CZ284168B6

CZ284168B6 - Způsob navrhování a syntetizace antagonistů LHRH

Info

Publication number: CZ284168B6
Application number: CZ93848A
Authority: CZ
Inventors: Xiao Shaobo
Original assignee: Asta Medica Aktiengesellschaft
Priority date: 1990-11-10
Filing date: 1991-11-08
Publication date: 1998-09-16
Also published as: PL295427A1; CN1036343C; CN1061605A; SK45393A3; CA2095932A1; HRP920585A2; LV10106A; AU8861291A; FI933156A0; ZA918847B; KR930703353A; EE03141B1; SK281319B6; YU48831B; UA41300C2; PT99458B; AU662496B2; WO1992008733A1; SI9111779A; PT99458A

Abstract

Řešení se týká způsobu navrhování a syntetizace antagonistů LHRH, při němž se jako rodičovské sloučeniny použije vysoce účinného antagonisty LHRH |NAc-D2Nal.sup.1.n., DpClPhe.sup.2.n., D3Pal.sup.3.n., Ser.sup.4.n., Tyr.sup.5.n., Arg.sup.6.n., Leu.sup.7.n., Arg.sup.8.n., Pro.sup.9.n., DAla.sup.10.n.| NH.sub.2 .n.(II) a modifikuje se jak bázická, tak lipofilní oblast molekuly (II), za vzniku nových antagonistů LHRH, které mají jak vysokou antiovulační činnost (AOA), tak nízkou účinnost uvolňování histaminu (HRA), na základě jejich topologické podobnosti s molekulovou neuropeptidu, látky P. Dále se řešení týká tímto způsobem nově vyrobených látek a jejich použití jako léčiv a antikoncepčních látek.ŕ

Description

Hormon uvolňující luteinizační hormon (LHRH) v hypotalamu působí na přední část podvěsku mozkového tak, že stimuluje sekreci luteinizačního hormonu (LH) a folikulámího stimulačního hormonu (FSH). Antagonistický analog LHRH působí na přední část hypofýzy rychle, jeho účinek je dlouhodobý a může ho být bezpečně a reverzibilně používáno pro antikoncepci nebo selektivní potlačování sekrece gonadotropinu. Pro takový způsob aplikace jsou antagonisty LHRH vhodnější než agonisty. Až dosud bylo navrženo a syntetizováno více než 2000 analogů LHRH, z nichž analog Nal-Arg vykazuje značně vysokou účinnost proti plodnosti. Analog Nal-Arg však také vykazuje velmi silnou účinnost při uvolňování histaminu (HRA). U krys, při podání v dávce 50 až lOOx vyšší, než je dávka terapeutická, způsobuje přechodné otoky přední části tlamičky a končetin. Výsledek klinické zkoušky ukazuje, že dochází k systemickým účinkům, které jsou spojeny s uvolňováním histaminu. Jiné antagonisty LHEH obsahující DArg⁶nebo DLys⁶ vykazují podobné vedlejší účinky; jejich hodnota ED₅₀ v případě HRA jsou nižší než 1 gg/ml. Vynález se týká nových antagonistů LHRH, které vykazují velmi vysokou antiovulační účinnost (AOA) a velmi nízkou účinnost při uvolňování histaminu (HRA) a mají zanedbatelné vedlejší účinky.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je peptid vykazující sekvenci [NAc-D2Nal’, AA², AA’, Ser⁴, AA’, D3Pal⁶, Leu , AA⁸, Pro⁹, DAla^,0]NH₂, kde zbytek AA² je zvolen ze souboru zahrnujícího DpCIPhe²a DPhe², zbytek AA³ je zvolen ze souboru zahrnujícího D3Pal³ a DPhe’, zbytek AAB je zvolen ze souboru zahrnujícího Arg⁸ a Pap⁸ a zbytek AA’je zvolen ze souboru zahrnujícího Mop⁵, Arg⁵a Tyr’, přičemž, když AA’ je Mop’ a potom AA“ je DpCIPhe' nebo DPhe² AA³ je D3Pal³ a AAB je Arg⁸; když AA’ je Arg’ a AA³ je DPhe³, potom AA² je DpCIPhe² nebo DPhe² a AA⁸ je Arg⁸; když AA⁵ je Arg’ a AA³ je D3Pal³, potom AA² je DpCIPhe² a AAB je Pap⁸; a když AA⁵ je Tyr⁵, potom AA² je DpCIPhe² nebo DPhe², AA³ je DPhe³ a AAB je Arg⁸.

Výhodná provedení tohoto peptidu vykazují sekvenci [NAc-D2Nal‘, DpCIPhe². DPhe³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH2; [NAc-D2Nal', DpCIPhe². DPhe³, Ser⁴, Tyr⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla'°]NH2; [NAc-D2Nal^l, DpCIPhe². D3Pal³, Ser⁴, Mop⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla'°]NH2; [NAc-D2Nal‘, DPhe², D3Pal³, Ser⁴, Mop⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla'°]NH2; nebo [NAc-D2Nal‘, DpCIPhe² D3PaI³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Pap⁸, Pro⁹ DAla'°]NH₂.

Předmětem vynálezu je dále použití některého z výše uvedených peptidů pro výrobu léčiva pro léčení poruch reprodukčního endokrinního systému a rakoviny prostaty a prsu.

Konečně je předmětem vynálezu také použití některého z výše uvedených peptidů pro výrobu léčiva pro použití jako antikoncepčního činidla a pro diagnostikaci a léčení neplodnosti.

- 1 CZ 284168 B6

Metodologie navrhování a konstrukce sloučenin podle vynálezu byla založena na topologické podobnosti mezi molekulou rodičovské sloučeniny [NAc-D2Nal', DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Tyr⁵, DArg⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla'°]NH₂ (sloučenina vzorce II) a neuropeptidem, látkou P. Tato metodologie zahrnovala modifikaci jak bázické, tak lipofilní oblasti v molekule rodičovské sloučeniny, za vzniku nových antagonistů, které mají vysokou AOA při nízké HRA. Pod pojmem modifikace se rozumí přizpůsobení nebo substituce aminokyselin v oblasti Tyr’-DArg⁶-Arg⁸u C-konce a aromatických kyselin u N-konce sloučeniny vzorce II. Tato konstrukce zahrnuje konkrétně zavádění vhodných bázických skupin a substituci nepřirozených aminokyselin do poloh 2, 3, 5, 6 a 8 sloučeniny vzorce II.

Peptidové antagonisty LHRH podle vynálezu představují peptidová léčiva, kterých je možno použít pro léčbu poruch reprodukčního endokrinologického systému, včetně endometriosis, předčasné puberty u dětí, rakoviny prostaty a rakoviny prsu a jakožto prostředku pro regulaci početí pro obě pohlaví nebo pro diagnostikaci a léčbu neplodnosti atd. Toto peptidové léčivo může být upraveno do podoby normálních injekcí, injektovatelných kapslí nebo jiných přípravků vhodných pro skutečnou aplikaci.

Neuropeptidová látka P hraje velmi důležitou úlohu v přirozeném průběhu uvolňování histaminu v těle. Její ED₅₀ pro HRA je 5 až 15 μΜ. Chemická struktura látky P je následující [Arg¹, Pro², Lys’, Pro⁴, Gin’, Gin⁶, Phe⁷. Phe⁸, Gly⁹, Leu¹⁰, Met⁽¹¹⁾]NH₂. Studie vztahu mezi strukturou a HRA ukázala, že pro HRA je důležitá sekvence Arg’-Pro²-Lys³ u N-konce molekuly látky P, poněvadž delecí těchto tří aminokyselin z molekuly se úplně zruší její HRA. Naproti tomu při deleci jedné, dvou nebo tri aminokyselin u C-konce zůstane zachována HRA zjedné čtvrtiny, ve srovnání ze samotnou látkou P. Další delece Phe⁸ a Phe⁷ má za následek snížení HRA nejprve na 4 % a potom na 0,57 % účinnosti látky P. Další delece Gin⁵ a Gin⁶ nezpůsobuje podstatnou změnu HRA. Z výše uvedených dat je zřejmé, že lipofilní oblast okolo Phe⁷ a Phe⁸ určuje hodnotu HRA a že se tato oblast podílí na vazbě molekuly látky P na receptor mastocytu.

Jak již bylo uvedeno výše. (D2Nal’, DArg⁶)analogy LHRH vykazují velmi vysokou HRA, což je způsobeno topologickou podobností jejich molekulární struktury s látkou P. Zdá se, že sekvence DArg⁶-Leu⁷-Arg⁸ v těchto analozích odpovídá sekvenci Arg¹ Pro² Lys³ u látky P. Obě tyto sekvence obsahují dvojici silně zásaditých zbytků aminokyselin, mezi nimiž je umístěn pouze jeden neutrální zbytek aminokyseliny, tj. jak (D2Nal‘, DArg⁶)analog LHRH, tak látka P obsahuje dva silně bázické zbytky aminokyselin, jejichž vzájemná poloha je 1, 3. Naproti tomu shluk zbytků aromatických aminokyselin ve výše uvedeném analogu, pravděpodobně odpovídá oblasti Phe'⁸ u látky P, pokud se týče určujícího vlivu na výši HRA.

Vývoj a příprava peptidů podle vynálezu zahrnuje dva aspekty: jedním z nich je modifikace oblasti Tyr⁵-DArg⁶-Arg⁸ u C-konce a druhým z nich je jemné přizpůsobení aromatických kyselin po optimalizaci modifikace bázické oblasti u C-konce.

Jako rodičovské sloučeniny se přitom používá sloučeniny o složení [NAc-D2Nal^l, DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Tyr⁵, DArg⁶. Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂ (II), která vykazuje AOA 100 % (0,5 μg v kukuřičném oleji) a 57 % (0,25 μg).

Ve sloučenině vzorce II se nejprve může DArg⁶ nahradit slabě bázickou nebo neutrální aromatickou kyselinou, jako je D3Pal. D6Qal, tetrahydrotryptofan nebo methyltryptofan. Sloučenina vzorce iíl [NAc-D2Nal\ DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Tyr⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH2 se získá při nahrazení DArg⁶ ve sloučenině vzorce II pomocí D3Pal⁶. Sloučenina vzorce III vykazuje AOA 100 % (3 μg) a 83 % (1 μg) v kukuřičném oleji a její hodnota ED;o pro HRA je 9,8 pg/ml, což je hodnota o mnoho lepší než v případě Nal-Arg analogu (jehož ED₅₀ pro HRA je nižší než 1 pg/ml). Zdá se, že pro dosažení vysoké AOA by měla být bazicita celé molekuly stejná nebo přibližně stejná, jako je bazicita argininové dvojice. Jelikož se ani poloha 5 ani

-2CZ 284168 B6 poloha 6 nepodílí na vazbě k receptorů, může se do polohy 5 vložit celá řada aminokyselin, včetně argininu. Podle vynálezu byla zkonstruována řada nových analogů. Tak například při substituci zbytku Tyr³ zbytkem Arg⁵ ve sloučenině vzorce III se získá sloučenina vzorce IV [NAc-D2Nal’, DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla^l0]NH₂. Jak sloučenina vzorce IV, tak sloučenina vzorce V obsahuje dva argininové zbytky, ale vzdálenost mezi těmito dvěma argininovými zbytky ve sloučenině vzorce IV, je větší než u sloučeniny vzorce II, poněvadž ve sloučenině vzorce IV je geometrický vztah argininových zbytků 1, 4, tj. mezi těmito dvěma argininovými zbytky jsou dva zbytky jiných aminokyselin. Tím dochází ke snížení HRA a na druhé straně, díky přítomnosti dvou argininových zbytků. AOA by neměla být nižší než AOA sloučeniny vzorce II. Na základě biologického stanovení se sloučeninou vzorce

IV byla zjištěna hodnota ED₅₀ pro HRA 3,5 pg/ml, zatímco AOA je 60% při 0,12 pg (v kukuřičném oleji), 85 % při 0,25 pg a 100 % při 0,5 pg.

Poprvé se u antagonistů LHRH dosáhlo hodnoty ED₅o pro AOA, která je rovna 0,125 pg nebo nižší. Další konstrukce byla tedy založena na sloučenině vzorce IV.

V molekule vzorce IV jsou obsaženy čtyři bázické zbytky D3Pal^3,6 a Arg³’⁸, zatímco sloučenina vzorce II obsahuje pouze 3 bázické zbytky. Je proto rozumné nahradit jeden zbytek D3Pal zbytkem neutrální aminokyseliny. Sloučenina vzorce IV na druhé straně vykazuje velmi silnou hydrofilitu a její snížení substitucí DPal zbytkem hydrofobní aminokyseliny ve sloučenině vzorce IV by bylo prospěšné pro retenci léčiva v těle a pro prodloužení doby účinnosti. Byla tedy syntetizována nová série analogů substitucí D3Pal^J ve sloučenině vzorce IV. Nejlepší látkou z této série je sloučenina vzorce V [NAc-D2Nal’, DpCIPhe², DPhe³, Ser⁴, Arg³, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂, v níž byl zbytek D3Pal³ substituován zbytkem DPhe³. Sloučenina vzorce V vykazuje 100 % AOA při 1 pg (ve fyziologickém roztoku), což je hodnota stejná, jako má rodičovská sloučenina vzorce IV, zatímco HRA je snížena o polovinu: ED50 pro HRA je 7,4 pg/ml.

Další substituce zbytku DCIPhe² zbytkem DPhe² má za následek snížení lipofility této oblasti molekuly a snížení HRA.

Sekvence Arg⁵-D3Pal⁶-Leu⁷-Arg⁸ u C-konce sloučeniny vzorce IV zřejmě hraje důležitou úlohu při spouštění uvolňování histaminu. D3Pal v sobě v jediné molekule spojuje aromatické vlastnosti, bazicitu a hydrofilitu a je rovněž stereo-přijatelná v LHRH antagonistech pro vazbu k receptorů. Podobně, konstrukce nové série nepřirozených aminokyselin, majících stejný charakter jako D3PA1, může vést k lepším antagonistům LHRH než jsou sloučeniny vzorce IV nebo V.

Modifikace přírodní lipofilní aromatické aminokyseliny, například fenylanalinu, která se například může provádět způsobem uvedeným dále v části nazvané Syntéza nových nepřirozených aminokyselin vede k sérii nových nepřirozených aminokyselin, v nichž se spojují v jedné molekule aromatičnost s hydrofilitou a bazicitou. Tyto aminokyseliny lze vyjádřit obecným vzorcem VI

R₁R₂NCH₂C₆H₄CH₂CH(NH)COOH (VI) kde každý ze symbolů R! a R₂, které mohou být stejné nebo různé, představuje lineární nebo cyklický zbytek, který· popřípadě může obsahovat také heteroatom. Modifikací zbytků R¹ a R' je možno získat sérii aminokyselin, které vykazují systemicky změněnou bazicitu, hydrofilitu a stereocharakter. Zavedením těchto aminokyselin do poloh 5, 6 a 8 sloučeniny vzorce IV vedlo k získání tří sérií nových antagonistů LHRH. Biologické výsledky ukázaly, že v každé sérii byl obsažen přinejmenším jeden nový antagonista vykazující 100% AOA při 1 pg, podobně jako je AOA sloučeniny vzorce IV, zatímco HRA byla podstatně snížena. Jako příklad je možno uvést

-3 CZ 284168 B6 sloučeninu vzorce VII [NAc-D2Nal’, DpCIPhe², D3PaI³, Ser⁴, Mop⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂, která vykazuje 100% AOA při 1 pg aED₅o 14,7 pg/ml pro HRA, což je hodnota lepší než v případě sloučeniny vzorce V. Když se provede substituce zbytku Arg⁸ ve sloučenině vzorce IV zbytkem aminokyseliny obecného vzorce VI, je hodnota poklesu HRA v pozitivní korelaci s délkou substituentu R v aminokyselině obecného vzorce VI, takže hodnota ED50 pro HRA může být vyšší než 200 pg/ml. Sloučeniny tohoto typu lze snadno rozpouštět ve vodném roztoku a očekává se, že bude možno jich klinicky využít bez toho, že by vznikaly potíže se zpracováním na přípravky. Výsledky ukazují, že Arg⁸ nebo Lys⁸ nejsou podstatné pro vysokou účinnost antagonistů LHRH. Vhodné bázické centrum v poloze 8 může zajistit vysokou AOA zatímco účinnost indukující vmastocytech uvolňování histaminu je pozoruhodně snížena, když bázické centrum zmíněné výše obsahuje podstatnou stereozábranu.

Při modifikaci jak N-, tak C-konce způsobem podle vynálezu se získají lepší antagonisty LHRH.

Přehled obrázků na výkrese

Na obr. 1 jsou znázorněny výsledky analýzy TLC antagonistů IV, V a VII za použití pěti různých vyvíjecích systémů.

Na obr. 2 je znázorněno HPLC spektrum na reverzní fázi v případě čistého vzorku antagonisty LHRH IV. Spektrum bylo naměřeno za těchto podmínek:

Sloupec: μ-Bondapak C18 (3,9 mm x 30 cm)

Mobilní fáze: A, 0,1M NEfiOAc (pH 7)

B, 20 % A + 80 % acetonitrilu

Gradientový postup: od 10 % koncentrace B do 100 % B za 15 minut

Průtok: 2 ml/min

Detektor: UV 229 nm.

Na obr. 3 je znázorněno HPLC spektrum na reverzní fázi v případě čistého vzorku antagonisty LHRH V. Spektrum bylo naměřeno za těchto podmínek:

Sloupec: μ-Bondapak C18 (3,9 mm x 30 cm)

Mobilní fáze: A, 0,01M KH₂PO₄ (pH 3)

B, 20 % A + 80 % acetonitrilu

Gradientový postup: od 40 % koncentrace B do 100 % B za 15 minut

Průtok: 2 ml/min

Detektor: UV 210 nm.

Na obr. 4 je znázorněno HPLC spektrum na reverzní fázi v případě čistého vzorku antagonisty LHRH VII. Spektrum bylo naměřeno za těchto podmínek:

Sloupec: μ-Bondapak C18 (3,9 mm x 30 cm)

-4CZ 284168 B6

Mobilní fáze: A, 0,01M KH7PO4 (pH 3)

B, 20 % A + 80 % acetonitrilu

Gradientový postup: od 40 % koncentrace B do 100 % B za 15 minut

Průtok: 1 ml/min

Detektor: UV 210 nm.

Na obr. 5 je znázorněno spektrum PICO-TAGTM antagonisty LHRH IV.

Na obr. 6 je znázorněno spektrum PICO-TAGTM antagonisty LHRH V.

Syntetický postup je ilustrován dále:

1. Syntéza nových nepřirozených aminokyselin

Čtyřmi syntetickými postupy, které jsou znázorněny v následujícím schématu bylo navrženo a syntetizováno více než 60 sériových a nesériových D- nebo L-aminokyselin. Struktura těchto nepřirozených aminokyselin je charakterizována pomocí obecných strukturních vzorců, které jsou uvedeny v tomto schématu. Některé z těchto aminokyselin obsahují bazická místa, některé hydrofilní místa a některé aromatická místa a některé z nich obsahují všechna tato místa v jedné molekule.

-5CZ 284168 B6

Dráha 1

Dráha 2

ArNH₂	ArCH₂Cl + HC(COOEt)₂
HC1 \| NaNO₂	NaOEt \| NH-AC 1

ArNjCl“⁺

CH₂=CHOOH

ArCHnC(COOEt),

I

NH-Ac { NaOH/EtOH d,l- ArCH,CHCOOH I

Cl

NH₃/H₂0

COONa

I

ArCHj-C-COOEt

NH-AC

4,1- ArCH₂CHCOOH nh₂

Ac₂O

H*

4»

COOH

Ar-CH,-C-COOEt

I

NH-AC d,l- ArCH,CHCOOH

I

NH-Ac

SOClj/EtOH

-6CZ 284168 B6

d,1- ArCH₂CHCOOEt

d-ArCH,CHCOOEt 1-ArCH,CHCOOH \ 1

NH-AC NH-AC

d—ArCHjCHCOOH

I nh₂-hci dt buty 1 dikarbonát

1-ArCH^CHCOQH

HH₂ · HC1 dt buty1 dikarbonát d-ArCH,CHCOOH I NH-Boc

1- ArCH^CHCOOH NH-Boc

NH-Boc

I

Dráha I D nebo L-Ar-CH2-CH-C00H, kde

Dráha II D nebo L-ArCH2-CH-C00H, kde

NH-Boc

f

-8CZ 284168 B6

-9CZ 284168 B6

Dráha III

NHCOCH3

EtOH SOC1₂

nhcoch₃

ZnCl ₂ch₃och₂ci

CH,CHCOOEt I nhcoch₃ d-ClCH₂-

-CH,CHCOOEt I nhcoch₃

sekundární amin

EtOH

ZnCl 2 ch₃och₂ci

- 10CZ 284168 B6 d-

l-ClCHj-

-CHjCHCOOEt

NHCOCHj

1)dibutyl- | dikarbonát 12) H* sekundární amin

EtOH

NH-Boc i-xch₂-

nhcoch₃

HC1

Dráha

HC1

-CH₃CHC00H

I

NH₂-HC1 _x I dibutyldikarbonát | ₂> H*

NH-80C

III

D- nebo L -xch₂

NH-Boc kde

[ ^N--, R₂N- , RR‘N- 11 CZ 284168 B6

Ar—CHO+CgHj—CO—NHCHjCOjH

Dráha iv

KHCO-, ac₂o

II Ar-CH=C-C \ 0 I

N = C \

^C6^H5 konc. hci

Ar-CH=C-C0₂H nh-co-c₆h₅ «2

Pd/C

Ar-CH₂-CH-C0₂H

NH-CO-CgHg

SOCI ₂

Ar-CH₂

MaOH subtilisin

CHC0₂CH,

I PH 7,6

NHCOCgHg

Ar-CH₂CHC0₂CH₃

NHC0C₆H₅

D-isomer

I 6NHC1

LAr-CH₂CHCO₂H l NHCOCgHg isomer | 6NHC1

Ar-CHjCH-CO-OH

I nh₂ (D-aminokyselina)

Ar-CH^CH-CO-OH nh₂ (L-aminokyselina)

-12CZ 284168 B6

Y = (CH₃)₂N-, cch₃ch₂ch₂)₂N-, ich₃ch₂)₂ν-,

2. Syntéza peptidů

Syntéza začíná na C-konci peptidu a provádí se postupem v tuhé fázi na benzhydryiaminhydrochloridové (BHA) pryskyřici způsobem, který zavedl Merrifield. Jedná se o třístupňový postup, který zahrnuje zakotvení, kondenzaci a odštěpení. Jako hlavního rozpouštědla pro promývání mezi jednotlivými stupni reakce se používá dichlormethanu (DCM) a pokud je to potřebné, používá se také isopropylalkoholu (IPA) aN,N-dimethylformamidu (DMF). Kondenzační reakce 10 je katalyzována nadbytkem dicyklohexylkarbodiimidu (DCC), přičemž se přidává vhodné množství 1-hdroxybenzotriazolu (HOBT). Stupeň kondenzační reakce se sleduje Kaisesovou ninhydrinovou metodou. Pokud se při Kaisesově zkoušce naměří pozitivní výsledek, provádí se kondenzace podruhé. Peptidový řetězec se odštěpí od pryskyřice za použití bezvodého

- 13CZ 284168 B6 fluorovodíku (HF) za přítomnosti anisolu, po ukončení všech potřebných reakcí, které mají na pryskyřici proběhnout, přičemž současně dojde k odštěpení všech dočasně přítomných chránících skupin. Po promytí ethylacetátem nebo etherem se LHRH antagonisty, jakožto surové produkty, získají extrakcí vodnou kyselinou octovou, po níž se provede lyofilizace. Výtěžek je vyšší než 50 %.

3. Purifikace peptidů (1) Peptid se čistí gelovou chromatografii nebo rozdělovači chromatografii na silikagelu za použití sloupce o výšce 60 až 100 cm, přičemž monitorování se provádí pomocí UV záření a chromatografie na tenké vrstvě. Jednou přečištěné antagonisty LHRH se získají lyofilizací hlavních frakcí. Výtěžek je 50 až 90 % a čistota může být nad 90 %.

(2) Potom se peptid přečistí vysoce účinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) na zařízení Waters, za použití sloupce s reverzní fází C18 (7,8 x 300 mm, μ-Bondapak 84176). Výtěžek v tomto stupni je 20 až 50 %, přičemž dosažená čistota není nižší než 99 %.

4. Analýza peptidů na čistotu (1) Analýza TLC

Tato analýza se provádí na plastovém listu s nánosem silikagelu 60 F254 o výšce 5 až 10 cm. Po vyvíjení pěti různými rozpouštědlovými systémy vykazují všechny peptidy jedinou skvrnu.

(2) Analýza HPLC

Za použití eluce dvěma druhy rozpouštědlových systémů a zařízení pro vysoce účinnou kapalinovou chromatografii Waters s analytickým sloupcem μ-Bondapak 27324 vykazují všechny peptidy při monitorování UV 210 jediný pík. Velikost vzorkuje 10 až 200 pg.

5. Analýza aminokyselin v peptidů

Metodou PICO - TAG, která byla vyvinuta firmou Waters Company, se 50 μg vzorku, který byl 2 hodiny sušen za sníženého tlaku, naváží na analytických vahách s přesností na 10'⁵ g. Vzorek se rozpustí ve vodě a alikvotní díl (10 μg) se umístí do zkumavky, do níž byla předložena podle předpisu 1:1 kyselina chlorovodíková (obsahující 1 % fenolu).

Reakce probíhá po dobu 22 až 24 hodin při 105 °C v uzavřené nádobě, která byla předem naplněna dusíkem a evakuována, aby se ze zkumavky odstranil kyslík. Přidá se isothiokyanát pro derivatizaci aminoskupiny, která proběhne po odpaření nadbytku kyseliny chlorovodíkové. Analýza se provádí pomocí přístroje pro provádění HPLC, vybaveného sloupcem pro analýzu aminokyselin PICO - TAG, přičemž monitorování se provádí pomocí UV 254. Vypočítá se obsah každé aminokyseliny ajejí relativní molámí podíl, aby se zjistilo aminokyselinové složení vzorku. Měření se provádí na základě srovnání integrované plochy pro každou aminokyselinu s integrovanou plochou standardního vzorku H firmy Waters. Pro kontrolu se také používá klasického postupu derivatizace s ionexem a ninhydrinem (IEN), který poskytuje stejné výsledky. Pro dosažení uspokojivého výsledku je však při posledně uvedené metodě zapotřebí 10-ti násobného množství vzorku.

6. Hodnocení biologické účinnosti

Používá se Corbinovy antiovulační metody na krysách. Při tomto pokusu se použije zdravých dospělých krysích samic SD (o tělesné hmotnosti 200 až 250 g). Všechna zvířata se chovají při

- 14CZ 284168 B6 až 24 °C v režimu 14 hodin světlo/10 hodin tma. Podává se jim standardní krmivo a voda ad libitum. Pro tento experiment se může používat krys vykazujících alespoň dva po sobě následující čtyřdenní cykly estru, což se zjistí zkouškou vaginálního výtěru. Krysám se podají peptidy (LHRH antagonisty) v kulminující fázi proestru různé dávce v roztoku chloridu sodného. Následující den se krysy usmrtí ajejich vejcovody na obou stranách se prohlédnou disekčním mikroskopem, aby se zjistil počet vajíček. Krysy se rozdělí do několika skupin podle dávkování, přičemž každá skupina zahrnuje přibližně 10 krys. Kontrolní skupina, v níž krysy dostávají stejné množství roztoku chloridu sodného, zahrnuje 9 až 10 krys.

Antiovulační účinnost (AOA) se zjistí z následující rovnice:

počet neovulujících krys

AOA =------------------------x 100 celkový počet ošetřených krys

7. Hodnocení účinnosti na uvolňování histaminu (1) Zkouška uvolňování histaminu (HRT) in vitro:

Při této zkoušce se používá zdravých dospělých samců krysy SD (o tělesné hmotnosti 200 až 50 g), kteří se chovají za stejných podmínek, jaké byly uvedeny výše. Po anestetizaci oxidem uhličitým se peritoneální dutina promyje 50 ml media PIPES AC, obsahujícího 20 jednotek heparinu. Po 8 minutovém odstřeďování při 200 x g při 4 °C se buňky znovu promyjí a nakonec resuspendují na koncentraci 8 až 24 x 10³ leukocytů, celkem, v ml media PIPAS AC. Tato suspenze obsahuje přibližně 5 až 10% mastocytů. Promytých buněk se použije ihned po odebrání a 5 minut se předehřívají na 37 °C, načež se 0,3 ml alikvotní vzorky odpipetují do polystyrénových zkumavek, které obsahují 0,3 ml zředěného peptidu. Směsi se 15 minut inkubují při 37 °C a potom se reakce zastaví 15-minutovým odstřeďováním při 400 x g, při 4 °C. Supematant se zkouší na obsah histaminu manuální fluorometrickou metodou po extrakci nejprve nbutanolem a potom n-heptanem. Obsah histaminu se může zjistit ze standardní křivky pro histamin (viz dále). Procentický podíl uvolněného histaminu je možno vypočítat z následující rovnice:

E-B podíl uvolněného histaminu (%) = --------x 100

C-B kde E představuje fluorometrický údaj naměřený u experimentálního vzorku, B představuje fluorometrický údaj naměřený u vzorku obsahujícího pouze buňky a tlumič aC představuje fluorometrický údaj úplného vzorku (buňky ošetřené kyselinou chloristou).

Standardní křivku je možno sestrojit vy nesením fluorometrických hodnot OD při 350 nm/450 nm (aktivace/fluorescence) proti koncentraci sériově zředěného roztoku přesně naváženého hydrochloridu histaminu. Relativní parametr r histaminové standardní křivky může mít hodnotu 0,9998. Nejnižší zjistitelná koncentrace histaminu je 0,5 ng/ml.

Hodnotu ED₅o peptidu je možno získat z křivky závislosti dávka-odpověď, která se získá vynesením množství uvolněného histaminu proti koncentraci peptidu na semilogaritmickém papíru.

Všechny peptidové vzorky by měly být zkoušeny s mastocyty od přinejmenším tří různých krys.

(2) Zkouška kutánní anafý taktické účinnosti (CAT)

Při této zkoušce se používá zdravých dospělých krysích samic SD (o tělesné hmotnosti 250 g). Krysám se intravenózně vstříkne Evanova modř (1 ml, 0,05 % roztoku). Ihned poté se krysám do

- 15CZ 284168 B6 oholeného místa na hřbetu vstříkne 0,05 ml roztoku peptidu (o koncentraci 5, 0,5 a 0,05 pg/ml) a roztoku chloridu sodného (kontrolní pokus). 30 minut po injekci se krysy usmrtí a prohlédne se jim kůže na hřbetě. Průměr lézí v mm se změří ve dvou na sebe kolmých směrech pomocí měřidla s noniem. Průměr u kontrolního zvířete je obvykle nižší než 5,5 mm.

Také se může spektrofotometricky změřit množství Evanovy modři, které pronikne do kůže z cév. Kůže z oblasti léze se seřízne a ponoří přes noc do směsi acetonu a roztoku chloridu sodného (7:3, objemově). Po odstředění se následující den spektrofotometricky změří obsah Evanovy modři v supematantu proti referenčnímu roztoku aceton/roztok chloridu sodného (7:3). Na měření se používá spektrofotometru UV 260 a pracuje se při 610 nm. Každý peptid se zkouší minimálně na třech různých krysách.

Výše popsaným způsobem se navrhnou a zkonstruují různé nové antagonisty LHRH. Nové struktury těchto antagonistů LHRH se dosáhne jednoduchou nebo několikanásobnou substitucí různými přirozenými nebo nepřirozenými aminokyselinami uvedenými v předchozích odstavcích.

Část příkladů nových antagonistů LHRH, které byly tímto způsobem získány je ilustrována v tabulce 1.

Tabulka 1 část příkladů podle vy nálezu

analog AA¹rodič NAc-D'	AA² !Na DpCIPhe	AA³ AA⁴ D3Pal Ser	AA⁵ Tyr	AA⁶ AA⁷ AA⁸ AA⁹ AA¹⁰
DArg Leu	Arg Pro DAla-NH₂
			Arg
			Arg	Dphe	Pip
			Arg	DMop	Pip
			Arg	DPhe	Mop
			Mop	D3Pal
		DPip	Mop	DMop	Pip
			Arg	D3Pal	Pap
			Arg	D3Pal	Pip
			DFPhe	D3Pal	Pap
				DPip	Eap
				DMap	Mop
		DPhe	Arg	DMop	Map
		DpCIPhe		DPip	Map
		DPhe	Arg	D3Pal
			Eap		Mop
			Tep	DMop	Pep
			Tep	DMap	Mop
			Tep	DEap
			Tep	DBap
			Tep	DPap
			Tep	DTep
	DpFPhe	D3Pal		DMop	Mop
	DPhe		Mop	DMop	Eap
				DPip	Pap
				DBaP	Pip

- 16CZ 284168 B6

Tabulka 1 (pokračování)

analog AA¹	AA²	AA³	AA⁴	AA⁵	AA⁶	AA⁷	AA⁸	AA⁹ AA¹⁰
rodič NAc-D2Na DpCIPhe	D3Pal	Ser	Tyr	DArg	Leu	Arg	Pro DAla-NH,

Tep	DMop	Eap
	Tep	DMop DTeP DMop DTep
DpCIPhe
DpCIPhe	Mop Mop Arg Arg Arg	DMop DMop D3Pal DMop DPip DTeP D3Pal	Pip Bap Pip
	Arg	D3Pal	Pip
	Arg	D3Pal	Mop
	Arg	D3Pal	Tep
	Arg	D3Pal	Pap
	Arg	DTep	Pip
	Arg	DTep	Mop
DPhe	Arg	DTep	Tep
DFPhe	Arg	DTep	Map
DFPhe	Arg	DTep	Eap
DFPhe	Arg	DTep	Pap
Mep	Tep	DPap	Bap
Aplikace vynálezu
1. Po dokončení preklinické farmakologické	a toxikologické studie,	se může těchto nových
antagonistů LHRH, které mají vysokou terapeutickou účinnost a nízké	vedlejší účinky používat

v klinické praxi pro vývoj nových léčiv, která jsou určena pro léčbu endometriosis a poruch reprodukčního endokrinologického systému, včetně předčasné puberty u dětí, rakoviny prostaty a rakoviny prsu. Jelikož tyto látky potlačují sekreci gonadotropinu tím, že soutěží o receptor s endogenní LHRH a působí rychle, vratně a bezpečně, je možno jich použít při vývoji nových antikoncepčních prostředků pro obě pohlaví. Také jich lze použít pro léčbu neplodnosti a selektivní a reverzibilní vyřazení podvěsku mozkového z funkce prostřednictvím sekrece gonadotropinu.

Vzhledem k tomu, že se jedná o peptidová léčiva není orální podávání antagonistů LHRH, které jsou popsány výše, pravděpodobné. Je však snadno možno je zpracovat na lyofilizovaný prášek, který je snadno rozpustný v roztoku chloridu sodného, za vzniku injekčního roztoku, který lze podávat intravenozné, subkutánně nebo intramuskulámě.

Studováno je také použití dlouhodobě působících dodávkových systémů, jako jsou biodegradovatelné injektovatelné kapsle. Tyto kapsle je možno implantovat subkutánně pomocí speciální injekční stříkačky, přičemž po uvolnění jej celého peptidového obsahu se absorbují okolní tkání, aniž by bylo nutno je chirurgicky odstraňovat. Dlouhodobě působící dodávkové systémy jsou zvláště užitečné při dlouhodobém podávání analogů LHRH v klinické praxi.

- 17CZ 284168 B6

Dále jsou uvedeny výsledky analýz naměřené v několika případech, při nichž se jako typických příkladů použilo analogů vzorce IV, V a VII.

(1) Čistota

Chromatografie na tenké vrstvě (TLC)

Na každém chromatogramu, který byl vyvíjen pěti různými rozpouštědlovými systémy, se vyskytuje pouze jediná skvrna.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC)

Na každém chromatogramu eluovaném dvěma různými rozpouštědlovými systémy se vyskytuje pouze jediný pík.

Hodnoty Rf a retenční doby TR jsou uvedeny v tabulce 2, spolu s odkazy na obr. 1 až 4.

Tabulka 2

Chromatografická analýza výsledných antagonistů LHRH

Analogy	TRI	HPLC TR2 (min)	TLC
Rfl	Rf2	Rf3	Rf4	Rf5
IV	7,55	5,26	0,23	0,21	0,31	0,19	0,65
V	7,90	8,11	0,32	0,30	0,35	0,30	0,69
VII	16,19	9,58	0,17	0,08	0,16	0,40	0,12

Roztok A + 80 % acetonitrilu

Rozpouštědlový systém 2:

Roztok A: 0,10M KH₂PO₄, ve vodě (pH 3)

Roztok B: 20 % roztoku A + 80 % acetonitrilu

TLC rozpouštědlový systém:

1. nBuOH/EtOAc/HOAc/H₂O (5:5:1:1)

2. nBuOAc/nBuOH(HOAc/H₂O (2:8:2:3)

3. nBuOAc/HOAc/H₂O (4:1:5), horní fáze

4. nBuOH/HOAc/H₂Ó (4:1:2)

5. nBuOH/EtO Ac/HOAc/H₂O (1:1:1:1) (2) Analýza aminokyselin

Analýza se provádí klasickou metodou IEN a novou metodou PICO-TAG. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3 a na obr. 5 a 6.

-18CZ 284168 B6

Tabulka 3

Složení aminokyseliny v antagonistech LHRH

Analog	metoda	Ser	Arg	Ala	Pro	Leu	Phe	Pal	pCIPhe	Nal
IV	IEN	0,86	2,05	1,01	0,99	1,13		+	+	ND
	PICO-TAG	0,92	2,25	0,91	1,01	0,91		+	+	+
V	IEN	0,81	2,02	1,03	1,03	0,12	0,99	+	+	+
	PICO-TAG	0,68	2,26	0,93	1,29	1,04	1,00	+	x	+
VI	IEN	0,91	0,91	1,00	1,00	1,09		+	+	ND

ND: nestanovena (3) Výsledky biostanovení

Výsledky biostanovení, včetně antiovulační účinnosti při různých dávkách a hodnot ED₅o pro účinnost vztahující se k uvolňování histaminu in vitro jsou ilustrovány v tabulce 4, v níž je uvedeno 26 antagonistů, jako příklady.

Tabulka 4

Výsledky biostanovení nových antagonistů LHRH založených na rodičovské struktuře*

substituované aminokyseliny	0,125	0,25	% AOA/mg 0,5	1,0	2,0	HRA (mg/ml) ED₅₀±SEM
1	rodič		50	75	100		3,5 ± 0,38
2	DPhe		29	60	100		7,4 ± 0,98
3	Dphe, DPhe				0		18,5 ±7,00
4	Dtyr, Lys				40		5,1 ±2,15
5	D-Phe					60	35,0 ± 5,05
6	Map			29			24,8 ± 4,47
7	Eap			43			12,0 ±0,50
8	Pap			0			9,6 ±0,19
9	Bap			14			23,5 ± 5,78
10	D-Map			12,5			18,3 ±2,38
11	Tep			14			36,8 ±5,68
12	Pip	17	33	71	100		9,4 ± 1,63
13	Mop			25	100		14,7 ±2,70
14	D-Map			14			19,5 ±2,50
15	D-Eap			14			13,0 ± 1,00
16	D-Tep			71			22,5 ± 3,25
17	D-Pip			0	50	57	7,6 ± 2,48
18	D-Mop		33	67	100		>11
19	Map			57	100		5,4 ± 1,22
20	Eap				29		56,9 ± 15,1
21	Pap				50	88	70,4 ± 26,8
22	Bap				0		>235
23	Tep				100		6,6 ±2,13

-19CZ 284168 B6

Tabulka 4 (pokračování)

substituované aminokyseliny 0,125 0,25	% AOA/mg 0,5	1,0	HRA (mg/ml) 2,0 ED50 ± SEM
24 Pip		43	27,5 ± 2,50
25 Mop		71	52,5 ± 17,5
26 D-Map		0	28,0 ± 9,00

* Rodičovská struktura je: [NAc-D2Nal’, DpClphe², D³PA1³, Ser⁴, Arg’, D³PA1⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂

SEM = směrodatná odchylka

Jak je ilustrováno a popsáno výše, vykazují antagonisty LHRH navržené a syntetizované podle vynálezu velmi dobré vlastnosti. Podle analýz TLC nebo HPLC jsou čisté. Jejich složení je správné, tj. odpovídá složení navrženému. Mají vysokou účinnost proti plodnosti: mohou inhibovat ovulaci krysy po subkutánní injekci v dávce 0,1 až 2,0 mg v době vrcholícího proestru. Jejich vedlejší účinek, který se projevuje uvolňováním histaminu, je nízký: Hodnota ED50, která se vztahuje k účinnosti uvolňování histaminu in vitro (účinná dávka, která má za následek uvolnění 50 % histaminu z mastocytú krysy) je v rozmezí od 5 do 300 pg/ml, léze indukovaná těmito látkami při kutánní anafylaktické zkoušce u krysy je tak malá, jak je to nutné v klinické praxi. Rozpustnost ve vodě těchto látek je velmi dobrá, všechna biologická stanovení byla prováděna v roztocích chloridu sodného. To se projevuje snadnou zpracovatelností těchto látek na injekční preparáty. Snadná je i zpracovatelnost těchto látek na dlouhodobě působící dodávkové systémy, z nichž jsou pro dlouhodobé potlačení gonadotropinu a gonadálních hormonů nejúčelnější injektovatelné mikrokapsle. Látek podle vynálezu je tedy možno používat jako vysoce účinných, reverzibilních a bezpečných antikoncepčních prostředků pro obě pohlaví. Také jich lze používat pro léčbu různých chorob, které mají vztah k poruchám reprodukčního endokrinologického systému, jako je rakovina prostaty závislá na hormonech, rakovina prsu, endometrióza a předčasná puberta u dětí. Také jsou užitečné při léčbě neplodnosti. Nových antagonistů LHRH, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je také možno používat v základním výzkumu reprodukční fyziologie a farmakologie, jako při studiích funkce hypofyzy, účinku gonadálních hormonů a gonadotropinů nebo LHRH na sexuální chování atd.

Zkratky

V textu tohoto popisu se používá následujících zkratek:

Ala alanin

AOA antiovulační účinnost

Arg arginin

Bap dibutylaminomethylfenylalanin

Boc t-butyloxykarbonyl

BuoAc butylacetát

CAT kutánní anafylaktický test

DCC dicyklohexylkarbodiimid

DCM dichlormethan

D2Nal E)-[3-(2-naftyl)alanin

D3Pal D-p-(3-pyridyl)alanin

DpCIPhe p-chlor-D-fenylalanin

DpFPhe p-fluor-D-fenylalanin

D6QA1 D-|3-(6-chinolyl)alanin

DMF N,N-dimethylformamid

Eap diethylaminomethylfenylalanin

-20CZ 284168 B6

ED50 účinná dávka pro 50 % odpověď

EtOAc ethylacetát

FSH hormon stimulující folikuly

Glu glutamová kyselina

Gly glycin

His histidin

HOBT 1-hydroxybenztriazol

HPLC vysoce účinná kapalinová chromatografie ninhydrinová derivatizace

HRA účinnost na uvolňování histaminu

HRT zkouška uvolňování histaminu

IEN ionexová chromatografie s dodatečnou kolonou

IPA isopropylalkohol

LH luteinizační hormon

LHRH hormon uvolňující luteinizační hormon

Leu leucin

Lys lysin

Map dimethylaminomethylfenylalanin

Met methionin

Mop morfolinomethylfenylalanin

NAc-D2Nal‘ N-acetjl-D-2-naftylalanin nBuOH n-buty lalkohol

NS normální roztok chloridu sodného

Pap dipropylaminomethylfenylalanin

Phe fenylalanin

Pip piperidinomethylfenylalanin

Pipes piperazin-N,N'-bis[2-ethansulfonová kyselina]

Pro prolin

Rf toková rychlost

SE směrodatná odchylka

Ser serin

TFA trifluoroctová kyselina

TLC chromatografie na tenké vrstvě

TR doba retence

Trp tryptofan

Tyr tyrosin

Tep tetrahvdroperrolylmethylfenylalanin

Claims

1. Peptid vykazující sekvenci [NAc-D2Nal‘, AA², AA³, Ser⁴, AA⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, AA⁸, Pro⁹, DAla'°]NH₂, kde zbytek AA² je zvolen ze souboru zahrnujícího DpCIPhe² a DPhe², zbytek AA³je zvolen ze souboru zahrnujícího D3Pal³ a DPhe³, zbytek AA⁸ je zvolen ze souboru zahrnujícího Arg⁸ a Pap⁸ a zbytek AA⁵ je zvolen ze souboru zahrnujícího Mop⁵, Arg⁵ a Tyr⁵, přičemž, když AA⁵ je Mop⁵, potom AA² je DpCIPhe² nebo DPhe², AA³ je D3Pal³ a AA⁸ je Arg⁸; když AA⁷ je Arg⁵ a AA³ je DPhe³, potom AA² je DpCIPhe² nebo DPhe² a AA⁸ je Arg⁸, když AA⁵ je Arg⁵a AA³ je D3Pal³, potom AA² je DpCIPhe² a AA⁸ je Pap⁸; a když AA⁵ je Tyr⁵, potom AA² je DpCIPhe² nebo DPhe², AA³ je DPhe³ a AA⁸ je Arg⁸.

2. Peptid podle nároku 1, vykazující sekvenci [NAc-D2Nal’, DpCIPhe², DPhe³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla‘°]NH₂.

3. Peptid podle nároku 1, vykazující sekvenci [NAc-D2Nal*, DpCIPhe², DPhe³, Ser⁴, Tyr⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla¹⁰]NH₂.

4. Peptid podle nároku 1, vykazující sekvenci [NAc-D2Nal^l, DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Mop³, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla'°]NH₂.

5. Peptid podle nároku 1, vykazující sekvenci [NAc-D2Nal’, Dphe², D3Pal³, Ser⁴, Mop⁷, D3Pal⁶, Leu⁷, Arg⁸, Pro⁹, DAla^l0]NH₂.

6. Peptid podle nároku 1, vykazující sekvenci [NAc-D2Nal', DpCIPhe², D3Pal³, Ser⁴, Arg⁵, D3Pal⁶, Leu⁷, Pap⁸, Pro⁹, DAla^l0]NH₂.

7. Použití peptidu podle některého z nároků 1 až 6 pro výrobu léčiva pro léčení poruch reprodukčního endokrinního systému a rakoviny prostaty a prsu.

8. Použití peptidu podle některého z nároků 1 až 6 pro výrobu léčiva pro použití jako antikoncepčního činidla a pro diagnostiku a léčení neplodnosti.