KR100244624B1

KR100244624B1 - 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(lhrh) 길항제 및 이를 함유하는 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR100244624B1
Application number: KR1019930701418A
Authority: KR
Inventors: 샤오보쟈오
Original assignee: 패르난대즈 마르케스, 아인팰드; 아스타 메디카 악티엔게젤샤프트
Priority date: 1990-11-10
Filing date: 1991-11-08
Publication date: 2000-02-15
Also published as: HRP920585B1; CZ84893A3; PH31178A; DE69125024D1; LV10106A; NO931697D0; ES2100965T3; DE69125024T2; EE03141B1; EP0564466A1; SI9111779B; CA2095932A1; FI933156A0; YU177991A; IE913915A1; CN1061605A; NZ240505A; LT3971B; DK0564466T3; HRP920585A2

Abstract

본 발명은 두가지 양태로 구성되어 있다 : 1) LHRH 길항제의 제조 및 합성 방법 ; 2) 상기한 방법을 사용하여 수득된 생성물, 모화합물로서, NAc-D2Nal¹, D3Pal³, Ser⁴. Tyr⁵, DArg⁶, Leu⁷, Arg³, Pro⁹, DAla¹⁰)NH₂를 취하여, (NAc-D2Nal¹, AA², AA³, Ser⁴, AA⁵, AA⁶, Leu⁷, AA³, Pro⁹, DAla¹⁰)NH₂로서 표시되는 일련의 신규한 동족체를 모화합물의 호지성 및 알칼리성 부위를 미세하게 개질시킴으로써 수득한다. 이러한 방식으로, 모화합물의 배란억제 활성을 유지시키고, 히스타민 방출활성을 임상적으로 요구되는 정도에 부합되는 양으로 감소시킬 수 있다.

Description

황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH) 길항제 및 이를 함유하는 약제학적 조성물

본 발명은 정확한 화학 구조를 갖는 신규한 펩타이드 및 이의 유도체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들을 제조하고 적용하는 방법을 제공한다. 시상하부의 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH : luteinizing hormone releasing hormone)은 황체 형성 호르몬(LH : luteinizing hormone) 및 난포 자극 호르몬(FSH : follicular stimulating hormone)의 분비를 자극하는 뇌하수체 전엽상에서 작용한다. LHRH의 길항성 동족체는 뇌하수체 전엽상에서 신속하게 작용하여 장기간 유지되고, 고나도트로핀 분비를 제한하고 선택적으로 억제하는데 있어 안전하게 가역적으로 사용될 수 있다. 이러한 유형의 용도를 위해서는, LHRH 길항제가 효능제에 비해 우세하다. 지금까지, 2,000종 이상의 LHRH 동족체가 제조 및 합성되었는데, 이중에서 ＆quot;Nal-Arg＆quot; 동족체가 상당히 또한 매우 강한 히스타민-방출 활성(HRA : histamin releasing activity)을 나타내기도 한다. 이는 치료량의 50 내지 100배 정도의 높은 용량으로 투여될 경우 랫트의 안면 및 사지의 일시적인 부종을 유발할 수 있다. 이에 대한 임상적 시험의 결과는 히스타민-관련된 전신 효과인 것으로 밝혀졌다. DArg⁶또는 DLys⁶을 함유하는 기타 LHRH 길항제도 상기와 유사한 부작용을 나타내는데, HRA에 대한 이들의 ED₅₀dms 1㎍/ml 미만이다. 본 발명은 배란 억제 활성(AOA : antiovulatory activity)이 매우 높고, 히스타민-방출 활성(HRA)이 매우 낮으며, 부작용이 무시할 정도로 작은 신규한 LHRH 길항제를 제공한다. 본 발명의 요지 및 예는 하기와 같다.

본 발명의 제조방법은 모 화합물인 [NAc-D2Nal¹, DpClPhe², D3Pal³, Ser⁴, Tyr⁵, DArg⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂(Ⅱ)의 분자와, 모 화합물의 분자내 알칼리성 부위 및 호지성 부위가 모두 변형됨으로써 AOA가 높고 HRA가 낮은 신규한 길항제를 제공하는 신생 펩타이드(neoro peptide)인 물질 P 간의 형태학적 유사성(topological similarity)을 기초로 한다. 본원에서 ＆quot;변형＆quot;이라는 용어는 모 화합물(II)의 C-말단의 Tyr⁵-DArg⁶-Arg⁸부위에서의 아미드산 및 모화합물(II)의 N-말단에서의 방향족 산이 조절되거나 치환된 상태를 나타낸다. 특히, 모화합물(II)의 위치, 2, 3, 5, 6 및 8번 위치에 비천연 아미노산의 적합한 알칼리성 그룹 및 치환체를 도입시킴으로써 제조한다.

본 발명의 또 다른 방법 및 예를 또한 하기에서 설명하고자 한다.

1. 모 화합물(Ⅱ)에서 DArg⁶을 적합한 염기성을 지닌 방향족 아미노산인 D3Pal로 치환하여, 동족체(Ⅲ) : [NAc-D2Nal¹, DpClPhe², D3Pal³, Ser⁴, Tyr⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂를 수득한다.

2. 화합물(Ⅲ)에서 Tyr⁵, Arg⁵로 치환하여, 동족체(Ⅳ): [NAc-D2Nal¹, DpClPhe², D3Pal³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂를 수득한다.

3. 화합물(Ⅳ)에서 D3Pal³를 DPhe³또는 이의 유도체인 DXCH₂Phe로 치환하여, 동족체(V): [NAc-D2Nal¹, DpClPhe², DPhe³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂또는 이의 (DXCH₂Phe³)동족체를 수득한다.

4. 화합물(Ⅲ)에서 D3Pal³를 DPhe³또는 이의 유도체로 치환하여, 동족체(V'): [NAc-D2Nal¹, DpClPhe², DPhe³, Ser⁴, Tyr⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂또는 이의 (DXCH₂Phe³)동족체를 수득한다.

일련의 일반식 [NAc-D2Nal¹, AA², AA³, Ser⁴, AA⁵, AA⁶, Leu⁷, AA⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂(여기서, AA는 D- 또는 L-ArAla로 표시되는 천연 아민노산 또는 비천연 아미노산이다)의 신규한 LHRH 길항제가 본 발명에 의해 합성되었다. 보다 상세하게, 상기식에서,

AA²는 D-pClPhe, D-ArAla, DPhe, Ar-Ala 및 DXCH₂Phe이고;

AA³은 D3Pal, Ar-Ala, D-ArAla, DPhe 및 D-XCH₂Phe이며;

AA⁵는 Arg, DMap, Pip, Tyr, Pal, Mop, Tep, Map, Phe, Eap, Pap, Bap 및 DMop이고;

AA⁶은 D3Pal, D-Ar-Ala 및 D-XCH²Phe이며;

AA⁸은 Pip, Mop, Tep, Map, Eap, Pap, Bap 및 Arg이고;

Ar은

및이며;

X는

R'₂N- 및 RR'N-이고;

R'는 CH₃-, CH₃CH₂-, C₃H₇-, C₄H₉- 및 H-이며:

R는 CH₃-, CH₃CH₂-, C₃H₇-, C₄H₉- 및 H-이다.

한 종류의 펩타이드 약제로서, 상기한 방법을 이용함으로써 수득한 LHRH 길항제는 재생성 내분비계의 질환, 예를 들면, 자궁내막증, 아동의 조속을 치료하고 전립선암 및 유방암을 치료하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 출산 조절을 위한 남녀용 피임제로서 사용되거나 불임증을 진단 및 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 펩타이드 약제는 통상의 주사용 캅셀제 또는 실제 사용하기 위한 기타 제형으로서 제조될 수 있다.

본 발명을 추가로 상세히 설명하자면 다음과 같다.

인체에서 히스타민이 방출되는 자연적인 경로상에서, 신생 펩타이드 물질 P는 매우 중요한 역할을 하는데, HRA에 대한 ED₅₀은 5 내지 15μM이다. SP의 화학구조는 [Arg¹, Pro², Lys², Pro⁴, Gln⁶, Phe⁷, Phe⁸, Gly⁹, Leu¹⁰, Met¹¹]NH₂이다. 이의 구조와 HRA간의 상관관계에 대한 연구는 SP 분자상에서 N-말단에서의 Arg¹- Pro²- Lys²이 HRA에 대해 필수적임을 나타내는데, 이는 분자로부터 상기한 3개의 아미노산을 제거하면 HRA가 완전히 파괴되기 때문이다. 이와는 대조적으로, C-말단에서의 1, 2 또는 3개의 아미노산을 제거해도 HRA는 HRA 자체로서 ¼만큼 높게 유지된다. Phe⁸및 Phe⁷을 추가로 제거하면, HRA는 SP의 것에 비해 4% 및 0.57% 감소된다. Gln^5.6을 추가로 제거하면, HRA의 특기할만한 변화가 유발되지 않는다. 상기한 결과는, Phe^7.8주변의 호지성 부위가 HRA 값을 결정지음을 내포하며, 상기 부위는 분자와 유선 세포의 수용체의 결합시 포함된다.

상기한 바와 같이, LHRH의 (D2Nal¹, DArg⁶) 동족체는 매우 높은 HRA를 나타내고, 이의 분자 구조는 SP와 형태학적 유사성을 지니며, LHRH의 (D2Nal¹, DArg⁶)동족체의 DArg⁶-Leu⁷-Arg⁸은 SP의 Arg¹-Pro²-Lys³에 상당하는 것으로 밝혀졌고, 둘다 그사이에 하나의 중성 아미노산 잔기만이 존재하는 한쌍의 강한 염기성 아미노산 잔기로 이루어져 있다. 즉, LHRH의 (D2Nal¹, DArg⁶) 동족체와 SP는 둘다 1,3 위치 관계에 있는 두개의 강한 염기성 아미노산 잔기를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 한편, HRA의 정도를 측정하는데 있어서, LHRH의 (D2Nal¹, DArg⁶) 동족체의 방향족 아미노산 잔기의 간섭범주는 SP 및 Phe^7.8부위에 상당하는 것으로 생각되어진다.

본 발명은 다음의 두가지 양태를 특징으로 한다. 즉, 하나의 양태는 C-말단부위에서의 Tyr⁵-DArg⁶-Arg⁸부위를 변형시키는 것이고, 다른 하나의 양태는 C-말단부위에서의 알칼리성 부위의 변형을 최적화한 다음 방향족 산을 조정하는 것이다. AOA가 옥수수유 중에서, 0.5㎍일때 100%이고 0.25㎍ 일때 57%인, [NAc-D2Nal¹, DpClPhe², D3Pal³, Ser⁴, Tyr⁵, DArg⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂(Ⅱ)를 모 화합물로서 사용한다.

우선, 모화합물(Ⅱ)중에서 DArg⁶은 약염기성 또는 중성 방향족 산(예: D3Pal, D6Qal, 테트라하이드로트립토판, 메틸 트립토판)으로 대체시킬 수 있다. D3Pal⁶로 모화합물(Ⅱ)의 DArg⁶를 대체하면, [NAc-D2Nal¹, DpClPhe², D3Pal^3.6, DAla¹⁰]LHRH(Ⅲ)를 수득할 수 있다. (Ⅲ)은 AOA가 옥수수유 중에서 3㎍일때 100%, 1㎍일때 83%를 나타내고, HRA에 대한 ED₅₀은 9.8㎍/㎖인데, 이는 HRA에 대한 ＆quot;Nal-Arg＆quot; 동족체의 ED₅₀이 1㎍/㎖ 미만인 사실에 비해 월등하게 높은 값이다. 이는 높은 AOA를 수득하기 위해서는 전체 분자의 염기도가 한쌍의 아르기닌의 염기도에 상당하거나 근접해야 할 것으로 생각된다. 6번 위치와 같이, 5번 위치는 수용체 결합에 포함되지 않기 때문에, 아르기닌을 포함하는 광범위한 아미노산을 5번 위치에 삽입시킬 수 있다. 일련의 신규한 동족체를 제조하였다. 예를 들어, (Ⅲ)에서 Tyr⁵를 Arg⁵로 치환시키면 [NAc-D2Nal¹, DpClPhe², D3Pal^3.6, Arg⁵, DAla¹⁰]NH₂(Ⅳ)를 수득할 수 있다. (Ⅳ) 및 (Ⅱ)는 둘다 2개의 아르기닌을 함유하나, 기하학적 상관관계가 1,4번에 위치하는, 즉 상기한 2개의 아르기닌 사이에 2개의 다른 아미노산이 존재하는 (Ⅳ)에서의 2개의 아르기닌 사이의 거리는 모화합물(Ⅱ)에서의 거리에 비해 멀다. 따라서, HRA는 감소할 것이고, 다른 한편, 2개의 아르기닌의 존재로 인해, AOA는 모 화합물(Ⅱ)의 AOA에 비해 크게 된다. 동족체(Ⅳ)의 생검정 결과는 HRA에 대한 ED₅₀이 3.5㎍/㎖이고, AOA가, 옥수수유에서, 0.12㎍일때 60%이고, 0.25㎍일때 85%이며, 0.5㎍일때 100%임을 입증한다. AOA에 대한 ED₅₀이 0.125㎍/㎖ 이하인 LHRH 길항제를 수득한 것은 본 발명에 이르러 처음이다.

이와 같은 추가의 발명상의 제조방법은 동족체(Ⅳ)의 구조를 기초로 한다.

동족체(Ⅳ)의 분자내에서는 4개의 알칼리성 잔기, 즉 D3Pal^3.6및 Arg^5.8이 존재하나, 모 화합물(Ⅱ)는 단지 3개의 알칼리성 잔기를 함유한다. 따라서, 하나의 D3Pal은 중성 아미노산으로 치환시키는 것이 합당하고, 다른 한편, 동족체(Ⅳ)는 매우 강한 친수성을 나타내는데, 동족체(Ⅳ)의 DPal을 소수성 이미노산으로 치환시킴으로써 친수성을 감소시키면, 인체의 약제 보유도 및 이에 따른 유효 기간의 연장에 유리할 것이다. 그 다음, D3Pal³를 치환시킴으로써 신규한 일련의 동족체를 제조하는데, (Ⅴ)의 AOA는 식염수 중에서 1㎍일때 100%(이는 모 화합물(Ⅳ)의 것과 동일하다)이며, HRA에 대한 ED₅₀의 반으로 감소된 HRA는 7.4㎍/㎖이다. 추가로 DClPhe²를 DPhe²로 치환시키면 분자의 상기 부위에서의 호지성 및 HRA가 감소된다.

(Ⅳ)의 C-말단에서의 Arg⁵-D3Pal⁶-Leu⁷-Arg⁸은 히스타민 방출을 유발시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. D3Pal은 한 분자내에서의 방향성, 염기성 및 친수성을 모두 가지고 있을 뿐만 아니라, 수용체 결합시 LHRH 길항제 중에서 입체적으로 허용되는 것이기도 하다. 이와 유사하게, D3Pal과 동일한 특성을 지니는, 신규한 일련의 비천연 아미노산은 (Ⅳ) 또는 (Ⅴ)보다 우수한 LHRH 길항제를 제공할 수 있다.

예를 들어 후술될 문헌[참조: The Syntheses of Novel Unnatural Amino Acids]의 방법을 이용함으로써 천연의 호지성 방향족 아미노산, 예를 들면, 페닐알라닌을 변형시키면, 한 분자내에 방향성, 친수성 및 염기성을 함께 지니며 일반식 R₁R₂NCH₂C₆H₄CH₂CH(NH)CO₂H의 신규한 일련의 아미노산(여기서, R₁및R₂는 각각 동일하거나 상이할 수 있으며, 쇄-형태이거나 사이클릭 형태이고 또한 헤테로 원자를 함유할 수도 있다)을 수득할 수 있다. R₁및R₂가 변화됨에 따라, 전체적으로 변화된 염기성, 친수성 및 입체 특성을 지니는 일련의 아미노산을 수득할 수 있다. 상기한 아미노산을 (Ⅳ)의 5. 6 및 8번 위치에 도입시키면 LHRH의 신규한 세가지 계열의 길항제를 수득할 수 있다. 생검정 결과는, 각각의 계열이 AOA가 (Ⅳ)의 것과 유사한, 즉 1㎍에서 100%이고, HRA가 현저히 감소된 신규한 길항제를 하나 이상 제공함을 입증하였다. 예를 들면, (Ⅴ)보다 우수한 것으로 생각되어지는, 1㎍에서의 AOA가 100%이고 HRA에 대한 ED₅₀이 14.7㎍/ml인, (Ⅶ): [NAc-D2Nal¹, DpClPhe², D3Pal³, Ser⁴, Mop⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]-NH₂가 있다. (Ⅳ)의 Arg⁸을 (Ⅵ)으로 치환시키면, HRA 감소도가 (Ⅵ)의 R의 길이에 대해 포지티브하게 상호관련지어져서, HRA에 대한 ED₅₀은 200㎍/ml 이상일 수 있으며, 이러한 종류의 화합물은 수용액중에 용해되기 쉽고 제형상에 문제를 유발시키지 않으면서 임상적으로 유용할 것으로 기대된다. 이 결과는 Arg⁸또는 Lys⁸이 매우 강력한 LHRH 길항제에 대해 필수적인 것이 아님을 입증한다. 8번 위치에서의 적합한 알칼리성 중심은 높은 AOA를 제공하는 한편, 유선 세포가 히스타민을 방출하도록 유도하는 활성은 상기한 바와 같이 현저한 입체-장애를 지닌 염기성 부위를 도입시켰을때 상당히 감소된다.

N- 및 C-말단부위를 둘다 변형시킴을 특징으로 하는 본 발명은 보다 우수한 LHRH 길항제를 제공한다.

합성 방법은 하기와 같이 설명할 수 있다.

1. 신규한 비천연 아미노산의 합성

60개 이상의 계열성 및 비계열성 D- 또는 L-아미노산은 하기 도식으로 도시화된 4개의 합성경로를 통해 제조 및 합성한다. 상기한 비천연 아미노산의 구조는 동일한 도식으로 나열된 일반식으로 표시된다. 이러한 아미노산중의 일부는 개별적으로 알칼리성, 친수성 및 방향성을 지니나, 나머지는 이들을 모두 분자내에서 함께 지닌다.

2. 펩타이드의 합성

본 합성은 Merrifield에 의해 도입된 고체-상 펩타이드 합성법을 이용하여 벤즈하이드릴아민 하이드로크로라이드 수지(BHA 수지)상의 펩타이드의 C-말단 부위로부터 시작한다. 이는 앵커, 커플링 및 분해를 포함한 3단계 공정이다. 디클로로메탄(DCM)은, 경우에 따라 이소프로판올 알콜(IPA) 및 N,N-디메틸 포름아미드(DMF)를 또한 사용하면서, 각각의 반응 단계중에서 세척하는데 사용되는 주요 용매이다. 과량의 디사이클로헥실카보디이미드(DCC)에 의해 촉매화된 커플링 공정을, 적당량의 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBT)을 가하면서 수행한다. 커플링 반응도는 Kaises의 닌하이드린 방법으로 모니터링한다. 제2 커플링 반응은, Kaises의 시험에서 포지티브한 결과를 제공하는 경우, 수행한다. 펩타이드 쇄는, 수지상에서 필요한 모든 반응이 완료된 후에, 즉 모든 일시적인 보호 그룹이 동시에 탈보호된 후에, 아니솔의 존재하에서 무수 불화수소(HF)를 사용하여 수지로부터 분해시킨다. LHRH 길항제의 에틸 아세테이트 또는 에테르 조 생성물은 수성 아세트산으로 추출한 후에 동결건조시킴으로써 수득한다. 수율은 50% 이상이다.

3. 펩타이드의 정제

(1) 펩타이드는 UV/TLC 모니터링의 보조하에서 60 내지 100cm 정도로 긴 컬럼을 통한 실리카 분배 크로마토그래피 또는 겔 침투 크로마토그래피에 의해 정제한다. 일단 정제된 LHRH 길항제는 주요 분획을 동결 건조시킨 후에 수득한다. 수율은 50 내지 90%이고, 순도는 90% 이상일 수 있다.

(2) 그후, 펩타이드는 역상 C18 컬럼(7.8×300mm)(μ-Bondapak 84176)을 사용하여 Waters 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 기기상에서 추가로 정제한다. 이 단계의 수율은 20 내지 50%이고 순도는 99% 이상이다.

4. 펩타이드의 순도 분석

(1) TLC 분석

이는 5 내지 10cm 길이의 실리카 겔 60 F254에 의해 피복된 플라스틱 시이트상에서 수행한다. 이들은 모두 5개의 상이한 용매 시스템으로 전개시킬 경우 단일 스포트(spot)를 나타낸다.

(2) HPLC 분석

이들은 모두 UV 210으로 모니터링한 경우, 분석용 컬럼(μ-Bondapak 27324)상에서 Waters HPLC 기기를 사용하여 각각 두가지 용매 시스템으로 용출시킨 경우 단일 피이크를 나타낸다. 샘플의 크기는 10 내지 200㎍이다.

5. 펩타이드의 아미노산 분석

Waters Company가 개발한 PICO-TAC 방법에 따라, 2시간에 걸쳐 진공하에서 건조시킨 샘플 50㎍을 10^-5g 눈금 저울 상에서 정확히 계량한다. 물에 용해시킨후, 10㎍ 분량을, 1% 페놀을 함유하는 1:1 하이드로클로라이드 산을 수동으로 가한 반응 튜브에 가한다. 이 반응은, 질소로 충전시키고 진공 펌프에 의해 반응 튜브내의 산소를 제거한 밀봉된 용기 내에서 105℃하에 22 내지 24시간 지속시킨다. 과량의 하이드로클로라이드 산을 증발시킨 후, 페놀 이소티오시아네이트를 가하여 아미노 그룹을 유도한다. 그 다음, 이를 PICO-TAG 아미노산 분석용 컬럼이 장착된 HPLC-기기로 분석하고 UV 254로 모니터링한다. 각각의 아미노산의 함량 및 상대적 몰 비율을 계산하여, Waters의 H-표준 샘플의 총 영역과 각각의 아미노산의 총 영역을 비교한 결과를 기초로 하여, 샘플의 아미노산 조성을 수득한다. 또한, 통상의 이온-교환-닌하이드린 유도 방법(IEN)을 동일한 결과를 제공하는 대조용으로 이용한다. 그러나, 만족스러운 결과를 수득하기 위해서는 10배 이상의 샘플을 사용할 필요가 있다.

6. 생물학적 활성의 평가

Corbin의 랫트 배란 억제방법을 이용한다. 건강하고 성숙한 암컷 SD 랫트(체중 200 내지 250g)를 본 시험에 사용한다. 모든 동물은 22 내지 24℃하에 14시간/10시간(광/암) 스케쥴에 따라 유지시킨다. 표준 사료 및 물을 무제한적으로 제공한다. 이 시험에서는, 질내용 도포 시험(vaginal smear examination)에 2개 이상의 연속적인 4-일 발정 주기를 나타내는 랫트를 사용한다. 이 랫트에 염수 용액중 상이한 용량으로 발정 전기의 절정기에 펩타이드(LHRH 길항제)를 제공한다. 그 다음날, 랫트를 치사시키고, 양쪽 난관을 해부용 현미경하에서 시험하여 난자수를 측정한다. 랫트를 투여량에 따라 몇몇 그룹으로 분류하는데, 각각의 그룹을 약 10마리의 랫트로 이루어지게 하고, 랫트에 동량의 염수를 제공하는 대조 그룹도 9 내지 10마리의 랫트로 이루어지게 한다. 배란 억제 활성(AOA)은 하기 식으로 나타낼수 있다:

7. 히스타민 방출 활성의 평가

(1) 시험관내에서의 히스타민 방출 시험(HRT)

상기와 동일한 조건하에서 가둔 건강하고 성숙한 숫컷 SD 랫트(체중 200 내지 250g)를 본 시험에 사용한다. CO₂로 마취시킨 후에, 복막강을 헤파린 20 단위를 함유하는 PIPES AC 매질 50ml로 세척한다. 4℃하에 200xg에서 8분 동안 원심분리시킨 후, 세포를 다시 세척하고, 최종적으로 재현탁시켜, PIPAS AC중 8 내지 24×10⁵백혈구 총 수/ml의 농도를 만든다 .이 현탁액은 약 5 내지 10%의 유선 세포를 함유한다. 세척된 세포를 수집한 후에 즉시 사용하고 37℃하에서 5분 동안 예비 가열한 후, 회석된 펩타이드 0.3ml를 함유하는 폴리스티렌 튜브내로 0.3ml 분취량을 피펫팅한다. 혼합물을 37℃에서 15분 동안 항온처리하고, 4℃하에 400xg에서 15분동안 원심분리시킴으로써 반응을 중단시킨다. 계속해서 n-부탄올 및 n-헵탄올로 추출한 후, 상등액의 히스타민 함량을 수동 형광 분석방법으로 분석한다. 히스타민 표준 곡선으로부터 히스타민 함량을 수득한다(하기를 참조한다). 히스타민 방출율(%)은 하기 식으로부터 계산한다.

상기식에서,

E는 시험 샘플으 형광분석 판독치이고,

B는 세포 및 완충액만을 포함하는 샘플의 형광 분석 판독치이며,

C는 ＆quot;완전한 세포＆quot;(HCIO₄로 처리된 세포)의 형광 분석 판독치이다.

정확히 계량된 히스타민 하이드로클로라이드의 일련의 희석액의 농도에 대해 350nm/450nm(활성/형광성)하에 형광 분석기상에서 0D값을 플롯팅함으로써 표준 곡선을 수득한다. 히스타민 표준 곡선의 상대 변수 r은 0.9998일 수 있고, 히스타민의 검출 가능한 최저 농도는 0.5ng/ml이다.

세미로그 페이퍼 상에서 펩타이드 농도에 대해 히스타민 방출량을 플롯팅함으로써 수득한 용량 반응 곡선으로부터 펩타이드의 ED₅₀값을 수득할 수 있다.

모든 펩타이드 샘플은 최소 3마리의 상이한 랫트로부터의 유선 세포로 시험해야 한다.

(2) 피하내 아나필락토이드 활성 시험(CAT.: Cutaneous anaphylactoid activity test)

건강하고 성숙한 암컷 SD 랫트(체중 250g)를 본 시험에 사용한다. 랫트에 Evan's blue(0.05% 용액 1ml)를 정맥내 주사한다. 그후 즉시 펩타이드 용액 0.05ml(각각 5㎍/ml. 0.5㎍/ml 및 0.055㎍/ml) 및 염수(대조용)를 동물의 등의 면도한 부위내로 피내 주사한다. 주사하고 30분 후에, 랫트를 치사하고, 등의 피부면을 드러낸다. 병변의 직경을, 버니어 캘리퍼(vernier caliper)로 2개의 수직방향에 대해 mm로 측정한다. 대조군의 직경은 통상적으로 5.5mm 미만이다.

혈관으로부터 피부로 침투하는 Evan's blue의 양을 또한 분광 광도계로 측정할 수 있다. 병변 부위에 상당하는 피부를 절단해 내고, 아세톤/식염수(7:3, Vol/Vol)의 혼합물 중에서 밤새 침지시킨다. 그 다음날, 원심분리시킨 후, 상등액중의 Evan's blue의 함량을 아세톤/염수(7:3)의 대조 용액에 대해 610mm에서 분광 광도계(UV-260)로 측정한다. 각각의 펩타이드를 최소 3마리의 상이한 랫트에 대해 시험한다.

다수의 신규한 LHRH 길항제를 상기한 방법을 이용하여 제조 및 합성한다. 간단히 말해서 LHRH 길항제의 신규한 구조는 상기한 단락에 나열된 각종 천연 및 비천연 아미노산을 단독적으로 또는 다중적으로 대체함으로써 수득한다.

이때, 수득한 신규한 LHRH 길항제의 예의 일부를 표 1에 나타내었다.

[표 1] : 본 발명과 관련된 예의 일부

본 발명의 적용

1. 예비임상적 약리학 및 독성학 연구를 수행한 후, 본 발명자들은 치료학적 유효성이 높고 임상적 부작용이 적은 상기한 신규의 LHRH 길항제를 적용하여, 자궁내막증 및 재생성 내분비계 질환, 예를 들면, 아동의 조숙, 전립선 암 및 유방암을 치료하기 위한 신규한 약제를 개발할 수 있었다. 이들은 내인성 LHRH와 경쟁하는 수용체를 통해 고나도트로핀이 분비되는 것을 억제하고, 신속하고 가역적이고 안전하게 작용하기 때문에, 신규한 유형의 남여용 피임제로서 추가로 개발시킬 수 있다. 그외에도, 이들은 또한 고나도트로핀을 분비하는데 있어서 뇌하수체의 작용을 선택적이고도 가역적으로 파괴하고 불임을 치료하는데에도 사용할 수 있다.

펩타이드 약제의 종류로서, 본 원에서 기술된 LHRH 길항제는 경구 투여하기 어렵다. 그러나, 이들은 정맥내, 피하 또는 근육내로 주사하기 위해 염수에 용해시키기 쉬운 동결건조된 분말로 용이하게 제조할 수 있다.

또한, 생분해성이고 주사가능한 캅셀제와 같이 장시간-작용하는 수송 시스템에 대해서도 연구하였다. 이 캅셀제는 특정 주사기를 통해 피하 삽입할 수 있으며, 펩타이드 내용물이 모두 방출된 후 조직에 의해 흡수될 것이며, 외과적으로 제거할 필요는 없다. 장시간-작용하는 수송 시스템은 임상적으로 LHRH 동족체를 장시간에 걸쳐 투여하는데 특히 유용하다.

하기는 (전형적인 예로서 세가지 동족체 Ⅳ, Ⅴ, Ⅶ을 취한) 예의 분석 결과이다.

(1) 순도

박층 크로마토그래피(TLC):

5개의 상이한 용매 시스템내에서 전개시킨 각각의 크로마토그램에서 단일 스포트만이 존재한다.

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC):

2개의 상이한 용매 시스템으로 용출시킨 각각의 크로마토그램에서 단일 피이크만이 존재한다.

R_f및 보유 시간 TR의 값들은 표 2에 나타내었으며 제1도 내지 제4도를 참조한다.

[표 2] : LHRH 길항제의 크로마토그래피 분석 결과

용액 A+80% 아세토니트릴

용매 시스템 2:

용액 A는 0.01M KH₂PO₄수용액(pH3)이다.

용액 B는 20% 용액 A+80% 아세토니트릴이다.

TLC 용액 시스템:

1. nBuOH/EtOAC/HOAC/H₂O (5:5:1:1)

2. nBuOAC/nBuOH/HOAC/H₂O (2:8:2:3)

3. nBuOAC/HOAC/H₂O (4:1:5), 상부 상

4. nBuOH/HOAC/H₂O (4:1:2)

5. nBuOH/EtOAc/HOAC/H₂O (1:1:1:1)

(2) 아미노산 분석

본 분석은 전형적인 IEN 및 신규한 Pico-Tag 방법에 따라 수행하는데, 그 결과를 표 3 및 제5도 및 제6도에 나타내었다.

[표 3] : LHRH 길항제의 아미노산 조성

ND: 측정되지 않음

(3) 생물학적 검정 결과

시험관내에서 히스타민-방출 활성에 대한 ED₅₀및 상이한 용량에서의 배란억제활성을 포함한 생검정 결과를, 26 종의 길항제가 예로 나열된 표 4에 나타내었다.

[표 4] 모화합물의 구조를 기본으로 한 신규한 LHRH 길항제의 생검정 결과

* 모화합물의 구조는 [NAc-D2Nal¹, DpClPhe², D3Pal³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂이다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따라 제조 및 합성된 LHRH 길항제는 매우 우수한 특성을 나타낸다. 이들은 TLC 또는 HPLC 분석시 순수한 것으로 밝혀졌다. 이들의 조성은 정확하다. 즉, 동일한 것이 제조되는 것이다. 이들의 수정억제 활성은 높은데, 이들은 발정 전기의 절정기에 0.1 내지 2.0㎍의 용량으로 피하 주사한 경우 랫트의 배란을 억제할 수 있다. 이들의 히스타민-관련된 부작용은 작은데, 이들의 시험관내 히스타민 방출 활성에 대한 ED₅₀(히스타민의 50%를 방출시키기 위한 랫트 유선 세포에 대한 유효 용량)은 5 내지 300㎍/ml이며, 랫트의 피하 아나필락토이드 시험에서 이들에 의해 유도된 병변은 임상적으로 요구되는 정도로 작다. 이들의 수용성은 매우 양호한데, 모든 생물학적 검정은 염수 용액중에서 수행하여, 임상적으로 주사하기 쉽게 제형화시킬 수 있다. 이들은 또한 장시간-작용하는 수송 시스템으로서 제형화시키기 쉬운데, 이들중에서도 고나도트로핀 및 고나달호르몬을 장시간 억제하는데에는 주사가능한 미세캅셀제가 가장 편리하다. 따라서, 이들은 남여 모두에 대해 매우 효과적이고 가역적이며 안전한 피임제로서 사용할 수 있다. 이들은 또한 재생성 내분비계 질환, 예를 들면, 자궁내막증, 아동의 조숙, 호르몬 의존성 전립선 암 및 유방암과 관련된 각종 질환을 치료하는데 유용할 수도 있다. 이들은 또한 불임을 치료하는데에도 유용하다. 본원의 신규한 LHRH 길항제는 또한 성별 특성에 대한 고나달 호르몬 또는 고나도트로핀 또는 LHRH의 효과에 대해 재생성 생리학 및 약리학을 기초적으로 연구하는데 있어서, 예를들어 뇌하수체의 작용을 연구하는데 있어서도 유용할 수 있다.

Claims

1. 구조식 [NAc-D2Nal¹, DpClPhe², DPhe³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂의 화합물.

2. 구조식 [NAc-D2Nal¹, DpClPhe², DPhe³, Ser⁴, Tyr⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂의 화합물.

3. 구조식 [NAc-D2Nal¹, DpClPhe², D3Pal³, Ser⁴, Mop⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂의 화합물.

4. 구조식 [NAc-D2Nal¹, DPhe², D3Pal³, Ser⁴, Mop⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂의 화합물.

5. 구조식 [NAc-D2Nal¹, DpClPhe², D3Phe³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Pap⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂의 화합물.

6. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 따른 LHRH 길항제 화합물을 포함하는, 재생성 내분비계 질환 치료용 약제학적 조성물.