FI92326C - LHRH:n nonapeptidi- ja dekapeptidianalogeja, jotka ovat käyttökelpoisia LHRH:n antagonisteina - Google Patents

Description

5 >. 3 2 6 LHRH:n nonapeptidi- ja dekapeptidianalogeja, jotka ovat kåyttdkelpoisia LHRH:n antagonisteina

Luteinisoivaa hormonia (LH) ja follikkelia stimu-5 loivaa hormonia (FSH) vapautuu aivolisSkkeen etulohkosta hypothalamuksen alueella tuotettavan luteinisoivaa hormonia vapauttavan hormonin (LHRH, LH/FSH-RH, GnRH) saate-lyn alaisena. LH ja FSH vaikuttavat gonadeihin kiihdyt-tSen steroidihormonien synteesia ja gameettien kypsymis-10 ta. LHRH:n sykayksittåinen vapautuminen ja siten LH:n ja FSH:n vapautuminen saatelevat lisaantymissykliå kotieiai-milia ja ihmisilia.

LHRH vaikuttaa myiis istukkaan ja sita kautta epa-suorasti gonadeihin aikaansaamalla koriogonadotropiinin 15 (OG) synteesin ja vapautumisen.

LHRH:n antagonistit ovat kayttdkelpoisia hedelmai-lisyyden saatelyssa. Sellaiset antagonistit estavat ovu-laatiota naarailla ja spermatogeneesia uroksilla. Naihin vaikutuksiin liittyy laheisesti gonadiperåisten steroi-• 20 disten sukupuolihormonien tason aleneminen verenkierros-sa esiintyvasta normaalitasosta, mika aiheuttaa aksesso-risten elinten massan pienentymista uroksilla ja naarailla. Kotielaimilia tama vaikutus ehkaisee sukupuolista kiertoa ja kayttaytymista (edistaen painon lisåantymista ..25 laiduntamisvaiheessa), aiheuttaa keskenmenoja tiineilia I « eiaimilia ja saa yleensa aikaan kemiallisen sterilisaa-tion.

Luonnollinen vapauttava hormoni LHRH on dekapep-tidi, joka koostuu luonnossa esiintyvista aminohapoista 30 (joilla glysiinia, joka on asymmetriakeskukseton amino-·;· happo, lukuunottamatta on L-konfiguraatio). Sen aminohap- pojarjestys on seuraava: (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH^ 35 123456789 10 2 ?V7"6 Tåmån luonnollisen aineen kanssa analogiset yhdisteet esitetåan usein lyhennetysså muodossa osoittamalla jon-kin tietyn aminohapon, jonka asema osoitetaan ylåindek-sillå, korvaajan luonne, mitå seuraa "LHRH". Monia LHRH:n 5 analogeja on tutkittu, ja hyvin suurella enemmistollå niista on riittåmåton biologinen aktiivisuus, jotta ne olisivat kliinisesti kayttokelpoisia. Eråillå tietyilla muunnoksilla on kuitenkin agonistista biologista aktii-visuutta tehostava vaikutus. Huomattava agonistisen ak-10 tiivisuuden lisaåntyminen saavutetaan vaihtamalla Gly:n tilalle 6-asemassa sijaitsevaksi happotahteeksi D-ami-nohappotahde.

Agonistien lisaksi on valmistettu analogeja, jot-ka ovat LHRH:n kompetitiivisia antagonisteja ja jotka 15 kaikki edellyttåvat 2-asemassa sijaitsevan histidyyli-ryhmån poistamista tai korvaamista Zw· Vale et al., Science 176 (1972) 933/. Yleisesti ottaen vaikuttaa sil-ta, etta D-aminohappotåhde tuottaa kyseiseen asemaan ketjussa sijoitettuna tulokseksi parhaan aktiivisuuden 20 ZR.W.A. Rees et al., J.Med.Chem. 17 (1974) 10167-

Sen lisaksi lisamuunnos 6-asemassa (joka ilman 2-aseman muuntamista johtaa edella mainittuun agonisti-seen aktiivisuuteen) lisaå 2-muunnettujen analogien an-tagonistista aktiivisuutta iC. W. Beattie et al., J. Med.

·. 25 Chem. 18 (1975) 1247; J. Rivier et al., Peptides 1976, Editions de l'Universite de Bruxeller, Belgia, 1976, s 4277.

Nåiden kahden påamuunnoksen, jotka johtavat te-hokkaampiin LHRH:n antagonisteihin, pohjalta antagonis-30 tista aktiivisuutta on voitu lisata edelleen muuntamalla jo 2,6-muunnetun peptidin 1-, 3-, 5- ja/tai 10-asemaa 7¾. H. Coy et al., Peptides 1976, Editions de l'Universite de Bruxelles, Belgia, 1976, s 462; J. E. Rivier et al., Life Sci. 23 (1978) 869; A. S. Dutta et al., 35 Biochem. Biophys. Res. Commun. 85 (1979) 7097· 0n mySs 1

II

· 3 i? 2 3 2 6 osoitettu, etta 1-asemassa sijaitsevan aminohappotåhteen N-asyloinnista on etua /K. Channabasavaia et al., Bio-chem. Biophys. Res. Commun. 81 (1978) 382; D. H. Coy et al., Peptides - Structure and Biological Function, Pier-5 ce Chemical Co., 1979, s 775/. Lisåksi on julkaistu ar-tikkeli /D.H. Coy, Endocrinology 110 (1982) 1445/1 joka kasittelee erittain tehokasta antagonistia, joka sisal- r i p taa D-Arg -substituution, (N-Ac-D-pCl-Phe , D-pCl-Phe , D-Trp3, D-Arg6, D-Ala10)LHRH.

β 10 Ikava kyllå, vaikka D-Arg -substituution sisaltava rynmå LHRH:n analogeja on havaittu tehokkaiksi ovulaa- tiota estaviksi aineiksi, ne olivat myos voimakkaita syottSsoluja degranuloivia aineita /Schmidt et al.,

Contraception 29 (1984) 283/ ja aiheuttivat odeemaa in 1 2 15 vivo. Niinpa esimerkiksi (N-Ac-D-Nal(2) , D-pCl-Phe , -¾ β D-Trp , D-Arg )LHRH:n ED,-g on 0,2 yug/ml, mita tulee his-tamiinin vapauttamiseen rotan syottosoluista in vitro.

Tama sivureaktio on kliinisesti tårkeS seuraavan anafy-laktistyyppisen reaktion mahdollisen hengenvaarallisen 20 luonteen vuoksi.

On alalla tunnettua, etta positiivisen varauksen/-positiivisia varauksia, erityisesti useita positiivisia varauksia, joihin yhdistyy hydrofobisuus, sisaltavat mo-lekyylit ovat voimakkaita syottosolujen degranuloijia '1 25 /Foreman ja Jordan, Agents and Action 13 (1983) 1057· Ensimmainen yritys kiertaa tamå ongelma kaksi Arg-tah-detta (asemissa 6 ja 8) sisSltavien analogien yhteydes-sa oli lisata tShteiden etSisyyttå (esim. (N-Ac-D-Nal(2)1, D-pCl-Phe2, D-Trp3, Arg5, D-Tyr6, D-Ala10)LHRH; ED^Q = 30 2yug/ml histamiinin vapautuksessa; R.W. Roeske et al., • 5 5 "Substitution of Arg for Tyr in GNRH antagonists".

Peptides - Structure and Function, toim. C.M. Deber, V. J. Hruby ja K. D. Koppie, Pierce Chemical Co.,

Rockford, Illinois, 1985, s 561). Vaikka tama heikensi 35 analogin kykyå degranuloida syottosoluja ja vapauttaa * 4 9/326 histamiinia, analogilla oli yha monta kertaa suurempi ky-ky aiheuttaa anafylaktistyyppinen reaktio kuin LHRH:11a, jonka EDgg on 328 pg/ml, mita tulee histamiinin vapautta-miseen.

5 Mytts Lys(iPr) on sisailytetty eri asemiin LHRH:n antagonisteihin. Sijoitettaessa se 6- ja 8-asemaan, kun 2-asemassa on samanaikaisesti D-pCl-Phe-tåhde, suuri ovu-laation vastainen teho ja heikentynyt histamiinin vapau-tuminen såilyvat (esim. (N-Ac-D-Nal(2)\ pCl-Phe2, q o in 10 D-Trp , D-Lys(iPr) , D-Ala )LHRH; EDj-q = 6,6 pg/ml histamiinin vapautuksessa). ErSåseen analogiin sijoitettiin 8-asemaan hArg(Et-), jolloin analogin kyky vapauttaa his- z 1 tamiinia oli samaa tasoa (so. (N-Ac-D-Nal(2) , D-oMe-pCl-Phe2, D-Pal(3)3, D-Arg6, hArg(Et^)8, 10 z 15 D-Ala )LHRH; ED^q =4,9 pg/ml histamiinin vapautuksessa). Voidaan kuitenkin havaita, etta nåmå analogit ovat silti hyvin tehokkaita histamiinia vapauttavia aineita LHRH:hon verrattuna. (R.W. Roeske et al., "LHRH Antagonists with Low Histamine Releasing Activity". LHRH and 20 its Analogs: Contraceptive and Therapeutic Applications, Part 2, toim. B. H. Vickery ja J. J. Nestor Jr., MTP Press, Boston, 1987, s 17-24).

8- ja 9-asema on myOs tunnistettu tarkeimmiksi substituoitaviksi kohdiksi, jotta estetaan histamiinin - 25 vapautus, koska Arg-Pro-jakso on neuropeptideissa, jotka aiheuttavat syOttGsolujen degranuloitumista, usein ha-vaittu ominaispiirre. Vaikka siis 8-asema on tieteelli-sin perustein ratkaiseva asema substituoitavaksi, nykyi-sin tunnetulla joukolla analogeja on huomattava mahdolli-30 suus myrkyllisyyteen ja muihin sivuvaikutuksiin.

Tama keksintd koskee uusia, hyvin tehokkaita LHRHrn nonapeptidi- ja dekapeptidianalogeja, joiden kyky vapauttaa histamiinia on hyvin pieni ja joiden ratkaise-van tarkea ominaispiirre on steerisesti estetty guanidi-35 nosubstituoitu arginyyliryhma 8-asemassa, vaittaen argi-nyyliryhmaa 6-asemassa. KeksintO koskee myOs koostumuk-j sia, jotka sisaltavat naita yhdisteita.

5 9'/ 326

Keksinndn kohteena on yhdiste, jolla on kaava (I), A-B-C-Ser-D-E-F-G-Pro-J (I) 123 4 5678 9 10 5 tai sen fysiologisesti hyvåksyttåvå suola.

LHRH:n 2-asemassa sijaitsevan L-histidyyliryhman korvaaminen muuttaa peptidin LHRH:n antagonistiksi. LHRH:ssa 6-asemassa sijaitsevan glysyyliryhmån korvaami-10 nen jollakin Erna mainituista ryhmista lisaa antagonis-tista vaikutusta voimakkaasti. Tassa esitetyt 1-, 2-, 3-, 5-, 7- ja 10-asemassa tehtåvåt korvaukset auttavat edelleen parantamaan antagonistista aktiivisuutta. Subs-tituutio G 8-asemassa alentaa voimakkaasti analogien te-15 hoa histamiinin vapautuksessa, kun 6-aseman Arg on kor-vattu jollakin muulla ryhmaiia, ja on ratkaisevan tarkea ajatellen analogien turvallisuutta.

Kuten edelia on esitetty, erilaisista yleisista aminohapoista kSytetSSn tamSn keksinnOn kuvauksen helpot-20 tamiseksi tavanomaisia lyhenteita peptidialalla yleisesti hyvSksytylia tavalla, jota on suositellut IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (Biochemistry 11 (1972) 1726). Kaikki tassa mainitut peptidijaksot on kir-joitettu noudattaen yleisesti hyvaksyttya tapaa, jossa N-. 25 terminaalinen aminohappo on vasemmalla ja C-terminaalinen aminohappo oikealla.

Esitetyt lyhenteen tarkoittavat L-aminohappoja, poikkeuksena asymmetriakeskukseton (akiraalinen) amino-happoglysiini ja lisapoikkeuksina ne luonnossa esiinty-30 mattOmat tai esiintyvat aminohapot, jotka ovat akiraali-sia tai joita muussa tapauksessa on merkitty D:lia tai DL:lia.

Tulisi huomata, etta J:n ollessa -NH-C(0)-NH2 C-terminaalinen ryhma on atsaglysinamidiryhma.

35 Lyhenne D-Glu(AA) tarkoittaa anisolin ja D-Glu- tahteen valista additiotuotetta, jolloin muodostuu p-met- 6 92326 oksifenyyliketoni (glutamiinihapposivuketjun C-terminaa-liseen paahån), so Glu(pMeO-Ph).

ErfiSt muutkin lyhenteet ovat kåyttOkelpoisia kek-sinnOn kuvauksessa. Tåsså keksinnOsså luonnollisen LHRH-5 peptidin aminohappoja korvataan aminohapoilla, joita ei esiinny luonnossa. Erityisen yleisesti kaytettyja niista ovat seuraavat:

Aminohappotahde Lyhenne 3-(2-naftyyli)alanyyli Nal(2) 10 3-(p-fluorifenyyli)alanyyli pF-Phe 3-(p-kloorifenyyli)alanyyli pCl-Phe 3-(3-pyridyyli)alanyyli Pal(3) N,N'-guanidino(dimetyyli)- homoarginyyli Dmh tai hArg(Me)2 15 N,Ν'-guanidino(dietyyli)- homoarginyyli Deh tai hArgCEt^ N,N'-guanidino(diprop- yyli)homoarginyyli Dph tai hArg(Pr>2 N,N'-guanidino(di-iso- 20 propyyli)homoarginyyli Dih tai hArgiiPr^ N,N'-guanidino(diheksyy- li)homoarginyyli Dhh tai hArg(heksyy- 11 >2 N,N'-guanidino(etano)- . . 25 homoarginyyli Eha tai hArgfCI^^ N,N'-guanidino(propeno)- homoarginyyli Pha tai hArgiCl·^)^ N,N'-guanidinobis(2,2,2-tri- fluorietyyli)homoarginyyli Bth tax hArg(CI^CF^)^ 30 NG-etyyli-NG'-(trifluori- etyyli)homoarginyyli hArgiCH^CFg, Et) NG,NG,-2-trifluorimetyyli- 2,2-difluorietyylihomoargi- nyyli hArg(CH2CF2CF3) 35 n-guanidino(etyyli)homo- arginyyli Meh tai hArg(Et) N-guanidino(propyyli)- homoarginyyli Prh tai hArg(Pr) 92326 7

AminohappotShde Lyhenne N-guanidino(isopropyyli)- homoarginyyli Tph tai hArg(iPr) N-guanidino(butyyli)homo- 5 arginyyli Mbh tai hArg(Bu) N,N'-guanidino(disyklo- heksyyli)homoarginyyli Dch tai hArg(syklo- heksyyli >2 N-guanidino(heptyyli)homo- 10 arginyyli Hha tai hArg(heptyy li ) N-guanidino(etyyli)arginyyli Mea tai Arg(Et) N,N'-guanidino(di-iso- propyyli)arginyyli Dia tai ArgiiPr^ 15 N,N'-guanidino(disyklo- heksyyli)arginyyli Dca tai Arg(syklohek- syyii)2 3-(3-piperidyyli)alanyyli 3-Pia 3- (4-piperidyyli)alanyyli 4-Pia 20 3-[(NE-metyyli)piperid- 4- yyli]-alanyyli Mpa 3- [(Ne-pentyyli)piperid- 4- yyli]alanyyli Ppa 3-[(Ne-bentsyyli)piperid- — 25 4-yyli]alanyyli Bpa

Ne-nikotinyyli-D-lysyyli Lys(Nic) Νε-(3-pyridyyli)asetyyli- D-lysyyli Lys(pyridyyliasetyy- li) 30 3-(2,4,6-trimetyylifenyy- li)alanyyli Tmp 2,2-difenyyliglysyyli Dpg TSssa kaytettynå ilmaisu fysiologisesti hyvaksyt-35 tavat suolat" tarkoittaa suoloja, joilla sailyy kantayh- disteen toivottu biologinen aktiivisuus ja joilla ei ole . mitaan ei-toivottuja toksikologisia vaikutuksia. Esimerk- keja sellaisista suoloista ovat 9 2326 δ (a) epåorgaanisten happojen, esimerkiksi suolahapon, bro-mivetyhapon, rikkihapon, fosforihapon, typpihapon ja vas-taavien, kanssa muodostetut happoadditiosuolat sekå or-gaanisten happojen, kuten esimerkiksi etikkahapon, oksaa- 5 lihapon, viinihapon, meripihkahapon, maleiinihapon, fu- maarihapon, glukonihapon, sitruunahapon, omenahapon, as-korbiinihapon, bentsoehapon, parkkihapon, pamonihapon, algiinihapon, polyglutamiinihapon, naftaleenisulfonihap-pojen, naftaleenidisulfonihappojen ja polygalakturoniha-10 pon, kanssa muodostetut suolat; (b) moniarvoisten metallikationien, kuten sinkin, kalsiu-min, vismutin, bariumin, magnesiumin, alumiinin, kuparin, koboltin, nikkelin, kadmiumin ja vastaavien, seka N,N'-dibentsyylietyleenidiamiinista tai etyleenidiamiinista 15 muodostuneen orgaanisen kationin kanssa muodostetut emas-additiosuolat; ja (c) yhdistelmat, jotka koostuvat (a):sta ja (b):sta, esimerkiksi sinkkitannaattisuola ja vastaavat.

Ilmaisu "alempi alkyyli" tarkoittaa suoraketjuista 20 tai haaroittunutta, tyydytettya hiilivetyryhmaa, joka si-saitaa 1-4 hiiliatomia, kuten esimerkiksi metyylia, etyy-lia, n-propyylia, isopropyylia, n-butyylia, isobutyylia, s-butyylia ja t-butyylia. "1-6 hiiliatomia sisaitava al-kyyli" sulkee sisaansa samat substituentit kuin alempi 25 alkyyli mutta lisaksi mytts 5 tai 6 hiiliatomia sisaitavat ryhmat, kuten esimerkiksi n-pentyylin, n-heksyylin ja 5 tai 6 hiiliatomia sisaitavat haaroittuneet ryhmat. "1-12 hiiliatomia sisaitava alkyyli" sulkee sisaansa hiilivety-ryhmat, joissa on 1-12 hiiliatomia, mm. edelia mainitut 30 ryhmat silia erotuksella, etta ryhmat voivat sisaitaa jo-pa 12 hiiliatomia.

"Fluorialkyyli" tarkoittaa 1-5 fluoriatomilla substituoitua alempaa alkyylia, esimerkiksi ryhmia CF3CH2-, CFg-, CF3CF2CH2- ja vastaavia.

35 "Halogeeni" tarkoittaa fluoria, klooria tai bro- mia.

Lyhenne "N-Ac" tarkoittaa N-asetyyli-suojaryhmaa, so. terminaalisen aminohappotahteen amiinityppeen sitou- 92326 9 tunutta asetyyliryhmaa, yleisesti hyvåksytyn nimeåmista-van mukaisesti.

Edullisia tårnSn keksinndn mukaisia yhdisteita ovat yhdisteet, joissa 5 A on N-Ac-D-Nal(2); B on D-pF-Phe tal D-pCl-Phe; C on D-Trp tai D-Pal(3); D on Pal(2), Tyr, Arg, Deh, Mbh, Bth tai Pha; E on D-Trp, D-Tyr, D-Pal(3), D-Deh, D-Mbh, D-Bth tai 10 D-Pha; F on Leu tai Phe; G on Deh, Bth, Mbh tai Bha; ja J on D-AlaNl·^ tai GlyNl^.

Viela edullisempia substituutiomalleja ovat sel-15 laiset, joissa A on N-Ac-D-Nal(2); B on D-pCl-Phe; C on D-Trp tai D-Pal(3); D on Tyr, Arg, Deh, Mbh, Bth tai Pha; 20 E on D-Trp, D-Pal(3), D-Tyr, D-Deh, D-Mbh, D-Bth tai D-Pha; F on Leu; G on Deh, Mbh, Bth tai Pha; ja J on D-AlaNH2.

- - 25 TSh3n edullisempaan ryhmaan kuuluu kolme edullista • · alaryhmaa: 1. Kun D on Tyr, E voi olla joko (a) jokin hydrofobisis-ta ryhmista D-Trp, D-Pal(3), ja D-Tyr, mutta edullisimmin D-Trp tai D-Pal(3); tai (b) jokin ryhmista D-Deh, D-Mbh, 30 D-Bth ja D-Pha.

2. Kun D on Arg, E on jokin kohdassa 1(a) luetelluista hydrofobisista ryhmista, edullisesti D-Tyr.

3. Kun D on Deh, Mbh, Bth tai Pha, E on edullisimmin D-Tyr tai D-Pal(3), mutta mytts D-Trp on edullinen.

35 Kussakin edullisista alaryhmista G on Deh, Mbh,

Bth tai Pha. Erityisen edullisia ovat Bth ja Deh ja edul- . lisin Deh.

> · 92326 10

Esimerkkejå edullisemmista substituutiomalleista ovat siis N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-Tyr-C-Leu-G-Pro-D-AlaNI^, jossa C on D-Trp tai D-Pal(3) ja G on Deh, Mbh, Bth tai Pha; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-Tyr-E-Leu-G-5 Pro-D-AlaNH2, jossa C on D-Trp tai D-Pal(3), E on D-Deh, D-Bth, D-Mbh tai D-Pha ja G on tåssS kappaleessa esite-tyn mååritelmån mukaisen E:n L-muoto; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-Arg-E-Leu-G-Pro-D-AlaNH2, jossa C on D-Trp tai D-Pal(3), E on D-Trp, D-Pal(3) tai D-Tyr ja G on Deh, 10 Mbh, Bth tai Pha; ja N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-D-E-

Leu-G-Pro-D-AlaNH2, jossa C on D-Trp tai D-Pal(3), D ja G ovat kumpikin itsenåisesti Deh, Bth, Mbn tai Pha ja E on D-Tyr, D-Trp tai D-Pal(3).

Muita edullisia toteutusmuotoja ovat 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-E-Leu-G-Pro-D-Ala- NH2, jossa E on D-Trp tai D-Tyr ja G on Deh, Bth, Mbh tai Pha; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-D-E-Leu-G-Pro-D-AlaNH2, jossa D ja G ovat kumpikin itsenåisesti Deh, Bth, Mbh tai 20 Pha ja C ja E ovat kumpikin itsenåisesti D-Trp tai D-Pal(3); ja N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-G-Pro-D-AlaNH2, jossa G on Deh, Bth, Mbh tai Pha.

Esimerkkejå edullisista toteutusmuodoista ovat -25 seuraavat: • · N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; 30 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-

Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-35 Deh-Pro-D-AlaNI^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-

Bth-Pro-D-AlaNH0; • z 11 52326 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phs-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; U_Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-

Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Mbh-Leu-MPh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Bth-10 Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Pna-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; ^ N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Mbn-

Leu-Mdh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-3th-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pha-20 Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3) -Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3) -

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; 35 12 92326 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-

Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N_Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-Den-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-Arg-D-Tyr-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-MDh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-TyΓΙΟ Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-Deh-D-Tyr-Leu-20 Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Mbh-D-Tyr-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Bth-D-Tyr-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; 25 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Pha-D-Tyr-Leu-

Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Deh-D-T rp-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Mbh-D-Trp-Leu-30 Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Bth-D-Trp-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Pha-D-Trp-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; 35 13 92326 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phs-D-Pal(3)-Ser-Deh-D-Pal(3)-Le'J-Deh-Pro-D-AlaNh2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Pne-D-Pal(3)-Ser-Mbn-D-Pal(3)-Leu-MDh-Pro-U-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-3th-D-Pal(3)-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pha-D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Deh-D-Nal(2)-10 Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Mbh-D-Nal(2)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-3th-D-Nal(2) -Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-Pha-D-Nal(2)-

Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; .

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)-20 D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)- D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)- D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; 25 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Mbh-Leu- 3tn-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Mbh-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)- 30 Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3) -

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Pl^e-D-Trp-SeΓ-Tyr-D-TΓp-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; -35 92326 14 N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-

Leu-3th-Pro-D-rtlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Den-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-T rp-Ser-Tyr-D-Bth-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Den-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Bth-10 Leu-3th-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal (2)-D-pF-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-T rp-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-3th-Pro-D-AlaNH2; 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-

Leu-3th-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-T rp-Ser-Deh-D-Tyr-Leu-20 Deh-Pro-D-AlaNH2; and N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Trp-Ser-Bth-D-Tyr-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2.

Tåman keksinnon piiriin kuuluu myos peptideja,jotka eivat valttamatta kuulu edella mainittuihin edullisiin ryftniin, kuten 25 esimerkiksi seuraavat: N-Ac-D-Nal(2)-D-pC1-Phe-D-T rp-Ser-Tyr-D-Tyr-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; 30 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-35 D-Nal(2)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; « · > • » 92326 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Nal(2) -Leu-Mbh-Pro-D-AlaNI^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Nal(2) -Leu-Bth-Pro-D-AlaNI^ · 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Na-(2) -

Leu-Pha-Pro-D-AlaNI^; N-Ac-D-Nal(2)-D-aMe,pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Btn-Pro-D-AlaNI^; N-Ac-D-Nal(2)-D-aMe,pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-10 Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-aMe,pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Glu(AA)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-

Glu(AA)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Glu(AA)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2 ? N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-20 Pal(3)-Leu-HArg(CH2CF2CF3)-Pro-D-AlaNH2; ja N-Ac-D-Nal(2)-Dpg-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Nal(2)-Bth-Pro-D-AlaNH2.

On yleenså edullista, etta A-, B-, C-, E- ja J-aminohappotahde ovat D-isomeerin muodossa ja etta D-, F-.25 ja G-amlnohappotahde ovat L-isomeerin muodossa. Stereoke- • · mia tulee kaslttaa tailalseksl, ellei sita ole toisenlai-seksl erikseen malnlttu.

Kaiklssa edelia mainituissa toteutusmuodoissa yh-dlste voidaan valmlstaa myds vastaavan farmaseuttisesti 30 hyvaksyttavan suolan muodossa.

Tdman kekslnnOn mukaisilla yhdlsteilia ja erityi-sestl nliden suolollla on yliattavan volmakas ja pltkaan kestava LHRH-antagonlstlnen aktllvlsuus.

16

9.1 o L O

LHRH-antagonismin voimakkuuden ensisijainen mitta on kyky estaa ovulaatiota rotilla, mika maaritetaan A. Corbinin ja C.W. Beattien menetelmaiia (Endocrine Res. Commun. 2 (1975) 1).

5 Kyky saada aikaan histamiinin vapautuminen rotan peritoneaalisista syttttttsoluista in vitro voidaan mSSrit-taa tavalla, jonka ovat esittaneet Sydbom ja Terenius (Agents and Action 16 (1985) 269) tai Siraganian et al. (Manual of Clinical Immunology, 2. painos, toim. N.E.

10 Rose ja M. Friedman, Amer. Soc. Microbiol., Washington, D.C., 1980, s. 808).

Muita biologisia testeja, joita voidaan kayttaa LHRH:n antagonistien ja taman keksinnttn mukaisten yhdis-teiden tutkimiseen, ovat 15 (a) LHRH:n aiheuttaman FSH:n ja LH:n vapautumisen inhi- bitio rotalla in vivo (J.A. Vilchez-Martinez et al., Endocrinology 96 (1975) 1130); (b) aivolisakkeen etulohkon solujen dispersioviljelman aikaansaama LH:n ja FSH:n vapautumisen inhibitio radio- 20 immunologisesti mitattuna (W. Vale et al., Endocrinology 91 (1972) 562); ja (c) gonadotropiinitasojen alentaminen kastroidulla rotalla ja koiralla (Petrie et al., Male Contraception, Harper and Row, Philadelphia, 1985, s. 361).

25 Antagonistiset vaikutukset ja kayttttmahdollisuudet • é

Tassa kuvattujen yhdisteiden antagonistisesta vai-kutuksesta johtuvat seuraavat kayttttmahdollisuudet: - hedelmttityksen ehkaisy naarailla, - ovulaation esto tai viivytys, 30 - hedelmttityksen ehkaisy uroksilla, - diagnostiset kayttttmahdollisuudet, kuten osteoporoosin diagnosointi, - muut kayttttmahdollisuudet, joita on esitetty artikke-lissa B. H. Vickery, Endocrine Reviews 7 (1986) 115.

II

17 92326

Sovellettaessa taman keksinndn mukaisia yhdisteitS esim. ovulaation estoon halutulle kohteelle annetaan vai-kuttava maarS taman keksinnOn mukaista yhdistetta tai si-ta slsaitavaa koostumusta. Nama yhdisteet tai koostumuk-5 set voidaan antaa eri tavoilla sen mukaan, mika on tarkka kaytttttarkoitus, mm. suun kautta, parenteraalisesti (mika kasittaa ihonalaisen, lihaksensisaisen ja laskimonsisai-sen annon), emattimen kautta (erityisesti hedelmttityksen ehkaisyn tapauksessa), perasuolen kautta, bukkaalisesti 10 (kuten esimerkiksi kielen alle), ihon lapi tai nenan kautta. Sopivin tie kussakin eri tapauksessa riippuu kayttdtarkoituksesta, kulloisestakin vaikuttavasta aine-osasta ja kohteesta. Yhdiste tai koostumus voidaan antaa myiSs saannttstellysti kayttaen vaikuttavaa aineosaa va-15 pauttavia depotistute- tai ruiskeformuloita, joita kuva-taan tarkemmin jaljempana.

Mita edelia esitettyihin kayttOtarkoituksiin tu-lee, vaikuttavaa aineosaa on yleensa tarkoituksenmukaista antaa noin 0,001 - 5 mg/ruumiinpaino-kg. Ihmisille ainet-20 ta annetaan edullisesti noin 0,01-1 mg/kg/vuorokausi ja eiaimille noin 0,1-1 mg/kg/vuorokausi. Tama antaminen voi tapahtua yhdelia kertaa, jakamalla annos useaan antoeraan tai vaikuttavaa aineosaa hitaasti vapauttavassa muodossa tehokkaimpien tulosten saavuttamiseksi. Kun kysymyksessa 25 on kiiman tai tiineyden ehkaisy eiaimilia, annos on edul- • · lisimmin noin 1-10 mg/kg ja se annetaan yhtena annoksena.

Parenteraalinen anto edellyttaa yleensa pienempaa annostusta kuin muut antornenetelmat, jotka ovat enemman imeytymisesta riippuvaisia.

30 KeksintO koskee myOs koostumuksia, jotka sisalta- vat vaikuttavana aineosana taman keksinnOn mukaista yh- ♦ distetta, joka on sekoitettu johonkin fysiologisesti hy-vaksyttavaan myrkyttomaan kantajaan. Kuten edelia on mai-nittu, sellaiset koostumukset voidaan valmistaa kaytetta- I · 18 92326 viksi parenteraaliseen (ihonalaiseen, lihaksensisaiseen tai laskimonsisåiseen) antamiseen erityisesti nestemais-ten liuosten ja suspensioiden muodossa; kaytettaviksi emattimen tai perasuolen kautta antamiseen erityisesti 5 puolikiinteissa muodoissa, kuten esimerkiksi voiteina ja perapuikkoina; kaytettaviksi suun kautta tai bukkaalises-ti antamiseen erityisesti tablettien tai kapselien muodossa; tai kaytettaviksi nenan kautta erityisesti pulve-reiden, nenatippojen tai aerosolien muodossa.

10 Koostumukset voidaan antaa katevasti yksikkOannos- muodossa ja voidaan valmistaa milla tahansa niista mene-telmista, jotka ovat farmasian alalla tunnettuja ja joi-ta esimerkiksi kuvataan teoksessa Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsyl-15 vania, 1970. Parenteraalisesti annettaviksi tarkoitetut formulat voivat sisaitaa tavanomaisia tSyteaineita, esimerkiksi steriilia vetta tai fysiologista suolaliuosta, alkyleeniglykoleja, kuten propyleeniglykolia, polyalky-leeniglykoleja, kuten polyetyleeniglykolia, kasviperaisia 20 dljyja, hydrattuja naftaleeneja seka vastaavia. Emattimen tai perasuolen kautta annettaviksi tarkoitetut formulat, esimerkiksi perapuikot, voivat sisaitaa tayteaineina esimerkiksi polyalkyleeniglykoleja, vaseliinia, kaakaovoita ja vastaavia. Nenan kautta annettaviksi tarkoitetut for-25 mulat voivat olla kiinteita ja sisaitaa tayteaineina esi- · merkiksi laktoosia ja dekstraania tai olla vesi- tai 01-jyliuoksia, jotka on tarkoitettu annettaviksi nenatippojen tai annostellun suihkeen muodossa. Bukkaalisissa an-tomuodoissa tyypillisia tayteaineita ovat sokerit, kal-30 siumstearaatti, magnesiumstearaatti, esigelatinoitu tark-kelys ja vastaavat.

Taman keksinnbn mukaisten nona- ja dekapeptidien antaminen nenan kautta on erityisen edullista. Imeytymis-ta nenan limakalvon lapi parantavat pinta-aktiiviset ha- 19

O o 7 O L "s lO LO

pot, kuten esimerkiksi glykokoolihappo, koolihappo, tau-rokoolihappo, kolaanihappo, etokoollhappo, deoksikooli-happo, kenodeoksikoolihappo, dehydrokoolihappo ja glyko-deokslkoollhappo.

5 LHRH:n antagonistia sisSltav&ån liuos- tai jauhe- formulaan voidaan lis&tS yhta tai useampaa pinta-aktii-vista happoa tai suolaa mutta edullisesti yhta fysiologisesti hyvaksyttavaa happosuolaa. Sopivia fysiologisesti hyvSksyttSvia pinta-aktiivisia suoloja ovat suolat, joita 10 kaytettaessa peptidin parantunut imeytyminen samoin kuin yhdisteen pinta-aktiiviset ominaisuudet sailyvat ja jotka eivåt ole kohteelle vahingollisia tai muista syista sovel tumattomia. Sellaisia suoloja ovat esimerkiksi epaor-gaanisista emaksista saatavat suolat, mm. natrium-, ka-15 lium-, litium-, ammonium-, kalsium-, magnesium-, alumii-ni-, rauta(III)- ja magnaani(III)suolat seka vastaavat. Erityisen edullisia ovat ammonium-, kalium-, natrium-, kalsium- ja magnesiumsuolat. Fysiologisesti hyvaksytta-vista myrkyttdmista orgaanisista emaksista saatavia suo-20 loja ovat primaaristen, sekundaaristen ja tertiaaristen amiinien, substituoitujen amiinien (luonnossa esiintyvdt substituoidut amiinit mukaan luettuina), syklisten amiinien ja emaksisten ioninvaihtohartsien, kuten esimerkiksi isopropyyliamiinin, trimetyyliamiinin, dietyyliamiinin, 25 trietyyliamiinin, tripropyyliamiinin, etanolamiinin, 2- I · dimetyyliaminoetanolin, 2-dietyyliaminoetanolin, tromet-amiinin, disykloheksyyliamiinin, lysiinin, arginiinin, histidiinin, kofeiinin, prokaiinin, hydrabamiinin, kolii-nin, betaiinin, etyleenidiamiinin, glykosamiinin, metyy-30 liglukamiinin, teobromiinin, puriinien, piperatsiinin, piperidiinin, N-etyylipiperidiinin, polyamiinihartsien seka mulden vastaavien, suolat. Erityisen edullisia myr-kyttOmia orgaanisia emaksia ovat isopropyyliamiini, di-etyyliamiini, etanolamiini, trometamiini, disykloheksyy-35 liamiini, koliini ja kofeiini.

. · 20 9'/ ό i 6

Vieia edullisemmin tSmSn keksinnOn kåytanniin so-vellutuksissa kaytettava pinta-aktiivinen aine on glyko-koolihapon alkalimetallisuola, edullisimmin natriumglyko-kolaatti.

5 Pinta-aktiivista ainetta kaytetaan taman keksin nOn kaytanndn sovellutuksissa sellaisena maarana, ettå se parantaa LHRH-peptidien imeytymista enemman kuin muut pinta-aktiiviset aineet, jotka saattavat parantaa pepti-dien imeytymista jossakin maarin. On havaittu, etta usein 10 sellainen maara on 0,2-15 % (massa/tilavuus), vieia useammin 0,2-5 % (massa/tilavuus) liuoksesta. Pinta-aktiivista ainetta on edullista olla mukana noin 0,5-4 % (massa/tilavuus), mieleliaan noin 1 % (massa/tilavuus) ja edullisesti noin 2 % (massa/tilavuus).

15 Naihin formuloihin voidaan lisata muitakin ainei- ta, kuten esimerkiksi sailymista parantavia aineita, suo-loja kudosta vastaavan elektrolyyttipitoisuuden saavutta-miseksi seka muita lisaaineita, jotka ovat nenan kautta annettaviksi tarkoitettujen formuloiden kemiassa tunnet-20 tuja. Erityisen edullisia sellaisia muita aineita ovat pinta-aktiiviset aineet, edullisesti ionittomat pinta-aktiiviset aineet, kuten polysorbaatit, 0,1-5 %:n (massa/tilavuus), vieia edullisemmin 0,25-2 %:n (massa/tilavuus ), pitoisuuksina.

25 On havaittu, etta paremman liukenevuuden ja sta- • 1 biilisuuden saavuttamiseksi sappihapon ja peptidin mooli-suhteen on tarkoituksenmukaista olla vahintaan 20:1, esimerkiksi ainakin 25:1.

Taman keksinndn mukaiset yhdisteet on erityisen 30 toivottavaa vapauttaa kohteeseen pitkan ajanjakson aika-na, esimerkiksi viikosta vuoteen vaihtelevan ajanjakson aikana yhdesta ainoasta antamisesta. Voidaan kayttaa hy-vaksi erilaisia hitaasti vaikuttavaa ainetta vapauttavia depotistutteita tai ruiskeina annosteltavia muotoja. An-35 nostusmuoto voi esimerkiksi sisaitaa yhdisteen fysiologi-

II

» · 21 Π r. *7 ιΛ S L·^ L Ο sesti hyvSksyttåvaa myrkytdnté suolaa, jonka liukoisuus ruumlin nesteisiin on plenl, eslmerklksl (a) moniemaksi-sen hapon, kuten fosforihapon, rikkihapon, sitruunahapon, viinihapon, parkkihapon, pamonihapon, algiinihapon, poly-5 glutamiinihapon, naftaleenimono- tai -disulfonihappojen, polygalakturonihapon tal vastaavan, muodostamaa happoad-ditiosuolaa; (b) moniarvoisten metallikationin, kuten slnkln, kalsiu-min, vismutin, bariumin, magneslumln, alumiinin, kuparln, 10 koboltin, nikkelin, kadmlumln tai vastaavan, tai esimer- kiksi N,N'-dibentsyylietyleenidiamiinista tai etyleeni-diamiinista muodostuneen orgaanisen kationin muodostamaa suolaa; tai (c) yhdistelm&å, joka koostuu (a):sta ja (b):stå, esimer- 15 kiksi sinkkitannaattisuolaa.

LisSksi tåman keksinnOn mukaiset yhdisteet tai edullisesti, niiden suhteellisen liukenemattomat suolat, kuten esimerkiksi juuri edelld esitetyt suolat, voidaan formuloida ruiskeina annettavaksi soveltuvaksi geeliksi, 20 esimerkiksi alumiinimonostearaattigeeliksi seesamidJljyå kfiyttåen. Erityisen edullisia suoloja ovat sinkkisuolat, sinkkitannaattisuolat, pamoaattisuolat ja vastaavat.

Eråsta toista tyyppiS oleva hitaasti vaikuttavaa ainetta vapauttava depotformula, joka soveltuu annettavaksi ruis-... 25 keina tai istutettavaksi kudok seen, voisi sisåltaa yhdis-tetta tai sen suolaa dispergoituna tai kapseloituna hitaasti hajoavaan, myrkyttdmaan, ei-antigeeniseen polymee-riin, kuten esimerkiksi polymaitohappo-polyglykolihappo-polymeeriin. Yhdisteet tai, edullisesti, niiden suhteel-30 lisen liukenemattomat suolat, kuten esimerkiksi edelld esitetyt suolat, voidaan myds formuloida kolesterolimat-riksipelleteiksi tai silastomeerimatriksi-istutteiksi tai hydrogeeli- tai huokoskapseleiksi, erityisesti silloin, kun niita on tarkoitus kayttaa eiaimilia. Muut hitaasti 35 vaikuttavaa ainetta vapauttavat depotistute- ja ruiske- • · « 92326 22 formulat, esimerkiksi liposomit, ovat alan kirjallisuu-dessa hyvin tunnettuja. Viitataan esimerkiksi teokseen Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, toim. J.R. Robinson, Marcel Dekker, Inc., New York, 5 1978. Erityisesti LHRH-tyyppisten yhdisteiden lahteeksi voidaan todeta esimerkiksi US-patenttijulkaisu 4 010 125. Tutustukaa myiis C.C. Pittin artikkeliin "The controlled delivery of polypeptides including LHRH analogs" teokses-sa LHRH and its Analogs: Contraceptive and Therapeutic 10 Applications, Part 2, toim. B.H. Vickery ja J.J. Nestor, Jr., MTP Press, Boston, 1987, s. 557.

Peptidien syntetisointi

TamSn keksinnOn mukaisia polypeptideja voidaan syntetisoida peptidi-alaan perehtyneille tutuin menette-15 lytavoin. Erinomainen yhteenveto monista sellaisista kayttiikelpoisista menettelytavoista on ldydettavissa teoksista J.M. Stewart ja J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969 ja J. Meienhofer, Hormonal Prosteins and Peptides, osa 2, Aca-20 demic Press, New York, 1973, s. 46, kun kysymyksessa on peptidien kiintea-faasisynteesi, ja teoksesta E. Schroder ja K. Lubke, The Peptides, osa 1, Academic Press, New York, 1865, kun kysymyksessa on klassinen liuossynteesi.

Yleensa nama menetelmat kasittavat yhden tai .. 25 useamman aminohapon tai sopivalla tavalla substituoidun aminohapon liittamisen perakkain kasvavaan peptidiket-juun. Normaalisti joko ensimmaisen aminohapon aminoryhma tai karboksyyliryhma suojataan sopivalla suojausryhmaiia. Suojattu tai johdannaisekseen muunnettu aminohappo voi-30 daan sitten joko kiinnittaa inerttiin kiinteaan kantajaan tai kayttaa hyvaksi liuoksena liittamaiia jarjestyksessa seuraava aminohappo, jossa vapaa ryhma (amino- tai karboksyyliryhma) on sopivalla tavalla suojattu, amidisidok-sen muodostamiseen soveltuvissa olosuhteissa. Sen jaikeen 35 tasta vastaliitetysta aminohappotahteesta poistetaan suo- 92326 23 jausryhma, ja sitten liitetaan seuraava (sopivalla taval-la suojattu) aminohappo jne. Sen jalkeen kun kaikki ami-nohapot on liitetty oikeassa jarjestyksessa, kaikki jai-jelia olevat suojausryhmat (ja mahdollinen kiintea kan-5 taja) poistetaan peråkkåin tai samanaikaisesti, jolloin saadaan lopullinen polypeptidi. Muuntamalla tata yleista menettelyå yksinkertaisella tavalla on mahdollista lisåta kasvavaan ketjuun enemmSn kuin yksi aminohappo kerral-laan, esimerkiksi liittamaiia toisiinsa suojattu tripep-10 tidi ja sopivalla tavalla suojattu dipeptidi (sellaisissa olosuhteissa, etta asymmetriakeskukset eivat rasemisoi-du), jolloin muodostuu suojausten poiston jalkeen penta-peptidi.

Synteesin edullisia toteutustapoja 15 Eras erityisen edullinen menetelma taman keksinnOn mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi sisaitaa kiintea-faasipeptidisynteesin.

Tåssa erityisen edullisessa menetelmassa aminohappo j en funktionaalinen a-aminoryhma suojataan happo- tai 20 emasherkaiia ryhmålia. Sellaisten suojausryhmien tulisi olla ominaisuuksiltaan stabiileja peptidisidosten muodos-tusolosuhteissa ja samalla helposti poistettavissa hajot-tamatta kasvavaa peptidiketjua tai rasemisoimatta mitaan sen sisaitamista asymmetriakeskuksista. Sopivia suojaus-.. 25 ryhmia ovat t-butyloksikarbonyyli (Boc), bentsyloksikar-bonyyli (Cbz), bifenyyli-isopropyloksikarbonyyli, t-amy-loksikarbonyyli, isobornyloksikarbonyyli, a,a-dimetyyli- 3,5-dimetoksibentsyloksikarbonyyli, o-nitrofenyylisulfe-nyyli, 2-syaani-t-butyloksikarbonyyli, 9-fluorenyylimety-30 loksikarbonyyli ja vastaavat, erityisesti t-butyloksikar-bonyyli.

Erityisen edullisia ryhmia sivuketjujen suojauk-seen ovat arginiinin tapauksessa nitro, p-tolueenisulfo-nyyli, 4-metoksibentseenisulfonyyli, Cbz, Boc ja adaman-35 tyloksikarbonyyli; tyrosiinin tapauksessa bentsyyli, o-bromibentsyloksikarbonyyli, 2,6-diklooribentsyyli, iso- 24 propyyli, sykloheksyyli, syklopentyyli ja asetyyli; seriinin tapauksessa bentsyyli ja tetrahydropyranyyli; seka histidiinin tapauksessa bentsyyli, p-tolueenisulfo-nyyli ja 2,4-dinitrofenyyli.

5 C-terminaalinen aminohappo kiinnitetåån sopivaan kiinteaan kantajaan. Sopivia kiinteita kantajia, joita voidaan kåyttåå edellå esitetyssa synteesisså, ovat sel-laiset aineet, jotka ovat inerttejå vaiheittaisten kon-densaatiosuojauksenpoistoreaktioiden reagensseille ja 10 olosuhteille ja jotka eivåt liukene kaytettaviin våliai-neisiin. Sopivia kiinteita kantajia ovat kloorimetyyli-polystyreeni-divinyylibentseenipolymeeri, hydroksimetyy-lipolystyreeni-divinyylibentseenipolymeeri ja vastaavat, erityisesti kloorimetyylipolystyreenistå ja 1 %:ista divi-15 nyylibentseenia koostuva polymeeri. Siina erikoistapauk-sessa, ettå yhdisteen C-terminaalinen tahde on glysiin-amidi, yksi erityisen kayttokelpoinen kantaja on bents-hydryyliaminopolystyreeni-divinyylibentseenipolymeeri, jota kuvaavat P. Rivaille et al., Helv. Chim. Acta 54 20 (1971) 2772. Kiinnitys kloorimetyylipolystyreeni-divi- nyylibentseenityyppiseen hartsiin toteutetaan antamalla N^-suojatun amihohapon, erityisesti Boc-aminohapon rea-goida cesium-, trimetyyliammonium-, trietyyliammonium-tai 1,5-diatsabisyklo,^4.4.07undek-5-eenisuolanaan tai ·' 25 muuna samankaltaisena suolana etanolissa, asetonitriilis-så, Ν,Ν-dimetyyliformamidissa (DMF) tai vastaavassa, erityisesti cesiumsuolana DMF:ssa, kloorimetyylihartsin kanssa korotetussa lampQtilassa, esimerkiksi noin 40-60°C: ssa, edullisesti noin 50°C:ssa, noin 12-48 tuntia, edul-30 lisesti noin 24 tuntia. N°^-Boc-aminohappo kiinnitetaan ·· bentshydryyliamiinihartsiin N,N'-di-isopropyylikarbodi- imidin (DIC)/1-hydroksibentsotriatsolin (HBT) vålittamån, noin 2-24 tuntia, edullisesti noin 12 tuntia, kestavan kytkentåreaktion avulla jossakin liuottimessa, kuten di-35 kloorimetaanissa tai DMF:sså, edullisesti dikloorimetaa- • 25 32326 nissa, noin 10-50°C:n, edullisesti 25°C:n, lampotilas-sa. Peråkkaisten suojattujen aminohappojen liittaminen voidaan toteuttaa automaattisessa polypeptidien synte-tisointilaitteessa, joka on alalia tunnettu. N^-suojaus-5 ryhmien poisto voidaan toteuttaa esimerkiksi trifluori-etikkahapon metyleenikloridiliuoksella, vetykloridin di-oksaaniliuoksella, vetykloridin etikkahappoliuoksella tai jollakin muulla vahvan hapon liuoksella, edullisesti 50 %:isella trifluorietikkahapon dikloorimetaaniliuok-10 sella, suunnilleen ymparistdn lampotilassa. Kutakin suo-jattua aminohappoa lisataan edullisesti suunnilleen 2,5-kertaisesti ylimaarin ja liittaminen voidaan toteuttaa dikloorimetaanissa, dikloorimetaani-DMF-seoksessa tai vastaavassa,erityisesti dikloorimetaanissa, suunnilleen 15 ympariston lampotilassa. Kytkentaalne on normaalisti DCC dikloorimetaanissa mutta voi olla myos N, N*-di-isopropyy-likarbodi-imidi (DIC) tai muu karbodi-imidi joko yksi-nåån tai yhdessa HBT:n, N-hydroksisukkinimidin, muun N-hydroksi-imidin tai oksiimin kanssa. Vaihtoehtoisesti 20 voidaan kåyttaa suojattuja aminohappojen aktiivisia es-tereita (esim. nitrofenyyli- ja pentafluorifenyylieste-ria ja vastaavia) tai symmetrisia anhydrideja.

Kiinteafaasisynteesin lopussa taydellisesti suo-jattu polypeptidi irrotetaan hartsista. Polypeptidin ja • · • 25 hartsikantajan valisen sidoksen ollessa bentsyyliesteri- tyyppia lohkaisu toteutetaan aminolyysilla, joka suori-tetaan peptidien, jotka sisSltavat C-terminaalisena ami-nohappona proliinin, tapauksessa alkyyliamiinilla tai fluorialkyyliamiinilla, tai aminolyysilla, joka suori-30 tetaan peptidien, jotka sisaltSvat C-terminaalisena ami- * nohappona glysiinin, tapauksessa esimerkiksi ammoniakki-metanoli- tai ammoniakki-etanoliyhdistelmailS, noin 10-50°C:n, edullisesti noin 25°C:n, lampdtilassa reaktio-ajan ollessa noin 12-24 tuntia, edullisesti noin 18 tun- 35 tia. Vaihtoehtoisesti peptidi voidaan irrottaa hartsista ' · 92326 26 transesteroinnin avulla, jota suoritetaan esimerkiksi metanolilla ja jota seuraa aminolyysi. Suojattu peptidi voidaan tåsså vaiheessa puhdistaa silikageelikromatogra-fian avulla. Sivuketjuja suojaavien ryhmien poisto poly-5 peptidistå toteutetaan kåsittelemållå aminolyysituote esimerkiksi vedettomållå nestemåisellå vetyfluoridilla anisolin tai jonkin muun karboniumakseptorin ollessa mu-kana, vetyfluoridipyridiinikompleksilla tai tris(trifluo-riasetyyli)boorilla ja trifluorietikkahapolla, pelkistå-10 målla se vedyllå palladium-hiili- tai palladium-polyvi-nyylipyrrolidonikatalysaattorin ollessa mukana tai pel-kiståmållå se natriumilla nestemåisesså ammoniakissa, edullisesti nestemåisellå vetyfluoridilla ja anisolilla noin -10 - +10°C:n, edullisesti noin 0°C:n, låmpotilas-15 sa kåsittelyajan ollessa noin 15 minuutista 1 tuntiin, edullisesti noin 30 minuuttia. Kun kysymyksesså ovat glysiiniterminaaliset aminohapot bentshydryyliamiini-hartseilla, hartsin lohkaisu ja suojauksen poisto voidaan yhdiståå yhdeksi ainoaksi vaiheeksi, jossa kåyte-20 tåån hyvåksi nestemåistå vetyfluoridia ja anisolia kuten edellå on kuvattu. Polypeptidi, josta suojaukset on poistettu tåydellisesti, puhdistetaan sitten kromatografisten vaiheiden sarjalla, jossa kåytetåån jotakin tai kaikkia seuraavista vaihetyypeistå: ioninvaihtokromato-\ 25 grafia-asetaattimuodossa olevalla heikosti emåksisellå hartsilla; hydrofobinen adsorptiokromatografia derivati-soimattomalla polystyreenidivinyylibentseenihartsilla (esimerkiksi Amberlite XAD:llå); silikageeliadsorptio-kromatografia; ioninvaihtokromatografia karboksimetyyli-30 selluloosalla; partitiokromatografia, esimerkiksi Sep-hadex G-25 vastavirtadistribuutio; ja suuren erotusky-vyn nestekromatografia (HPLC), erityisesti kåanteis-faasi-HPLC kåyttåen kolonnin sidottu faasi - tåytteenå oktyyli- tai oktadekyylisilyylisilikaa.

35 Kåytettåesså 1-, 2-, 3- tai 6-asemassa raseemista aminohappoa diastereomeeriset nonapeptidi- tai dekapep- qo 7 9 c y i. sj i. o 27 tidilopputuotteet erotetaan ja haluttu peptidi, joka si-saitaa asianmukaisessa asemassa D-aminohapon, eristetaan ja puhdistetaan, edullisesti edellS mainitun kromatografisen prosessin aikana.

5 Peptideina, jotka sisaitavat C-terminaalisen atsa- glysiiniamidin, valmistus toteutetaan edullisesti klas-sista peptidien liuossyntetisointia ja tunnettuja pepti-divaiituotteita kayttaen. Tata kuvataan yksityiskohtai-semmin esimerkissM 3.

10 Kaavan (I) mukaisia yhdisteita ja niiden fysiolo gisesti hyvaksyttavia suoloja valmistetaan yleisesti siten, ettå suojatusta polypeptidista poistetaan suojaryh-mat ja mahdollisesti kovalenttisesti sitoutunut kiintea kantaja, kaavan (I) mukaisen yhdisteen tai sen suolan ai- 15 kaansaamiseksi; tai kaksi halutun, kaavan (I) mukaisen yhdisteen fragmenttia liitetaan yhteen vaadittavaan jar-jestykseen; tai (a) kaavan (I) mukainen yhdiste muunnetaan fysiologisesti hyvaksyttavaksi suolakseen; 20 (b) kaavaa (I) mukaisen yhdisteen suola muunnetaan fysio logisesti hyvaksyttavaksi suolaksi tai (c) kaavan (I) mukaisen yhdisteen suola muunnetaan va-paaksi polypeptidiksi, jolla on kaava (I).

Seuraavat esimerkit on esitetty, jotta alan ammat-. 25 ti-ihmiset kykenevat saamaan paremman kasityksen keksin-nOsta ja soveltamaan sita kaytannOssa. Niita ei tulisi kasittaa keksinnOn piiria rajoittaviksi, vaan pelkastaan keksintoa valaiseviksi ja kuvaaviksi.

Valmistus A

30 3-(2-naftyyli)-DL-alaniini 3-(2-naftyyli)-DL-alaniini valmistetaan US-patent-tijulkaisussa nro 4 341 767 esitetylia menettelytavalla.

N-asetyyli-3-(2-naftyyli)-DL-alaniinin valmistus ja muuntaminen metyyli-N-asetyyli-3-(2-naftyyli)-DL-ala- 35 ninaatiksi seka D-isomeerin erottaminen toteutetaan US- 92326 28 patenttijulkaisussa nro 4 341 767 esitetyllå menettely-tavalla.

Valmistus B

Bentsyyli-N^-bentsyloksikarbonyyli-NfN'-guanidinodi-5 isopropyyli-D-homoargininaattitolueenisulfonaatti

Seokseen, joka sisalsi 5,24 g bentsyyli-N°°-bentsyl-karbonyyli-D-lysinaattitolueenisulfonaattia (B. Bezus ja L. Zervas, J. Am. Soc . 83 (1961) 719) ja 1,72 ml di-iso-propyylietyyliamiinia 60 mlrssa dioksaania, lisattiin 10 1,89 g N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidia. Reaktioseosta sekoitettiin 100°C:ssa 6 tuntia, ja se jåahdytettiin huo-neen låmpotilaan ja haihdutettiin, jolloin saatiin kiin-tea aine. Kiintoaine suspendoitiin 20 ml:aan lamminta DMF:a, suspensio suodatettiin N,N'-di-isopropyyliurean 15 poistamiseksi ja suodos haihdutettiin, jolloin saatiin kiintea aine. Bentsyyli-Nc^'-bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodi-isopropyyli-D-homoargininaattitolueenisulfo-naatti saatiin valkoisena kiinteåna aineena kiteyttåmal-1M se metanoli-etyyliasetaattiseoksesta; 20 /o£7d = “7,26° (c = 0,3, MeOH).

Vastaavasti kSyttamSlla edellå kuvattua menettely-tapaa mutta vaihtamalla N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidin tilalle N,N1-disykloheksyylikarbodi-imidi; N,N'-di-(n-heksyyli)-karbodi-imidi; *'25 N ,N' -dietyylikarbodi-imidi; N,N'-di-(n-propyyli)-karbodi-imidi; N-isopropyylikarbodi-imidi; N-propyylikarbodi-imidi; N-(n-butyyli)-karbodi-imidi? . 30 N,N'-di-(n-butyyli)-karbodi-imidi; : Ν,Ν'-di-isobutyylikarbodi-imidi? Ν,Ν'-di-(n-pentyyli)-karbodi-imidi; N,N1-di-isopentyylikarbodi-imidi; N,N1-difenyylikarbodi-imidi; 35 N,N'-ditolyylikarbodi-imidi tai 92326 29

1-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidihydro-kloridi tai vastaava saadaan bentsyyli-N °^-bentsyloksi-karbonyyli-Ν,Ν'-guanidinodisykloheksyyli-D-homoargini-naattia, = 8,07° (c = 0,9, MeOH) , bentsyyli-N

5 bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodietyyli-D-homoargi- ninaattia, bentsyyli-N -bentsyloksikarbonyyli-N-N'-gua-nidinodi-(n-propyyli)-D-homoargininaattia, ~ 8,07° (c = 0,9, MeOH), bentsyyli-N*·-bentsyloksikarbonyyli-N-guanidino-(n-propyyli)-D-homoargininaattia, 10 bentsyyli-N*-bentsyloksikarbonyyli-N-guanidino-(n-butyy- li)-D-homoargininaattia, bentsyyli-N * -bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodi-(n-butyyli)-D-homoargininaattia, bentsyyli-N* -bentsyloksikarbonyyli-N,N-guanidinodi-iso-15 butyyli-D-homoargininaattia, bentsyyli-N*-bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodi-(n-pentyyli)-D-homoargininaattia, bentsyyli-N* -bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodifenyy-li-D-homoargininaattia, 20 bentsyyli-N *-bentsyloksikarbonyyli-N,N' -guanidinodimetyy- li-D-homoargininaattia, bentsyyli-N*-bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodi-(n-heksyyli)-D-homoargininaattia ja bentsyyli-N* -bentsyloksikarbonyyli-N,N1-guanidinodi-iso-: 25 propyyli-D-argininaattia, /jpQ-q = -10,5° (c = 0,5, MeOH), bentseenisulfonaattisuoloinaan. Vastaavasti korvaamalla D-lysinaatti bentsyyli-N *-bentsyloksikarbonyyli-D-orni-tinaatilla voidaan saada aikaan vastaavia arginiinianalo-geja tolueenisulfonaattisuoloinaan.

30 Valmistus C

^^ Q|

Bentsyyli-N -bentsyloksikarbonyyli-N ,N -eteno-D-homoargininaatti

Seokseen, joka sisålsi 15 ml tolueenia ja 15 ml t-BuOH:ta, lisattiin 2,71 g bentsyyli-N*-bentsyloksikar-35 bonyylilysinaattia ja 1,46 g 2-metyylitio-imidatsoliini- 30 92326 hydrojodidia (saatavissa Aldrichilta). Seoksen pH saadet-tiin suunnilleen arvoon 8 di-isopropyylietyyliamiinia lisååmållå, ja liuosta refluksoitiin 24 tuntia.

Liuos vakevoitiin alipaineessa, ja jaannos pakat-5 tiin silikageelipylvaaseen (250 mg). Pylvas eluoitiin kåyttåen C^C^-MeOH-seosgradienttia suhteesta 19:1 suh-teeseen 7:3. Tuotetta sisaltavat jakeet tunnistettiin TLC:n avulla, yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jol-loin saatiin 2,9 g valkoista vaahtoa.

10 2 g;:n era edellå mainittua tuotetta liuotettiin 50 ml:aan EtOH:ta, joka sisålsi 0,8 g katalysaattoria, joka sisålsi 10 % Pd:a hiilikantoaineella. Liuosta sekoi-tettiin Η2»·η alla 8 tuntia. Seos suodatettiin seliitin (piimaan) låpi ja suodos haihdutettiin kuiviin, jolloin G G1 15 saatiin 1,2 g N ,N -etanohomoarginiinia valkoisena vaah- tona.

Samalla tavoin mutta kåyttåmållå guanylointiaineena S-metyyli-3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidiinitiolia (Aldrich) G G1 saatiin N ,N -propanohomoarginiinia valkoisena vaahtona.

20 Vastaavasti mutta kåyttåmållå guanylointiaineena S-metyylibis-(2,2,2-trifluorietyyli)-tiouroniumjodidia G G1 saatiin N ,N -bis-(trifluorietyyli)-homoarginiinia (Bth) valkoisena vaahtona.

Valmistus D

25 Ν'** -t-butyloksikarbonyyli-N ,N ’ -guanidinodi-iso- propyyli-D-homoarginiinitolueenisulfonaatti Tåmå valmistusesimerkki valaisee N,N'-guanidinodi-substituoitujen D-homoarginiinien valmistamista tolueeni-sulfonaattiesiasteistaan.

30 Seosta, joka sisålsi bentsyyli-N^-bentsyloksikar- : bonyyli-N,N'-guanidinodi-isopropyyli-D-homoargininaatti- tolueenisulfonaattia (3,25 g) ja 100 mg katalysaattoria, joka sisålsi 10 % Pd:a hiilikantoaineella, 50 ml:ssa jååetikkaa, kåsiteltiin vetykaasulla ilmakehån paineessa 35 4 tuntia. Katalysaattori erotettiin suodattamalla seos

II

31

o t',"7 S

o l 6 seliitin lapi, ja suodos haihdutettiin, jolloin saatiin kiinteåtå N,N'-guanidinodi-isopropyyli-D-homoarginiinito-lueenisulfonaattia. Liuokseen, joka sisalsi tatå yhdistet-ta (2,13 g) 60 ml:ssa dioksaani-vesiseosta (1:1), lisat-5 tiin 10 ml IN natriumhydroksidia ja 0,4 g magnesiumoksidia. Sen jalkeen tåhån seokseen lisattiin 1,1 g di-(t-butyv-li)-dikarbonaattia, ja sitå sekoitettiin huoneen lampo-tilassa 2 tuntia. Magnesiumsuola erotettiin suodattamalla ja suodos våkevditiin alipaineessa. Emaksinen liuos pes-10 tiin etanolilla, ja sen jalkeen sen pH saadettiin arvoon 2,5 natriumsulfaatilla. Hapan vesiliuos uutettiin etyyli-asetaatilla, ja etyyliasetaattiliuos kuivattiin magnesium-sulfaatilla. Kuivausaine poistettiin suodattamalla, ja suodos haihdutettiin. Kiteytys etyyliasetaatti-heksaani-15 seoksesta tuotti tulokseksi -t-butyloksikarbonyyli-N,N1 -guanidinodi-isopropyyli-D-homoarginiinitolueenisulfonaat-tia.

Menettelemalla samalla tavalla mutta kayttamalla asianmukaisia tolueenisulfonaattiesiasteita voidaan val-20 mistaa muita Ν°ί-t-butyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodi-substituoituja D-homoarginiini- tai D-arginiiniyhdistei-tå.

Valmistus E

-t-butyloksikarbonyyli-3-/4'-(1'-propyylipipe-• 25 ridyyli)y-D-alaniini 400 ml:aan absoluuttista etanolia lisattiin 4,6 g natriummetallia ja seosta kuumennettiin. Tulokseksi saa-tuun natriumetoksidiliuokseen lisattiin 21,.7 g dietyyli-(asetamidomalonaattia) ja 16,4 g 4-pikolyylikloridihydro-. 30 kloridia (Aldrich Chemical Co). Reaktioseosta kuumennettiin 100°C:ssa 4 tuntia, ja se jåShdytettiin, suodatet-tiin ja vakevoitiin alipaineessa. Seos siirrettiin sili-kageelipylvaaseen metyleenikloridi-metanoliseoksessa (19:1) , ja eluointi suoritettiin samalla seoksella. Tuo-35 te paikallistettiin nopeasti liikkuvaksi UV-positiivisek- « 32 92326 si tåplåksi silikageeliohutkerroskromatogrammissa (eluent-tina metyleenikloridi-metanoliseos suhteessa 19:1). Yh-distetyt jakeet vakevoitiin, jolloin saatiin tuote.

Edellisen kappaleen mukainen tuote liuotettiin 200 5 ml:aan etanolia, ja tata liuosta kåsiteltiin liuoksella, joka sisalsi 2,72 g natriumhydroksidia 40 ml:ssa vettå, 50°C:ssa 6 tuntia. Liuos tehtiin happamaksi 12 ml :11a 6 N HCl:a, se haihdutettiin kuiviin, ja jåannos sekoitet-tiin 200 ml:aan dioksaania. Suspensio suodatettiin, ja 10 suodosta refluksoitiin 2 tuntia. Liuos jaahdytettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin etyyli-N^Casetyyli-3-(4-pyridyyli)-DL-alaniinia valkoisena kiinteanS aineena.

Osa tastå N-asetyyliesterista liuotettiin uudel-leen kasittelemalla sita 200 ml :11a subtilisiini Carls-15 bergia (Sigma Chem. Co., Proteaasi VIII) seoksessa joka sisalsi 300 ml dimetyylisulfoksidia ja 400 ml 0,01 M KCl, (pH 7,2). 6 tunnin kuluttua uudelleen liukenemi-nen oli taydellista. Liuos laimennettiin 400 ml:11a vetta ja uutettiin neljalla 750 ml:n erallS etyyliasetaat-20 tia. Orgaaniset kerrokset yhdistettiin ja kuivattiin mag- nesiumsulfaatilla seka vakevoitiin, jolloin saatiin etyy-li-N^-asetyyli-S-(4-pyridyyli)-3-alaninaattia oljyna.

Oljyn annettiin 1,22 g:n kanssa n-propyylibromi-dia 50 ml:ssa etanolia, minka jålkeen liuos haihdutettiin 25 kuiviin, jolloin saatiin etyyli-N0^-asetyyli-3-(1-propyy- lipyridinium-4-yyli)-D-alaninaattibromidia valkoisena hygroskooppisena kiintoaineena.

Tama valkoinen kiintea aine liuotettiin 200 ml:aan etanolia ja pelkistettiin vetyatmosfaårissa kayttaen ka-30 talysaattorina 100 mg yhdistelmaa, joka sisalsi 10 % Pd:a hiilikantoaineellao 18 tunnin pelkistyksen jalkeen kata-lysaattori erotettiin suodattamalla ja liuos haihdutettiin, jolloin saatiin etyyli-N"^ -asetyyli-3-/4'-(1'-propyyli-piperidyyli)^7~D-alaninaattia kullanruskeana kiinteana 35 aineena. Vapaa happo valmistettiin refluksoimalla etyyli-

II

92326 esteria 100 ml:ssa 6 H HCl:å 4 tuntia, jolloin saatiin 3- /4 1 - (1' -piperidyyli)_7-D-alaniinia valkoisena kiinteånå aineena.

Vapaa happo liuotettiin 100 ml:aan dioksaani-vesi-5 seosta (1:1), ja liuokseen lisattiin 2 g di-(t-butyyli)-dikarbonaattia. pH pidettiin 9:nå pH-staatilla 1 N NaOH: ta lisååmållå. Kahden tunnin kuluttua reaktioseos vake-vditiin alipaineessa ja pestiin 100 ml :11a etyylieette-riå, ja vesikerros siirrettiin Amberlite XAD-2 hartsi-10 pylvaaseen (hydrofobinen hartsi). Pylvas eluoitiin 250 ml :11a vettå ja sen jalkeen 250 ml:lla etanoli-vesiseosta (1:1). Etanolieluaatit yhdistettiin ja haihdutettiin kui-viin, jolloin saatiin N -t-butyloksikarbonyyli-3-/41 -(1'-propyylipiperidyyli)7-D-alaniinia valkoisena kiinteå-15 na aineena.

Menettelemållå samalla tavalla mutta korvaamalla 4- pikolyylikloridihydrokloridi 3-pikolyylikloridihydro-kloridilla saadaan valmistetuksi -t-butyloksikarbo-nyyli-3-^3' - (1' -propyylipiperididyyli)_7-D-alaniinia.

20 Valmistus F

Boc-Gly-O-hartsi 4,9 g Boc-glysiinia liuotettiin seokseen, joka sisålsi 50 ml etanolia ja 50 ml tislattua vetta. Liuok-sen pH såadettiin arvoon 7 cesiumvetykarbonaatin vesi-.·. 25 liuoksella. Liuotin haihdutettiin sitten alipaineessa.

Sen jalkeen kun jåånnostå oli kuivattu 18 tuntia suuressa alipaineessa, se liuotettiin 150 ml:aan kuivaa DMF:å. Liuokseen lisattiin 25 g kloorimetyloitua poly-styreenihartsia, joka sisålsi 1 % divinyylibentseeniå 30 (Merrifield* 25 mmol:a kloridia vastaava). Seosta ravis-!: tettiin 50°C:ssa 24 tuntia, se suodatettiin, ja hartsi pestiin sen jålkeen peråkkåin DMFillå, vedellå ja etano-lilla. Hartsia kuivattiin alipaineessa 3 vuorokautta, jolloin saatiin 28,34 g Boc-Gly-O-hartsia.

34 9 2 3 2 6

Valmistus G

A. S-metyyli-3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidiini- tiolihydrojodidi

Liuokseen, joka sisalsi 23,24 g 3,4,5, 6-tetrahydro-5 2-pyriraidiinitiolia 175 ml:ssa MeOH:ta, lisattiin 15,57 ml Mel:ta, ja seosta refluksoitiin 1,5 tuntia. Liuotin haihdutettiin alipaineessa ja jaannos suspendoitiin di-etyylieetteriin. Sakka erotettiin suodattamalla ja kui-vattiin alipaineessa, jolloin saatiin 51,4 g S-metyyli-10 3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidiinitiolia valkoisina kiteina.

B. N^-t-butyloksikarbonyyli-N ,N -propeno-L-ho- moarginiini S-metyyli-3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidiinitioli saatiin 51,4 g:sta HI-suolaansa suorittamalla partitio 15 CH2Cl2:n (300 ml) ja 4 N NaOH:n (50 ml) kesken. Tulok- seksi saatu CH2Cl2-liuos vakevoitiin noin 100 ml:n tila-vuuteen, ja siihen lisattiin noin 100 ml EtOHrta. S-me-tyyli-3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidiinitioliliuos lisSt-tiin pisaroittain 60°C:ssa liuokseen, joka sisalsi 24 g 20 lysiinihydrokloridia 66 ml:ssa 2 N NaOH:ta. Sekoittamista jatkettiin yon yli 60°C:ssa typen alla. 10,78 g lisaa HI-suolaa hajotettiin 15 ml:11a 4 N NaOH:ta, uutettiin 90 %:sella CH2Cl2:lla ja lisattiin pisaroittain ja se-koittaen toiset 24 tuntia 60°C:ssa, jona aikana reaktio : 25 meni suurin piirtein loppuun.

Reaktioseos pestiin kahdella EtOAc-eralla, ja Pha:ta sisaltava vesikerros laimennettiin 200 ml:11a dioksaania ja 200 ml:11a vetta. Liuos jaahdytettiin 0°C: seen, ennen kuin siihen lisattiin 33 mg di(t-butyyli)-30 dikarbonaattia ja 6 g MgO:ta. 4 g:n lisaera MgO:ta ja 22 g:n lisaera di-(t-butyyli)-dikarbonaattia saivat reaktion menemaan loppuun.

MgO erotettiin suodattamalla seliitin lapi, ja suodos vakevoitiin alipaineessa puoleen tilavuudestaan.

35 JaannSs pestiin kahdesti dietyylieetterilla ennen siir-

II

35 9 2 3 2 6 tåmistå silikageelipylvååseen (750 g silikageeliå, joka oli pakattu pylvaaseen CH^CNissa). Pylvas pestiin 5 lit-ralla CH^CN:. ja eluoitiin CH^CNrlla, joka sisalsi 10 % vetta (yht. 2 litraa), ja edelleen CH^CNtlla, joka sisal-5 si 20 % vetta (yht. 5 litraa). Tuotejakeet paikallistet-tiin ohutkerroskromatografisesti silikageelilevyilla (CH3CN-H0Ac-H20-seos suhteessa 4:1:1). Tuotejakeet yhdis-tettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 5,0 g tuotetta valkoisena vaahtona, jonka sulamispiste oli 96°C ja 10 = 16,1° (c = 0,54, MeOH), ja lisaksi 15 g lievasti epa- puhdasta oljya.

Samalla tavalla mutta kåyttamalla asianmukaisia S-metyyli-N,N1-dialkyylitiouroniumhydrojodideja saadaan vastaavia -t-butyloksikarbonyyli-N ,N -dialkyylihomo-15 arginiineja.

Esiinerkki 1 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-hArg(CH2CF3)2~ D-Tyr-Leu-hArg(CH2CF3)2~Pro-D-Ala-NH2 Otsikon mukainen yhdiste on esitetty tassa seli-20 tyksessa myQs N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Bth- D-Tyr-Leu-Bth-Pro-D-Ala-NH2:na.

Beckman 990 Peptide Synthesizer-laitteen reaktio-astiaan laitettiin 0,758 g (0,5 mmol) bentshydryyliamino-polystyreenihartsia (Peninsula Labs., 0,66 mmol/g).

25 Ensimmainen aminohappo liitettiin lisaamalla 0,284 g

Boc-D-Ala-OH:ta, 0,202 g Hbt:t. ja 3 ml 0,5 M di-iso-propyylikarbodi-imidiå. 3 tunnin liitSntajakson ja hart-sin pesun jalkeen tShSn hartsiin lisåttiin perakkain muut aminohapot synteesiohjelman mukaisesti seuraavasti: 30 Vaihe 1 CH2CL2~pesu kerran 1,5 min 2 suojauksen poisto CF3C02H-CH2Cl2-seoksella (1:1) kerran 1,5 min 3 suojauksen poisto cf3co2h-ch2ci2- 35 seoksella (1,1) kerran 30 min 36 92326 4 C^C^-pesu kolmesti 1,5 min 5 trietyyliamiini-Ci^C^-seos (1:1) kahdesti 1,5 min 6 CH2Cl2-pesu kolmesti 1,5 min 7 N -Roc-aminohappo liuotettuna 5 C^C^-DMF-seokseen (1:1) kerran lisays 8 N,N'-di-isopropyylikarbodi- imidiliuos (0,5 M) kerran lisays 9 Cl^C^-huuhtelu ja -såilytys, liitanta kerran liitanta- 10 reaktio 2 tuntia 10 CH2Cl2-huuhtelu kerran 1,5 min 11 CH2Cl2-pesu kolmesti 1,5 min 12 etanolipesu kolmesti 1,5 min 15 13 CHjC^-pesu kolmesti 1,5 min

Vaiheet 1-13 paattavat yhden aminohapon liitanta-syklin, ja reaktion loppuunmeno voidaan tarkistaa nin-hydriinimenetelmalla /E. Kaiser et al., Anal. Biochem.

34 (1970) 595J.

20 Hartsiin liitettiin aminohappoja perakkain kayt- taen 2,0-3,0 -kertaista moolista ylimaaraa kutakin suo-jattua aminohappoa sekå DIC:ta. Hartsi kSsiteltiin pe-rakkaisten liitantåsyklien aikana 0,269 g:11a Boc-Pro-OH:ta, 25 0,610 g:11a Boc-Bth-OH:ta, 0,311 g:11a Boc-Leu-OH’I^C^ta, 0,375 g:11a Boc-D-Tyr-OH:ta, 0,610 g:11a Boc-Bth-OH:ta, 0,380 g:11a Boc-Ser(bentsyyli)-OH:ta, ; 30 0,320 g:11a Boc-D-Pal(3)-OH:ta, 0,390 g:11a Boc-D-pCl-Phe-OH:ta, 0,400 g:11a Boc-D-Nal(2)-OH:ta ja 2,5 ml:11a etikkahappoanhydridia.

Hartsi poistettiin reaktioastiasta, pestiin C^C^: 35 Ha ja kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin 1,43 g » ·

II

92326 37 suojattua polypeptidi-hartsiyhdistelmaa. Peptidista poistettiin suojaukset, ja se irrotettiin hartsista ka-sittelemalla yhdistelmaå 25 ml :11a vedetdnta nestemais-ta HF:. 2,5 ml:n anisolia (akseptori) låsna ollessa Kel-5 F-reaktioastiassa 0°C:ssa 1 tunti, HF haihdutettiin ali- paineessa, jaljelle jaanyt N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal (3)-Ser-hArg(CG2CF3)2-D-Tyr-Leu-hArg(CH2CF3)2~Pro-D-Ala-NH2 (HF-suolanaan) pestiin eetterilla. JaSnnos uutettiin sitten jååetikalla (3 x 30 ml). Etikkahappouuttoliuos 10 haihdutettiin kuiviin. Puhdistamaton aine muunnettiin asetaattisuolaksi laskemalla se vedessa asetaattimuotoon muunnetun AG3-pylvaan (heikosti emaksinen tertiaarinen amiinihartsi lHpi. Eluaatin kylmakuivaus tuotti tulok-seksi 0,5 g puhdistamatonta peptidin asetaattisuolaa 15 valkoisena kiinteana aineena.

Epapuhdas peptidi puhdistettiin HPLC:n avulla Licroprep RP-18-pylvaassa (25,40^um), jonka koko oli 2,5 x 100 cm ja joka oli saatettu tasapainoon 0,1 % CF3C02:ta CH2CN-H20-seoksessa (1:1) sisaltavålla pusku-20 rilla (pH 2,5). UV-valoa absorboiva (280 nm) paahuippu, joka eluoitui siina vaiheessa, kun pylvaMsta oli saatu noin 2 kertaa pylvS^n tilavuus eluaattia, kerattiin talteen ja haihdutettiin kuiviin seka kylmakuivattiin kolmesti tislatusta vedesta, jolloin saatiin 64 mg puh-25 dasta N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-hArg(CG2CF3)2- D-Tyr-Leu-hArg(CH2CF3)2-Pro-D-Ala-NH2:ta, foCj^5 = -17,96° (c = 0,4, HOAc).

B. Menettelemalla samalla tavalla mutta kaytta-målla mainittujen aminohappojen tilalla asianmukaista .30 A-, B-, C-, D-, E-, F-, G- ja J-aminohappoa valmistet- tiin vastaavat dekapeptidit, joista on annettu esimerk-keja alia: 38 9/326 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Den-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Mbh-D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)- D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Deb-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)- 10 L9u-3tn-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal (2)-D-pCl-Pne-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Pbe-D-Pal (3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-

Leu-3th-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Ls'J-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-20 Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-Pna-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Pna-Pro-D-AlaNH2; *25 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-Tyr-D-Btn-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Pna-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Deh-;.30 Leu-Den-Prb-D-AlaNH2; and : N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-3th-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH^.

C. Menettelemållå samalla tavalla mutta korvaamalla 35 mainitut aminohapot asianmukaisella A-, B-, C-, D-, E-, . F-, G- ja J-aminohapolla saadaan valmistetuksi vastaa- vat dekapeptidit, joista on annettu esimerkkeja alla: li 92326 39 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-MPh-Pro-D-AlaNH^; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-

Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Den -Leu-Deh-Pro-D-AlaNh^; N-Ac-D-Nal (2)-D-pCl-Pne-D-Trp-Ser-Tyr-D-Mbn-Leu-Moh-Prc-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Mbh-Leu-Mbh-Prc-D-Ala NH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pha-^ Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Pbe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-Nbh-Prc-D-Ala NH2; N-Ac-D-Nal(2) -D-pCl-Phe-D-Pal (3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Bth-Prc-D-AlaNH2; 2o N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg- D-Pal(3)-Leu-Mbn-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Tyr-

Leu-Den-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Tyr-25 Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; : N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Tyr-

Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Tyr-Le u-Ph a -Pr o-D- Ala NH2; 30 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-

Leu-Bth-Prc-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-Mbh-Prc-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-35 Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; q o 3 9 6

40 st-OLO

N-Ac-D-Nal (2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Deh-D-Tyr-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Mbh-D-Tyr-Leu-

Mbh-Pro-D-AlaNH9; N_Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-3tn-D-Tyr-Lej- 3tn-Pro-D-AlaNH2; N -Ac-D-Na 1 (2) -D-pCl-Pne-D-Trp-Ser-Pna-D-Ty r-Leu- 10

Pha-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Deh-D-T rp-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Mbh-D-Trp-Leu-1 Mbn-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-3th-D-Trp-Leu-

Btn-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Pha-D-T rp-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH^; 2Q N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Deh-D-Pal(3)-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Mbh-D-Pal(3)-

Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2;

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-3tn-D-Pal(3)-«25 Leu-Bth-Pro-D-AlaNh^J

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pha-D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Deh-D-Nal(2)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2*j 2q N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Moh-D-Nal(2)- *: Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Pbe-D-Trp-Ser-3th-D-Nal(2)-Leu-3th-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Pha-D-Nal(2)-35 Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; li 41 52326 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N_Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)- D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N_Ac-D-Nal(2)-0-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)- 0-3al(3)-Leu-Mpn-Pro-D-AlaNH2.

Esimerkki 2 10 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-hArg(CH2CF3)2~ D-Tyr-Leu-hArg(CH2CF2)2~Pro-NHet C-terminaalisen Pro-NHCH2CH2:n sisåltavien analogien syntetisoinnissa kSytettiin esimerkissa 1 kuvatun synteesiohjelman kanssa identtistå ohjelmaa. Beckman 990-15 syntetisointilaitteen reaktioastiaan laitettiin 0,71 g

Boc-Pro-O-hartsia, joka oli valmistettu antamalla 1,3 ker-taisen modisen ylimaarSn kuivaa Boc-Pro-OH:n cesiumsuo-laa reagoida 1 % divinyylibentseenia sisaltavån kloori-metyylipolystyreenihartsin (Lab Systems, Inc.) kanssa.

20 Kaytetty maara Boc-Pro-O-hartsia sisalsi 0,5 mmol proliinia.

Hartsiin liitettiin aminohappoja peråkkain kayttaen 2,0-3,0-kertaista moolista ylim&aråa kutakin suojattua aminohappoa seka DIC:ta. Hartsin annettiin siis reagoida perakkaisten liitantSsyklien aikana : '25 0,610 g:n kanssa Boc-Bth-OH:ta, 0,311 g:n kanssa Boc-Leu-0H*H20:ta, 0,375 g:n kanssa Boc-D-Tyr-OH:ta, 0,610 g:n kanssa Boc-Bth-OH:ta, 0,380 g:n kanssa Boc-Ser(bentsyyli)-OH:ta, .:30 0,320 g:n kanssa Boc-D-Pal (3)-OH:ta, 0,390 g:n kanssa Boc-D-pCl-Phe-OH:ta, 0,400 ml:n kanssa Boc-D-Nal(2)-OH:ta ja 2.5 ml:n kanssa etikkahappoanhydridia.

Hartsi poistettiin reaktioastiasta, pestiin 35 CH2Cl2:lla ja kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin 1.5 g suojattua polypeptidi-hartsiyhdistelmSa.

92326 42 lyysillå, joka toteutettiin 25 ml :11a etyyliamiinia 2°C: ssa reaktioajan ollessa 18 tuntia. Etyyliamiinin annet-tiin haihtua, ja hartsi uutettiin metanolilla. Metanoli haihdutettiin, 2,5 ml:n kanssa anisolia ja 25 ml:n kans-5 sa uudelleen tislattua (CoF^sta) vedetontå nestemaista HF:a Kel-F-reaktioastiassa 0°C:ssa 1 tunti. HF haihdutettiin alipaineessa, ja jaånnos pestiin eetterilla. Jåannos liuotettiin 2 M etikkahappoon ja muunnettiin asetaattisuo-laksi laskemalla se vedessa asetaattimuotoon muunnetun 10 AC3-pylvaan lapi. Eluaatin kylmakuivaus tuotti tulokseksi 0,5 g puhdistamatonta peptidin asetaattisuolaa valkoisena kiinteana aineena. Lopullinen puhdistus toteutettiin HPLC-pylvaassa, jonka koko oli 2,5 x 100 mm ja joka sisalsi 40-50^um:n oktadekyylisilyloitua silikaa (Merck, Lichro-15 prep C-^g), kayttaen eluenttina 50-%:sta CHgCN:a (0,1 % CFgC02H:ta). Tuotteen kylmakuivaus vedesta tuotti tulokseksi 70 mg N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-hArg-(CH2CF2-D-Tyr-Leu-hArg(CH2CF3)2-ProNHEt:tå valkoisena jauheena.

20 Menettelemålla samalla tavalla mutta kayttamalla vaadittavia suojattuja aminohappoja saadaan valmistetuksi seuraavat yhdisteet: N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-NHEt, *;25 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-

Mbh-Pro-NHEt, N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-NHEt, N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-30 Deh-Pro-NHEt, ·' N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Nal(2)-Leu- 3th-Pro-NHEt.

Toistettaessa edellM esitetty lohkaisu ja korvat-^ taessa etyyliamiini stokiometrisella maaralla metyyli- _ ·« 43 Q07 o £ s <L 0 tai propyyliamiinia saadaan vastaavia edella mainittujen nonapeptidien metyyli- tai propyyliamideja„

Esimerkki 3

Yhdisteita, jotka vastaavat kaavaa (I), voidaan 5 valmistaa myds klassisella liuossynteesilla.

Esimerkiksi kahden pentapeptidifragmentin yhteen liittamisessa voidaan kayttaa seuraavaa menettelytapaa: N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe- Boc-Den-Leu-Den-Pro-D-Ala-NH2 10 Q-?al(3)-Ser-Tyr-OMs (1) (2) — . v — H-D-Deh-Leu-Deh-Pro-D-Ala-Ny 'f N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-15 D-Pal(3)-Ser-Tyr-N3

V

H-D-Deh-

Leu-Deh-Pro-AzaGlyNH2 (3) <r N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Oeh-Pro-D-Ala-NH? 20 ^

Erillisten fragmenttien liittaminen yhteen voidaan toteuttaa asyyliatsidimenetelmalla (J. Honzel et al.,

Coll. Czech. Chem. Commun. 26 (1971) 2333), DCC/HBT-lii-*.25 tannalla, difenyylifosforyyliatsidiliitannalla tai jolla- kin muulla rasemisoimattomalla fragmenttien liitantatek-niikalla. Yhdiste (2) voidaan valmistaa edella esitetylla tavalla, ja yhdiste (1) voidaan valmistaa esimerkissa 1 kuvatun kaltaisilla menetelmilla. Yhdiste (3) valmis-30 tetaan yhdisteesta (2) poistamalla Cbz hydraamalla, mita « ί seuraa N-Boc-N,N*-guanidinodietyyli-D-homoarginiinin liit taminen DCC-HBT-yhdistelmaa tai jotakin muuta, alalia tun-nettua liitantaainetta kayttaen.

Tallå tavalla yhteen liitettavat fragmentit ovat 35 usein peptideja tai aminohappoja. Vaihtoehtoisesti N-ter- 92326 44 minaalinen nonapeptidi voidaan valmistaa kiinteåfaasi-tai liuosmenetelmalla ja liittaa sen jålkeen alkyyliamii-niin tai semikarbatsidihydrokloridiin disykloheksyyli-karbodi-imidin ja hydroksibentsotriatsolin avulla tai 5 jollakin muulla liitåntåmenetelmållå, jolloin saadaan vastaavan kaltaisia yhdisteita.

Esimerkki 4

Suolojen valmistus A. Liuos, joka sisalsi 0,1 g (N-Ac-D-Nal(2)x, 10 D-pCl-Phe2, D-Pal(3)3,8, Btn8, D-Ala"^) LHRH :n vetyfluori-disuolaa (ts esimerkki 1) liuotettuna 50 ml:aan vettå, laskettiin pylvaan lapi, joka sisalsi 50 g Dowex 3-anio-ninvaihtohartsia, joka oli saatettu tasapainoon aikai-semmin etikkahapolla ja pesty deionisoidulla vedellå.

15 Pylvas eluoitiin deionisoidulla vedellå ja eluaatti kylmå-kuivattiin, jolloin saatiin vastaavaa (N-Ac-D-Nal(2)^, 9 O C O T Λ D-pCl-Phe“, D-Pal(3) ' , Bth , D-Ala )LHRH:n etikkahappo- suolaa.

Toistettaessa edellå esitetty menettely mutta kor-20 vattaessa etikkahappo muilla hapoilla hartsin tasapaino-tuksessa voidaan valmistaa esimerkiksi vastaavia suola-hapon, bromivetyhapon, rikkihapon, fosforihapon, typpi-hapon, bentsoehapon sekå muiden samankaltaisten happojen suoloja.

·* 25 Vastaavasti voidaan valmistaa muita LHRH:n kanssa analogisten peptidien, joita tåsså selityksesså on esitetty, happoadditiosuoloja.

B. Suoloja, jolden vesiliukoisuus on heikko, voidaan valmistaa vedestå saostamalla haluttua happoa hyvåk- , 30 si kåyttåen. Esimerkiksi: » « ·· Sinkkitannaattisuola - Liuos, joka sisålsi 10 mg (N-Ac-D-

Nal(2)1, D-pCl-Phe2, D-Pal(3)3,6, Bth8, D-Ala10)LHRHrn etikkahapposuolaa 0,1 mlrssa vettå, kåsiteltiin liuok-sella, joka sisålsi 8 mg parkkihappoa 0,08 ml:ssa 0,25 M 35 NaOH:ta. LHRH-analogin liuokseen lisåttiin vålittomåsti « _ · 92326 45 liuos, joka sisalsi 5 mg ZnSO^-7H20:ta 0,1 ml:ssa vettå.

Tulokseksi saatu suspensio laimennettiin 1 ml :11a vettå, ja sakka erotettiin sentrifugoimalla. Supernatant-ti poistettiin dekantoimalla, ja jåannos pestiin kahdesti 5 1 ml:n erillå vettå sentrifugoimalla sakka ja dekantoi malla supernatantti. Sakka kuivattiin alipaineessa, jol-loin saatiin 15 mg edellå mainitun LHRH-analogin sinkki-tannaattisekasuolaa.

Pamoaattisuola — Liuokseen, joka sisålsi 50 mg 10 (N-Ac-D-Nal(2)1, D-pCl-Phe2, D-Pal(3)3'6, Bth8, D-Ala10)-LHRH:n etikkahapposuolaa seoksessa, joka sisålsi 1,6 ml etanolia ja 0,1 ml 0,25 M NaOH:ta, lisåttiin liuos, joka sisålsi 11 mg pamonihappoa 0,3 ml:ssa 0,25 M NaOH:ta. Liuottimet poistettiin alennetussa paineessa, jåånnos 15 suspendoitiin 2 ml:aan vettå, suspensio sentrifugoitiin, ja supernatantti dekantoitiin. Sakka pestiin 1,5 ml :11a vettå ja sentrifugoitiin, ja supernatantti dekantoitiin. Sakka kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin 54 mg edellå mainitun LHRH-analogin pamoaattisuolaa.

20 Samalla tavalla voidaan valmistaa muitakin suoloja, joiden vesiliukoisuus on heikko.

C. Happoadditiosuolan valmistus vapaasta pepti-distå

Liuokseen joka sisålsi 50 mg (N-Ac-D-Nal(2) ^, . 25 D-pCl-Phe2, D-Pal(3)3,6, Bth8, D-Ala10)LHRH:ta vapaana emåksenå, lisåttiin 30 ml 1 N etikkahappoa. Tulokseksi saatu liuos kylmåkuivattiin, jolloin saatiin 50 mg edellå mainitun LHRH-analogin etikkahapposuolaa.

Vastaavasti korvattaessa etikkahappo muilla hapoil-30 la (stokiometrisesti ekvivalenttisina måårinå suhteessa peptidiin) saadaan muita tåsså selityksesså esitettyjen peptidien happoadditiosuoloja, esimerkiksi suolahapon, bromivetyhapon, rikkihapon, fosforihapon ja typpihapon suoloja.

35 D. Metallikationin muodostaman suolan, esimerkik si sinkkisuolan, valmistus : Liuokseen, joka sisålsi 50 mg (N-Ac-D-Nal(2) 46 92326 D-pCl-Phe2, D-Pal(3)3'6, Bth8, D-Ala10)LHRH:n etikkahap-posuolaa seoksessa, joka sisalsi 0,4 ml 0,25 M NaOH:ta, 0,3 ml vetta ja 1 ml etanolia, lisattiin liuos, joka si-5 salsi 15 mg ZnSO^·71^0:ta 0,2 ml:ssa vetta. Sakka sentri-fugoitiin ja supernatantti erotettiin dekantoimalla. Sakka pestiin 1 ml:11a vetta sentrifugoimalla ja dekantoimalla supernatantti. Sakka kuivattiin alipaineessa, jol-loin saatiin edelia mainitun LHRH-analogin sinkkisuolaa.

10 Samalla tavalla voidaan valmistaa suoloja muiden moniarvoisten kationien, esimerkiksi kalsiumin, vismutin, bariumin, magnesiumin, alumiinin, kuparin, koboltin, nik-kelin, kadmiumin ja muiden samankaltaisten, kanssa.

Esimerkki 5 15 Suolojen muuntaminen vapaaksi emMkseksi

Liuos, joka sisalsi 50 mg (N-Ac-D-Nal(2)*, D-pCl-Phe2, D-Pal(3)3'6, Bth8, D-Ala10)LHRH:n etikkahap-posuolaa 25 ml:ssa vetta laskettiin pylvaan lapi, joka sisalsi 50 g Dowex l:ta (voimakkaasti emaksinen ammonium- 20 anioninvaihtohartsi), joka oli tasapainotettu NaOH-liuok- sella hydroksidivastaionin aikaansaamiseksi. Pylvas elu-oitiin 150 ml:11a vetta, ja eluaatti kylmakuivattiin, jolloin saatiin 45 mg vastaavaa polypeptidia vapaana emaksena.

25 Muut tassa selityksessa esitettyjen peptidiyhdis- teiden happoadditiosuolat voidaan muuntaa vapaiksi emak-siksi vastaavalla tavalla.

Karakterisointitiedot

Edelia olevien esimerkkien mukaisesti valmistettu- 30 jen yhdisteiden karakterisointitiedot on esitetty taulu-koissa 1 ja 2: 92326 47 S D iZ<Z<<Z<< ~Ζ<<<Ζ*<Ζ<<<<ί<Ζ<<< ν' - Q “ O x x 5 - * < c x i x Q -. -. * -. -. * -. . - L« * - * - * * m — C x. * _' . o r— ^ ® κτ ΓΝ o m . CM <N o u o ~ o ^ O* o O 6 o “ o o o' 6 O o o o o o o o o' o o O o ° ο°ο°ουθου °°οουυοοουοοοοοουου awCJ·*— Ow-W*-'^·'^-' 00-^-2^2^2^0^0^0^^ O O O o 9 o 9 · ®

OwOw99000 ^ w ® « _— ιΠ psj — U3 vO ® ® ® ^S'SSSSSfNO'T^SSaOO^^ N - O o IT1 ^ 1 y, , , . .. . .

I (ΝθΟΓ~Γ^<Νθι°*ί~ — — ηί — ηίίηΚ®ηίη!«»!η — ^

L -fM----(NM- CN — — ^^ Τ,, Γι i I I I I I I I

0 i i i I i i i I I .......i i i I i.....

E-H

!l sssk;5;ss s;si;s:s;ss!s;s;;s li3 ÉéåÉÉÉÉÉÉ ÉÉåÉoÉÉÉÉÉÉÉÉÉÉÉÉÉ * * * * * *

K X

x j£ X J x ¥ X

¥^ ϊο £ S ¥=^¥x _l — x_l— XXX -J <=> -J g

o" — ¥o" — — — ¥ X X «Γ OO _| X

X X— O _»—<©©_I O' I Qi — — — — QJ

x gx c — ~ « I--== X XX β < ίο O ^ X

x x — < o— q«oo-)XX-j — i — — x -j _i x _j < i — < - — — g _i — < CI < O g — — Κ~ΙΟ X OlOO<<OOX— O I - I — xo fs) O TO Q .XXXX— Q N I I--_ _l O — o O Q < -J — — _J— *ΟΟΩ:ΧίΕα:<»'",*ΩΩ< % K> · I X © * X — O CD CM X _J X X I CD POU. , I -O « “ . . X® Λ® O 2° * frt • Q£ © -— * λ j — j i η ^ ^03 ¢0 Q ^ X X X ^ CM—*· » ^ ^ .

< X— < m in — o — — . (NO n« . I C < I g g X —X (NOO _l O I -P

I _l O I INIlO - o o s -4- Tm ~ 1N0B o — I O X X _J 3 O +- — — C tø O — — O — O — O— — — LU x ΓΊ +- CN . < O _l _l — O — LU «Ό < * λ , -O < - ΚΛ T\l C — <3 Ο η I U -O · -03 — — O — σ> — +-— ' ® U>

i—I i— — ifflu.x— < — — ·*-σ>— o—mmo® k-o o — muoi®0® — M

® o o — o o < i < < lu L. σι w σι u_ —-___· " * l < l » - > ♦; ~

_ O — · <N ΤΊ — I O I I — < U O) L U m® - N««-<r<OI<®lll P

O Q.<®-*-XoiQ.Oooi£<U<'',U-'nniX — — < £ · Γ L I ‘ · i—1 U1 «I * LJ f 1 i -CD . » L. .£^£XO — XP^^ * -® - ^ O ® m r-(

75 o O in — — < ® Kto æ < O .2 . o ni m O — IIOO w 2„·-ΐι. P

Ai ~ ·» Oln2n- - n2-o .o C. X X — σι a o -oo m (J nj 3 cmo — i_ c. » (m (m -- . <n —. ® — σ> O O σ> u - -® — <n y m — +- r. jj

.3 f k\3<<it 4-T3 m® 4-— mm£ — —u<æ® m σ x < ~ inui x -P

·~2 u-æ£i-iuOjiu.-u ooKr-'-'-ao l ui;'!0 3 — m — - -m — ——'QfN—ajniiuSuu® -m— ni— — >. — luo>-^ m Z σι x σιιη « w σισιστΝ-*- σι·ΡΧ~· »<< ·<η -*-ox tu σιο. ζ “ i Ρ1 zf.

•ο ΐ-οι-σίν. _ lllxiuluo o»m -c ^ m aiiiaouLvx»<L 1) -εθ)£<ι-ηΧ££^σΐ£<σι<».ιηιη ι_< σισσ£^ >.>~< i -c “i

I I- - - I« - - ·β” I Ϊ Lf< »»< - L. L_ L. I I _I _I —I - M

O <® <0 Q Ό lø®® i. < Ο I < I Ό I, L. -Ό < < < O o » · * o

' m immmmf-immSim.i .m . . » m « - »m m · - - « m i—I

— ό — — — — ^ — λ ^c^ λ — m η n —®®»n— ®®® — kl kl m <—<

Kl .Κ1ΚΙΚΙΚΙΙΊΚΙΚΙ .Kl- .-KI · - .C - Kl Kl - - - ; ^ f.

® — k> wwwwwwwm»n w «κι m—mmin „ _ m κι κι κί — +J

4J — Q. — — __ — — — O.Q. — wo.— — O.Q. — “0.0.0. — — ww — w— ^u m ol.ooooOool.uo — u — ou.^ — euui-oo — — — — o rn

, 0-1— Itilllti-t· O. Ot— OQ.I— h * I H l· ►“Q.Q.OOO^Q- W

Ή I I I 'liTT Ιιιιη.ιη.11 ·0-Ι I I 1110.0.0-4-1. >-

IT-J QQQQqqQQQqqqiqiqQQ IQQQQqq i tlTO C

ZL -“--..----..Q -Q ..-0------Q000 - K-1 JU (VNNNNNNNINNNN .<N .(Μ ΓΜ ΓΜ -m fSCMINnifM ... -tN ,—|

Sh ΦΦΦΦφφΟΦΦΟΑΟηΐ φ(Ν φ φ Φ fN ΦΦΦΦφφίΝΓΝ ΟΙ. Μ φ — . — ££££££££££££¢^¢^££¢££££££¢¢¢9-0 <0

οοοΰοοόοοΰοοι!.οι!.οθΡι*-ΡΡ00ΰθα-ιί^υΐυθ O

p-p-p-f-p-p-p-p-p-f-p-p-p-p-p-p-p-p-p-p-f-p-f-p-p-p-p-p-p·?· g.

QOQQqqOQCI 3QCiQQQ©0Q0QOQOqq0qQQQ Q*i CMCMrMfNrMCMCMCMCNcMrMCMrMCNCMCNf^r^CNCNfNCNCNrsir^CNfMf^fNf^ q — — ϋ — rx — — — — — — — — — — — — — — — — — — — c

CQQOqqOQ OOeoeeec<0<jO«3C <3O<Jt0<0H)«3CC

?????????????????????????????? « UOUUgnUUOoguuUUOUOUUOoUouOu^U^ η ιι·ΐιιΐιΐιιιιιιιΐιιιιιΐιιιι·'' h;

X zzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzz M

H — — — — — — — — — — — Jj

C (tJ

I i rn ^^♦«C^miOOO^^OO'inOOOfN^^vCOO' - — opm — cm

Xi Ocd — η-(Ν— c^ — Ov^r-ooD — fMfMOCOCMCMOmm — comoQ^ 1ΝΐΛΝ\£)-ιΛ^^®Λ^^ΓΜ0ίΜ-ί"Ιί'ρ,*0'ΰΛα>ΐΛΡΒ'0" || Ό * o -i-^iOi^i«i=|x|x|r|-i|!£|x|s|2i|g|^|a|s:|s|K|s|?:|s|R|s|p;|«|^|^|Si| 48 o O 7 9 £

W L. V

Taulukko 2 Aminohappoanalyysit 15 (RS-26334): Ser 0,96 (1); Pro 0,96 (1); Ala 0,98 (1); Leu 0,95 (1); Tyr 1,07 (1); Lys 5 0,09 (0); NH3 1,82 (1); Trp 2,12 (2); p-Cl-Phe 1.00 (1); hrtrg(CH2CF3 )2 0,89 (1); Nal(2 ) 1,09 (1).

21 (RS-26126): Ser 1,01 (1); Pro 0,99 (1); Ala 0,98 i n — (1); Leu 0,95 (1); Lys 0,20 (1); NH3 1,27 (1); Arg 1,08 (1); Pal(3) 2,10 (2); p-Cl-Phe 1,11 (1); hArg(CH2CF3) 0,79 (1); Nal(2) 1,02 (1).

15 2_2 (RS-26906): Ser 1,03 (1); Pro 0,97 (1); Ala 0,98 (1); Leu 0,90 (1); NH3 2,25 (1); Trp 2.30 (2); Arg 1,12 (1); p-Cl-Phe 1,03 (1); hArg(CH2CF3)2 0,99 (1);

Nal(2) 1,12 (1).

20 r 31 (RS-64736): Ser 0,84 (1); Pro 0,89 (1); Ala 0,99 (1); Leu 1,01 (1); Lys 1,05 (1); ΝΗ? 0,91 (1); hArg(Et2) 1,04 (1); Pal(3) ; 25 2,42 (2); p-F-Phe 1,21 (1); Nal(2) 1,13 (1).

32 (RS-64802): Ser 0,92 (1); Pro 0,95 (1); Ala 1,01 (1); Leu 0,99 (1); Lys 1,01 (1); NH3 30 0,96 (1); hArg(Et2) 1,02 (1); Pal(3) 2.30 (2); p-F-Phe 1,15 (1); Nal(2) 0,96 (1).

39 (RS-12972): Ser 0,76 (1); Pro 1,06 (1); Ala 0,89 (1); Leu 1,04 (1) ; Tyr 1,07 (1); 35 p-Cl-Phe 1,17 (1); NH3 1,03 (1);

Pal(3 ) 2,10 (2); hArg(C2H5> . : CH2CF3) 1,66 (1); Nal(2) 1,14 (1).

II

, .'· "7 S

49 yοζο

Yhdisteiden bioloqinen aktiivisuus (a) Testosteronitasojen aleneminen Testosteronitasojen aleneminen mitattiin seuraavaa testausmenettelya kayttaen: 5 Suoritettiin kaksi tutkimusta kayttaen toisessa 11 ja toisessa 13 taysikasvuista, urospuolista, intaktia be-aglekoiraa (iåltSSn 1,5-6,5 vuotta, toimittaja Syntex, LRE, Ridglan tai White Eagle). Kullakin viikolla 6 viikon ajan elaimet jaettiin sattumanvaraisesti johonkin 11 tai 10 13 annosryhmasta (apuainetta tai erilaisia annoksia ku- takin LHRH:n antagonistia) niin, etta kuhunkin ryhmaan tuli 6 koiraa. Ryhmaan 1 kuuluneet saivat yhtena ihon-alaisena ruiskeena 0,1 ml apuainetta ruumiinpaino-kg:a kohden. Muihin ryhmiin kuuluneet elaimet saivat jaljem-15 påna esitetyssa luettelossa 1 esitetyt annokset (^ug yh-distetta/0,1 ml:n ruisketilavuus/ruumiinpaino-kg). Apu-aineena oli propyleeniglykolin ja fysiologisen suolaliu-oksen seos suhteessa 1:1. Kultakin koiralta otettiin påan valtimon kautta juuri ennen ruiskeen antamista ja 30 mi-20 nuuttia sekS 1, 2, 4, 6, 8 ja 24 tuntia ruiskeen annon jSl-keen noin 3 ml:n hepariinipitoinen verinåyte. Verinaytteen sijoitettiin valittfimSsti ottamisen jålkeen jaihin. Plasma erotettiin sentrifugoimalla ja imusuodattamalla 2 tun-. nin kuluessa ja sailytettiin -20°C:ssa ennen testoste- 25 ronitasojen RIA-mååritysta.

Testosteronitasot mitattiin radioimmunologisella maarityksella. Naiden kahden tukimuksen tulokset yhdis-tettiin, ja piirrettiin testosteronitasoja annostasojen funktiona kuvaava kayra ID^Q-arvojen (annos, joka vaadi-‘30 taan testosteronitason alentamiseksi 50 %:iin maksimiar- vostaan 8 tunnin aikana) saamiseksi. Nama arvot on esi-tetty taulukossa 3, jossa on esitetty myos teho suhteessa LHRH:n standardiantagonistiin Detirelix (RS-68439).

50 'J'/ 3 /! ^

Luettelo 1 Annosryhmåt

Tutkimus 1 (11 annosryhmåa):

Ryhmå Yhdiste (RS-nro) Annos 1 Valiaine 2 RS-26306 0,06yg/0,lml/kg 3 RS-26306 0,25yg/0,lml/kg 4 RS-26306 1,0yg/0, l.nl/kg 5 RS-26306 4 10yg/0,lul/kg 6 RS-26306 16,0y3/0,lml/kg 7 RS-26723 0f06yg/0,lml/kg 8 RS-26723 0;25yQ/0,lml/kg 9 RS-26723 1f0yg/0,lml/kg 10 RS-26723 4,Oyg/QfIml/kg 11 RS-26723 16;Oyg/ύ,lml/kg

Tutkimus 2 (13 annosryhmaa)

Ryhma Yhdiste (RS-nro) Annos 1 valiaine 2 RS-68439 (standard!) 0,25 ug/0,lml/kg 3 RS-68439 (standard!) 1,0 ug/0 imi/kg 4 RS-68439 (standard!) 4,0 ug/0,lml/kg : 5 RS-68439 (standard!) 16,0 ug/0,lml/kg 6 RS-15378 0,25 ug/0,lml/kg 7 RS-15378 1,0 ug/0,lmi/kg 8 RS-15378 4,Q yg/0 lml/kg 9 RS-15378 16,0 ug/0,lml/kg 10 RS-15678 °»2S pg/O.lml/kg .1' 11 RS-15678 1,0 Ug/0 lml/kg 12 RS-15678 4,0 ug/0,lml/kg 13 RS-15i78 ug/ojlml/kg 92326 51 C Λ α> ^ c 00 5 ι ^ ^ ^ '2 Ο Ο <3* CNJ CO C0 Ε ·*· ·> *» ·*» ** Ο) Ο <-Η Ο —I ΙΑ Γ- C -Η ·*— ν— —^ ^ -— m -Ρ

Jl ·η σι er. οι σι σ· c 5J -9 .X.*.*-*: χ. a <0_·Γ-| \ \ S. \ \ .JH.

c “ I ss ss s s •?l| m - r^m σ. ^ K\ i: UM-rH^ rsi (Λ _i o (—) ΠΙΟ -H CO _ (C O O Æ 00 4J ^ oS 2 ro

•η tn -P Pj ϋ 4J

C o m tn S

O u 0) o X S

i_i o m +J o JS

Q) w LA 5

p J-> C S 9 -H

0) tu 0) H H E

0 tn to m Ρ Μ X ^ ^ Λ i2 tn o 3 co iA a-' -.—- g <D E -P i tn * · —< £ -P -H 3 -Η I V w w ^ 1 +j ·η C q 3 di -c -d

_ <P ® C O \ r -c -C -C a O

O^^OCiiVD m « PH si > qStnrH® Ό ® Λ « •h 3 tn o) > -p -h .* ro a

tn r-t fH Q

C 2a!Sfl5p g

iB^US-S S

3 ^ 4J Λ 8 ^ 2 'O Ό Ό VO c 5 *H —( —i g in i i i i i Ti

•H Ifl I +J -H

>CtnQ)‘£' vo miA vo *d H 8 S ϋ J2 1 ° °1 “ 5 i! .5 L 8 ° ° ° ° o ;§ y u-hc5^

m ae 5 $ 3 J? S

3 § § M 3 Cn VO “ Ό "" xw 0) -Ρ O ·Ρ -P 3 « «* .. J3 " J S5 5J> «· "L "L -L ϊ t ; J5 S T C — 3 o" <" ' C X ^H -H i—i i—t e n P ή o; ro _ ro ro ro ro O £ ro T CL X Q- q_~h<t} 3* Q_ —I i or i i ci jj ro -7 ' · '—> Q X Q qi-h

4-* * t-J Q «_!_·> ·* Q TJ

C! ^ “ t· «OfM i—t CN Cvl ·. nj ro S N,. 5 N <υ o <υ X qj co {§ 10 n, ^5 JJ C turo jz cr n ^ >

. 5J mi-, x rj CL ro CL X Q. N

3 S Q- «i i^h i _ι I 4J ro ” 3 1 q (-C1 ri J. ^ et -} -HU 12 § jg 3 ^Sro * Ω ‘d σ .1 I d«* Ϊη" is :· ^_CN*'H"^cv»^“ef ή * -f n

*1 (0 mT^a JJ Q Λ _! C

' ·” s 3«* 3 S SS S«r- s«- S

2 -5 S 2* "ro ^~Cvi ^ II

O Ih zhh Zd ZdZ4-> z*j Λί O ω OVIUKV I X CO i r O lu VO I U o

3+JS fAQwtNQ ΙΓ"0|Γ-ο!ϋ OQw IO

rt [ή H <r ID>r7t_J\0|_jKV I CT ΓΑ I r-T) O

COOLiVOtj.iAtj.moM VO Λ U «Η VOddCvidlA H H c[ 5 CM <5 <5 3^i i ix i ισ»ι ισ>ι ιχ i i r- il roxw COZIOOZIhCOZU^ZI unzi EHXCi X^QX^dCC«—'dX1—>_J X< |Q * 92326 52 (b) Histamiinin vapautusvaikutus ja ovulaation vastainen vaikutus

Seuraavia menettelytapoja kåyttåen vertailtiin tyy-pillisten tåmån keksinnon mukaisten yhdisteiden histamii-5 ninvapautusvaikutusta ja ovulaation vastaista vaikutusta.

1. Histamiinin vapautustutkimus

Kolmesta tai neljåstå urospuolisesta Sprague-Dawley-rotasta (350 g, Iffa-Credo, Ransa) eristettiin sekalaisia peritoneaalisia soluja antaen niille intraperitoneaalisena 10 ruiskeena 10 ml 0,9 %:sta NaCl:a (joka sisålsi 50^ug hepa-riinia/ml). Sen jålkeen kun vatsaonteloa on hierottu ke-vyesti 1 minuutin ajan, peritoneaaliset solut eristettiin ja yhdistettiin, ja niitå sentrifugoitiin 5 minuuttia no-peudella 1500 min Kolmesti Ca++-vapaalla Krebs-Ringer-15 puskurilla (KRB), jonka koostumus oli seuraava: 141,9 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgS04, 2,5 mM Na2HP04, 0,6 raM KH2P04; huuhtelemisen jålkeen solut laskettiin mikroskoo-pin alla ja laimennettiin sopivalla tilavuusmåårållå Ca -vapa-ata KBR: tå niin, ettå saavutettiin solutiheydek-20 si noin 2 x 10® solua/ml. 0,3 ml:n eriå esilåmmitettiin 0,3 ml:n kanssa Ca++-vapaata KRB:tå 5 minuuttia 35°C:ssa, ja lisåttiin 0,1 ml asianmukaista testattavaa lååkeliuos-ta. 5 minuutin kuluttua kåynnistettiin reaktio lisååmållå 0,1 ml Ca -pitoista KRB:tå halutun pitoisuuden saavuttami-. 25 seksi. 15 minuutin kuluttua reaktio pysåytettiin lisååmållå 2,5 ml jååkylmåå Ca++-vapaata KRB:tå ja asettamalla suspensio jåihin. Solususpension sentrifugoinnin jålkeen mååritettiin supernatantin histamiinipitoisuus fluori-metrisesti menetelmållå, jonka ovat esittåneet Shore et al. 30 /Immunol. 127 (1959) 182-1867» jåttåen pois uuttoprosessi (eksitaatio aallonpituudella 365 nm, emissio aallonpituu-della 450 nm). Yksikåån reagensseista ei fluoresoinut 0-ftaalidialdehydin kanssa kokeissa kåytettyinå pitoisuuk-sina.

35 Solususpension kokonaishistamiinipitoisuus mååri- 53 9 2 3 2 6 tettiin ultraåånikåsittelyn (2 min, pulssitaajuus 5/s) jålkeen.

Kaikista mitatuista arvoista vahennettiin spontaani histamiinin vapautuminen.

5 - Laskut

Prosentuaalinen histamiinin vapautuminen lasket-tiin seuraavan yhtalSn avulla:

Histamiinia soluista vapaassa supernatantissa -spontaani vapautuminen 10 - x 100

Kokonaishistamiinimåarå solususpensiossa - Reagenssit ja laitteet: O-ftaalidialdehydi hankittiin Flukalta (nro 79760) . 15 Kaikki muut yhdisteet olivat analyysilaatua ja liuotet-tiin Ca++-vapaaseen KRB:hen. KSytetty fluorimetri oli Perkin Elmer 2000 -malli. UltraSSnikåsittely tehtiin VIBRA-CELL-laitteella (Sonics Materials) mikrokarkia kayttaen.

20 2. Ovulaation vastaisuuden tutkiminen

Menettely: Naarasrottia sopeutetaan laboratorio-olosuhteisiin (valon ja pimean suhde 14:10, valot paalla klor 5 aamulla) vShintSan 7-10 vuorokautta. Kullekin ro-talle tehdSan pSivittåinen ematinhuuhtelu klo 7,30 - 9,00 25 ainakin 12 vuorokauden ajan. Émåtinhuuhtelunesteen sytolo-gia tutkitaan mikroskooppisesti estrussyklin vaiheen maå-rittåmiseksi. Rotat, joilla on ollut ainakin 2 normaalia nelipaivSistM syklia ennen parhaillaan olevaa syklia, valitaan. Odotetun estruspaivan aamuna rotat tapetaan, 30 munanjohtimet poistetaan, ja niistS tutkitaan vastairron-neiden munasolujen esiintyminen. Munasolut "houkutellaan" ulos munanjohtimesta ja lasketaan. Niiden naaraiden, joilla esiintyy ovulaatiota, prosentuaalinen m&årå esitetaSn graafisesti annoksen logaritmin funktiona ED^^-arvon 35 laskemiseksi ovulaation vastaiselle vaikutukselle.

Histamiinin vapautusvaikutus ja ovulaation vastai-nen vaikutus on esitetty seuraavassa taulukossa 4.

54 92326 C tn ^—- 0 3 O' •Η 3 d ® ® ® S! y 3 (ΟιγΪγ-'ΟΟ^νΟΟιΛ ΟιΓ.Γ^σ'Ο'ιΟ V irt |M ·*> ^ *, 4' * ^ 1 ·.

(flto O o — o — — 0<N(V1000 00 i—I -P O O O — — til - 3 i/ι in j s 01 3 c i TI "d ^ CN κι ιβ ® ® t n C (θ' o o - - - « « 3 o- O* ° * - s 1 ti ^ +l + l + l + l + l + l 1ΛΟ— tt ® C 4Jmo od — m <e r» ° °i_ ^ ® c-·^ ® 0_ \o_ ^ 5 W gj in "l T. ov »6 m ί o ιτ m o æ O o o" ιίΓ - £ o — *H -HfpQ Oo cs in ® (N — — 10 -P S > W — (0

rO

i—i x 5 ϊ i

> X X _l X X

0 ¥ ¥o i τ 5 si _ -J p — T £ J° JH, o" o' — — ¥ X X o' c ° S"c -» T2 d $ = Ϊ -c <

,-. T — — O «JO P X X P — I

5 xp< <* —- — α p — < o O o; — i _ x i ® < o © x — O i · r- To αΧχχο (ni — — p o — o oo ·0ίΧοί»-«-*ό^ζθ—— β « κ> <D x o CO ϊ ι χ ® kn . i — o «— OD ^ I) ΧχΟ — *_J — _J—»L/l© O < “ — < X cn

χ X — <—O — <NO ~ * i q < i o; —X

CO X _J C I (NO — © +· <N C<j0 O — I O X 3 0 r-t -J — — Q -V — C “ UJ I f <N * < Q » J CD w < — O <· K*\ «3 — CwOUJ I ·® — W O) •P O— I GO IL.—*< — 0)ww ΙΛ NQ® KO o L.

r-j -·βθΛϋ<ι<ί®σιΐΐ(Λ ι<

x o — « o* r* I O i < ^ t o OflD «-* <N O < «C

(0 — < © -t-xo_. q2<< IN U n ni - j; Q. < I · UJ o *®_“· •c2xo~xo< .o x4 I Q iTv w —- æ ΚΌ0 vO · · O (N fNo « I © K\ (0 o.. » 819-- - -i® ® ~·χχ^σ>ο — ~

S «®__ — l. L. (M <M — CN ~ — 01(3 o Cj)p * — <N

- \ΟΙ^>3<<·*-Χ3·*-— fNU''wl_<®=X

- ~3,ffl22iuueu3<-< pioi<£~aO

r; CNNW *«^^w^C0uj£Ll£ *'Jw« p + x σι® ® οι σ> σι coi “ — »<< .® « o οι p ωοι.σιι.ι-ι.ΐ-ΐ.Ο' σι® j: £ ® σι tu ι_ l.

C x-<l>><<<<i.loi · «aL-<< , eorKhirirKiL ® ® i_ < σι 2 -c

p l-i_ « . I « *| £r<01D< »l-ι I

•fH <<®®qi0®®qI|®1-l.«®<OO

en\ ΐ £ * · · * * · % O q · < ^ Ό » £ « * w i i in in m «i in in in . «κι . « . «η .κι κι (Ti -p ΙΟ®®-«®-« — μ rn » · κνκνκν®κνκνκν — -.Kl . · rt. ΚΝ . ®® 01 -H a. q. _ _ — — ___ww — Q.O.W — a. — — i rr-i Ρι.σοβθοβο — _«ji_l — 5*-σ*> p iti »71-Q-Q.a.ti-Q.tLQ.eoa-i-i- c q. i- o. cl -d .d Α,'ι,Α,,|ίΐ-ο-ΑΑ,ο-ΧΑ,Α S_i a0000®Q00* i O O q i Ω Q q o

C (N. <N IN N Λ N N N « » . CN CN ON .CN CN CN CN

rt) ΦΦΦΦΦΦΦΦΦ CN CN φφφΓΝ φφφφ p Sefrr-seiFjF-si1

Cn iii 1 iiiiil·11·!!*1!!!! * 03 OoOOOPOOO li- ιί. 00(3ι[θϋϋϋ ^ p Λ ? ? P- p-f p- p- p-f p- f1?· i" P· P- ? •o·-! 00000“000“000000000 drO . . ......

<ϋ 4J rt. Λ ,."3. -. rt. rt."A. -. rt. — rt. rt. «."A rt. rt."A

I P N(NNCNCNN|N(N(NN(NIN(N(NINNCN(nIN

ac o rrrrr-rrr-r--rr--r- CL· > ^«50<300ooO«J«jCJ«3c«3®®C<3

^ OugugUuguOoOUuuUUgU

•Hj3 <<<<<<<·<<<<<<<·<<<<< ij<n Α''|'Α'|,Α|ΑΑ'ιΑΑ·Α w +J ΖΖΖΖΖΖΪΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖ •

• I

’ 0 rr p c 0 I σ'-»Ν·οοσ'®οο®σ;ο®®ΐΝΓ.®'τ — — i/ rn ®oo — γ.ον!Τ· — oio®cNmooocNn>i2— ® TT Xi 2®r»® — η η ® n cn cn - <5 — ®T;®Oi® Λ Pi ® — ®® — ®>0®® — ®®®ffllO®^^^ Z3 ®m — — io~cnvcn®cncncn^cncn®io®

i-I

I % cN|®|^|r.|Di|^|®|z|^|®|o|-|<N|®|,|®|®|S|o| H w 55 9 2 3 2 6

Yhdisteiden akuutti myrkyllisyys

Keksinnon mukaisten yhdisteiden akuuttia myrkylli-syyttå arvioitiin antamalla niita rotille laskimonsisai-sena ruiskeena. 3 urosrotan ryhmat saivat yhden ruiskeen 5 valiainetta tai laaketta (RS-15378 tai RS-26306) annok-sen ollessa 1,0 mg/kg. Kaksi muuta rottaryhmaa sai joko 0,3 mg tai 1,0 mg standardiyhdistetta (RS-68439)/kg.

(Kaikki yhdisteet on nimetty aikaisemmissa esimerkeissa).

Ruiskeet annettiin hantålaskimoon 15-20 sekunnin 10 vålein. Elåimiå tarkkailtiin myrkyllisyyden kliinisten merkkien havaitsemiseksi valittdmasti antamisen jalkeen ja 0,5, 1,0, 3,0 ja 6,0 tunnin kuluttua ruiskeen antami-sesta.

Tulokset on esitetty taulukossa 5.

j » 56 9/326 3 (1) :3 Λ! -Η •Η »—( 3 (L) > Τ3 C Φ - (1)

•Η C S

cn ή φ o ε -u oo 3 3 3 ^ (O -n >i :3 CO -P τι

>i <D

-C X

W >,

3 -P P

-PC Φ O :3 ε > :3 P in ro

3 -H -H

-P <H > (0 (0

tO -P -P

' ' M -P -P

C tn 3 -Η Φ Φ •h >, > tn -p -p -p σ'-p a in in •H p -H C 3 3 (0 Λί 3 σ' -Η Η > > Ρ -Ρ 3 > ηΗ Φ Φ φ >ι Ο ·Η -Η S J .c κλ; w ω

•Η r-I

ο — λ: σ' >ι Μ r-l \ σ> σ' -η ε c —' m ο ο ο φ - ^ ^ Φ ιη ο ι—ι *—ι ι—ι ι—i Ο >ι c a 5 0 a 3 φ c <#> _ ο Φ m ιη -Ρ * α . 0) >—I Ρ _Η —1 ·· : ·η 'Τ' Hr ^ ^ φ J Ό w ο νο X <Ν τ <Ν ·> 3 Ο * *τ5 *<ν“£ 5 - ^ο“ 5 * 5 Ja u_- 9 ζ Η α; ο 9 9 'oiS ο ί ^ 2 oamw-wo =3 3 Ρ σι Λ Λ 2* « 00 1 _L ^ Η Π3 «> I W CT UJ r-t > r-i 3 Μ ecoccrH Γ- artiraH OOHrth^a 3 to QO z T ι 1 m 4 ι <ac I ιο ' 9“ 9 9 =r ^

EnOiiD ^300 r-i SooaQ(N5.QQQ3Q * k · 57 9 :> 3 2 6

Fysiologiset formulat

Seuraavat ovat tyypillisiS fysiologisia koostumuk-sia, jotka sisaitavat vaikuttavana aineosana jotakin ta-mSn keksinnOn mukaista LHRH:n antagonistia, esimerkiksi 5 (N-Ac-D-Nal(2)1, D-pCl-Phe2, Pal(3)3'6, Bth8, D-Ala10)- LHRH:ta sellaisenaan tai fysiologisesti hyvåksyttavana suolanaan, esimerkiksi etikkahappoadditiosuolana, sinkki-suolana, sinkkitannaattisuola tms.

A. Tablettiformulat 10 1. LHRH:n antagonistia 10,0 mg

Puristettavissa olevaa sokeria, USP 86,0 mg

Kalsiumstearaattia 4,0 mg 2. LHRHrn antagonistia 10,0 mg

Puristettavissa olevaa sokeria, USP 88,5 mg 15 Magnesiumstearaattia 1,5 mg 3. LHRHrn antagonistia 5,0 mg

Mannitolia, USP 83,5 mg

Magnesiumstearaattia, USP 1,5 mg

Esigelatinoitua tarkkelysta, USP 10,0 mg 20 4. LHRHrn antagonistia 10,0 mg

Laktoosia, USP 74,5 mg

Esigelatinoitua tårkkelysta, USP 15,0 mg

Magnesiumstearaattia, USP 1,5 mg 25 Valmistusmenetelma (a) LHRHrn antagonist! liuotetaan riittflv&an maa-raan vetta, jotta muodostuu marka granulaatti, kun siihen sekoitetaan sokeriosuus tayteaineista. Taydellisen se-koittumisen jalkeen granulaatti kuivataan lautasella tai 30 leijukerroskuivurissa. Kuiva granulaatti seulotaan mah-dollisten suurten aggregaattien hajottamiseksi, ja sen jalkeen siihen sekoitetaan jaijelia olevat aineosat. Granulaatti puristetaan sitten tavanomaisella tabletointiko-neella maaratyn massan omaaviksi tableteiksi.

35 (b) Tassa valmistusmenetelmasså kaikki formulat sisaltavat 0,01 % sisaitavat 0,01 % gelatiinia (USP). Ge- 58 92376 latiini liuotetaan ensin granulointiliuottimena toimivaan veteen ja sen jaikeen liuotetaan LHRH-analogi. Loput vai-heet on samanlalsla kuln edelia kohdassa (a).

Formulaa 4 voitaisiin kayttaa mytts suun kautta an- 5 nettavana tablettina.

B. Pitkåvaikutteinen lihaksensiséisesti injek- toitava formula 1. Pitkavaikutteinen llhaksensisMinen ruiske-sesamdljygeeli 10 LHR:n antagonistla 10,0 mg

Alumiinimonostearaattia, USP 20,0 mg

SeesamiOljya gs ad 1,0 ml:ksi

Alumiinimonostearaatti ja seesamiOljy yhdistetaan ja yhdistelmaa kuumennetaan 125°C:ssa samalla sekoittaen, 15 kunnes muodostuu kirkas keltainen liuos. Sen j&lkeen tSma seos autoklavoidaan steriloinnin suorittamiseksi ja sen annetaan jaahtya. Sitten lisataan LHRH-analogi aseptises-ti samalla trituroiden. Erityisen edullisia LHRH-analoge-ja ovat heikosti liukenevat suolat, esimerkiksi sinkki-20 suolat, sinkkitannaattisuolat, pamoaattisuolat ja vastaa-vat. Niilia on poikkeuksellisen pitka vaikutuksen kesto.

2. Pitkavaikutteinen lihaksensisainen ruiske -biologisesti hajoavasta polymeerista valmiste-tut mikrokapselit . 25 LHRH:n antagonistia 7 % 25/75 glykosidi/aktidikopolymeeria 93 % (ominaisviskositeetti 0,5)

Edelia olevan formulan mukaiset mikrokapselit sus-pendoidaan seuraavaan liuokseen: 30 Dekstroosia 5,0 % ; Natrium-CMC:ta 0,5 %

Bentsyylialkoholia 0,9 %

Tween 80:a 0,1 %

Puhdistettua vetta gs 100,0 %:ksi 35 25 mg mikrokapseleita suspendoitiin 1,0 ml:aan vaiiainet- ta.

92326 59 C. Lihaksensisaisesti ruiskutettava vesiliuos LHRHrn antagonistia 0,5 %

Etikkahappoa 0,02 mol/1

Bentsyylialkanolia 0,9 % 5 Mannitolia 3,5 %

Propyleeniglykolia 20 %

NaOH:a pH:n saatamiseksi arvoon 5

Vetta gs 100 %:ksi

Etikkahappo, bentsyylialkoholl, mannitoll ja pro-10 pyleeniglykoli liuotettiin 90 %:iin vesimaarasta. Tahan liuokseen liuotettiin sitten LHRH:n antagonist!, ja pH saadettiin NaOHtlla. Lisattiin puuttuva vesimaara. Liuos suodatettiin 1 pm:n suodattimen lapi, pakattiin pieniin laakepulloihin ja steriloitiin autoklaavikasittelylia.

15 D. Nenaan annettava vesiformula LHRH:n antagonistia 50 mg 0,02M asetaattipuskuria 5 ml

Natriumglykokolaattia 500 mg 0,02M asetaattipuskuria, pH 5,2 10 ml:ksi 20 E. Rektaalisesti annettava formula

Perapuikko: LHRH:n antagonistia 5,0 mg

Witepsol H15:ta 20,0 g LHRH:n antagonisti yhdistettiin sulaan Witepsol .25 H15:een, ne sekoitettiin hyvin ja seos kaadettiin 2 g:n muotteihin.

·

Claims (10)

60 92326

1. LHRH:n nonapeptidi-tai dekapeptidianalogi, jol-la on kaava (I), 5 A-B-C-Ser-D-E-F-G-Pro-J (I) 123 4 5678 9 10 tai sen fysiologisesti hyvaksyttava suola, t u η n e t -10 t u siita, etta A on jokin aminoasyyliryhmista N-Ac-3- (1-naftyyli)-D,L-alanyyli ja N-Ac-3-(2-naftyyli)-D,L-ala-nyyli, niiden D- tai L-isomeeri; B on jokin aminoasyyliryhmista D-fenyylialanyyli, D-p-kloorifenyylialanyyli, D-p-fluorifenyylialanyyli ja D-a-15 metyyli-p-kloorifenyylialanyyli; C on jokin aminoasyyliryhmista D-tryptofanyyli ja 3-(3-pyridyyli)-D-alanyyli; D on jokin aminoasyyliryhmista L-fenyylialanyyli, L-tyro-syyli, 3-(3-pyridyyli)-alanyyli ja arginyyli, tai amino-20 asyyliryhma, jolla on rakennekaava -HN-CH-CO- <™2’n UI) NH 1 1 2

25 R -HN-C=NR jossa n on 1 - 5; R1 on alkyyli, joka sisaitaa 1-6 hii-liatomia, tai fluorialkyyli; ja R2 on vety tai R1; E on 3-(3-pyridyyli)-D-alanyyli, D-tyrosyyli, D-trypto£a-30 nyyli tai aminoasyyliryhma, jolla on rakennekaava -HN-CH-CO- (CB2)n (ID NH 1 1 2

35 R -HN-C=NR 61 C o 7 O ^ ^ o jossa n on 1 - 5; R1 on alkyyli, joka sisåltåå 1-6 hii-liatomia, ja R2 on vety tai R1; tal R1-HN-C=NR2 on

2. A on N-Ac-D-Nal(2); B on D-pCl-Phe; C on D-Trp tai D-Pal(3); D on Tyr, Arg, Deh, Mbh tai Bth; F on Leu; ja 30 J on D-AlaNH2.

• 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdiste, tun nettu siita, etta se on N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Pro-D-AlaNH2 tai sen fysiologisesti hyvaksyttava suola.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdiste tai sen fysiologisesti hyvåksyttavS suola, tunnettu siita, etta

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdiste, tun nettu siita, etta se on N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D- 62 9 'i 3 'ί 6 Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2 tai sen fysiologisesti hyvaksyttava suola.

5 Pal(3)-Ser-Mbh-D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2 tai sen fy siologisesti hyvaksyttava suola.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdiste, tun-n e t t u siita, etta se on N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-

5 HN N \ / H jossa m on 1 - 4; 10. on jokin aminoasyyliryhmista L-leusyyli ja L-fenyyli-alanyyli; G on aminoasyyliryhma, jolla on rakennekaava -HN-CH-CO- 15 <CH2)n (II) NH 1 * 2 R -HN-C=NR jossa n on 1 - 5; R1 on alkyyli, joka sisaitaa 1-6 hii-20 liatomia, tai fluorialkyyli; ja R2 on vety tai R1; ja J on D-alaninamidi tai glysinamidi.

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdiste, tun-n e t t u siita, etta se on N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2 tai sen 10 fysiologisesti hyvåksyttavå suola.

7. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdiste, tun-n e t t u siita, etta se on N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2 tai sen fysiologisesti hyvaksyttava suola.

8. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdiste, tun- n e t t u siita, etta se on N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Bth-D-Tyr-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2 tai sen fysiologisesti hyvaksyttava suola.

9. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdiste, t u n - 20. e t t u siita, etta se on N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D- Pal(3)-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2 tai sen fysiologisesti hyvaksyttava suola.

10. Koostumus, tunnettu siita, etta se si-saitaa jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukaista yhdis- 25 tetta sekoitettuna ainakin yhteen fysiologisesti hyvak-syttavaan tayteaineeseen. 63 92326