FI92211B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten nonapeptidi- ja dekapeptidianalogien valmistamiseksi, jotka ovat LHRH:n antagonisteja - Google Patents

Description

9221 1

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten nonapeptidi- ja dekapeptidianalogien valmistamiseksi, jotka ovat LHRH:n antagonisteja 5 Jakamalla erotettu hakemuksesta 880509.

Lutenisoivaa hormonia (LH) ja follikkelia stimuloivaa hormonia (FSH) vapautuu aivolisäkkeen etulohkosta hypotalamuksen alueella tuotettavan luteinisoivaa hormonia va-10 pauttavan hormonin (LHRH, LH/FSH-RH, GrRH) säätelyn alaisena. LH ja FSH vaikuttavat gonadeihin kiihdyttäen steroidihormonien synteesiä ja gamaattien kypsymistä. LHRH:n sy-käyksittäinen vapautuminen ja siten LH:n ja FSH:n vapautuminen säätelevät lisääntymissykliä kotieläimillä ja ihmi-15 sillä.

LHRH vaikuttaa myös istukkaan ja sitä kautta epäsuorasti gonadeihin aikaansaamalla koriogonadotropiinin (OG) synteesin ja vapautumisen.

LHRH:n antagonistit ovat käyttökelpoisia hedelmäl-20 lisyyden säätelyssä. Sellaiset antagonistit estävät ovulaa tiota naarailla ja spermatogeenisiä uroksilla. Näihin vaikutuksiin liittyy läheisesti gonadiperäisten steroidisten sukupuolihormonien tason aleneminen verenkierrossa esiintyvästä normaalitasosta, mikä aiheuttaa aksessoristen elinten 25 massan pienentymistä uroksilla ja naarailla. Kotieläimillä tämä vaikutus ehkäisee sukupuolista kiertoa ja käyttäytymistä (edistäen painon lisääntymistä laiduntamisvaiheessa), aiheuttaa keskenmenoja tiineillä eläimillä ja saa yleensä aikaan kemiallisen sterilisaation.

30 Luonnollinen vapauttava hormoni LHRH on dekapepti- di, joka koostuu luonnossa esiintyvistä aminohapoista, (joilla glysiiniä, joka on asymmetriakeskukseton aminohappo, lukuunottamatta on L-konfiguraatio). Sen aminohappojärjestys on seuraava: 35 (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH^ : 123456789 10 92211 2 Tämän luonnollisen aineen kanssa analogiset yhdisteet esitetään usein lyhennetyssä muodossa osoittamalla jonkin tietyn aminohapon, jonka asema osoitetaan yläindek-sillä, korvaajan luonne, mitä seuraa "LHRH". Monia LHRH:n 5 analogeja on tutkittu, ja hyvin suurella enemmistöllä niistä on riittämätön biologinen aktiivisuus, jotta ne olisivat kliinisesti käyttökelpoisia. Eräillä tietyillä muunnoksilla on kuitenkin agonistista biologista aktiivisuutta tehostava vaikutus. Huomattava agonistisen ak-10 tiivisuuden lisääntyminen saavutetaan vaihtamalla Gly:n tilalle 6-asemassa sijaitsevaksi happotähteeksi D-ami-nohappotähde.

Agonistien lisäksi on valmistettu analogeja, jotka ovat LHRH:n kompetitiivisia antagonisteja ja jotka 15 kaikki edellyttävät 2-asemassa sijaitsevan histidyyli-ryhmän poistamista tai korvaamista /W. Vale et ai., Science 176 (1972) 933/. Yleisesti ottaen vaikuttaa siltä, että D-aminohappotähde tuottaa kyseiseen asemaan ketjussa sijoitettuna tulokseksi parhaan aktiivisuuden 20 /R.W.A. Rees et ai., J.Med.Chem. 17 (1974) 1016/.

Sen lisäksi lisämuunnos 6-asemassa (joka ilman 2-aseman muuntamista johtaa edellä mainittuun agonisti-seen aktiivisuuteen) lisää 2-muunnettujen analogien antagonistista aktiivisuutta (JZ. W. Beattie et ai., J. Med. 25 Chem. 18 (1975) 1247; J. Rivier et ai., Peptides 1976, Editions de 1'Universite de Bruxeller, Belgia, 1976, s 4277.

Näiden kahden päämuunnoksen, jotka johtavat tehokkaampiin LHRH:n antagonisteihin, pohjalta antagonis-30 tista aktiivisuutta on voitu lisätä edelleen muuntamalla jo 2,6-muunnetun peptidin 1-, 3-, 5- ja/tai 10-asemaa /D. H. Coy et ai., Peptides 1976, Editions de 1'Univer-site de Bruxelles, Belgia, 1976, s 462; J. E. Rivier et ai., Life Sei. 23 (1978) 869; A. S. Dutta et ai., 35 Biochem. Biophys. Res. Commun. 85 (1979) 7097· 0n myös 92211 3 osoitettu, että 1-asemassa sijaitsevan aminohappotähteen N-asyloinnista on etua /K. Channabasavaia et ai., Bio-chem. Biophys. Res. Commun. 81 (1978) 382; D. H. Coy et ai., Peptides - Structure and Biological Function, Pier-5 ce Chemical Co., 1979, s 775/. Lisäksi on julkaistu artikkeli /5.H. Coy, Endocrinology 110 (1982) 14457, joka käsittelee erittäin tehokasta antagonistia, joka sisältää D-Arg®-substituution, (N-Ac-D-pCl-Phe1, D-pCl-Phe2, D-Trp3, D-Arg6, D-Ala10)LHRH.

10 Ikävä kyllä, vaikka D-Arg6-substituution sisältävä ryhmä LHRH:n analogeja on havaittu tehokkaiksi ovulaatiota estäviksi aineiksi, ne olivat my&s voimakkaita syöttösoluja degranuloivia aineita /Schmidt et ai.,

Contraception 29 (1984) 2837 ja aiheuttivat ödeemaa in 1 2 15 vivo. Niinpä esimerkiksi (N-Ac-D-Nal(2) , D-pCl-Phe , O £ D-Trp , D-Arg )LHRH:n ED5q on 0,2 yUg/ml, mitä tulee histamiinin vapauttamiseen rotan syöttösoluista in vitro.

Tämä sivureaktio on kliinisesti tärkeä seuraavan anafy-laktistyyppisen reaktion mahdollisen hengenvaarallisen 20 luonteen vuoksi.

On alalla tunnettua, että positiivisen varauksen/-positiivisia varauksia, erityisesti useita positiivisia varauksia, joihin yhdistyy hydrofobisuus, sisältävät molekyylit ovat voimakkaita syöttösolujen degranuloijia 25 /Foreman ja Jordan, Agents and Action 13 (1983) 1057· Ensimmäinen yritys kiertää tämä ongelma kaksi Arg-täh-dettä (asemissa 6 ja 8) sisältävien analogien yhteydessä oli lisätä tähteiden etäisyyttä (esim. (N-Ac-D-Nal(2)^, D-pCl-Phe2, D-Trp3, Arg5, D-Tyr6, D-Ala10)LHRH; ED5Q = 30 2 ,ug/ml histamiinin vapautuksessa; R.W. Roeske et ai., ' 5 5 "Substitution of Arg for Tyr in GNRH antagonists",

Peptides - Structure and Function, toim. C.M. Deber, V. J. Hruby ja K. D. Kopple, Pierce Chemical Co.,

Rockford, Illinois, 1985, s 561). Vaikka tämä heikensi 35 analogin kykyä degranuloida syöttösoluja ja vapauttaa 9221 1 4 histamiinia, analogilla oli yhä monta kertaa suurempi kyky aiheuttaa anafylaktistyyppinen reaktio kuin LHRH:11a, jonka ED50 on 328 yg/ml, mitä tulee histamiinin vapauttamiseen.

Myös Lys(iPr) on sisällytetty eri asemiin LHRH:n 5 antagonisteihin. Sijoitettaessa se 6- ja 8-asemaan, kun 2-asemassa on samanaikaisesti D-pCl-Phe-tähde, suuri ovulaation vastainen teho ja heikentynyt histamiinin vapautuminen säilyvät (esim. (N-Ac-D-Nal(2)1, pCl-Phe2, D-Trp3, D-Lys(iPr)8, D-Ala10)LHRH; ED50 = 6,6 yg/ml histamiinin va-10 pautuksessa). Erääseen analogiin sijoitettiin 8-asemaan hArg(Et2), jolloin analogin kyky vapauttaa histamiinia oli r samaa tasoa (so (N-Ac-D-Nal(2 )1, D-aMe-pCl-Phe2, D-Pal(3)3, D-Arg6, hArg(Et2)8, D-Ala10)LHRH; ED50 = 4,9 yg/ml histamiinin vapautuksessa). Voidaan kuitenkin havaita, että nämä 15 analogit ovat silti hyvin tehokkaita histamiinia vapauttavia aineita LHRH:hon verrattuna. (R.W. Roeske et ai., "LHRH Antagonists with Low Histamine Releasing Activity". LHRH and its Analogs: Contraceptive and Therapeutic Applications, Part 2, toim. B. H. Vickery ja J. J. Nestor Jr., 20 MTP Press, Boston, 1987, s 17-24).

8- ja 9-asema on myös tunnistettu tärkeimmiksi sub-stituoitaviksi kohdiksi, jotta estetään histamiinin vapautus, koska Arg-Pro-jakso on neuropeptideissä, jotka aiheuttavat syöttösolujen degranuloitumista, usein havaittu omi-. 25 naispiirre. Vaikka siis 8-asema on tieteellisin perustein ratkaiseva asema substituoitavaksi, nykyisin tunnetulla joukolla analogeja on huomattava mahdollisuus myrkyllisyyteen ja muihin sivuvaikutuksiin.

Tämä keksintö koskee uusien, hyvin tehokkaiden 30 LHRH:n nonapeptidi- ja dekapeptidianalogien valmistusta, joiden kyky vapauttaa histamiinia on hyvin pieni ja joiden ratkaisevan tärkeä ominaispiirre on steerisesti estetty guanidinosubstituoitu arginyyliryhmä 8-asemassa, välttäen arginyyliryhmää 6-asemassa.

35 Keksinnön kohteena on menetelmä kaavan (I) mukais ten, terapeuttisesti käyttökelpoisten nonapeptidi- ja dekapeptidianalogien ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi 5 92211 A-B-C-Ser-D-E-F-G-Pro-J (I) 123 4 5678 9 10 jossa A on jokin aminoasyyliryhmistä N-Ac-3-(1-naftyyli)-5 D,L-alanyyli ja N-Ac-3-(2-naftyyli )-D,L-alanyyli, niiden D-tai L-isomeeri; B on jokin aminoasyyliryhmistä D-fenyylialanyyli, D-p-kloorifenyylialanyyli, D-p-fluorifenyylialanyyli ja D-a-metyyli-p-kloorifenyylialanyyli; 10 C on jokin aminoasyyliryhmistä D-tryptofanyyli ja 3-(3-py-ridyyli)-D-alanyyli; D on jokin aminoasyyliryhmistä L-fenyy^ialanyyli, L-tyro-syyli, 3-(3-pyridyyli)-alanyyli ja arginyyli, tai amino-asyyliryhmä, jolla on rakennekaava 15 -HN-CH-CO- (CH2)n (II)

20 NH

x I 2 R1-HN-C=NR2 jossa n on 1 - 5; R1 on alkyyli, joka sisältää 1-6 hiili-25 atomia, tai fluorialkyyli; ja R2 on vety tai R1; E on 3-(3-pyridyyli)-D-alanyyli, D-tyrosyyli, D-tryptofa-nyyli tai aminoasyyliryhmä jolla on rakennekaava -HN-CH-CO- 30 | (CH2)n (II)

NH

. 1 2 35 R1-HN-C=NR2 jossa n on 1 - 5; R1 on alkyyli, joka sisältää 1-6 hiili-atomia, ja R2 on vety tai R1; tai R1-HN-C=NR2 on 6 9221 1

HN N

5 \ / H-C—(CH2)„

H

jossa m on 1 - 4; F on jokin aminoasyyliryhmistä L-leusyyli ja L-fenyyli-10 alanyyli; G on aminoasyyliryhmä, jolla on rakennekaava -HN-CH-CO- 15 (CH2)n (II)

NH

x I a R1-HN-C=NR2 20 jossa n on 1 - 5; R1 on alkyyli, joka sisältää 1-6 hiiliatomia, tai fluorialkyyli; ja R2 on vety tai R1; ja J on D-alaniiniamidi tai glysiiniamidi.

Yhdisteet (I) valmistetaan keksinnön mukaisesti si-25 ten, että (a) liitetään halutut, sopivasti suojatut aminohapot yhteen haluttuun järjestykseen esim. kiinteäfaasisyn-teesillä, minkä jälkeen poistetaan suojaryhmät ja mahdollinen kiinteä kantaja, tai 30 (b) kaksi halutun polypeptidin fragmenttia liite tään yhteen haluttuun järjestykseen esim. liuossynteesillä käyttäen asyyliatsidimenetelmää, jolloin saadaan haluttu kaavan (I) mukainen poly-peptidi tai sen suola, ja mahdollisesti 35 (i) kaavan (I) mukainen polypeptidi muutetaan far maseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi, tai (ii) kaavan (I) mukaisen polypeptidin suola muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi, tai (iii) kaavan (I) mukaisen polypeptidin suola muute-40 taan kaavan (I) mukaiseksi vapaaksi polypeptidiksi.

92211 7 LHRH:n 2-asemassa sijaitsevan L-histidyyliryhmän korvaaminen muuttaa peptidin LHRH:n antagonistiksi. LHRHrssa 6-asemassa sijaitsevan glysyyliryhmän korvaaminen jollakin E:nä mainituista ryhmistä lisää anta-5 gonistista vaikutusta voimakkaasti. Tässä esitetyt 1-, 2-, 3-, 5-, 7- ja 10-asemassa tehtävät korvaukset auttavat edelleen parantamaan antagonistista aktiivisuutta. Substituutio G 8-asemassa alentaa voimakkaasti analogien tehoa histamiinin vapautuksessa, kun 6-aseman Arg on kor-10 vattu jollakin muulla ryhmällä, ja on ratkaisevan tärkeä ajatellen analogien käyttöä turvallisina lääkkeinä.

Kuten edellä on esitetty, erilaisista yleisistä aminohapoista käytetään tämän keksinnön kuvauksen helpottamiseksi tavanomaisia lyhenteitä peptidialalla 15 yleisesti hyväksytyllä tavalla, jota on suositellut IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (Biochemistry 11 (1972) 1726). Kaikki tässä mainitut pepti-dijaksot on kirjoitettu noudattaen yleisesti hyväksyttyä tapaa, jossa N-terminaalinen aminohappo on vasem-20 maila ja C-terminaalinen aminohappo oikealla.

Esitetyt lyhenteet tarkoittavat L-aminohappoja, poikkeuksena asymmetriakeskukseton (akiraalinen) amino-happoglysiini ja lisäpoikkeuksina ne luonnossa esiintymättömät tai esiintyvät aminohapot, jotka ovat akiraali-25 siä tai joita muussa tapauksessa on merkitty D:llä tai DL:llä.

Tulisi huomata, että J:n ollessa -NH-C(0)-NH2 C-terminaalinen ryhmä on atsaglysinamidiryhmä.

Lyhenne D-Glu(AA) tarkoittaa anisolin ja D-Glu-30 tähteen välistä additiotuotetta, jolloin muodostuu p-me-toksifenyyliketoni (glutamiinihapposivuketjun C-terminaa-liseen päähän), so Glu(pMeO-Ph).

Eräät muutkin lyhenteet ovat käyttökelpoisia keksinnön selostamisessa. Tässä keksinnössä luonnollisen 35 LHRH-peptidin aminohappoja korvataan aminohapoilla, joi- 92211 8 ta ei esiinny luonnossa. Erityisen yleisesti käytettyjä niistä ovat seuraavat:

Aminohappotähde Lyhenne 3-(2-naftyyli)alanyyli Nai(2) 5 3-(p-fluorifenyyli)alanyyli pF-Phe 3-(p-kloorifenyyli)alanyyli pCl-Phe 3-(3-pyridyyli)alanyyli Pal(3) N,N'-guanidino(dimetyyli)- homoarginyyli Dmh tai hArg(Me)2 10 N,N*-guanidino(dietyyli)- homoarginyyli Deh tai }iArg(Et)2 N,N'-guanidino(diprop- yyli)homoarginyyli Dph tai hArg(Pr)2 N,N'-guanidino(di-iso- 15 propyyli)homoarginyyli Dih tai hArg(iPr)2 N,N'-guanidino(diheksyy- li)homoarginyyli Dhh tai hArg(heksyyli)2 N,N*-guanidino(etano)- homoarginyyli Eha tai hArg(CH2)2 20 N,N'-guanidino(propeno)- homoarginyyli Pha tai hArg(CH2)2 N,N'-guanidinobis(2,2,2-tri- f luorietyyli) homoarginyyli Bth tai hArg (CI^CF^) 2 NG-etyyli-NG*-(trifluori- ! 25 etyyli)homoarginyyli hArgfCt^CF^, Et) - NG,NG'-2-trifluorimetyyli-2,2-difluorietyylihomoargi- nyyli hArg (CI^CF^F-j) n-guanidino(etyyli)homo- 30 arginyyli Meh tai hArg(Et) N-guanidino(propyyli)- homoarginyyli Prh tai hArg(Pr) N-guanidino(isopropyyli)- homoarginyyli Tph tai hArg(iPr) 35 N-guanidino(butyyli)homoarginyyli Mbh tai hArg(Bu) 9221 1 9

Aminohappotähde Lyhenne N,Ν'-guanidino(disyklo- heksyyli)homoarginyyli Dch tai hArg(sykloheksyy- li) 2 5 N-guanidino(heptyyli)homoarginyyli Hha tai hArg(heptyyli) N-guanidino(etyyli)arginyyli Mea tai Arg(Et) N,N1-guanidino(di-iso- propyyli)arginyyli Dia tai Arg(iPr)2 10 N,N'-guanidino(disyklo- heksyyli)arginyyli Dca tai Arg(sykloheksyyli)2 3-(3-piperidyyli)alanyyli 3-Pia 3-(4-piperidyyli)alanyyli 4-Pia 3— /7n£ -metyyli)piperid- 15 4-yyli7~alanyyli Mpa (N^ -pentyyli)piperid- 4- yyli7alanyyli Ppa 3- //’(N^ -bentsyyli)piperid- 4- yyli7alanyyli Bpa 20 -nikotinyyli-D-lysyyli Lys(Nic) N £ _(3-pyridyyli)asetyyli- D-lysyyli Lys(pyridyyliasetyyli) 3-(2,4,6-trimetyylifenyy-li)alanyyli Tmp '25 2,2-difenyyliglysyyli Dpg Tässä käytettynä ilmaisu "farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat" tarkoittaa suoloja, joilla säilyy kantayhdisteen toivottu biologinen aktiivisuus ja joilla 30 ei ole mitään ei-toivottuja toksikologisia vaikutuksia. Esimerkkejä sellaisista suoloista ovat (a) epäorgaanisten happojen, esimerkiksi suolahapon, bromivetyhapon, rikkihapon, fosforihapon, typpihapon ja vastaavien, kanssa muodostetut happoadditiosuolat 35 sekä orgaanisten happojen, kuten esimerkiksi etikkahapon, 9221 1 10 oksaalihapon, viinihapon, meripihkahapon, maleiinihapon, fumaarihapon, glukonihapon, sitruunahapon, omenahapon, as-korbiinihapon, bentsoehapon, parkkihapon, pamonihapon, al-giinihapon, polyglutamiinihapon, naftaleenisulfonihappojen, 5 naftaleenidisulfonihappojen ja polygalakturonihapon, kanssa muodostetut suolat; (b) moniarvoisten metallikationien, kuten sinkin, kalsiumin, vismutin, bariumin, magnesiumin, alumiinin, kuparin, koboltin, nikkelin, kadmiumin ja vastaavien, sekä Ν,Ν'-di- 10 bentsyylietyleenidiamiinista tai etyleenidiamiinista muo dostuneen orgaanisen kationin kanssa muodostetut emäsaddi- t tiosuolat; ja (c) yhdistelmät, jotka koostuvat (a):sta ja (b):stä, esimerkiksi sinkkitannaattisuola ja vastaavat.

15 Ilmaisu "alempi alkyyli" tarkoittaa suoraketjuista tai haaroittunutta, tyydytettyä hiilivetyryhmää, joka sisältää 1-4 hiiliatomia, kuten esimerkiksi metyyliä, etyyliä, n-propyyliä, isopropyyliä, n-butyyliä, isobutyyliä, s-butyyliä ja t-butyyliä. "1-6 hiiliatomia sisältävä alkyy- 20 li" sulkee sisäänsä samat substituentit kuin alempi alkyyli mutta lisäksi myös 5 tai 6 hiiliatomia sisältävät ryhmät, kuten esimerkiksi n-pentyylin, n-heksyylin ja 5 tai 6 hiiliatomia sisältävät haaroittuneet ryhmät. "1-12 hiiliatomia sisältävä alkyyli" sulkee sisäänsä hiilivetyryhmät, joissa . 25 on 1-12 hiiliatomia, mm. edellä mainitut ryhmät sillä erotuksella, että ryhmät voivat sisältää jopa 12 hiiliatomia.

"Fluorialkyyli" tarkoittaa 1-5 fluoriatomilla sub-stituoitua alempaa alkyyliä, esimerkiksi ryhmiä CF3CH2-, CF3-, CF3CF2CH2- ja vastaavia.

30 "Halogeeni" tarkoittaa fluoria, klooria tai bromia.

Lyhenne "N-Ac" tarkoittaa N-asetyyli-suojaryhmää, so. terminaalisen aminohappotähteen amiinityppeen sitoutunutta asetyyliryhmää, yleisesti hyväksytyn nimeämistavan mukaisesti.

92211 11

Edullisia tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä ovat yhdisteet, Joissa A on N-Ac-D-Nal(2); B on D-pF-Phe tai D-pCl-Phe; 5 C on D-Trp tai D-Pal(3); D on Pal(2), Tyr, Arg, Deh, Mbh, Bth tai Pha; E on D-Trp, D-Tyr, D-Pal(3), D-Deh, D-Mbh, D-Bth tai D-Pha; F on Leu tai Phe; G on Deh, Bth, Mbh tai Bha; ja 10 J on D-AlaNH2 tai GlyNH2.

Vielä edullisempia substituutiomalleja ovat sellaiset, joissa A on N-Ac-D-Nal(2); B on D-pCl-Phe; 15 C on D-Trp tai D-Pal(3); D on Tyr, Arg, Deh, Mbh, Bth tai Pha; E on D-Trp, D-Pal(3), D-Tyr, D-Deh, D-Mbh, D-Bth tai D-Pha; F on Leu; G on Deh, Mbh, Bth tai Pha; ja 20 J on D-AlaNH2.

Tähän edullisempaan ryhmään kuuluu kolme edullista alaryhmää; 1. Kun D on Tyr, E voi olla joko (a) jokin hydrofobisista ·. ryhmistä D-Trp, D-Pal(3), ja D-Tyr, mutta edullisimmin 25 D-Trp tai D-Pal(3); tai (b) jokin ryhmistä D-Deh, D-Mbh, D-Bth ja D-Pha.

2. Kun D on Arg, E on jokin kohdassa 1(a) luetelluista hydrofobisista ryhmistä, edullisesti D-Tyr.

3. Kun D on Deh, Mbh, Bth tai Pha, E on edullisimmin D-Tyr 30 tai D-Pal(3), mutta myös D-Trp on edullinen.

Kussakin edullisista alaryhmistä G on Deh, Mbh, Bth tai Pha. Erityisen edullisia ovat Bth ja Deh ja edullisin Deh.

Esimerkkejä edullisemmista substituutiomalleista 35 ovat siis N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-Tyr-C-Leu-G-Pro- 12 92211 D, AlaNH2, jossa C on D-Trp tai D-Pal(3) ja G on Deh, Mbh, Bth tai Pha; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-Tyr-E-Leu-G-Pro-D-AlaNH2, jossa C on D-Trp tai D-Pal(3), E on D-Deh, D-Bth, D-Mbh tai D-Pha ja G on tässä kappaleessa esitetyn määri-5 telmän mukaisen E:n L-muoto; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-Arg-E-Leu-G-Pro-D-AlaNH2, jossa C on D-Trp tai D-Pal(3), E on D-Trp, D-Pal(3) tai D-Tyr ja G on Deh, Mbh, Bth tai Pha; ja N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-D-E-Leu-G-Pro-D-AlaNH2, jossa C on D-Trp tai D-Pal(3), D ja G ovat kumpikin itse-10 näisesti Deh, Bth, Mbn tai Pha ja E on D-Tyr, D-Trp tai D-Pal(3).

f

Muita edullisia toteutusmuotoja ovat N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-E-Leu-G-Pro-D-AlaNH2, jossa E on D-Trp tai D-Tyr ja G on Deh, Bth, Mbh tai Pha; 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-D-E-Leu-G-Pro-D-AlaNH2, jossa D ja G ovat kumpikin itsenäisesti Deh, Bth, Mbh tai Pha ja C ja E ovat kumpikin itsenäisesti D-Trp tai D-Pal(3); ja N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-G-Pro-D-AlaNH2, jossa G on Deh, Bth, Mbh tai Pha.

20 Esimerkkejä edullisista toteutusmuodoista ovat seu- raavat: N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-25 Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; 30 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-

Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2;

II

13 9221 1 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phs-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-MPh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-

Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Mbh-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNI-^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-Tyr-D-3th-10 Leu-3th-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Pna-

Leu-Pha-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Deh-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Mbh-

Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-3th-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pha- 20

Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCI-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-T rp-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; ^ N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp- : Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-

Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-30 Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; 35 92211 14 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Lau-Pba-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Na1(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-Den-Pro-D-AlaN^; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Tyr-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; M_Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-TyΓΙΟ Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCi-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-

Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Deh-D-Tyr-Leu-20 Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Mbh-D-Tyr-Leu-

Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Bth-D-Tyr-Leu-

Bth-Pro-D-AlaNH2; 25 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Pba-D-Tyr-Lsu-

Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-Deh-D-T rp-Leu-

Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Mbh-D-Trp-Leu- 30 Mbb-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Bth-D-Trp-Leu-

Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Pha-D-Trp-Leu-

Pha-Pro-D-AlaNH2; 55 • · 15 9221 1 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Deh-D-Pal(3)-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNh2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Pne-D-Pal(3)-Ser-Mbn-D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-U-AlaNH^; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-3th-D-Pal(3)-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pha-D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Deh-D-Nal(2)-10 Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Mbh-D-Nal(2)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Bth-D-Nal (2)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-Pha-D-Nal (2)-

Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)-20 D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)-D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N_Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)-D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; 25 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Mbh-Leu- ; 3tn-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Mbh-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-30 Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; • 35 16 92211 (M-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-3th-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Bth-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Deh-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-3th-10 Leu-Bth-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; ' N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-T rp-Leu-3th-Pro-D-AlaNH2; 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Trp-Ser-Deh-D-Tyr-Leu-20 Deh-Pro-D-AlaNH2; and N-Ac-D-Nal(2)-D-pF-Phe-D-Trp-Ser-Bth-D-Tyr-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2< Tämän keksinnön piiriin kuuluu myös peptidejä,jotka eivät välttämättä kuulu edellä mainittuihin edullisiin ryhmiin, kuten 2 5 es imeneiksi seuraavat: N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2| N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr-

Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; 30 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Tyr-

Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-35 D-Nal(2)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; « 92211 17 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Nal(2)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2 ; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Nal(2)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Nal(2)-

Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-aMe,pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-aMe,pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-10 Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-aMe,pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; t N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Glu(AA)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Glu(AA)-

Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2 ; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Glu(AA)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-20 Leu-HArg(CH2CF2CF3)-Pro-D-AlaNH2; ja N-Ac-D-Nal(2)-Dpg-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Nal(2)-Bt:h-Pro-D-AlaNH2.

On yleensä edullista, että A-, B-, C-, E- ja J-ami-nohappotähde ovat D-isomeerin muodossa ja että D-, F- ja G-25 aminohappotähde ovat L-isomeerin muodossa. Stereokemia tu lee käsittää tällaiseksi, ellei sitä ole toisenlaiseksi erikseen mainittu.

Kaikissa edellä mainituissa toteutusmuodoissa yhdiste voidaan valmistaa myös vastaavan farmaseuttisesti hy-30 väksyttävän suolan muodossa.

18 92217 Tämän keksinnön mukaisilla yhdisteillä ja erityisesti niiden suoloilla on yllättävän voimakas ja pitkään kestävä LHRH-antagonistinen aktiivisuus.

LHRH-antagonismin voimakkuuden ensisijainen mitta 5 on kyky estää ovulaatiota rotilla, mikä määritetään A. Corbinin ja C.W. Beattien menetelmällä (Endocrine Res. Commun. 2 (1975) 1).

Kyky saada aikaan histamiinin vapautuminen rotan peritoneaalisista syöttösoluista in vitro voidaan määrittää 10 tavalla, jonka ovat esittäneet Sydbom ja Terenius (Agents and Action 15 (1985) 269) tai Siraganian et ai. (Manual of t

Clinical Immunology, 2. painos, toim. N.E. Rose ja M. Friedman, Amer. Soc. Microbiol., Washington, D.C., 1980, s 808).

15 Muita biologisia testejä, joita voidaan käyttää LHRH:n antagonistien ja tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden tutkimiseen, ovat (a) LHRH:n aiheuttaman FSH:n ja LH:n vapautumisen inhibitio rotalla in vivo (J.A. Vilchez-Martinez et ai., Endocrinolo- 20 gy 96 (1975) 1130); (b) aivolisäkkeen etulohkon solujen dispersioviljelmän aikaansaama LH:n ja FSH:n vapautumisen inhibitio radioimmuno-logisesti mitattuna (W. Vale et ai., Endocrinology 91 (1972) 562); ja 25 (c) gonadotropiinitasojen alentaminen kastroidulla rotalla ja koiralla (Petrie et ai., Male Contraception, Harper and Row, Philadelphia, 1985, s 361).

Antagonistiset vaikutukset ja käyttömahdollisuudet Tässä kuvattujen yhdisteiden antagonistisesta vai-30 kutuksesta johtuvat seuraavat terapeuttiset käyttömahdolli suudet : 92211 19 - ovulaation esto tai viivytys, - tiineyden keskeytys koti- ja lemmikkieläimillä, - synnytyksen käynnistys, - ovulaation tahdistus, 5 - naaraan kiiman tukahduttaminen, - naaraseläinten kasvun edistäminen, - luteolyysi, kuukautisten käynnistys, - kuukautisia edeltävän oireiston hoito, - ennenaikaisen sukukypsyyden hoito, 10 - kohdun leiomyooman hoito, - raskauden keskeytys varhaisessa vaiheessa, ensimmäisten 3 kuukauden aikana, f - endometrioosin hoito, - kasvainten ja kystojen hoito nisäkkäillä, 15 - polykystisen munasarjasyndrooman tai -sairauden hoito, - kohtusyövän hoito, - hyvänlaatuisen eturauhasen liikakasvun ja eturauhassyövän hoito, - gonadiperäisten hormoonien liikatuotannosta seurauksena 20 olevien sairauksien hoito kummalla sukupuolella tahansa, - urospuolisten ravinnontuotantoeläinten funktionaalinen kastraatio, - kiimaa edeltävä verenvuodon ehkäiseminen naaraskoirilla, - munasarjan ylistimuloitumisen ehkäisy, • 25 - hedelmällisyyden säilytys kemoterapien tai säteilytyksen tapauksessa, - muut käyttömahdollisuudet, joita on esitetty artikkelissa B, H. Vickery, Endocrine Reviews 7 (1986) 115.

Eräs erityisen kiinnostava tämän keksinnön mukais-30 ten LHRH:n antagonistien käyttömahdollisuus on niiden käyttö munasarjan ylistimuloitumisen ehkäisyyn. Tavallisesti naispuolisen kohteen kärsiessä normaalin kuukautiskierron häiriintymisestä aiheutuvista tiloista, esimerkiksi polykystisestä munasarjasairaudesta, kemoterapian aiheutta- 92211 20 masta menopausaalisesta oireistosta tai oligomenorreasta, hedelmällisyys voidaan saada aikaan joko in situ tai in vitro-hedelmöityksen/munasolun siirron tapauksessa antamalla eksogeenisia gonadotropiineja. Tämä gonadotropiinihoito 5 johtaa kuitenkin usein munasarjan ylistimuloitumiseen ja/-tai monisikiöisiin synnytyksiin endogeenisten ja eksogee-nisten gonadotropiinien yhteisvaikutuksen vuoksi. Niinpä tämän keksinnön mukaiset LHRH:n antagonistit soveltuvat endogeenisten gonadotropiinien inhiboimiseen niin, että kye-10 tään saavuttamaan munasarjan normaali stimulaatioaste.

Se puoli tätä keksintöä, joka liittyy edellä kuvat- f tujen yhdisteiden erikoiskäyttöön, koskee näitä käyttömahdollisuuksia, aivan erityisesti ovulaation estoa, kuukautisia edeltävän oireiston hoitoa, eksogeenisista gonadotro-15 piineista aiheutuvan munasarjan ylistimulaation hoitoa ja endometrioosin hoitoa naaraspuolisella nisäkäskohteella; spermatogeneesin estoa ja eturauhasen liikakasvun hoitoa urospuolisella nisäkäskohteella; isoseksuaalisen todellisen (idiopaattisen) ennenaikaisen sukukypsyyden (so. joko urok-20 sella tai naaraalla siintyvän hypotalamusperäisen ennenaikaisen sukukypsyyden) ehkäisyä; naaraan kiiman tukahduttamista (so. kiiman keskeytystä eläimillä); ja raskauden keskeyttämistä nisäkkäillä.

Sovellettaessa tämän keksinnön mukaista menetelmää 25 käytännössä kyseisen hoidon tarpeessa olevalle tai hoitoa haluavalle kohteelle annetaan vaikuttava määrä tämän keksinnön mukaista yhdistettä tai sitä sisältävää farmaseuttista koostumusta. Nämä yhdisteet tai koostumukset voidaan antaa eri tavoilla sen mukaan, mikä on tarkka käyttötarkoi-30 tus, mm. suun kautta, parenteraalisesti (mikä käsittää ihonalaisen, lihaksensisäisen ja laskimonsisäisen annon), emättimen kautta, peräsuolen kautta, bukkaalisesti (kuten esimerkiksi kielen alle), ihon läpi tai nenän kautta. Sopivin tie kussakin eri tapauksessa riippuu käyttötarkoituk- 9221 1 21 sesta, kulloisestakin vaikuttavasta aineosasta, hoidettavasta kohteesta ja hoitavan lääkärin harkinnasta. Yhdiste tai koostumus voidaan antaa myös käyttäen säännöstellysti vaikuttavaa aineosaa vapauttavia depotistute- tai ruiske-5 formuloita, joita kuvataan tarkemmin jäljempänä.

Mitä edellä esitettyihin käyttötarkoituksiin tulee, vaikuttavaa aineosaa on yleensä tarkoituksenmukaista antaa noin 0,001 - 5 mg/ruumiinpaino-kg. Ihmisiä hoidettaessa vaikuttavaa ainetta annetaan edullisesti noin 0,01-1 10 mg/kg/vuorokausi ja eläimiä hoidettaessa noin 0,1-1 mg/kg/-vuorokausi. Tämä antaminen voi tapahtua yhdellä kertaa, jakamalla annos useaan antoerään tai hitaasti vaikuttavaa aineosaa vapauttavassa muodossa tehokkaimpien tulosten saavuttamiseksi. Kun kysymyksessä on kiiman tai tiineyden eh-15 käisy eläimillä, annos on edullisimmin noin 1-10 mg/kg ja se annetaan yhtenä annoksena.

Näiden yhdisteiden ja koostumusten tarkka annostus ja anto-ohjeet määräytyvät pakostakin hoidettavan yksilön tarpeiden, hoidon tyypin, tuska-asteen tai tarpeen ja luon-20 nollisesti hoitavan lääkärin harkinnan mukaan. Parenteraa-linen anto edellyttää yleensä pienempää annostusta kuin muut antomenetelmät, jotka ovat enemmän imeytymisestä riippuvaisia .

Yhdisteet (I) voidaan antaa farmaseuttisten koostu-25 musten muodossa, jotka sisältävät vaikuttavana aineosana tämän keksinnön mukaista yhdistettä, joka on sekoitettu johonkin farmaseuttisesti hyväksyttävään myrkyttömään kantajaan. Kuten edellä on mainittu, sellaiset koostumukset voidaan valmistaa käytettäviksi parenteraaliseen (ihonalai-30 seen, lihaksensisäiseen tai laskimonsisäiseen) antamiseen erityisesti nestemäisten liuosten ja suspensioiden muodossa; käytettäviksi emättimen tai peräsuolen kautta antamiseen erityisesti puolikiinteissä muodoissa, kuten esimer- 9221 1 22 kiksi voiteina ja peräpuikkoina; käytettäviksi suun kautta tai bukkaalisesti antamiseen erityisesti tablettien tai kapselien muodossa; tai käytettäviksi nenän kautta erityisesti pulvereiden, nenätippojen tai aerosolien muodossa.

5 Koostumukset voidaan antaa kätevästi yksikköannos- muodossa ja voidaan valmistaa millä tahansa niistä menetelmistä, jotka ovat farmasian alalla tunnettuja ja joita esimerkiksi kuvataan teoksessa Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 10 1970. Parenteraalisesti annettaviksi tarkoitetut formulat voivat sisältää tavanomaisia täyteaineita, esimerkiksi ste- » riiliä vettä tai fysiologista suolaliuosta, alkyleeniglyko-leja, kuten propyleeniglykolia, polyalkyleeniglykoleja, kuten polyetyleeniglykolia, kasviperäisiä öljyjä, hydrattuja 15 naftaleeneja sekä vastaavia. Emättimen tai peräsuolen kautta annettaviksi tarkoitetut formulat, esimerkiksi peräpuikot, voivat sisältää täyteaineina esimerkiksi polyalkyleeniglykoleja, vaseliinia, kaakaovoita ja vastaavia. Nenän kautta annettaviksi tarkoitetut formulat voivat olla kiin-20 teitä ja sisältää täyteaineina esimerkiksi laktoosia ja dekstraania tai olla vesi- tai öljyliuoksia, jotka on tarkoitettu annettaviksi nenätippojen tai annostellun suihkeen muodossa. Bukkaalisissa antomuodoissa tyypillisiä täyteaineita ovat sokerit, kalsiumstearaatti, magnesiumstearaatti, 25 esigelatinoitu tärkkelys ja vastaavat.

Tämän keksinnön mukaisten nona- ja dekapeptidien antaminen nenän kautta on erityisen edullista. Imeytymistä nenän limakalvon läpi parantavat pinta-aktiiviset hapot, kuten esimerkiksi glykokoolihappo, koolihappo, taurokooli-30 happo, kolaanihappo, etokoolihappo, deoksikoolihappo, keno-deoksikoolihappo, dehydrokoolihappo ja glykodeoksikoolihap-po.

li 9221 1 23 LHRH:n antagonistia sisältävään liuos- tai jauhe-formulaan voidaan lisätä yhtä tai useampaa pinta-aktiivista happoa tai suolaa mutta edullisesti yhtä farmaseuttisesti hyväksyttävää happosuolaa. Sopivia farmaseuttisesti hyväk-5 syttäviä pinta-aktiivisia suoloja ovat suolat, joita käytettäessä peptidin parantunut imeytyminen samoin kuin yhdisteen pinta-aktiiviset ominaisuudet säilyvät ja jotka eivät ole hoidettavalle kohteelle vahingollisia tai muista syistä soveltumattomia. Sellaisia suoloja ovat esimerkiksi 10 epäorgaanisista emäksistä saatavat suolat, mm. natrium-, kalium-, litium-, ammonium-, kalsium-, magnesium-, alumiini-, rauta(III)- ja magnaani(III)suolat sekä vastaavat. Erityisen edullisia ovat ammonium-, kalium-, natrium-, kalsium- ja magnesiumsuolat. Farmaseuttisesti hyväksyttävistä 15 myrkyttömistä orgaanisista emäksistä saatavia suoloja ovat primaaristen, sekundaaristen ja tertiaaristen amiinien, substituoitujen amiinien (luonnossa esiintyvät substituoi-dut amiinit mukaan luettuina), syklisten amiinien ja emäksisten ioninvaihtohartsien, kuten esimerkiksi isopropyyli-20 amiinin, trimetyyliamiinin, dietyyliamiinin, trietyyliamii- nin, tripropyyliamiinin, etanolamiinin, 2-dimetyyliamino-etanolin, 2-dietyyliaminoetanolin, trometamiinin, disyklo-heksyyliamiinin, lysiinin, arginiinin, histidiinin, kofeiinin, prokaiinin, hydrabamiinin, koliinin, betaiinin, ety- 25 leenidiamiinin, glykosamiinin, metyyliglukamiinin, teo- bromiinin, puriinien, piperatsiinin, piperidiinin, N-etyy-liipiperidiinin, polyamiinihartsien sekä muiden vastaavien, suolat. Erityisen edullisia myrkyttömiä orgaanisia emäksiä ovat isopropyyliamiini, dietyyliamiini, etanolamii-30 ni, trometamiini, disykloheksyyliamiini, koliini ja kofeiini.

9221 1 24

Vielä edullisemmin tämän keksinnön käytännön sovellutuksissa käytettävä pinta-aktiivinen aine on gly-kokoolihapon alkalimetallisuola, edullisimmin natrium-glykokolaatti.

5 Pinta-aktiivista ainetta käytetään tämän keksin nön käytännön sovellutuksissa sellaisena määränä, että se parantaa LHRH-peptidien imeytymistä enemmän kuin muut pinta-aktiiviset aineet, jotka saattavat parantaa peptidien imeytymistä jossakin määrin. On havaittu, että usein 10 sellainen määrä on 0,2-15 % (massa/tilavuus), vielä useammin 0,2-5 % (massa/tilavuus) liuoksesta- Pinta-aktiivista ainetta on edullista olla mukana noin 0,5-4 % (massa/-tilavuus), mielellään noin 1 % (massa/tilavuus) ja edullisesti noin 2 % (massa/tilavuus).

15 Näihin formuloihin voidaan lisätä muitakin aineita, kuten esimerkiksi säilymistä parantavia aineita, suoloja kudosta vastaavan elektrolyyttipitoisuuden saavuttamiseksi sekä muita lisäaineita, jotka ovat nenän kautta annettaviksi tarkoitettujen formuloiden kemiassa tunnettuja. Eri-20 tyisen edullisia sellaisia muita aineita ovat pinta-aktii-viset aineet, edullisesti ionittomat pinta-aktiiviset aineet, kuten polysorbaatit, 0,1 - 5 %:n (massa/tilavuus), vielä edullisemmin 0,25-2 %:n (massa/tilavuus), pitoisuuksina.

25 On havaittu, että paremman liukenevuuden ja stabii- lisuuden saavuttamiseksi sappihapon ja peptidin moolisuh-teen on tarkoituksenmukaista olla vähintään 20:1, esimerkiksi ainakin 25:1.

Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet on erityisen 30 toivottavaa vapauttaa hoidettavaan kohteeseen pitkän ajanjakson aikana, esimerkiksi viikosta vuoteen vaihtelevan ajanjakson aikana yhdestä ainoasta antamisesta. Voidaan käyttää hyväksi erilaisia hitaasti vaikuttavaa ainetta vapauttavia depotistutteita tai ruiskeina annosteltavia 35 muotoja. Annostusmuoto voi esimerkiksi sisältää yhdisteen 92211 25 farmaseuttisesti hyväksyttävää myrkytöntä suolaa, jonka liukoisuus ruumiin nesteisiin on pieni, esimerkiksi (a) moniemäksisen hapon, kuten fosforihapon, rikkihapon, sitruunahapon, viinihapon, parkkihapon, pamonihapon, 5 algiinihapon, polyglutamiinihapon, naftaleenimono- tai -disulfonihappojen, polygalakturonihapon tai vastaavan, muodostamaa happoadditiosuolaa; (b) moniarvoisten metallikationin, kuten sinkin, kalsiumin, vismutin, bariumin, magnesiumin, alumiinin, kuparin, 10 koboltin, nikkelin, kadmiumin tai vastaavan, tai esimerkiksi N,N'-dibentsyylietyleenidiamiinista tai etyleeni-diamiinista muodostuneen orgaanisen kationin muodostamaa suolaa; tai (c) yhdistelmää, joka koostuu (a):sta ja (b):stä, esimer- 15 kiksi sinkkitannaattisuolaa.

Lisäksi tämän keksinnön mukaiset yhdisteet tai edullisesti, niiden suhteellisen liukenemattomat suolat, kuten esimerkiksi juuri edellä esitetyt suolat, voidaan formuloida ruiskeina annettavaksi soveltuvaksi geeliksi, esi-20 merkiksi alumiinimonostearaattigeeliksi seesamiöljyä käyttäen. Erityisen edullisia suoloja ovat sinkkisuolat, sink-kitannaattisuolat, pamoaattisuolat ja vastaavat. Erästä toista tyyppiä oleva hitaasti vaikuttavaa ainetta vapauttava depotformula, joka soveltuu annettavaksi ruiskeina 25 tai istutettavaksi kudokseen, voisi sisältää yhdistettä tai sen suolaa dispergoituna tai kapseloituna hitaasti hajoavaan, myrkyttömään, ei-antigeeniseen polymeeriin, kuten esimerkiksi polymaitohappo-polyglykolihappopolymee-riin. Yhdisteet tai, edullisesti, niiden suhteellisen liu-30 kenemattomat suolat, kuten esimerkiksi edellä esitetyt suolat, voidaan myös formuloida kolesterolimatriksipel-leteiksi tai silastomeerimatriksi-istutteiksi tai hydro-geeli- tai huokoskapseleiksi, erityisesti silloin, kun niitä on tarkoitus käyttää eläimillä. Muut hitaasti vai-35 kutiavaa ainetta vapauttavat depotistute- ja ruiskefor- 9221 1 26 mulat, esimerkiksi liposomit, ovat alan kirjallisuudessa hyvin tunnettuja. Viitataan esimerkiksi teokseen Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, toim. J.R. Robinson, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Erityisesti 5 LHRH-tyyppisten yhdisteiden lähteeksi voidaan todeta esi merkiksi US-patenttijulkaisu 4 010 125. Tutustukaa myös C.C. Pittin artikkeliin "The controlled delivery of polypeptides including LHRH analogs" teoksessa LHRH and its Analogs: Contraceptive and Therapeutic Applications, Part IQ 2, toim. B.H. Vickery ja J.J. Nestor, Jr., MTP Press, Boston, 1987, s 557.

Peptidien syntetisointi Tämän keksinnön mukaisia polypeptidejä voidaan syntetisoida peptidi-alaan perehtyneille tutuin menette-15 lytavoin. Erinomainen yhteenveto monista sellaisista käyttökelpoisista menettelytavoista on löydettävissä teoksista J.M. Stewart ja J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969 ja J. Meien-hofer, Hormonal Prosteins and Peptides, osa 2, Academic 20 Press, New York, 1973, s 46, kun kysymyksessä on peptidien kiinteä-faasisynteesi, ja teoksesta E. Schroder ja K. Lubke, The Peptides, osa 1, Academic Press, New York, 1865, kun kysymyksessä on klassinen liuossynteesi.

Yleensä nämä menetelmät käsittävät yhden tai useam-25 man aminohapon tai sopivalla tavalla substituoidun aminohapon liittämisen peräkkäin kasvavaan peptidiketjuun. Normaalisti joko ensimmäisen aminohapon aminoryhmä tai karb-oksyyliryhmä suojataan sopivalla suojausryhmällä. Suojattu tai johdannaisekseen muunnettu aminohappo voidaan sitten 30 joko kiinnittää inerttiin kiinteään kantajaan tai käyttää hyväksi liuoksena liittämällä järjestyksessä seuraava aminohappo, jossa vapaa ryhmä (amino- tai karboksyyliryh-mä) on sopivalla tavalla suojattu, amidisidoksen muodostamiseen soveltuvissa olosuhteissa. Sen jälkeen tästä 35 vastaliitetystä aminohappotähteestä poistetaan suojaus- 92211 27 ryhmä, ja sitten liitetään seuraava (sopivalla tavalla suojattu) aminohappo jne. Sen jälkeen kun kaikki aminohapot on liitetty oikeassa järjestyksessä, kaikki jäljellä olevat suojausryhmät (ja mahdollinen kiinteä kan-5 taja) poistetaan peräkkäin tai samanaikaisesti, jolloin saadaan lopullinen polypeptidi. Muuntamalla tätä yleistä menettelyä yksinkertaisella tavalla on mahdollista lisätä kasvavaan ketjuun enemmän kuin yksi aminohappo kerrallaan, esimerkiksi liittämällä toisiinsa suojattu 10 tripeptidi ja sopivalla tavalla suojattu dipeptidi (sellaisissa olosuhteissa, että asymmetriakeskukset eivät rasemisoidu), jolloin muodostuu suojausten poiston jälkeen pentapeptidi.

Synteesin edullisia toteutustapoja 15 Eräs erityisen edullinen menetelmä tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi sisältää kiinteä-faasipeptidisynteesin.

Tässä erityisen edullisessa menetelmässä aminohappojen funktionaalinen -aminoryhmä suojataan happo-20 tai emäsherkällä ryhmällä. Sellaisten suojausryhmien tulisi olla ominaisuuksiltaan stabiileja peptidisidosten muodostusolosuhteissa ja samalla helposti poistettavissa hajottamatta kasvavaa peptidiketjua tai rasemisoimatta mitään sen sisältämistä asymmetriakeskuksista. Sopivia . 25 suojausryhmiä ovat t-butyloksikarbonyyli (Boc), bentsy- loksikarbonyyli (Cbz), bifenyyli-isopropyloksikarbonyyli, t-amyloksikarbonyyli, isobornyloksikarbonyyli, o^cC-di-metyyli-3,5-dimetoksibentsyloksikarbonyyli, o-nitrofenyyli-sulfenyyli, 2-syaani-t-butyloksikarbonyyli, 9-fluorenyy-30 limetyloksikarbonyyli ja vastaavat, erityisesti t-butyloksikarbonyyli.

Erityisen edullisia ryhmiä sivuketjujen suojaukseen ovat arginiinin tapauksessa nitro, p-tolueenisulfo-nyyli, 4-metoksibentseenisulfonyyli, Cbz, Boc ja adaman-35 tyloksikarbonyyli; tyrosiinin tapauksessa bentsyyli, o-bromibentsyloksikarbonyyli, 2,6-diklooribentsyyli, iso- 28 92211 propyyli, sykloheksyyli, syklopentyyli ja asetyyli; seriinin tapauksessa bentsyyli ja tetrahydropyranyyli; sekä histidiinin tapauksessa bentsyyli, p-tolueenisulfo-nyyli ja 2,4-dinitrofenyyli.

5 C-terminaalinen aminohappo kiinnitetään sopivaan kiinteään kantajaan. Sopivia kiinteitä kantajia, joita voidaan käyttää edellä esitetyssä synteesissä, ovat sellaiset aineet, jotka ovat inerttejä vaiheittaisten kon-densaatiosuojauksenpoistoreaktioiden reagensseille ja 10 olosuhteille ja jotka eivät liukene käytettäviin väliaineisiin. Sopivia kiinteitä kantajia ovat kloorimetyyli- f polystyreeni-divinyylibentseenipolymeeri, hydroksimetyy-lipolystyreeni-divinyylibentseenipolymeeri ja vastaavat, erityisesti kloorimetyylipolystyreenistä ja 1 %:sta divi-15 nyylibentseeniä koostuva polymeeri. Siinä erikoistapauk sessa, että yhdisteen C-terminaalinen tähde on glysiini amidi, yksi erityisen käyttökelpoinen kantaja on bents-hydryyliaminopolystyreeni'-divinyylibentseenipolymeeri, jota kuvaavat P. Rivaille et ai., Helv. Chim. Acta 54 20 (1971) 2772. Kiinnitys kloorimetyylipolystyreeni-divi- nyylibentseenityyppiseen hartsiin toteutetaan antamalla N0^-suojatun amihohapon, erityisesti Boc-aminohapon reagoida cesium-, trimetyyliammonium-, trietyyliammonium-tai 1,5-diatsabisyklo^4.4.Q7undek-5-eenisuolanaan tai • 25 muuna samankaltaisena suolana etanolissa, asetonitriilis- sä, Ν,Ν-dimetyyliformamidissa (DMF) tai vastaavassa, erityisesti cesiumsuolana DMF:ssä, kloorimetyylihartsin kanssa korotetussa lämpötilassa, esimerkiksi noin 40-60°C: ssa, edullisesti noin 50°C:ssa, noin 12-48 tuntia, edul-30 lisesti noin 24 tuntia. N°^-Boc-aminohappo kiinnitetään bentshydryyliamiinihartsiin N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidin (DIC)/1-hydroksibentsotriatsolin (HBT) välittämän, noin 2-24 tuntia, edullisesti noin 12 tuntia, kestävän kytkentäreaktion avulla jossakin liuottimessa, kuten di-35 kloorimetaanissa tai DMF:ssä, edullisesti dikloorimetaa-

II

92211 29 nissa, noin 10-50°C:n, edullisesti 25°C:n, lämpötilassa. Peräkkäisten suojattujen aminohappojen liittäminen voidaan toteuttaa automaattisessa polypeptidien synte-tisointilaitteessa, joka on alalla tunnettu. N^-suojaus-5 ryhmien poisto voidaan toteuttaa esimerkiksi trifluori-etikkahapon metyleenikloridiliuoksella, vetykloridin di-oksaaniliuoksella, vetykloridin etikkahappoliuoksella tai jollakin muulla vahvan hapon liuoksella, edullisesti 50-%:isella trifluorietikkahapon dikloorimetaaniliuok-lo sella, suunnilleen ympäristön lämpötilassa. Kutakin suojattua aminohappoa lisätään edullisesti suunnilleen 2,5-kertaisesti ylimäärin ja liittäminen voidaan toteuttaa dikloorimetaanissa, dikloorimetaani-DMF-seoksessa tai vastaavassa,erityisesti dikloorimetaanissa, suunnilleen 15 ympäristön lämpötilassa. Kytkentäaine on normaalisti DCC dikloorimetaanissa mutta voi olla myös N, N'-di-isopropyy-likarbodi-imidi (DIC) tai muu karbodi-imidi joko yksinään tai yhdessä HBT:n, N-hydroksisukkinimidin, muun N-hydroksi-imidin tai oksiimin kanssa. Vaihtoehtoisesti 20 voidaan käyttää suojattuja aminohappojen aktiivisia es-tereitä (esim. nitrotenyyli- ja pentafluorifenyylieste-riä ja vastaavia) tai symmetrisiä anhydridejä.

Kiinteäfaasisynteesin lopussa täydellisesti suojattu polypeptidi irrotetaan hartsista. Polypeptidin ja • 25 hartsikantajan välisen sidoksen ollessa bentsyyliesteri-tyyppiä lohkaisu toteutetaan aminolyysillä, joka suoritetaan peptidien, jotka sisältävät C-terminaalisena aminohappona proliinin, tapauksessa alkyyliamiinilla tai fluorialkyyliamiinilla, tai aminolyysillä, joka suori-30 tetaan peptidien, jotka sisältävät C-terminaalisena aminohappona glysiinin, tapauksessa esimerkiksi ammoniakki-metanoli- tai ammoniakki-etanoliyhdistelmällä, noin 10-50°C:n, edullisesti noin 25°C:n, lämpötilassa reaktio-ajan ollessa noin 12-24 tuntia, edullisesti noin 18 tun-35 tia. Vaihtoehtoisesti peptidi voidaan irrottaa hartsista 92211 30 transesteröinnin avulla, jota suoritetaan esimerkiksi metanolilla ja jota seuraa aminolyysi. Suojattu peptidi voidaan tässä vaiheessa puhdistaa silikageelikromatogra-fian avulla. Sivuketjuja suojäävien ryhmien poisto poly-5 peptidistä toteutetaan käsittelemällä aminolyysituote esimerkiksi vedettömällä nestemäisellä vetyfluoridilla anisolin tai jonkin muun karboniumakseptorin ollessa mukana, vetyfluoridipyridiinikompleksilla tai tris(trifluo-riasetyyli)boorilla ja trifluorietikkahapolla, pelkistäkö mällä se vedyllä palladium-hiili- tai palladium-polyvi-nyylipyrrolidonikatalysaattorin ollessa, mukana tai pelkistämällä se natriumilla nestemäisessä ammoniakissa, edullisesti nestemäisellä vetyfluoridilla ja anisolilla noin -10 - +10°C:n, edullisesti noin 0°C:een, lämpötilas-k5 sa käsittelyajan ollessa noin 15 minuutista 1 tuntiin, edullisesti noin 30 minuuttia. Kun kysymyksessä ovat glysiiniterminaaliset aminohapot bentshydryyliamiini-hartseilla, hartsin lohkaisu ja suojauksen poisto voidaan yhdistää yhdeksi ainoaksi vaiheeksi, jossa käyte-20 tään hyväksi nestemäistä vetyfluoridia ja anisolia kuten edellä on kuvattu. Polypeptidi, josta suojaukset on poistettu täydellisesti, puhdistetaan sitten kromatografisten vaiheiden sarjalla, jossa käytetään jotakin tai kaikkia seuraavista vaihetyypeistä: ioninvaihtokromato-25 grafia-asetaattimuodossa olevalla heikosti emäksisellä hartsilla; hydrofobinen adsorptiokromatografia derivati-soimattomalla polystyreenidivinyylibentseenihartsilla (esimerkiksi Amberlite XAD:llä); silikageeliadsorptio-kromatografia; ioninvaihtokromatografia karboksimetyyli-30 selluloosalla; partitiokromatografia, esimerkiksi Sep- hadex G-25 vastavirtadistribuutio; ja suuren erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC), erityisesti käänteis-faasi-HPLC käyttäen kolonnin sidottu faasi - täytteenä oktyyli- tai oktadekyylisilyylisilikaa.

35 Käytettäessä 1-, 2-, 3- tai 6-asemassa raseemista aminohappoa diastereomeeriset nonapeptidi- tai dekapep- 92211 31 tidilopputuotteet erotetaan ja haluttu peptidi, joka sisältää asianmukaisessa asemassa D-aminohapon, eristetään ja puhdistetaan, edullisesti edellä mainitun kromatografisen prosessin aikana.

5 Peptideinä jotka sisältävät C-terminaalisen atsa- glysiiniamidin, valmistus toteutetaan edullisesti klassista peptidien liuossyntetisointia ja tunnettuja peptidiväli-tuotteita käyttäen. Tätä kuvataan yksityiskohtaisemmin esimerkissä 3.

10 Seuraavat esimerkit on esitetty, jotta alan ammat- ti-ihmiset kykenevät saamaan paremman käsityksen keksinnöstä ja soveltamaan sitä käytännössä. Niitä ei tulisi kä- r sittää keksinnön piiriä rajoittaviksi vaan pelkästään keksintöä valaiseviksi ja kuvaaviksi.

15 Valmistus A

3-(2-naftyyli)-DL-alaniini 3-(2-naftyyli)-DL-alaniini valmistetaan US-patent-tijulkaisussa nro 4 341 767 esitetyllä menettelytavalla.

N-asetyyli-3-(2-naftyyli)-DL-alaniinin valmistus ja 20 muuntaminen metyyli-N-asetyyli-3-(2-naftyyli)-DL-alaninaa-tiksi sekä D-isomeerin erottaminen toteutetaan US-patentti-julkaisussa nro 4 341 767 esitetyllä menettelytavalla.

Valmistus B

Bentsyyli-N -bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidino-. 25 diisopropyyli-D-homoargininaattitolueenisulfonaatti

Seokseen, joka sisälsi 5,24 g bent syy li-N^bent syy -likarbonyyli-D-lysinaattitolueenisulfonaattia (B. Bezus ja L. Zervas, J. Am. Soc. 83 (1961) 719) ja 1,72 ml di-isopro-pyylietyyliamiinia 60 ml:ssa dioksaania, lisättiin 1,89 g 30 N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidiä. Reaktioseosta sekoitet- 9221 1 32 tiin 100°C:ssa 6 tuntia, ja se jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja haihdutettiin, jolloin saatiin kiinteä aine. Kiintoaine suspendoitiin 20 ml:aan lämmintä DMF:ä, suspensio suodatettiin N,N’-di-isopropyyliurean poistamiseksi ja 5 suodos haihdutettiin, jolloin saatiin kiinteä aine. Bents-yyli-N ^-bentsyloksikarbonyyli-N,N'guanidinodi-isopropyyli-D-homoargininaattitolueenisulfonaatti saatiin valkoisena kiinteänä aineena kiteyttämällä se metanoli-etyyliasetaat-tiseoksesta; 10 [a]D - -7,26° (c = 0,3, MeOH).

Vastaavasti käyttämällä edellä kuvattua menettelytapaa mutta vaihtamalla N, N' -di-isoproj?yylikarbodi-imidin tilalle N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidi; N,N'-di-(n-heksyyli)-karbodi-imidi; 15 N,N'-dietyylikarbodi-imidi; N,N'-di-(n-propyyli)-karbodi-imidi? N-isopropyylikarbodi-imidi; N-propyy1ikarbodi-imidi; N-(n-butyyli)-karbodi-imidi; 20 N,N'-di-(n-butyyli)-karbodi-imidi; N,N'-di-isobutyylikarbodi-imidi; N,N'-di-(n-pentyyli)-karbodi-imidi; N,N'-di-isopentyylikarbodi-imidi; N,N'-difenyylikarbodi-imidi; 25 N,N'-ditolyylikarbodi-imidi tai l-(3-dimetyyliaminopropyyli)-3-etyylikarbodi-imidihydroklo-ridi tai vastaava saadaan bentsyyli-N °^-bentsyloksikarbo-nyyli-N,N’-guanidinodisykloheksyyli-D-homoargininaattia, [a]D = 8,07° (c « 0,9, MeOH) , bentsyyli-N °£-bentsyloksi-30 karbonyyli-N,N'-guanidinodietyyli-D-homoargininaattia, 92211 33 bentsyyli-N -bentsyloksikarbonyyli-N-N'-guanidinodi-(n-propyyli)-D-homoargininaattia, [a]D = 8,07° (c = 0,9,

MeOH), bentsyyli-N °^-bentsyloksikarbonyyli-N-guanidino-(n-propyyli)-D-homoargininaattia, 5 bentsyyli-N °^-bentsyloksikarbonyyli-N-guanidino-(n-butyy- li)-D-homoargininaattia, bentsyyli-N ^-bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodi-(n-bu-tyyli)-D-homoargininaattia, bentsyyli-N** -bentsyloksikarbonyyli-N,N-guanidinodi-isobu-10 tyyli-D-homoargininaattia, bentsyyli-N -bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodi-(n-pentyyli)-D-homoargininaattia, bentsyyli-N** -bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodifenyy-li-D-homoargininaattia, 15 bentsyyli-N ^-bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodimetyy- li-D-homoargininaattia, bentsyyli-N °*-bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodi-(n-heksyyli)-D-homoargininaattia j a bentsyyli-N <*-bentsyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodi-iso-20 propyyli-D-argininaattia, [a]D = -10,5° (c = 0,5, MeOH) , bentseenisulfonaattisuoloinaan. Vastaavasti korvaamalla D-lysinaatti bentsyyli-N ^-bentsyloksikarbonyyli-D-ornitinaa-tilla voidaan saada aikaan vastaavia arginiinianalogeja to-lueenisulfonaattisuoloinaan.

25 Valmistus C

Bentsyyli-N ^-bentsyloksikarbonyyli-N0, NG' , -eteno-D-homoargininaatti

Seokseen, joka sisälsi 15 ml tolueenia ja 15 ml t-BuOH:ta, lisättiin 2,71 g bentsyyli-N°^-bentsyloksikar-30 bonyylilysinaattia ja 1,46 g 2-metyylitio-imidatsoliini-hydrojodidia (saatavissa Aldrichilta). Seoksen pH säädettiin suunnilleen arvoon 8 di-isopropyylietyyliamiinia lisäämällä, ja liuosta refluksoitiin 24 tuntia.

9221 1 34

Liuos väkevöitiin alipaineessa, ja jäännös pakattiin silikageelipylvääseen (250 mg). Pylväs eluoitiin käyttäen CH2Cl2-MeOH-seosgradienttia suhteesta 19:1 suhteeseen 7:3. Tuotetta sisältävät jakeet tunnistettiin TLC:n avulla, 5 yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 2,9 g valkoista vaahtoa.

2 g:n erä edellä mainittua tuotetta liuotettiin 50 ml:aan EtOH:ta, joka sisälsi 0,8 g katalysaattoria, joka sisälsi 10 % Pd:a hiilikantoaineella. Liuosta sekoitettiin 10 H2;n alla 8 tuntia. Seos suodatettiin seliitin (piimään) läpi ja suodos haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 1,2 g N°,N°'-etanohomoarginiinia valkoisena väahtona.

Samalla tavoin mutta käyttämällä guanylointiaineena S-metyyli-3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidiinitiolia (Aldrich) 15 saatiin NG, Nc'-propanohomoarginiinia valkoisena vaahtona.

Vastaavasti mutta käyttämällä guanylointiaineena S-metyylibis-(2,2,2-trifluorietyyli)-tiouroniumjodidia saatiin Ng,Ng'-bis-(trifluorietyyli)-homoarginiinia (Bth) valkoisena vaahtona.

20 Valmistus D

N^-t-butyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodi-isopro- pyyli-D-homoarginiinitolueenisulfonaatti Tämä valmistusesimerkki valaisee N,N'-guanidinodi-substituoitujen D-homoarginiinien valmistamista tolueeni-. 25 sulfonaattiesiasteistaan.

Seosta, joka sisälsi bentsyyli-N°^-bentsyloksikar-bonyyli-N,N'-guanidinodi-isopropyyli-D-homoargininaattito-lueenisulfonaattia (3,25 g) ja 100 mg katalysaattoria, joka sisälsi 10 % Pd:a hiilikantoaineella, 50 ml:ssa jääetikkaa, 30 käsiteltiin vetykaasulla ilmakehän paineessa 4 tuntia. Ka talysaattori erotettiin suodattamalla seos seliitin läpi, ja suodos haihdutettiin, jolloin saatiin kiinteätä N,N'- 35 *2211 guanidinodi-isopropyyli-D-homoarginiinitolueenisulfonaat-tia. Liuokseen, joka sisälsi tätä yhdistettä (2,13 g) 60 ml:ssa dioksaani-vesiseosta (1:1), lisättiin 10 ml IN nat-riumhydroksidia ja 0,4 g magnesiumoksidia. Sen jälkeen tä-5 hän seokseen lisättiin 1,1 g di-(t-butyyli)-dikarbonaattia, ja sitä sekoitettiin huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Magne-siumsuola erotettiin suodattamalla ja suodos väkevöitiin alipaineessa. Emäksinen liuos pestiin etanolilla, ja sen jälkeen sen pH säädettiin arvoon 2,5 natriumsulfaatilla.

10 Hapan vesiliuos uutettiin etyyliasetaatilla, ja etyyliase- taattiliuos kuivattiin magnesiumsulfaatilla. Kuivausaine poistettiin suodattamalla, ja suodos haihdutettiin. Kitey-tys etyyliasetaatti-heksaaniseoksesta tuotti tulokseksi N -t-butyloksikarbonyyli-N,N'guanidinodi-isopropyyli-D-ho-15 moarginiinitolueenisulfonaattia.

Menettelemällä samalla tavalla mutta käyttämällä asianmukaisia tolueenisulfonaattiesiasteita voidaan valmistaa muita N-t-butyloksikarbonyyli-N,N'-guanidinodisubsti-tuoituja D-homoarginiini- tai D-arginiiniyhdisteitä.

20 Valmistus E

N 04 -t-butyloksikarbonyyli-3-[4'-(1'-propyylipiperi- dyyli)]-D-alaniini 400 ml:aan absoluuttista etanolia lisättiin 4,6 g natriummetallia ja seosta kuumennettiin. Tulokseksi saatuun 25 natriumetoksidiliuokseen lisättiin 21,7 g dietyyli(asetami- domalonaattia) ja 16,4 g 4-pikolyylikloridihydrokloridia (Aldrich Chemical Co). Reaktioseosta kuumennettiin 100°C:ssa 4 tuntia, ja se jäähdytettiin, suodatettiin ja väkevöitiin alipaineessa. Seos siirrettiin silikageelipyl-30 vääseen metyleenikloridi-metanoliseoksessa (19:1), ja eluointi suoritettiin samalla seoksella. Tuote paikallistettiin nopeasti liikkuvaksi UV-positiiviseksi täpläksi si- 9221 1 36 likageeliohutkerroskromatogrammissa (eluenttina metyleeni-kloridi-metanoliseos suhteessa 19:1). Yhdistetyt jakeet vä-kevöitiin, jolloin saatiin tuote.

Edellisen kappaleen mukainen tuote liuotettiin 200 5 ml:aan etanolia, ja tätä liuosta käsiteltiin liuoksella, joka sisälsi 2,72 g natriumhydroksidia 40 ml:ssa vettä, 50°C:ssa 6 tuntia. Liuos tehtiin happamaksi 12 ml:11a 6 N HCl:ä, se haihdutettiin kuiviin, ja jäännös sekoitettiin 200 ml:aan dioksaania. Suspensio suodatettiin, ja suodosta 10 refluksoitiin 2 tuntia. Liuos jäähdytettiin ja haihdutet tiin kuiviin, jolloin saatiin etyyli-N^-asetyyli-S-i 4-py-ridyyli)-DL-alaniinia valkoisena kiinteänä aineena.

Osa tästä N-asetyyliesteristä liuotettiin uudelleen käsittelemällä sit. 200 ml:11a subtilisiini Carlsbergilla 15 (Sigma Chem. Co., proteaasi VIII) seoksessa, joka sisälsi 300 ml dimetyylisulfoksidia ja 400 ml 0,01 M KC1. (pH 7,2). 6 tunnin kuluttua uudelleen liukeneminen oli täydellistä. Liuos laimennettiin 400 ml:11a vettä ja uutettiin neljällä 750 ml:n erällä etyyliasetaattia. Orgaaniset kerrokset yh-20 distettiin ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla sekä väkevöi-tiin, jolloin saatiin etyyli-N^-asetyyli-S-t4-pyridyyli)-3-alaninaattia öljynä.

Öljyn annettiin 1,22 g:n kanssa n-propyylibromidia 50 ml:ssa etanolia, minkä jälkeen liuos haihdutettiin kui-25 viin, jolloin saatiin etyyli-N**-asetyyli-3-(1-propyylipy-ridinium-4-yyli)-D-alaninaattibromidia valkoisena hygroskooppisena kiintoaineena.

Tämä valkoinen kiinteä aine liuotettiin 200 ml:aan etanolia ja pelkistettiin vetyatmosfäärissä käyttäen kata-30 lysaattorina 100 mg yhdistelmää, joka sisälsi 10 % Pd:a hiilikantoaineella 18 tunnin pelkistyksen jälkeen katalysaattori erotettiin suodattamalla ja liuos haihdutettiin, • · 92211 37 jolloin saatiin etyyli-N^-asetyyli-S-[4 '-(1'-propyylipipe-ridyyli)]-D-alaninaattia kullanruskeana kiinteänä aineena. Vapaa happo valmistettiin refluksoimalla etyyliesteriä 100 ml:ssa 6 H HCl:ä 4 tuntia, jolloin saatiin 3-[4'-(1'-pipe-5 ridyyli)]-D-alaniinia valkoisena kiinteänä aineena.

Vapaa happo liuotettiin 100 ml:aan dioksaani-vesi-seosta (1:1), ja liuokseen lisättiin 2 g di-(t-butyyli)-di-karbonaattia. pH pidettiin 9:nä pH-staatilla 1 N NaOH:ta lisäämällä. Kahden tunnin kuluttua reaktioseos väkevöitiin 10 alipaineessa ja pestiin 100 ml:11a etyylieetteriä, ja vesi-kerros siirrettiin Amberlite XAD-2 hartsipylvääseen (hydrofobinen hartsi). Pylväs eluoitiin 250 ml:11a vettä ja sen r jälkeen 250 ml:11a etanoli-vesiseosta (1:1). Etanolieluaa-tit yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 15 N^-t-butyloksikarbonyyli-S-[4'-(1'-propyylipiperidyyli)]- D-alaniinia valkoisena kiinteänä aineena.

Menettelemällä samalla tavalla mutta korvaamalla 4-pikolyylikloridihydrokloridi 3-pikolyylikloridihydroklori-dilla saadaan valmistetuksi N^-t-butyloksikarbonyyli-S-20 [3'-(1'-propyylipiperididyyli)]-D-alaniinia.

Valmistus F

Boc-Gly-O-hartsi 4,9 g Boc-glysiiniä liuotettiin seokseen, joka sisälsi 50 ml etanolia ja 50 ml tislattua vettä. Liuoksen pH 25 säädettiin arvoon 7 cesiumvetykarbonaatin vesiliuoksella.

Liuotin haihdutettiin sitten alipaineessa.

Sen jälkeen kun jäännöstä oli kuivattu 18 tuntia suuressa alipaineessa, se liuotettiin 150 ml:aan kuivaa DMF:ä. Liuokseen lisättiin 25 g kloorimetyloitua polysty-30 reenihartsia, joka sisälsi 1 % divinyylibentseeniä (Merri-field; 25 mmol:a kloridia vastaava). Seosta ravistettiin 50°C:ssa 24 tuntia, se suodatettiin, ja hartsi pestiin sen jälkeen peräkkäin DMF:llä, vedellä ja etanolilla. Hartsia kuivattiin alipaineessa 3 vuorokautta, jolloin saatiin 35 28,34 g Boc-Gly-O-hartsia.

92211 38

Valmistus G

A. S-metyyli-3,4,5, 6-tetrahydro-2-pyrimidiini- tiolihydrojodidi

Liuokseen, joka sisälsi 23,24 g 3,4,5,6-tetrahydro-5 2-pyrimidiinitiolia 175 ml:ssa MeOH:ta, lisättiin 15,57 ml Meiltä, ja seosta refluksoitiin 1,5 tuntia. Liuotin haihdutettiin alipaineessa ja jäännös suspendoitiin di-etyylieetteriin. Sakka erotettiin suodattamalla ja kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin 51,4 g S-metyyli-10 3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidiinitiolia valkoisina kiteinä.

B. N^-t-butyloksikarbonyyli-N ,N -propeno-L-ho- moarginiini S-metyyli-3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidiinitioli saatiin 51,4 g:sta HI-suolaansa suorittamalla partitio 15 CH2Cl2:n (300 ml) ja 4 N NaOH:n (50 ml) kesken. Tulokseksi saatu CH2Cl2-liuos väkevöitiin noin 100 ml:n tilavuuteen, ja siihen lisättiin noin 100 ml EtOHrta. S-me-tyyli-3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidiinitioliliuos lisättiin pisaroittain 60°C:ssa liuokseen, joka sisälsi 24 g 20 lysiinihydrokloridia 66 ml:ssa 2 N NaOH:ta. Sekoittamista jatkettiin yön yli 60°C:ssa typen alla. 10,78 g lisää HI-suolaa hajotettiin 15 ml :11a 4 N NaOHrta, uutettiin 90 %:sella CH2Cl2:lla ja lisättiin pisaroittain ja sekoittaen toiset 24 tuntia 60°C:ssa, jona aikana reaktio ; 25 meni suurin piirtein loppuun.

Reaktioseos pestiin kahdella EtOAc-erällä, ja Pha:ta sisältävä vesikerros laimennettiin 200 ml :11a dioksaania ja 200 ml:11a vettä. Liuos jäähdytettiin 0°C: seen, ennen kuin siihen lisättiin 33 mg di(t-butyyli)-30 dikarbonaattia ja 6 g MgO:ta. 4 g:n lisäerä MgO:ta ja 22 g:n lisäerä di-(t-butyyli)-dikarbonaattia saivat reaktion menemään loppuun.

MgO erotettiin suodattamalla seliitin läpi, ja suodos väkevöitiin alipaineessa puoleen tilavuudestaan.

35 Jäännös pestiin kahdesti dietyylieetterillä ennen siir- 39 92211 tömistä silikageelipylvääseen (750 g silikageeliä, joka oli pakattu pylvääseen CH^CNrssä). Pylväs pestiin 5 litralla CH^CN:. ja eluoitiin CH^CNrllä, joka sisälsi 10 % vettä (yht. 2 litraa), ja edelleen CH^CNrllä, joka sisäl-5 si 20 % vettä (yht. 5 litraa). Tuotejakeet paikallistettiin ohutkerroskromatografisesti silikageelilevyillä (CH^CN-HOAc-I^O-seos suhteessa 4:1:1). Tuotejakeet yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin 5,0 g tuotetta o 25 valkoisena vaahtona, jonka sulamispiste oli 96°C ja E°Ll^ ]_0 = 16,1° (c = 0,54, MeOH) , ja lisäksi 15 g lievästi epä puhdasta öljyä.

Samalla tavalla mutta käyttämällä asianmukaisia S-metyyli-N,N'-dialkyylitiouroniumhydrojodideja saadaan vastaavia N^-t-butyloksikarbonyyli-N ,N -dialkyylihomo-15 arginiineja.

Esimerkki 1 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-hArg(CH2CF3)2~ D-Tyr-Leu-hArg(CH2CF3)2~Pro-D-Ala-NH2 Otsikon mukainen yhdiste on esitetty tässä seli-20 tyksessä myös N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Bth- D-Tyr-Leu-Bth-Pro-D-Ala-NH2:na.

Beckman 990 Peptide Synthesizer-laitteen reaktio-astiaan laitettiin 0,758 g (0,5 mmol) bentshydryyliamino-polystyreenihartsia (Peninsula Labs., 0,66 mmol/g).

25 Ensimmäinen aminohappo liitettiin lisäämällä 0,284 g

Boc-D-Ala-OH:ta, 0,202 g Hbt:t. ja 3 ml 0,5 M di-iso-propyylikarbodi-imidiä. 3 tunnin liitäntäjakson ja hartsin pesun jälkeen tähän hartsiin lisättiin peräkkäin muut aminohapot synteesiohjelman mukaisesti seuraavasti: 30 Vaihe 1 CH2CL2~pesu kerran 1,5 min 2 suojauksen poisto CF3C02H-CH2Cl2-seoksella (1:1) kerran 1,5 min 3 suojauksen poisto cf3co2h-ch2ci2- 35 seoksella (1,1) kerran 30 min 4 40 >2211 4 Cl^C^-pesu kolmesti 1,5 min 5 trietyyliamiini-Ct^C^-seos (1:1) kahdesti 1,5 min 6 C^C^-pesu kolmesti 1,5 min 7 N -Roc-aminohappo liuotettuna 5 CB^C^-DMF-seokseen (1:1) kerran lisäys 8 N,N1-di-isopropyylikarbodi- imidiliuos (0,5 M) kerran lisäys 9 Ci^C^-huuhtelu ja -säilytys, liitäntä kerran liitäntä- 10 reaktio 2 tuntia r 10 CH2Cl2~huuhtelu kerran 1,5 min 11 Cl^C^-pesu kolmesti 1,5 min 12 etanolipesu kolmesti 1,5 min 15 13 Ci^C^-pesu kolmesti 1,5 min

Vaiheet 1-13 päättävät yhden aminohapon liitäntä-syklin, ja reaktion loppuunmeno voidaan tarkistaa nin-hydriinimenetelmällä /E. Kaiser et ai., Anal. Biochem.

34 (1970) 5957.

20 Hartsiin liitettiin aminohappoja peräkkäin käyt täen 2,0-3,0 -kertaista moolista ylimäärää kutakin suojattua aminohappoa sekä DIC:tä. Hartsi käsiteltiin peräkkäisten liitäntäsyklien aikana 0,26 9 g :11a Boc-Pro-OH:ta, 25 0,610 g :11a Boc-Bth-OH:ta, 0,311 grlla Boc-Leu-OH'^O:ta, 0,375 g :11a Boc-D-Tyr-OH:ta, 0,610 g:11a Boc-Bth-OH:ta, 0,380 g:lla Boc-Ser(bentsyyli)-OH:ta, 30 0,320 g:lla Boc-D-Pal(3)-OH:ta, 0,390 g:11a Boc-D-pCl-Phe-OH:ta, 0,400 g:lla Boc-D-Nal(2)-OH:ta ja 2,5 ml:11a etikkahappoanhydridiä.

Hartsi poistettiin reaktioastiasta, pestiin C^C^: 35 11a ja kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin 1,43 g 41 ill 11 suojattua polypeptidi-hartsiyhdistelmää. Peptidistä poistettiin suojaukset, ja se irrotettiin hartsista käsittelemällä yhdistelmää 25 ml:11a vedetöntä nestemäistä HF:. 2,5 ml:n anisolia (akseptori) läsnä ollessa Kel-5 F-reaktioastiassa 0°C:ssa 1 tunti, HF haihdutettiin ali paineessa, jäljelle jäänyt N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal (3)-Ser-hArg(CG2CF3)2-D-Tyr-Leu-hArg(CH2CF3)2~Pro-D-Ala-NH2 (HF-suolanaan) pestiin eetterillä. Jäännös uutettiin sitten jääetikalla (3 x 30 ml). Etikkahappouuttoliuos 10 haihdutettiin kuiviin. Puhdistamaton aine muunnettiin asetaattisuolaksi laskemalla se vedessä asetaattimuotoon muunnetun AG3-pylvään (heikosti emäksinen tertiaarinen amiinihartsi läpi. Eluaatin kylmäkuivaus tuotti tulokseksi 0,5 g puhdistamatonta peptidin asetaattisuolaa 15 valkoisena kiinteänä aineena.

Epäpuhdas peptidi puhdistettiin HPLCrn avulla Licroprep RP-18-pylväässä (25,40^um), jonka koko oli 2,5 x 100 cm ja joka oli saatettu tasapainoon 0,1 % CF3C02:ta CH3CN-H20-seoksessa (ΓΪ1) sisältävällä pusku-20 rilla (pH 2,5). UV-valoa absorboiva (280 nm) päähuippu, joka eluoitui siinä vaiheessa, kun pylväästä oli saatu noin 2 kertaa pylväin tilavuus eluaattia, kerättiin talteen ja haihdutettiin kuiviin sekä kylmäkuivattiin kolmesti tislatusta vedestä, jolloin saatiin 64 mg puh-25 dasta N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-hArg(CG2CF3)2~ D-Tyr-Leu-hArg(CH2CF3)2-Pro-D-Ala-NH2:ta, foC?^5 = -17,96° (c = 0,4, HOAc).

B. Menettelemällä samalla tavalla mutta käyttämällä mainittujen aminohappojen tilalla asianmukaista 30 A-, B-, C-, D-, E-, F-, G- ja J-aminohappoa valmistet tiin vastaavat dekapeptidit, joista on annettu esimerkkejä alla: 9221 1 42 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Mbh-D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)- D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3) -Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Na1(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Ty r-D-Pal(3) -10 Leu-3th-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Pne-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; 15 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-

Leu-3tb-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-3er-Arg-D-Trp-Ls'J-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ssr-Arg-D-Trp-20 Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-Pna-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal ( 3)-Leu-Pna-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-Tyr-O-Btb-Leu-8th-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Pha-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; and N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-3th-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2.

C. Menettelemällä samalla tavalla mutta korvaamalla 35 mainitut aminohapot asianmukaisella A-, B-, C-, D-, E-, | F-, G- ja J-aminohapolla saadaan valmistetuksi vastaa vat dekapeptidit, joista on annettu esimerkkejä alla: 92211 43 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-

Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-

Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Pne-D-Trp-Ser-Tyr-D-Mbh-Leu-Moh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Mbh-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; r N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pha- 1C Leu-Pha-Pro-D-AlaNH0;

Id / N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Pne-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-

Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; n-Ac-D-Na1(2)-0-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro'-D-AlaNH2; 2o N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg- D-Pal(3)-Leu-Mbn-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Tyr-

Leu-Den-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Tyr- 25 Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; 30 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-

Leu-8th-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr- 35 Leu-Deh-Prc-D-AlaNH2; 44 922Ί Ί N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Tyr-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH^; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Deh-D-Tyr-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Mbh-D-Tyr-Leu-

Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Pne-D-Trp-Ser-3th-D-Tyr-Leu- 3tn-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Pne-D-Trp-Ser-Pna-D-Tyr-Leu- ^ Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal (2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-pah-D-Trp-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Mbh-D-Trp-Lsu-Mbn-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ssr-Bth-D-Trp-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Pha-D-Trp-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Deh-D-Pal(3)-20 K Leu-Deb-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Mbb-D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-3tn-D-Pal(3)-’25 Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal (3)-Ser-Pha-D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-5er-Deh-D-Nal(2)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; 3Q N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Mbh-D-Nal(2)-

Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-T rp-Ser-3 th-D-Nal(2)-Leu-3tb-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Pha-D-Nal(2)-j5 Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; ll 92211 45 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-ΡεΙ(3)-Ser-Pal(3)-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2; 5 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3) - D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2; N_Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)-0-°al(3)-Leu-Mön-Pro-D-AlaNH2.

Esimerkki 2 10 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-hArg(CH2CP3)2- D-Tyr-Leu-hArg (Cf^CF^) 2-Pro-NHet C-terminaalisen Pro-NHCH^H^ :n sisältävien analogien syntetisoinnissa käytettiin esimerkissä 1 kuvatun synteesiohjelman kanssa identtistä ohjelmaa. Beckman 990-15 syntetisointilaitteen reaktioastiaan laitettiin 0,71 g

Boc-Pro-O-hartsia, joka oli valmistettu antamalla 1,3 kertaisen moolisen ylimäärän kuivaa Boc-Pro-OH:n cesiumsuo-laa reagoida 1 % divinyylibentseeniä sisältävän kloori-metyylipolystyreenihartsin (Lab Systems, Inc.) kanssa.

20 Käytetty määrä Boc-Pro-O-hartsia sisälsi 0,5 mmol proliinia.

Hartsiin liitettiin aminohappoja peräkkäin käyttäen 2,0-3,0-kertaista moolista ylimäärää kutakin suojattua aminohappoa sekä DIC:tä. Hartsin annettiin siis reagoida . peräkkäisten liitäntäsyklien aikana 25 0,610 g:n kanssa Boc-Bth-OH:ta, 0,311 g:n kanssa Boc-Leu-OH*H20:ta, 0,375 g:n kanssa Boc-D-Tyr-OH:ta, 0,610 g:n kanssa Boc-Bth-OH:ta, 0,380 g:n kanssa Boc-Ser(bentsyyli)-OH:ta, 30 0,320 g:n kanssa Boc-D-Pal(3)-OH:ta, 0,390 g:n kanssa Boc-D-pCl-Phe-OH:ta, 0,400 ml:n kanssa Boc-D-Nal(2)-OH:ta ja 2.5 ml:n kanssa etikkahappoanhydridiä.

Hartsi poistettiin reaktioastiasta, pestiin 35 0Η2012:1ΐ3 ja kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin 1.5 g suojattua polypeptidi-hartsiyhdistelmää.

9221 1 46 lyysillä, joka toteutettiin 25 ml:11a etyyliamiinia 2°C: ssa reaktioajan ollessa 18 tuntia. Etyyliamiinin annettiin haihtua, ja hartsi uutettiin metanolilla. Metanoli haihdutettiin, 2,5 ml:n kanssa anisolia ja 25 ml:n kans-5 sa uudelleen tislattua (CoF^ista) vedetöntä nestemäistä HF:ä Kel-F-reaktioastiassa 0°C:ssa 1 tunti. HF haihdutettiin alipaineessa, ja jäännös pestiin eetterillä. Jäännös liuotettiin 2 M etikkahappoon ja muunnettiin asetaattisuo-laksi laskemalla se vedessä asetaattimuotoon muunnetun 10 AC3-pylvään läpi. Eluaatin kylmäkuivaus tuotti tulokseksi 0,5 g puhdistamatonta peptidin asetaattisuolaa valkoisena kiinteänä aineena. Lopullinen puhdistus toteutettiin HPLC-pylväässä, jonka koko oli 2,5 x 100 mm ja joka sisälsi 40-50^um:n oktadekyylisilyloitua silikaa (Merck, Lichro-15 prep C-^g), käyttäen eluenttina 50-%:ista CH^CNiä (0,1 % CFgCC^Hita). Tuotteen kylmäkuivaus vedestä tuotti tulokseksi 70 mg N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-hArg-(Ci^CF^)2~D-Tyr-Leu-hArg(CI^CF^)2_ProNHEt:tä valkoisena jauheena.

20 Menettelemällä samalla tavalla mutta käyttämällä vaadittavia suojattuja aminohappoja saadaan valmistetuksi seuraavat yhdisteet: N-Ac-D-Nai(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-3th-Pro-NHEt, '25 N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-U-Pal(3)-Leu-

Mbh-Pro-NHEt, N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-NHEt, N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-30 Deh-Pro-NHEt, N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Nal(2)-Leu-3th-Pro-NHEt.

Toistettaessa edellä esitetty lohkaisu ja korvat-35 taessa etyyliamiini stökiometrisella määrällä metyyli-

II

9221 1 47 tai propyyliaraiinia saadaan vastaavia edellä mainittujen nonapeptidien metyyli- tai propyyliamideja»

Esimerkki 3

Yhdisteitä, jotka vastaavat kaavaa (I), voidaan 5 valmistaa myös klassisella liuossynteesillä.

Esimerkiksi kahden pentapeptidifragmentin yhteen liittämisessä voidaan käyttää seuraavaa menettelytapaa: N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe- 3oc-0eh-Leu-Den-Pro-D-Ala-NH2 10 ΰ-Pal(3)-Ser-Tyr-OMe (1) (2) — . v — H-D-Deh-Leu-Deh-Pro-D-Ala-Nlj 7 N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-15 D-Pal ( 3)-Ser-Ty r-i^3 H-D-Deh-

Leu-Deh-Pro-AzaGlyNhio (3) 7 N-Ac-D-Nal(2)-D-p-Cl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Deh-2q Leu-Deh-Pro-D-Ala-NH2

Erillisten fragmenttien liittäminen yhteen voidaan toteuttaa asyyliatsidimenetelmällä (J. Honzel et ai.,

Coll. Czech. Chem. Commun. 26 (1971) 2333), DCC/HBT-lii-•25 tännällä, difenyylifosforyyliatsidiliitännällä tai jolla kin muulla rasemisoimattomalla fragmenttien liitäntätek-niikalla. Yhdiste (2) voidaan valmistaa edellä esitetyllä tavalla, ja yhdiste (1) voidaan valmistaa esimerkissä 1 kuvatun kaltaisilla menetelmillä. Yhdiste (3) valmis-30 tetaan yhdisteestä (2) poistamalla Cbz hydraamalla, mitä seuraa N-Boc-N,N1-guanidinodietyyli-D-homoarginiinin liittäminen DCC-HBT-yhdistelmää tai jotakin muuta, alalla tunnettua liitäntäainetta käyttäen.

Tällä tavalla yhteen liitettävät fragmentit ovat 35 usein peptidejä tai aminohappoja. Vaihtoehtoisesti N-ter- 9221 1 48 minaalinen nonapeptidi voidaan valmistaa kiinteäfaasi-tai liuosmenetelmällä ja liittää sen jälkeen alkyyliamii-niin tai semikarbatsidihydrokloridiin disykloheksyyli-karbodi-imidin ja hydroksibentsotriatsolin avulla tai 5 jollakin muulla liitäntämenetelmällä, jolloin saadaan vastaavan kaltaisia yhdisteitä.

Esimerkki 4

Suolojen valmistus A. Liuos, joka sisälsi 0,1 g (N-Ac-D-Nal(2)^, 10 D-pCl-Phe2, D-Pal(3)3,8, Btn8 , D-Ala^"8)LHRH:n vetyfluori-disuolaa (ts esimerkki 1) liuotettuna 50 ml:aan vettä, r laskettiin pylvään läpi, joka sisälsi 50 g Dowex 3-anio-ninvaihtohartsia, joka oli saatettu tasapainoon aikaisemmin etikkahapolla ja pesty deionisoidulla vedellä.

15 Pylväs eluoitiin deionisoidulla vedellä ja eluaatti kylmä-kuivattiin, jolloin saatiin vastaavaa (N-Ac-D-Nal(2)^, D-pCl-Phe2, D-Pal(3)3'6, Bth8, D-Ala10)LHRH:n etikkahappo-suolaa.

Toistettaessa edellä esitetty menettely mutta kor- 20 vattaessa etikkahappo muilla hapoilla hartsin tasapainotuksessa voidaan valmistaa esimerkiksi vastaavia suolahapon, bromivetyhapon, rikkihapon, fosforihapon, typpihapon, bentsoehapon sekä muiden samankaltaisten happojen suoloja.

25 Vastaavasti voidaan valmistaa muita LHRH in kanssa analogisten peptidien, joita tässä selityksessä on esitetty, happoadditiosuoloja.

B. Suoloja, joiden vesiliukoisuus on heikko, voidaan valmistaa vedestä saostamalla haluttua happoa hyväk- 30 si käyttäen. Esimerki ks i i

Sinkkitannaattisuola - Liuos, joka sisälsi 10 mg (N-Ac-D-Nai(2)1, D-pCl-Phe2, D-Pal(3)3'6, Bth8, D-Ala10)LHRH:n etikkahapposuolaa 0,1 ml:ssa vettä, käsiteltiin liuoksella, joka sisälsi 8 mg parkkihappoa 0,08 ml:ssa 0,25 M

35 NaOH:ta. LHRH-analogin liuokseen lisättiin välittömästi li 92211 49 liuos, joka sisälsi 5 mg ZnSO^·71^0:ta 0,1 ml:ssa vettä.

Tulokseksi saatu suspensio laimennettiin 1 ml :11a vettä, ja sakka erotettiin sentrifugoimalla. Supernatant-ti poistettiin dekantoimalla, ja jäännös pestiin kahdesti 5 1 ml:n erillä vettä sentrifugoimalla sakka ja dekantoi malla supernatantti. Sakka kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin 15 mg edellä mainitun LHRH-analogin sinkki-tannaattisekasuolaa.

Pamoaattisuola — Liuokseen, joka sisälsi 50 mg 10 (N-Ac-D-Nal(2)1, D-pCl-Phe2, D-Pal(3)3'6, Bth8, D-Ala10)-LHRH:n etikkahapposuolaa seoksessa, joka sisälsi 1,6 ml etanolia ja 0,1 ml 0,25 M NaOH:ta, lisättiin liuos, joka sisälsi 11 mg pamonihappoa 0,3 ml:ssa 0,25 M NaOH:ta. Liuottimet poistettiin alennetussa paineessa, jäännös 15 suspendoitiin 2 ml:aan vettä, suspensio sentrifugoitiin, ja supernatantti dekantoitiin. Sakka pestiin 1,5 ml:11a vettä ja sentrifugoitiin, ja supernatantti dekantoitiin. Sakka kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin 54 mg edellä mainitun LHRH-analogin pamoaattisuolaa.

20 Samalla tavalla voidaan valmistaa muitakin suoloja, joiden vesiliukoisuus on heikko.

C. Happoadditiosuolan valmistus vapaasta peptidistä

Liuokseen joka sisälsi 50 mg (N-Ac-D-Nal(2)^, * 25 D-pCl-Phe2, D-Pal(3)3,6, Bth8, D-Ala10)LHRH:ta vapaana emäksenä, lisättiin 30 ml 1 N etikkahappoa. Tulokseksi saatu liuos kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 50 mg edellä mainitun LHRH-analogin etikkahapposuolaa.

Vastaavasti korvattaessa etikkahappo muilla hapoil-30 la (stökiometrisesti ekvivalenttisina määrinä suhteessa peptidiin) saadaan muita tässä selityksessä esitettyjen peptidien happoadditiosuoloja, esimerkiksi suolahapon, bromivetyhapon, rikkihapon, fosforihapon ja typpihapon suoloja.

35 D. Metallikationin muodostaman suolan, esimerkik si sinkkisuolan, valmistus

Liuokseen, joka sisälsi 50 mg (N-Ac-D-Nal(2) , 92211 50 D-pCl-Phe2, D-Pal(3) 3'6 , Bth8, D-Ala10)LHRH:n etikka-happosuolaa seoksessa, joka sisälsi 0,4 ml 0,25 M NaOH:ta, 0,3 ml vettä ja 1 ml etanolia, lisättiin liuos, joka sisälsi 15 mg ZnSO^ · 7^0: ta 0,2 ml:ssa vettä. Sakka sentri-5 fugoitiin ja supernatantti erotettiin dekantoimalla. Sakka pestiin 1 ml :11a vettä sentrifugoimalla ja dekantoimalla supernatantti. Sakka kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin edellä mainitun LHRH-analogin sinkkisuolaa.

Samalla tavalla voidaan valmistaa suoloja muiden 30 moniarvoisten kationien, esimerkiksi kalsiumin, vismutin, bariumin, magnesiumin, alumiinin, kuparin, koboltin, nikkelin, kadmiumin ja muiden samankaltaisten, kanssa.

Esimerkki 5

Suolojen muuntaminen vapaaksi emäkseksi 15 Liuos, joka sisälsi 50 mg (N-Ac-D-Nal(2) D-pCl-Phe2, D-Pal (3) 3'8, Bth8, D-Ala^) LHRH : n etikkahappo-suolaa 25 ml:ssa vettä laskettiin pylvään läpi, joka sisälsi 50 g Dowex l:tä (voimakkaasti emäksinen ammonium-anioninvaihtohartsi), joka oli tasapainotettu NaOH-liuok-20 sella hydroksidivastaionin aikaansaamiseksi. Pylväs elu- oitiin 150 ml:11a vettä, ja eluaatti kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 45 mg vastaavaa polypeptidiä vapaana emäksenä.

Muut tässä selityksessä esitettyjen peptidiyhdistei-den happoadditiosuolat, esimerkiksi esimerkissä 6 maini-25 tut, voidaan muuntaa vapaiksi emäksiksi vastaavalla ta valla.

Esimerkki 6

Farmaseuttiset formulat

Seuraavat ovat tyypillisiä farmaseuttisia koostu-30 muksia, jotka sisältävät vaikuttavana aineosana jotakin tämän keksinnön mukaista LHRH:n antagonistia, esimerkiksi (N-Ac-D-Nal(2)1, D-pCl-Phe2, Pal(3)3'6, Bth8, D-Ala10)-LHRH:ta sellaisenaan tai farmaseuttisesti hyväksyttävänä suolanaan, esimerkiksi etikkahappoadditiosuolana, sinkki-35 suolana, sinkkitannaattisuola tms.

9221 1 51 A. Tablettiformulat 1. LHRH:n antagonistia 10,0 mg

Puristettavissa olevaa sokeria, USP 86,0 mg

Kalsiumstearaattia 4,0 mg 5 2. LHRH:n antagonistia 10,0 mg

Puristettavissa olevaa sokeria, USP 88,5 mg

Magnesiumstearaattia 1,5 mg 3. LHRH:n antagonistia 5,0 mg

Mannitolia, USP 83,5 mg 10 Magnesiumstearaattia, USP 1,5 mg

Esigelatinoitua tärkkelystä, USP 10,0 mg 4. LHRH:n antagonistia , 10,0 mg

Laktoosia, USP 74,5 mg

Esigelatinoitua tärkkelystä, USP 15,0 mg 15 Magnesiumstearaattia, USP 1,5 mg

Valmistusmenetelmä (a) LHRH:n antagonisti liuotetaan riittävään määrään vettä, jotta muodostuu märkä granulaatti, kun siihen sekoitetaan sokeriosuus täyteaineista. Täydellisen se- 20 koittumisen jälkeen granulaatti kuivataan lautasella tai leijukerroskuivurissa. Kuiva granulaatti seulotaan mahdollisten suurten aggregaattien hajottamiseksi, ja sen jälkeen siihen sekoitetaan jäljellä olevat aineosat. Granulaatti puristetaan sitten tavanomaisella tabletointiko-•25 neella määrätyn massan omaaviksi tableteiksi.

(b) Tässä valmistusmenetelmässä kaikki formulat sisältävät 0,01 % sisältävät 0,01 % gelatiinia (USP). Gelatiini liuotetaan ensin granulointiliuottimena toimivaan veteen ja sen jälkeen liuotetaan LHRH-analogi. Loput 30 vaiheet on samanlaisia kuin edellä kohdassa (a).

Formulaa 4 voitaisiin käyttää myös suun kautta annettavana tablettina.

9221 1 52 B. Pitkävaikutteinen lihaksensisäisesti injektoitava formula 1. Pitkävaikutteinen lihaksensisäinen ruiske-sesamöljygeeli 5 LHR:n antagonistia 10,0 mg

Alumiinimonostearaattia, USP 20,0 mg

Seesamiöljyä gs ad 1,0 mlsksi

Alumiinimonostearaatti ja seesamiöljy yhdistetään ja yhdistelmää kuumennetaan 125°C:ssa samalla se-10 koittaen, kunnes muodostuu kirkas keltainen liuos. Sen jälkeen tämä seos autoklavoidaan steriloinnin suoritta- r miseksi ja sen annetaan jäähtyä. Sitten lisätään LHRH-analogi aseptisesti samalla trituroiden. Erityisen edullisia LHRH-analogeja ovat heikosti liukenevat suolat, 15 esimerkiksi sinkkisuolat, sinkkitannaattisuolat, pamo- aattisuolat ja vastaavat. Niillä on poikkeuksellisen pitkä vaikutuksen kesto.

2. Pitkävaikutteinen lihaksensisäinen ruiske -biologisesti hajoavasta polymeeristä valmiste- 20 tut mikrokapselit LH.RH:n antagonistia 7 % 25/75 glykosidi/aktidikopolymeeriä 93 % (ominaisviskositeetti 0,5}

Edellä olevan formulan mukaiset mikrokapselit sus-'25 pendoidaan seuraavaan liuokseen:

Dekstroosia 5,0 %

Natrium-CMC:tä 0,5 %

Bentsyylialkoholia 0,9 %

Tween 80:ä 0,1 % 30 Puhdistettua vettä gs 100,0 %:ksi 25 mg mikrokapseleita suspendoitiin 1,0 ml saan väliainetta.

C. Lihaksensisäisesti ruiskutettava vesiliuos LHRH:n antagonistia 0,5 %

Etikkahappoa 0,02 mol/1 35 Bentsyylialkanolia 0,9 %

Mannitolia 3,5 % 92211 53

Propyleeniglykolia 20 %

NaOH:a pH:n säätämiseksi arvoon 5

Vettä gs 100 %:ksi

Etikkahappo, bentsyylialkoholi, mannitoli ja 5 propyleeniglykoli liuotettiin 90 %:iin vesimäärästä.

Tähän liuokseen liuotettiin sitten LHRH:n antagonisti, ja pH säädettiin NaOH:lla. Lisättiin puuttuva vesimäärä. Liuos suodatettiin l^um:n suodattimen läpi, pakattiin pieniin lääkepulloihin ja steriloitiin autoklaavikäsittelyllä. 10 D. Nenään annettava vesiformula LHRH:n antagonistia 50 mg 0,02M asetaattipuskuria ’ 5 ml

Natriumglykokolaattia 500 mg 0,02M asetaattipuskuria, pH 5,2 10 ml:ksi 15 E. Rektaalisesti annettava formula

Peräpuikko: LHRH:n antagonistia 5,0 mg

Witepsol H15:tä 20,0 g LHRH:n antagonisti yhdistettiin sulaan Witepsol 20 Hl5:een, ne sekoitettiin hyvin ja seos kaadettiin 2 g:n muotteihin.

Esimerkki 7

Edellä olevien esimerkkien mukaisesti valmistettujen yhdisteiden karakterlsointitiedot on esitetty tau-25 lukoissa 1 ja 2: 9221 1 54 5^Sq£5|S? <u ί ? ? ; ο ί ϊ q ? ϊ ϊ ϊ : ϊ s ί ί. -.

*SJ s · ; » f d s s -. J £ 7 s d 5 5 d -. S ~ 5 2 s 1; q = 2

CJ 0^0^ 0 0 0°0 Z · O O O O o O O O O O O O o o o o O

o o°o°ooooo °°ουοουυουοουοοοοοο

Dj w ϊ Γ Γ Γ ~ ” ·" · · 1 * · · · · *.

W «ro .ο · νη«τΓΜΐο«Γ O 0 ωττΌιηω^’^^σ'^ — «riD^r^lO^ <B(Mi^r~C7'Or'^(N1 ΚΊΡ- — CiOOiinOiiNCNO^ ^'JDDO β d d d d d d O d d d d d d - d d d d d d d s d d -· d «2 s 0 I I I I 7 7 7 I Il III..............

Bj-h ro tn 'S C (si>£)ffl<N(N-CNOO (NnJin-r.niN.ncOKicor^ao.nKimrNiNao g J PJm“dd«r^^^ flCfll------------- ij SH oddöddodi iiiNNAoiiii^siiooi <3 ro °,οίκι?;««ΐ; ,£ιΐκ'!ί3ΣϋΖ--------Σ-- * * * * * * X ¥ ’ jr _ x x x _j x x x ϊ5 ¥ο"ϊξτ ¥=^ ¥ x —i — x_j— rxx j o —ι oj d~2 5o" d ¥ x x "ccTi x X X— «3 _| — < O O _l (T ΤΚ — — — e

X X «3 — — ro i — — 1— X X X <o < ia O X

x x— < o — a c o o _i x X _i — i-- x _i x _J < I „ - <_·-- - r ί < a < o s -

— e — I o X «3 I CO < < «3 0 X —O I . I — XO

O XOQ.XgXX — Q CN | ---JO — Q o o < _J — — _j — .CO χΧθία;<.— oo< O--«3 · m « I X — o «IX— «3 CO (N X _l X χ | CO K> . .| — O «3— xao— ® o X © — „1 _~o — - — J — _|JQ — u. co co Q<— — < X X X — <N — . X — < < X — <iri m — o — — . (Mo m— .1 c < i χχΧ —x neo _i «3 i 4-> I _| O I (M U- O — O O CD ΓΜ — (M30 C3 - I0XX_!=0+- — — — O [n O — — O— O— «3— — -ui (N + (M . < O «_J_I — fflwUJ <Ό < « ti

_. «O < . ΚΊ «N «3 — O O CN w (j X U Λ O I »<D — —O — &>-*-— 1 CO O

1 1 f— — I CO Li. X — < — — -t-OIwO — «I NO® "«O O — OI L Cl UI «θ'1 V

Φ OQ — O u < i < < U l- OI w OILI. — «»O — — — Ol.<l_w— « + Vr

0.0 — . (N TN w I O I I - < L Cl L (J IOD0 — (MOO — <jC<Ot<<DLU

α.<Β<·ΧοιΟ •Oooii:<L<"lii,'iNX--<r .cli * ,Η

y£ . I * UJ o L. *0O - . l. . 2 < .c X O — X O < < I . © . < O ΙΟ K> 7J

© o in — w < go mco αο <\θ . 2; . o (N (\U —' ι ι o © i°io JZ - — u_

—i - - VO .vOwXX — Cl O O . — — — .CO (NO (O

3 (SlO — L. L. . (N (N — — . (M — LO — CTlOOOlL. - -00 — (M υ m — -t- (N , ,

-4~ί03<<ιη-κχθ (*>0 -t- — K>(Ml_wwL.<00CO -Λ 3 X < — (NLUX +J

Lii — co -c — iu o m u_ — ujo — 4-^σισι<£ — — — χοι-υ^-^Ο

3 w (N w . -IOwwwO (Mwrn (N 11J X L L £ - (N— (Nww>. — LtJ OI— . I

m oi x oim >o w οι σι ci m +. σι— X— -<< -in -t- οχαισιχχ — i_oi -u

l-Ol-Olu — L-l-L-JLilLClO Olin c cm OILUOQULL.W— OI<L. (U

Eh <“< 1- >.«I<<<0 — < ud L. C7) - . OI L - ~ < C l/l UI L^< m * L. · »I «, « · I 5 L.^< CTO)< «L.U1.I | _I _1 ^ Jj · ^ O < Ό Ό Q Ό Ό Ό < q I c I v£ 1. L· ·νΟ <<<QQ * · ·· λ . . i . . “ . * * · < J · o 5 n . < <0 » £ £ £ . ,<0 Ό Ό Ό * 9

I m ΙΟ ΚΙ ΙΛ ΙΟ ΙΟ £ ι ΙΟ » ι *K> ** tr\ * * * * ίΛ «H

—‘C--''-*-.—**-*-«· -1<Ö Q m Λ ΚΛ ^ VO Ό K> —H vO Ό Ά « —« ΙΟ IO - W

m ^ ·λ»λ* · ,

w w ΚΛ '-'’»-'^^wwwK^KN wKNtO K^wfOK\fO -P

4-) — O.—- — — _ — — 0.0.— ^ Q.W — CL CL ^ “ ^O.a. — — ww'—

rrt Cl-Ul-iQiQ — — — — UJ

_ι 0-Η·0-0_ο^ο^0_β_0_^_^_η «}μ— onf—»— OQ-h— h->— q_q_ ta O <3 ΙΠ •H * ι » ι I ι I I 11110.10.11 I Q- I I · l||Q_Q_Q-Q-» S-

QQOQqqQOQqqqi q| qQQ I QQOQQQI! I'O C

-G (V (N NNNN(NNNN(N(N ·<Ν m. (NJ <N CN »CM CMCMCMCMCM » . » »CM —_J

>H ΦΦΦΦφφΦΦΦφφφΓΜ φ (N φ Φ Φ (N Φ Φ Φ Φ φ φ CM (N <N CM Φ 7_J

οοοοοοθοοοοοιΙυίοοοιίυοοοοοχχ^υ.υ O

Ρ,ί1·ί^Ρ·{ίΛ?,Ρ'Ρ·^{ΐο.ΐ£ΐα£ΐΛ^^^0ι^^{χααα0.^Ρ· o 1'JLi. ‘ ι ill ΓγΡιγγιι ι il ι ι ΐιιιιΐ ι ι t*<

OOQQqqQQCqqqqqqqQOOQQOQqqqqQOQ

*_*_*—*_*_*_ td ^^^^ΓΜ<Ν^^^ΓΜ(ΝΓΜΓΜΟΜ(Ν(Ν^ΓΜΓΜΓΜΓΜΓΜΓΜΓΜθ^^ίΝθΜΓΜ(Ν 'q

— e — — — » — — — » ^ — m m m m — — — — — — — — — C

ΠΠ'?Π!' e ' ?<f «

y^J.y.yyuyy.UyUOOUUUUOUUOUUuUUUUOU

O Α'·'»·1±Λ«»»·ΙΙ|Ι»ΙΙ··ΙΙΙΙΙ·«Ι m

y ZZZZZZ222ZZ222222ZZZZZZZZZZ222 W

m ---- .μ I <0 I k> ζ/] (T'^r^rrocTLmCDOO^rOO^inovOvOfNr^fO^TCDC' — — ^ocm — cm ^ KO CD — ^(N-^TS^r^OCD — cMCMOCDCMCMOinm — aDK*iOOK^ n κι n <o - lO^^co^^-iocMefN — σ' — ιηρ^Ονύκ^^ροΓ^αοΌ·” Il --mm-ioir^flS'OiO'O-CDONOOiDOOV'iVvnvv^'t Ό * 9221 1 55

Taulukko 2 Aminohappoanalyysit 1_5 (RS-26334): Ser 0,96 (1); Pro 0,96 (1); Ala 0,98 (1); Leu 0,95 (1); Tyr 1,07 (1); Lys 5 0,09 (0); NH3 1,82 (1); Trp 2,12 (2); p-Cl-Phe 1.00 (1); hArg(CH2CF3 )2 0,89 (1) ; Nai(2) 1,09 (1).

21 (RS-26126): Ser 1,01 (1); Pro 0,99 (1); Ala 0,98 10 — (1); Leu 0,95 (1); Lys 0,20 (1); NH3 1,27 (1); Arg 1,08 (1); Pal(3) 2,10 (2); p-Cl-Phe 1,11 (1); hAfg(CH2CF3) 0,79 (1) ; Nai(2) 1,02 (1) .

15 22 (RS-26906): Ser 1,03 (1); Pro 0,97 (1); Ala 0,98 (1); Leu 0,90 (1); NH3 2,25 (1); Trp 2.30 (2); Arg 1,12 (1); p-Cl-Phe 1,03 (1); hArg(CH2CF3)2 0,99 (1); 2Q Nai(2 ) 1,12 (1).

31 (RS-64736): Ser 0,84 (1); Pro 0,89 (1); Ala 0,99 (1); Leu 1,01 (1); Lys 1,05 (1); N H 0,91 (1); hArg(Et2) 1,04 (1); Pal(3) : 25 2,42 (2); p-F-Phe 1,21 (1); Nal(2) 1,13 (1).

32 (RS-64802): Ser 0,92 (1); Pro 0,95 (1); Ala 1,01 (1); Leu 0,99 (1); Lys 1*01 (1); NH3 30 0,96 (1); hArg(Et2) 1,02 (1); Pal(3) 2.30 (2); p-F-Phe 1,15 (1); Nal(2) 0,96 (1).

39 (RS-12972) : Ser 0,76 (1); Pro 1,06 (1); Ala 0,89 (1); Leu 1,04 (1) ; Tyr 1,07 (1); 35 p-Cl-Phe 1,17 (1); NH3 1,03 (1);

Pal(3) 2,10 (2); hArg(C2H5, - CH2CF3) 1,66 (1); Nai(2) 1,14 (1).

92211 56

Yhdisteiden biologinen aktiivisuus (a) Testosteronitasojen aleneminen

Testosteronitasojen aleneminen mitattiin seuraavaa testausmenettelyä käyttäen: 5 Suoritettiin kaksi tutkimusta käyttäen toisessa 11 ja toisessa 13 täysikasvuista, urospuolista, intaktia be-aglekoiraa (iältään 1,5-6,5 vuotta, toimittaja Syntex, LRE, Ridglan tai White Eagle). Kullakin viikolla 6 viikon ajan eläimet jaettiin sattumanvaraisesti johonkin 11 tai 10 13 annosryhmästä (apuainetta tai erilaisia annoksia ku takin LHRH:n antagonistia) niin, että kuhunkin ryhmään f tuli 6 koiraa. Ryhmään 1 kuuluneet saivat yhtenä ihonalaisena ruiskeena 0,1 ml apuainetta ruumiinpaino-kg:a kohden. Muihin ryhmiin kuuluneet eläimet saivat jäljem-15 pänä esitetyssä luettelossa 1 esitetyt annokset (^,ug yh- distettä/Q,l ml:n ruisketilavuus/ruumiinpaino-kg). Väliaineena oli propyleeniglykolin ja fysiologisen suolaliuoksen seos suhteessa 1:1. Kultakin koiralta otettiin pään valtimon kautta juuri ennen ruiskeen antamista ja 30 mi-. 20 nuuttia sekä 1, 2, 4, 6, 8 ja 24 tuntia ruiskeen annon jäl keen noin 3 ml:n hepariinipitoinen verinäyte. Verinäytteen sijoitettiin välittömästi ottamisen jälkeen jäihin. Plasma erotettiin sentrifugoimalla ja imusuodattamalla 2 tunnin kuluessa ja säilytettiin -20°C:ssa ennen testoste-*25 ronitasojen RIA-määritystä.

Testosteronitasot mitattiin radioimmunologisella määrityksellä. Näiden kahden tutkimuksen tulokset yhdistettiin, ja piirrettiin testosteronitasoja annostasojen funktiona kuvaava käyrä ID^Q-arvojen (annos, joka vaadi-30 taan testosteronitason alentamiseksi 50 %:iin maksimiar vostaan 8 tunnin aikana) saamiseksi. Nämä arvot on esitetty taulukossa 3, jossa on esitetty myös teho suhteessa LHRH:n standardiantagonistiin Detirelix (RS-68439).

*22 i 1 57

Luettelo 1 Annosryhmät

Tutkimus 1 (11 annosryhmää):

Ryhmä Yhdiste (RS-nro) Annos 1 Apuaine 2 RS-26306 0,06yg/0,Imi/kg 3 RS-26306 0,25yg/0fImi/kg 4 RS-26306 1,Oyg/O,lml/kg 5 RS-26306 4,0yg/0,Imi/kg 6 RS-26306 16,0yg/0,lml/kg 7 RS-26723 Ό,06yg/0,lml/kg 8 RS-26723 0,25yg/0,lml/kg 9 RS-26723 1,Oyg/Q,lml/kg 10 RS-26723 4,Oyg/0,lml/kg 11 RS-26723 16,Oyg/0,lml/kg

Tutkimus 2 (13 annosryhmää)

Ryhmä Yhdiste (RS-nro) Annos 1 apuaine 2 RS-68A39 (standardi) 0,25 yg/0; lml/kg 3 RS-68439 (standardi) 1,0 yg/o?imi/kg A RS-68439 (standardi) 4,0 yg/0?lml/kg 5 RS-68439 (standardi) 16,0 yg/0,lml/kg 6 RS-15378 0r25 yg/0,lml/kg 7 RS-15378 1,0 yg/0,lml/kg 8 RS-15378 4,0 yg/0flml/kg 9 RS-15378 16,0 yg/0,lml/kg 10 RS-15678 0,25 yg/0;lml/kg 11 RS-15678 1,0 yg/0,lml/kg 12 RS-15678 4^0 yg/0,lml/kg 13 RS-15678 16,0 yg/Qjlml/kg 92211 58

C A

ω c 00 ^ 'c o O -a- cn co co tj ·* «·*.

03 O *—10 la r~.

G -H ^ ^ w w v_ Q) 4-> rH’ri CJICTCTCT CT r* 3 a s * « « * §

ci i % % SS S

r-inj- ΓΛιΛ CA<r ΓΑ 5 o U .¾ _ csT irT o' <-T Λ 03 -H CO ° ro o P £, 00 ϋ -s SS I s G O 03 m 0) O U 03 o X o

G 3 ^ -U o W

^ S Q j3

+> 4J G £ S -H

to 0) a) ^ M 3

0 03 03 - ^ -H

4J X X Λ M

03 3 3 -'CO LA'-' w "S

<U E -*-· I {τι ·~* * .^h g

^ -H 3 -in y ^ w ^ "" Z

λ ς 1 4-1 ·Η G ^ lu tT1 *3 n 5 .5 C O \ £ -C r: £ <r 0 O £4 ^ O G 4-1 VD C4 34

> 8 S 03 S ® Ό <r co λ S

•h cu tn a) t!

> 4J -rH X rt W

03 r-4 .-H O

ΓΗ o Ή G >H — 4-1

4J (I) O (D O W

0) Ό -H 03 £ 03 (U >ι4-Ι M Φ 4->

” ^ ί Λ 2 - « VO VO v£> VO G

2 -4 -4 ^4 -4 >—I O

03 I I | I I -H

•H (rt | 4J 4-J

> c ti 0) vo la m o h & a s .g °i a 3 a su 1 ° ° ° ° o -g

X G -H G G —' -H

<0 _ <0 03 (o φ

... ‘c ro 4-> *\ ,« S

Sslas? ί ί .χ s ί Sä!J-N V "L "L "L £ ί

03 Λ KV IA IA i—‘S

. -H fA ^w —ο 10

G n w i -4 —· -1-4 C

O £ rj Q£ ro ro ro re s )± ro X Q_ X CL Q_ —4 2* 'T Q- —l i gc i idjj 5 *"· q a ^ q ^ Q o i a

c Ό ° Q.cP aj“q 'S

ro S Έ- <N -4 03 o ωχ U CO S

10 ro N £ 2Ξ roro £;^h -Cq; r; c ί 5 0- ro CL X CL 04 ? c 2 ί1 i M 1 -4 I_| 14-iro ·· C L Ti r-T^ I ι-H ci *-H r—1 H y § 5 ä ?2„ Ui 8 ΐ £ SS g ° 3 4 -r A< ° s ° 1 » I * i"b ° "b x" ^ ^ i CL J, 8 •m Q CsiO CN uj CnJ - OsJ g ro O w ww ww wC0 vo (3

O Πί /"NJ ^ ^ CD »"H »—* *«—S

ο 8 -5 rou ro(N rocsill

o M Z4J Z <1 7 rf 7 jj 7 JJ

λ; ω 03 OVIUJ ^ΙΧΟθ72®Ιϋ4 VO Ι ^ O

Λί 4-1 £ IAQ —'O'lQir^QiO'QCi OQ-3· LO

<~l tn H <T I CT | _1 VO I _I IA I r-n tAim O

CDUUVOu -lAfj.LArj^ νοΛΡ -H

d £ f vo et <5 04 acm ^ <g- la -4 =2 £ C4 ^ £ 3 TI 1 i ix i icniirni|> ι , % Il rox!C0 tnxi 002 (Η0Ί2 5^00 XI cnxa E4>4b: c-q i-icidcij e e, q ^ li 92211 59 (b) Histamiinin vapautusvaikutus ja ovulaation vastainen vaikutus

Seuraavia menettelytapoja käyttäen vertailtiin tyypillisten tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden histamii-5 ninvapautusvaikutusta ja ovulaation vastaista vaikutusta.

1. Histamiinin vapautustutkimus

Kolmesta tai neljästä urospuolisesta Sprague-Dawley-rotasta (350 g, Iffa-Credo, Ransa) eristettiin sekalaisia peritoneaalisia soluja antaen niille intraperitoneaalisena 10 ruiskeena 10 ml 0,9 %:ista NaCl:ä (joka sisälsi 50 pq hepa-riinia/ml). Sen jälkeen kun vatsaonteloa on hierottu kevyesti 1 minuutin ajan, peritoneaaliset,solut eristettiin ja yhdistettiin, ja niitä sentrifugoitiin 5 minuuttia nopeudella 1500 min Kolmesti Ca++-vapaalla Krebs-Ringer-15 puskurilla (KRB), jonka koostumus oli seuraava: 141,9 mM NaCl, 4,7 mM KC1, 1,2 mM MgS04, 2,5 mM Na2HP04, 0,6 mM KH2P04; huuhtelemisen jälkeen solut laskettiin mikroskoopin alla ja laimennettiin sopivalla tilavuusmäärällä Ca++-vapa-ata KBR:tä niin, että saavutettiin solutiheydek-20 si noin 2 x 10^ solua/ml. 0,3 ml:n eriä esilämmitettiin 0,3 ml:n kanssa Ca++-vapaata KRB:tä 5 minuuttia 35°C:ssa, ja lisättiin 0,1 ml asianmukaista testattavaa lääkeliuos-ta. 5 minuutin kuluttua käynnistettiin reaktio lisäämällä 0,1 ml Ca++-pitoista KRB:tä halutun pitoisuuden saavuttami-•25 seksi. 15 minuutin kuluttua reaktio pysäytettiin lisäämällä 2,5 ml jääkylmää Ca++-vapaata KRB:tä ja asettamalla suspensio jäihin. Solususpension sentrifugoinnin jälkeen määritettiin supernatantin histamiinipitoisuus fluori-metrisesti menetelmällä, jonka ovat esittäneet Shore et ai. 30 ^Immunol. 127 (1959) 182-1867, jättäen pois uuttoprosessi (eksitaatio aallonpituudella 365 nm, emissio aallonpituudella 450 nm). Yksikään reagensseista ei fluoresoinut O-ftaalidialdehydin kanssa kokeissa käytettyinä pitoisuuksina .

35 Solususpension kokonaishistamiinipitoisuus määri- 9221 1 60 tettiin ultraäänikäsittelyn (2 min, pulssitaajuus 5/s) jälkeen.

Kaikista mitatuista arvoista vähennettiin spontaani histamiinin vapautuminen.

5 - Laskut

Prosentuaalinen histamiinin vapautuminen laskettiin seuraavan yhtälön avulla:

Histamiinia soluista vapaassa supernatantissa -spontaani vapautuminen 10 - x 100

Kokonaishistamiinimäärä solususpensiossa f - Reagenssit ja laitteet: O-ftaalidialdehydi hankittiin Flukalta (nro 79760) . Kaikki muut yhdisteet olivat analyysilaatua ja liuotettiin Ca++-vapaaseen KRB:hen. Käytetty fluorimetri oli Perkin Elmer 2000 -malli. Ultraäänikäsittely tehtiin VIBRA-CELL-laitteella (Sonics Materials) mikrokärkiä käyttäen.

2. Ovulaation vastaisuuden tutkiminen

Menettely: Naarasrottia sopeutetaan laboratorio-olosuhteisiin (valon ja pimeän suhde 14:10, valot päällä klo 5 aamulla) vähintään 7-10 vuorokautta. Kullekin rotalle tehdään päivittäinen emätinhuuhtelu klo 7,30 - 9,00 25 ainakin 12 vuorokauden ajan. Emätinhuuhtelunesteen sytologia tutkitaan mikroskooppisesti estrussyklin vaiheen määrittämiseksi. Rotat, joilla on ollut ainakin 2 normaalia nelipäiväistä sykliä ennen parhaillaan olevaa sykliä, valitaan. Odotetun estruspäivän aamuna rotat tapetaan, 30 munanjohtimet poistetaan, ja niistä tutkitaan vastairron-neiden munasolujen esiintyminen. Munasolut "houkutellaan" ulos munanjohtimesta ja lasketaan. Niiden naaraiden, joilla esiintyy ovulaatiota, prosentuaalinen määrä esitetään graafisesti annoksen logaritmin funktiona ED^g-arvon 35 laskemiseksi ovulaation vastaiselle vaikutukselle.

: Histamiinin vapautusvaikutus ja ovulaation vastai nen vaikutus on esitetty seuraavassa taulukossa 4.

61 9ζι 11 .§ § § „ m vn g vOvnS-voScuSo O S 0_ vn N ^ » vO_ (0(0 ^ Λ. _T o" -* o” 0--0--^-0 «n «n o o o p p iH 4-) O O o -- ? ( !

,- 3 tn in J

§ a s a

W

5 el ·ιΗ \ (N ΚΙ vO vO Ό W C tji OO — — _*~ (0 -H W 3

St’"" + I + M + I + I + I κν ό — „ » S' C jSirtO 00 - -n vO (- O ° '‘l 'ΊΟ (0 a 41 -λ',ΐΛι^'^ΦΟιΙ^ΙΛ<>αθΟΟθΌ-£θ- •H -H3Q o o fN in ^ in — — it» 4-) 33 > M — 3 (0 H 5 t e §* κ > x x —I x “ ° 5 sell *2 *0 o o — == X X x © c •γί x— — < o _» <x x eg > —— ^ 5 » ° i-„o 5ιϊϊ ;i g 1 d f x ?=* r«o ¥=^o f°.

Ä qLi ¥ 1 Q. “« ^ dl x — «jmxiTcDKi.i— 0 10 — _ 00 —

X x χ 0 — -_i — _i~u,03O<— — <X'-(N

4-) a-r— < m — 0 — mo — - ιο<ια — x tn x 0 1 (no — 0 -t- (n (Vjo 0 — 1 ox =o I: _J — — — — — C — uIfN*<Q >4β“ 3 —o < «mo — CwOuj—0 1 «03 — —- 3> 4-> o— 1® Il-<-CB“ - <0 (Ο σι u — — 00»U<I<L1 2 3 4 5(JH· l_< 3 C _ . (N (N I — I ^L-l_0 KXD — (N O < j: (C — <00^χο .ο2<<(Νΐι-(θ<ΝΧ — .e» Ο < I * UJ U * (3 « « -3 _c X O — X O "C - 4- I ilfi “ „00 K-CO vo . .0 m m 0 — ΙΌ 10 m a ‘"i — ^, σι — — — — vo 0 — x x «~ 0 Q ^ -

S -vO -LUmM-iN-- OOO CT U - - (N

^ (O 41:3.^.^4-134-- (NI-'-wl.^lCO 2 Λ --UrrUJUUU 34-< 01 01 < £ ~ O u

— mm — - L Ι.Γ - J“'X

, 4- x en m Ό 0 01 o 0 “ - * ·< «e _ -m — σι p H uuloil^lll® Dim £( -C >n 31 UJ ι_ 1-

Cwwi^l LlO) * · o L w < < 0>0)£<l-££££<<^ L- < P* -C -f

•fi 1_ ι_ « · I * . «1 I JL

--( <<vO'OqvOO'OqIi'OOi_ «Ό < Q O

e d) I 1 m m κι κι m vn m · «m « · - m »*n m -j jj οΛ-- — — — — — — m »n — Ό Ό m —vo — — -p w „>v::ϊ2:2:κί2κίκ? sc^ 22 2 iä — ou"io*3

•Η Ό Knilll(lQ.a.Q. flelIhh OlIHQ.(L

* Sj qQQOQ°QOQJL I QÖq j QOqQ

*«*«***»*θο»·*ο****

C NN CSNNfSNNlN ·· »(N (N <N »tN <N CN CN

n. Φφφφ0Φφφφ(Ν(ΝΦΦφ(ΝφΦφΦ •Ή O-O.O-O.Q.O-Q.a.Q.if^Q-a-Q.Jrtt-Q.Q.Q- tji l.1111— J.'J.T0· — — -L°- — — J- — . O 3 oGGÖ5oooou>ooo. o

H -H

(g Ή QqOqqOqqqQqQOqqOOqO

I ^(SNNMNiNfNOI^NNtN^pgOJCNfsM

S > e*lÖ15o^OociaOO«3j5«3«3«OcO

k f f ?ff f f f f iffi if Ti f f O υυυυοϋοϋϋ^^υϋυυυ^^υ0 •hx: <<<<<<<<<<<-f<<<<<<<

. , /11 I t | 1 1 I 1 1 1 * I I I I I I I I I

h ?! zzzzzZzzzZzzzzzzzzz W 4- — — — — — — — — — — — — — — — — “ — —

O

2 S-i 3 O I <7'-'T*rcOC7‘®OOO^‘OOvOc^r-«-K'iTj· — — k/ f λ ιΛ o — r-CN^ — — ® 'S jy ^ror-vO — ^ηωΐΛ^Ν-Ο'-ίΓι^οοιη 4

Oh «Ο-ιΛιη-'ΛΌωΌ-'βΌ^ΦΌ'Ο^ν^

rH

5 U (N|-n|vo|r-|o|(N|^|vj^jo|o(-|ni|K}|N;|in|vo|ov|p| 7 ii \ 1 62

Yhdisteiden akuutti myrkyllisyys

Keksinnön mukaisten yhdisteiden akuuttia myrkyllisyyttä arvioitiin antamalla niitä rotille laskimonsisäi-senä ruiskeena. 3 urosrotan ryhmät saivat yhden ruiskeen 5 väliainetta tai lääkettä (RS-15378 tai RS-26306) annoksen ollessa 1,0 mg/kg. Kaksi muuta rottaryhmää sai joko 0,3 mg tai 1,0 mg standardiyhdistettä (RS-68439)/kg. (Kaikki yhdisteet on nimetty aikaisemmissa esimerkeissä). Ruiskeet annettiin häntälaskimoon 15-20 sekunnin 10 välein. Eläimiä tarkkailtiin myrkyllisyyden kliinisten merkkien havaitsemiseksi välittömästi antamisen jälkeen t ja 0,5, 1,0, 3,0 ja 6,0 tunnin kuluttua ruiskeen antamisesta .

Tulokset on esitetty taulukossa 5.

li 9221 1 63 ta Q) :ra

a; H

•H »H

ra a) > Ό c a) - Q)

•H C C

tn -h ω o e -p 0 0 3 CP Ai (0 -n >i '.(0 M -P ·η >, 0) - C Ai m >, Ai

P -P P

-PC o o ;ta e > :ta PM ra

P -H -H

-P rH > ra rO

ta -p -p

- - Ai -P -P

cm ta -h o o

•H >1 > M -P -P

P Cn-p Oi ID m h p -h c ta ta ta

Ai ta en ph > >

P -P C > -H

a) o o >1 o -h -H

S Pl -C K Ai w w

•H

i—H

o

Ai tri >1

Ai rl \ O’ tr> ·η E ® ^ n o o o a) •k «. %, ^ 0)

W O f-H Γ-H »H «H

O >i

C CU

c o

< P

CU

c ω c

dP

« O

ω m in -P - a.

•H ^ I— Hv ^ a)

lft 'O ϋ qo‘ X £J .X CM vo“xS

: s 3«; >3 3«-3

Aio 9 9 QXmiii *Γο ί 3 |3 S ά Λ ^ ^ ™ g i Λ ^ S’ > 31 -Γ ^ a. x 9 m nCfUaiS^ 11 03 CO 00 zil1 in ^Τ"ι<ίΙνο4·ιιιβΓΐ

En Oi <D *—< O O Q i—1 i_j o O -C Q ^ l___1 Q Q Q n G K

Claims (9)

92211 64

1. Menetelmä kaavan (I) mukaisten, terapeuttisesti käyttökelpoisten nonapeptidi- ja dekapeptidianalogien ja 5 niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi A-B-C-Ser-D-E-F-G-Pro-J (I) 123 4 5678 9 10 10 jossa A on jokin aminoasyyliryhmistä N-Ac-3-(1-naftyyli)-D,L-alanyyli ja N-Ac-3-( 2-naftyyli ) -D, Ι,-alanyyli, niiden D-tai L-isomeeri; B on jokin aminoasyyliryhmistä D-fenyylialanyyli, D-p-15 kloorifenyylialanyyli, D-p-fluorifenyylialanyyli ja D-a- metyyli-p-kloorifenyylialanyyli; C on jokin aminoasyyliryhmistä D-tryptofanyyli ja 3-(3-py-ridyyli)-D-alanyyli; D on jokin aminoasyyliryhmistä L-fenyylialanyyli, L-tyro-20 syyli, 3-(3-pyridyyli)-alanyyli ja arginyyli, tai amino-asyyliryhmä, jolla on rakennekaava -HN-CH-CO- 25 (CH2)n (II) NH R1-HN-C=NR2 30 jossa n on 1 - 5; R1 on alkyyli, joka sisältää 1-6 hiili-atomia, tai fluorialkyyli; ja R2 on vety tai R1; E on 3-(3-pyridyyli)-D-alanyyli, D-tyrosyyli, D-tryptofanyyli tai aminoasyyliryhmä jolla on rakennekaava 35 9221 1 65 -HN-CH-CO- ( ch2 )n (II)

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että A on N-Ac-D-Nal(2); B on D-pCl-Phe; 15. on D-Trp tai D-Pal(3); D on Tyr, Arg, Den, Mbh tai Bth; F on Leu; ja J on D-AlaNH2.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että valmistetaan N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Pro-D-AlaNH2 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan N-Ac-D-Nal(2)-D- 25 pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Mbh-D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2 tai 30 sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

5 NH x I 2 R1-HN-C=NR2 jossa n on 1 - 5; R1 on alkyyli, joka sisältää 1-6 hiili-10 atomia, ja R2 on vety tai R1; tai R1-HN-C=NR2 on HN N 15 \ / H-C—(CH2)b H jossa m on 1 - 4; 20. on jokin aminoasyyliryhmistä L-leusyyli ja L-fenyyli-alanyyli; G on aminoasyyliryhmä, jolla on rakennekaava -HN-CH-CO- 25 | (CH2)n (II) NH I 2 ·. 30 R1-HN-C=NR2 jossa n on 1 - 5; R1 on alkyyli, joka sisältää 1-6 hiili-atomia, tai fluorialkyyli; ja R2 on vety tai R1; ja J on D-alaniiniamidi tai glysiiniamidi, 35 tunnettu siitä, että (a) liitetään halutut, sopivasti suojatut aminohapot yhteen haluttuun järjestykseen esim. kiinteäfaasisyn-teesillä, minkä jälkeen poistetaan suojaryhmät ja mahdollinen kiinteä kantaja, tai 40 (b) kaksi halutun polypeptidin fragmenttia liite- 9221 1 66 tään yhteen haluttuun järjestykseen esim. liuossynteesillä käyttäen asyyliatsidimenetelmää, jolloin saadaan haluttu kaavan (I) mukainen poly-peptidi tai sen suola, ja mahdollisesti 5 (i) kaavan (I) mukainen polypeptidi muutetaan far maseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi, tai (ii) kaavan (I) mukaisen polypeptidin suola muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi, tai (iii) kaavan (I) mukaisen polypeptidin suola muute-10 taan kaavan (I) mukaiseksi vapaaksi polypeptidiksi.

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal(3)-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola. 92211 67

7. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

8. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Bth-D-Tyr-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

9. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että valmistetaan N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola. 68 *2z i 1