (Phe、Tyr、或Trp)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<400> 21
Xaa Cys Cys Xaa Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa
1 5 10
<210> 22
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(10)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(14)
<223> 除半胱氨酸以外的任何氨基酸
<400> 22
Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Xaa Xaa
1 5 10
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> 瓜氨酸 或 Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> iY 或 Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> bhY, Y, 或 bA
<400> 23
Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Xaa Xaa Gln Cys Xaa Arg
1 5 10
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 3-碘-酪氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> L-β-高酪氨酸
<400> 24
Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Arg Xaa Gln Cys Xaa Arg
1 5 10
<210> 25
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成结构
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 3-碘-酪氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> β-丙氨酸
<400> 25
Gly Cys Cys Thr Asp Pro Arg Cys Arg Xaa Gln Cys Xaa Arg
1 5 10

Claims (85)

1.α-RgIA4肽类似物，其包含：
识别指区域，所述识别指区域被配置以结合α9α10烟碱型乙酰胆碱受体；和
侧链键合构型，所述侧链键合构型保护半胱氨酸间硫键，
其中所述类似物具有对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的结合亲和力，所述结合亲和力是α-RgIA4肽的结合亲和力的至少2.5％。
2.具有由受保护的半胱氨酸间硫键维持的结构的α-RgIA4肽类似物，所述结构提供对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的结合亲和力，所述结合亲和力是α-RgIA4肽结合亲和力的至少2.5％。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的α-RgIA4肽类似物，其中对所述α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的结合亲和力为：
所述α-RgIA4肽的结合亲和力的至少5％，或
所述α-RgIA4肽的结合亲和力的至少7.5％，或
所述α-RgIA4肽的结合亲和力的至少15％，或
所述α-RgIA4肽的结合亲和力的至少25％，或
所述α-RgIA4肽的结合亲和力的至少40％，或
所述α-RgIA4肽的结合亲和力的至少50％，或
所述α-RgIA4肽的结合亲和力的至少80％，或
基本上等于所述α-RgIA4肽的结合亲和力，或
大于所述α-RgIA4肽的结合亲和力。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的α-RgIA4肽类似物，其中与α-RgIA4肽的效力相比，所述受保护的半胱氨酸间硫键提供增加的效力。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物提供了α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值，其是：
基本上等于所述α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值，或
不大于所述α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的2.0倍，或
不大于所述α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的3.0倍，或
不大于所述α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的5.0倍，或
不大于所述α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的15.0倍，或
不大于所述α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的25.0倍。
6.根据权利要求1或权利要求2所述的α-RgIA4肽类似物，其中与α-RgIA4肽或没有受保护的半胱氨酸间硫键的α-RgIA4肽类似物相比，所述受保护的半胱氨酸间硫键减少二硫键加扰、二硫键降解中的一种或多种，或其组合。
7.根据权利要求1所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述侧链键合构型包括亚甲基硫缩醛、用内酰胺桥环化到C端氨基酸侧链的N端氨基酸侧链中的一种或多种，或其组合。
8.根据权利要求7所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述侧链键合构型是包含CII和CIV之间的半胱氨酸间键的亚甲基硫缩醛。
9.根据权利要求7所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述侧链键合构型是用内酰胺桥环化到C-末端氨基酸侧链的N-末端氨基酸侧链。
10.根据权利要求9所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述N-末端氨基酸选自谷氨酸和天冬氨酸。
11.根据权利要求9所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述C-末端氨基酸选自赖氨酸和L-2,3-二氨基丙酸。
12.根据权利要求9所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述N-末端氨基酸是谷氨酸并且所述C-末端氨基酸是赖氨酸。
13.根据权利要求1或权利要求2所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述受保护的半胱氨酸间硫键为在人血清中的所述α-RgIA4肽类似物提供稳定性，其大于在人血清中的α-RgIA4肽的稳定性，其中通过在90％人血清AB型中温育0.1mg/mL的所述α-RgIA4肽类似物或所述α-RgIA4肽并且在37℃下温育1、2、4、8、24、48或72小时中的至少一个后剩余的量，来测量在所述人血清中的所述稳定性。
14.根据权利要求13所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述α-RgIA4肽类似物在人血清中的稳定性可以大于所述α-RgIA4肽在人血清中的稳定性的10％、20％、40％、60％、80％、100％、200％、300％、400％、500％或1000％中的至少一个或多个。
15.根据权利要求1或权利要求2所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述受保护的半胱氨酸间硫键为在还原型谷胱甘肽中的所述α-RgIA4肽类似物提供稳定性，其大于在还原型谷胱甘肽中的α-RgIA4肽的稳定性，其中通过在pH为7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的10当量还原型谷胱甘肽中，温育0.1mg/mL的所述α-RgIA4肽类似物或所述α-RgIA4肽并且在37℃下温育1、2、4、8、24、48或72小时中的至少一个后剩余的量，来测量在所述还原型谷胱甘肽中的所述稳定性。
16.根据权利要求15所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述α-RgIA4肽类似物在所述还原型谷胱甘肽中的稳定性大于所述α-RgIA4肽在所述还原型谷胱甘肽中的稳定性的10％、20％、40％、60％、80％、100％、200％、300％、400％、500％、或1000％中的至少一个或多个。
17.根据权利要求1或权利要求2所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述受保护的半胱氨酸间硫键提供α9α10烟碱型乙酰胆碱受体选择性，其基本上等于α-RgIA4肽的所述α9α10烟碱型乙酰胆碱受体选择性。
18.根据权利要求1或权利要求2所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述受保护的半胱氨酸间硫键提供α9α10烟碱型乙酰胆碱受体选择性，其与不同烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)亚型的选择性相比，对所述α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的选择性高5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或200倍中的至少一个或多个。
19.根据权利要求18所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述不同nAChR亚型选自：α1β1δε、α2β2、α2β4、α3β2、α3β4α4β2、α4β4、α6/α3β2β3和α6/α3β4。
20.根据权利要求1或权利要求2所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述受保护的半胱氨酸间硫键提供安全性，其基本上等于或大于α-RgIA4肽的安全性，其中所述安全性通过以下一项或多项来测量：
如自动化全细胞膜片钳测定所测量的，以浓度100μM存在的所述类似物抑制低于25％的人类ether-a-go-go相关基因(hERG)K+通道，
或如通过单胺氧化酶(MAO)测定所测量的，以浓度100μM存在的所述类似物具有小于约20％的抑制活性，或
如在CYP测定中测量的，以浓度10μM存在的所述类似物具有小于20％的抑制活性。
21.根据权利要求1或权利要求2所述的α-RgIA4肽类似物，其中受所述保护的半胱氨酸间键是CI和CII、CIII和CIV之间的半胱氨酸间键中的一个或多个，或其组合。
22.根据权利要求2所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述结构是球状的。
23.α-RgIA4肽类似物，其包含：
包含D P R的识别指区域；和
包含CI、CII、CIII和CIV的胱氨酸残基，其中：
CI和CIII通过第一半胱氨酸间硫键连接，并且
CII和CIV通过第二半胱氨酸间硫键连接；
并且
其中至少所述第二半胱氨酸间硫键被侧链键合构型保护。
24.根据权利要求23所述的α-RgIA4肽类似物，其中：
所述第二半胱氨酸间硫键包含亚甲基硫缩醛，
可通过内酰胺桥环化至C-末端氨基酸侧链的N-末端氨基酸侧链，或
其组合。
25.根据权利要求23所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述第二半胱氨酸间硫键包含亚甲基硫缩醛。
26.根据权利要求25所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物包含氨基酸序列Xaa1 CC Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5 C Xaa6(SEQ ID NO:13)，其中Xaa1-6是除C之外的任何氨基酸。
27.根据权利要求26所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物包含氨基酸序列Xaa1 CC Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5 C Xaa6(SEQ ID NO:14)，其中：
Xaa1是除C之外的任何蛋白源性或非蛋白源性氨基酸，
Xaa2是除C之外的任何蛋白源性或非蛋白源性氨基酸，
Xaa3是选自以下的成员：(Cit)或任何蛋白原性或非蛋白原性阳性氨基酸，
Xaa4是任何蛋白源性或非蛋白源性芳香族氨基酸，
Xaa5是任何蛋白源性或非蛋白源性阳性氨基酸，并且
Xaa6是任何蛋白源性或非蛋白源性芳香族氨基酸。
28.根据权利要求25所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物包含氨基酸序列Xaa1 CC Xaa2 D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5 C Xaa6 Xaa7(SEQ ID NO:20)，其中Xaa1-7是除C之外的任何氨基酸。
29.根据权利要求28所述的α-RgIA4肽类似物，类似物可包含氨基酸序列Xaa1 C C Xaa2D P R C Xaa3 Xaa4 Xaa5 C Xaa6 Xaa7(SEQ ID NO:21)，其中：
Xaa1是除C之外的任何蛋白源性或非蛋白源性氨基酸，
Xaa2是除C之外的任何蛋白源性或非蛋白源性氨基酸，
Xaa3是选自以下的成员：(Cit)或任何蛋白源性或非蛋白源性阳性氨基酸，
Xaa4是任何蛋白源性或非蛋白源性芳香族氨基酸，
Xaa5是任何蛋白源性或非蛋白源性阳性氨基酸，
Xaa6是任何蛋白源性或非蛋白源性芳香族氨基酸，并且
Xaa7是除C之外的任何蛋白源性或非蛋白源性氨基酸。
30.根据权利要求26所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物包含氨基酸序列G C CT D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6(SEQ ID NO:15)，其中Xaa1是G，Xaa2是T，Xaa5是Q，并且Xaa3、Xaa4或Xaa6是除C之外的任何氨基酸。
31.根据权利要求26所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物包含氨基酸序列G C CT D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6(SEQ ID NO:16)，其中：
Xaa3是选自(Cit)和R的成员，
Xaa4是选自(iY)和Y的成员，并且
Xaa6是选自(bhY)、Y和bA的成员。
32.根据权利要求26所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物包含氨基酸序列G C CT D P R C(Cit)(iY)Q C Y(SEQ ID NO:18)，其中：
Xaa3是(Cit)，
Xaa4是(iY)，和
Xaa6是Y。
33.根据权利要求28所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物包含氨基酸序列G C CT D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6 Xaa7(SEQ ID NO:22)，其中Xaa1是G，Xaa2是T，Xaa5是Q，并且Xaa3、Xaa4、Xaa6或Xaa7是除C之外的任何氨基酸。
34.根据权利要求28所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物包含氨基酸序列G C CT D P R C Xaa3 Xaa4 Q C Xaa6 Xaa7(SEQ ID NO:23)，其中：
Xaa3是选自(Cit)和R的成员，
Xaa4是选自(iY)和Y的成员，
Xaa6是选自(bhY)、Y和bA的成员，并且
Xaa7是R。
35.根据权利要求28所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物包含氨基酸序列G C CT D P R C R(iY)Q C(bhY)R(SEQ ID NO:24)，其中：
Xaa3是R，
Xaa4是(iY)，并且
Xaa6是(bhY)。
36.根据权利要求28所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物包含氨基酸序列G C CT D P R C R(iY)Q C(bA)R(SEQ ID NO:25)，其中：
Xaa3是R，
Xaa4是(iY)，并且
Xaa6是(bA)。
37.根据权利要求23所述的α-RgIA4肽类似物，进一步包含用内酰胺桥环化至C-末端氨基酸侧链的N-末端氨基酸侧链。
38.根据权利要求37所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述N-末端氨基酸选自谷氨酸和天冬氨酸。
39.根据权利要求37所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述C-末端氨基酸选自赖氨酸和L-2,3-二氨基丙酸。
40.根据权利要求37所述的α-RgIA4肽类似物，其中N-末端氨基酸是谷氨酸并且C-末端氨基酸是赖氨酸。
41.根据权利要求37所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物包含氨基酸序列Xaa8Xaa9C C Xaa10 D P R C Xaa11 Xaa12 Xaa13 C Xaa14 Xaa15(SEQ ID NO:3)，其中Xaa8-15是除C之外的任何氨基酸。
42.根据权利要求41所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物包含氨基酸序列Xaa8Xaa9C C Xaa10 D P R C Xaa11 Xaa12 Xaa13 C Xaa14 Xaa15(SEQ ID NO:4)，其中：
Xaa8是选自E和D的成员，
Xaa15是选自K和(Dap)的成员，
并且
Xaa9-14是除C之外的任何氨基酸。
43.根据权利要求41所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物包含氨基酸序列Xaa8Xaa9C C T D P R C Xaa11 Xaa12 Q C Y Xaa15(SEQ ID NO:5)，其中：
Xaa8是选自E和D的成员，
Xaa10是T，
Xaa13是Q，
Xaa14是Y，
Xaa15是选自K和(Dap)的成员，
并且
Xaa9、Xaa11或Xaa12是除C之外的任何氨基酸。
44.根据权利要求41所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物包含氨基酸序列Xaa8Xaa9C C T D P R C Xaa11 Xaa12 Q C Y Xaa15(SEQ ID NO:6)，其中：
Xaa8是选自E和D的成员，
Xaa9是G或(bA)，
Xaa11是R或(Cit)，
Xaa12是Y或(iY)，并且
Xaa15是选自K和(Dap)的成员。
45.根据权利要求41所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物包含氨基酸序列E G CC T D P R C(Cit)Y Q C Y K(SEQ ID NO:9)，其中：
Xaa8是E，
Xaa9是G，
Xaa11是(Cit)，
Xaa12是Y，并且
Xaa15是K。
46.根据权利要求41所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物包含氨基酸序列E(bA)CC T D P R C(Cit)Y Q C Y K(SEQ ID NO:10)，其中：
Xaa8是E，
Xaa9是(bA)，
Xaa11是(Cit)，
Xaa12是Y，并且
Xaa15是K。
47.根据权利要求41所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物可包含氨基酸序列E GC C T D P R C(Cit)(iY)Q C Y K(SEQ ID NO:11)，其中：
Xaa8是E，
Xaa9是G，
Xaa11是(Cit)，
Xaa12是(iY)，并且
Xaa15是K。
48.根据权利要求41所述的α-RgIA4肽类似物，其中所述类似物包含氨基酸序列E G CC T D P R C R(iY)Q C Y K(SEQ ID NO:12)，
其中：
Xaa8是E，
Xaa9是G，
Xaa11是R，
Xaa12是(iY)，并且
Xaa15是K。
49.组合物，其包含：
根据权利要求1、2或23中任一项所述的治疗有效量的类似物与药学上可接受的载体的组合。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述组合物适用于局部、经皮、静脉内或皮下施用。
51.根据权利要求50所述的组合物，其中所述组合物进一步包含其他的活性剂。
52.根据权利要求51所述的组合物，其中所述其他的活性剂是选自以下的成员：抗炎剂、麻醉剂、二级镇痛肽、非肽镇痛剂、及其组合。
53.根据权利要求49所述的组合物，其中所述其他的活性剂以约0.0001wt％至约10wt％的浓度存在。
54.根据权利要求49所述的组合物，其中所述组合物被配制为以下之一：溶液、悬浮液、乳液、凝胶、水凝胶、热敏凝胶、乳膏、软膏、糊剂、粘合剂、储液库、贴剂、或其组合。
55.根据权利要求50所述的组合物，其中所述组合物可以适用于皮下注射。
56.根据权利要求55所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括水、张度剂、缓冲剂、防腐剂中的一种或多种，或其组合。
57.维持α-RgIA4类似物中对于α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的α-RgIA4效力的方法，包括：
用维持处于α-RgIA4构型的类似物的识别指区域的侧链键合构型来保护半胱氨酸间硫键。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述类似物结合所述α9α10烟碱型乙酰胆碱受体，其亲和力为：
所述α-RgIA4肽的结合亲和力的至少5％，或
所述α-RgIA4肽的结合亲和力的至少7.5％，或
所述α-RgIA4肽的结合亲和力的至少15％，或
所述α-RgIA4肽的结合亲和力的至少25％，或
所述α-RgIA4肽的结合亲和力的至少40％，或
所述α-RgIA4肽的结合亲和力的至少50％，或
所述α-RgIA4肽的结合亲和力的至少80％，或
基本上等于所述α-RgIA4肽的结合亲和力，或
大于所述α-RgIA4肽结合亲和力。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述类似物抑制所述α9α10烟碱型乙酰胆碱受体，其IC50值是：
基本上等于所述α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值，或
不大于所述α-RgIA4肽的9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的2.0倍，或
不大于所述α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的3.0倍，或
不大于所述α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的5.0倍，或
不大于所述α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体IC50值的15.0倍，或
不大于所述α-RgIA4肽的α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的IC50值的25.0倍。
60.根据权利要求57所述的方法，其中保护所述半胱氨酸间硫键提供α9α10烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)选择性，其与不同nAChR亚型的选择性相比，对所述α9α10烟碱型乙酰胆碱受体的选择性多5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或200倍中的至少一个或多个。
61.根据权利要求57所述的方法，其中保护所述半胱氨酸间硫键提供所述α-RgIA4肽类似物在人血清中的稳定性，与α-RgIA4肽在人血清中的所述稳定性相比，高10％、20％、40％、60％、80％、100％、200％、300％、400％、500％或1000％中的至少一个或多个。
62.根据权利要求57所述的方法，其中保护所述半胱氨酸间键包括保护CII与CIII、CII与CIV之间的半胱氨酸间键中的一个或多个，或其组合。
63.根据权利要求62所述的方法，其中保护所述半胱氨酸间硫键包括在CII和CIV之间插入亚甲基硫缩醛。
64.根据权利要求57所述的方法，其中保护所述半胱氨酸间硫包括在N-末端氨基酸和C-末端氨基酸之间产生内酰胺桥。
65.用于治疗受试者中对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体结合有应答的状况的方法，其包括：
向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求48中所述的所述组合物。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述状况是疼痛。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述疼痛是神经性疼痛，包括以下的一种或多种：化学诱导的神经病(CIPN)、糖尿病性神经病、关节炎性神经病、骨关节炎性神经病、或其组合。
68.根据权利要求66所述的方法，其中所述疼痛是HIV疼痛。
69.根据权利要求66所述的方法，其中所述疼痛是与麻风病相关的疼痛。
70.根据权利要求66所述的方法，其中所述疼痛是手术后疼痛或创伤后疼痛中的一种或多种。
71.根据权利要求65所述的方法，其中所述状况是脊柱多发性神经根病。
72.根据权利要求65所述的方法，其中所述状况是带状疱疹后遗神经痛。
73.根据权利要求65所述的方法，其中所述状况是三叉神经痛。
74.根据权利要求65所述的方法，其中所述状况是复杂的局部疼痛综合症。
75.根据权利要求65所述的方法，其中所述况是癌症。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述癌症包括以下一种或多种：上皮癌、肺癌、乳腺癌、或其组合。
77.根据权利要求65所述的方法，其中所述状况是多发性硬化症。
78.根据权利要求65所述的方法，其中所述状况是炎症。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述炎症由免疫细胞介导，与风湿病相关，或其组合。
80.根据权利要求65所述的方法，其中所述治疗在施用后选定的时间量内提供症状减轻至少10％。
81.根据权利要求65所述的方法，进一步包括：
向所述受试者施用所述治疗有效量的所述组合物每天1至5次。
82.根据权利要求65所述的方法，进一步包括：
根据每天至少一次的剂量方案向所述受试者施用所述治疗有效量的所述组合物，持续约一天至约3个月。
83.根据权利要求65所述的方法，进一步包括：
以皮下剂型、经皮剂型、局部剂型、静脉内剂型、或其组合施用所述治疗有效量的所述组合物。
84.用于治疗受试者中对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体结合有应答的状况的组合物，包含：
治疗有效量的根据权利要求49所述的组合物给予受试者。
85.组合物在制备用于治疗受试者中对α9α10烟碱型乙酰胆碱受体结合有应答的状况的药物中的用途，包括：
治疗有效量的根据权利要求49所述的组合物给予受试者。
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