NO176440B - Syntetiske nonapeptid- og decapeptidanaloger av LHRH for anvendelse for regulering av fruktbarheten og forplantningssyklusen hos mennesker og husdyr - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse angår nonapeptid- og decapeptidanaloger av LHRH for anvendelse for regulering av fruktbarheten og forplantningssyklusen hos mennesker og husdyr, samt preparater inneholdende samme som aktiv bestanddel.

Luteiniserende hormon (LH) og folikkelstimulerende hormon (FSH) avgis fra hypofyseforlappen, regulert av det luteiniserende-hormon-frigjørende hormon (LHRH; LH/FSH-RH; GnRH) som dannes i hypothalamusområdet. LH og FSH virker på gonadene for derved å stimulere syntese av steroidhormoner og stimulere kjønnscellemodning. Den pulserende avgivelse av LHRH, og derved avgivelsen av LH og FSH, regulerer forplantningssyklusen hos mennesker og husdyr.

LHRH innvirker også på placenta, og derfor også in-direkte på gonadene, ved å bevirke syntese og avgivelse av chorionisk gonadotropin (CG).

LHRH-antagonister er nyttige for regulering av fruktbarheten. Slike antagonister blokkerer eggløsningen hos kvinnen og hos hunndyr og undertrykker spermatogenesis hos mannen og hos hanndyr. Forbundet med disse virkninger er en undertrykkelse av de normale sirkulasjonsmengder av seksual-steroider av kjønnskjertelopprinnelse, hvilket avstedkommer en reduksjon i vekten av angjeldende organer hos mannen/- hanndyr .og hos kvinnen/hunndyr. Hos husdyr undertrykker denne virkning seksualsyklusen og den seksuelle atferd (og fremmer vektøkning i en situasjon med knappe formengder), fremkaller abort hos drektige dyr og virker generelt som et kjemisk steriliseringsmiddel.

Det naturlig forekommende frigjøringshormon LHRH er et decapeptid som består av naturlig forekommende aminosyrer (som har L-konfigurasjon, med unntak for den achirale aminosyreglycin). Dets sekvens er som følger:

Analoger av dette naturlig -forekommende stoff angis ofte i forkortet form ved at man viser arten av substituenten på en gitt aminosyre, med angivelse av en indeks for dens pias-sering, med påfølgende angivelse av "LHRH". Mange analoger av LHRH er blitt undersøkt, og et meget stort flertall av dem oppviser utilstrekkelig biologisk aktivitet til at de er nyttige i klinisk henseende. Imidlertid oppviser visse utvalgte modifikasjoner en potensierende virkning på agonistisk biologisk aktivitet. En betydelig forbedring av den agonistiske aktivitet oppnås ved å endre gruppen i 6-stilling fra Gly til en D-aminosyre.

I tillegg til agonister er det blitt fremstilt analoger som er konkurransedyktige antagonister til LHRH. Disse krever alle utelatelse eller erstatning av histidylgruppen i 2-stilling, se Vale, W. et al., Science, 176: 933

(1972). Vanligvis synes det som om en D-aminosyre anbrakt i denne stilling i sekvensen gir den beste aktivitet, jf. Rees, R.W.A. et al., J. Med. Chem., 17: 1016 (1974).

Innføring av en modifikasjon i 6-stillingen (som uten modifikasjonen i 2-stillingen resulterer i den ovennevnte agonistiske aktivitet) forbedrer dessuten den antagonistiske aktivitet av de 2-modifiserte analoger, jf. Beattie, C.W. et al., J. Med. Chem., 18: 1247 (1975); Rivier, J. et al., Peptides 1976, s. 427, Editions de l'Universite de Bruxelles, Belgia (1976).

I tillegg til disse to større endringer, som resulterer i kraftigere LHRH-antagonister, kan det foretas ytterligere økninger i den antagonistiske aktivitet ved at man modifiserer stillingene 1, 3, 5 og/eller 10 i det allerede 2-, 6-modifiserte peptid, jf. Coy, D.H. et al., Peptides 1976, s. 462, Editions de l'Universite de Bruxelles, Belgia

(1976); Rivier, J.E. et al., Life Sei., 23: 869 (1978); Dutta, A.S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 81: 382

(1978), Humphries, J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 85: 709 (1978). Det er også blitt vist at N-acylering av aminosyren i 1-stilling er gunstig, se Channabasavaia, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 81: 382 (1978); Coy, D.H. et al., Peptides. - Structure and Biological Function, s. 775, Pierce Chemical Co. (1979). Dessuten er en meget kraftig antagonist med en D-Arg<6->substituering, nemlig (N-

Ac-D-pCl-Phe<1>, DpCl-Phe<2>, D-Trp<3>, D-Arg<6>, D-Ala<10>)LHRH,

blitt publisert av D.H. Coy, Endocrinology, 110, 1445

(1982).

Skjønt klassen av LHRH-analoger med en D-Arg<6->sub-stituering har vist seg å ha kraftig eggløsningshindrende virkning, har disse dessverre også vist seg å være kraftige mastcelledegranulerende substanser, se Schmidt et al., Contraception, j29, 283 (1984), og å forårsake ødem in vivo.

Således har f.eks. (N-Ac-Nal(2) 1, D-pCl-Phe<2>, D-Trp<3>, D-Arg<6>)LHRH en ED50 på 0,2 \ ig/ ml for frigjøring av histamin

fra rottemastceller in vitro. Denne bireaksjon er av klinisk betydning på grunn av den potensielle livstruende art av den derav følgende anafylaktoide reaksjon.

Det er velkjent i faget at molekyler som oppviser en eller flere positive ladninger, spesielt multiple positive ladninger, sammen med hydrofobisitet, er kraftige mast-celledegranulatorer, jf. Foreman og Jordan, Agents and Actions, 13, 105 (1983). Et første forsøk på å omgå dette problem i analoger inneholdende to Arg-grupper (nemlig i 6-og 8-stillingene) gikk ut på å øke avstanden mellom gruppene (f.eks. (N-Ac-D-Nal(2)<1>, D-pCl-Phe<2>, D-Trp<3>, Arg<5>, D-Tyr<6>, D-Ala^<O>)LHRH, (ED50 = 2 ug/ml for frigjøring av histamin, se R.W..Roeske et al., "Substitution of Arg<5> for Tyr<5> in GNRH antagonists", i Peptides: Structure and Function, CM. Deber, V.J. Hruby, K.D. Kopple (Eds.), Pierce Chemical Co., Rockford IL, 1985, s. 561). Skjønt dette førte til en nedsettelse av analogens styrke med hensyn til degranulering av mastceller og frigjøring av histamin, har analogen fortsatt mange ganger større anafylaktoid styrke enn LHRH, for hvilken sistnevnte ED50 er 328 y.g/ml for histaminfrigjøring.

Også Lys(iPr) er blitt innlemmet i flere stillinger i LHRH-antagonister. Når denne gruppe innlemmes i 6- og 8-stillingene sammen med en D-pCl-Phe-gruppe i 2-stillingen, bibeholdes den store eggløsningshindrende styrke og den ned-satte frigjøring av histamin (f.eks. (N-Ac-D-Nal(2)<1>, pCl-Phe<2>, D-Trp<3>, D-Lys(iPr)6, Lys(iPr)8, D-Ala<10>)LHRH; ED50<= >6,6 ug/ml for histaminfrigjøring. I en analog ble hArg(Et2) innført i 8-stillingen under oppnåelse av en tilsvarende grad av histaminfrigjørende styrke (nemlig (N-Ac-D-Nal(2) 1, D-aMe-pCl-Phe<2>, D-Pal(3)<3>, D-Arg<6>, hArg(Et2)<8,> D-Ala10)LHRH; ED50 = 4,9 ug/ml for histaminfrigjøring. Det vil imidlertid ses at disse analoger fortsatt er meget kraftige histamin-frigjørende midler sammenlignet med LHRH, jf. R.W. Roeske et al., "LHRH Antagonists with Low Histamine Releasing Activi-ty", i LHRH and its Analogs: Contraceptive and Therapeutic Applications, Part 2, B.H. Vickery og J.J. Nestor Jr.,

(Eds.), MTP Press, Boston, 1987, sider 17-24.

8- og 9-stillingene er også blitt identifisert som et viktig sted for å foreta erstatninger for å hindre histamin-frigjøring, da Arg-Pro-sekvensen er en frekvens som i neuro-peptider ofte ses å forårsake mest celledegranulering.

Skjønt det finnes vitenskapelig basis for å anta at 8-stillingen er det kritiske sted for å foreta erstatninger,

er det for tiden kjente sett av analoger fortsatt beheftet med betydelig risiko for toksisitet og andre bivirkninger.

Med den foreliggende oppfinnelse er det nå funnet frem til nye, meget kraftige nonapeptid- og decapeptid-analoger LHRH med minimal histaminfrigjørende styrke, som er særpreget ved en erstatning i 8-stillingen med en sterisk hindret guanidino-substituert arginylgruppe, i kombinasjon med at det ikke er til stede noen arginylsubstituent i 6-stillingen.

I henhold til oppfinnelsen tilveiebringes det således nye nonapeptid- og decapeptidanaloger av LHRH for anvendelse for regulering av fruktbarheten og forplantningssyklusen hos mennesker og husdyr, hvilke er karakteristiske ved at de er forbindelser med den generelle formel:

hvor:

A er en aminosyregruppe valgt blant D- og L-isomerene av N-Ac-3-(l-nafthyl)-D,L-alanyl og N-Ac-3-(2-nafthyl)-D,L-ala-nyl,

B er en aminosyregruppe valgt blant D-fenylalanyl, D-p-klorfenylalanyl, D-p-fluorfenylalanyl og D-a-methyl-p-klor-fenylalanyl,

C er en aminosyregruppe valgt blant D-tryptofanyl og 3-(3-pyridyl)-D-alanyl,

D er en aminosyregruppe valgt blant L-fenylalanyl, L-tyrosyl, 3-(3-pyridyl)-alanyl og arginyl eller er lik G, hvor n er 1-5, R<1> er alkyl med 1-6 carbonatomer eller fluoralkyl og R<2> er hydrogen eller R<1>,

E er 3-(3-pyridyl)-D-alanyl, D-tyrosyl, D-tryptofanyl eller G, hvor n er 1-5, R<1> er alkyl med 1-6 karbonatomer, R<2> er hydrogen eller R<1>;

F er en aminosyregruppe valgt blant L-leucyl og L-fenylalanyl ,

G er en aminosyregruppe med den generelle formel:

hvor n er fra 1 til 5, R<1> er alkyl med 1-6 carbonatomer eller fluoralkyl med 1-4 carbonatomer, og R<2> er hydrogen eller R<1>, og

J er D-alaninamid eller glycinamid,

og i fysiologisk henseende aksepterbare. salter derav.

Utskiftningen av L-histidylgruppen som befinner seg i 2-stillingen i LHRH, overfører peptidet til en LHRH-antagonist. Utskiftning av glycylgruppen i 6-stillingen i LHRH med en av gruppene angitt som E, medfører en dramatisk forbedring av den antagonistiske virkning. Erstatningene i stillingene 1, 2, 3, 5, 7 og 10 som her omtales, bidrar ytterligere til å forbedre den antagonistiske aktivitet. Erstatningen G i 8-stillingen gir en kraftig nedsettelse av den histaminfrigjørende styrke hos analogene når 6-stillingen inneholder en annen gruppe enn Arg og er av av-gjørende betydning for en i fysiologisk henseende sikker bruk av analogene.

Forkortelser og definisjoner

Som ovenfor angitt benyttes for de forskjellige vanlige aminosyrer de konvensjonelle forkortelser som er anerkjent i peptidfaget, og som anbefales av IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, Biochemistry, 11, 1726 (1972). Alle peptidsekvenser som her er nevnt, er skrevet i henhold til den vanlig aksepterte konvensjon, hvorved den N-terminale aminosyre blir stående til venstre og den C-terminale aminosyre blir stående til høyre.

Forkortelsene som her benyttes, betegner L-aminosyrer, med unntak for den achirale aminosyreglycin, og med ytterligere unntak av eventuelle ikke naturlig forekommende eller naturlig forekommende aminosyrer som er achirale eller som betegnes som D- eller D,L-.

Det er å merke at når J = NH-C(0)-NH2, er C-ende-gruppen en aza-glycinamid-gruppe.

Forkortelsen D-Glu(AA) representerer anisol-69-veien til en D-Glu-gruppe for dannelse av et para-methoxy-fenyl-keton (ved glutaminsyresidekjedens carboxyl-endegruppe), nemlig Glu(pMeO-Ph).

Også visse andre forkortelser vil bli benyttet for å beskrive oppfinnelsen. I henhold til oppfinnelsen gjøres det bruk av erstatninger av aminosyrer i det naturlig forekommende LHRH-peptid med aminosyrer som ikke forekommer i naturen. Særlig vanlig benyttede blant disse er de føl-gende :

Den her benyttede betegnelse "i fysiologisk henseende aksepterbare salter" refererer seg til salter som har i behold den ønskede biologiske aktivitet av den opphavlige forbindelse, og som ikke fører inn uønskede toksikologiske virkninger. Eksempler på slike salter er (a) syreaddisjons-salter dannet med uorganiske syrer, f.eks. saltsyre, hydro-bromsyre, svovelsyre, fosforsyre, salpetersyre o.l. og salter dannet med organiske syrer som f.eks. eddiksyre, oxalsyre, vinsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, glucon-syre, sitronsyre, eplesyre, ascorbinsyre, benzoesyre, garvesyre, pamonsyre, alginsyre, polyglutaminsyre, naftha-lensulfonsyrer, nafthalendisulfonsyrer og polygalacturonsyre; (b) baseaddisjonssalter dannet med flerverdige metallkationer som f.eks. sink, kalsium, vismut, barium, magnesium, aluminium, kobber, kobolt-, nikkel, kadmium o.l., eller med et organisk kation dannet ut fra N,N'-dibenzyl-ethylendiamin eller ethylendiamin; eller (c) kombinasjoner av (a) og (b), f.eks. et sinktannatsalt o.l.

Betegnelsen "lavere alkyl" refererer seg til en rett-kjedet eller forgrenet, mettet hydrocarbongruppe som har 1 til 4 carbonatomer, som f.eks. methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, isobutyl, sek-butyl og tert-butyl. Uttryk-ket "alkyl med 1-6 carbonatomer" omfatter de samme substi-tuenter som lavere alkyl, men innbefatter i tillegg grupper med 5 eller 6 carbonatomer, som f.eks. n-pentyl, n-hexyl og forgrenede grupper med 5 eller 6 carbonatomer. Betegnelsen "alkyl med 1-12 carbonatomer" innbefatter de ovenfor omtalte grupper, men omfatter videre tilsvarende grupper med inntil 12 carbonatomer.

Betegnelsen "fluoralkyl" refererer seg til lavere alkyl som er substituert med 1-5 fluoratomer. Eksempler på slike grupper er CF3CH2-, CF3-, CF3CH2CH2- o.l.

Halogen refererer seg til fluor, klor og brom.

Forkortelsen "N-Ac" refererer seg - i henhold til generelt akseptert nomenklatur - til den beskyttende gruppe N-acetyl, dvs. en acetylgruppe som er bundet til en aminosyre-endegruppe på aminets nitrogen.

Forbindelser som er foretrukne utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse, er forbindelser med den generelle formel (I) hvor:

A er N-Ac-D-Nal(2),

B er D-pCl-Phe,

C er D-Trp eller D-Pal(3),

D er Tyr, Arg, Deh, Mbh, Bth eller Pha,

F er Leu, og

J er D-AlaNH2,

og i fysiologisk henseende aksepterbare salter derav.

Særlig foretrukne forbindelser på grunn av deres særlig gode egenskaper er

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-G-Pro-D-AlaNH2,

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2,

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Mbh-D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2,

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2,

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2,

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Bth-D-Tyr-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2,

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2,

og deres i fysiologisk henseende aksepterbare salter.

Det foretrekkes vanligvis at aminosyregruppene A, B, C, E og J foreligger i form av B-isomeren, og at gruppene D, F og G foreligger i form av L-isomeren. Dersom ikke annet er angitt, er det denne stereokjemi som er representert.

Prøvningsprosedyrer

De nye forbindelser, og spesielt saltene,

oppviser overraskende høy og langvarig LHRH-antagonistisk aktivitet.

Et primært mål på den LHRH-antagonistiske aktivitet er evnen til å inhibere eggløsning hos rotter, hvilken bestemmes ved hjelp av prosedyren ifølge Corbin, A. og Beattie, C.W., Endocrine Res. Commun., 2: 1 (1975).

Evnen til å forårsake histaminfrigjøring av peritoneale rotte-mastceller in vitro kan bestemmes i henhold til Sydbom og' Terenius, Agents and Actions, 16, 269 (1985) eller Siraganian et al., Manual of Clinical Immunology, 2. utgave, N.E. Rose og M. Friedman, Eds., Amer. Soc. Microbiol., Washington, D.C., 1980, s. 808.

Andre biologiske prøvningsmetoder som kan anvendes for LHRH-antagonister og for de nye forbindelser er: (a) inhibering av LHRH-frembrakt FSH- og LH-fri-gj øring in vivo hos rotter, ifølge Vilchez-Martinez, J.A. et al., Endocrinology, 96: 1130

(1975). (b) inhibering av LH- og FSH-frigjøring ved hjelp av kulturer av dispergerte hypofyseforlappceller, bestemt radioimmunologisk (Vale, W. et al., Endocrinology, 91: 562 (1972). (c) inhibering av gonadotropinkonsentrasjonene hos kastrerte rotter og hunder (Petrie et al., Male Contraception, Harper og Row, Philadelphia

(1985), s. 361).

Antagonistiske virkninger og anvendelser

De følgende anvendelser følger av den antagonistiske virkning av de her beskrevne forbindelser:

- hindre befruktning hos kvinner og hunndyr,

- hindre eller forsinke eggløsning,

- avslutte drektighet hos husdyr og kjæledyr,

- fremkalle fødsel,

- synkronisere eggløsning,

- undertrykke brunst,

- fremme vekst hos hunndyr,

- luteolysis, frembringe menstruasjon,

- fremkalle tidlig abort i første trimester,

- hindre befruktningsdyktighet hos menn eller hanndyr,

- funksjonell kastrering av matproduserende hanndyr,

- undertrykke preøstrum-blodutflod hos hunder,

- bevare fruktbarheten i tilfeller hvor det foretas chemoterapi eller strålebehandling, - og andre fruktbarhetsregulerende anvendelser som angitt i Vickery, B.H., Endocrine Reviews, 7: 115 (1986).

En særlig interessant anvendelse av de foreliggende LHRH-antagonister er deres anvendelse for å hindre hyperstimulering av eggstokkene. Når en kvinne eller et hunndyr lider under en tilstand som resulterer i nedbrytning av den normale menstruasjonssyklus, f.eks. polycystis-eggstokk-sykdom, menopause-syndrom som følge av chemoterapi eller oligomenorrhea, kan ofte fruktbarhet fremkalles enten in situ eller for befruktning/eggoverføring in vitro ved administrering av eksogene gonadotropiner. Denne gonado-tropinterapi resulterer imidlertid ofte i hyperstimulering av eggstokkene og/eller flere fødsler som følge av den kombinerte virkning av de endogene og eksogene gonadotropiner. Følgelig er de nye LHRH-antagonister som nå fremskaffes, nyttige for å undertrykke de endogene gonadotropiner, slik at en normal grad av eggstokkstimulering kan oppnås.

Det aspekt av den foreliggende oppfinnelse som angår bestemte anvendelser av de ovenfor beskrevne forbindelser, angår disse utnyttelsesmuligheter, og spesielt: inhibering av eggløsning, behandling av premenstruasjonssyndromet, behandling av hyperstimulering av eggstokkene forårsaket av eksogene gonadotropiner og behandling av endometriosis hos kvinnen og hos hunnpattedyr; inhibering av spermatogenesis og behandling av prostata-hypertrophia hos menn og hann-pattedyr; undertrykkelse av isoseksuell, sann (idiopatisk), for tidlig utviklet pubertet (dvs. for tidlig utviklet pubertet av hypothalamisk opprinnelse hos menn/kvinner eller hanndyr/hunndyr); undertrykkelse av estrus (dvs. avbrytelse av seksuell opphisselse hos dyr); og avbrytelse av en drektig-hetstilstand hos dyr.

For å oppnå den ønskede virkning gis en effektiv

mengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen eller et preparat som inneholder en slik forbindelse.

Disse forbindelser eller preparater kan administreres ved

hjelp av en hvilken som helst av en lang rekke administreringsmetoder, avhengig av formålet. Administreringen kan således blant annet skje oralt, parenteralt (inklusive sub-kutant, intramuskulært og intravenøst), vaginalt (spesielt for befruktningshindring), rektalt, bukkalt (inklusive sub-lingualt), transdermalt eller intranasalt. Den best egnede administreringsmetode i et gitt tilfelle vil avhenge av bruken, den benyttede aktive bestanddel, pasienten som skal behandles, og legens bedømmelse av situasjonen. Forbindel-

sen eller preparatet kan også administreres ved hjelp av depot-implantasjoner eller injiserbare preparater som gir en regulert avgivelse av den aktive bestanddel, slik det vil bli nærmere beskrevet nedenfor.

For de ovenfor omtalte anvendelser vil det vanligvis

være hensiktsmessig å administrere en aktiv bestanddel i meng-der av fra 0,001 til 5 mg/kg kroppsvekt. For avbrytelse av seksuell opphisselse eller for å forhindre drektighet hos dyr, foretrekkes det spesielt å gi en dose i området fra 1 til 10 mg/kg i én enkelt dose.

Vanligvis krever parenteral administrering lavere doser enn andre administreringsmetoder som er mer avhengige av ab-sorpsjon.

Oppfinnelsen angår også preparater inneholdende som

aktiv bestanddel en forbindelse ifølge oppfinnelsen. Disse preparater inneholder en slik forbindelse i blanding med en i fysiologisk henseende akseptertar, ikke-toksisk bærer. Som ovenfor nevnt kan slike preparater fremstilles for bruk ved parenteral (subkutan, intramuskulær eller intravenøs) administrering, spesielt i form av væskeoppløsninger eller væskeformige suspensjoner; for bruk ved-vaginal eller rektal administrering, spesielt i halvfaste former, f.eks. som kremer eller

stikkpiller; for oral eller bukkal administrering, spesielt i form av tabletter eller kapsler; eller for intranasal administrering, spesielt i form av pulvere, nesedråper, eller aerosoler.

Preparatene kan hensiktsmessig administreres i enhets-doseform og kan tilberedes etter en hvilken som helst av de i faget velkjente metoder, f.eks. som beskrevet i Reming-ton's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA., 1970. Preparater for parenteral administrering kan inneholde som vanlige eksipienter sterilt vann eller steril saltoppløsning, alkylenglycoler som f.eks. propylenglycol, polyalkylenglycoler som f.eks. polyethylenglycol, oljer av vegetabilsk opprinnelse, hydrogenerte nafthalener o.l. Preparater for vaginal eller rektal administrering, f.eks. stikkpiller, kan inneholde som eksipienter f.eks. polyalkylenglycoler, vaselin, kokossmør o.l. Preparater for nasal administrering kan være faste og kan inneholde som eksipienter f.eks. laktose eller dextran, eller de kan være vandige oppløsninger eller oljeoppløsninger for administrering i form av nesedråper eller sprøytedoser. For bukkal administrering innbefatter typiske eksipienter sukkere, kalsiumstearat, magnesiumstearat, pregelatinert stivelse o.l.

En eller flere overflateaktive syrer eller salter, men fortrinnsvis ett enkelt, i fysiologisk henseende aksepterbart syresalt, kan settes til LHRH-antagonisten i et oppløs-ningspreparat eller et pulverpreparat. Egnede i fysiologisk henseende aksepterbare overflateaktive salter vil være de salter som bibeholder egenskapen med forbedret peptid-absorpsjon og likeledes forbindelsens overflateaktivitets-egenskaper, og som ikke er skadelige for pasienten eller på annen måte er betenkelige. Slike salter er f.eks. de salter som avledes fra uorganiske baser, som f.eks. natrium-, kalium-, lithium-, ammonium-, kalsium-, magnesium-, ferro-, sink-, kobber-, mangan(II)-, aluminium-, ferri-, mangan-(III)-salter o.l. Særlig foretrukne er ammonium-, kalium-, natrium-, kalsium- og magnesiumsaltene. Salter avledet fra i fysiologisk henseende aksepterbare organiske ikke-toksiske baser innbefatter salter av primære, sekundære og tertiære aminer, substituerte aminer, deriblant naturlig forekommende substituerte aminer, cykliske aminer og basiske ionevekslerharpikser, som f.eks. isopropylamin, trimethyl-amin, diethylamin, triethylamin, tripropylamin, ethanolamin, 2-dimethylaminoethanol, 2-diethylaminoethanol, tromethamin, dicyclohexylamin, lysin, arginin, histidin, caffein, pro-cain, hydrabamin, cholin, betain, ethylendiamin, glucosamin, methylglucamin, theobromin, puriner, piperazin, piperidin, N-ethylpiperidin, polyaminharpikser o.l. Særlig foretrukne organiske ikke-toksiske baser, er isopropylamin, diethylamin, ethanolamin, tromethamin, dicyclohexylamin, cholin og caffein.

Mer foretrukket vil det overflateaktive middel som benyttes ved utøvelsen av den foreliggende oppfinnelse, være et alkalimetallsalt av glycocholinsyre, mest foretrukket natriumglycocholat.

Mengden av overf lateaktivt middel som anvendes vil være en mengde som øker absorpsjonen av LHRH-peptider sammenlignet med den tilsvarende mengde av andre overflateaktive midler som også i en viss grad er i stand til å øke peptidabsorpsjonen. Det har vist seg at en slik mengde ofte er i området mellom 0,2 og 15% (vekt/vol), som oftest fra 0,2 .til 5 % (vekt/vol) av oppløsningen. Det foretrekkes at det overflateaktive middel er til stede i en mengde av mellom 0,5 og 4 % (vekt/vol), hensiktsmessig i en mengde av omkring 1 % (vekt/vol), fortrinnsvis i en mengde av ca. 2 % (vekt/vol).

Også andre stoffer, så som konserveringsmidler, salter som gir vevets toniske verdi, eller andre additiver som det er kjent å benytte i nesepreparater, kan settes til disse preparater. Særlig fordelaktige blant slike andre stoffer er overflateaktive midler, gjerne ikke-ioniske overflateaktive midler som f.eks. polysorbatene, i konsentrasjoner som passende kan være i området fra 0,1 til 5 % (vekt/vol), mer foretrukket i området fra 0,25 til 2 % (vekt/vol).

Det har vist seg at for å oppnå forbedret oppløselig-het og stabilitet, er det ofte gunstig at molforholdet mellom gallesyre og peptid er >20:1, f.eks. >25:1.

Det er særlig ønskelig at de nye forbindelser avgis f.eks. over et tidsrom av fra 1 uke til 1 år fra én enkelt administrering. Forskjelige depotformer for implantasjon eller injisering, som gir langsom avgivelse av den aktive bestanddel, kan benyttes. Eksempelvis kan en doseringsform inneholde et i fysiologisk henseende aksepterbart ikke-toksisk salt av forbindelsen som har en lav grad av oppløselighet i kroppsvæsker, f .eks. (a) et syreaddisjonssalt med en flerbasisk syre, som f.eks. fosforsyre, svovelsyre, sitronsyre, vinsyre, garvesyre,' pamonsyre, alginsyre, polyglutaminsyre, nafthalen-mono-sulfonsyrer og nafthalen-disulfonsyrer, polygalacturonsyre o.l., (b) et salt med et flerverdig metallkation som f.eks. sink, kalsium, vismut, barium, magnesium, aluminium, kobber, kobolt, nikkel, kadmium o.l., eller med et organisk kation dannet fra f.eks. N,N'-dibenzylethylendiamin eller ethylendiamin; eller (c) en kombinasjon av (a) og (b), f.eks. et sinktannatsalt. Dessuten kan de nye forbindelser eller, fortrinnsvis, et relativt uoppløselig salt derav, så som et av de nettopp beskrevne, inngå i en gel, f.eks. en aluminium-monostearatgel sammen med f.eks. sesamolje, hvilken gel egner seg for injeksjon. Særlig foretrukne salter er sinksalter, sinktannatsalter, pamoatsalter o.l. En annen type depotpreparat for langsom avgivelse, beregnet for injeksjon eller implantasjon, vil inneholde forbindelsen eller saltet dispergert eller innkapslet i en ikke-toksisk, ikke-antigen polymer som nedbrytes langsomt, f.eks. en polymelkesyre/- polyglycolsyre-polymer. Forbindelsene eller, fortrinnsvis, relativt uoppløselige salter derav, så som de ovenfor beskrevne, kan også inngå i pellets med cholesterolmatriks eller i implantater med silastomermatriks eller i hydrogel-kapsler eller porøse kapsler, spesielt for behandling av dyr. Også andre depotpreparater for implantasjon eller injeksjon, som gir langsom avgivelse, som f.eks. liposomer, er omtalt i litteraturen, se f.eks. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Slike vil.finnes omtalt med spesiell henvisning til forbindelser av LHRH-typen i f.eks. U.S. patentskrift nr. 4 010 125. Se også Pitt, C.G., "The controlled delivery of polypeptides including LHRH analogs", i LHRH and its Analogs: Contraceptive and Therapeutic Applications, Part 2, B.H. Vickery og J.J. Nestor, Jr.

(Eds.) MTP Press, Boston, 1987, s. 557.

Syntese av peptidene

De nye polypeptider kan syntetiseres ved hjelp av en hvilken som helst av de metoder som er kjent i faget. En utmerket oversikt over de mange metoder som er anvendelige, vil finnes i J.M. Stewart og J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, og i J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Vol. 2, s. 46, Academic Press (New York), 1973 hva angår peptidsyntese i fast fase og i E. Schroder og K. Lubke, The Peptides, Vol. 1, Academic Press (New York), 1965 hva angår den klassiske syntese i oppløsning.

Vanligvis omfatter disse metoder sekvensiell addering av en eller flere aminosyrer eller hensiktsmessig beskyttede aminosyrer til en voksende peptidkjede. Normalt blir enten aminogruppen eller carboxylgruppen i den første aminosyre beskyttet med en egnet beskyttende gruppe. Den beskyttede eller derivatiserte aminosyre kan så enten bindes til en inert, fast bærer eller anvendes i oppløsning, og den neste aminosyre i sekvensen - som har den komplementære gruppe (aminogruppe eller carboxylgruppe) hensiktsmessig beskyttet

- under betingelser som egner seg for dannelse av amid-bindingen. Den beskyttende gruppe fjernes så fra den nytil-satte aminosyregruppe, og den neste aminosyre (med egnet beskyttelse) tilsettes deretter, osv. Etter at alle de ønskede aminosyrer er blitt sammenbundet i den riktige rekkefølge, kan eventuelle gjenværende beskyttende grupper (og eventuell fast bærer) fjernes sekvensielt eller samtidig, hvorved det ferdige polypeptid fås. Gjennom enkel modifisering av denne generelle prosedyre er det mulig å

addere mer enn én aminosyre ad gangen til en voksende kjede, f.eks. ved at et beskyttet tripeptid kobles (under betingelser som ikke fører til racemisering av chiral-sentre) med et hensiktsmessig beskyttet dipeptid, slik at det - etter

avbeskyttelse - fås et pentapeptid.

Foretrukne utførelsesformer av syntesen

En særlig foretrukken fremgangsmåte for fremstilling av de nye forbindelser involverer peptidsyntese i fast fase.

Ved denne særlig foretrukne fremgangsmåte beskyttes aminosyrenes a-aminofunksjon med en syre- eller basefølsom gruppe. Slike beskyttende grupper må være stabile ved betingelsene hvorunder peptidbindingen dannes, samtidig som de lett lar seg fjerne, uten at den voksende peptidkjede ødelegges eller .racemisering av noen av chiral-sentrene finner sted. Egnede beskyttende grupper er t-butyloxycarbonyl (Boe), benzyloxycarbonyl (Cbz), bifenylisopropyl-oxycarbonyl, t-amyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, a,a-dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, o-nitrofenylsulfen-yl, 2-cyano-t-butyloxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl o.l., spesielt t-butyloxycarbonyl (Boe).

Særlig foretrukne beskyttende grupper for sidekjeder er, for arginin: nitro, p-toluensulfonyl, 4-methoxybenzen-sulfonyl, Cbz, Boe og adamantyloxycarbonyl; for tyrosin: benzyl, o-brombenzyloxycarbonyl, 2,6-diklorbenzyl, iso-propyl, cyclohexyl, cyclopentyl og acetyl; for serin: benzyl og tetrahydropyranyl; for histidin: benzyl, p-toluensulfonyl og 2,4-dinitrofenyl.

Den C-terminale aminosyre bindes til en egnet, fast bærer. Egnede faste bærere som er anvendelige ved den ovenfor omtalte syntese, er de materialer som er inerte overfor reagensene og reaksjonsbetingelsene som benyttes ved de trinnvise kondensasjons- og avbeskyttelsesreaksjoner, og som er uoppløselige i de benyttede medier. Egnede faste bærere er klormethylpolystyren-divinylbenzen-polymer, hydroxy-methyl-polystyren-divinylbenzen-polymer o.l., spesielt klormethylpolystyren-(1 % divinylbenzen)-polymer. I det spesielle tilfelle hvor forbindelsens C-endegruppe vil være glycinamid, er en særlig anvendelig bærer den benzhydryl-amino-polystyren-divinylbenzen-polymer som beskrives av P. Rivaille et al., Heiv. Chim. Acta., 54, 2772 (1971). Til-bindingen av harpiksen av klormethyl-polystyren-divinylbenzen-type foretas ved at den Na<->beskyttede aminosyre, spesielt Boe-aminosyren, i form av dens cesium, tetramethyl-ammonium, triethylammonium, 1,5-diazabicyclo-[5,4,0]-undec-5-en-salt eller lignende salt i ethanol, acetonitril, N,N-dimethylformamid (DMF) o.l., spesielt cesiumsaltet i DMF, omsettes med klormethylharpiksen ved en forhøyet temperatur, f.eks. ved temperatur mellom 40 og 60°C, fortrinnsvis ved ca. 50°C, i 12-48 timer, fortrinnsvis i ca. 24 timer. Na-Boc-aminosyren bindes til benzhydrylaminharpiksen ved at det foretas en N,N'-diisopropylcarbodiimid (DIC)/1-hydroxybenzo-triazol (HBT)-befordret kobling i 2-24 timer, fortrinnsvis ca. 12 timer, ved en temperatur mellom 10 og 50°C, fortrinnsvis ved 25°C, i et oppløsningsmiddel som f.eks. diklormethan eller DMF, fortrinnsvis diklormethan. Koblingen av på hverandre følgende beskyttede aminosyrer kan utføres i et automatisk polypeptidsynteseapparat, slik dette er velkjent i faget. Fjerningen av de Na<->beskyttende grupper kan foretas i nærvær av f.eks. en oppløsning av trifluoreddiksyre i methylenklorid, hydrogenklorid i dioxan, hydrogenklorid i eddiksyre eller annen sterk syreoppløsning, fortrinnsvis 50 % trifluoreddiksyre i diklormethan, ved omtrent romtemperatur. Hver beskyttet aminosyre innføres fortrinnsvis i- et omtrent 2,5 molart overskudd, -og koblingen kan utføres i diklormethan, diklormethan/DMF-blandinger, DMF o.l., spesielt i methylenklorid ved omtrent romtemperatur. Koblingsmidlet er normalt DCC i diklormethan, men det kan også være N,N'-di-iso-propylcarbodiimid (DIC) eller annet carbodiimid, enten alene eller i nærvær av HBT, N-hydroxy-succinimid, eller andre N-hydroxyimider eller oximer. Alternativt kan aktive estere av beskyttede aminosyrer

(f.eks. p-nitrofenylestere, pentafluorfenylestere o.l.)

eller symmetriske anhydrider benyttes.

Etter avsluttet syntese i fast fase fjernes det beskyttede polypeptid fra harpiksen. Når bindingen til harpiksbæreren er av benzylestertypen, foretas avspaltningen ved aminolyse med et alkylamin eller flubralkylamin for peptider med en prolin-C-endegruppe, eller ved aminolyse med f.eks. ammoniakk/methanol eller ammoniakk/ethanol for peptider med en glycin-C-endegruppe ved en temperatur mellom 10 og 50°C, fortrinnsvis ved ca. 25°C, i 12-24 timer, fortrinnsvis i ca. 18 timer. Alternativt kan peptidet fjernes fra harpiksen ved omforestring, f.eks. med methanol, med påfølgende aminolyse. Det beskyttede peptid kan renses på dette tidspunkt ved kromatografering på silikagel. Fjerningen av de sidekjedebeskyttende grupper fra polypeptidet foretas ved at aminolyseproduktet behandles f.eks. med vannfritt, flytende hydrogenfluorid i nærvær av anisol eller annen carboniumfjerner, ved behandling med hydrogenfluorid/- pyridin-kompleks, ved behandling med tris-(trifluoracetyl)-bor og trifluoreddiksyre, ved reduksjon med hydrogen og palladium på carbon eller polyvinylpyrrolidon, eller ved reduksjon med natrium i flytende ammoniakk, fortrinnsvis med flytende hydrogenfluorid og anisol ved en temperatur mellom ca. -5-10 og +10°C, fortrinnsvis ved ca. 0°C, i et tidsrom av fra 15 min. til 1 time, fortrinnsvis i ca. 30 min. For de glycinavsluttede peptider på benzhydrylaminharpiksene kan harpiksavspaltnings- og avbeskyttelsestrinnene kombineres i ett enkelttrinn hvor det benyttes flytende hydrogenfluorid og anisol som ovenfor beskrevet. Det fullstendig avbeskyt-tede polypeptid renses deretter ved hjelp av en sekvens av kromatograferingstrinn hvor det gjøres -bruk av en eller flere av de følgende typer behandlinger: ioneveksling på en svakt basisk harpiks i acetatformen; hydrofob adsorpsjonskromatografering på ikke-derivatisert polystyren-divinylbenzen (f.eks. "Amberlite XAD"); adsorpsjonskromatografering på silikagel; ionevekslingskromatografering på carboxy-methylcellulose; fordelingskromatografering, f.eks. på "Sephadex G-25" eller motstrømsfordeling; høytrykksvæske-kromatografering (HPLC), spesielt omvendt fase-HPLC på octyl- eller octadecylsilyl-silika.

Dersom en racemisk aminosyre benyttes il-, 2-, 3-eller 6-stillingen, skilles de diastereomere nonapeptid-eller decapeptid-sluttprodukter fra hverandre, og det ønskede peptid inneholdende en D-åminosyre i den passende stilling isoleres og renses, fortrinnsvis under den ovenfor omtalte kromatograferingsprosess.

Fremstilling av peptider med C-terminale azaglycin-amider foretas fortrinnsvis ved konvensjonell peptidsyntese i oppløsning under anvendelse av kjente peptidmellomproduk-ter. Denne fremstilling beskrives mer inngående i eksempel 3.

De følgende eksempler er gitt for å gjøre fagfolk på området enda bedre i stand til å forstå og utføre den foreliggende oppfinnelse.

Fremstilling A

3-( 2- nafthyl)- D/ L- alanin

Fremstillingen av 3-(2-nafthyl)-D,L-alanin foretas i henhold til prosedyren beskrevet i U.S. patentskrift nr. 4 341 767.

Fremstillingen av N-acetyl-3-(2-nafthyl)-D,L-alanin, dets overføring til methyl-N-acetyl-3-(2-nafthyl)-D,L-alaninat og utskillelsen av D-isomeren utføres etter prosedyren beskrevet i U.S. patentskrift nr. 4 341 767.

Fremstilling B

Benzyl- Na- benzyloxycarbonyl- N, N'- guanidino- diisopropyl- D-homoargininat- toluensulfonat

"En"blanding av 5,24 g benzyl-Na<->bénzyloxycarbonyl-D-lysinat-toluensulfonat (B. Bezus og L. Zervas, J. Am. Chem. Soc, 83, 719 (1961)) og 1,72 ml diisopropylethylamin i 60 ml dioxan behandles med 1,89 g N,N'-diisopropylcarbo-diimid. Reaksjonsblandingen omrøres ved 100°C i 6 timer, avkjøles til romtemperatur og inndampes til et fast stoff. Det faste stoff oppslemmes i 20 ml varmt DMF og filtreres for å fjerne N,N'-diisopropylurea, og filtratet inndampes til et fast stoff. Benzyl-Na<->benzyloxycarbonyl-N,N'-guanidino-diisopropyl-D-homoargininat-toluensulfonat fås som et hvitt, fast stoff ved krystallisering fra methanol/ethylacetat. [a]D = -5-7,26° (C 0,3, MeOH) .

Fremstilling C

Benzyl- Na- benzvloxvcarbonyl- NG. NG'- etheno- D- homoargininat

Til en blanding av 15 ml toluen og 15 ml t-BuOH ble det satt 2,71 g benzyl-Na<->benzyloxycarbonyl-lysinat og 1,46 g 2-methylthioimidazolin-HI (som kan fås fra Aldrich). Blandingens pH-verdi ble brakt til ca. 8 ved tilsetning av diisopropylethylamin, og oppløsningen ble kokt med tilbake-løpskjøling i 24 timer.

Oppløsnignen ble inndampet i vakuum, og residuet ble fylt på en silikagelkolonne (250 g). Kolonnen ble eluert med en gradient fra CH2Cl2/MeOH (19:1) til CH2Cl2/MeOH (7:3). Fraksjonene inneholdende produktet ble påvist ved TLC, slått sammen og inndampet til tørrhet, hvorved det ble erholdt 2,9 g hvitt skum.

En 2 grams porsjon av det ovenfor erholdte produkt ble oppløst i 50 ml EtOH inneholdende 0,8 g 10 % Pd/C. Oppløs-ningen ble omrørt under H2 i 8 timer. Blandingen ble filtrert på celitt, og filtratet ble inndampet til tørrhet, hvorved det ble erholdt 1,2 g N<G>,N<G>'-ethanohomoarginin i form av et hvitt skum.

Ved at man benyttet S-methyl-3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidinethiol (Aldrich) som guanyleringsmiddel, fikk man på tilsvarende måte N<G>,N<G>'-propanohomoarginin i form av et hvitt skum.

Ved at man benyttet S-methyl-bis-(2,2,2-trifluor-ethyl)-thiouroniumjodid som guanyleringsmiddel, fikk man på tilsvarende måte N<G>,N<G>'-bis-(trifluorethyl)-homoarginin (Bth) som et hvitt skum.

Fremstilling D

Na- t- butyloxycarbonyl- N, N1- guanidino- diisopropyl- D- homo-arginin- toluensulfonat

Her illustreres fremstillingen av Na<->t-butyloxycarbonyl-derivater N,N'-guanidino-disubstituert-D-homo-argininer fra deres toluensulfonat-forløpere.

En blanding av 3,25 g benzyl-Na<->benzyloxycarbonyl-N,N'-guanidino-diisopropyl-D-homoargininat-toluensulfonat og 100 mg 10 % Pd/C i 50 ml iseddik behandles med hydrogengass ved atmosfæretrykk i 4 timer. Katalysatoren frafiltreres på celitt, og filtratet inndampes til et fast stoff, bestående av N,N'-guanidino-diisopropyl-D-homoarginin-toluensulfonat. En oppløsning av 2,13 g av denne forbindelse i 60 ml 50 % dioxan/vann behandles med 10 ml IN natriumhydroxyd og 0,4 g magnesiumoxyd. Denne blanding behandles så med 1,1 g di-t-butyldicarbonat og omrøres ved romtemperatur i 2 timer. Magnesiumsaltet frafiltreres, og filtratet konsentreres under vakuum. Den basiske oppløsning vaskes med ethanol, hvoretter pH-verdien bringes til 2,5 med natriumsulfat. Den sure, vandige oppløsning ekstraheres med ethylacetat, og ekstrakten tørkes over magnesiumsulfat. Tørkemidlet frafiltreres, og filtratet inndampes. Ved krystallisering fra ethylacetat/hexan fås Na<->t-butyloxycarbonyl-N,N'-guanidino-diisopropyl-D-homoarginin-toluensulfonat.

Fremstilling E

Na- t- butyloxycarbonyl- 3-( 4'-( 1'- propylpiperidyl))- D- alanin

En 4,6 grams porsjon metallisk natrium ble satt til 400 ml absolutt ethanol, og blandingen ble oppvarmet. Til den resulterende oppløsning av natriumethoxyd ble det satt 21,7 g diethylacetamidomalonat og 16,4 g 4-picolylklorid-hydroklorid (Aldrich Chem. Co.). Reaksjonsblandingen ble oppvarmet ved 100°C i 4 timer, avkjølt, filtrert og inndampet i vakuum. Blandingen ble fylt på en silikagelkolonne i methylenklorid/methanol (19:1) og eluert med den samme blanding. Produktet ble lokalisert som en seig hurtig bevegende UV-positiv flekk ved TLC på silikagel i methylenklorid/methanol (19:1). Sammenslåtte fraksjoner ble inndampet for å tilveiebringe produktet.

Produktet fra det foregående avsnitt ble oppløst i 200 ml ethanol, og oppløsningen ble behandlet med en opp-løsning av 2,72 g natriumhydroxyd i 40 ml vann ved 50°C i 6 timer. Oppløsningen ble surgjort med 12 ml 6N HC1, inndampet til tørrhet og tatt opp i 200 ml dioxan. Oppslem-pningen ble filtrert, og filtratet ble kokt med tilbakeløps-kjøling i 2 timer. Oppløsningen ble avkjølt og inndampet til tørrhet, hvorved man fikk Na<->acetyl-3-(4-pyridyl)-D,L-alanin i form av et hvitt, fast stoff.

En del av denne N-acetylester ble underkastet optisk spaltning ved behandling med 200 ml av enzymet subtilisin Carlsberg- (Sigma Chem. Co., protease VIII) i en blanding av 300 ml dimethylsulfoxyd og 400 ml 0,01M KC1 (pH 7,2). pH-verdien ble opprettholdt gjennom tilsetning av IN NaOH i en pH-stat. Etter 6 timer var den optiske spaltning fullført. Oppløsningen ble fortynnet med 400 ml vann, og det ble foretatt ekstraksjon med 4 x 750 ml ethylacetat. De organiske lag ble slått sammen og tørket over magnesiumsulfat og inndampet, hvorved man fikk ethyl-Na<->acetyl-3-(4-pyridyl)-D-alaninat i form av en olje.

Oljen ble omsatt med 1,22 g n-propylbromid i 50 ml ethanol, hvoretter oppløsningen ble inndampet til tørrhet. Det ble derved erholdt ethyl-Na<->acetyl-3-(1-propyl-pyri-dinium-4-yl)-D-alaninat-bromid i form av et hvitt, hygro-skopisk, fast stoff.

Dette hvite, faste stoff ble oppløst i 200 ml ethanol, og ble redusert under en atmosfære av hydrogengass under anvendelse av 100 ml 10 % Pd/C som katalysator. Etter 18 timers reduksjon ble katalysatoren frafiltrert og opp-løsningen inndampet, hvorved man fikk ethyl-Na<->acetyl-3-(4'-(1'—propylpiperidyl))-D-alaninat i form av et gyllen-brunt, fast stoff. Den frie syre ble fremstilt ved koking av ethylesteren med tilbakeløpskjøling i 100 ml 6N HC1 i 4 timer. Det ble derved erholdt 3-(4'-(1'-propylpiperid-" yl))-D-alanin i form av et hvitt, fast stoff.

Den frie syre ble oppløst i 100 ml dioxan/vann (1:1), og oppløsningen ble behandlet med 2 g di-t-butyldicarbonat. pH-verdien ble holdt på 9 ved tilsetning av IN NaOH i en pH-stat. Etter 2 timer ble reaksjonsblandingen inndampet i vakuum og vasket med 100 ml ethylether. Det vandige lag ble fylt på en kolonne av hydrofob harpiks av typen "Amberlite XAD-2". Kolonnen ble eluert med 250 ml vann etterfulgt av 250 ml 50 % ethanol/vann. Ethanoieluatet ble samlet og inndampet til tørrhet, hvorved man fikk Na<->t-butyloxycarbonyl-3-(4'-(1'-propylpiperidyl))-D-alanin i form av et hvitt, fast stoff.

Fremstilling F

Boc- Gly- O- harpiks

4,9 g Boc-glycin ble oppløst i en blanding av 50 ml ethanol og 50 ml destillert vann. Oppløsningens pH-verdi ble brakt- til 7 med vandig cesiumbicarbonat. Oppløsnings-midlet ble så fjernet under vakuum.

Etter 18 timers tørking under høyt vakuum ble residuet oppløst i 150 ml tørt DMF. 25 g klormethylert polystyren-(1 % divinylbenzen)-harpiks (Merrifield) (svarende til 25 mmol klorid) ble tilsatt. Blandingen ble rystet ved 50°C i 24 timer og filtrert, hvoretter harpiksen ble vasket i rekkefølge med DMF, vann og ethanol. Harpiksen ble tørket under vakuum i 3 dager, hvorved man fikk 28,34 g Boc-Gly-O-harpiks.

Fremstilling G

A. S-methyl-3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidin-thio«hydrojodid

En oppløsning av 23,24 g 3,4,5,6-tetrahydro-2-pyri-midinthiol i 175 ml MeOH ble behandlet med 15,57 ml Mel, og blandingen ble kokt med tilbakeløpskjøling i 1,5 timer. Oppløsningsmidlet ble avdrevet under vakuum, og residuet ble oppslemmet i Et20. Utfellingen ble frafiltrert og tørket i vakuum, hvorved det ble erholdt 51,4 g -S-methyl-3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidinthiol i form av hvite krystaller.

B. Na<->t-butyloxycarbonyl-N<G>,N<G>'-propeno-L-homoarginin

S-methyl-3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidinthiol ble erholdt fra 51,4 g av dens HI-salt ved fordeling mellom 300 ml CH2CI2 og 50 ml 4N NaOH. Den resulterende CH2Cl2-o<pp>løsning ble inndampet til ca. 100 ml, og det ble tilsatt ca. 100 ml EtOH. En oppløsning av 24 g lysin-hydroklorid i 66 ml 2N NaOH ble behandlet dråpevis, ved 60°C, med oppløsningen av S-methyl-3,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidinthiol. Det ble foretatt omrøring natten over ved 60°C under N2. Ytterligere 10,78 g av HI-saltet ble dannet med 15 ml 4N NaOH, ekstra-hert med 90 % CH2CI2 og tilsatt dråpevis under omrøring i løpet av ytterligere 24 timer, ved 60°C, hvoretter reaksjonen var praktisk talt fullført.

Reaksjonsblandingen ble vasket med to porsjoner EtOAc, og det vandige lag inneholdende Pha ble fortynnet med 200 ml dioxan og 200 ml H2. Oppløsningen ble kjølt til 0°C, før 33 g di-t-butyldicarbonat og 6 g MgO ble tilsatt. En ytterligere porsjon på 4 g MgO og 22 g di-t-butyldicarbonat brakte reaksjonen til fullførelse.

Magnesiumoxydet ble frafiltrert på celitt, og filtratet ble inndampet i vakuum til det halve volum. Residuet ble vasket to ganger med Et20, før det ble fylt på en silikagelkolonne (750 g silikagel pakket i CH3CN). Kolonnen ble vasket med 5 1 CH3CN, eluert med 10 % H20/CH3CN (2 1) og eluert videre med 20 % H20/CH3CN (5 1). Produktfraksjonene ble lokalisert ved tynnsjiktskromatografering (CN3CN/HOAC/-H20; 4:1:1) på silikagelplater. Produktfraksjonene ble slått sammen og inndampet, hvorved man fikk 5,04 g av produktet i form av et hvitt skum med smeltepunkt 96°C, [cl]2^ = 16,1°

(C 0,54 MeOH), og dessuten 15 g av en svakt uren olje.

Eksempel 1

N-Ac-D-Nal( 2)- D- pCl- Phe- D- Pal( 3)- Ser- hArq( CHqCFt)2- D- Tyr-Leu- hArglcHoCFr)) o- Pro- D- Ala NBo (Forb. nr. 9 i Tabell 1).

Den i overskriften angitte forbindelse betegnes her også som" N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal (1)-Ser-Bth-D-Tyr-Leu-Bth-Pro-D-Ala-NH2.

I reaksjonsbeholderen i et "Beckman 990"-peptid-synteseapparat ble det anbrakt 0,758 g (0,5 mmol) benzhyd-rylamino-polystyrenharpiks (Peninsula Labs, 0,66 mmol/g)." Den første aminosyre ble tilkoblet ved tilsetning av 0,284 g Boc-D-Ala-OH, 0,202 g HBt og 3 ml 0,5 M diisopropylcarbo-diimid. Etter 3 timers koblingstid og vasking av harpiksen ble ytterligere aminosyrer tilsatt i rekkefølge til denne harpiks ved hjelp av følgende synteseprogram:

Trinn 1-13 fullfører en 'koblingssyklus for én aminosyre, og fullstendigheten av reaksjonen kan kontrolleres ved bruk av ninhydrin-metoden ifølge E. Kaiser et al., Anal. Biochem., 34, 595 (1970).

Harpiksen ble koblet sekvensielt med et 2,0-3,0 molart overskudd av hver beskyttede aminosyre og DIC. Harpiksen ble således behandlet under suksessive koblingssykluser med:

0,269 g Boc-Pro-OH,

0,610 g Boc-Bth-OH,

0,311 g Boc-Leu-OH-H20,

0,375 g Boc-D-Tyr-OH,

0,610 g Boc-Bth-OH,

0,380 g Boc-Ser(benzyl)-OH,

0,320 g Boc-D-Pal(3)-0H,

0,390 g Boc-D-pCl-Phe-OH,

0,400 g Boc-D-Nal(2)-OH og

2,5 ml eddiksyreanhydrid.

Harpiksen ble fjernet fra reaksjonsbeholderen, vasket med CH2C12 og tørket i vakuum, hvorved man fikk 1,43 g beskyttet polypeptidharpiks. Det beskyttede peptid ble av-beskyttet og fjernet fra harpiksen ved behandling med 25 ml vannfritt-, væskeformig HF i nærvær av 2,5 ml anisol (fjerne-middel) i en "Kel-F"-reaksjonsbehoIder ved 0°C i 1 time. Hydrogenfluoridet (HF) ble avdampet under vakuum, og residuet bestående av N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-hArg(cH2CF3)2-D-Tyr-Leu-hArg(CH2<C>F3)2-Pro-D-Ala-NH2 i form av HF-saltet, ble vasket med ether. Residuet ble så ekstra-hert med 3 x 30 -ml iseddik. Eddiksyreekstrakten ble inndampet til tørrhet. Det urene materiale ble overført til acetatsaltet ved at det ble ført i vann gjennom en kolonne av "AG3" (en svakt basisk tertiær aminoharpiks), som var blitt overført til acetatformen. Ved frysetørking av eluatet fikk man 0,5 g av det urene peptidacetatsalt i form av et hvitt, fast stoff.

Det urene peptid ble renset ved HPLC i en 2,5 x 100 cm kolonne av "Licroprep RP-18" (25-40 um) som var blitt brakt i likevekt med bufferen 50 % CH3CN/50 % H20 (0,1 % i CF3-C02H, pH 2,5). Den større UV-absorberende (280 nm) topp som eluerte ved ca. to kolonnevolumer, ble oppsamlet, inndampet til tørrhet og frysetørket tre ganger fra destillert vann, hvorved man fikk 64 mg ren N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-hArg < CH2CF3)2-D-Tyr-Leu-hArg(CH2CF3)2-Pro-D-Ala-NH2, [a]25 = -5-17,96° (C 0,4, HOAc) .

B. Ved at man går frem på tilsvarende måte men benytter den dertil egnede A-, B-, C-, D-, E-, F-, G- eller J-aminosyre istedenfor de ovenfor angitte, ble de decapeptider som nedenfor er angitt som eksempler, fremstilt (se data i Tabell 1): N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2 (Forbindelse nr. 12);

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Mbh-D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2 (Forbindelse nr. 6);

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-PaK3)-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2 (Forbindelse nr. 11);

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2 (Forbindelse nr. 7);

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2 (Forbindelse nr. 14);

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2 (Forbindelse nr. 13);

N-Ae-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2 (Forbindelse nr. 15);

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-8th-Pro-D-AlaNH2 (Forbindelse nr. 22);

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Arg-D-Trp-Leu-Pna-Pro-D-AlaNH2 (Forbindelse nr. 23);

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2 (Forbindelse nr. 24);

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Pha-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2 (Forbindelse nr. 19) og N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2 (Forbindelse nr. 17). C. Ved at man går frem på tilsvarende måte men benytter den dertil egnede A-, B-, C-, D-, E-, F-, G- eller J-aminosyre istedenfor de ovenfor angitte, ble de decapeptider som nedenfor er angitt som eksempler, fremstilt: N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser—Ty r-D-Trp-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2 (Forbindelse nr. 26): N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2 (Forbinelse nr. 27);

N_Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Pha-Pro-D-AlaNH2 (Forbindelse nr. 28);

N_Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2 (Forbindelse nr. 16);

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Mbh-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2 (Forbindelse nr. 29);

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2 (Forbindelse nr. 21) og

N_Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Se.r-Deh-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2 (Forbindelse nr. 34).

Eksempel 2

N-Ac-D- Nal( 2)-D-pCl-Phe-D-Pal( 3)- Ser- hArq( CH2CF^)2- D- Tyr-Leu- hArglcHoCF?)2- Pro- NHEt

For syntese av analoger med en C-terminal Pro-NHCH2-CH3-gruppe benyttes et synteseprogram som er identisk med det beskrevet i eksempel 1. I reaksjonsbeholderen i "Beckman 990"-synteseapparatet anbringes 0,71 g Boc-Pro-O-harpiks, fremstilt ved omsetning av et 1,3 molart overskudd av det tørre cesiumsalt av Boc-Pro-OH med klormethyl-poly-styren/1 % divinylbenzen (Lab Systems, Inc.). Den benyttede mengde Boc-Pro-O-harpiks inneholder 0,5 mmol prolin.

Harpiksen kobles sekvensielt med et 2,0-3,0 molart overskudd av hver beskyttede aminosyre og DIC. Således omsettes harpiksen under suksessive koblingssykluser med:

0,610 g Boc-Bth-OH,

0,311 g Boc-Leu-OH-H20,

0,375 g Boc-D-Tyr-OH,

0,610 g Boc-Bth-OH, '

0,380 g Boc-Ser(benzyl)-OH,

0,320 g Boc-D-Pal(3)-OH,

0,390 g Boc-D-pCl-Phe-OH,

0,400 g Boc-D-Nal(2)-OH og

2,5 ml eddiksyreanhydrid.

Harpiksen fjernes fra reaksjonsbeholderen, vaskes med CH2C12 og tørkes i vakuum, hvorved det fås 1,5 g beskyttet polypeptidharpiks.

Det beskyttede peptid avspaltes fra harpiksen ved aminolyse med 25 ml ethylamin i 18 timer ved 2°C. Ethyl-aminet tillates å avdampe, og harpiksen ekstraheres med methanol. Methanolen avdampes, hvorved det fås 0,7 g beskyttet peptid. Dette beskyttede peptid blandes med 2,5 ml anisol og 25 ml omdestillert (fra C0F3) vannfritt, flytende HF ved 0°C i 1 time i en "Kel-F"-reaksjonsbeholder. Det under vakuum avdampede (HF) og residuet vaskes med ether. Residuet oppløses i 2 M eddiksyre og overføres til acetatsaltet ved at det, i vann, føres gjennom en kolonne av "AG3" som er blitt overført til acetatformen. Ved frysetørking av eluatet fås 0,5 g av det urene peptidacetatsalt i form av et hvitt, fast stoff. Den avsluttende rensing foretas ved preparativ HPLC i en 2,5 cm x 100 mm kolonne med octadecyl-silylert silika (40-50 um) (Merck "Licroprep C^g) under anvendelse av 50 % CH3CH (0,1 % CF3CO2H som elueringsmiddel. Ved frysetørking av produktet fra H2O fås 70 mg N-Ac-D-Nal (2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-hArg(CH2CF3)2-D-Tyr-Leu-hArg-(cH2CF3)2-Pro-NHEt i form av et hvitt pulver.

Ved at man går frem på tilsvarende måte men benytter de dertil egnede beskyttede aminosyregrupper, fås de følgende forbindelse : N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-3th-Pro-NHEt (Forbindelse nr. 39).

Eksempel 3

Forbindelser med formel I ble også fremstilt ved

klassisk syntese i oppløsning.

Eksempelvis kan den følgende metode benyttes til å

koble sammen to pentapeptidfragmenter.

Sammenkoblingen av fragmentene kan foretas etter acyl-azidmetoden (J. Honzel et al., Coll. Czech. Chem. Comm., 26, 2333 (1971), ved DCC/HBT-kobling, etter difenylfosforylazid-teknikken eller ved hjelp av andre racemiserende teknikker

for sammenkobling av frie fragmenter. Forbindelse (2) kan

fremstilles ved hjelp av den ovenstående metode, og forbindelse (1) kan fremstilles ved hjelp av metoder som er analoge med den beskrevet i eksempel 1. Forbindelse (3) fremstilles fra (2) ved fjerning av gruppen Cbz ved hydro-genolyse„ etterfulgt av kobling med N-Boc-N,N'-guanidino-diethyl-D-homoarginin under anvendelse av DCC/HBT eller annet i faget kjent koblingsmiddel.

Ofte vil fragmentene som kobles sammen på denne måte, være peptider eller aminosyrer. Alternativt kan den N-terminale nonapeptidsyre fremstilles ved fast-fase-metoden eller oppløsningsmetoden og deretter kobles til alkylaminer eller semicarbazid-HCl etter dicyclohexylcarbodiimidhydroxy-benzotriazol-metoden eller annen koblingsmetode, for dannelse av analoge forbindelser.

Fremstilling av salter

A. En oppløsning av 0,1 g av hydrogenfluoridet av (N-Ac-D-NalU)<1>, D-pCl-Phe<2>, D-Pal(3)3'<6>, Bth<8>, D-Ala<10>)-LHRH (se eksempel 1) oppløses i 50 ml vann, og oppløsningen føres gjennom en kolonne inneholdende 50 g "Dowex 3" anionveksler-harpiks som på forhånd er blitt brakt i likevekt med eddiksyre og vasket med avionisert vann. Kolonnen elueres med avionisert vann, og avløpet frysetørkes, hvorved man får det tilsvarende eddiksyresalt av (N-Ac-D-Nal(2)<1>, D-pCl-Phe<2>, D-Pal(3)3'<6>, Bth<8>, D-Ala<10>)-LHRH.

B. Når det gjelder salter som er lite oppløselige i vann, kan disse fremstilles ved utfelling fra vann ved bruk av den ønskede syre. Eksempelvis ble for sinktannatsaltets vedkommende en oppløsning av 10 mg (N-Ac-D-Nal(2)<1>, D-pCl-Phe<2>, D-Pal(3)3'<6>, Bth<8>, D-Ala<10>)-LHRH-eddiksyresalt i

0,1 ml vann behandlet med en oppløsning av 8 mg garvesyre i 0,08 ml 0,25 M NaOH. En oppløsning av 5 mg ZnSO^hepta-hydrat i 0,1 ml vann ble straks satt til oppløsningen av LHRH-analogen.

Den resulterende oppslemming ble fortynnet med 1 ml vann, og utfellingen ble sentrifugert. Den overflytende væske ble dekantert, og residuet ble vasket to ganger med 1 milliliters porsjoner vann ved sentrifugering av utfellingen og dekantering av den overstående. Utfellingen ble tørket i vakuum, hvorved det ble erholdt 15 mg av det blandede sinktannatsalt av den ovenfor angitte LHRH-analoge.

Foe. pamoatsaltets vedkommende ble det til en opp-løsning av 50 mg (N-Ac-D-Nal(2)<1>, D-pCl-Phe<2>, D-Pal(3)<3>'<6>, Bth<8>, D-Ala<10>)-LHRH-eddiksyresalt i en blanding av 1,6 ml ethanol og 0,1 ml 0,25 M NaOH tilsatt en oppløsning av 11 mg pamonsyre i 0,3 ml 0,25 M NaOH. Oppløsningsmidlene ble fjernet under redusert trykk, og residuet ble oppslemmet i 2 ml vann, hvorpå det ble foretatt sentrifugering og den overstående væske ble dekantert. Utfellingen ble vasket med 1,5 ml H2O, hvoretter det ble foretatt sentrifugering og den overstående væske ble dekantert. Utfellingen ble tørket i vakuum, hvorved det ble erholdt 54 mg av pamoatsaltet av den ovenfor angitte LHRH-analoge. C. Fremstilling av syreaddisjonssalt fra fritt peptid.

Til en oppløsning av 50 mg (N-Ac-D-Nal(2)<1>, D-pCl-Phe<2>, D-Pal(3)3'<6>, Bth<8>, D-Ala<10>)-LHRH i fri baseform settes 30 ml IN eddiksyre. Den resulterende oppløsning frysetørkes, hvorved.det fås 50 mg av eddiksyresaltet av det ovenstående materiale. D. Fremstilling av salt med metallkation, f.eks. sinksalt.

Til en oppløsning av 50 mg (N-Ac-D-Nal(2)<1>, D-pCl-Phe<2>, D-Pal(3)3'<6>, Bth<8>, D-Ala1<0>)-LHRH-eddiksyresalt i en blanding av 0,4 ml 0,25 M NaOH, 0,3 ml vann og 1 ml ethanol ble det satt en oppløsning av 15 mg ZnS04-heptahydrid i 0,2 ml vann. Utfellingen ble sentrifugert, og den overstående væske ble dekantert. Utfellingen ble vasket med 1 ml vann ved sentrifugering og dekantering av den overstående væske. Utfellingen ble tørket i vakuum, hvorved man fikk sinksaltet av den ovenfor angitte LHRH-analoge.

Eksempel 5

Overføring av salter til den frie base

En oppløsning av 50 mg (N-Ac-D-Nal(2)<1>, D-pCl-Phe<2>, D-Pal(3)3'<6>, Bth<8>, D-Ala10)-LHRH-eddiksyresalt i 25 ml vann føres gjennom en 50 grams kolonne av "Dowex 1" (sterkt basisk, kvartær ammoniumanionvekslerharpiks) som var blitt brakt i likevekt med NaOH-oppløsning for å få hydroxyl som motion. Kolonnen elueres med 150 ml vann, og eluerings-midlet frysetørkes, hvorved det fås 45 mg av det tilsvarende polypeptid i fri baseform.

Eksempel 6

Preparater

De følgende er typiske preparater inne-

holdende som aktiv bestanddel en LHRH-antagonist som er en av de nye forbindelser, f.eks. (N-Ac-D-Nal(2)<1>, D-pCl-Phe<2>, D-Pal(3)<3>'<6>, Bth<8>, D-Ala<10>)-LHRH, som sådan eller i form av et i fysiologisk henseende aksepterbart salt, f.eks. eddik-syreaddisjonssaltet, sinksaltet, sinktannatsaltet osv.

Fremstillingsmetode

(a) LHRH-antagonisten oppløses i vann i tilstrekkelig mengde til å danne et våtgranuleringsmateriale etter blanding med sukkerandelen av eksipientene. Etter fullført blanding-tørkes det granulerte materiale i en brettørker eller en tørker med fluidisert sjikt. Det tørre granulerte materiale siktes deretter for å bryte opp store aggregater og blandes deretter med de gjenværende bestanddeler. Granu-latet sammenpresses deretter i en standard tablettfremstil-lingsmaskin til den spesifiserte tablettvekt. (b) Ved bruk av denne fremstillingsmetode vil alle preparater inneholde 0,01 % gelatin, USP. Gelatinen vil være den første bestanddel som oppløses i det vandige granuleringsoppløsningsmiddel, og den etterfølges av LHRH-analogen. De øvrige trinn vil være som angitt under punkt (a) ovenfor.

Preparat 4 vil også kunne anvendes som en tablett for oral administrering.

B. Preparat med langvarig virkning for intramuskulær injeksjon

1. I. M. injiserbart preparat med langvarig virkning - sesamoljegel

Aluminiummonostearatet føres sammen med sesamoljen, og blandingen oppvarmes til 125°C under omrøring, inntil det dannes en klar, gul oppløsning. Denne blanding steriliseres deretter i autoklav og tillates å avkjøles. LHRH-analogen tilsettes deretter under.aseptiske betingelser og under triturering. Særlig foretrukne LHRH-analoger er salter med liten oppløselighet, f.eks. sinksalter, sinktannatsalter, pamoatsalter o.l. Disse oppviser eksepsjonelt langvarig aktivitet.

2. I. M. injiserbart preparat med langvarig virkning - bionedbrytbare polymermikrokapsler

Mikrokapsler av det ovenfor angitte preparat oppslemmet i:

25 mg mikrokapsler vil bli oppslemmet i 1,0 ml bærer. C. Vandig oppløsning for intramuskulær injeksjon

Eddiksyre, benzylalkohol, mannitol og propylenglycol ble oppløst i 90 % av vannet. Deretter ble antagonisten oppløst i denne oppløsning, og pH-verdien ble innstilt med NaOH. Vann ble tilsatt til den ønskede mengde. Oppløsningen ble filtrert gjennom et filter med maskevidde 1 um, pakket i flasker og sterilisert i autoklav.

D. Vandig preparat for nasal administrering

E. Preparat for rektal administrering

LHRH-antagonisten blandes godt med det smeltede "Witepsol H15", og blandingen helles over i 2 grams former.

Eksempel 7

Karakteriserende data for forbindelser fremstilt i henhold til de foregående eksempler er gitt i tabeller 1 og 2:

Eksempel 8

Biologisk aktivitet

( a) UNDERTRYKKELSE AV TESTOSTERON

Undertrykkelsen av testosteron ble målt ved hjelp av den følgende forsøksprosedyre: Det ble foretatt to undersøkelser, ved hver av hvilke det ble benyttet elleve eller tretten voksne, uskadede beagle-hannhunder (fra 1,5 til 6,5 år gamle; skaffet til veie fra Syntex, LRE, Ridglan eller White Eagle). Hver uke, i 6 uker, plasseres dyrene tilfeldig i en av dosegruppene på elleve eller tretten dyr (bærer eller en av flere forskjellige doser av hver LHRH-antagonist), slik at det fås seks hunder pr. dosegruppe. Dyrene i gruppe 1 gis én enkelt subkutan injeksjon av 0,1 ml bærer pr. kg kroppsvekt. Dyrene i de øvrige grupper gis de doser som er angitt i det etter-følgende Skjema 1 (y.g forbindelse/0,1 ml injeksjonsvolum/kg kroppsvekt). Bæreren bestod av en 50/50-blanding av propylenglycol og saltoppløsning. Hepariniserte blodprøver på ca. 3 ml ble oppsamlet fra hver hund, via hodevenen, straks før injeksjonen og 30 min., 1 time, 2 timer, 4 timer, 6 timer, 8 timer og 24 timer etter injeksjonen. Straks etter blod-tagningen ble blodprøvene anbrakt på is. Plasma ble utvunnet ved sentrifugering og sugning i løpet av 2 timer og ble opp-bevart ved *20°C før radioimmunologisk måling (RIA) av testosteroninnholdet ble foretatt.

Resultatene av de to undersøkelser ble samlet, og testosteroninnholdet ble avsatt som funksjon av dosen -for å få frem ID5ø-verdier (den dose som kreves for å oppnå 50 % av den maksimale undertrykkelse av testosteron over 8 timer). Disse verdier er gitt i tabell 3, som også viser styrken i forhold til en standard LHRH-antagonist, "Detirelix" (RS-68439) .

Skjema 1. Dosegrupper

Undersøkelse 1 (elleve dosegrupper):

Undersøkelse 2 (tretten dosegrupper):

( b) FRIGJØRING AV HISTAMIN OG EGGLØSNINGSHINDRENDE AKTIVITET

Frigjøringen av histamin og den eggløsningshindrende aktivitet ble sammenlignet for representative forbindelser blant de nye forbindelser under anvendelse av de følgende prosedyrer:

1. BESTEMMELSE AV FRIGJØRINGEN AV HISTAMIN

Blandede peritoneale celler ble utvunnet fra tre eller fire Sprague Dawley hannrotter (350 g, Iffa-Credo, Frank-rike) ved intraperitoneal injeksjon av 10 ml 0,9 % NaCl (inneholdende" 50 ug/ml heparin). Etter forsiktig massasje av bukhulen i 1 min. ble de peritoneale celler fjernet, samlet og sentrifugert i 5 min. ved 1500 o./min. Etter tre skyllinger i CA<++->fri Krebs-Ringer buffer (KRB) av sammen-setning: 141,9 mM NaCl; 4,7 mM KCl; 1,2 mM MgS04; 2,5 mM Na2HP04; 0,6 rnM KH2PO4 ble cellene tellet under et mikroskop og spedd ut i det passende volum CA<++->fri KRB til å gi en celletetthet på ca. 2 x 10~<6> celler/ml. Aliguoter på 0,5 ml ble forvarmet med 0,3 ml CA<++->fri KRB i 5 min. ved 35°C, og 0,1 ml av den passende oppløsning av forbindelsen som skulle testes, ble tilsatt. Etter 5 min. ble reaksjonen startet ved tilsetning av 0,1 ml KRB inneholdende CA<++> i tilstrekkelig mengde til å oppnå den nødvendige konsentrasjon. Etter 15 min. ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 2,5 ml iskald CA<++->fri KRB, og blandingen ble anbrakt på is. Etter sentrifugering av cellesuspensjonen ble histamininnholdet i den overstående væske bestemt fluorimetrisk etter metoden ifølge Shore et al., (1959) Immunol., 127, 182-186, idet man utelot ekstraksjonsprosedyren (eksitasjon ved 365 nm; ut-stråling ved 450 nm). Ingen av reagensene fluorescerte med o-fthaldialdehyd ved de konsentrasjoner som ble benyttet under forsøkene.

Det totale histamininnhold i cellesuspensjonen ble bestemt etter lydbølgebehandling (2 minutter - 5 sekunders pulser).

Den spontane histaminfrigjøring ble subtrahert fra alle de målte verdier.

Beregninger:

Den prosentvise histaminfrigjøring ble beregnet ved hjelp av den følgende ligning:

Histamin i cellefri overstående væske

r. spontan frigjøring x i<qq >Total mengde histamin i cellesuspensjonen

Reagenser og apparatur:

o-fthaldialdehyd ble tilveiebrakt fra Fluka (nr. 79760). Alle de øvrige forbindelser var av analysekvalitet og var oppløst i CA<++->fri KRB. Det benyttede fluorimeter var en Perkin'Eimer modell 2000. Lydbølgebehandlingen ble foretatt med VIBRA-CELL (Sonics Materials) med mikrospisser.

2. PRØVNING AV EGGLØSNINGSHINDRENDE EGENSKAPER

PROSEDYRE: Hunnrotter akklimatiseres til laboratoriebeting-elser (lys:mørke 14:10, idet lyset slås på kl 5 om ettermiddagen) i minst 7-10 dager. Daglig vaginale lavager foretas på hver rotte mellom 7:30 a.m. og 9:00 a.m. i minst 12 dager. Cyto-logien av de vaginale lavager undersøkes mikro-skopisk for å bestemme estrussyklusens stadium. Rotter med minst to normale 4-dagers sykluser forut for den angjeldende" syklus foretrekkes.

Om morgenen den dag estrus forventes, avlives rottene, hvoretter egglederne fjernes og under-søkes under et disseksjonsmikroskop med henblikk på tilstedeværelse av nylig løsnede egg. Eggene presses ut av egglederen og telles. Den prosentvise andel av hunnrottene som har eggløsning, avsettes som funksjon av logaritmen av dosen for beregning av ED50 for den eggløsningshindrende aktivitet.

Histaminfrigjøringsaktiviteten og den eggløsnings-hindrende aktivitet er oppført i den følgende tabell 4.

Claims (10)

1. Nonapeptid- og decapeptidanaloger av LHRH for anvendelse for regulering av fruktbarheten og forplantningssyklusen hos mennesker og husdyr, karakterisert ved at de er forbindelser med den generelle formel: hvor: A er en aminosyregruppe valgt blant D- og L-isomerene av N-Ac-3-(l-nafthyl)-D,L-alanyl og N-Ac-3-(2-nafthyl)-D,L-alanyl, B er en aminosyregruppe valgt blant D-fenylalanyl, D-p-klorfenylalanyl, D-p-fluorfenylalanyl og D-cc-methyl-p-klor-fenylalanyl, C er en aminosyregruppe valgt blant D-tryptofanyl og 3-(3-pyridyl)-D-alanyl, D er én aminosyregruppe valgt blant L-fenylalanyl, L-tyrosyl, 3-(3-pyridyl)-alanyl og arginyl eller er lik G, hvor n er.1-5, R<1> er alkyl med 1-6 carbonatomer eller fluoralkyl og R2 er hydrogen eller R<1>, E er 3-(3-pyridyl)-D-alanyl, D-tyrosyl, D-tryptofanyl eller G, hvor n er 1-5, R<1> er alkyl med 1-6 karbonatomer, R<2> er hydrogen eller R<1>; F er en aminosyregruppe valgt blant L-leucyl og L-fenylalanyl, G er en aminosyregruppe med den generelle formel: hvor n er fra 1 til 5, R<1> er alkyl med 1—6 carbonatomer eller fluoralkyl med 1-4 carbonatomer, og R2 er hydrogen eller R<1>, og J er D-alaninamid eller glycinamid, og i fysiologisk henseende aksepterbare salter derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er en forbindelse med den generelle formel (I) hvor: A er N-Ac-D-Nal(2), - B er D-pCl-Phe, C er D-Trp eller D-Pal(3), D er Tyr, Arg, Deh, Mbh, Bth eller Pha, F er Leu, og J er D-AlaNH2, eller et i fysiologisk henseende aksepterbart salt derav.

3. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at den er N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-G-Pro-D-AlaNH2 eller et i fysiologisk henseende aksepterbart salt derav.

4. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at den er N-Ac-D-Nal(2 )-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2 eller et i fysiologisk henseende aksepterbart salt derav.

5. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at den er er N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Mbh-D-Pal(3)-Leu-Mbh-Pro-D-AlaNH2 eller et i fysiologisk henseende aksepterbart salt derav.

6. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at den er N-Ac-D-Nal(2)-D- • pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Pal-D-Pal(3)-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2 eller et i fysiologisk henseende aksepterbart salt derav.

7. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at den er N-Ac-D-Nal(2 )-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Pal(3)-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2 eller et i fysiologisk henseende aksepterbart salt derav.

8. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at den er N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Bth-D-Tyr-Leu-Bth-Pro-D-AlaNH2 eller et i fysiologisk henseende aksepterbart salt derav.

9. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at den er N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-Q-Pal(3)-Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Deh-Pro-D-AlaNH2 eller et i fysiologisk henseende aksepterbart salt derav.

10. Preparat for regulering av fruktbarheten og forplantningssyklusen hos mennesker og husdyr, karakterisert ved at det inneholder en forbindelse ifølge krav 1-9 i blanding med minst én i fysiologisk henseende aksepterbar eksipient.