PL170564B1

PL170564B1 - Sposób wytwarzania antagonisty hormonu uwalniajacego hormon luteinizujacy ssaków PL PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL170564B1
Application number: PL91295427A
Authority: PL
Inventors: Shaobo Xiao
Original assignee: Asta Medica Ag
Priority date: 1990-11-10
Filing date: 1993-05-10
Publication date: 1996-12-31
Also published as: DE69125024T2; GR3023389T3; FI933156A; CA2095932A1; LT3971B; CZ84893A3; CN1061605A; KR100244624B1; UA41300C2; CA2095932C; LV10106A; DE69125024D1; HRP920585A2; KR930703353A; IE913915A1; LV10106B; HRP920585B1; YU177991A; PT99458B; SI9111779A

Abstract

Sposób wytwarzania antagonisty hormonu uwalniajacego hormon luteinizujacy ssaków [NAc-D2Nal 1 DpClPhe 2-D3Pal 3-Ser4-Mop 5-D3Pal6 -Leu 7-Arg8-Pro 9-DAla 10]NH 2, [NAc-D2Nal 1 DpCIPhe 2-D3Pal 3-Ser4-Arg5-D3Pal 6-Leu 7-Pan8 -Pm 9DAla 10]NH 2 albo [NAc-D2Nal1-DpClPhe2-DPhe3-Ser4-Arg5 -D3Pal6-Leu7-Arg8 -Pro9 -DAla10]NH 2, znamienny tym, ze wytwarza sie wyzej wymienione polipeptydy na drodze syntezy peptydów na fazie stalej wedlug Merrfield’ a w naczyniu reakcyjnym do syntezy peptydów z zywica metylobenzhydryloaminopolistyrenodiwi- nylobenzenowa oznaczona skrótem MBHA, stosujac zwykle metody syntezy sekwencji dla oligopeptydów w nastepujacych etapach a) koncowy wegiel BOC-D-alaniny wiaze sie kowalencyjnie do zywicy MBHA, stosujac trzykrotny molamy nadmiar kazdego diizopropylokarbodiimidu, oznaczonego skrótem DIC i 1-hydroksybenzotria - zolu, oznaczonego skrótem HOBt w dichlorometanie, b) rozszczepia ilosciowo zabezpieczony BOC 50% kwasem trifluorooctowym w CH2Cl2, a naste- pnie c) zobojetnia 10% diizopropyloetyloamina oznaczona skrótem DIPEA w CH2Cl2, d) wydluza sie lancuch odpowiednio do zakonczenia sekwencji w trzykrotnym nadmiarze kazdego kwasu BOC-aminowego (DIC)HOBt, zakoncza acylacje, co potwierdza sie ninhydrynowa metoda Kaiser’a albo testem chloroamlinowym i w przypadku niepelnego przylaczenia prowadzi sie dodatkowo reakcje sprzegania, za pomoca nadmiaru acetyloimidazolu, e) odszczepia sie lancuch peptydowy od polimerycznego nosnika stosujac nadmiar cieklego fluo- rowodoru w anizolu, f) oddziela sie surowe peptydy w wodnym roztworze kwasu octowego od zywicy, wytraca pod zmniejszonym cisnieniem i oczyszcza na drodze preparatywnej HPLC, stosujac standardowe rutynowe fazy odwrócone. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania antagonisty hormonu uwalniającego hormon luteinizujący ssaków.

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania nowych peptydów należących do klasy dekapeptydów i ich pochodnych mających określoną budowę chemiczną. Hormon podwzgórza uwalniający hormon luteinizujący (LHRH) działa na przedni płat gruczołu przysadki stymulując wydzielanie hormonu luteinizującego (LH) i hormonu pęcherzykowego pobudzającego (FSH). Antagonistyczny analog LHRH działa na przedni płat przysadki szybko, długotrwale i może być bezpiecznie i odwracalnie stosowany dla celów antykoncepcji i selektywnego hamowania wydzielania gonadotropiny. W tego rodzaju zastosowaniach antagoniści LHRH mają przewagę nad agonistami.

Do chwili obecnej zostało zaprojektowanych i zsyntetyzowanych ponad dwa tysiące analogów LHRH, a wśród nich analog Nal-Arg wykazywał bardzo wysoką zdolność ograniczania płodności. Jednakże analog Nal-Arg wykazywał również bardzo silną zdolność uwalniania histaminy (HRA). Przy podawaniu w dawkach wysokich, 50-100 razy wyższych niż dawka terapeutyczna, powodował przejściowy obrzęk pyska i łap u szczurów. Badania kliniczne wykazały efekty systemiczne wywoływane przez histaminę. Inne związki antagonistyczne LHRH, zawierające DArg⁶ lub DLys^ wykazywały podobne działania uboczne, ich ED50 dla HRA miało wartość niższą 1 pg/ml. Niniejszy wynalazek dostarcza nowe związki będące

170 564

-DpClPhe²-DPhe³-Ser⁴-Arg⁵-D3Pal⁶-Leu7

Arg⁸-Pro⁹-DAia¹⁰]NH2.

antagonistami LHRH i posiadające bardzo wysoką zdolność hamowania owulacji (AOA) i bardzo niską zdolność uwalniania histaminy (hRa), przy nieznaczonych działaniach ubocznych.

Treść i przykłady do niniejszego wynalazku są następujące:

Sposób wytwarzania według niniejszego wynalazku opiera się na podobieństwie topograficznym budowy cząsteczki związku macierzystego (NAc-D2Nal', DpCIPhe , D3Pal , Ser , Tyr5, DArg⁶, Leu⁷, Arg8, Pro⁹, DAla¹⁰)NH2 (II) i neuropeptydu, Substancji P, które cechuje modyfikacja zarówno alkalicznego jak lipofilowego obszaru cząsteczki związku macierzystego, co prowadzi do nowych antagonistów mających zarówno wysokie AOA jak niskie HRA. Termin modyfikacja ich, oznacza dostosowanie, lub podstawienie amido kwasu w obszarze TyrADarg6-Arg8 na końcu C i kwasu aromatycznego na końcu N związku II. Bardziej szczegółowo, według omawianego sposobu jest wprowadzenie odpowiedniej grupy alkalicznej i podstawienie nienaturalnych aminokwasów w pozycję 2, 3, 5, 6, 8 związku (II).

Wymiana aminokwasów w łańcuchu peptydowym prowadzi do nowych związków, które wykazują lepsze działanie farmakologiczne.

Są to:

[NAc-D2Nal¹-DpClPhe2-D3Pal³-Ser4-Mop5-D3Pal6-Leu7-Arg8-Pro9-DAla^ł0]NH2, [NAc-D2Nai^,-DpClPhe2-D3Pai³-Ser4-Arg-DPal6-Leu7-Pap8-Pro9-DAla^lθ]NH2 albo [NAc-D2Nalł

Związki antagonistyczne LHRH otrzymane według wynalazku metody mogą być, jako rodzaj leku peptydowego, stosowane w leczeniu zaburzeń endokrynologii układu rozrodczego, takich jak endometrioza, przedwczesne dojrzewanie dzieci, oraz do leczenia raka prostaty, raka sutka, jak również może być stosowany jako preparat antykoncepcyjny dla mężczyzn i kobiet, do kontroli urodzeń, a także w diagnozowaniu i leczeniu bezpłodności itd. Taki lek peptydowy może być sporządzony w postaci zwykłych iniekcji, kapsułek iniekcyjnych, lub w innych formach do konkretnego stosowania.

Opis niniejszego wynalazku przedstawia się następująco: W naturalnym toku uwalniania histaminy w ciele neuropeptyd - substancja P-odgrywa bardzo ważną rolę. Jego ED 50 dla HRA wynosi 5-15 μΜ. Chemiczna struktura SP jest (Arg- Pro2, Lys³, Pro\ Gin‘5, Gln6, Phe7, Phe8, Gly9, Leu-⁰, Met i)NH2. Badanie zależności między jego strukturą i HRA wykazało, że obecność na końcu N cząsteczki SP, Argi-Pro2-Lys3 jest zasadnicze dla jego HRA, ponieważ usunięcie tych trzech aminokwasów z cząsteczki całkowicie znosi jego HRA. I przeciwnie, usunięcie jednego, dwóch lub trzech aminokwasów na końcu C pozostawiało HRA w wysokości równej jednej czwartej HRA jako takiej. Dalsze usunięcie Phe8 i Phe7, HRA redukowało 4% i 0,57% SP. Dalsze usunięcie Gin5 6 nie powoduje istotnych zmian HRA. Powyższe dane oznaczają, że lipofilowy obszar wokół Phe7 8 przesądza o wartości HRA. Obszar ten odgrywa rolę w wiązaniu cząsteczki z receptorem komórki tucznej.

Jak wspomniano poprzednio, (D2Nali, DArg6) analogi LHRH wykazywały bardzo wysoką HRA, jego budowa cząsteczki wykazuje topograficzne podobieństwo z SP: DArg6-Leu⁷-Arg8. W pierwszym z nich okazały się odpowiadać Arg--Pro2-Lys3 w drugim, obydwa zawierają parę silnie zasadowych reszt aminokwasów, pomiędzy którymi znajduje się tylko obojętna reszta aminokwasu, to znaczy, że zarówno [D2Nal- DArg analog LHRH jak i SP zawierają dwie silnie zasadowe reszty aminokwasowe znajdujące się względem siebie w pozycjach 1, 3. Z drugiej strony, uważa się, że zakłócenia reszt aromatycznego aminokwasu w pierwszym odpowiadają obszarowi Phe7 8 w SP pod względem oznaczanej wartości HRA.

Projekt według niniejszego wynalazku składa się z dwóch faz: jedna polega na modyfikowaniu obszaru Tyr-DArg6-Arg8 na końcu C, druga to dokładne dobranie aromatycznych aminokwasów po optymalizacji modyfikacji obszaru alkalicznego na końcu C. (NAc-D2NalDpClPhe2, D3Pal³, Se/, Ty/, DArg6, Leu7, Arg⁸, Pro9, DAla-0)NH2 (II) stosuje się jako związek wyjściowy; wykazywał on AOA -00% przy 0,5 μg oleju kukurydzianym, 57% przy 0,25 μg.

Najpierw DArg6 w związku (II) może być zastąpiona przez słabo zasadowe lub obojętne kwasy aromatyczne, takie jakD3Pal, D6Qal, tetrahydrotryptofan, metylotryptofan. Gdy D3Pa/ podstawiono w miejscu DArg6 w związku (II), otrzymano (NAc-D2Nal- DpCIPhe2, D3Pa/6.

170 564

DAla¹⁰/LHRH(III). (III) wykazywał AOA 100% przy gg, 83% przy 1 gg (w oleju kukurydzianym), a jego ED 50 dla HrA wynosiła 9,8 gg/ml i była o wiele lepsza niż dla Nal-Arg analogu, którego ED50 dla HRA była niższa niż 1 gg/ml. Wydaje się, że w celu uzyskania wysokiej AOA, zasadowość całej cząsteczki powinna być równa lub zbliżona do zasadowości pary argininy. Ponieważ pozycja 5, podobnie jak pozycja 6 nie odgrywają roli w wiązaniu receptora, można w pozycję 5 podstawiać szeroką gamę różnorodnych aminokwasów, z argininą włącznie.

Zaprojektowano serię nowych analogów. Na przykład, podstawienie Arg⁵ zamiast Tyr w związku (III) daje (Nac-DNal¹, DpClPhe², D3Pal, Arg⁵, DAla’0) LHRH (IV). Zarówno (IV) jak i (II) zawierały dwie argininy, ale odległość między dwoma argininami w (IV), których wzajemny układ stał się 1, 4, to jest między tymi dwoma argininami znajdowały się dwa inne aminokwasy, była większa niż w związku (II). Dlatego też HRA mogła być zredukowana, a z drugiej strony, z powodu obecności dwóch arginin, AOA nie powinna być niższa niż dla związku (II). Wyniki testów biologicznych dla związku (IV) wykazały wartość ED50 dla HRA 3,5 gg/ml, podczas gdy, AOA wynosiła 60% przy 0,12 gg (olej kukurydziany), 85% przy 0,25 |ig, 100% przy 0,5 gg. Był to pierwszy przypadek osiągnięcia przez jednego z antagonistów LHRH ED 50 dla AOA, równej lub niższej niż 0,125 gg. Dlatego też dalsze projektowanie oparto na strukturze związku (IV). W cząsteczce związku (IV) znajdują się cztery reszty zasadowe, D3Pal^{3 6} i Arg5⁸, podczas gdy związek (II) zawiera tylko trzy reszty zasadowe. Dlatego też racjonalne jest zastąpienie jednego D3Pal obojętnym aminokwasem; z drugiej strony, związek (IV) wykazywał bardzo silną hydrofilność i obniżenie jej przez podstawienie hydrofobowego aminokwasu w miejsce DPal w związku (IV) byłoby korzystne dla zatrzymywania leku w organizmie, a następnie dla wydłużenia czasu efektywnego działania. Zaprojektowano nową serię analogów uzyskaną przez zastąpienie D3Pal³. Związek (V) wykazywał 100% AOA przy 1 gg (w roztworze soli), co było równe wartości dla związku macierzystego (IV), podczas ądy HRA redukował o połowę: ED50 dla HRA wynosiła 7,4 gg/ml. Dalsze podstawienie DPhe“ w miejsce DpClPhe2 obniżyło lipofilowość tego obszaru cząsteczki i obniżyło HRA.

Arg5-D3Pal6-Leu⁷-Arg⁸ na końcu C związku (IV) wydaje się odgrywać główną rolę w zapoczątkowywaniu uwalniania histaminy. D3Pal łączy w jednej cząsteczce aromaty czność, zasadowość i hydrofilowość, jest również do przyjęcia pod względem budowy przestrzennej jako antagonista LHRH do wiązania receptorów. Podobnie, projekt nowej serii nienaturalnych aminokwasów posiadających taki sam charakter jak D3Pal może prowadzić do lepszych antagonistów LHRH niż związki (IV) lub (V).

Modyfikowanie naturalnego, lipofilowego, aromatycznego AMINokwasu, na przykład fenyloalaniny, na przykład przy użyciu metody opisanej poniżej w syntezie nowych nienaturalnych aminokwasów, prowadzi do serii nowych aminokwasów, które łączą w cząsteczce aromatyczność, hydrofilowość i zasadowość i mogą być wyrażone wzorem: RiR2NCH2C6H4CH2CH(NH)COOHTV), w którym Ri R2 mogą byćjednakowe, lub różne i mogą mieć postać podobną do łańcucha lub cykliczną i mogą również zawierać heteroatom. Zmieniając R1 i R2 można otrzymać serie aminokwasów wykazujących systematycznie zmieniające się zasadowość, hydrofilowość i charakter przestrzenny. Wprowadzenie tych aminokwasów w pozycje 5,6,8 związku (IV) dało trzy serie nowych antagonistów LHRH. Wyniki testów biologicznych wykazały, że każda seria dostarcza co najmniej jednego nowego antagonistę wykazującego 100% AOA przy 1 gg, podobnie do związku (IV), podczas gdy HRA była znacznie niższa Przykładem był związek (VII): (NAc-D2Nal1, DpCIPhe2, D3Pal³, Ser⁴, Mop5, D3Pal6 Leu7, Arg8, Pro⁹, DAla10)-NH2, który wykazywał 1100%o AOA przy 1 gg, ED50 14,7 gg dla HRA i był lepszy niż związek (V). Przy podstawieniu związku (IV) w miejsce Arg8 w związku (VI) stopień zmniejszania się HRA był dodatnio uzależniony od długości łańcucha w związku (VI), tak że ED50 dla HRA mogła być wyższa niż 200 gg/ml; taki rodzaj związków może być łatwo rozpuszczony w wodnym roztworze i można oczekiwać, że ich kliniczne stosowanie nie nastręczy problemów z wytwarzaniem formy farmaceutycznej. Wyniki wykazały, że Arg8 lub Lys8 nie były decydujące dla antagonistów LHRH o wysokiej aktywności. Odpowiednio alkaliczne centrum w pozycji 8 może zapewnić wysoką wartość AOA, podczas gdy działanie stymulujące komórki tuczne do uwalniania histaminy zmniejszało się znacznie, gdy wymienione powyżej centrum zasadowe posiadało znaczące przeszkody przestrzenne.

170 564

Niniejszy wynalazek łącząc modyfikacje zarówno końca N jak i końca C prowadzi do związków będących lepszymi antagonistami LHRH.

Procesy syntetyczne przedstawiają się następująco:

1. Synteza nowych nienatnrelnyuh amih okwjnów. Ponad on serii i nie -serii D- lub L-aminokwasów zaprojektowano i zsyntetyzowano czterema drogami przedstawionymi na poniższym schemacie. Struktury tych nienaturalnych aminokwasów przedstawione są za pomocą ogólnych wzorów strukturalnych zestawionych w tym samym schemacie. Niektóre z tych aminokwasów mają odpowiednio, zasadowość, hydrofilowość i aromatyczność, podczas gdy inne mają wszystkie te cechy w cząsteczce łącznie.

Droga 1 Droga 2

HCl

ArNH,

NaNO,

ArCH₂Cl

NaOEt + HC(C00Et)„

I ²

NH-Ac

ArN^Cl

ArCH C(C00Et)₂ ch₅_=chooh

NHeAc

NaOH/EtOH d, l-ArCH₂CHC00H

Cl nh₃/h₂o

COONa

I

ArCH„-C-C00Et

I

NH-Ac d,l-ArCH CHCOOH

NH,

COOH

Agp

Ar-CH₂-C-C00Et

I

NH-Ac d,l- ArCH₂CHC00H

NH-Ac

S0U₂/Et0H

170 564

d,1-ArCH₂CHC00Et

NH-Ac NH-Ac

HCl

Ψ d-ArCH₂CHC00H

1-ArCH₂CHC00H nh₂.hci

Dwuwęglan dibutylu

V d-ArCH₂CHC00H nh₂.hci

Dwuwęglan dibutylu

1-ArCH₂CHCOOH

NH-Boc

NH-BOc

170 564

NH-Boc i

Droga I D lub L-Ar-CH₂CH-C00H gdzie

Droga II D lub L-ArCH -CH-C00H gdzie

I

NH-Boc

170 564

-CH CHCOOH

I

NHC0CH₃

Drogalll

-CH„CHCOOEt ²I

NHCOCH

CH CHCOOH

NHCOCH₃

ZnCl₂

CH₃OCH₂C1

Ct^C1CH2

-CH₂CHC00Et

NHCOCH

O llrz amina

EtOH

V

S0Cl₂/Et0H

V

CH_oCHC00Et ²\

NHCOCH₃

ZnCl₂CH,OCHOCI

CH CHCOOEt

I

NHCCH

O

HCl

-h₂/0>HCl

CH_nCHCOOH ²l .HCl

NI^ (1) dwuwęglan •xch₂Droga III ❖

(2) H'

W

•CHNCHCOOH ²I

NH-Boc

1-C1CH,

-eH_nCHCOOEt ²I

NHCOCH.,

II rz amina i-xch₂ —1

EtOH

CH.CHCOOEt ²I

HCl

i-xch₂-

-CH.CHCOOH ²)

NH-Boc

O’ CH₂CHC00H

NH-Boc gdzie θ' , [3^4- RaN- RR?

170 564

KHC0₃

Ar-CHO+C_cH_-CO-NHCH_nCO_H

5 2 2. . _ ^Ac2°

Droga IV

Ar-CH=C-C

I

M=C ^C6^H5 stęż.HCl

H,

S0C1,

MeOH

Ar-CH=CC0_H

I ²

NH-C0-C_H o o

Pd/C

Ar-CH₂-CH-C0₂H

NH-**C0-C-H_cb o subtilizyna

Ar-CHCHCOCH 2 | 2 3

NHCOC-H,. b o pH 7,6

Ar-CH_CHCQ,CH_O2 | 5 3

NHCOC-H _cb 5

D-izomer

Ar-CH„CHCO„H 2 | 2

NHCOC-H 6 5

L-izomer

6NHC1

Ar-CH CH-CO-OH ²t

NH„

Ar-CH CH-CO-OH

Ί

NH„ (D-aminokwas) (L-aminokwas)

170 564

(c^h3)₂n-.

CH

CH (ch₃ch₂)₂n-, (ch₃ch₂ch₂)₂n-,

N-, (CH³Cfe²CH²CH²)²NCH,

170 564

Podsumowując, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania antagonisty hormonu uwalniającego hormon luteinizujący ssaków [NAc-D2Nal -DpClPhe2-D3Pal3-Ser4-Mop5D3Pal6-Leu-Arg⁸-Pro9-Dalai0)NH2, [NAc-D2Nall-DpClPhee-D3Pal3-Ser4-Arg5-D3Pai6Łeu7-Pap⁸-Pro9-DAla-⁰]NH2 albo [NAc-D2Nali-DpClPhe2-DPhe3-Ser4-Arg5-D3Pal6- Leu7 -Arg⁸-Pro9-DAla¹⁰]NH2,polegający na tym, że wytwarza się wyżej wymienione polipeptydy na drodze syntezy peptydów na fazie stałej według Merrfield’a w naczyniu reakcyjnym do syntezy peptydów z żywicą metylobenzhydryioaminopolistyrenodiwinylobenzenową oznaczonej skrótem MBHA, stosując zwykłe metody syntezy sekwencji dla oligopeptydów, w następujących etapach a) końcowy węgiel BOC-D-alaniny wiąże się kowalencyjnie do żywicy MBHa, stosując trzykrotny molarny nadmiar każdego diizopropylokarbodiimidu, oznaczonego skrótem DIC i 1-hydroksybenzotriazolu, oznaczonego skrótem HOBt w dichlorometanie, b) rozszczepia ilościowo zabezpieczony BOC 50% kwasem trifluorooctowym w CH2O2, a następnie c) zobojętnia 10% diizopropyloetyloaminą oznaczoną skrótem DIPEA w CH2Cl2, d) wydłuża się łańcuch odpowiednio do zakończenia sekwencji w trzykrotnym nadmiarze każdego, kwasu BOC-ammowego (DIC)HOBt, zakończa acylację, co potwierdza się ninhydrynową metodą Kaisser’a albo testem chloroanilinowym i w przypadku niepełnego przyłączenia prowadzi się dodatkowo reakcję sprzęgania, za pomocą nadmiaru acetyloimidazolu, e) odszczepia się łańcuch peptydowy od polimerycznego nośnika stosując nadmiar ciekłego fluorowodoru w anizolu, f) oddziela się surowe peptydy w wodnym roztworze kwasu octowego od żywicy, wytrąca pod zmniejszonym ciśnieniem i oczyszcza na drodze preparatywnej HPLC, stosując standardowe rutynowe fazy odwrócone.

W sposobie według wynalazku uzyskuje się antagonistę, który wykazuje zwiększoną aktywność antyowulacyjną i niższą zdolność uwalniania histaminy.

2. Synteza peptydu. Syntezę na żywicy z chlorowodorkiem benzydryloaminy (żywica BHA) rozpoczyna się od końca C, stosując wprowadzoną przez Merrifielda metodę syntezy na fazie ciekłej. Jest to trójstopniowy proces obejmujący zakotwiczenie, sprzężenie i rozszczepienie. Głównym rozpuszczalnikiem stosowanym do przemywań między każdym z etapów jest dichlorometan, chociaż w razie potrzeby stosuje się również alkohol izopropylowy (IPA) i N,N-dimetyloformamid (DMF). Reakcję sprzęgania przeprowadza się katalizując ją dodatkiem nadmiaru dicykloheksylokarbodiimidu (DCC) przy równoczesnym dodawaniu odpowiedniej ilości - -hydroksybenzotriazolu (HOBT). Postęp reakcji sprzęgania monitoruje się ninhydrynową metodą Kaises. Druga reakcja sprzęgania może być przeprowadzona, gdy test Kaises wypada pozytywnie. Po zakończeniu wszystkich reakcji, które mają być przeprowadzone na żywicy, łańcuch peptydowy odszczepia się od żywicy stosując bezwodny fluorowodór (HF) w obecności anizolu, przy czym równocześnie następuje usunięcie wszystkich czasowo zabezpieczających grup. Po przemyciu octanem etylu lub eterem, surowe produkty stanowiące związki antagonistyczne LHRH otrzymuje się przez ekstrakcję wodnym kwasem octowym, a następnie liofilizację. Wydajność wynosi ponad 50%.

3. Oczyszczanie peptydu.

(1) Peptyd oczyszcza się chromatograficznie metodą przepuszczania przez żel (gel permeation) lub przez chromatografię rozdzielczą na żelu krzemionkowym na kolumnie wysokości 60 - -00 cm, z monitorowaniem za pomocą UV/TLC. Jeden raz oczyszczane związki antastists LHRH otrzymuje się po zliofilizowaniu głównych frakcji. Wydajność wynosi 50 - 90%, a czystość może przekraczać 90%.

(2) Peptyd jest następnie dalej oczyszczany na aparacie Watersa do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z zastosowaniem kolumny C18 do faz odwróconych (7,8 x 300 mm) (μ-Bondapak 84176). Wydajność tego etapu wynosi 20 - 50%, przy czystości nie mniejszej niż 99%.

4. Analiza czystości peptydu.

(1) Analiza TLC . Przeprowadza się ją na plastykowych płyhcacy wysokości 5- i0 cm, pokrytych żelem krzemionkowym 60 F254. Wszystkie one rozwijane w pięciu różnych układach rozpuszczalników wykazują pojedynczą plamę.

170 564 (2) Analiza KPaC. Przy zastosowaniu apiratu HPLC PLC.'W na konumole mnaMla^znej (μ-Bondapak 27324), z monitorowaniem za pomocą UV 210 przy -Iuc# dwoma rodzajami układów rozpuszczalników, wszystkie wykazują odpawiadaio pojedynczy pik. Wielkość próbki wynosi 10 - 200 μg.

5. Analiza aminokwasów w peptydzie. Według opracowanej przez firmę Waters metody PICO-TAG, na wadze z podziałką 10'⁵ g odważa się dokładnie 50 μg próbki, wysuszonej w ciągu 2 godzin pod próżnią. Po rozpuszczeniu w wodzie, 10 μg podwialokrotaoSć dodaje się do probówki zawierającej kwas solny 1:1 (zawierający 1% fenolu) według podręcznika. Reakcję prowadzi się w ciągu 22-24 godzin w temperaturze 105°C w szczelnym naczyniu wypełnionym azotem i podłączonym do próżni w celu usunięcia znajdującego się w probówce tlenu. Po odparowaniu nadmiaru kwasu solnego dodaje się izarodanak fenylu w celu utworzenia pochodnej grupy aminowej. Następnie przeprowadza się analizę na aparacie HPLC wyposażonym w kolumnę PICO-TAG do analizy aminokwasów, z woaitorowaaiam za pomocą UV 254. Na podstawie porównania uzyskanego przez całkowanie pola, dla każdego aminokwasu, z próbką wzorca H Watersa, uzyskuje się zawartość każdego aminokwasu, wzajemny stosunek molowy, co daje kompozycję aminokwasów w próbce. Jako kontrolę zastosowano również klasyczną metodę wymieniacz jonowy - pochodna z aiahydryaą (IEN) i uzyskano takie same wyniki. Jednakże dla uzyskania zadowalających wyników metoda ta wymaga dziesięciokrotnie większych próbek.

6. Ocena aktywności biologicznej: Stosuje się metodą Corbin’a oznaczania aktywności aatyowulacyjaej na szczurach. W tym doświadczeniu używa się zdrowych dorosłych samic szczurów SD (masa ciała 200 - 250 g). Wszystkie zwierzęta utrzymywano w temperaturze 22-24°C, według rozkładu 14/10h (światło/ciawaość). Podawano im standardowe pożywienra i wodę ad libitum. Do doświadczenia można użyć szczurów, u których badaniem wymazu z pochwy stwierdzono co najmniej dwa kolejne czterodniowe cykle rui. Szczurom w południe wstępnego dnia cyklu rui (proastrous) podano peptydy (związki antagoarstyczae LHRH) w różnych dawkach, w roztworze soli. Następnego dnia szczury zabito i ich jajowody z obu stron, badano pod mikroskopem do oglądania preparatów w celu stwierdzenia ilości jajeczek. Szczury podzielono na kilka grup, według dawek, przy czym każda grupa składała się z około 10 szczurów, a grupa kontrolna, w której szczurom podawano równe ilości roztworu soli składała się z 9-10 szczurów. Aktywność aatyawulacyjna (AOA) przedstawiona jest następującym równaniem:

ilość ozcaurów ów owuianji ,

AOA = -— — _t ---——- x 100% łączna ilosc traktowanych szczurów ⁷

7. Ocena działania wywołującego uwalnianie histaminy:

(1). Test uwalniania histaminy (HRT) in vitro: W tym doświadczeniu używa się zdrowych, dorosłych samców szczurów SD (masa ciała 200-250 g) chowanych w podanych wyżej warunkach. Po uśpieniu za pomocą CO 2 jamę otrzewnową przemywa się przy użyciu 50 ml płynu PIPES AC zawierającego 20 jednostek heparyny. Po odwirowaniu przy 200 xg w ciągu 8 minut w temperaturze 4°C, komórki przemywa się ponownie i na koniec zawiesza w PIPAS AC w stężeniu 8 do 24x 1^5 łącznie z leukocytów/ml. Zawiasiaa ta zawiera w przyblrżaarL około 5-10% komórek tucznych. Przemyte komórki używa się bezpośrednio po zebraniu; po wstępnym ogrzaniu w ciągu 5 minut w temperaturze 37°C, odpipetowuje się podwialokrotaoścr po 0,3 ml do probówek polistyrenowych zawierających po 0,3 ml rozcieńczonego peptydu. Mieszaniny inkubie się w temperaturze 37°C w ciągu 15 minut, a następnie zatrzymuje się reakcję przez odwirowanie przy 400 xg w ciągu 15 minut, w temperaturze 4°C. Supematanty bada się na zawartość histaminy ręczną metodą fluorywatryczaą, po uprzednim wykonaniu ekstrakcji kolejno n-butanolem i a-heptaaaw. Zawartość histaminy można uzyskać ze standardowej krzywej histamraowej (patrz niżej). Procentową zawartość uwalnianej histaminy można wyliczyć z następującego równania:

170 564

Uwalnianie histaminy (%) x 100% w którym E=odczyt fluorometryczny badanej próbki, B oznacza odczyt fluorometryczny próbek zawierających tylko komórki i bufor, a C jest odczytem fluorometrycznym dla complet (komórki zadane HCIO4).

Krzywą standardową można uzyskać przez wykreślenie wartości OD z fluorymetru przy 350 nm/450 nm (aktywacja/fluorescencja) względem stężeń seryjnie rozcieńczanego roztworu dokładnie odważonego chlorowodorku histaminy. Względny parametr r standardowej krzywej histaminowej może wynosić 0,9998, a najniższe wykrywalne stężenie histaminy wynosi 0,5 ng/ml.

Wartość ED50 dla peptydu można uzyskać z krzywej odpowiedzi na dawkę, przez wykreślenie na papierze półlogarytmicznym uwalniania histaminy względem stężenia peptydu.

Wszystkie próbki peptydu powinny być testowane z komórkami tucznymi pochodzącymi od minimum 3 różnych szczurów.

(2). Badanie skórnej aktywności anfilaktycznej (CAT): Do tego doświadczenia używa się zdrowych, dorosłych samic szczurów SD (masa ciała 250 g). Szczurom wstrzykuje się dożylnie błękit Evansa (1 ml 0,05% roztworu). Natychmiast po tym wstrzykuje się śródskórnie 0,05 ml roztworu peptydu (5, 0,5 i 0,05 gg/ml odpowiednio) i roztwór soli (kontrola). Wstrzyknięcia dokonuje się w ogolone pole na grzbiecie zwierzęcia. Po upływie 30 minut od iniekcji szczury zabija się i następnie ogląda grzbietową skórę. Za pomocą noniuszowej suwmiarki mierzy się w milimetrach średnice ran w dwóch prostopadłych kierunkach. Średnica kontrolnych jest zwykle mniejsza niż 5,5 mm. Można również zmierzyć spektrofotometrycznie ilość błękitu Evansa przenikającego z naczyń krwionośnych do skóry. Skórę odpowiadającą obszarowi ran wycina się i zanurza na noc w mieszaninie aceton/roztwór soli (7:3, obj./obj.). Następnego dnia, po odwirowaniu mierzy się za pomocą spektrofotometru (UV-260) przy 610 nm, zawartość błękitu Evansa w supernatancie wobec acetonu/roztworu soli (7:3) jako roztworu referencyjnego. Każdy peptyd testuje się na minimum 3 różnych szczurach.

Za pomocą opisanej wyżej metody zaprojektowano i zsyntetyzowano szereg różnych nowych związków antagonistycznych LHRH. W skrócie, przez pojedyncze lub wielokrotne podstawienie różnych wymienionych w poprzednich punktach, naturalnych i nienaturalnych aminokwasów otrzymano nową strukturę związków antagonistycznych LHRH. Otrzymane w ten sposób przykłady nowych związków antagonistycznych LHRH przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1

Analog macie- rzysty	AA1 AA2 NAc-DŻNaDpClPhe	AA3 D3Pal	AA4 Ser	AA5 Tyr	AA6 DArg	AA7 Leu	AA8 Arg	AA9 Pro	AA10 DAla- NH2
				Mop	D3Pal
		Arg	D3Pal		Pap
DPhe		Arg	D3Pal

Zastosowania niniejszego wynalazku:

1. Po zakon czaniu przedklinicznych l^aHań farmakologicznoch i yah ań toksycznosci możemy zastosować te nowe związki ontagnclstyazcc LHRH, mające wysoką skuteczność terapeutyczną przy niewielkich efektach ubocznych, w klimce w celu opracowania nowego leku do leczenia endometriozy i zaburzeń endokrynologii układu rozrodczego, obejmujących przedwczesne dojrzewanie dzieci, raka prostaty i raka sutka. Ponieważ hamują one wydzielanie gonodotropinc przez współzawodniczenie z endogennym LHRH w wiązaniu receptora i działają szybko, odwracalnie i bezpiecznie, to mogą być dalej opracowywane jako nowego typu środki antykoncepcyjne dla mężczyzn i kobiet. Ponadto, mogą być również stosowane w leczeniu

170 564 bezpłodności i do selektywnego i odwracalnego znoszenia czynności gruczołu przysadkowego w zakresie wydzielania gonadotropiny.

Jest mało prawdopodobne, aby opisane powyżej związki, które mają charakter leku peptydowego, mogły być podawane doustnie. Można z nich jednak łatwo sporządzić liofilizowany proszek, który nadaje się do rozpuszczenia w roztworze soli w celu wstrzykiwania iv, sc lub im. Ponadto, prowadzone są badania nad systemami zapewniającymi długotrwałe uwalnianie, takimi jak ulegające biodegradacji kapsułki iniekcyjne. Kapsułki mogą być implantowane podskórnie za pomocą specjalnej strzykawki i po uwolnieniu całej ilości peptydu, byłyby one adsorbowane przez tkankę, bez konieczności usuwania chirurgicznego. System zapewniający długotrwałe uwalnianie jest szczególnie użyteczny przy długotrwałym podawaniu antagonistów LHRH w klinice.

Analityczne wyniki przykładów są następujące. (Jako typowe przykłady wzięto dwa analogi (V i VII) (1) CzyCość.

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC): Na każdym z chromatogramów rozwijanych w pięciu różnych układach rozpuszczalników występuje tylko jedna plama.

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC): Na każdym z chromatogramów uzyskanych przez elucję dwoma różnymi układami rozpuszczalników występuje tylko pojedynczy pik.

W tabeli 2 przedstawione są wartości Rf i czas retencji TR.

Tabe1 a 2

Wyniki analizy chromatograficznej antagonistów LHRH

Analogi	TR1	HPLC TR2 (min)	Rf1	TLC Rf2	Rf3	Rf4	Rf5
V	7,90	8,11	0,32	0,30	0,35	0,30	0,69
VII	16,19	9,58	0,17	0,08	0,16	0,40	0,12

Roztwór A + 80% acetonitrylu

Układ rozpuszczalników 2: Roztwór A stanowi 0,01 m wodny roztwór KH 2PO 4. Roztwór B stanowi 20% roztworu A + 80% acetonitrylu.

Układ rozpuszczalników do TLC:

1. nBuOH/EtOAc/HOAC/HoO (5:5:1:1)

2. nBuOAC/nBuOH/HOAC/H2O (2:8:2:3)

3. nBuOAC/HOAC/foO (4:1:5), faza wstępująca

4. nBuOH/HOAC/H2O (4:1:2)

5. nBuOH/EtOAC/HOAC/H 2O (1:1:1:1) (2) Analiza aminokwasów. Analizę przeprowadza się według klasyczncy metody JEN i nowej Pico-Tag. Wyniki przedstawione są w tabeli 3.

Tabela 3

Kompozycja omlazówosów w związkach oatosoaićtycoaych LHRH

Analogi	Metody	Ser	Arg	Ala	Pro	Leu	Phe	Pal	pClPhe	Nal
IV	IEN	0,86	2.05	101	0.99	1.13		+	+	ND
Pico- TAG	0,92	2.25	0.91	1.01	0.91		+	+	+
V	IEN	0.81	2.02	1.03	1.03	0.12	0.99	+	+	+
Pico- TAG	0.68	2.26	0.93	1.29	1.04	1.00	+	+	+
VI	IEN	0.91	0.91	1.00	1.00	1.09		+	+	ND

ND: nie oznaczone

170 564 (3) Wyniki testów biologicznych. Wyniki testów biologicznych obejmujących aktywność antyowulacyjną przy różnych dawkach i ED dla działania uwalniającego histaminę in vitro przedstawione są w tabeli 4.

Tabela 4

Wyniki testów biologicznych dla nowych antagonistów LHRH w oparciu o struktury modyfikacji zasadowej

Podstawione aminokwasy	%AOA/pg	HRA (mg/lm) ED5o±SEM
0.125	0.25	0.5	1.0	2.0
modyfikacja zasadowa		50	75	100		3.5±0.38
DPHe³		29	60	100		7.4±0.98
Mop⁵			25	100		14.7±2 70
Pap8				50	88	70.4+26.8

♦Strukturą modyfikacji zasadowej jest: (NAc-D2Nal1 DpClPhe2, D3Pal³, Ser⁴, Arg5, D3Pal6, Leu⁷, Arg⁸, PrcL, DAla1°)NH2

Jak wyżej objaśniono przykładami i opisano, związki antagonistyczne LHRH zaprojektowane i zsyntetyzowane według niniejszego wynalazku wykazują bardzo dobre własności. Analizy TLC i HPLC wykazują, że są one czyste. Ich skład jest właściwy to znaczy taki jaki zaprojektowano. Ich działanie przeciw płodności jest duże: hamują owulację u szczurów po wstrzyknięciu s. c. w dawce 0,1 do 2,0 pg w południe dnia proestrus. Ich efekt uboczny spowodowany histaminą jest niski (ED50 dla działania uwalniającego histaminę in vitro dawka skuteczna, aby komórki tuczne szczura uwalniały 50% histaminy) waha się pomiędzy 5 a 300 pg/ml; rany wywoływane przez nie w skórnym teście anafilaktycznym są tak małe, jak jest to wymagane w klinice. Ich rozpuszczalność w wodziejest bardzo dobra, wszystkie testy biologiczne przeprowadzano w roztworze soli, tak więc sporządzenie w klinice preparatu do iniekcji będzie łatwe. Nadają się również do sporządzania form zapewniających długotrwałe uwalnianie, wśród których mikrokapsułki iniekcyjne są najdogodniejsze do długotrwałego hamowania wydzielania gonadotropin i hormonów płciowych. Dlatego też mogą one być stosowane jako bardzo skuteczne, odwracalne i bezpieczne środki antykoncepcyjne zarówno dla mężczyzn, jak i kobiet. Mogą być również używane do leczenia różnych chorób spowodowanych zaburzeniami endokrynologii układu rozrodczego, takich jak hormonozależny rak prostaty i sutka, endometrioza, przedwczesne dojrzewanie dzieci. Są również użyteczne w leczeniu bezpłodności.

Nowe związki antagonistyczne LHRH według wynalazku, mogą być również stosowane w badaniach podstawowych nad fizjologią i farmakologią rozrodu, takich jak badania funkcji gruczołu przysadkowego, badania wpływu hormonów płciowych lub gonadotropin lub LHRH na zachowania seksualne itd.

SKRÓTY

W tekście niniejszego dokumentu zgłoszenia patentowego zastosowano następujące skróty.

Ala alanina

AOA czynność antyowalacyina

Arg argmma

Bap dibutyloaminometylofenyloalanina

Boc t-butyloksykrrbonyl

BuOAC octan buyylu

CAT skórny test i^r^<tflh^I<y^(^:^i^y

DCC dicykloheksylokarbodiimid

DCM dichlorometan

D2Nal D-β(22-naStyloalanina

D3Pal D-β-(3-piy/dylo)alanina

DpCIPhe p-chloro-D-fenyloalanina

170 564

DpFPhe	p-fluoro-D-fenyloalanina
D6Qal	D-P-(6-chinolilo)alanina
DMF	N,N-dimetyloformamid
Eap	dietyloaminometylofenyloalanina
ED 50	dawka skuteczna dla uzyskania 50% odpowiedzi
EtO	AC octan etylu
FSH	hormon pęcherzykowy pobudzający
Glu	kwas glutaminowy
Gly	glicyna
His	histydyna
HOBT	1 -hydroksybenzotriazol
HPLC	wysokosprawna chromatografia cieczowa pochodna ninhydryny
HRA	zdolność uwalniania histaminy
HRT	test na uwalnianie histaminy
IEN	chromatografia jonowymienna z post-kolumną
IPA	alkohol izopropylowy
LH	hormon luteinizujący
LHRH	hormon uwalniający hormon luteinizujący
Leu	leucyna
Lys	lizyna
Map	dimetyloaminometylofenyloalanina
Met	metionina
Mop	morfolinometylofenyloalanina
nBuOH	alkohol n-butylowy
NS	normalny roztwór soli (normal salinę)
Pap	dipropyloaminometylofenyloalanina
Phe	fenyloalanina
Pip	piperydynometylofenyloalanina
Pipes	piperazyno-N,N^,-bis/2-eta^nosulfonowy kwas/
Pro	prolina
Rf	szybkość przepływu
SE	błąd standardowy
Ser	seryna
TFA	kwas trifluorooctowy
TLC	chromatografia cienkowarstwowa
TR	czas retencji
Trp	tryptofan
Tyr	tyrozyna
Tep	tetrahydroperolilometylofenyloalanina

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Sposób wytwarzania antagonisty hormonu uwalniającego hormon luteinizujący ssaków [NAc-D2Nal¹-DpClPhe²-D3Pal-Ser⁴-Mop⁵-D3Pal-Leu⁷-Arg⁸-Pro⁹-DAla^l0]NH 2, [NAc-]D2Nal¹-DpClPhe²-D3Pal³-Ser⁴-Arg⁵-D3Pal⁶-Leu⁷-P<nP-Pro⁹DAla^li)]NH2 albo [NAc-D2Nal1-DpClPhe²-DPhe³-Ser4-Argg-D3Pal⁶-Leu7-Argg-Pro9-DAla1°]NH2, znamienny tym, że wytwarza się wyżej wymienione polipeptydy na drodze syntezy peptydów na fazie stałej według Merrfield’a w naczyniu reakcyjnym do syntezy peptydów z żywicą metylobenzhydryloaminopolistyrenodiwinylobenzenową oznaczoną skrótem MBHA, stosując zwykłe metody syntezy sekwencji dla oligopeptydów w następujących etapach

a) końcowy węgiel BOC-D-alaniny wiąże się kowalencyjnie do żywicy MBHA, stosując trzykrotny molarny nadmiar każdego diizopropylokarbodiimidu, oznaczonego skrótem DIC i l-hydroksybenzotriazolu, oznaczonego skrótem HOBt w dichlorometanie,

b) rozszczepia ilościowo zabezpieczony BOC 50% kwasem trifluorooctowym w CH 2Cl2, a następnie

c) zobojętnia 10%o diizopropyloetyloaminą oznaczoną skrótem DIPEA w CH2Cl2,

d) wydłuża się łańcuch odpowiednio do zakończenia sekwencji w trzykrotnym nadmiarze każdego kwasu BOC-aminowego (DIC)HOBt, zakończa acylację, co potwierdza się ninhydrynową metodą Kaiser’a albo testem chloroanilinowym i w przypadku niepełnego przyłączenia prowadzi się dodatkowo reakcję sprzęgania, za pomocą nadmiaru acetyloimidazolu,

e) odszczepia się łańcuch peptydowy od polimerycznego nośnika stosując nadmiar ciekłego fluorowodoru w anizolu,

f) oddziela się surowe peptydy w wodnym roztworze kwasu octowego od żywicy, wytrąca pod zmniejszonym ciśnieniem i oczyszcza na drodze preparatywnej HPLC, stosując standardowe rutynowe fazy odwrócone.