HU215855B

HU215855B - Eljárás LH-RH-analógok és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására

Info

Publication number: HU215855B
Application number: HU19/88A
Authority: HU
Inventors: John J. Nestor; Brian H. Vickery
Original assignee: Syntex U.S.A. Inc.
Priority date: 1987-02-05
Filing date: 1988-02-04
Publication date: 2001-02-28
Also published as: NL300016I2; IE63707B1; NO2001001I1; JPH0791314B2; FI92211C; NO301014B1; NO922632D0; HK35997A; NO880494D0; DE3850789T2; FI92326C; FI880509A; EP0277829A3; DE10075027I1; IE880298L; NO922632L; BR1100688A; MX9202737A; ATE109159T1; FI930694A

Abstract

A találmány tárgya az új (I) általános képletű LH–RH-analógok, ezekettartalmazó gyógyászati készítmények és eljárás ezek előállítására;ebben a képletben A jelentése N-(2–5 szénatomos)-alkanoil-D-3-(2-naftil)-alanil-csoport; B jelentése D-(p-klór-fenil)-alanil- vagy D-(p-fluor-fenil)-alanil-csoport; C jelentése D-triptofil- vagy D-3-(3-piridil)-alanil-csoport; D jelentése L-tirozil-, L-alanil-, L-(3-piridil)-alanil-csoport vagy (II) általános képletű csoport, amelybenR1 jelentése 2–6 szénatomos alkilcsoport és R2 jelentése hidrogénatom,vagy R1 és R2 jelentése azonosan 1–4 szénatomos alkilcsoport vagy ?-trifluor-(2–4 szénatomos)-alkil- | csoport, vagy az R1–NH–C=NR2 rész jelentése (3-piridil)-CH2–CO–vagy nikotinoilcsoport, n =4; E jelentése D-tirozil-, D-triptofil-, D-3-(3-piridil)-alanil-csoport vagy (II) általános képletű csoport, aholR1 jelentése 2–6 szénatomos alkilcsoport és R2 jelentése hidrogénatom,vagy R1 és R2 jelentése azonosan 1–4 szénatomos alkilcsoport vagy R1és R2 jelentése együtt egy 2–5 szénatomos egyenes láncúalkiléncsoport, n =4; F jelentése L-leucil- vagy L-fenil-alanil-csoport; G jelentése L-arginil-csoport vagy (II) általános képletűcsoport, és ebben R1 jelentése 2–6 szénatomos alkilcsoport és R2jelentése hidrogénatom vagy ?-trifluor-(2–4 szénatomos)-alkil-csoport,R1 és R2 jelentése azonosan ?-trifluor-(2–4 szénatomos)-alkil-csoportvagy 1–4 szénatomos alkilcsoport, vagy R1 és R2 jelentése együtt egy2–5 szénatomos egyenes láncú alkiléncsoport; J jelentése D-alanil-NH2csoport. Az új LH–RH-analógok LH–RH-antagonista hatásúak. ŕ

Description

A találmány tárgya új, a luteinizálóhormont felszabadító hormont (LH-RH) antagonizáló hatású LH-RHanalógok, ezeket tartalmazó gyógyszerészeti készítmények és eljárás ezek előállítására.

A hipofízis elülső lebenyéből a hipotalamuszban képződő luteinizálóhormont felszabadító hormon (LH-RH; LH/FSH-RH; GnRH) ellenőrzése alatt luteinizálóhormon (LH) és tüszőstimuláló hormon (FSH) szabadul fel. Az LH és az FSH úgy hat az ivarmirigyekre, hogy a szteroidhormonok szintézisét és a gaméták érését stimulálja. Az LH-RH lüktetőfelszabadulása és ezáltal az LH és FSH felszabadulása szabályozza a háziállatok és emberek reprodukciós ciklusát.

Az LH-RH hat a placentára és ezért indirekt módon az ivarmirigyekre is, a korion-gonadotropin (CG) szintézisét és felszabadulását idézi elő.

(piro)Glu-His-Trp-Ser12 3 4

Ennek a természetes anyagnak az analógjait gyakran rövidített formában írják le oly módon, hogy egy adott aminosav szubsztituensének megjelölése mellett az aminosav helyzetét egy felső index segítségével adják meg, majd az LH rövidítés következik. Nagyon sok LH-RH-analógot tanulmányoztak, amelyek döntő többsége nem rendelkezett a klinikai alkalmazáshoz elegendő biológiai hatással. Bizonyos kiválasztott analógok azonban potencírozzák az agonisták biológiai hatását A 6-helyzetü glicinnek D-aminosavra való cserélése az agonista hatás szignifikáns növekedését eredményezi.

Az agonisták mellett olyan analógokat is előállítottak, amelyek az LH-RH kompetitív antagonistái, ezek mindegyikéből a 2-helyzetű hisztidilcsoportot elhagyták vagy mással helyettesítették [Vale, W. és munkatársai, Science, 176, 933 (1972)]. Általában úgy tűnik, hogy akkor kapják a legjobb hatást, ha a szekvencia ezen helyére D-aminosavat tesznek [Rees, R. W. A. és munkatársai, J. Med. Chem. 17, 1016 (1974)].

Emellett egy 6-os helyzetben való módosítás (amely a 2-helyzetben végzett módosítás nélkül a fenti agonista hatást eredményezi) a 2-helyzetben módosított analógok antagonista hatását növeli [Beattie, C. W. és munkatársai, J. Med. Chem. 18, 1247 (1975); Rivier, J. és munkatársai, Peptides 1976, 427. oldal, Editions de l’Universite de Bruxelles, Belgium (1976)].

Ezen két fő változtatás mellett, amelyek potenciálisabb LH-RH-antagonistákat eredményeznek, a már 2és 6-helyzetben módosított peptidek 1-, 3-, 5- és/vagy 10-helyzetében végrehajtott változtatásokkal az antagonista hatás további növekedését érhetjük el [Coy, D. H. és munkatársai, Peptides 1976, 462. oldal, Edition de l’Universite de Bruxelles, Belgium (1976); Rivier, J. E. és munkatársai, Life Sci., 23, 869 (1978); Dutta A. S. és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun. 81, 382 (1978), Humphries, J. és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun. 85, 709 (1978)]. Az is bebizonyosodott, hogy az 1-helyzetű aminosav N-acilezése is javítja a hatást [Channabasavia, K. és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Commun. 81, 382 (1978); Coy,

Az LH-RH-antagonisták a termékenység szabályozására használhatók, így nőnemű egyedekben blokkolják az ovulációt és hímneműekben visszaszorítják az ondóképződést. Ezen hatások következményeként az ivarmirigyből származó szteroid ivari hormonok normális keringési szintjei visszaszorulnak, ami a hím és nőnemű egyedekben a járulékos szervek súlyának csökkenését okozza. A háziállatokban ez a hatás elnyomja a nemi ciklust és viselkedést (hizlalás esetén elősegíti a súlygyarapodást), a terhes állatokban megindítja a vetélést és általában kémiai sterilizálószerként hat.

A természetes LH-RH-felszabadító hormon olyan dekapeptid, amely a természetben előforduló aminosavakból épül fel, ezek az akirális glicin kivételével Lkonfigurációjúak. Szekvenciájuk a következő:

Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂6 7 8 9 10

D. H. és munkatársai, Peptides - Structure and Biological Function, 775. oldal, Pierce Chemical Co. (1979)]. Emellett egy, a 6-os helyzetben D-arginint tartalmazó nagyon hatásos antagonistát, az [N-Ac-D-pCl-Phe¹, DpCl-Phe², D-Trp³, D-Arg⁶, D-Ala¹⁰]LH-RH-t D. H. Coy ismertetett [Endocrinology, 110, 1445 (1982)].

Sajnálatos módon azonban a 6-os helyzetben Darginint tartalmazó LH-RH-analógok csoportjáról kiderült, hogy az ovulációellenes hatás mellett a fehérvérsejtekre is hatnak, mégpedig azok degranulációját (szemcsevesztését) idézik elő [Schmidt és munkatársai, Contraception, 29, 283 (1984)] és ezáltal in vivő ödémát okoznak. így például az [N-Ac-D-Nal(2)¹, D-pClPhe², D-Trp³, D-Arg⁶]LH-RH patkányfehérvérsejtből való hisztaminfelszabadításra vonatkozó ED₅₀-értéke 0,2 pg/ml in vitro. Ez a mellékreakció klinikai szempontból fontos, mivel az ebből eredő anafilaxiás reakció életveszélyes lehet.

A szakterületen jól ismert, hogy a pozitív töltésű, különösen a több pozitív töltéssel rendelkező molekulák, amelyek egyúttal hidrofóbok is, hatásos fehérvérsejt-degranulátumok [Foreman and Jordán, Agents and Actions, 13, 105 (1983)]. A két (azaz a 6- és 8-helyzetben lévő) argininrészt tartalmazó analógok esetében ezt a problémát először úgy próbálták elkerülni, hogy növelték a távolságot a két csoport között {például [NAc-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², D-Trp³, Arg³, D-Tyr⁶, DAla¹⁰]LH-RH, a hisztaminfelszabadításra vonatkozó ED50=2pg/ml, R. W. Roeske és munkatársai, „Substitution of Arg⁵ fór Tyr⁵ in GNRH-antagonists”, Peptides : Structure and Fuction, C. M. Deber, V. J. Hruby, K. D. Kopple (Eds.), Pierce Chemical Co., Rockford IL, 1985, 561. oldal}. Noha ez a változtatás az analóg fehérvérsejt-degranuláló és hisztaminfelszabadító hatását csökkentette, az analóg még így is sokszorta nagyobb anafilaxiás potenciálú maradt az LH-RH-hoz viszonyítva, amelynek hisztaminfelszabadításra vonatkozó ED50-értéke 328 pg/ml.

Az LH-RH-antagonisták különböző helyzeteibe Lys(iPr)-t is építettek be. Amikor a 6-os és 8-as helyzet2

HU 215 855 Β ben tartalmazta ezt a részt az analóg és a 2-es helyzetben D-pCl-Phe csoport volt, a nagy ovulációellenes hatás megmaradt, a hisztaminfelszabaditó hatás pedig csökkent {például [N-Ac-D-Nal(2)¹, pCl-Phe², D-Trp³, DLys(iPr)⁶, Lys(iPr)⁸, D-Ala^l0]LH-RH; ED50=6,6 pg/ml (hisztaminfelszabadítás)}. Egy másik analógba hArg(Et2)-t építettek be a 8-helyzetbe, így azonos hisztaminfelszabadító potenciálú peptidet kaptak {[N-Ac-DNal(2)i, D-alfaMe-pCl-Phe², D-Pal(3)³, D-Arg⁶, hArg(Et2)⁸, D-Ala¹⁰]LH-RH; ED_S0=4,9 pg/ml (hisztaminfelszabadítás)}. Látható, hogy az LH-RH-hoz viszonyítva ezek az analógok még mindig nagyon nagy hisztaminfelszabadító hatással rendelkeznek [R. W. Roeske és munkatársai, „LH-RH Antagonists witb Low Histamin Releasing Activity”, LH-RH and its Analogs: Contraceptive and Therapeutic Applications, Part 2, Β. H. Vickery and J. J. Nestor Jr. (Eds), MTP Press, Boston, 1987,17-24 oldal].

Azt is megállapították, hogy a hisztaminfelszabadítás megakadályozása szempontjából a 8-as és 9-es helyzet a fontos, mivel az Arg-Pro szekvencia gyakran megtalálható olyan neuropeptidekben, amelyek fehérvérsejt-degranulációt okoznak. így, noha tudományos alapon a 8-as helyzet a szubsztitúció szempontjából kritikus, a jelenleg ismert analógoknál még mindig nagy a toxicitás és más mellékhatások valószínűsége.

A jelen találmány olyan új, nagyon hatásos nonapeptid és dekapeptid LH-RH-analógok előállítására vonatkozik, amelyek minimális hisztaminfelszabaditó hatással rendelkeznek, és szerkezetükre a 8-as helyzetben egy szférikusán gátolt, guanidinocsoporttal helyettesített arginilcsoport, valamint a 6-os helyzetben az arginilcsoport távolléte jellemző. A találmány emellett kiterjed ezen vegyületeket vagy gyógyászati szempontból elfogadható sóikat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására is.

A találmány szerint előállítható új LH-RH-analóg peptidek aminosavszekvenciáját az (I) általános képlet ábrázolja. Ebben a képletben

A jelentése N-(2-5 szénatomos)-alkanoil-D-3-(2-naftil)-alanil-csoport;

B jelentése D-(p-klór-fenil)-alanil- vagy D-(p-fluor-fenil)-alanil-csoport;

C jelentése D-triptofil- vagy D-3-(3-piridil)-alanil-csoport;

D jelentése L-tirozil-, L-arginil-, L-3-(3-piridil)-alanil-csoport vagy (II) általános képletű csoport, amelyben

R¹ jelentése 2-6 szénatomos alkilcsoport és

R² jelentése hidrogénatom vagy

R^l és R² jelentése azonosan 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy ü)-trifluor-(2-4 szénatomos)-alkilcsoport, vagy az R*-NH-C=NR² részjelentése (3-piridil)-CH₂-CO- vagy nikotinoilcsoport, n=4;

E jelentése D-tirozil-, D-triptofil-, D-3-(3-piridil)-alanil-csoport vagy (II) általános képletű csoport, ahol R¹ jelentése 2-6 szénatomos alkilcsoport és R² jelentése hidrogénatom, vagy

R¹ és R² jelentése azonosan 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy

R¹ és R² jelentése együtt egy 2-5 szénatomos egyenes láncú alkiléncsoport, n=4;

F jelentése L-leucil- vagy L-fenil-alanil-csoport;

G jelentése L-arginil-csoport vagy (II) általános képletű csoport, és ebben

R¹ jelentése 2-6 szénatomos alkilcsoport és

R² jelentése hidrogénatom vagy co-trifluor-(2-4 szénatomos)-alkil-csoport, vagy

R¹ és R² jelentése azonosan w-trifluor-(2-4 szénatomos)-alkil-csoport vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport, vagy

R¹ és R² jelentése együtt egy 2-5 szénatomos egyenes láncú alkiléncsoport;

J jelentése D-alanil-NH₂ csoport.

A találmány körébe tartozik az (I) általános képletű peptidek gyógyászatilag elfogadható sóinak, valamint az (I) általános képletű peptideket és/vagy sóikat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítása is.

A természetes LH-RH eredeti szekvenciájának módosítása, egyes L-aminosavak más L-aminosavakra vagy pedig azonos vagy más D-aminosavakra való kicserélése - amint ezt fentebb már említettük - lényeges változásokat eredményez a peptid biológiai tulajdonságaiban is. így különösen meg kell említeni, hogy az LH-RH 2-es helyzetében levő L-hisztidil-csoport más csoporttal való helyettesítése a peptidet LH-RHantagonistává változtatja. Az LH-RH 6-helyzetében lévő glicilcsoport valamelyik E csoporttal való helyettesítése az antagonista hatást drámaian megnöveli. Az 1-,

2- , 3-, 5-, 7- és 10-helyzetben a leírásban ismertetett helyettesítések az antagonista hatás további erősítését segítik elő. A 8-helyzetben a G helyettesítő az analógok hisztaminfelszabaditó potenciálját jelentősen csökkenti, ha a 6-helyzetű csoport Arg-tól eltérő, és ezért a vegyületek biztonságos hatóanyagként való alkalmazása szempontjából kritikus.

Mint azt az előzőekben is tettük, a találmány leírásának megkönnyítésére a különféle aminosavak esetében a peptidkémiában elfogadott, IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature által javasolt [Biochemistry, 11, 1726 (1972)] hagyományos rövidítéseket alkalmazzuk. Minden említett peptidszekvenciát az általánosan elfogadott egyezménynek megfelelően írunk, amely szerint az N-terminális aminosav a bal oldalon és a C-terminális aminosav a jobb oldalon található.

Az alkalmazott rövidítések L-aminosavakat jelentenek az akirális aminosav, a glicin és további természetes és nem természetes akirális aminosavak és azon esetek kivételével, amikor D vagy DL jelölést használunk.

Bizonyos további rövidítések is hasznosak a találmány leírásánál. A találmány a természetes LH-RHpeptid aminosavait olyan aminosavakkal helyettesíti, amelyek nem fordulnak elő a természetben. Ezek közül különösen gyakran alkalmazottak a következők. Aminosavcsoport Rövidítés

3- (2-naftil)-alanil Nal(2)

3-(p-fluor-fenil)-alanil pF-Phe

HU 215 855 Β

Aminosavcsoport	Rövidítés
3-(p-klór-fenil)-alanil	pCl-Phe
3-(3-piridil)-alanil	Pal(3)
N,N’-guanidino-(dietil)-
homoarginil	Deh vagy hArg(Et)₂	5
N,N’-guanidino-(propeno)-
homoarginil	Pha vagy hArg(CH₂)₃
N,N ’ -guanidino-bisz(2,2,2-
trifluor-etil)-homoarginil	Bth vagy hArg(CH₂CF₃)₂
N^G-etil-N°’-trifluor-etil-		10
homoarginil	hArg(CH₂CF₃, Et)
N-guanidino-(butil)-
homoarginil	Mbh vagy HArg(Bu)
N^E-nikotinoil-D-lizil	Lys(Nic)
N^E-(3-piridil)-acetil-D-lizil	Lys(piridil-acetil)	15

A „gyógyászatilag elfogadható sók” kifejezés a leírásban olyan sókra utal, amelyek az eredeti vegyület kívánt biológiai hatását megtartják és nincs nemkívánatos toxikológiai hatásuk. Ilyen sók (a) a szervetlen savakkal képzett savaddíciós sók, például a hidrogén-kloriddal, 20 hidrogén-bromiddal, kénsavval, foszforsavval, salétromsavval és hasonlókkal képezett sók; és a szerves savak, így az ecetsav, oxálsav, borkősav, borostyánkősav, maleinsav, fumársav, glükonsav, citromsav, almasav, aszkorbinsav, benzoesav, csersav, pamoesav, alginsav, poli- 25 glutaminsav, naftalinszulfonsavak, naftalindiszulfonsavak, poligalakturonsavak sói; (b) a többértékű fémkationokkal, így cinkkel, kalciummal, bizmuttal, báriummal, magnéziummal, alumíniummal, rézzel, kobalttal, nikkellel, kadmiummal és hasonlókkal képezett bázisaddíciós 30 sók; vagy valamely szerves, például N,N’-dibenzil-etilén-diaminból vagy etilén-diaminból képezett kationnal alkotott sók; vagy (c) az (a) és (b) alatt említettek kombinációi, például cink-tannát-sók és hasonlók.

A fluor-alkil-csoport kevés szénatomos, 1-5 fluor- 35 atommal helyettesített csoportokat, például CF₃CH₂~, CF₃-, CF₃CF₂CH₂- és hasonló csoportokat jelent.

A halogénatom fluor-, klór- vagy brómatom.

Az „N-Ac” az N-acetil-védőcsoportot jelöli, azaz olyan acetilcsoportot jelent, amely a terminális amino- 40 csoport aminonitrogénjéhez kapcsolódik, az általános elfogadott nómenklatúrával összhangban.

A találmány szerinti vegyületek közül előnyösek azok, amelyekben

A N-Ac-D-Nal(2); 45

B D-pF-Phe vagy D-pCl-Phe;

C D-Trp vagy Pal(3);

D Pal(3), Tyr, Arg, Deh, Mbh, Bth vagy Pha;

E D-Trp, D-Tyr, D-Pal(3), D-Deh, D-Mbh, D-Pha vagy D-Bth; 50

F Leu vagy Phe;

G Deh, Bth, Mbh vagy Pha; és J D-AlaNH₂.

Még előnyösebbek azok a láncok, amelyekben A N-Ac-D-Nal(2); 55

B D-pCl-Phe;

C D-Trp vagy D-Pal(3);

D Tyr, Arg, Deh, Mbh, Bth vagy Pha;

E D-Trp, D-Pal(3), D-Tyr, D-Deh, D-Mbh, D-Bth vagy D-Pha; 60

F Leu;

G Deh, Mbh, Bth vagy Pha; és

J D-AlaNH₂.

Ezen igen előnyös csoporton belül három előnyös alcsoportot említhetünk.

1. Ha D Tyr, E lehet (a) a D-Trp, D-Pal(3), D-Nal(2) vagy D-Tyr hidrofób csoport, de legelőnyösebben D-Pal(3) csoport, vagy (b) D-Deh; D-Mbh, D-Bth vagy D-Pha;

2. Ha D Arg, E előnyösen a fentebb említett 1 (a) hidrofób csoportok egyike és legelőnyösebben D-Tyr;

3. Ha D Deh, Mbh, Bth vagy Pha, E legelőnyösebben D-Tyr vagy D-Pal(3), de a D-Nal(2) és D-Trp csoportok szintén előnyösek.

Minden előnyös alcsoportban G Deh, Mbh, Bth vagy Pha. Különösen előnyösek a Bth és Deh, és legelőnyösebb a Deh.

A legelőnyösebb szerkezetekre példaként a következőket említhetjük:

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-Tyr-C-Leu-GPro-D-AlaNH₂, amelyben C D-Trp vagy D-Pal(3) és G Deh, Mbh, Bth vagy Pha; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-Tyr-E-Leu-GPro-D-AlaNH₂, amelyben C D-Trp vagy D-Pal(3),

E D-Deh, D-Bth, D-Mbh vagy D-Pha, és G az ebben a bekezdésben megadott E csoportok Lizomeije;

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-Arg-E-Leu-GPro-D-AlaNH₂, amelyben C D-Trp vagy D-Pal(3)

E D-Trp, D-Pal(3), D-Nal(2) vagy D-Tyr, és G Deh, Mbh, Bth vagy Pha; és N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-D-E-Leu-G-ProD-AlaNH₂, amelyben C D-Tip vagy D-Pal(3),

D és G egymástól függetlenül Deh, Bth, Mbh vagy

Pha és

E D-Tyr, D-Nal(2), D-Trp vagy D-Pal(3).

További előnyös vegyületek azok, amelyekben NAc-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-E-LeuG-Pro-D-AlaNH₂ lánc van, és abban E D-Trp, D-Tyr vagy D-Nal(2) és G Deh, Bth, Mbh vagy Pha; N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-C-Ser-D-E-Leu-G-ProD-AlaNH₂ lánc van, és abban D és G egymástól függetlenül Deh, Bth, Mbh vagy Pha, és C és E egymástól függetlenül D-Trp vagy D-Pal(3); és

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-Ser-Tyr-DPal(3)-Leu-G-Pro-D-AlaNH₂, és abban G Deh, Bth, Mbh vagy Pha.

A találmány szerinti vegyületek, különösen a sóik, meglepő mértékű és hosszan tartó LH-RH-antagonista hatást fejtenek ki.

Az LH-RH-antagonista hatás első jellemzője, hogy a vegyületek patkányokban az ovulációt gátolják, ennek meghatározását Corbin, A. és Beattie, C. W. írta le [Endocrine Rés, Commun., 2, 1 (1975)].

A vegyületeknek a patkány peritoneális hízósejtjeiből hisztamin felszabadulását okozó képességét in vitro

HU 215 855 Β

Sydbom és Terenius [Agents and Actions, 15, 269 (1985)] vagy Siraganian és munkatársai (Manual of Clinical Immunology, 2d Ed, N. E. Rose and M. Friedman, Eds, Amer. Soc. Microbiol., Washington, D. C., 1980, 808. oldal) szerint mérhetjük.

A találmány szerinti vegyületek és LH-RH-antagonisták biológiai vizsgálatára más módszereket is használhatunk:

(a) LH-RH által indukált FSH- és LH-felszabadulás gátlása patkányokban, in vivő; Vilchez-Martinez, J. A. és munkatársai, Endocrinology, 96, 1130 (1975); és (b) diszpergált hipofízis elülső lebenyéből származó sejttenyészetből való LH- és FSH-felszabadulás gátlásának radioimmun-módszerrel való mérése [Vale, W. és munkatársai, Endocrinology 91, 562 (1972)];

(c) kasztrált patkányban és kutyában a gonadotropinszintek gátlása [Petrie és munkatársai, Male Contraception, Harper and Row, Philadelphia (1975), 361. oldal].

A találmány szerinti vegyületek antagonista hatása következtében a következő felhasználási területek adódnak:

- női fogamzásgátlás;

- ovuláció megelőzése vagy késleltetése;

- terhesség időzítése háziállatokban;

- szülés megindítása;

- ovuláció szinkronizálása;

- nemi ciklus megszüntetése;

- nőstény állatok növekedésének elősegítése;

- luteolízis, menstruáció megindítása;

- menstruáció előtti szindróma gyógykezelése;

- idő előtti pubertás gyógykezelése;

- méhsimaizom-daganat gyógykezelése;

- korai, első negyedévi magzatelhajtás;

- endometriózis gyógykezelése;

- emlődaganatok és ciszták gyógykezelése;

- sokhólyagúpetefészek-szindróma/betegség gyógykezelése;

- méhrák gyógykezelése;

- jóindulatú prosztatamegnagyobbodás és prosztatarák gyógykezelése;

- hímneműek fogamzásgátlása;

- bármelyik nemnél túlzott ivarhormon-termelésből származó betegségek gyógykezelése;

- hímnemű, élelmet termelő állatok funkcionális kasztrálása;

- kutyák nemi ciklust megelőző véres folyásának megszüntetése;

- diagnosztikai célok, így például csontritkulásra való hajlam megállapítása;

- petefészek-hiperstimuláció megelőzése;

- kemoterápia vagy besugárzás esetében a termékenység megőrzése;

- és más, a Vickery, Β. H. közleményében [Endocrine Reviews, 7, 115 (1986)] szereplő más alkalmazási lehetőségek, amelyek mindegyikére ezúton utalunk.

Egy különösen érdekes alkalmazása a találmány szerinti LH-RH-antagonistáknak a petefészek-hiperstimuláció megakadályozására való felhasználás. Általában, amikor egy nőnemű egyed olyan betegségben szenved, ilyen például a sokhólyagúpetefészek-szindróma, kemoterápia okozta menopauzális szindróma vagy ritka/kevés havivérzés, amely a normális menstruációs ciklust megzavarja, a termékenység in situ vagy in vitro megtermékenyítése esetén (peteátvitel) exogén gonadtropinok adagolásával indukálható. Azonban ez a gonadotropterápia gyakran a petefészek hiperstimulációjához és/vagy többes szüléshez vezet az endogén és exogén gonadotropinok kombinált hatása következtében. Ennek megfelelően a találmány szerinti LH-RH-antagonisták az endogén gonadotropinok visszaszorítására alkalmazhatók, és így normális mértékű petefészek-stimulációt kaphatunk.

A találmány szerinti eljárást a gyakorlatban úgy valósítjuk meg, hogy a találmány szerinti vegyület vagy a vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmény hatásos mennyiségét az ilyen kezelésre szoruló vagy kezelést kívánó egyednek beadjuk. A vegyületek és készítmények a végső felhasználástól függően számos módon, így orálisan, parenterálisan (szubkután, intramuszkulárisan és intravénásán), vaginálisan (különösen fogamzásgátlás esetén), rektálisan, bukkálisan (beleértve a szublingvális adagolást), transzdermálisan vagy intranazálisan adagolhatok. Minden adott esetben a legmegfelelőbb adagolási mód az alkalmazástól, a hatóanyagtól, a kezelendő egyedtől és a gyakorló orvos megítélésétől függ. A vegyületet és a készítményt szabályozott hatóanyagleadású formában, depó-beültethető vagy injektálható készítmények formájában is adagolhatjuk.

Általában a fentebb említett felhasználások esetében célszerű a hatóanyagot 0,001 és 5 mg/kg testtömeg közötti mennyiségben beadni. Humánterápiában a hatóanyagot előnyösen 0,01 és 1 mg/kg/nap közötti mennyiségben és állatok esetében 0,1 és 1 mg/kg/nap közötti mennyiségben adagoljuk. Ez történhet egyetlen adagban vagy több részletben, vagy lassú hatóanyag-felszabadulást biztosító formában; cél a lehető legjobb eredmény elérése. Az állatokban a hevülés megszakítására vagy terhesség megelőzésére alkalmazott dózis legelőnyösebben körülbelül 1 és 10 mg/kg közötti mennyiség között változik, amelyet egyszerre adunk be.

A találmány szerinti vegyületek és készítmények pontos dózisa és adagolási módja szükségszerűen a kezelendő egyén szükségleteitől, a kezelés típusától, a szenvedés vagy szükség mértékétől és természetesen a gyakorló orvos megítélésétől függ. Általában a parenterális adagoláshoz kisebb dózisok szükségesek, mint más adagolási módokhoz, amelyek az abszorpciótól jobban függnek.

A találmány továbbá olyan gyógyászati készítmények előállítására vonatkozik, amelyek a találmány szerinti vegyületeket gyógyászatilag elfogadható, nem toxikus hordozókkal együtt tartalmazzák. Mint már említettük, az ilyen készítmények parenterális (szubkután, intramuszkuláris vagy intravénás) adagolás céljára, különösen folyékony oldatok vagy szuszpenziók formájában; vaginális vagy rektális alkalmazásra, különösen félszilárd fonnák, így krémek és szuppozitóriumok formájában; orális vagy bukkális adagolásra, különösen tabletták és kapszulák formájában; vagy intranazális adagolásra, különösen porok, nazális cseppek vagy aeroszolok formájában állíthatók elő.

HU 215 855 Β

A készítményeket kényelmesen egységdózis formájában adagolhatjuk, amelyeket bármely, a gyógyszerészet területén jól ismert módszerrel, például a „Remington’s Pharmaceutical Sciences”-ben (Mack Publishing Company, Easton, PA., 1970) leírt módszerek bármelyikével előállíthatjuk. A parenterális adagolásra alkalmas készítmények általános segédanyagként steril vizet vagy sóoldatot, alkilénglikolokat, például propilénglikolt, polialkilénglikolokat, így polietilénglikolt, növényi olajokat, hidrogénezett naftalinokat és hasonlókat tartalmazhatnak. A vaginalis vagy rektális adagolásra szánt készítmények, így a szuppozitóriumok segédanyagai például polialkilénglikolok, vazelin, kakaóvaj és hasonlók lehetnek. A nazálisán adagolható készítmények lehetnek szilárdak, és ekkor segédanyagként például laktózt vagy dextránt tartalmaznak, vagy lehetnek vizes vagy olajos oldatok, amelyek orrcseppek vagy meghatározott mennyiségű permetet kibocsátó sprayk formájában készülhetnek. A bukkális készítmények jellemző segédanyagai például a cukrok, kalcium-sztearát, magnézium-sztearát, elózselatinált keményítő és hasonlók.

A találmány szerinti nona- és dekapeptidek nazális adagolása különösen előnyös. Az orr nyálkahártyáján keresztül történő abszorpciót a felületaktív savak, így például a glikokólsav, kólsav, taurokólsav, kolánsav, etokólsav, dezoxikólsav, kenodezoxikólsav, dehidrokólsav és glikodeoxikólsav fokozza.

Egy vagy több felületaktív savat vagy sót, de előnyösen egyetlen gyógyászatilag elfogadható sót adhatunk az LH-RH-antagonistához oldat vagy por formájú készítmény esetében. Erre a célra azok a gyógyászatilag elfogadható felületaktív sók alkalmasak, amelyek megtartják a megnövekedett peptidabszorpciót, valamint a vegyületek felületaktív jellemzőit, és amelyek nem ártalmasak az egyénre vagy nem ellenjavalltak. Ilyen sók például a szervetlen bázisokból származtatható, például nátrium-, kálium-, lítium-, ammónium-, kalcium-, magnézium-, vas(II)-, cink-, réz-, mangán(II)-, alumínium-, vas(III)-, mangán(III)- és hasonló sók. Különösen előnyösek az ammónium-, kálium-, nátrium-, kalcium- és magnéziumsók. A gyógyászatilag elfogadható nem toxikus bázisokból levezethető sók, például a primer, szekunder és tercier aminok, helyettesített, például a természetben előforduló helyettesített aminok, gyűrűs aminok és bázikus ioncserélő gyanták, így izopropil-amin, trimetil-amin, dietil-amin, trietil-amin, tripropil-amin, etanol-amin, 2-dimetil-amino-etanol, trometamin, diciklohexil-amin, lizin, arginin, hisztidin, koffein, prokain, hidrabamin, kolin, bétáin, etilén-diamin, glükózamin, metil-glükamin, teobromin, purinok, piperazin, piperidin, N-etil-piperidin, poliamingyanták és hasonlók sói. Különösen előnyös szerves nem toxikus bázisok az izopropil-amin, dietil-amin, etanolamin, trometamin, diciklohexil-amin, kolin és koffein.

A találmány megvalósításakor még előnyösebben alkalmazható felületaktív sók a glikokólsav alkálifémsói, legelőnyösebben a nátrium-glikokolát.

A gyakorlatban a felületaktív anyagot olyan mennyiségben használjuk, amely más, olyan felületaktív anyagnál, amely bizonyos fokig növelheti a peptidabszorpciót, jobban növeli az LH-RH-peptidek abszorpcióját. Azt találtuk, hogy ez a mennyiség oldatban gyakran 0,2 és 15% között változik, még gyakrabban 0,2 és 5 tömeg/térfogat% közötti. Előnyösen a felületaktív anyag 0,5 és 4, alkalmasan 1, még előnyösebben azonban 2 körüli tömeg/térfogat%-ban van jelen.

Más anyagokat, például konverválószereket, a szövet toniás értékét biztosító sókat vagy más adalékokat, amelyeket a nazális készítmények kémiájában ajánlanak, szintén tartalmazhatnak a készítmények. Különösen előnyös további ilyen anyagok a felületaktív anyagok, ezek közül például a nemionos felületaktív anyagok, így a poliszorbátok, mégpedig alkalmasan 0,1 és 5, előnyösebben 0,25 és 2 tömeg/térfogat% közötti mennyiségben.

Azt találtuk, hogy a jobb oldhatóság és nagyobb stabilitás eléréséhez az epesav és peptid mólaránya előnyösen >20:1, például >25:1.

Különösen kívánatos, hogy a találmány szerinti vegyületek hozzáférhetőségét az egyénnek hosszabb időn át, például egy hétig vagy egy évig egyetlen beadással biztosítsuk. Különféle, nagyon lassú hatóanyag-leadású, depó implantálható vagy injektálható dózisformákat használhatunk. Például egy dózisforma a találmány szerinti vegyület gyógyászatilag elfogadható nem toxikus sóját tartalmazhatja, amely a testnedvekben nagyon kevéssé oldódik, például (a) egy több-bázisú sav, így foszforsav, kénsav, citromsav, borkősav, csersav, pamoesav, alginsav, poliglutaminsav, naftalinmono- vagy -diszulfonsavak, poligalakturonsav és hasonlók sóját, vagy (b) egy több vegyértékű fémkation, így cink-, kalcium-, bizmut-, bárium-, magnézium-, alumínium-, réz-, kobalt-, nikkel-, kadmium- és hasonló ionok sóját, vagy például az Ν,Ν’-dibenzil-etilén-diamin vagy etilén-diamin szerves kationjaival képezett sókat, vagy (c) az (a) és (b) kombinációját, például cink-tannát-sót tartalmazhat. A jelen találmány szerinti vegyületeket, különösen a fentebb leírt, aránylag oldhatatlan sókat gél formájában is kikészíthetjük, így almínium-monosztearát-gélben például szezámolajjal, amely injektálásra alkalmas. Különösen előnyös sók a cinksók, a cink-tannát-sók, pamoátsók és hasonlók. Az injektálásra vagy implantálásra alkalmas, lassú hatóanyag-leadású depókészítmények másik típusa a vegyületet vagy sóját lassú lebomlású, nem toxikus, nem antigén polimerben, például politejsav/poliglikolsav polimerben diszpergálva vagy kapszulázva tartalmazhatja. A vegyületek vagy előnyösen azok aránylag oldhatatlan sói, amelyeket az előzőekben leírtunk, koleszterinmátrix-pelletek vagy szilasztomermátrix-implantátumok, vagy (különösen állatgyógyászatban való felhasználásra) hidrogél vagy porkapszulák formájában is kikészíthetők. Más, lassú hatóanyag-leadású depó implantálható vagy injektálható készítmények, így a liposzómák az irodalomban jól ismertek. A témával kapcsolatos irodalmi helyek közül a következőket említjük: „Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”, J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc. New York, 1978, különösen az LH-RH típusú vegyületekkel kapcsolatban: 4 010 125 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Pitt, C. G., „The controlled delivery of polypeptides including LH-RH analogs”,

HU 215 855 Β

LH-RH and its Analogs: Contraceptive and Therapeutic Applications, Part 2, Β. H. Vickery and J. J. Nestor, Jr. (Eds.), MTP Press, Boston, 1987. 557. oldal.

A találmány szerinti vegyületek előállításának különösen előnyös módszere a szilárd fázisú peptidszintézis.

Ezen különösen előnyös eljárás során az aminosavak alfa-aminocsoportját sav- vagy bázisérzékeny csoporttal védjük. Az ilyen védőcsoportoknak stabilaknak kell lenniük a peptidkötés képzésének körülményei között, emellett az egyre növekvő peptidlánc lebontása vagy az abban levő királis centrumok racemizációja nélkül eltávolíthatónak kell lenniük. Alkalmas védőcsoportok a terc-butoxi-karbonil-csoport (Boc), benzil-oxikarbonil-csoport (Cbz), bifenil-izopropil-oxi-karbonilcsoport, terc-amil-oxi-karbonil-csoport, izobomil-oxikarbonil-csoport, alfa,alfa-dimetil-3,5-dimetoxi-benziloxi-karbonil-csoport, o-nitro-fenil-szulfenil-csoport, 2ciano-terc-butil-oxi-karbonil-csoport, 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil-csoport és hasonlók, különösen a tercbutoxi-karbonil-csoport (Boc).

Arginin esetében különösen előnyös oldallánc-védőcsoportok a következők: nitrocsoport, p-toluolszulfonilcsoport, 4-metoxi-benzolszulfonil-csoport, benzil-oxikarbonil-csoport, terc-butoxi-karbonil-csoport és adamantil-oxi-karbonil-csoport; tirozin esetében: a benzilcsoport, o-bróm-benzil-oxi-karbonil-csoport, 2,6-diklór-benzil-csoport, izopropilcsoport, ciklohexilcsoport, ciklopentilcsoport és acetilcsoport; szerin esetében : a benzilcsoport és tetrahidropiranilcsoport; hisztidin esetében: a benzilcsoport, p-toluolszulfonilcsoport és a 2,4-dinitro-fenil-csoport.

A C-terminális aminosav alkalmas szilárd hordozóhoz kapcsolódik. Az ilyen szintézisre megfelelő szilárd hordozók azok az anyagok, amelyek a fokozatos kondenzációs és védőcsoport-eltávolítási reakciókban nem vesznek részt, közömbösek az alkalmazott reagensekkel szemben és a közegben nem oldódnak. Ilyen alkalmas hordozók a klór-metil-polisztirol-divinil-benzol polimer, hidroxi-metil-polisztirol-divinil-benzol polimer és hasonlók, különösen a klór-metil-polisztirol-1% divinil-benzol polimer. Abban a speciális esetben, amikor a vegyület C-terminusa glicinamid, különösen előnyös hordozó a benzhidril-amino-polisztirol-divinil-benzol polimer, amelyet P. Rivaille és munkatársai [Helv. Chim. Acta, 54, 2772 (1972)] írtak le. A klór-metil-polisztirol-divinil-benzol típusú gyantához az aminosavat úgy kapcsoljuk, hogy az N^aIfa-védett aminosavat, előnyösen Boc-aminosavat cézium-, tetrametil-ammónium-, trietil-ammónium-, 1,5-diazabiciklo[5.4.0]undec-5-én vagy hasonló sója formájában etanolban, acetonitrilben, Ν,Ν-dimetil-formamidban és hasonlókban, különösen céziumsó formájában és dimetilformamidban emelt hőmérsékleten, például körülbelül 40 és 60 °C között, előnyösen 50 °C-on, körülbelül 12 és 48 óra közötti ideig, előnyösen 24 órán át reagáltatjuk a klór-metil-gyantával. Az N^alfa-Boc-aminosavat a benzhidril-amin-gyantához N,N’-diizopropilkarbodiimid (DIC)/l-hidroxi-benzotriazol (HBT) segítségével kapcsoljuk 2 és 24 óra közötti idő, előnyösen körülbelül 12 óra alatt körülbelül 10 és 50 °C közötti, előnyösen 25 °C hőmérsékleten diklór-metán- vagy dimetil-formamid-, előnyösen diklór-metán-oldószerben. A védett aminosavak sorozatos kapcsolását automata polipeptidszintetizátorban is elvégezhetjük, mint ahogy az az irodalomból ismert. Az N^alfa-védőcsoportokat például metilén-kloridos trifluor-ecetsav-oldatban, dioxános sósavban, ecetsavas sósavoldatban vagy más erős sav oldatában, előnyösen 50%-os diklór-metános trifluor-ecetsavban szobahőmérsékleten távolítjuk el. Minden védett aminosavat előnyösen körülbelül 2,5 mólos fölöslegben alkalmazunk, és a kapcsolást diklór-metánban, diklór-metán és dimetil-formamid elegyében, dimetil-formamidban és hasonlókban, különösen metilén-kloridban, szobahőmérsékleten végezzük. A kapcsolószer általában diciklohexil-karbodiimid diklór-metánban, de N,N’-diizopropil-karbodiimidet vagy más karbodiimidet magában vagy HBT, N-hidroxi-szukcinimid, más N-hidroxi-imidek vagy oximok jelenlétében is használhatunk. Más esetben a védett aminosav aktív észtereivel, például p-nitro-fenil-észterével, pentafluor-fenil-észterével és hasonlókkal vagy szimmetrikus anhidridekkel dolgozhatunk.

A szilárd fázisú szintézis végén a teljesen védett polipeptidet a gyantáról eltávolítjuk. Ha a gyantához való kapcsolódás benzil-észter típusú, a hasítást alkilaminnal vagy fluor-alkil-aminnal végezhetjük prolin Cterminus esetében, vagy az ammonolízishez például metanolos vagy etanolos ammóniát használhatunk glicin C-terminusú peptidek esetében, és körülbelül 10 és 50 °C közötti, előnyösen körülbelül 25 °C körüli hőmérsékleten dolgozunk 12 és 24 óra közötti ideig, előnyösen 18 órán át végezve a reakciót. A pepiidet a gyantáról például metanollal végzett átészterezéssel is eltávolíthatjuk, amely reakció után aminolízist végzünk. A védett peptidet a szintézis ezen lépése után kovasavgélen kromatográfiásan tisztíthatjuk. A polipeptid oldalláncainak védőcsoportjait az aminolízissel kapott termékről oly módon távolíthatjuk el, hogy például folyékony hidrogén-fluoriddal anizol vagy más karboniumionmegkötő jelenlétében, hidrogén-fluorid-piridin komplexszel, trisz(trifluor-acetil)-bórral és trifluor-ecetsavval kezeljük, hidrogénnel szénhordozós vagy poli(vinil-pirrolidon)-hordozós palládium jelenlétében redukáljuk, vagy folyékony ammóniában nátriummal redukáljuk, előnyösen folyékony hidrogén-fluoriddal és anizollal körülbelül -10 és +10 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen körülbelül 0 °C-on körülbelül 15 perc és 1 óra közötti időtartamig, előnyösen 30 percen át reagáltatjuk. A benzhidril-amin-gyantán levő glicinterminálisú peptidek esetében a gyantáról való leszedést és a védőcsoportok eltávolítását egyetlen lépésben, hidrogén-fluorid és anizol alkalmazásával a fentebb leírt módon elvégezhetjük. Az összes védőcsoport eltávolítása után a polipeptidet kromatográfiás lépések sorozatával tisztítjuk meg a következő típusú eljárások valamelyikét vagy mindegyikét alkalmazva: ioncsere acetát formában lévő gyengén bázikus gyantán; hidrofób adszorpciós kromatográfia funkciós csoportokkal el nem látott polisztirol-divinil-benzol gyantán (például Amberlite XAD); kovasavgélen végzett adszorpciós kro7

HU 215 855 Β matográfia; karboxi-metil-cellulózon végzett ioncserés kromatográfia; megoszlási kromatográfia például Sephadex G-25 adszorbensen vagy ellenáramú megoszlás; nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC), különösen fordított fázisú HPLC oktil- vagy oktadecil-szilil-kovasav-tartalmú oszloptölteten.

Ha az 1-, 2-, 3- vagy 6-helyzetben racém aminosavat használunk, a diasztereomer nonapeptid vagy dekapeptid végtermékeket elválasztjuk, és a megfelelő helyen D-aminosavat tartalmazó kívánt peptidet elkülönítjük és előnyösen a fentebb leírt kromatográfiás eljárással tisztítjuk.

A C-terminálisként azaglicin-amidokat tartalmazó peptideket a klasszikus, oldatban végzett peptidszintézissel állítjuk elő, amelyhez ismert peptid közbenső termékeket alkalmazunk. Ezt az eljárást részletesen a 3. példában ismertetjük.

A találmány vonatkozik továbbá a találmány szerinti peptidek és azok gyógyászatilag elfogadható sói előállítási eljárására, amely abban áll, hogy egy védett polipeptidről eltávolítjuk a védőcsoportokat, és kívánt esetben a kovalensen kötött szilárd hordozót, így az I általános képletü vegyületet vagy sóját kapjuk; vagy a kívánt 1 általános képletü vegyület két ffagmensét a szükséges sorrendben összekapcsoljuk; vagy

a) egy I általános képletü vegyületet gyógyászatilag elfogadható sóvá alakítunk, vagy

b) az I általános képletü vegyület egy sóját gyógyászatilag elfogadható sóvá alakítjuk, vagy

c) az I általános képletü vegyület sóját szabad I általános képletü polipeptiddé alakítjuk.

A következő példákat azért ismertetjük, hogy a szakemberek még jobban megértsék és megvalósítsák a találmányt. Nem tekinthetők a találmány terjedelmét korlátozóaknak, csupán annak bemutatására és szemléltetésére szolgálnak.

A) példa

3-(2-Naftil)-DL-alanin

A 3-(2-naftil)-DL-alanint a 4 341 767 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint állítjuk elő.

Az N-acetil-3-(2-naftil)-DL-alanin előállítását, annak metil-N-acetil-3-(2-naftil)-DL-alanináttá alakítását és a D-izomer elválasztását a 4 341 767 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban leírtak szerint végezzük.

B) példa

Benzil-N^alfa-benzil-oxi-karbonil-N,N ’ -guanidinodiizopropil-D-homoargininát-toluolszulfonát

5,24 g benzil-N^alfa-benzil-oxi-karbonil-D-lizináttoluolszulfonát [B. Bezus és L. Zervas, J. Am. Chem. Soc. 83, 719 (1961)] és 1,72 ml diizopropil-etil-amin elegyét 60 ml dioxánban 1,89 g N,N’-diizopropil-karbodiimiddel reagáltatjuk. A reakcióelegyet 100 °C-on 6 órán át keverjük, majd szobahőmérsékletre hűtjük és szárazra pároljuk. A szilárd anyagot 20 ml meleg dimetil-formamidban szuszpendáljuk, az N,N’-diizopropil-karbamidot szűréssel eltávolítjuk, és a szűrletet szárazra pároljuk. Benzil-N^alfa-N,N’-guanidino-diizopropil-D-homoargininát-toluolszulfonátot kapunk fehér, szilárd anyag formájában metanol és etil-acetát elegyéből való átkristályosítás után.

[a]_D=-7,26° (c=0,3, metanol).

A fenti eljárás szerint dolgozunk, de N,N’-diizopropil-karbodiimid helyett N,N’-di(n-propil)-karbodiimidet alkalmazunk; az így kapott termék benzil-N^alfa-benzil-oxi-karbonil-N,N’-guanidino-di(npropil)-D-homoargininát, [a]_D=8,07° (c=0,9, metanol).

C) példa

Benzil-N^alfa-benzil-oxi-karbonil-N^G,N°’-eteno-Dhomoargininát ml toluol és 15 ml terc-butanol elegyéhez 2,71 g benzil-N^alfa-benzil-oxi-karbonil-lizinátot és 1,46 g 2metil-tio-imidazolin-hidrojodidot (Aldrich) adunk. Az elegy pH-ját diizopropil-etil-amin hozzáadásával 8-ra állítjuk, és az oldatot 24 órán át forraljuk.

Az oldatot vákuumban bepároljuk, és a maradékot 250 g kovasavgélből készült oszlopra visszük. Az oszlopot metilén-klorid és metanol 19:1 térfogataránytól 7:3 térfogatarányig változó összetételű gradiens elegyével eluáljuk. A temréket tartalmazó frakciókat vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal választjuk ki, majd egyesítjük és szárazra pároljuk. így 2,9 g fehér habot kapunk.

A fenti termék 2 g-ját 50 ml, 0,8 g 10%-os, szénhordozós palládiumkatalizátort tartalmazó etanolban oldjuk. Az oldatot hidrogénatmoszférában keveijük 8 órán át. A keveréket celiten szűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk. így 1,2 gN^G,N^G’-etano-homoarginint kapunk fehér hab formájában.

Hasonlóképpen eljárva, de guanilezőszerként S-metil-3,4,5,6-tetrahidro-2-pirimidin-tiolt (Aldrich) használva, N^G,N^G’-propano-homoarginint kapunk fehér hab alakjában.

Guanilezőszerként S-metil-bisz(2,2,2-trifluor-etil)tiourónium-jodidot használva N^GN^G’-bisz(trifluor-etil)homoargininhez (Bth-hoz) jutunk, amely fehér hab.

D) példa

N^alfa-terc-Butil-oxi-karbonil-N,N’-guanidino-diizopropil-D-homoarginin-toluolszulfonát

Ez a példa az N,N’-guanidino-di-helyettesítettD-homoargininek N^alfa-terc-butil-oxi-karbonil-származékainak toluolszulfonát prekurzoraikból való előállítását szemlélteti.

3,25 g N^alfa-bentil-oxi-karbonil-N,N’-guanidino-diizopropil-D-homoargininát-toluolszulfonát és 100 mg 10%-os, szénhordozós palládiumkatalizátor elegyét 50 ml jégecetben hidrogénezzük atmoszféranyomáson, 4 órán át. A katalizátort celiten kiszűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk, így N,N’-guanidino-diizopropil-Dhomoarginin-toluolszulfonátot kapunk. Ezen vegyületből 2,13 g-ot 60 ml, 50% dioxánt és 50% vizet tartalmazó elegyben 10 ml 1 n nátrium-hidroxiddal és 0,4 g magnézium-oxiddal reagáltatunk. Ehhez az elegyhez 1,1 g di(terc-butil)-dikarbonátot adunk, és szobahőmérsékleten két órán át keverjük. A magnéziumsót kiszűr8

HU 215 855 Β jük, és a szűrletet vákuumban bepároljuk. A bázikus oldatot etanollal mossuk, majd a pH-t n/10 sósavoldattal 2,5-re állítjuk. A savas vizes oldatot etil-acetáttal extraháljuk, az extraktumot vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk. A szárítószert kiszűrjük, és a szűrletet bepároljuk. Etil-acetát és hexán elegyéből való kristályosítás után N^alfa-terc-butil-oxi-karbonil-N,N’-guanidinodiizopropil-D-homoarginin-toluolszulfonátot kapunk.

Hasonló módon eljárva, de a megfelelő toluolszulfonát prekurzorokat alkalmazva más N^alfa-terc-butil-oxikarbonil-Ν,Ν ’ -guanidino-di-hely ettesített-D-homoarginin- vagy D-arginin-vegyületeket állíthatunk elő.

E) példa

N^alf»-terc-Butil-oxi-karbonil-[4’-(l’-propil-piperidil)]-D-alanin

400 ml abszolút etanolhoz 4,6 g nátriumfémet adunk, majd melegítjük. A képződött nátrium-etoxid-oldathoz 21,7 g dietil-acetamido-malonátot és 16,4 g 4-pikolilklorid-hidrokloridot (Aldrich Chem. Co.) adunk. A reakcióelegyet 100 °C-on tartjuk 4 órán át, majd lehűtjük és vákuumban pároljuk. A keveréket kovasavgél oszlopra visszük, amelyet metilén-klorid és metanol 19:1 térfogatarányú elegyével készítünk, és ugyanezzel az eleggyel eluálunk. A frakciókat kovasavgélen vékonyréteg-kromatográfiásan vizsgáljuk metilén-klorid és metanol 19:1 térfogatarányú elegyében, és a terméket gyorsan mozgó, UV-pozitív foltként azonosítjuk. Az egyesített frakciókat bepároljuk, így a terméket kapjuk.

Az előzőekben leírt módon kapott anyagot 200 ml etanolban oldjuk és 2,72 g nátrium-hidroxid 40 ml vízzel készült oldatával hat órán át 50 °C-on tartjuk. Az oldatot 12 ml 6 n sósavval megsavanyítjuk, szárazra pároljuk és 200 ml dioxánnal felvesszük. A szuszpenziót szűrjük és a szűrletet 2 órán át forraljuk. Az oldatot lehűtjük és szárazra pároljuk, így fehér, szilárd anyagként etil-N^alfa-acetil-3-(4-piridil)-DL-alanint kapunk.

A fenti N-acetil-észter egy részletét 200 ml subtilisin Carlsberg (Sigma Chem. Co., protease VIII) enzimmel 300 ml dimetil-szulfoxid és 400 ml 0,01 mól kálium-klorid (pH 7,2) elegyében rezolváljuk. A pH-t 1 n nátrium-hidroxid-oldat adagolásával a kiindulási értéken tartjuk. 6 óra eltelte után a rezolválás teljes. Az oldatot 400 ml vízzel hígítjuk, és 4 alkalommal 750-750 ml etil-acetáttal extraháljuk. A szerves rétegeket egyesítjük és vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, majd bepároljuk, így etil-N^alfa-acetil-3-(4-piridil)-D-alaninátot kapunk olaj alakjában.

Az olajat 1,22 g n-propil-bromiddal 50 ml etanolban reagáltatjuk, majd az oldatot szárazra pároljuk, így etil-N^alfa-acetil-3-( 1 -propil-piridinium-4-il)-D-alaninátbromidot kapunk fehér, higroszkópos szilárd anyag formájában.

Ezt a fehér, szilárd anyagot 200 ml etanolban oldjuk és hidrogéngáz-atmoszférában 100 mg 10%-os szénhordozós palládiumkatalizátor jelenlétében hidrogénezzük. 18 órás redukciós idő után a katalizátort kiszűrjük és az oldatot bepároljuk, így etil-N^alfa-acetil-3-[4-(lpropil-piperidil)]-D-alaninátot kapunk cserszinű szilárd anyag formájában. A szabad savat úgy készítjük, hogy az etil-észtert 100 ml 6 n sósavban négy órán át forraljuk, ekkor 3-[4’-(l’-piperidil)]-D-alanint kapunk fehér, szilárd anyag formájában.

A szabad savat 100 ml dioxán és víz 1:1 térfogatarányú elegyében oldjuk, és 2 g di(terc-butil)-dikarbonátot adunk hozzá. A pH-t 1 n nátrium-hidroxid adagolásával 9-en tartjuk. Két óra eltelte után a reakcióelegyet vákuumban bepároljuk, 100 ml etil-éterrel mossuk és a vizes réteget Amberlite XAD-2 hidrofób gyantára visszük. Az oszlopot 250 ml vízzel, majd 250 ml, 50% vizet és 50% etanolt tartalmazó eleggyel eluáljuk. Az etanolos eluátumokat egyesítjük és szárazra pároljuk, így N^alfa-terc-butil-oxi-karbonil-3-[4’-(r-propil-piperidil)]D-alanint kapunk fehér, szilárd anyag formájában.

Hasonló módon eljárva, de a 4-pikolil-kloridot 3pikolil-kloriddal helyettesítve N^alfa-terc-butil-oxi-karbonil-3-[3 ’-(l ’-propil-piperidil)]-D-alanint kapunk.

F) példa

Boc-Gly-O-gyanta

4,9 g Boc-glicint 50 ml etanol és 50 ml desztillált víz elegyében oldunk. Az oldat pH-ját cézium-hidrogén-karbonáttal 7-re állítjuk. Az oldószert aztán vákuumban eltávolítjuk.

A maradékot 18 órán át nagyvákuumban szárítjuk, majd 150 ml száraz dimetil-formamidban oldjuk. 25 g klór-metilezett polisztirol-1% divinil-benzol (Merrifield) gyantát (ami 25 mmol kloridnak felel meg) adunk hozzá. Az elegyet 50 °C-on 24 órán át rázzuk, majd szűrjük, és a gyantát aztán dimetil-formamiddal, vízzel és etanollal mossuk. A gyantát három napon át vákuumban szárítjuk, így 28,34 g Boc-Gly-O-gyantát kapunk.

G) példa

A) S-Metil-3,4,5,6-tetrahidro-2-pirimidin-tiolhidrojodid

23,24 g 3,4,5,6-tetrahidro-2-pirimidin-tiol 175 ml metanollal készült oldatához 15,57 ml metil-jodidot adunk és 1,5 órán át forraljuk. Az oldószert ezután vákuumban lepároljuk, és a maradékot dietil-éterben szuszpendáljuk. A csapadékot kiszűijük és vákuumban szárítjuk, így 51,4 g S-metil-3,4,5,6-tetrahidro-2-pirimidin-tiolt kapunk fehér kristályok formájában.

B) N^alfMerc-Butil-oxi-karbonil-N^G,N^G’-propeno-Lhomoarginin

51,4 g hidrojodidsóból az S-metil-3,4,5,6-tetrahidro-2-pirimidin-tiolt felszabadítjuk oly módon, hogy 300 ml metilén-klorid és 50 ml 4 n nátrium-hidroxid között megosztjuk. A kapott diklór-metános oldatot körülbelül 100 ml-re bepároljuk, és körülbelül 100 ml etanolt adunk hozzá. Ezután 24 g lizin-hidroklorid 66 ml 2 n nátrium-hidroxiddal készült oldatához 60 °C-on az S-metil-3,4,5,6-tetrahidro-2-pirimidin-tiol oldatát hozzácsepegtetjük. A keverést 60 °C-on, nitrogén alatt egy éjszakán át folytatjuk. További 10,78 g hidrojodidsóból is felszabadítjuk 15 ml 4 n nátrium-hidroxiddal a bázist és 90% metilén-kloriddal extraháljuk, majd a reakcióelegyhez csepegtetjük, amelyet még 24 órán át 60 °C-on keverünk, ez alatt az idő alatt a reakció lényegében teljesen végbemegy.

HU 215 855 Β

A reakcióelegyet két alkalommal etil-acetáttal mossuk és a Pha-t tartalmazó vizes réteget 200 ml dioxánnal és 200 ml vízzel hígítjuk. Az oldatot 0 °C-ra hűtjük és 33 g di(terc-butil)-dikarbonátot, valamint 6 g magnézium-oxidot adunk hozzá. További 4 g magnézium- 5 oxid és 22 g di(terc-butil)-dikarbonát hatására a reakció teljesen végbemegy.

A magnézium-oxidot celiten kiszűrjük és a szűrletet vákuumban felére pároljuk. A maradékot két alkalommal dietil-éterrel mossuk, majd 750 g kovasavgélből acetonitrilben készült oszlopra visszük. Az oszlopot 5 liter acetonitrillel mossuk, majd 2 liter 10 térfogat% vizet, ezt követően pedig 5 liter 20% vizet tartalmazó acetonitrillel eluáljuk. A frakciókat kvoasavgélből vékonyrétegen acetonitril, acetsav és víz 4:1:1 térfogatarányú elegyében kromatografáljuk, és a terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd bepároljuk. így 5,04 g terméket kapunk fehér hab formájában, amely 96 °C-on olvad [a]²D⁵=16,1° (c=0,54, metanol), és emellett 15 g enyhén szennyezett olajat különítsünk el.

Hasonlóképpen eljárva, de alkalmas S-metil-N,N’dialkil-tiourónium-hidrojodidokat alkalmazva a megfelelő N^alfa-(terc-butil)-oxi-karbonil-N^G,N^G’-dialkil-homoarginineket kapunk.

1. példa

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-SerhArg(CH₂CF₃)₂-D-Tyr-Leu-hArg(CH₂CF₃)₂-Pro-DAla-NH₂

A cím szerinti vegyületet N-Ac-D-Nal(2)-D-pClPhe-D-Pal(3)-Ser-Bth-D-Tyr-Leu-Bth-Pro-D-Ala-NH₂formájában is felírhatjuk.

Egy 990-es Beckman peptidszintetizátor reakciólombikjába 0,758 g (0,5 mmol) benzhidril-amino-polisztirolgyantát (Peninsula Labs, 0,66 mmól/g) helyezünk. Az első aminosavat 0,284 g Boc-D-Ala-OH, 0,202 g HBT és 3 ml 0,5 mólos diizopropil-karbodiimid hozzáadásával kapcsoljuk. Háromórás kapcsolási idő után a gyantát mossuk, további aminosavakat adunk ehhez a gyantához a következő szintézisprogramnak megfelelően:

1. lépés	metilén-kloridos mosás	egyszer	1,5 perc
2. lépés	védőcsoport-eltávolítás 50%-os metilén-kloridos trifluor-ecetsavval	egyszer	1,5 perc
3. lépés	védőcsoport-eltávolítás 50%-os metilén-kloridos trifluor-ecetsavval	egyszer	30 perc
4. lépés	metilén-kloridos mosás	háromszor	1,5 perc
5. lépés	10%-os metilén-kloridos trietil-amin	kétszer	1,5 perc
6. lépés	metilén-kloridos mosás	háromszor	1,5 perc
7. lépés	N-Boc-aminosav 50% metilén-kloridot tartalmazó dimetil-formamidban	egyszer	adagolás
8. lépés	N,N’-diizopropil-karbodiimid 0,5 mólos oldatban	egyszer	adagolás
9. lépés	metilén-kloridos öblítés és kapcsolás	egyszer	kapcsolási reakció
10. lépés	metilén-klorid-öblítőszer-hozzáadás	egyszer	2 óra 1,5 perc
11. lépés	metilén-kloridos mosás	háromszor	1,5 perc
12. lépés	etanolos mosás	háromszor	1,5 perc
13. lépés	metilén-kloridos mosás	háromszor	1,5 perc

Egy aminosav kapcsolási ciklusa a fenti 1-13. lépésekből áll, és a kapcsolás teljességét E. Kaiser és munkatársai [Anal. Biochem., 34, 595 (1970)] ninhidrines módszerével ellenőrizhetjük.

A gyantát ezután egymást követően minden védett aminosav és DIC 2,0-3,0 mólos feleslegével kapcsoljuk. így a gyantát a kapcsolási ciklusban a következő vegyületekkel kezeljük:

0,269 g Boc-Pro-OH,

0,610 gBoc-Bth-OH,

0,311 g Boc-Leu-OH.H₂O

0,375 g Boc-D-Tyr-OH,

0,610 g Boc-Bth-OH,

0,380 g Boc-Ser(benzil)-OH,

0,320 g Boc-D-Pal(3)-OH,

0,390 g Boc-D-pCl-Phe-OH,

0,400 g Boc-D-Nal(2)-OH és

2,5 ml ecetsavanhidrid.

A gyantát kivesszük a lombikból, metilén-kloriddal mossuk és vákuumban szárítjuk, így 1,43 g védett polipeptidgyantát kapunk. A védett pepiidről a védőcsoportokat, majd a gyantáról a polipeptidet 25 ml vízmentes folyékony hidrogén-fluoriddal, 2,5 ml anizol jelenlétében Kel-F reakcióedényben 0 °C-on 1 órás reakcióban távolítjuk el. A hidrogén-fluoridot vákuumban lepároljuk, és a maradékot, amely N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-PheD-Pal(3)-Ser-hArg(CH₂CF₃)₂-D-Tyr-LeuhArg(CH₂CF₃)₂-Pro-D-Ala-NH₂-hidrofluorid, éterrel mossuk A maradékot aztán három alkalommal 30-30 ml jégecettel extraháljuk. Az ecetsavas extraktumokat szárazra pároljuk. A nyersanyagot vízben oldva gyengén bázikus tercier amin gyantából (AG3) készült, acetát formában lévő oszlopon átengedve acetátsóvá alakítjuk. Az eluátum liofilizálása után 0,5 g nyers peptid-acetátsót kapunk fehér, szilárd anyag formájában.

A nyerspeptidet nagy teljesítményű folyadékromatográfiás módszerrel 2,5x100 cm-es, a futópufferrel (50% acetonitril) 50% víz (0,1% trifluor-ecetsavban, pH 2,5) egyensúlyba hozott Licoprep RP-18 (25-40 mikron) oszlopon tisztítjuk. A körülbelül két oszloptérfogatnál eluálódó fő UV-abszorbeáló (280 nm) anyagot tartal10

HU 215 855 Β mazó frakciókat összegyűjtjük, szárazra pároljuk és három alkalommal desztillált vízből liofilizáljuk, így 64 mg tiszta N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)-SerhArg(CH₂CF₃)₂-D-Tyr-Leu-hArg(CH₂CF₃)₂-Pro-DAla-NH₂-t kapunk, [a]g=-17,96° (c=0,4, ecetsav).

2. példa

Az (I) általános képletű vegyületeket a klasszikus, oldatban végzett peptidszintézissel is előállíthatjuk.

Például a két pentapeptidfragmens kapcsolására a 5 következő megközelítést alkalmazhatjuk:

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-PheD-Pal(3)-Ser-Tyr-OMe (1) ψ

N-Ac-D-Nal(2)-D-pCl-PheD-Pal(3)-Ser-Tyr-N₃

Ψ

N-AcD-Nal(2)-D-pCl-Phe-D-Pal(3)Boc-Deh-Leu-Deh-Pro-A-Ala-NH₂(2) 1

H-D-Deh-Leu-Deh-Pro-D-Ala-NH₂

Ψ

H-D-Deh-Leu-Deh-Pro-AzaGlyNH₂ (3)

Ser-Tyr-D-Deh-Leu-Deh-Pro-D-Ala-NH₂

Az egyes fragmensek kapcsolására például a savazidmódszert [J. Honzel és munkatársai, Coll. Czech. Chem. Comm. 26, 2333 (1971)] diciklohexil-karbodiimidet, hidroxi-benzotriazolt és difenil-foszforil-azidot 20 vagy más, racemizációt nem okozó kapcsolási technikát alkalmazhatunk. A (2) vegyületet az előző módszerrel, és az (1) vegyületet az 1. példában leírttal analóg eljárásokkal állíthatjuk elő. A (3) vegyületet a (2)-ből a Cbz csoport hidrogenolízissel való eltávolításával, 25 majd N-Boc-N,N’-guanidino-dietil-D-homoargininnel való kapcsolással kaphatjuk, amelyhez diciklohexil-karbodiimidet és hidroxi-benztriazolt vagy a szakterületen ismert más kapcsolódó reagenst használunk.

Az ily módon kapcsolt fragmensek gyakran pép- 30 tidek vagy aminosavak. Az N-terminális nonapeptid savat szilárd fázisú szintézissel vagy oldatban is előállíthatjuk, és azután kapcsoljuk alkil-aminokkal vagy szemikarbazid-hidrokloriddal diciklohexil-karbodiimid és hidroxi-benzotriazol jelenlétében vagy analóg vegyü- 35 letekhez vezető más kapcsolási módszerrel.

3. példa

Sók előállítása

A) [N-Ac-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³·⁶, Bth⁸, 40 D-Ala*°]LH-RH hidrogén-fluorid-sójának (lásd 1. példa) 0,1 g-ját 50 ml vízben oldjuk, és az oldatot 50 g Dowex 3 anioncserélő gyantából készült oszlopon, amelyet előzőleg ecetsavval egyensúlyba hoztunk és ionmentes vízzel mostunk, átengedjük. Az oszlopot ion- 45 mentes vízzel eluáljuk, és az eluátumot liofilizálva az [N-Ac-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³·⁶, Bth», DAla¹⁰]LH-RH ecetsavas sóját kapjuk.

A fenti eljárást megismételve, és a gyanta egyensúlyba hozását más savval végezve, például sósavval, hidra- 50 gén-bromiddal, kénsavval, foszforsawal, salétromsavval, benzoesawal és hasonlókkal alkotott sókat kaphatunk.

Ilyen módon más, a leírásban szereplő LH-RH-analóg peptidek savaddíciós sóit is előállíthatjuk.

B) A vízben kevéssé oldódó sók előállításánál úgy já- 55 runk el, hogy a kívánt savval vízből csapjuk ki a sót.

Cink-tannát-só mg [N-Ac-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³·⁶, Bth⁸, D-Ala¹⁰]LH-RH ecetsavas sót 0,1 ml vízben oldunk és 8 mg csersav 0,08 ml 0,25 mólos nátrium- 60 hidroxiddal készült oldatát, majd rögtön ezután 5 mg cink-szulfát-heptahidrát 0,1 ml vízzel készült oldatát adjuk hozzá.

A kapott szuszpenziót 1 ml vízzel hígítjuk, és a csapadékot centrifugáljuk. A felülúszót leöntjük és a maradékot két alkalommal 1-1 ml vízzel mossuk oly módon, hogy az elegyet centrifugáljuk és a felülúszót leöntjük. A csapadékot vákuumban szárítjuk, így 15 mg anyagot kapunk, amely a fentebb említett LH-RH analóg vegyes cink-tannát sója.

Pamoátsó mg N-Ac-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², D-Pal(3)^{3 * *}·^{6 *}, Bth^{8 *}, D-Ala¹⁰]LH-RH ecetsavas sót 1,6 ml etanol és 0,1 ml 0,25 mólos nátrium-hidroxid elegyében oldunk, és 11 mg pamoesav 0,3 ml 0,25 mólos nátriumhidroxiddal készült oldatát adjuk hozzá. Az oldószereket csökkentett nyomáson lepároljuk, és a maradékot 2 ml vízben szuszpendáljuk, centrifugáljuk és a felülúszót leöntjük. A csapadékot 1,5 ml vízzel mossuk, centrifugáljuk és a felülúszót leöntjük. A csapadékot vákuumban szárítva 54 mg anyagot kapunk, amely a fentebb említett LH—RH-analóg pamoátsója.

Hasonló módon eljárva állíthatunk elő más, vízben kevéssé oldódó sót is.

C) Savaddíciós só előállítása szabad pepiidből mg [N-Ac-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³>⁶, Bth⁸, D-Ala¹⁰]LH-RH szabad bázis oldatához 30 ml 1 n ecetsavat adunk. A kapott oldatot liofilizáljuk, így a fenti vegyület ecetsavas sóját kapjuk, 50 mg mennyiségben.

Hasonlóképpen eljárva, az ecetsavat más savnak a pepiidre számított ekvivalens mennyiségével helyettesítve az itt említett peptidek más savval, például sósavval, hidrogén-bromiddal, kénsavval, foszforsavval vagy salétromsavval képzett savaddíciós sóit kaphatjuk.

D) Fémkationnal képezett, például cinksó előállítása mg [N-Ac-D-Nal(2)·, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³·⁶,

Bth⁸, D-Ala*°]LH-RH ecetsavas sót 0,4 ml 0,25 mólos nátrium-hidroxid, 0,3 ml víz és 1 ml etanol elegyében oldunk, és 15 mg cink-szulfát-heptahidrát 0,2 ml vízzel készült oldatát adjuk hozzá. A csapadékot centrifugáljuk és a felülúszót leöntjük. A csapadékot 1 ml vízzel mossuk, centrifugáljuk, és a felülúszót leöntjük. A csapadékot vákuumban szárítjuk, így a fentebb megnevezett LH-RH-analóg cinksóját kapjuk.

HU 215 855 Β

Hasonlóképpen eljárva más, többértékű kationnal, például kalcium-, bizmut-, bárium-, magnézium-, alumínium-, réz-, kobalt-, nikkel-, kadmium- és hasonló ionokkal alkotott sókat kaphatunk.

4. példa

Sók szabad bázissá alakítása mg [N-Ac-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³>⁶, Bth⁸, D-Ala¹⁰]LH-RH ecetsavas só 25 ml vízzel készült oldatát 50 g Dowex 1 (erősen bázikus, kvartemer ammónium anioncserélő) gyantából készült oszlopon engedjük át, amelyet előzőleg nátrium-hidroxidoldattal hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot 150 ml vízzel eluáljuk és az eluátumot liofilizáljuk, így 45 mg megfelelő polipeptidet kapunk szabad bázis formájában.

Ugyanígy az említett, például a 6. példában említett peptidek más savaddíciós sóit is a megfelelő szabad bázisokká alakíthatjuk.

5. példa

Gyógyászati készítmények

A következők általános gyógyászati készítmények, amelyek hatóanyagként egy találmány szerinti LH-RH-antagonistát, például [N-Ac-D-Nal(2)¹, DpCl-Phe², D-Pal(3)³·⁶, Bth⁸, D-Ala^l0]LH-RH-t szabad vagy gyógyászatilag elfogadható só, például ecetsavas savaddíciós só, cinksó, cink-tannát-só stb. formájában tartalmaznak.

A) Tablettakészítmények
1. LH-RH-antagonista	10,0 mg
Préselhető cukor, USP	86,0 mg
Kalcium-sztearát	4,0 mg
2. LH-RH-antagonista	10,0 mg
Préselhető cukor	88,5 mg
Magnézium-sztearát	1,5 mg
3. LH-RH-antagonista	5,0 mg
Mannit, USP	83,5 mg
Magnézium-sztearát, USP	1,5 mg
Előzselatinált keményítő, USP	10,0 mg
4. LH-RH-antagonista	10,0 mg
Laktóz, USP	74,5 mg
Előzselatinált keményítő, USP	15,0 mg
Magnézium-sztearát, USP	1,5 mg

Előállítási eljárás

a) Az antagonistát annyi vízben oldjuk, amennyi elegendő a cukorral való keverés után a nedvesgranuláláshoz. A teljes összekeverés után a granulátumot tálcán vagy fluidágyas szárítóban szárítjuk. A száraz granulátumot ezután megszitáljuk, a nagy aggregátumokat aprítjuk, és aztán a megmaradó komponensekkel keverjük, majd standard tablettázógépen speciális súlyú tablettákká préseljük.

b) Ebben az előállítási eljárásban minden készítmény 0,01% zselatint (USP) tartalmaz. A zselatint a vizesgranuláláshoz használt oldószerben oldjuk fel az LH-RH-analóg után. A többi lépést az a) eljárásnak megfelelően végezzük.

A 4-es készítményt tablettaként is alkalmazhatjuk orálisan adagolva.

B) Hosszan ható, intramuszkulárisan injektálható készítmény

1. Hosszan ható, intramuszkulárisan injektálható szezámolaj gél

LH-RH-antagonista 10,0 mg

Alumínium-monosztearát 20,0 mg

Szezámolaj q. s. 1,0 ml-ig

Az alumínium-monosztearátot a szezámolajjal összekeveijük és 125 °C-on addig keverjük, amíg tiszta, sárga oldat képződik. Ezt a keveréket aztán autoklávban sterilizáljuk és hűlni hagyjuk. Az LH-RH-analógot ezután adjuk hozzá aszeptikus körülmények között, keverés közben. Előnyösen az LH-RH-analógok kevéssé oldódó sóit, például cinksóit, cink-tannát-sóit, pamoátsóit és hasonló sóit használjuk. Ezek különösen hosszú ideig hatnak.

2. Hosszan ható, intramuszkulárisan injektálható biológiailag lebontható polimer mikrokapszulák

LH-RH-antagonista 7%

25/75 glikolid/laktid kopolimer 93% (0,5 belső viszkozitás)

A fenti mikrokapszulákat a következő elegyben szuszpendáljuk.

Dextróz 5,0%

CMC, nátrium 0,5%

Benzil-alkohol 0,9%

Tween 80 0,1%

Víz, tisztított, q. s. 100,0%-ig mg mikrokapszulát 1,0 ml hordozóban szuszpendálunk.

C) Vizes oldat intramuszkuláris injektálásra

LH-RH-antagonista 0,5%

Ecetsav 0,02 M

Benzil-alkohol 0,9%

Mannit 3,5%

Propilénglikol 20,0%

Nátrium-hidroxid, a pH 5-re állításához elengendő mennyiségben

Víz q. s. 100,0%-ig

A víz 90%-ában az ecetsavat, benzil-alkoholt, mannitot és a propilénglikolt feloldjuk. Ezután az antagonistát ebben az oldatban oldjuk, és az elegy pH-ját nátrium-hidroxiddal beállítjuk, majd az oldatot a szükséges mennyiségű vízzel kiegészítjük. Egymikronos szűrőn szűrjük, fiolákba töltjük, és autoklávban sterilizáljuk.

D) Vizes készítmény nazális adagolásra

LH-RH-antagonista 50 mg

0,02 M acetátpuffer 5 ml

Nátrium-glikokolát 500 mg

0,02 M acetátpuffer, pH 5,2 q. s. 10 ml-ig

E) Rektális adagolásra alkalmas készítmény LH-RH-antagonista 5,0 mg

Witepsol Hl 5 20,0 g

Az LH-RH-antagonistát a megolvasztott Witepsol H15-tel jól elkeverjük, és 2 g-os formákba öntjük.

6. példa

Az előző példák szerint előállított vegyületek jellemző adatait az 1. és 2. táblázatokban foglaltuk össze.

HU 215 855 Β

1. táblázat

Vegyület száma	RS	Vegyület	Aminosav- elemzés	Olvadáspont, °C	Ml⁵
1.	61209	[N-Ac-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³, D-hArg(Et₂)⁶, Phe’, D-Ala¹⁰]LH-RH		130-132	-12,84° (c=0,39, HOAc)
3.	31384	[N-Ac-D-Nal(2)', D-pCl-Phe², D-Trp³, D-hArg(CH₂)₃ ⁶, D-Ala^l0]LH-RH		183-186	-28,2° (c=0,27, HOAc)
6.	15714	[N-Ac-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², DPal(3)³·⁶, hArg(Bu)⁵·⁸, D-Ala’°]LH-RH		156-158	-16,76° (c=0,44, HOAc)
7.	15678	[N-Ac-D-Nal(2)', D-pCl-Phe², DPal(3)³·⁶, Arg³, hArg(Et₂)«, DAla¹⁰]LH-RH		130-132	-17,7° (c=0,53, HOAc)
9.	61129	[N-Ac-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³, D-Tyr⁶, hArg(CH₂CF₃)₂ ³·⁸, DAla¹⁰]LH-RH		140-142	-17,96° (c=0,38, HOAc)
11.	15515	[N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCl-Phe², DPal(3)³·⁶, Pal(3)³, hArg(CH₂CF₃)₂«, DAla'°]LH-RH		140-141	-12,64° (c=0,14 HOAc)
12.	15378	[N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCl-Phe², DPal(3)³·⁶, hArg(Et₂)⁸, D-Ala'°]LH-RH		140-142	-20,72° (c=0,3, HOAc)
13.	26310	[N-Ac-D-Nal(2)>,D-pCl-Phe², DPal(3)³·⁶, hArg(CH₂)₃«, D-Ala*°]LH-RH		149-150	-23,53° (c=0,38, HOAc)
14.	48890	[N-Ac-D-Nal(2)', D-pCl-Phe², DPal(3)³·⁶, hArg(Bu)⁸, D-Ala^l0]LH-RH		154-156	-17,24° (c=0,21, HOAc)
15.	26334	[N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCl-Phe², D-Trp³·⁶, hArg(CH₂CF₃)₂8, D-Ala'»]LH-RH	*
16.	96473	[N-Ac-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², D-Trp³, D-hArg(Et2)⁶, hArg(Et2)⁸, DAla¹⁰]LH-RH		160-162	-23,3° (c=0,4, HOAc)
17.	26306	[N-Ac-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³, D-hArg(Et2)⁶, hArg(Et2)«, DAla¹⁰]LH-RH		140-142	-15,7° (c=0,16, HOAc)
18.	61289	[N-Ac-D-Nal(2)i, D-pF-Phe², D-Pal(3)³, D-hArg(Bu)⁶, hArg(CH₂CF₃)₂8, DAla¹⁰]LH-RH		132-135	-17,18° (c=0,ll, HOAc)
19.	48815	[N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCl-Phe², D-Trp³, DhArg(CH2)3⁶, hArg(CH2)₃*, DAla¹⁰]LH-RH		152-154	-23,94° (c=0,21, HOAc)
20.	26220	[N-Ac-D-Nal(2)>, D-pF-Phe², D-Pal(3)³, D-hArg(Et2)⁶, hArg(Et2)⁸, DAla*°]LH-RH		143-145	-21,66° (c=0,28, HOAc)
21.	26126	[N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCl-Phe², DPal(3)³·⁶, Arg³, hArg(CH₂CF₃)₂8, DAla¹⁰]LH-RH	*	120-122	-14,95° (c=0,7, HOAc)
22.	26906	[N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCl-Phe², D-Trp³·⁶, Arg³, hArg(CH₂CF₃)₂8, D-Ala¹⁰]LH-RH	*	140-143	-14,58° (c=0,48, HOAc)
23.	48182	[N-Ac-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², D-Trp³·⁶, Arg³, hArg(CH₂)₃8, D-Ala¹⁰]LH-RH		156-158	-22,94° (c=0,27, HOAc)

HU 215 855 Β

1. táblázat (folytatás)

Vegyület száma	RS	Vegyület	Aminosav- elemzés	Olvadáspont, °C	Mi⁵
24.	26527	[N-Ac-D-Nal(2)i, D-pF-Phe², D-Pal(3)³·⁶, Arg⁵, hArg(CH₂)₃ ⁸, D-AIa¹⁰]LH-RH		150-153	-19,26° (c=0,3, HOAc)
25.	26723	[N-Ac-D-Nal(2)', D-pCl-Phe², DPal(3)³·⁶, Arg⁵, hArg(CH₂)₃ ⁸, DAla¹⁰]LH-RH		156-158	-22,22° (c=0,27, HOAc)
26.	64004	[N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCl-Phe², D-Trp³·⁶, hArg(Et₂)⁸, D-Ala’°]LH-RH		155-157	-34,09° (c=0,26, HOAc)
27.	64658	[N-Ac-D-Nal(2)!, D-pCl-Phe², D-Trp³·⁶, hArg(Bu,)⁸, D-Ala¹⁰]LH-RH		146-148	-32,46° (c=0,34, HOAc)
28.	64359	[N-Ac-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², D-Trp³·⁶, hArg(CH₂)₃ ⁸, D-Ala¹⁰]LH-RH		163-165	-28,71° (c=0,42, HOAc)
29.	64911	[N-Ac-D-Nal(2)', D-pCl-Phe², D-Pal(3)³, D-hArg(Bui)⁶, hArg(Bu)⁸, DAla^l0]LH-RH		150-153	-22,44° (c=0,10 HOAc)
30.	64381	[N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³, D-hArg(CH2)3⁶, hArg(CH2)₃ ⁶, DAla¹⁰]LH-RH		154-155	-22,68° (c=0,23, HOAc)
31.	64736	[N-Ac-D-Nal(2)i, D-pF-Phe², D-Pal(3)³·⁶, Lys(PyrAc)⁵, HArg(Et₂)⁸, DAla¹⁰]LH-RH	*	140-142	-41,84° (c=0,l, HOAc)
32.	64802	[N-Ac-D-Nal(2)', D-pF-Phe², D-pal^)³·⁶, Lys(Nic)⁵, HArg(Et₂)⁸, D-Ala¹⁰]LH-RH	*	140-142	-57,03° (c=0,12, HOAc)
33.	64601	[N-Ac-D-Nal(2)¹, D-pF-Phe², D-Pal(3)³·⁶, hArg(Et₂)⁸, D-Ala'»]LH-RH		176-178	-18,33° (c=0,12, HOAc)
34.	64132	[N-Ac-D-Nal(2)', D-pF-Phe², D,Pal(3)³·⁶, L-hArg(Et₂)⁵·⁸, D-Ala¹⁰]LH-RH			-24,26° (c=0,70 HOAc)
39.	12972	[N-Ac-D-Nal(2)', D-pCl-Phe², DPal(3)³·⁶, hArg(CH₂CF₃,Et)⁸, DAla¹⁰]LH-RH	*

* vesd össze: 2. táblázat

2. táblázat

Vegyület száma	Aminosavelemzés
15. (RS-26334)	Ser 0,96 (1); Pro 0,96 (1); Alá 0,98 (1); Leu 0,95 (1); Tyr 1,07 (1); Lys 0,09 (0); NH₃ 1,82 (1); Trp 2,12 (2); p-Cl-Phe 1,00 (1); hArg(CH₂CF₃)₂ 0,89 (1); Nal(2) 1,09 (1).
21. (RS-26126)	Ser 1,01 (1); Pro 0,99 (1); Alá 0,98 (1); Leu 0,95 (1); Lys 0,20 (1); NH₃1,27 (1); Arg 1,08 (1); Pal(3) 2,10 (2); p-Cl-Phe 1,11 (1); hArg(CH₂CF₃)₂ 0,79 (1); Nal(2) 1,02 (1).
22. (RS-26906)	Ser 1,03 (1); Pro 0,97 (1); Alá 0,98 (1); Leu 0,90 (1); NH₃ 2,25 (1); Trp 2,30 (2); Arg 1,12 (1); p-Cl-Phe 1,03 (1); hArg(CH₂CF₃)₂ 0,99 (1); Nal(2) 1,12 (1).
31. (RS-64736)	Ser 0,84 (1); Pro 0,89 (1); Alá 0,99 (1); Leu 1,01 (1); Lys 1,05 (1); NH₃ 0,91 (1); hArg(Et₂) 1,04 (1); Pal(3) 2,42 (2); p-F-Phe 1,21 (1); Nal(2) 1,13 (1).
32. (RS-64802)	Ser 0,92 (1); Pro 0,95 (1); Alá 1,01 (1); Leu 0,99 (1); Lys 1,01 (1); NH₃ 0,96 (1); HArg(Et₂) 1,02 (1); Pal(3) 2,30 (2); p-F-Phe 1,15 (1); Nal(2) 0,96 (1).
39. (RS-12972)	Ser 0,76 (1); Pro 1,06 (1); Alá 0,89 (1); Leu 1,04 (1); Tyr 1,07 (1); p-Cl-Phe 1,17 (1); NH₃ 1,03 (1); Pal(3) 2,10 (2); hArg(C₂H₅,CH₂CF₃) 1,66 (1); Nal(2) 1,14 (1).

HU 215 855 Β

7. példa

Biológiai aktivitás a) Tesztoszteron-visszaszorítása A tesztoszteron-visszaszorítást a következő eljárás szerint mértük.

Két kísérletet végeztünk, amelyekhez 11 vagy 13 felnőtt érintetlen hím kutyát (Beagle, 1,5 és 6,5 közötti korúak, amelyeket a Syntex, LRE, Ridglan vagy White Eagle cégektől kaptunk) használtunk. Az állatokat minden héten, hat héten át, tetszőlegesen all vagy 13 dózi- 10 sú csoport valamelyikébe osztottuk (hordozó vagy minden LH-RH-antagonista néhány különböző dózisából egy) úgy, hogy minden dóziscsoportban hat kutya volt.

Az 1. csoport állatai egyetlen szubkután injekciót kaptak, amely 0,1 ml/kg testsúly hordozót tartalmazott. 15 A többi csoportban az állatok a mellékelt 1. listán látható dózisokat kapták (pg vegyület/0,1 ml injekció-térfogat/kg testsúly). A hordozó 50/50 propilénglikol/konyhasó oldat volt. Minden kutyától a feji vénán át körülbelül 3 ml heparinizált vérmintát vettünk közvetlenül az injek- 20 tálás előtt és 30 perccel, 1,2,4,6, 8 és 24 órával az injektálás után. A vérmintákat a vétel után azonnal jégre tettük. A plazmát centrifugálással és felszívással két órán belül elkülönítettük, és a tesztoszteronszintek radioimmunmeghatározásáig -20 °C-on tároltuk.

A tesztoszteronszinteket radioimmuneljárással határoztuk meg. A két vizsgálat eredményét összesítettük, és a tesztoszteronszinteket a dózisok függvényében ábrázolva meghatároztuk az ID₅₀-értékeket (amelyek nyolc órán át a tesztoszteron 50%-os maximális vissza- 30 szorításához szükségesek). Ezeket az értékeket a 3. táblázatban foglaltuk össze, amelyek a standardként használt LH-RH-antagonista Detirelix (RS-68439)-hez viszonyítva is mutatják a vegyületek relatív hatásosságát.

1. lista

1. vizsgálat (11 dóziscsoport) Csoport Vegyület (RS-szám) Dózis

1.	hordozó
2.	RS-26306	0,06 pg/0,1 ml/kg
3.	RS-26306	0,25 pg/0,1 ml/kg
4.	RS-26306	1,0 pg/0,1 ml/kg
5.	RS-26306	4,0 pg/0,1 ml/kg
6.	RS-26306	16,0 pg/0,1 ml/kg
7.	RS-26723	0,06 pg/0,1 ml/kg
8.	RS-26723	0,25 pg/0,1 ml/kg
9.	RS-26723	1,0 pg/0,1 ml/kg
10.	RS-26723	4,0 pg/0,1 ml/kg
11.	RS-26723	16,0 pg/0,1 ml/kg
2.	vizsgálat (13 dóziscsoport)
Csoport Vegyület (RS-szám)	Dózis
1.	hordozó
2.	RS-68439 (standard)	0,25 pg/0,1 ml/kg
3.	RS-68439 (standard)	1,0 pg/0,1 ml/kg
4.	RS-68439 (standard)	4,0 pg/0,1 ml/kg
5.	RS-68439 (standard)	16,0 pg/0,1 ml/kg
6.	RS-15378	0,25 pg/0,1 ml/kg
7.	RS-15378	1,0 pg/0,1 ml/kg
8.	RS-15378	4,0 pg/0,1 ml/kg
9.	RS-15378	16,0 pg/0,1 ml/kg
10.	RS-15678	0,25 pg/0,1 ml/kg
11.	RS-15678	1,0 pg/0,1 ml/kg
12.	RS-15678	4,0 pg/0,1 ml/kg
13.	RS-15678	16,0 pg/0,1 ml/kg

3. táblázat

LH-RH-antagonisták in vivő hatása - tesztoszteron-visszaszorítás

Vegyület RS-szám és szerkezet	Hím kutyákkal végzett vizsgálatok
Egyetlen szubkután injekció formájában beadott dózisok (Mg/kg)	A teljes tesztoszteronvisszaszorítás időtartama 16 pg/kg-nál (hatás)	Tesztoszteronvisszaszorítás O-tól 8 óráig ID₅₀* (hatás)
RS-68439 (Detirelix-standard) [N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCIPhe², D-Trp³, D-hArg(Et₂)⁶, D-Ala¹⁰]LH-RH	.25-16	8 óra(l)	2,3 pg/kg (1,0)
RS-26723 [N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCIPhe², D-Pal(3)³, Arg³, LhArg(CH₂)₃ ⁸, D-Ala’°]LH-RH	.06-16	6 óra (.8)	5,5 pg/kg (0,4)
RS-15678 [N-Ac-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³·⁶, Arg³, LhArg(Et₂)⁸, D-Ala'°]LH-RH	.25-16	4 óra (.5)	1,9 pg/kg (1,2)
RS-15378 [N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³-⁶, LhArg(Et₂)⁸, D-Ala'°]LH-RH	.25-16	8 óra(l)	0,4 pg/kg (5,8)
RS-26306 [N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³, DhArg(Et2)⁶, L-hArg(Et2)⁸, D-Ala¹⁰]LH-RH	.06-16	>24óra(>3)	0,3 pg/kg (7,8)

ID₅₀*: az a dózis, amely a tesztoszteron maximum 50%-os, nyolc órán át való visszaszorításához szükséges

HU 215 855 Β

b) Hisztaminfelszabadító és ovulációellenes hatás

Néhány, találmány szerinti vegyület hisztaminfelszabadító és ovulációellenes hatását a következő eljárások segítségével hasonlítottuk össze.

1. Hisztaminfelszabadítás meghatározása

Három vagy négy hím Sprague-Dawley-patkányból (350 g, Iffa-Credo, Franciaország) vegyes peritoneális sejteket különítettünk el oly módon, hogy először 10 ml, 50 pg/ml heparint tartalmazó 0,9%-os konyhasóoldatot injektáltunk az állatokba intraperitoneá- 10 lisan. A hasüreg egy percig tartó gyengéd masszírozásával a peritoneális sejteket eltávolítottuk, összegyűjtöttük és 5 percig (1500 fordulat/perc) centrifugáltuk. Három alkalommal kalciummentes Krebs-Ringer pufferrel (KRB) öblítettük a sejteket (a puffer összetétele: 15 141,9 mmol nátrium-klorid; 4,7 mmol kálium-klorid;

1,2 mmol magnézium-szulfát; 2,5 mmol dinátrium-hidrogén-foszfát; 0,6 mmol kálium-dihidrogén-foszfát), majd mikroszkóp alatt megszámoltuk és megfelelő mennyiségű kalciummentes KRB-oldattal oly mérték- 20 ben hígítottuk, hogy a koncentráció 2xl0^-6 sejt/ml volt. Az elegy 0,5 ml-es részleteit 0,3 ml kalciummentes KRB-oldattal 5 percig 35 °C-on előmelegítettük, és 0,1 ml, vizsgálandó anyagot tartalmazó oldatot adtunk hozzá. Öt perc eltelte után a reakciót 0,1 ml, kalcium- 25 tartalmú KRB-oldat hozzáadásával indítottuk meg, perccel később pedig 2,5 ml kalciummentes KRBoldattal állítottuk le, és az elegyet jégre tettük. A sejtszuszpenziót centrifugáltuk, a felülúszó hisztamintartalmát Shore és munkatársai [Immunoi., 127, 182-186 (1959)] módszerével, fluorimetriásan határoztuk meg, azonban az extrakciós eljárást elhagytuk (gerjesztés 365 nm, emisszió 450 nm). A kísérletben alkalmazott koncentrációnál egyik reagens sem fluoreszkált o-ftaldialdehiddel.

A sejtszuszpenzió teljes hisztamintartalmát szonikálás után (2 perc, 5 másodperces frekvenciaimpulzus) határoztuk meg.

A spontán hisztaminfelszabadulást minden mért értékből levontuk.

Számítás

A felszabadult hisztamin százalékát a következő 5 egyenlet alapján számítottuk:

A sejtmentes felülúszó hisztamintartalma-spontán felszabadult hisztamin —--xl00

A sejtszuszpenzió teljes hisztamintartalma

Reagensek és készülékek

Az o-ftaldialdehidet a Fluka cégtől (No. 79760) szereztük be. Minden más vegyület analitikai tisztaságú volt, és az oldatokat kalciummentes KRB-oldatban készítettük.

Perkin Elmer 2000 fluoriméterrel dolgoztunk, a szonikálást VIBRA-CELL (Sonics materials) készülékkel végeztük, amely mikrofeltétekkel van ellátva.

2. Az ovulációellenes hatás vizsgálata

Eljárás. Nőstény patkányokat legalább 7-10 napig a laboratóriumi körülményekhez akklimatizáltunk (14 óra világosság, 10 óra sötétség, a fények reggel 5kor bekapcsolva). Minden patkány esetében délelőtt fél nyolc és kilenc között naponta vaginális öblítést végeztünk legalább 12 napig, és az ivarzási ciklus állapotának meghatározására a folyadék citológiáját mikroszkopikusan vizsgáltuk. Azokat a patkányokat választottuk ki, amelyeknél az utolsó észlelt ciklust megelőzően két normális négynapos ciklust találtunk. A várható nemi ciklus napján az állatokat megöltük, a petevezetékeket 30 eltávolítottuk és boncolómikroszkóp alatt, a frissen érett peték szempontjából vizsgáltuk. A petéket leválasztottuk a petevezetékről, és megszámoltuk. Az ovulációellenes hatás ED₅₀-értékének kiszámításához az ovuláló nőstények százalékát a dózis függvényében ábrá35 zoltuk.

A hisztaminfelszabadító és ovulációellenes hatás vizsgálatakor kapott eredményeket a 4. táblázatban foglaljuk össze.

4. táblázat

Különböző LH-RH-analógok hisztaminfelszabadító és ovulációellenes hatásainak összehasonlítása

A vegyület	Hisztaminfelszabadítás ED₅₀ (pg/ml)	Ovulációellcncs hatás ED₅₀ (pg)
száma	kódja	képlete
2.	68439	[N-Ac-D-Nal(2)'_; D-pCl-Phe², D-Trp³, DhArg (Et₂)⁶, D-Ala¹⁰]LH-RH	0,18+0,02	0,6
3.	31384	[N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCl-Phe², D-Trp³, DhArg (CH₂)₃ ⁶, D-Ala^l0]LH-RH	0,41+0,03	0,56
6.	15714	[N-Ac-D-Nal(2)¹, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³·⁶, hArg(BU])⁵’⁸, D-Ala^l0]LH-RH	9,3+0,6	1,5
7.	15678	[N-Ac-D-Nal(2)', D-pCl-Phe², D-Pal(3)³⁶, Arg⁵, hArg(Et₂)⁸, D-Ala¹⁰]LH-RH	23,6+6	0,425
9.	61129	[N-Ac-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³, DTyr⁶, hArg(CH₂CF₃)₂ ⁵·⁸, D-Ala¹⁰]LH-RH	53+13,6	1,15
12.	15378	[N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³⁶, hArg(Et₂)⁸, D-Ala¹⁰]LH-RH	196+39,6	0,6

HU 215 855 Β

4. táblázat (folytatás)

A vegyület	Hisztaminfelszabadítás ED₅₀ (pg/ml)	Ovulációellenes hatás ED_S0 (pg)
száma	kódja	képlete
13.	26310	[N-Ac-D-Nal(2)<, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³·⁶, hArg(CH₂)₃ ^{8 *}, D-Ala¹⁰]LH-RH	20	0,68
14.	48890	[N-Ac-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³·⁶, hArg(Bu,)⁸, D-Ala¹⁰]LH-RH	15,7	1,2
17.	26306	[N-Ac-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³, DhArg(Et2)⁶, hArg(Et2)⁸, D-Ala'°]LH-RH	13	0,285
18.	61289	[N-Ac-D-Nal(2)', D-pF-Phe², D-Pal(3)³, DhArgíBuj)⁶, hArg(CH₂CF₃)₂ ⁸, DAla¹⁰]LH-RH	59	1,0
20.	26220	[N-Ac-D-Nal(2)’, D-pF-Phe², D-Pal(3)³, DhArg(Et2)⁶, hArg(Et2)⁸, D-Ala¹⁰]LH-RH	8,0	1,0
21.	26126	[N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³·⁶, Arg⁵, hArg(CH₂CF₃)₂ ⁸, D-Ala¹⁰]LH-RH	0,95	0,595
22.	26906	[N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCl-Phe², D-Trp³⁶, Arg⁵, hArg(CH₂CF₃)₂ ⁸, D-Ala*°]LH-RH	0,56	12
23.	48182	[N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCl-Phe², D-Trp³·⁶, Arg⁵, hArg(CH₂)₃ ⁸, D-Ala¹⁰]LH-RH	0,81	12,0
24.	26527	[N-Ac-D-Nal(2)i, D-pF-Phe², D-Pal(3)³·⁶, Arg⁵, hArg(CH₂)₃ ⁸, D-Ala'°]LH-RH	6,2	0,5
25.	26723	[N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³·⁶, Arg⁵, hArg(CH₂)₃ ⁸, D-Ala¹⁰]LH-RH	1,5	0,295
26.	64004	[N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCl-Phe², D-Trp³·⁶, hArg(Et₂)⁸, D-Ala^l0]LH-RH	16,0	0,9
29.	64911	[N-Ac-D-Nal(2)', D-pCl-Phe², D-Pal(3)³, DhArg(Bu,)⁶, hArg(Bu,)⁸, D-Ala*°]LH-RH	0,64	0,9
30.	64381	[N-Ac-D-Nal(2)¹, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³, D- hArg(CH₂)₃ ⁶,hArg(CH₂)₃ ⁸,D- Ala¹⁰]LH-RH	1,33	0,6

8. példa

A találmány szerinti vegyületek akut toxicitását int- 40 ravénás injektálással, patkányokban vizsgáltuk. Három hím patkányból álló csoportot egyetlen, hordozót vagy

1,0 mg/kg hatóanyagot (RS-15378 vagy RS-26306 kódszámú vegyületet) tartalmazó injekciót kaptak. Két további csoport vagy 0,3, vagy 1,0 mg/kg RS-68439 45 kódszámú standard vegyületet kapott (a korábbi példákban minden vegyületet megneveztünk).

Az injekciókat a farki vénába adtuk 15-20 másodperces időközökben. Az állatokat rögtön a beadáskor és 0,5,1,0, 3,0 és 6,0 órával a beadás után figyeltük meg a toxicitás klinikai tünetei szempontjából. Az eredmények az 5. táblázatban láthatók.

5. táblázat

A vegyület kódszáma neve	Dózis mg/kg	Tünetek
68439 [N-Ac-D-Nal(2)>, D-pCl-Phe², D-Trp³, D-hArg(Et₂)⁶, D-Ala¹⁰]LH-RH	0,3	letargia, puffadás, cianózis, nehéz légzés, fokozott ivás
1,0	a fenti súlyos tünetek, halál
15378 [N-Ac-D-Nal(2)i, D-pCl-Phe², D-Pal(3)³·⁶, hArg(Et₂)⁸, D-Ala’°]LH-RH	1,0	nincs válasz
26306 [N-Ac-D-Nal(2)', D-pCl-Phe², D-Pal(3)³, D-hArg(Et₂)⁶, hArg(Et₂)⁸, D-Ala¹⁰]LH-RH	1,0	nincs válasz

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás az (I) általános képletű LH-RH-analógok

- ebben a képletben

A jelentése N-(2-5 szénatomos)-alkanoil-D-3-(2-naftil)-alanil-, előnyösen N-acetil-D-3-(2-nafitil)-alanil-csoport,

B jelentése D-(p-klór-fenil)-alanil- vagy D-(p-fluorfenil)-alanil-csoport,

C jelentése D-triptofil- vagy D-3-(3-piridil)-alanil-csoport,

D jelentése L-tirozil-, L-arginil-, L-3-(3-piridil)-alanil-csoport vagy (II) általános képletű csoport, amelyben

R¹ jelentése 2-6 szénatomos alkilcsoport és

R² jelentése hidrogénatom, vagy

R* és R² jelentése azonosan 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy cű-trifluor-(2-4 szénatomos)-alkilcsoport, vagy az

I

R*-NH-C=NR² rész jelentése (3-piridil)-CH₂-CO- vagy nikotinoilcsoport, n=4,

E jelentése D-tirozil-, D-triptofil-, D-3-(3-piridil)-alanil-csoport vagy (II) általános képletű csoport, ahol R¹ jelentése 2-6 szénatomos alkilcsoport és R² jelentése hidrogénatom, vagy

R¹ és R² jelentése azonosan 1-4 szénatomos alkilcsoport, vagy

R¹ és R² jelentése együtt egy 2-5 szénatomos egyenes láncú alkiléncsoport, n=4,

F jelentése L-leucil- vagy L-fenil-alanil-csoport,

G jelentése L-arginil-csoport vagy (II) általános képletű csoport, és ebben

R¹ jelentése 2-6 szénatomos alkilcsoport és R² jelentése hidrogénatom vagy <o-trifluor-(2-4 szénatomos)-alkil-csoport, vagy R¹ és R² jelentése azonosan ro-trifluor-(2-4 szénatomos)-alkil-csoport vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport, vagy

R¹ és R² jelentése együtt egy 2-5 szénatomos egyenes láncú alkiléncsoport, n=4,

J jelentése D-alanil-NH₂ csoport és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy védett (I) általános képletű, kívánt esetben szilárd hordozógyantához kötött polipeptidről - ahol A, B, C, D, E, F, G és J jelentése egyezik a tárgyi körben megadottal - a védőcsoportokat és adott esetben a kovalensen kötött szilárd hordozógyantát eltávolítjuk, vagy

b) az (I) általános képletnek megfelelő két peptidfragmenst kondenzáljuk és/vagy

i) egy így kapott (I) általános képletű vegyületet gyógyászatilag elfogadható sóvá alakítunk, vagy ii) egy így kapott (I) általános képletű vegyület gyógyászatilag elfogadható sóját egy más, gyógyászatilag elfogadható sóvá alakítjuk, vagy iii) egy így kapott (I) általános képletű vegyület gyógyászatilag elfogadható sóját a megfelelő szabad pepiiddé alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, amelyek képletében

B jelentése D-(p-klór-fenil)-alanil- vagy D-(p-fluorfenil)-alanil-csoport,

D jelentése L-tirozil-, L-arginil, L-3-(piridil)-alanil-,

N,N’-guanidino-(dietil)-L-homoarginil-, N-guanidino-(butil)-L-homoarginil-, N,N’-guanidino-bisz(2,2,2-trifluor-etil)-L-homoarginil- vagy N,N’-guanidino-(propeno)-L-homoarginil-csoport,

E jelentése D-triptofil-, D-tirozil-, D-3-(3-piridil)alanil-, N,N’-guanidino-(dietil)-D-homoarginil-, N-guanidino-(butil)-D-homoarginil-, N,N’-guanidino-bisz(2,2,2-trifluor-etil)-D-homoarginil- vagy N,N’-guanidino-(propeno)-D-homoarginil-csoport,

G jelentése N,N’-guanidino-(dietil)-L-homoarginil-, N-guanidino-(butil)-L-homoarginil-, N,N’-guanidino-bisz(2,2,2-trifluor-etil)-L-homoarginil- vagy N,N’-guanidino-(propeno)-L-homoarginil-csoport,

A, C, F és J jelentése pedig egyezik az 1. igénypontban megadottal, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, amelyek képletében

B jelentése D-(p-klór-fenil)-alanil-csoport,

D jelentése L-tirozil-, L-arginil-, N,N’-guanidino-(dietil)-L-homoarginil, N-guanidino-(butil)-L-homoarginil-, N,N’-guanidino-bisz(2,2,2-trifluor-etil)-L-homoarginil- vagy N,N’-guanidino-(propeno)-L-homoarginil-csoport,

F jelentése L-leucil-csoport,

A, C és J jelentése egyezik az 1. igénypontban megadottal,

E és G jelentése egyezik a 2. igénypontban megadottal, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás G helyén N,N’guanidino-(dietil)-L-homoarginil- vagy N,N’-guanidino-bisz-(2,2,2-trifluor-etil)-L-homoarginil-csoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyületek - ahol A,

B, C, D, E, F és J jelentése egyezik a 3. igénypontban megadottal - és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás G helyén N,N’guanidino-(dietil)-homoarginil-csoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyületek - ahol A, B, C, D, E, F és J jelentése egyezik a 3. igénypontban megadottal - és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, amelyek képletében

HU 215 855 Β

A, C és J jelentése egyezik az 1. igénypontban megadottal,

B jelentése D-(p-klór-fenil)-alanil-csoport,

D jelentése L-tirozil-csoport,

E jelentése D-3-(3-piridil)-alanil- vagy D-triptofilcsoport,

F jelentése L-leucil-csoport,

G jelentése N,N’-guanidino-(dietil)-L-homoarginil-,

N-guanidino-(butil)-L-homoargiml-, N,N ’-guanidino-bisz(2,2,2-trifluor-etil)-L-homoarginil- vagy N,N’-guanidino-(propeno)-L-homoarginil-csoport, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás a 6. igénypontban adott szűkebb körű meghatározásnak megfelelő, de C és E helyén azonos csoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
8. A 2. igénypont szerinti eljárás az E helyén N,N’guanidino-(dietil)-D-homoarginil-, N-guanidino-(butil)-D-homoarginil-, N,N’-guanidino-bisz(2,2,2-trifluor-etil)-D-homoarginil- vagy N,N’-guanidino-(propeno)-D-homoarginil-csoportot tartalmazó, egyébként a 6. igénypontban adott szűkebb körű meghatározásnak megfelelő (I) általános képletű vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, amelyek képletében

A, C és J jelenléte egyezik az 1. igénypontban megadottal,

B jelentése D-(p-klór-fenil)-alanil-csoport,

D jelentése L-arginil-csoport,

E jelentése D-triptofil-, D-tirozil- vagy D-3-(3-piridil)-alanil-csoport,

F jelentése L-leucil-csoport,

G jelentése egyezik a 3. igénypontban megadottal, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás a 9. igénypontban adott szűkebb körű meghatározásnak megfelelő, de E helyén D-triptofil- vagy D-3-(3-piridil)-alanil-csoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
11. A 9. igénypont szerinti eljárás a 9. igénypontban adott szűkebb körű meghatározásnak megfelelő, de C és E helyén azonos csoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
12. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, amelyek képletében

A, C és J jelentése egyezik az 1. igénypontban megadottal

B jelentése D-(p-klór-fenil)-alanil-csoport,

D jelentése egyezik a 3. igénypontban megadottal,

E jelentése D-tirozil-, D-triptofil- vagy D-3-(3-piridil)-alanil-csoport,

F jelentése L-leucil-csoport,

G jelentése egyezik a 2. igénypontban megadottal, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás a 12. igénypontban adott szűkebb körű meghatározásnak megfelelő, de E helyén D-tirozil- vagy D-3-(3-piridil)-alanil-csoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
14. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, amelyek képletében

A és J jelentése egyezik az 1. igénypontban megadottal,

B jelentése D-(p-klór-fenil)-alanil-csoport,

C jelentése D-triptofil-csoport,

D jelentése egyezik a 2. igénypontban megadottal,

E jelentése D-triptofil- vagy D-tirozil-csoport,

F jelentése L-leucil-csoport,

G jelentése egyezik a 3. igénypontban megadottal, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
15. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, amelyek képletében

A és J jelentése egyezik az 1. igénypontban megadottal,

B jelentése D-(p-klór-fenil)-alanil-csoport,

C és E jelentése egymástól függetlenül D-triptofilvagy D-3-(3-piridil)-alanil-csoport,

D és G jelentése egymástól függetlenül N,N’-guanidino-(dietil)-L-homoarginil-, N-guanidino-(butil)L-homoarginil-, N,N’-guanidino-bisz(2,2,2-trifluor-etil)-L-homoarginil- vagy N,N’-guanidino(propeno)-L-homoarginil-csoport,

F jelentése L-leucil-csoport, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
16. Az 1. igénypont szerinti eljárás az olyan (I) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, amelyek képletében

A jelentése N-acetil-D-3-(2-naftil)-alanil-csoport,

B jelentése D-(p-klór-fenil)-alanil-csoport,

C és E jelentése D-3-(3-piridil)-alanil-csoport,

D jelentése L-tirozil-csoport,

F jelentése L-leucil-csoport,

G jelentése egyezik a 2. igénypontban megadottal,

J jelentése D-alanil-NH₂ csoport, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
17. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-acetil-D-3-(2naftil)-alanil-D-3-(p-klór-fenil)-alanil-D-3-(3-piridil)alanil-L-szeril-L-tirozil-D-3-(3-piridil)-alanil-L-leucilN,N’-guanidino-(dietil)-L-homoarginil-L-prolil-D-alanil-amid és gyógyászatilag elfogadható sói előállításá19

HU 215 855 Β ra, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási anyagokat alkalmazunk.
18. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-acetil-D-3-(2naftil)-alanil-D-3-(p-klór-fenil)-alanil-D-3-(3-piridil)alanil-L-szeril-N-guanidino-(butil)-L-homoarginil-D3-(3-piridil-alanil-L-leucil-N-guanidino-(butil)-L-homoarginil-L-prolil-D-alanil-amid vagy gyógyászatilag elfogadható sói előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási anyagokat alkalmazunk.
19. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-acetil-D-3-(2naftÍl)-alanil-D-3-(p-klór-fenil)-alanil-D-3-(3-piridil)-alanil-L-szeril-3-(3-piridil)-alanil-D-3-(3-piridil)-alanil-Lleucil-N,N’-guanidino-bisz(2,2,2-trifluor-etil)-L-homoarginil-L-prolil-D-alanil-amid és gyógyászatilag elfogadható sói előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási anyagokat alkalmazunk.
20. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-acetil-D-3-(2naftil)-alanil-D-3-(p-klór-fenil)-alanil-D-3-(3-piridil)alanil-L-szeril-L-arginil-D-3-(3-piridil)-alanil-L-leucilN,N’-guanidino-(dietil)-L-homoarginil-L-prolil-Dalanil-amid és gyógyászatilag elfogadható sói előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási anyagokat alkalmazunk.
21. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-acetil-D-3-(2naftil)-alanil-D-3-(3-p-klór-fenil)-alanil-D-3-(3-piridil)-alanil-L-szeril-N,N’-guanidino-bisz(2,2,2-trifluoretil)-L-homoarginil-D-tirozil-L-leucil-N,N’-guanidinobisz(2,2,2-trifluor-etil)-L-homoarginil-L-prolil-D-alanil-amid és gyógyászatilag elfogadható sói előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási anyagokat alkalmazunk.
22. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-acetil-D-3-(2naftil)-alanil-D-3-(3-p-klór-fenil)-alanil-D-3-(3-piridil)-alanil-L-szeril-L-tirozil-N,N ’ -guanidino-(dietil)D-homoarginil-L-leucil-N,N’-guanidino-(dietil)-Lhomoarginil-L-prolil-D-alanil-amid és gyógyászatilag elfogadható sói előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási anyagokat alkalmazunk.
23. Az 1. igénypont szerinti eljárás N-acetil-D-3-(2naftil)-alanil-D-3-(3-p-klór-fenil)-alanil-D-3-(3-piridil)-alanil-L-szeril-L-tirozil-D-3-(3-piridil)-alanil-Lleucil-N-guanidino-(butil)-L-homoarginil-L-prolil-Dalanil-amid,

N-acetil-D-3-(2-naftil)-alanil-D-3-(3-p-klór-fenil)alanil-D-3-(3-piridil)-alanil-L-szeril-L-tirozil-D-3-(3piridil)-alanil-L-leucil-N,N’-guanidino-(propeno)-L-homoarginil-L-prolil-D-alanil-amid,

N-acetil-3-(2-naftil)-alanil-D-3-(p-klór-fenil)-alanil-Dtriptofil-L-szeril-L-tirozil-D-triptofil-L-leucil-N,N’guanidino-bisz(2,2,2-trifluor-etil)-L-homoarginil-Lprolil-D-alanil-amid,

N-acetil-3-(2-naftil)-alanil-D-3-(p-klór-fenil)-alanil-Dtriptofil-L-szeril-L-arginil-D-triptofil-L-leucil-N,N’guanidino-bisz(2,2,2-trifluor-etil)-L-homoarginil-Lprolil-D-alanil-amid,

N-acetil-3-(2-naftil)-alanil-D-3-(p-klór-fenil)-alanil-Dtriptofil-L-szeril-L-arginil-D-triptofil-L-leucil-N.N’guanidino-(propeno)-L-homoarginil-L-prolil-D-alanil-amid,

N-acetil-D-3-(2-naftil)-alanil-D-3-(p-klór-fenil)-alanilD-3-(3-piridil)-alanil-L-szeril-L-arginil-D-3-(p-klórfenil)-alanil-L-leucil-N,N’-guanidino-bisz(2,2,2-trifluor-etil)-L-homoarginil-L-prolil-D-alanil-amid,

N-acetil-D-3-(2-naftil)-alanil-D-3-(p-klór-fenil)-alanilD-3-(3-piridil)-alanil-L-szeril-L-arginil-D-3-(p-klór-fenil)-alanil-L-leucil-N,N’-guanidino-(propeno)-L-homoarginil-L-prolil-D-alanil-amid, és gyógyászatilag elfogadható sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási anyagokat alkalmazunk.
24. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított (I) általános képletű vegyületet - ahol A, B, C, D, E, F, G és J jelentése egyezik az 1. igénypontban megadott meghatározás szerintivel vagy ennek valamely gyógyászatilag elfogadható sóját gyógyászati célokra alkalmas vivőanyaggal és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal összekeveqük, és gyógyászati készítménnyé alakítjuk.
25. Az (I) általános képletű LH-RH-analógok, mely képletben

A jelentése N-(2-5 szénatomos)-alkanoil-D-3(naftil)-alanil-, előnyösen N-acetil-D-3-(2-naftil)alanil-csoport,

B jelentése D-(p-klór-fenil)-alanil- vagy D-(p-fluorfenilj-alanil-csoport,

C jelentése D-triptofil- vagy D-3-(3-piridil)-alanilcsoport,

D jelentése L-tirozil-, L-arginil-, 3-(3-piridil)-alanilcsoport vagy (II) általános képletű csoport, amelyben

R¹ jelentése 2-6 szénatomos alkilcsoport és

R² jelentése hidrogénatom, vagy

R¹ és R² jelentése azonosan 1 -4 szénatomos alkilcsoport vagy (o-trifluor-(2-4 szénatomos)alkil-csoport, vagy az R*-NH-C=NR² részjelentése (3-piridil)-CH₂-CO- vagy nikotinoilcsoport, n=4,

E jelentése D-tirozil-, D-triptofil-, D-3-(3-piridil)alanil-csoport vagy (II) általános képletű csoport, ahol

R¹ jelentése 2-6 szénatomos alkilcsoport és

R² jelentése hidrogénatom, vagy

R^l és R² jelentése azonosan 1 -4 szénatomos alkilcsoport vagy

R¹ és R² jelentése együtt egy 2-5 szénatomos egyenes láncú alkiléncsoport n=4,

F jelentése L-leucil- vagy L-fenil-alanil-csoport,

G jelentése L-arginil-csoport vagy (II) általános képletű csoport, és ebben

R¹ jelentése 2-6 szénatomos alkilcsoport és R² jelentése hidrogénatom vagy ω-trifluor(2-4 szénatomos)-alkil-csoport, vagy R¹ és R² jelentése azonosan <a-trifluor-(2-4 szénatomos)-alkil-csoport vagy (1-4 szénatomos)alkil-csoport, vagy

HU 215 855 Β

R¹ és R² jelentése együtt egy 2-5 szénatomos egyenes láncú alkiléncsoport, n=4,

J jelentése D-alanil-NH₂ csoport, és gyógyászati szempontból elfogadható sóik.
26. A 25. igénypont szerinti (I) általános képletű

LH-RH-analógok és gyógyászati szempontból elfogadható sóik, mely képletben

B jelentése D-(p-klór-fenil)-alanil- vagy D-(p-fluor-fenil)-alanil-csoport,

D jelentése L-tirozil-, L-arginil-, L-3-(3-piridil)alanil-, N,N’-guanidino-(dietil)-L-homoarginil-, Nguanidino-(butil)-L-homoarginil-, N,N’-guanidinobisz(2,2,2-trifluor-etil)-L-homoarginil- vagy N,N’guanidino-(propeno)-L-homoarginil-csoport,

E jelentése D-triptofil-, D-tirozil-, D-3-(3-piridil)-alanil-, N,N’-guanidino-(dietil)-D-homoarginil-, Nguanidino-(butil)-D-homoarginil-, N,N ’-guanidinobisz(2,2,2-trifluor-etil)-D-homoarginil- vagy N,N’guanidino-(propeno)-D-homoarginil-csoport,

G jelentése N,N’-guanidino-(dietil)-L-homoarginil-, Nguanidino-(butil)-L-homoarginil-, N,N’-guanidinobisz(2,2,2-trifluor-etil)-L-homoarginil- vagy N,N’guanidino-(propeno)-L-homoarginil-csoport,

A, C, F és J jelentése pedig egyezik az 1. igénypontban megadottal.
27. A 26. igénypont szerinti (I) általános képletű

LH-RH-analógok és gyógyászati szempontból elfogadható sóik, mely képletben

B jelentése D-(p-klór-fenil)-alanil-csoport,

D jelentése L-tirozil-, L-arginil-, N,N’-guanidino-(dietil)-L-homoarginil-, N-guanidino-(butil)-L-homoarginil-, N,N’-guanidino-bisz(2,2,2-trifluor-etil)-Lhomoarginil- vagy N,N’-guanidino-(propeno)-L-homoarginil-csoport,

F jelentése L-leucil-csoport,

A, C és J jelentése egyezik a 26. igénypontban megadottal.
28. A 27. igénypont szerinti (I) általános képletű

LH-RH-analógok és gyógyászati szempontból elfogadható sóik, mely képletben G jelentése N,N’-guanidino(dietil)-L-homoarginil- vagy N,N’-guanidino-bisz(2,2,2-trifluor-etil)-L-homoarginil-csoport, A, B, C, D, E, F és J jelentése egyezik a 3. igénypont szerintivel.
29. A 28. igénypont szerinti (I) általános képletű

LH-RH-analógok és gyógyászati szempontból elfogadható sóik, mely képletben G jelentése N,N’-guanidino(dietil)-homoarginil-csoport, A, B, C, D, E, F és J jelentése egyezik a 3. igénypont szerintivel.
30. A 25. igénypont szerinti (I) általános képletű LH-RH-analógok és gyógyászati szempontból elfogadható sóik, mely képletben

A, C és J jelentése egyezik a 25. igénypontban megadottal,

B jelentése D-(p-klór-fenil)-alanil-csoport,

D jelentése L-tirozil-csoport,

E jelentése D-3-(3-piridil)-alanil- vagy D-triptofilcsoport,

F jelentése L-leucil-csoport

G jelentése N,N’-guanidino-(dietil)-L-homoarginil-,

N-guanidino-(butil)-L-homoarginil-, N,N’-guanidino-bisz(2,2,2-trifluor-etil)-L-homoarginil- vagy N,N’-guanidino-(propeno)-L-homoarginil-csoport.
31. A 30. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyületek és gyógyászati szempontból elfogadható sóik, melyek a képlet C és E helyén azonos csoportot tartalmaznak.
32. A 27. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyületek és gyógyászati szempontból elfogadható sóik, mely képletben

E jelentése N,N’-guanidino-(dietil)-D-homoarginil-, N,N’-guanidino-bisz(2,2,2-trifluor-etil)-N-homoarginil-, N-guanidino-(butil)-D-homoarginil- vagy N,N’guanidino-(propenil)-D-homoarginil-csoport,

A, B, C, D, F, G és J jelentése pedig egyezik a 27.

igénypont szerintivel.
33. A 27. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyületek és gyógyászati szempontból elfogadható sóik, mely képletben

E jelentése D-triptofil-, D-3-(3-piridil)-alanil- vagy D-tirozil-csoport,

A, B, C, D, F, G és J jelentése egyezik a 27. igénypont szerintivel.
34. A 33. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyületek és gyógyászati szempontból elfogadható sóik, mely képletben E jelentése D-triptofil- vagy D-3-(3piridil)-alanil-csoport, A, B, C, D, F, G és J jelentése egyezik a 27. igénypont szerintivel.
35. A 34. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyületek és gyógyászati szempontból elfogadható sóik, mely képletben C és E helyén azonos csoportot tartalmaznak.