JP3645255B1

JP3645255B1 - ５位および６位で修飾されているＧｎＲＨ拮抗物質

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Publication number: JP3645255B1
Application number: JP2004320615A
Authority: JP
Inventors: グレーメ・センプル; ガンチェン・ジアン; ジーン・イー・エフ・リビエール
Original assignee: フェリングベスローテンフェンノートシャップ
Priority date: 1997-04-11
Filing date: 2004-11-04
Publication date: 2005-05-11
Anticipated expiration: 2018-04-13
Also published as: JP4249806B2; US6214798B1; NL300395I1; SK139699A3; CZ358699A3; ES2260833T3; MY114811A; CN1230442C; AU728642B2; SI1003774T1; EP1003774B1; US5925730A; CA2286190C; CZ299097B6; KR20010006233A; EE03974B1; UA58547C2; DE122009000033I2; NO2009016I2; FR09C0028I2

Abstract

ＧｎＲＨ拮抗特性の持続期間が改善されたペプチドを提供する。これら拮抗物質は、受胎能の調整およびステロイド依存性腫瘍の治療に用いることができるし、その他短期および長期いずれの治療適応症に対しても用いることができる。これら拮抗物質は、５位または５位および６位に、アミノＰｈｅ誘導体またはその等価体を有している。この誘導体は、カルバモイル基または側鎖に、尿素部分を含有する複素環を含むように修飾される。注射後９６時間にわたって著しくＬＨ分泌抑制を発揮し続ける、特に有効なデカペプチドは、式：
Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロト）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２、および
Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロト）−Ｄ−４Ａｍｆ（Ｑ_２）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｘａａ_１０
を有する。式中、Ｑ_２はＣｂｍまたはＭｅＣｂｍであり、Ｘａａ_１０はＤ−Ａｌａ−ＮＨ_２、Ｄ−Ａｌａ−ｏｌ、またはＡｌａ−ｏｌである。

Description

本発明は、一般に、ヒトゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の拮抗物質であるペプチドであって、有利な物理的、化学的、および生物学的特性を有するペプチドに関する。より詳細には、生殖腺機能と、ステロイドホルモンであるプロゲステロンおよびテストステロンの放出とを長時間にわたって抑制するデカペプチド、ならびにこのような目的において、特に生殖腺ステロイドの過剰分泌によって生じる諸状態を管理するために、このデカペプチドを含有する医薬品組成物を投与する方法に関する。

ゴナドトロピンまたは性腺刺激ホルモンと呼ばれることもある、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体化ホルモン（ＬＨ）は、柄によって視床下部に付いている下垂体から放出される。

通常、下垂体前葉からホルモンが放出されるには、例えばＧｎＲＨデカペプチドなどの、視床下部で産生されるホルモンが予め放出される必要がある。

一般に哺乳動物においてゴナドトロピンの分泌を抑制するために、また排卵を抑制または遅延するために、ＧｎＲＨの正常な作用に拮抗するＧｎＲＨアナログの投与が用いられてきた。

改善されたＧｎＲＨ拮抗物質の探求の結果、アンチド（Ａｎｔｉｄｅ）すなわち［Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ^１，Ｄ−４ＣｌＰｈｅ^２，Ｄ−３Ｐａｌ^３，Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）^５，Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）^６，ＩＬｙｓ^８，Ｄ−Ａｌａ^１０］−ＧｎＲＨ；およびセトロレリックス（Ｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘ）すなわち［Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ^１，Ｄ−４ＣｌＰｈｅ^２，Ｄ−３Ｐａｌ^３，Ｄ−Ｃｉｔ^６，Ｄ−Ａｌａ^１０］−ＧｎＲＨが生成された。米国特許第５，５１６，８８７号には、血漿テストステロンの抑制においてアンチドより有効であると言われるＧｎＲＨ拮抗物質、例えばアンタレリックス（Ａｎｔａｒｅｌｉｘ）と呼ばれる［Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ^１，Ｄ−４ＣｌＰｈｅ^２，Ｄ−３Ｐａｌ^３，Ｄ−Ｎ^ε−カルバモイルＬｙｓ^６，ＩＬｙｓ^８，Ｄ−Ａｌａ^１０］−ＧｎＲＨについて記載されている。

１９９４年３月２２日発行の米国特許第５，２９６，４６８号には、多くのＧｎＲＨ拮抗物質の設計および合成について開示されているが、ここでは、選択された残基の側鎖は反応してシアノグアニジノ部分を生じ、その一部は続いて自発的に所望の複素環に変換するものであり、例えば３−アミノ−１，２，４−トリアゾール（ａｔｚ）がある。このようなシアノグラニジノ部分は、リジン、オニチン、４−アミノフェニルアラニン（４Ａｐｈ）、または４Ａｐｈの延長鎖型である４−アミノホモフェニルアラニン（４Ａｈｐ）などのアミノ酸側鎖のオメガアミノ基において形成される。このように有意に修飾されたアミノ酸または非天然アミノ酸を５位および６位に有するＧｎＲＨ拮抗物質は、良好な生物学的な効力を呈し、シアノグラニジノ部分がＡｐｈ上に作られているものが一般に好ましいとされている。特に好ましいＧｎＲＨ拮抗物質は、アザリン（Ａｚａｌｉｎｅ）Ｂ、すなわち［Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ^１，Ｄ−４ＣｌＰｈｅ^２，Ｄ−３Ｐａｌ^３，４Ａｐｈ（ａｔｚ）^５，Ｄ−４Ａｐｈ（ａｔｚ）^６，ＩＬｙｓ^８，Ｄ−Ａｌａ^１０］−ＧｎＲＨである。米国特許第５，５０６，２０７号には、５位および６位の残基のアミノ置換フェニルアラニン側鎖がアシル化されている生物作用能が大きいＧｎＲＨ拮抗物質が開示されているが、特に効力の大きいデカペプチドは、アシリン（Ａｃｙｌｉｎｅ）、すなわち［Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ^１，Ｄ−４ＣｌＰｈｅ^２，Ｄ−３Ｐａｌ^３，４Ａｐｈ（Ａｃ）^５，Ｄ−４Ａｐｈ（Ａｃ）^６，ＩＬｙｓ^８，Ｄ−Ａｌａ^１０］−ＧｎＲＨである。

これら一群のＧｎＲＨ拮抗物質が有する魅力ある特性にもかかわらず、より一層改善されたＧｎＲＨ拮抗物質、特に生物学的作用が長時間持続するＧｎＲＨ拮抗物質の探求は今日まで続いている。ペプチドアナログは、短期および長期の治療適応症のいずれの場合も、ＬＨ分泌に対する活性の持続時間が長いものであること、すなわち体内でのタンパク質分解酵素に対する分解ペプチドの抵抗性によって助長される特性を呈することがしばしば重要となる。さらに、これらの化合物をゲル化することなしに、哺乳動物、特にヒトに対して投与することを容易にするには、このようなＧｎＲＨ拮抗物質デカペプチドが、通常の生理学的ｐＨ、すなわち約ｐＨ５から約ｐＨ７．４において、水に対する溶解度が高いことが非常に有利であると考えられる。

（発明の概要）
セトロレリックス、アンタレリックス、アシリン、アンチドなどを含むＧｎＲＨ拮抗物質のサブクラスにおいて、５位の残基または５位および６位の残基に別のある修飾を施すと、意外なことに、皮下投与したときに生物活性の持続期間が長いという特に有利な特性を呈する化合物が得られることが判明した。このような修飾は、４アミノＰｈｅ残基もしくはそれの等価な４Ａｈｐ残基、または第一級アミノ基が４位もしくはパラ位にあるメチル基に結合している４−アミノメチルフェニルアラニン（４Ａｍｆ）に対して行われる。このような修飾においては、側鎖のアミノ基はイソシアネートと反応して尿素基を形成するか、あるいは尿素部分を構成するように配置された少なくとも２個の窒素原子を含有する複素環式カルボン酸と反応する。好ましい複素暇反応物は、Ｄ−ヒドロオロト酸またはＬ−ヒドロオロト酸（Ｈｏｒ）（Ｃ_４Ｎ_２Ｈ_５（Ｏ）_２ＣＯＯＨ）、およびＤ−イミダゾリドン−４−カルボン酸またはＬ−イミダゾリドン−４−カルボン酸（Ｉｍｚ）（Ｃ_３Ｎ_２Ｈ_５（Ｏ）ＣＯＯＨ）である。

一般に、式：
Ｘ−Ｄ−Ｎａｌ−（Ａ）Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｘａａ_５−Ｘａａ_６−Ｌｅｕ−Ｘａａ_８−Ｐｒｏ−Ｘａａ_１０を有するＧｎＲＨ拮抗物質デカペプチド、密接に関連するそのアナログ、および薬剤学的に許容可能なその塩は、特に生物活性持続期間が長いという改善された薬理学的特性を有することが判明している：
上式で、
Ｘは、最高で７個の炭素原子を有するアシル基、またはＱであって、該Ｑは

であり、式中Ｒは、Ｈまたは低級アルキルであり、
Ａは、４Ｃｌ、４Ｆ、４Ｂｒ、４ＮＯ_２、４ＣＨ_３、４ＯＣＨ_３、３，４Ｃｌ_２またはＣ^αＭｅ４Ｃｌであり、
Ｘａａ_５は、Ａｐｈ（Ｑ_１）またはＡｍｆ（Ｑ_１）であって、式中Ｑ_１は

であり、
Ｘａａ_６は、Ｄ−Ａｐｈ（Ｑ_２）、Ｄ−Ａｍｆ（Ｑ_２）、Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）、Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｈｃｉ、またはＤ−Ｐａｌであって、式中Ｑ_２はＦｏｒ、Ａｃ、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、Ｑ、またはＱ_１であり、
Ｘａａ_８は、Ｌｙｓ（ｉｐｒ）、Ａｒｇ、Ｈａｒ、Ａｒｇ（Ｅｔ_２）、またはＨａｒ（Ｅｔ_２）であり、そして
Ｘａａ_１０は、Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２、Ｄ−Ａｌａ−ｏｌ、Ａｌａ−ｏｌ、ＮＨＣＨ_２ＣＨ_３、Ｇｌｙ−ＮＨ_２、ＡｚａＧｌｙ−ＮＨ_２、Ａｌａ−ＮＨ_２、Ａｇｌ−ＮＨ_２、Ｄ−Ａｇｌ−ＮＨ_２、Ａｇｌ（Ｍｅ）−ＮＨ_２、またはＤ−Ａｇｌ（Ｍｅ）−ＮＨ_２であり、
ただし、Ｘａａ_５のα−アミノ基は、任意選択でメチル化されていてもよく、さらにＸａａ_６がＤ−ＨｏｒもしくはＬ−ＨｏｒまたはＤ−ＩｍｚもしくはＬ−Ｉｍｚを含有するとき、Ｘａａ_５はＡｃ、Ｆｏｒ、または３−アミノ−１，２，４−トリアゾールをＱ_１として有してもよく、Ｘａａ_６がＱを含有するとき、Ｘａａ_５もＱを含有していてもよい。

別の態様において、本発明は、ＧｎＲＨが過剰なホルモン分泌または腫瘍の増殖を引き起こしている状態をｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏで診断する方法を提供するものであり、該方法には、前記種類のＧｎＲＨ拮抗物質ペプチドを投与することと、ホルモン分泌および腫瘍細胞の増殖をモニタすることとが含まれる。

さらに別の態様において、本発明は、式：
Ｘ^１−Ｄ−Ｎａｌ−（Ａ）Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ（Ｘ^２）−Ｘａａ_５−Ｘａａ_６−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉｐｒ）（Ｘ^４）−Ｐｒｏ−Ｘ^５
を有するＧｎＲＨ拮抗物質ペプチドを生成するための中間体を提供し、
上式で、
Ｘ^１は、α−アミノ保護基であり、
Ａは、４Ｃｌまたは４Ｆであり、
Ｘ^２は、Ｈまたはヒドロキシル保護基であり、
Ｘａａ_５は、Ａｐｈ（Ｑ_１）またはＡｍｆ（Ｑ_１）であって、式中Ｑ_１は、下式のいずれかのＤ−異性体、Ｌ−異性体、またはＤ／Ｌ−異性体混合物であり、

であり、
Ｘａａ_６は、Ｄ−Ａｐｈ（Ｑ_２）、Ｄ−Ａｍｆ（Ｑ_２）、またはＤ−Ｐａｌであって、式中Ｑ_２は、Ａｃ、Ｑ_１、カルバモイル、またはメチルカルバモイルであり、
Ｘ^４は、酸に不安定なアミノ保護基であり、そして
Ｘ^５は、Ｄ−Ａｌａ−、Ｇｌｙ−、Ａｌａ−、Ａｇｌ−、Ｄ−Ａｇｌ−、Ａｇｌ（Ｍｅ）−、もしくはＤ−Ａｇｌ（Ｍｅ）−樹脂保持体；Ｎ（Ｅｔ）−樹脂保持体；Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、もしくはＡｌａのアミド；エチルアミド；ＡｚａＧｌｙ−ＮＨ_２；またはＯＨであり、
ただし、Ｘａａ_５のα−アミノ基は、任意選択でメチル化されていてもよい。

これらの拮抗物質は、活性の持続期間が長いために、すなわち少なくとも約４日間にわたってＬＨの分泌を有意に抑制しつづけるために、ヒトでのゴナドトロピンの分泌の抑制、および受胎能調整剤として特に有効である。は非常によく、ヒスタミン放出の刺激に関する副作用も許容でき、すなわち現在使用されているＧｎＲＨスーパーアゴニストに比べてより良好である。さらに、有効濃度において皮下（ＳＣ）注射してもゲル化は最小限しか認められない。これらのＧｎＲＨ拮抗物質は、比較的小さな膨疹を引き起こすアナフィラキシーアッセイ（ａｎａｐｈｙｌａｃｔｏｉｄａｓｓａｙ）においても良好に機能する。その結果、これらのペプチドを、受胎能調整剤として、あるいは性的早熟庄、ホルモン依存性腫瘍形成、月経困難症、子宮内膜症、ステロイド依存性腫瘍、およびその他本明細書で先に言及した短期適応症もしくは長期適応症の治療用に、哺乳動物、特にヒトへの投与において、特に用いることが見出される。これらは診断にも有用である。

これらのＧｎＲＨ拮抗物質は、約５から約７．４の生理学的ｐＨ範囲で容易に溶解するため、特にｐＨ約５からｐＨ約７において濃縮された形態で製剤化および投与することができる。その極性ゆえに、既知コポリマーをベースとした徐放性調製品での使用に特に適している。これらのＧｎＲＨ拮抗物質は、長期にわたってＬＨおよびＦＳＨの抑制に有効であるため、雄哺乳動物の避妊治療に（テストステロンを任意選択で投与しながら）、およびステロイド依存性腫瘍の治療に、特に有効でもある。

（好ましい実施形態の詳細な説明）
最近１０年から１２年の間、有効な拮抗物質をつくるという観点から、ＧｎＲＨ配列における１０個の残基それぞれの特性について徹底した研究がなされてきた。その結果、等価な残基として選択し得る種々の残基があること、およびこれらの等価な残基の１つを別の等価な残基と置換してもデカペプチドＧｎＲＨ拮抗物質の生物作用能が有意に損なわれることはないことが分かった。本発明のＧｎＲＨ拮抗物質において、このような等価な置換を行うことができる。

例えば、パラ−置換Ｄ−Ｐｈｅ、２，４ジクロロ−置換Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｃ^αＭｅ４ＣｌＰｈｅ、またはＤ−ペンタメチル（Ｍｅ５）Ｐｈｅ残基を２位に有するようにすると、ＧｎＲＨ拮抗物質の活性は有意に増すが、環置換基の特有の独自性は、クロロ、フルオロ、ブロモ、ニトロ、メチル、およびアルコキシの中から選択した場合には、あまり重要でないことが一般に認められている。したがって、２位のこのような残基は、一般的に用いるＤ−４ＣｌＰｈｅの等価体であると考えられる。Ｐｈｅ^７は、Ｌｅｕ^７の等価体と考えられる。Ｎ末端は、好ましくはアセチル（Ａｃ）により、Ｎ−アシル化されていることが好ましいが、例えばホルミル（Ｆｏｒ）、アクリリル（Ａｃｒ）、ｎ−プロピオニル（Ｐｎ）、ブチリル（Ｂｙ）、バレリル（Ｖｌ）、ビニルアセチル（Ｖａｃ）、およびベンゾイル（Ｂｚ）などの炭素原子を最高で７個有するその他のアシル基により、Ｎ−アシル化されていても好ましい。あるいは、置換カルバモイルまたは非置換カルバモイルによって修飾されていてもよい。その他のより長いアシル基も等価体であると考えられるが、あまり好ましくない。米国特許第５，１１０，９０４号に開示されているように、５位の残基のα−アミノ基を任意選択でメチル化して水溶性を高めることもできるが、このような修飾を行うとＬＨ抑制持続期間が短縮され、ヒスタミン放出の可能性が大きくなる。Ｃ末端は、Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２、Ｄ−Ａｌａ−ｏｌ、またはＡｌａ−ｏｌであることが好ましいが、Ｇｌｙ−ＮＨ_２、ＮＨＣＨ_２ＣＨ_３、ＡｚａＧｌｙ−ＮＨ_２、Ａｌａ−ＮＨ_２、Ａｇｌ−ＮＨ_２、Ｄ−Ａｇｌ−ＮＨ_２、Ａｇｌ（Ｍｅ）−ＮＨ_２、およびＤ−Ａｇｌ（Ｍｅ）−ＮＨ_２も、既知の等価体と考えられることから、代わりに使用することができる。

本明細書で先に述べたように、本発明は、次式：
Ｘ−Ｄ−Ｎａｌ−（Ａ）Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｘａａ_５−Ｘａａ_６−Ｌｅｕ−Ｘａａ_８−Ｐｒｏ−Ｘａａ_１０
で表わされるＧｎＲＨ拮抗物質のファミリー、および薬剤学的に許容可能なその塩を提供することを意図し、
上式で、
Ｘは、Ｆｏｒ、Ａｃ、Ａｃｒ、Ｐｎ、Ｂｙ、Ｖｌ、Ｖａｃ、Ｂｚ、またはＱであって、該Ｑは

であり、式中Ｒは、Ｈまたは低級アルキルであり、
Ａは、４Ｃｌ、４Ｆ、４Ｂｒ、４ＮＯ_２、４ＣＨ_３、４ＯＣＨ_３、３，４Ｃｌ_２、またはＣ^αＭｅ４Ｃｌであり、
Ｘａａ_５は、Ａｐｈ（Ｑ_１）またはＡｍｆ（Ｑ_１）であって、式中Ｑ_１は、

であり、
Ｘａａ_６は、Ｄ−Ａｐｈ（Ｑ_２）、Ｄ−Ａｍｆ（Ｑ_２）、Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）、Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｈｃｉ、またはＤ−Ｐａｌであって、式中Ｑ_２は、Ｆｏｒ、Ａｃ、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール、Ｑ、またはＱ_１であり、
Ｘａａ_８は、Ｌｙｓ（ｉｐｒ）、Ａｒｇ、Ｈａｒ、Ａｒｇ（Ｅｔ_２）、またはＨａｒ（Ｅｔ_２）であり、そして
Ｘａａ_１０は、Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２、Ｄ−Ａｌａ−ｏｌ、Ａｌａ−ｏｌ、ＮＨＣＨ_２ＣＨ_３、Ｇｌｙ−ＮＨ_２、ＡｚａＧｌｙ−ＮＨ_２、Ａｌａ−ＮＨ_２、Ａｇｌ−ＮＨ_２、Ｄ−Ａｇｌ−ＮＨ_２、Ａｇｌ（Ｍｅ）−ＮＨ_２、またはＤ−Ａｇｌ（Ｍｅ）−ＮＨ_２であり、
ただし、Ｘａａ_５のα−アミノ基は、任意選択でメチル化していてもよい。

ＧｎＲＨ拮抗物質と密接に関連するファミリーでは、Ｘａａ_５は、Ｑ_１としてＡｃ、Ｆｏｒ、または３−アミノ−１，２，４−トリアゾールのいずれかを有していてよく、この場合Ｘａａ_６は、Ｄ−ＨｏｒもしくはＬ−Ｈｏｒ、またはＤ−ＩｍｚもしくはＬ−ＩｍｚであるＱ_２を含んでいる。

別のＧｎＲＨ拮抗物質と密接に関連するファミリーでは、Ｘａａ_６はＱを含み、Ｘａａ_５もＱ含んでいる。

Ｄ−Ｎａｌは、β−炭素原子でナフチルが置換したアラニンのＤ−異性体を意味し、すなわちβ−Ｄ−Ｎａｌまたは３−Ｄ−Ｎａｌともいう。ナフタレンとの結合が環構造上の２位である、Ｄ−２Ｎａｌを用いることが好ましいが、Ｄ−１Ｎａｌを用いることもできる。Ｄ−ＣＰａは、クロロ−Ｄ−Ｐｈｅを表わしており、Ｄ−４ＣｌＰｈｅすなわちＤ−４ＣＰａが好ましい。Ｄ−Ｐａｌは、β−炭素原子でピリジルが置換したアラニンのＤ−異性体を表わし、ピリジン環の３位に結合していること、すなわちＤ−３Ｐａｌ（β−３−ピリジル−Ｄ−Ａｌａ）であることが好ましいが、Ｄ−２Ｐａｌ（β−２−ピリジル−Ｄ−Ａｌａ）を代わりに用いることもできる。４Ａｐｈは、フェニル環上のアミノ置換基が４位にある４ＮＨ_２Ｐｈｅを意味し、３ＮＨ_２Ｐｈｅ（３Ａｐｈ）は、これらアナログ中に含まれる、それの等価体であると考えられる。さらに、２ＮＨ_２Ｐｈｅも生物作用能の観点から等価体であると考えられる。４Ａｍｆは、側鎖アミノ基にメチレンが結合している４ＮＨ_２ＣＨ_２Ｐｈｅを意味し、３ＮＨ_２ＣＨ_２Ｐｈｅ（３Ａｍｆ）は、等価体であると考えられる。ＨｏｒまたはＬ−Ｈｏｒは、Ｌ−ヒドロオロチルを意味し、ＩｍｚまたはＬ−ＩｍｚはＬ−２−イミダゾリドン−４−カルボニルを意味し、いずれもＤ−異性体またはＤ／Ｌ混合物として用いることもできる。ａｔｚは、３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを意味する。４Ａｐｈ（ａｔｚ）は、より正確な化学名である４−（３’−アミノ−１Ｈ−１’，２’，４’−トリアゾール−５’−イル）アミノフェニルアラニンでも知られている。Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）は、Ｎ^ε−ニコチノイルリジンを意味し、すなわちＬｙｓのε−アミノ基が３−カルボキシピリジンでアシル化されている。Ｄ−Ｃｉｔは、シトルリンのＤ−異性体を意味し、Ｄ−Ｈｃｉは、Ｄ−Ｎ^ε−カルバモイルリジンでもある、ホモシトルリンのＤ−異性体を意味する。ＩＬｙｓまたはＬｙｓ（ｉｐｒ）は、Ｌｙｓのε−アミノ基がアルキル化されているＮ^ε−イソプロピルリジンを意味する。Ａｌａ−ｏｌは、アラニノール、すなわちＣＨ_３ＣＨ（ＮＨ_２）ＣＨ_２ＯＨを意味し、ＡｚａＧｌｙ−ＮＨ_２は、ＮＨＮＨＣＯＮＨ_２を意味する。Ｈａｒは、ホモアルギニンを意味する。Ａｇｌは、α−アミノグリシンを意味する。Ｃｂｍは、カルバモイルを意味し、ＭｅＣｂｍは、メチルカルバモイルまたは−ＣＯＮＨＣＨ_３を意味する。低級アルキルは、Ｃ_１からＣ_５を意味し、好ましくはＣ_１からＣ_３を、さらに好ましくはＣ_１またはＣ_２、すなわちメチル（Ｍｅ）またはエチル（Ｅｔ）を意味する。

これらＧｎＲＨ拮抗物質の６位に組み込まれる好ましいＤ−異性体を具体例によって開示したが、過去２０年にわたる当該技術分野の広範な研究の結果、多くの既知の等価なＤ−異性体が存在する。このような従来技術のＤ−異性体置換によっても、本明細書に開示した特定の５位の置換によって得られる生物作用能に合致するものであって、これが損なわれることはなく、したがって該置換を任意選択で用いることができる。

ＧｎＲＨ拮抗物質の好ましい下位部類（ｓｕｂｇｅｎｕｓ）は、式：Ｘ−Ｄ−Ｎａｌ−（Ａ）Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｘａａ_５−Ｘａａ_６−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉｐｒ）−Ｐｒｏ−Ｘａａ_１０を有し、および薬剤学的に許容可能なその塩であり
上式で、
Ｘは、Ｆｏｒ、Ａｃ、Ａｃｒ、Ｐｎ、Ｂｙ、Ｖｌ、Ｖａｃ、Ｂｚ、またはＱであって、該Ｑは

であり、式中Ｒは、Ｈまたは低級アルキルであり、
Ａは、４Ｃｌまたは４Ｆであり、
Ｘａａ_５は、Ａｐｈ（Ｑ_１）またはＡｍｆ（Ｑ_１）であって、式中Ｑ_１は

であり、
Ｘａａ_６は、Ｄ−Ａｐｈ（Ｑ_２）、Ｄ−Ａｍｆ（Ｑ_２）、Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）、またはＤ−Ｐａｌであって、式中Ｑ_２は、Ｆｏｒ、Ａｃ、Ｑ、またはＱ_１であり、そして
Ｘａａ_１０は、Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２、Ｄ−Ａｌａ−ｏｌ、Ａｌａ−ｏｌ、ＮＨＣＨ_２ＣＨ_３、またはＧｌｙ−ＮＨ_２である。

別のＧｎＲＨ拮抗物質の好ましい下位部類は、式：
Ｘ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｘａａ_５−Ｘａａ_６−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉｐｒ）−Ｐｒｏ−Ｘａａ_１０
を有し、および薬剤学的に許容可能なその塩であり、
上式で、
Ｘは、ＡｃまたはＱであって、該Ｑは

であり、式中Ｒは、Ｈまたはメチルであり、
Ｘａａ_５は、Ａｐｈ（Ｑ_１）またはＡｍｆ（Ｑ_１）であって、式中Ｑ_１は、

であり、
Ｘａａ_６は、Ｄ−Ａｐｈ（Ｑ_２）、Ｄ−Ａｍｆ（Ｑ_２）、またはＤ−Ｐａｌであって、式中Ｑ_２は、Ａｃ、Ｑ、またはＱ_１であり、そして
Ｘａａ_１０は、Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２、Ｄ−Ａｌａ−ｏｌ、またはＡｌａ−ｏｌである。

別のＧｎＲＨ拮抗物質の好ましい下位部類は、式：
ＭｅＣｂｍ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−Ｘａａ_６−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ_１０を有し、および薬剤学的に許容可能なその塩である。
上式で、
Ｄ−Ｘａａ_６は、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｑ_１）、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｑ_１）、またはＤ−３Ｐａｌであって、式中Ｑ_１は、Ｄ−Ｈｏｒまたは

であり、式中Ｒは、Ｈまたは低級アルキルであり、好ましくはＨまたはメチルであり、
Ｘａａ_１０は、Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２、Ｄ−Ａｌａ−ｏｌ、またはＡｌａ−ｏｌである。

本発明の化合物は、古典的なペプチド溶液合成によって合成することができ、このような合成は、大量の製品を合成するのに好ましい。例えば１ｋｇ未満の限られた量を得るためには、固相技術を利用して合成することが好ましい。当技術分野で周知であるように、側鎖の保護基は、アミノ酸が樹脂上につくられる鎖にカップリングするときに著しく活性な側鎖または不安定な側鎖を有する任意アミノ酸の一部として、含まれていることが好ましい。このような合成によって、Ｘ^１−Ｄ−Ｎａｌ−（Ａ）Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ（Ｘ^２）−Ｘａａ_５−Ｘａａ_６−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉｐｒ）（Ｘ^４）−Ｐｒｏ−Ｘ^５などの、充分保護された中間体ペプチド樹脂が得られる。

５位および６位に所望のヒドロオロチルなどを含有する残基を有するＧｎＲＨ拮抗物質の合成に用いる化学中間体の一例は、式：Ｘ^１−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ（Ｘ^２）−Ａｐｈ（Ｘ^３）−Ｄ−Ａｐｈ（Ｘ^３）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ（Ｘ^４）−Ｐｒｏ−Ｘ^５で表わされる。この式を有するペプチド中間体およびその他のアナログの合成には、後述するような基Ｘ^１およびＸ^５を用いることができる。

Ｘ^１は、ポリペプチドの段階的合成に有用であることが当技術分野において知られている型のα−アミノ保護基であり、所望のペプチド組成物中のＸが特定のアシル基である場合、その基を保護基として用いることができる。Ｘ^１に含まれるα−アミノ保護基の種類は、（１）ホルミル（Ｆｏｒ）、トリフルオロアセチル、フタロイル、ｐ−トルエン−スルホニル（Ｔｏｓ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンゼンスルホニル、ジチアスクシノイル（Ｄｔｓ）、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル（Ｎｐｓ）、トリチルスルフェニル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、アクリリル（Ａｃｒ）、クロロアセチル、アセチル（Ａｃ）、およびγ−クロロブチリルなどの、アシル型保護基、（２）ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ならびにｐ−クロロベンジルオキシ−カルボニル（ＣｌＺ）、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、およびｐ−メトキシベンジルオキシカルボニルなどの置換ベンジルオキシカルボニルなどの、芳香族ウレタン型保護基、（３）ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、およびアリルオキシカルボニルなどの、脂肪族ウレタン型保護基、（４）シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、およびシクロヘキシルオキシカルボニルなどの、シクロアルキルウレタン型保護基、（５）フェニルチオカルボニルなどの、チオウレタン型保護基、（６）アリル（Ａｌｙ）、トリフェニルメチル（トリチル）、およびベンジル（Ｂｚｌ）などの、アルキル型保護基、（７）トリメチルシランなどの、トリアルキルシラン基である。好ましいα−アミノ保護基は、Ｂｏｃである。

Ｘ^２は、Ａｃ、Ｂｚ、トリチル、２，６−ジクロロベンジル（ＤＣＢ）、またはベンジルエーテル（Ｂｚｌ）などの、Ｓｅｒのヒドロキシル側鎖の保護基であり、Ｂｚｌであることが好ましい。

Ｘ^３は、α−アミノ保護基または別のアミノ保護基を除去するときに除去されない側鎖アミノ基の保護基である。具体例には、（１）Ｆｍｏｃまたはその他の弱酸性に安定な芳香族ウレタン型保護基などの塩基に不安定な基、（２）チオール分解により除去または切断することができるジチアスクシノイル（Ｄｔｓ）などのチオールに不安定な基、（３）ヒドラジン分解によって切断されるフタロイル（Ｐｈｔ）などのヒドラジンに不安定な基、（４）チオアセトアミドまたは弱酸もしくはその塩によって切断されるｏ−ニトロフェニルスルフェニル（Ｎｐｓ）などの求核試薬に不安定な基、（５）光分解によって切断される光に不安定な基、および（６）Ｄｔｓなどの還元によって選択的に取り除かれる基などが含まれる。Ｆｍｏｃは、ＢｏｃＳＰＰＳストラテジーに好ましい。

Ｘ^４は、Ｚまたは２ＣｌＺなどの、第一級または第二級アミノ側鎖基に用いる酸に不安定な保護基である。

Ｘ^５は、Ｄ−Ａｌａ−、Ｇｌｙ−、Ａｌａ−、Ａｇｌ−、Ｄ−Ａｇｌ−、Ａｇｌ（Ｍｅ）−、もしくはＤ−Ａｇｌ（Ｍｅ）−ＮＨ−［樹脂保持体］であってもよいし、Ｎ（Ｅｔ）−［樹脂保持体］であってもよい。Ｘ^５は、ＧｌｙもしくはＡｌａもしくはＤ−Ａｌａのいずれかのアミド、Ｐｒｏに直接付いている低級アルキル置換アミド、ＡｚａＧｌｙ−ＮＨ_２、または−ＯＨ（遊離酸）とすることもできる。Ｘ^５が遊離酸のとき、中間体は、Ｄ−アラニノールまたはＬ−アラニノールにカップリングさせてＣ末端にアルコールを有するデカペプチドを得るように設計されている、ノナペプチドフラグメントである。

側鎖保護基Ｘ^２〜Ｘ^４の選択基準は、合成の各段階におけるα−アミノ保護基（Ｂｏｃが好ましい）の除去用に選択される反応条件下で、保護基が試薬に対して概ね安定であることである。これらの保護基は、一般にカップリング条件下で分離されるようなことがあってはならないが、所望のアミノ酸配列の合成が完了したときに、ペプチド鎖に変化を生ずることのないような反応条件下で取り除くことが可能でなければならない。５位および６位の残基に最初に用いた保護基は、取り除かれることが好ましく、本明細書中で後述するが、該選択的反応は、樹脂から最終段階のペプチドを切断する前に行う。前述したデカペプチド中間体を合成する場合、Ｘ^３保護基は、個別的に除去可能であることが望ましい。

Ｘ^５基がＤ−Ａｌａ−ＮＨ−［樹脂保持体］であるとき、保護基Ｄ−Ａｌａは、アミド結合によってＢＨＡ樹脂またはＭＢＨＡ樹脂に結合するが、このことはＡｇｌまたはＤ−ＡｇｌをＣ末端に用いた場合も同様である。Ｘ^５基がＮ（Ｅｔ）−［樹脂保持体］のとき、Ｐｒｏは、エチルアミド結合によってＮ−アルキルアミノメチル樹脂（ＮＡＡＭ）に結合する。

Ｎ末端をアセチル化する場合に、例えば、１位のβ−Ｄ−Ｎａｌのα−アミノ基に対するＸ^１保護基としてアセチルを用いることが可能であるが、このことは、β−Ｄ−Ｎａｌをペプチド鎖にカップリング前にアセチルを該アミノ酸に加えることにより可能となる。しかしながら、樹脂上のペプチド中間体を用いて反応を行うことが好ましい。α−アミノ保護基を脱保護した後、所望の側鎖が保護されたまま状態で、無水酢酸を用いた反応によってアセチル化を行うことが好ましい。あるいは、ジイソプロピルカルボジイミドまたはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＩＣまたはＤＣＣ）の存在下で、酢酸を用いて反応を行うこともでき、あるいは当技術分野で知られているその他の適当なアシル化反応によって行うこともできる。Ｎ末端にカルバモイル基または置換カルバモイル基を所望する場合も、同様の手順が行われる。残基がペプチド鎖の一部となっている状態で、脱保護した側鎖アミノ基を修飾する場合には、例えばＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）などの適当な塩基の存在下、適当なイソシアネートを用いて反応を行う。ただし、このような塩基の使用は任意選択である。最終製品に非置換カルバモイル基が所望される場合、脱保護したアミノ側鎖をベンジルイソシアネート、ｐ−トシルイソシアネート、トリメチルシリルイソシアネート、またはｔｅｒｔ−ブチルイソシアネートと反応させてもよいが、ｔｅｒｔ−ブチルイソシアネートと反応させることが好ましい。このようなストラテジーを用い、ｔ−ブチル部分を樹脂から切断される際に取り除き、カルバモイル基が残される。

本発明はさらに、例えば、式：Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ａｃ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２を有するＧｎＲＨ拮抗物質を生成する新規方法を提供するものであって、該方法には、（ａ）式：Ｂｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｘ^３）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ（Ｘ^４）−Ｐｒｏ−Ｘ^５（式中、Ｘ^３は、塩基に不安定なアミノ基保護基、ヒドラジンに不安定なアミノ基保護基、またはその他の適当な不安定なアミノ基保護基であり；Ｘ^４は、酸に不安定なアミノ側鎖保護基であり；Ｘ^５は、Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ−［樹脂保持体］である。）を有する中間ペプチドを生成すること、（ｂ）Ｄ−４ＡｐｈからＸ^３を取り除いて、中間ペプチドのアミノ酸残基の側鎖第一級アミノ基を脱保護すること（ｃ）この脱保護した側鎖第一級アミノ基と、無水酢酸とを反応させること、（ｄ）鎖の延長を完了して、中間体Ｘ^１−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ（Ｘ^２）−４Ａｐｈ（Ｘ^３）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ａｃ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ（Ｘ^４）−Ｐｒｏ−Ｘ^５（上式で、Ｘ^１は、水素またはα−アミノ保護基、Ｘ^２は、水素またはＳｅｒのヒドロキシル基を保護するための保護基である。）を生成すること、（ｅ）Ｎ末端のアミノ基を脱保護してアセチル化すること、（ｆ）４ＡｐｈからＸ^３を取り除いて、脱保護された第一級アミノ基とヒドロオロト酸とを反応させること、ならびに（ｇ）残存するすべての保護基を分離すること、および／またはＸ^５に含まれる樹脂保持体から切断することとが含まれる。

ペプチドの最終的な精製は、当技術分野で知られているクロマトグラフィーにより、好ましくはＲＰ−ＨＰＬＣを用いて行うことが好ましい。Ｊ．Ｒｉｖｉｅｒ他、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、２８８巻、３０３〜３２８頁、１９８４年；ならびにＣ．ＭｉｌｌｅｒおよびＪ．Ｒｉｖｉｅｒ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（ＰｅｐｔｉｄｅＳｃｉｅｎｃｅ）、４０巻、２６５〜３１７頁、１９９６年を参照のこと。

本発明のＧｎＲＨ拮抗物質は、雌ラットの排卵を防止するために、発情前期の正午頃に皮下投与した場合、体重１ｋｇ当たり１００マイクログラム未満のレベルで有効であると考えられる。排卵抑制期間を長くするには、体重１ｋｇ当たり約０．１ミリグラムから約２．５ミリグラムの範囲の用量レベルを使用する必要がある。この拮抗物質を哺乳動物の雄に規則的に投与すると、精子形成の停止にも有効であり、したがって避妊薬としても使用できる。これらの化合物はテストステロンレベルを低下させ、したがってリビドーをも低下させるため（正常な性的活動力のある雄にとっては望ましくない結果）、リビドーを維持しながら無精子症を達成するためには、ＧｎＲＨ拮抗物質と併用して補充用量（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｄｏｓａｇｅ）のテストステロンを投与することが望ましかろう。この拮抗物質は、ゴナドトロピンおよび性ステロイドの調整に用いることもでき、本明細書で先に述べたようなその他の長期および短期の適応症にも用いることもでき、これをペットの避妊薬として獣医学にも適用できる。

本発明によって提供されるペプチドは、生理学的ｐＨ値において著しい溶解性があり、したがって比較的高濃度の投与液剤として、特に皮下注射剤として調製することができる。これらのペプチドは体内で充分耐性であり、有効濃度で皮下投与する場合に容易にはゲル化しない。一般に、このようなペプチドと、医薬品として容認可能な好適な賦形剤とを含有する医薬品組成物を、１日に体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇから約２．５ｍｇの間のレベルで、静脈、腹腔、皮下などに投与することができ、通常は１日体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇで充分である。

適正に保護されたＤ−もしくはＬ−ヒドロオルチル−含有アミノ酸、カルバモイル−含有アミノ酸、および／またはＤ−もしくはＬ−イミダゾリドン−カルボニル−含有アミノ酸を合成し、次いで鎖延長ペプチド合成で用いることができる。しかしながら、等しく有効な合成は、適正に保護されたＡｐｈ残基、Ｄ−Ａｐｈ残基、Ａｍｆ残基、またはＤ−Ａｍｆ残基を、ペプチド中間体の所望の位置に最初に組込むことによって達成され、このような方法は、最初はわずか少量だけが望まれる実験室向けの方法として選択することができよう。この方法における最後のストラテジーは、特定の残基を順次に脱保護し（合成の際に直ちにまたは順次のいずれか）、次いで脱保護した側鎖アミノ基を所望の試薬と反応させることによって達成される。

本発明を以下の実施例でさらに説明する。

（実施例１）
式：Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−（Ｎｉｃ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２（アンチド）を有するペプチドは、ＧｎＲＨの拮抗物質として非常に良好な生物学的性質を示し、アンチドとは５位および６位のみが異なる、現在アシリンと呼ばれているペプチドも同様であることが判明している。現在では、これらの分子を出発点として用いることにより、およびデカペプチドアシリンの５位もしくは６位またはデカペプチドアシリンの５位に他の置換を施すことにより、ｉｎｖｉｖｏでの生物活性持続時間が改善されたＧｎＲＨ拮抗物質が得られることが判明している。１〜４位および７〜１０位に関しては、アンチド、アシリン、およびアザリンのいずれも全く同じであることに注意する。

以下のデカペプチド［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）^６］−アンチド、または［Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ^１、Ｄ−４Ｃｐａ^２、Ｄ−３Ｐａｌ^３、４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）^６、ＩＬｙｓ^８、Ｄ−Ａｌａ^１０］−ＧｎＲＨは、固相合成法によって合成される。このペプチドは以下の式を有する：Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（カルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２。

ＭＢＨＡ樹脂（Ｂａｃｈｅｍ）約０．５０グラム（０．５４ｍｍｏｌ／ｇ）を最初に用い、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）／ＣＨ_２Ｃｌ_２中で、活性化試薬またはカップリング試薬として約０．６５ミリモルのＢｏｃ誘導体、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、および無水１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を用い、約２時間かけて、Ｂｏｃ−保護Ｄ−Ａｌａを該樹脂にカップリングさせる。Ｄ−Ａｌａ残基は、アミド結合によりＭＢＨＡ残基と結合する。

各アミノ酸残基のカップリングの後、出発樹脂約０．５グラムから１グラムに対し、洗浄、脱保護、次いで次のアミノ酸残基のカップリングを以下の合成計画要覧に従って行う。

前記の計画は、最初のアミノ酸を結合した後、本発明ペプチドの各アミノ酸のカップリングに用いる。Ｎ^αＢｏｃ保護は、合成全体を通して、カップリングされる各アミノ酸に用いる。Ｎ^αＢｏｃ−β−Ｄ−２Ｎａｌは、例えば米国特許第４，２３４，５７１号で詳述されているように、当技術分野で知られている方法によって調製することができるし、米国オレゴン州ＳｙｎｔｈｅＴｅｃｈ社から市販されてもいる。５位における４Ａｐｈ、および６位におけるＤ−４Ａｐｈの側鎖の第一級アミノ基は、Ｆｍｏｃによって保護する。ベンジルエーテル（Ｂｚｌ）をＳｅｒのヒドロキシル基の側鎖保護基として用いることが好ましいが、Ｓｅｒは側鎖の保護を行わずにカップリングすることができる。Ｎ^αＢｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｐｒ、Ｚ）を８位残基に用いる。

６位残基にＮ^αＢｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）としてＤ−Ａｐｈを付加すると、以下の中間体：Ｂｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉｐｒ、Ｚ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ−［ＭＢＨＡ樹脂保持体］が得られる。６位残基の側鎖アミノ基を、まず側鎖保護基を除去した後に修飾する。２５％ピペリジンのＤＭＦ溶液（１０ｍｌ）を用いて、それぞれ約１５分間、連続的に処理することによって、Ｆｍｏｃ保護基を除去する。ペプチド樹脂をＤＭＦで洗浄した後、ＤＭＦ中の２０倍の過剰なｔｅｒｔ−ブチルイソシアネートを用いて、室温で、約１２時間またはニンヒドリン試験で検査しながら反応が完了するまで、新しく遊離したアミノ基を処理する。次いでペプチド樹脂を標準的に洗浄し、次の残基を付加するためにＢｏｃを除去する。

次いで、５位の残基をＮ^αＢｏｃ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）として付加する。次いで、前述のようにこの側鎖を脱保護して、Ｌ−ヒドロオロチン酸０．１０ｇ（０．６６ｍｍｏｌ）、ＨｏＢｔ９０ｍｇ（０．６６ｍｍｏｌ）、およびＤＩＣ０．６６ｍｍｏｌのＤＭＦ溶液３ｍｌを用いて、室温で、約８時間、または標準的ニンヒドリン試験を用いて検査しながら反応が完了するまで、反応を行う。洗浄し、Ｎ^αＢｏｃを除去した後、Ｎ^αＢｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ−３Ｐａｌ、Ｎ^αＢｏｃ−４Ｃｐａ、およびＮ^αＢｏｃ−Ｄ−２Ｎａｌを用いて逐次反応を行い、デカペプチドの合成を完了する。

Ｎ末端のα−アミノ基をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で脱保護した後、約３０分間、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の大過剰の無水酢酸を用いて、アセチル化を行う。あるいは、Ｎ末端のアセチル化後まで４ＡｐｈのＦｍｏｃ保護を除去せず、次いでＬ−ヒドロオロチン酸との反応を行う。

ペプチド樹脂を乾燥し、不純物除去剤としてアニソール（０．５ｍｌ）を添加した後、残存するｔ−ブチル部分を除去しながら、樹脂からのペプチドの切断と、Ｓｅｒ側鎖およびＬｙｓ側鎖の脱保護とを、ＨＦ１５ｍｌを用いて、約０℃で約１．５時間行う。真空下でＨＦを除去した後、エチルエーテル１００ｍｌで樹脂を２回洗浄する。切断されたペプチドは、０．２％ＴＦＡの２５％ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ溶液で毎回１００ｍｌずつ繰り返し抽出する。抽出液を集め、凍結乾燥して、粗ペプチド粉末約６００ｍｇを得る。

次いで、ペプチドを、当技術分野で知られており、Ｊ．Ｒｉｖｉｅｒ他、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、２８８巻、３０３〜３２８頁、１９８４年で具体的に述べられている、分取用逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により精製する。ＲＰ−ＨＰＬＣ分離による最初の分取ではＴＥＡＰ（リン酸トリエチルアンモニウム）を用い、最終の分離は、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙの文献にすべて詳述されているように、０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）勾配を用いて行う。

ペプチド（約３０ｍｇ）（以後ペプチド番号１と称する）は、キャピラリゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を用いて実質的に均質であると判断され、その純度は約９８％と推定される。精製されたペプチドのアミノ酸分析は、調製された構造式と一致する。液体二次イオン質量分析計（ＬＳＩＭＳ）によって測定した分子量は、１６３１．９Ｄａとして測定され、これはこのペプチドの期待される分子量１６３１．８Ｄａと一致する。

親水性は、緩衝液ＡをｐＨ７．０のＴＥＡＰとし、緩衝液ＢをＣＨ_３ＣＮ７０％および緩衝液Ａ３０％とし、３０分間にわたり緩衝液Ｂ４０％から緩衝液Ｂ７０％の濃度勾配としたＲＰ−ＨＰＬＣを用いて保持時間を測定することにより、検査した。ペプチド番号１は、アシリンより親水性であって、アシリンより速く溶出する。ｐＨ約５から約７の水性緩衝液での溶解度、およびｉｎｖｉｖｏでのゲル化抵抗性により、循環ＬＨレベルを抑制する長時間作用生物作用能（後述）を有しながら、概ね同等の生物学的効力を有する化合物に比べて、特に皮下注射による投与に適するものとなる。

ラットでのＬＨ分泌抑制効果を測定するために、ペプチドをｉｎｖｉｖｏでアッセイした。ペプチドで皮下処理したスプラーグ−ダウレー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットの精巣除去した雄における循覆ＬＨレベルの測定を、Ｃ．Ｒｉｖｉｅｒ他、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃ．、２９巻、３７４〜３７８頁、１９８３年に報告されているように行う。ペプチドをまず１．０ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌの濃度で静菌水に溶解し、次いでさらに０．１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液０．０４Ｍで希釈する。以後の希釈はリン酸緩衝液で行う。ペプチドを５匹のラットに皮下注射し、メトタン麻酔して血液試料（３００μｌ）を集める。血清（５０μｌ）のＬＨレベルを、ＮａｔｉｏｎａｌＰｉｔｕｉｔａｒｙａｎｄＨｏｒｍｏｎｅＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎＰｒｏｇｒａｍ（ＮＩＤＤＫ）から提供された試薬を用いて２回検査する。検査により、ラット当たりペプチド５０μｇの用量で、ＬＨレベルを注射後９６時間の間、コントロールレベルの５０％よりかなり低いレベルに抑制することが示される。さらに、９６時間後に測定されたレベルは、アシリンを５０マイクログラムの用量で同様に注射したラットで示されるＬＨレベルの約３０％にすぎない。ペプチド番号１は非常に長時間作用すると考えられる。ラットの実験により、該ペプチドは、注射箇所における著しいゲル化は検出できず、耐性が良好であることがあることが示された。

数多くのＧｎＲＨ拮抗物質の検査から得られた経験から、このような長時間ＬＨの抑制作用を表すペプチドは、成熟したスプラーグ−ダウレーラットのメスでｉｎｖｉｖｏで測定した場合、２．５マイクログラムの用量で完全に排卵を遮断することが示される。

（実施例１Ａ）
Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ−４Ａｍｆ（Ｆｍｏｃ）をＮ^αＢｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）の代わりに用いて、実施例１で述べた合成を繰り返す。Ｄ−４Ａｍｆ側鎖の脱保護の後、前述のようにしてｔ−ブチルイソシアネートとの反応を行う。実施例１に述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（カルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られ、実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析によって、質量１６４５．９Ｄａが示されるが、これは期待される質量１６４５．８Ｄａに良く相当する。ＨＰＬＣの結果から、このペプチドがアシリンよりも親水性であることを示すことができる。

このペプチドをラットの標準ｉｎｖｉｖｏＬＨ抑制試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、１、２、および３日目におけるＬＨレベルの抑制はアシリンと同等の効果を有することが示される。９６時間後、ＬＨレベルは、アシリンを注射したラットのＬＨレベルの約２５％に過ぎない。ペプチド番号１Ａは、非常に作用時間が長いと考えられる。

（実施例１Ｂ）
アナログ［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５］−アシリンを形成するために、脱保護される６位側鎖との反応に無水酢酸をｔ−ブチルイソシアネートの代わりに用いて、実施例１で述べた合成を繰り返す。実施例１に述べたように、樹脂からデカペプチドを切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析により、質量１６３０．６Ｄａが示され、これは計算値質量である１６３０．８Ｄａに相当する。

このペプチドを実施例１のようにラットの標準ｉｎｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、このペプチドは５０マイクログラムの用量で生物活性を有し、１日目から４日目までアシリンとほぼ同等の効果を有することが示される。非常に長時間ＬＨを抑制する作用を示すと考えられる。

（実施例１Ｃ）
Ｄ／Ｌヒドロオロチン酸をＬ−ヒドロオロチン酸の代わりに用いて実施例１Ｂで述べた合成を繰り返し、異性体デカペプチドを形成する。実施例１に述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｄ／Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。他の不純物が入っていない、２つの化合物の均質な混合物であると判断される。質量スペクトル分析により、質量１６３０．６Ｄａが示され、これは計算値質量である１６３０．８Ｄａと一致する。

このペプチドを実施例１のようにラットの標準ｉｎｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、このペプチドは５０マイクログラムの用量で生物活性を有し、１日目から４日目までアシリンとほぼ同等の効果を有することが示される。長時間ＬＨを抑制する作用を示すと考えられる。

（実施例１Ｄ）
Ｄ−ヒドロオロチン酸をＬ−ヒドロオロチン酸の代わりに用いて実施例１Ｂで述べた合成を繰り返し、異性体デカペプチドを形成する。実施例１で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｄ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は９８パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析により、質量１６３０．８Ｄａが示され、これは計算値質量である１６３０．８Ｄａと一致する。

このペプチドを実施例１のようにラットの標準ｉｎｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、このペプチドは５０マイクログラムの用量で長時間ＬＨを抑制する生物活性を有し、１日目から４日目までアシリンとほぼ同等の効果であることが示される。

（実施例１Ｅ）
Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ−４ＦｐｈｅをＮ^αＢｏｃ−Ｄ−４ＣｌＰｈｅの代わりに用いて実施例１Ｂで述べた合成を繰り返し、デカペプチド［Ｄ−４ＦＰｈｅ^２、４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５］−アシリンを形成する。実施例１で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｆｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析によって、質量１６１５．１Ｄａが示され、これは計算値質量である１６１４．８Ｄａと一致する。

このペプチドを実施例１のようにラットの標準ｉｎｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、このペプチドは５０マイクログラムの用量で生物活性を有し、１日目から４日目までアシリンとほぼ同等の効果であることが示される。長時間ＬＨを抑制する作用を示すと考えられる。

（実施例１Ｆ）
Ｎ^αＢｏｃ−４Ａｍｆ（Ｆｍｏｃ）をＮ^αＢｏｃ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）の代わりに用いて実施例１Ｂで述べた合成を繰り返し、デカペプチド［４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）^５］−アシリンを形成する。実施例１で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｍｆ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製で得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は９８パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析により、質量１６４４．７Ｄａで、これは計算値質量１６４４．８Ｄａと一致する。

このペプチドを実施例１のようにラットの標準ｉｎｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で生物活性を有し、１日目から４日目までアシリンとほぼ同等の効果であることが示される。長時間ＬＨを抑制する作用を示すと考えられる。

（実施例１Ｇ）
実施例１で述べた合成を繰り返すが、Ｄ−４Ａｐｈの側鎖アミノをｔ−ブチルイソシアネートと反応させる代わりに、それと４Ａｐｈ残基を同時にヒドロオロチン酸と反応させて、デカペプチド［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^６］−アンチドを形成する。実施例１で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２がＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセント以上であることが推定される。質量スペクトル分析により、質量１７２８．４Ｄａが示され、これは計算値質量１７２８．８Ｄａと一致する。ＲＰ−ＨＰＬＣの結果により、このペプチドは、アシリンより親水性であるアザリンＢよりも、さらに親水性であることが示される。

このペプチドを実施例１で述べたようにして、ラットの標準ｉｎｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、このペプチドは５０マイクログラムで生物活性を有しており、１日目から４日目までアシリンとほぼ同等の効果があることが示される。長時間ＬＨを抑制する作用を示すことが考えられる。

Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ−４Ａｍｆ（Ｆｍｏｃ）をＮ^αＢｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）の代わりに用いてこの合成を繰り返し、デカペプチド［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−Ａｍｆ（Ｈｏｒ）^６］−アンチドを生成し、これは一般にＬＨ分泌を抑制する生物作用能を有する。

（実施例１Ｈ）
実施例１で述べた合成を繰り返すが、Ｄ−４Ａｐｈの側鎖アミノ基をｔ−ブチルイソシアネートと反応させる代わりに、Ｄ−ヒドロオロチン酸と反応させて、デカペプチド［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｄ−Ｈｏｒ）^６］−アンチドを形成する。実施例１で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｄ−ヒドロオロチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は９８パーセント以上であることが推定される。質量スペクトル分析により、質量１７２８．７Ｄａが示され、計算値質量である１７２８．８Ｄａと一致する。ＲＰ−ＨＰＬＣの結果によって、このペプチドが、アシリンよりも親水性のアザリンＢよりも、さらに親水性であることが示される。

このペプチドを実施例１に述べたようにラットの標準ｉｎｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、このペプチドは５０マイクログラムの用量で生物活性を有しており、１日目から３日目までアシリンとほぼ同等の効果があることが示される。４日目ではアシリンよりもかなり効果があり、ＬＨを抑制する作用が非常に長時間にわたると考えられる。

（実施例１Ｊ）
デカペプチド［ＭｅＣｂｍ−Ｄ−２Ｎａｌ^１、４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５］−アシリンの合成は、実施例１Ｂで述べた通常の方法によって行うが、Ｎ^αＢｏｃ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）を付加後に直ちにＦｍｏｃ−保護基を除去せずに、樹脂上でのデカペプチドの合成を完了させる。次いで、Ｎ末端を脱保護した後、無水酢酸と反応させる代わりに、メチルイソシアネートと反応させて、Ｎ末端にメチルカルバモイルを形成する。次いで、Ｆｍｏｃを除去し、実施例１Ｂのようにして４Ａｐｈの側鎖アミノ基をＬ−ヒドロオロチン酸と反応させる。実施例１で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドメチルカルバモイル−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析によって、質量１６４５．７Ｄａであり、これは計算値質量である１６４５．８Ｄａと一致する。ＲＰ−ＨＰＬＣの結果によって、このペプチドは、アシリンよりも親水性であるアザリンＢよりも、さらに親水性であることが示される。

このペプチドをラットの標準ｉｎｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、生物活性を有しており、１日目から３日目までアシリンとほぼ同等の効果を有し、９６時間後にはより大きな効果（５０％に近い効果）を有することが示される。非常に長時間ＬＨを抑制する作用を示すと考えられる。

（実施例１Ｋ）
Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ−３ＰａｌをＮ^αＢｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）の代わりに用いて実施例１に述べた合成を繰り返し、次いでのｔ−ＢｕＮＣＯとの反応を除いて、デカペプチド［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−３Ｐａｌ^６］−アンチドを形成する。実施例１で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドアセチル−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセント以上であることが推定される。質量スペクトル分析により、質量１５７４．７Ｄａが示され、これは計算値質量である１５７４．７Ｄａと一致する。

このペプチドを実施例１のようにラットの標準ｉｎｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、生物活性を有しており、３日間アシリンとほぼ同等の効果を有することが示されたが、９６時間後ではＬＨレベルの抑制はアシリンの場合の約３５％である。非常に長時間ＬＨを抑制する作用を示すと考えられる。

（実施例１Ｌ）
ｔ−ブチルイソシアネートをヒドロオロチン酸の代わりに用いて実施例１Ｇで述べた合成を繰り返し、デカペプチド［４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）^６］−アンチドを形成する。実施例１で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（カルバモイル）−Ｄ−４Ａｐｈ（カルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析により、質量１５３４．９Ｄａが示され、これは計算値質量である１５３４．７Ｄａと一致する。

このペプチドを実施例１のようにラットの標準ｉｎｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、このペプチドが生物活性を有し、４日間アシリンとほぼ同等の効果を有することが示される。長時間ＬＨを抑制する作用があると考えられる。

（実施例１Ｍ）
メチルイソシアネートをヒドロオロチン酸の代わりに用いて実施例１Ｇで述べた合成を繰り返し、デカペプチド［４Ａｐｈ（ＭｅＣｂｍ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（ＭｅＣｂｍ）^６］−アンチドを形成する。実施例１で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（メチルカルバモイル）−Ｄ−４Ａｐｈ（メチルカルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセント以上であることが推定される。質量スペクトル分析によって、質量１５６２．８Ｄａが示され、これは計算値質量である１５６２．８Ｄａと一致する。

このペプチドを実施例１のようにラットの標準ｉｎｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、このペプチドが生物活性を有し、２日間アシリンとほぼ同等の効果を有し、次いでＬＨ抑制がやや減少し始めることが示される。

（実施例２）
ペプチド［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−Ｃｉｔ^６］−アンチドは、式Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２を有するペプチドであるセトロレリックスのアナログで、実施例１に概要を述べた合成法で合成する。Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈの代わりに、Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ−Ｃｉｔを６位にカップリングさせる。あるいは、Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｆｍｏｃ）を６位にカップリングさせて、次式のペプチド中間体：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｆｍｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉｐｒ、Ｚ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ−［ＭＢＨＡ樹脂保持体］が得られた後、一時的に鎖延長を中断する。次いで、Ｏｒｎ残基のアミノ側鎖を、実施例１のようにＦｍｏｃを除去することにより脱保護し、中間体を過剰のｔ−ブチルイソシアネートのＤＭＦ溶液で約６時間室温で処理して、Ｏｒｎ残基の側鎖と反応させる。次いで、実施例１のようにデカペプチド中間体の合成を完了する。

次いで、実施例１で述べたようにして、このペプチド樹脂を洗浄し、樹脂から切断し、脱保護し、次いで精製する。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセント以上であることが推定される。ＬＳＩＭＳ分析により、質量が１５８３．７Ｄａが示され、これはこのペプチドの計算値質量である１５８３．８Ｄａと一致する。

このペプチドはセトロレリックスよりも親水性で、実施例１で述べたようにしてＬＨ分泌の抑制をｉｎｖｉｖｏで検査すると、セトロレリックスと同等の時間、生物活性が示される。３日目でセトロレリックスよりはわずかに良好な抑制があり、９６時間後にはかなり良好な抑制が見られる。

（実施例２Ａ）
米国特許第５，１６９，９５３号の実施例１で述べられた合成法を用いて、ペプチドであるアンチドのアナログ、すなわち［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５］アンチドを合成する。６位にＮ^αＢｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）をカップリングさせた後、過剰のニコチン酸のＤＭＦ溶液を脱保護後に反応させる。次いで、５位にＮ^αＢｏｃ−Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）をカップリングさせ、次いで実施例１のようにＡｐｈ残基のアミノ側鎖を脱保護する。中間体をＬ−ヒドロオロチン酸のＤＭＦ溶液と反応させて、実施例１のようにデカペプチド中間体の合成を完了させる。

標準洗浄の後、実施例１で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。セトロレリックスよりも親水性であって、セロトリックスと同等の時間、ＬＨ分泌を抑制する生物活性を表すと考えられる。

（実施例３）
Ｄ／Ｌ−ＩｍｚをＬ−Ｈｏｒの代わりに用いたことを除き、実施例１Ｂで概要を述べた方法に従って、アナログ［４Ａｐｈ（Ｄ／Ｌ−Ｉｍｚ）^５］−アシリンを合成する。したがって、５位にある４Ａｐｈの脱保護の後で、中間体を過剰のＤ／Ｌ−２−イミダゾリドン−４−カルボン酸、ＨＯＢｔ約９０ｍｇ、およびＤＩＣ約０．６６ｍｍｏｌのＤＭＦ溶液で、室温で約６時間処理する。次いで、実施例１のようにデカペプチド中間体の合成を完了させる。

実施例１で述べたように、ペプチド樹脂を洗浄し、切断して脱保護し、精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｄ／Ｌ−２−イミダゾリドン−４−カルボニル）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ａｃ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。他の不純物のない、２つの化合物の均質な混合物であると判断される。ＬＳＩＭＳ分析により、測定質量１６０２．７Ｄａが示され、このペプチドの計算値質量である１６０２．８Ｄａと一致する。

実施例１のようにラットの標準ｉｎｖｉｖｏ試験を用いてこのペプチドをアッセイすることによって、５０マイクログラムの用量で、長時間ＬＨ分泌を抑制することが示される。３日目および９６時間後ではアシリンよりわずかに良好な抑制が見られる。

（実施例３Ａ）
Ｄ／Ｌ−Ｉｍｚの代わりに過剰のＬ−２−イミダゾリドン−４−カルボン酸を用いて、実施例３の合成を繰り返す。結果として得られたペプチドは実質的に均質であると判断され、その純度は約９９パーセントであることが推定される。ＬＳＩＭＳ分析により測定質量１６０２．５Ｄａが示され、このペプチドの計算値質量である１６０２．８Ｄａと一致する。このペプチドはアシリンよりも水によく溶ける。

実施例１のようにアッセイを行うことにより、このペプチドは５０マイクログラムの用量で、長時間ＬＨ分泌を抑制し、９６時間にわたってアシリンとほぼ同等の効果を示す。

（実施例３Ｂ）
Ｄ／Ｌ−Ｉｍｚの代わりに過剰のＤ−２−イミダゾリドン−４−カルボン酸を用いて、実施例３の合成を繰り返す。結果としてペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｄ−Ｉｍｚ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ａｃ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が得られる。ＬＳＩＭＳ分析により測定質量１６０２．６Ｄａが示され、これはこのペプチドの計算値質量である１６０２．８Ｄａと一致する。このペプチドはアシリンよりも水に溶けやすい。

実施例１のようにアッセイを行う。このペプチドは５０マイクログラムの用量で生物活性を有し、ＬＨ分泌の抑制を示す。

（実施例３Ｃ）
実施例１Ａ（Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）^６を導入するため）および実施例３Ａ（４Ａｐｈ（Ｉｍｚ）^５を導入するため）で述べられた方法を組み合わせて用いることにより、ペプチド［４Ａｐｈ（Ｉｍｚ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）^６］−アシリンを合成する。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−Ｉｍｚ）−Ｄ−４Ａｍｆ（カルバモイル）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は９８パーセント以上であることが推定される。ＬＳＩＭＳ分析により測定質量１６１７．６Ｄａが示され、このペプチドの計算値質量である１６１７．８Ｄａと一致する。実施例１のようにアッセイをすることにより、このペプチドは５０マイクログラムで長時間のＬＨ分泌抑制を示す。３日間にわたってアシリンと実質的に同等の抑制を示し、９６時間後ではやや優れた抑制を示す。

（実施例４）
ペプチド［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（ＭｅＣｂｍ）^６］−アンチドは、式Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（ＭｅＣｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２を有し、実施例１Ａで概要を述べた合成を用いて合成される。６位のＤ−４ＡｍｆにＤＭＦ中で過剰のｔ−ブチルイソシアネートを反応させる代わりに、メチルイソシアネートを反応させる。次いで、実施例１Ａのようにして、デカペプチド中間体の合成を完了する。

実施例１で述べたように、ペプチド樹脂を洗浄、切断して脱保護し、精製する。ペプチドＡｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（ＭｅＣｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセント以上であることが推定される。ＬＳＩＭＳ分析により測定質量１６５９．８Ｄａが示され、このペプチドの計算値質量１６５９．８と一致する。

このペプチドをラットの標準ｉｎｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、ペプチドＮｏ．４は、５０マイクログラムでアシリンよりも良好なＬＨ分泌抑制を示し、非常に長時間作用する生物活性を示すと考えられる。

（実施例４Ａ）
無水酢酸をメチルイソシアネートの代わりに用いて実施例４の合成を繰り返し、ペプチド［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（Ａｃ）^６］−アンチドを形成する。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（Ａｃ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセント以上であることが推定される。ＬＳＩＭＳ分析により測定質量１６４４．５Ｄａが示され、これはこのペプチドの計算値質量である１６４４．８Ｄａと一致する。

このペプチドを実施例１のように５０マイクログラムの用量でアッセイすることにより、長時間作用する生物活性が示される。ＬＨ分泌抑制は、３日間アシリンと同等で、９６時間後ではアシリンよりわずかに優れていることが示される。

（実施例４Ｂ）
実施例１Ａで合成しアッセイしたデカペプチドに変更を加えて、Ｃ末端をＤ−アラニルアミドの代わりにＤ−アラニノールとする。実施例１Ａで概要を述べた合成を用いるが、Ｂａｃｈｅｍ．Ｉｎｃ社から購入可能なメリフィールド樹脂（クロロメチル化された架橋ポリスチレン）を用いて、まず、Ｃ末端に遊離酸としてプロリンを有するノナペプチド断片を合成する。切断、脱保護および精製の後、以下のノナペプチド：Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−ＯＨが得られる。完全に脱保護されてＨＰＬＣで精製されたノナペプチド０．１５ｍｍｏｌを、Ｄ−アラニノール（ＬａｎｃａｓｔｅｒＣｈｅｍｉｃａｌ）３．０ｍｍｏｌとともに、乾燥ＤＭＦ３ｍｌに溶解する。次いで、ＰｙＢＯＰ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社）０．６０ｍｍｏｌを固体で、カップリング試薬として添加し、反応混合液を室温で３０分間攪拌した。水２００ｍｌを加えて反応を冷却するとエマルジョンが得られ、このエマルジョンは、氷酢酸を用いてｐＨを２．５に調製することにより透明な溶液に変わった。得られたデカペプチド、Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｃｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ｏｌを、ＴＥＡＰ（ｐＨ２．３）を緩衝液として用いた分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、続いて０．１％ＴＦＡを緩衝液として用いてさらに精製した。得られたペプチドは実質的に均質であると判断され、その純度は９９％以上であると推定される。質量スペクトル分析によって、質量１６３２．９Ｄａが示され、これは計算値質量である１６３２．８Ｄａと一致する。

このペプチドを実施例１のようにラットの標準ｉｎｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、このペプチドは生物活性を示し、この生物活性は少なくとも９６時間持続することが示される。このペプチドは非常に作用時間が長いと考えられる。

（実施例４Ｃ）
Ｄ−アラニノールの代わりにＬ−アラニノール（ＡｌｄｒｉｄｇｅＣｈｅｍｉｃａｌ社）３．０ｍｍｏｌを反応混合物中に用いて、実施例４Ｂの合成を繰り返す。得られたデカペプチドは、実施例４Ｂのように精製され、実質的に均質であると判断され、約９８％より大きな純度を有すると推定される。質量スペクトル分析によって、質量１６３２．９Ｄａが示され、これは計算値質量である１６３２．８Ｄａと一致する。

このペプチドを実施例１のようにラットの標準ｉｎｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、このペプチドは生物活性を有し、この生物活性は少なくとも９６時間持続することが示される。このペプチドは非常に作用時間が長いと考えられる。

（実施例４Ｄ）
実施例１で合成し検査したデカペプチドに変更を加えて、Ｃ末端をＤ−アラニルアミドの代わりにＤ−アラニノールとする。メリフィールド樹脂上でＳＰＰＳを用いるが、その他は実施例１に関して概要を述べた通りにして、Ｃ末端に遊離酸としてプロリンを有するナペプチド断片を合成する。切断、脱保護、および精製の後、以下のノナペプチド：Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−ＯＨが得られる。次いで、実施例４Ｂで述べたようにして、精製されたノナペプチドをＤ−アラニトールとを反応させ、得られたデカペプチド、Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ｏｌを、ＴＥＡＰをｐＨ２．３の代わりにｐＨ６．５で用いること以外は実施例４Ｂで述べたようにして、分取ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製する。得られたペプチドは、実質的に均質であると判断され、約９９％以上の純度を有する。質量スペクトル分析によって、質量１６１８．９Ｄａが示され、これは計算値質量１６１８．８Ｄａと一致する。このペプチドをｉｎｖｉｖｏでアッセイすることにより、生物活性を有することが示される。

（実施例４Ｅ）
Ｌ−アラニノールをＤ−アラニノールの代わりに用いて、実施例４Ｄで述べた合成を繰り返す。得られたデカペプチド：Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ｏｌを、実施例４Ｄで述べたようにして、分取ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製した。得られたペプチドは、実質的に均質であると判断され、約９９％以上の純度を有する。質量スペクトル分析によって、質量１６１８．９Ｄａが示され、これは計算値質量１６１８．８Ｄａと一致する。このペプチドをｉｎｖｉｖｏでアッセイすることにより、生物活性を有することが示される。

（実施例５）
実施例１Ａで概要を述べた合成を用いて、式Ａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｄ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２を有するペプチド［４Ａｐｈ（Ｄ−Ｈｏｒ）^５，Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）^６］−アンチドを合成する。５位の４ＡｐｈをＬ−ヒドロオロチン酸と反応させる代わりに、この側鎖をＤ−ヒドロオロチン酸と反応させる。次いで、実施例１Ａのようにして、このデカペプチド中間体の合成を完了する。

次いで、実施例１で述べたようにして、ペプチド樹脂を、標準洗浄し、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｄ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は９８パーセントより高いと推定される。ＬＳＩＭＳ分析により測定された質量、１６４５．８Ｄａが示され、これはこのペプチドの計算値質量である１６４５．８Ｄａと一致する。

このペプチドをラットの標準のｉｎｖｉｖｏ試験でアッセイすることにより、５０マイクログラムの用量で、このペプチドは、アシリンとほぼ同等の２日間にわたってＬＨ分泌を抑制する生物活性を示し、７２時間後および９６時間後において抑制の効果はアシリンよりいくらか少ない程度で持続している。

（実施例５Ａ）
４Ａｍｆの脱保護され側鎖をｔ−ブチルイソシアネートと反応させる代わりにこれを無水酢酸と反応させることを除いて、実施例５の合成を繰り返す。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｐｈ（Ｄ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（Ａｃ）−Ｌｅｕ−ＩＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセントより高いと推定される。ＬＳＩＭＳ分析により、実測質量１６４４．７Ｄａが示され、これはこのペプチドの計算値質量である１６４４．８Ｄａと一致する。

このペプチドを実施例１のようにアッセイして、５０マイクログラムの用量で、このペプチドは、３日間にわたって実質的にアシリンと同等のＬＨ分泌抑制があり、９６時間後には、アシリンよりやや優れたＬＨ抑制があることが示される。

（実施例６）
Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｍｏｃ）の代わりにＮ^αＢｏｃ−Ｄ−４Ａｍｆ（Ｆｍｏｃ）を６位の残基に用いることを除いて、実施例１Ｆに概要を述べた合成を繰り返し、デカペプチド［４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（Ａｃ）^６］−アンチドを形成する。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｍｆ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセント以上であることが推定される。質量スペクトル分析により、質量１６５８．７Ｄａが示され、これは計算値質量である１６５８．８Ｄａと一致する。

ペプチドを実施例１のようにアッセイし、５０マイクログラムの用量で、このペプチドはＬＨ分泌を抑制する作用時間が長いことが分かる。その作用は最初の２日間はアシリンとほぼ同等であり、３日目から４日目にかけてはアシリンとほとんど等しい生物作用能を示す。

（実施例６Ａ）
実施例１のようにＤ−４Ａｍｆの脱保護した側鎖を無水酢酸と反応させる代わりにこれをｔ−ブチルイソシアネートと反応させることを除いて、実施例６の合成を繰り返し、ペプチド［４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）^６］−アンチドを形成する。デカペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｍｆ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（カルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は約９９パーセントであると推定される。質量スペクトル分析によって、質量１６５９．６Ｄａが示され、これは計算値質量である１６５９．８Ｄａと一致する。

ペプチドを実施例１のようにアッセイし、５０マイクログラムの用量で、このペプチドは、１日後ではアシリンと同等の、２日後ではアシリンとほとんど同等のＬＨ分泌抑制活性を有する。３日後にやや活性が弱まるが、４日後でもアシリンとほぼ同等の活性が示される。

（実施例６Ｂ）
ｔ−ブチルイソシアネートの代わりにメチルイソシアネートと反応させることを除いて、実施例６Ａの合成を繰り返し、ペプチド［４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（ＭｅＣｂｍ）^６］−アンチドを生成する。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｍｆ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｐｈ（メチルカルバモイル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は約９９パーセントであると推定される。質量スペクトル分析によって、質量１６７３．６Ｄａが示され、これは計算値質量である１６７３．８Ｄａと一致する。ペプチドを実施例１のようにアッセイし、５０マイクログラムの用量で、このペプチドは、１日後ではアシリンと同等の、２日後ではアシリンとほぼ同等のＬＨ分泌抑制活性を有する。３日目および４日目では、ＬＨ分泌抑制の効果はアシリンより著しく少ない程度で持続している。

（実施例６Ｃ）
Ｄ−ヒドロオロチン酸をＬ−ヒドロオロチン酸の代わりに用いて実施例６の合成を繰り返し、ペプチド［４Ａｍｆ（Ｄ−Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（Ａｃ）^６］−アンチドを形成する。ペプチドＡｃ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−２Ｎａｌ−Ｄ−４Ｃｐａ−Ｄ−３Ｐａｌ−Ｓｅｒ−４Ａｍｆ（Ｌ−ヒドロオロチル）−Ｄ−４Ａｍｆ（アセチル）−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ_２が、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は９９パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析によって、質量１６５８．７Ｄａが示され、これは計算値質量である１６５８．８Ｄａと一致する。

ペプチドを実施例１のようにアッセイし、５０マイクログラムの用量で、このペプチドは、１日目および２日目ではアシリンと実質的に同じ効果である。３日目では、アシリンより実質的に少ない効果が示され、その後著しく生物作用能が下がり続ける。

（実施例７）
実施例１から５で概要を述べた手順を用いて、以下のＧｎＲＨ拮抗物質ペプチドも調製する：
［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）^６、Ｐｒｏ^９ＮＨＣＨ_２ＣＨ_３］−アンチド
［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）^６、Ｐｒｏ^９ＮＨＣＨ_２ＣＨ_３］−アンチド
［Ａｃｒ−Ｄ−２Ｎａｌ^１、４ＦＤ−Ｐｈｅ^２、４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５］−アシリン
［Ｂｚ−Ｄ−２Ｎａｌ^１、４ＮＯ_２Ｄ−Ｐｈｅ^２、４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^６］−アンチド
［Ｆｏｒ−Ｄ−２Ｎａｌ^１、４ＯＣＨ_３Ｄ−Ｐｈｅ^２、４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｄ−Ｈｏｒ）^６］−アンチド
［Ａｃｒ−Ｄ−２Ｎａｌ^１、４ＢｒＤ−Ｐｈｅ^２、４Ａｐｈ（Ｉｍｚ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｉｍｚ）^６］−アンチド
［Ｐｎ−Ｄ−２Ｎａｌ^１、４ＣＨ_３Ｄ−Ｐｈｅ^２、３Ａｐｈ（Ｄ−Ｉｍｚ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｄ−Ｈｏｒ）^６］−アンチド
［Ｂｙ−Ｄ−２Ｎａｌ^１、３、４Ｃｌ_２Ｄ−Ｐｈｅ^２、４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^６］−アンチド
［Ｖｌ−Ｄ−２Ｎａｌ^１、４ＮＯ_２Ｄ−Ｐｈｅ^２、４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−３Ａｐｈ（Ｃｂｍ）^６］−アンチド
［Ｖａｃ−Ｄ−２Ｎａｌ^１、Ｃ^αＭｅ４ＣｌＤ−Ｐｈｅ^２、４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｇｌｙ^１０］−アシリン
［Ｐｎ−Ｄ−２Ｎａｌ^１、３Ａｐｈ（Ｉｍｚ）^５、Ｄ−３Ａｍｆ（Ｄ−Ｈｏｒ）^６−Ａｇｌ^１０］−アンチド
［Ａｃｒ−Ｄ−２Ｎａｌ^１、４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ａｒｇ（Ｅｔ_２）^８、Ｄ−Ａｇｌ（Ｍｅ）^１０］−アシリン
［ＭｅＣｂｍ−Ｄ−２Ｎａｌ^１、４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ａｒｇ^８、Ａｇｌ（Ｍｅ）^１０］−アシリン
［Ｃｂｍ−Ｄ−２Ｎａｌ^１，３Ａｍｆ（Ｉｍｚ）^５，Ａｌａ^１０］−アシリン
［ＥｔＣｂｍ−Ｄ−２Ｎａｌ^１、４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）^５、Ｐｒｏ^９ＮＨＣＨ_２ＣＨ_３］−アシリン
［Ａｃｒ−Ｄ−２Ｎａｌ^１、４Ａｐｈ（Ｉｍｚ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）^６、Ａｒｇ^８］−アンチド
［Ｃｂｍ−Ｄ−２Ｎａｌ^１、４Ａｐｈ（ＭｅＣｂｍ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（ＭｅＣｂｍ）^６、Ａｒｇ（Ｅｔ_２）^８］−アンチド
［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５，Ｄ−４Ａｈｐ（Ｉｍｚ）^６，Ｄ−Ａｌｇ^１０］−アンチド
［Ａｃ−Ｄ−１Ｎａｌ^１、４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｄ−Ｈｏｒ）^６、Ａｒｇ^８］−アンチド
［ＰｒＣｂｍ−Ｄ−２Ｎａｌ^１、４Ａｍｆ（Ｉｍｚ）^５、Ｄ−４Ａｈｐ（ＥｔＣｂｍ）^６、Ｐｒｏ^９ＮＨＣＨ_２ＣＨ_３］−アンチド
［４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）^６、ＡｚａＧｌｙ^１０］−アンチド
［４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−Ｃｉｔ^６、Ｈａｒ（Ｅｔ_２）^８］−アンチド
［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）^６、Ｄ−Ａｇｌ^１０］−アンチド
［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−Ｈｃｉ^６、Ａｇｌ（Ｍｅ）^１０］−アンチド
［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−３Ｐａｌ^６、Ｈａｒ^８、Ａｇｌ^１０］−アンチド
［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｆｏｒ）^６、Ｄ−Ａｇｌ（Ｍｅ）^１０］−アンチド
［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（ａｔｚ）^６、Ｈａｒ（Ｅｔ_２）^８］−アンチド
［４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（ｉｐｒＣｂｍ）^６、Ｄ−Ａｇｌ^１０］−アンチド
［Ｆｏｒ−Ｄ−１Ｎａｌ^１、４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（ａｔｚ）^６、Ｇｌｙ^１０］−アンチド
［４Ａｐｈ（Ｄ−Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）^６、Ａｌａ^１０−ｏｌ］−アンチド
これらのペプチドはＬＨの分泌を阻害する生物作用能を有する。

（実施例８）
実施例１から５、および米国特許第５、４９１，２１７号に概要を述べた手順を用いて、以下のＧｎＲＨ拮抗物質ペプチドも調製する：
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）^６］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）^６］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５］−アシリン
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｄ−Ｈｏｒ）^５］−アシリン
［Ｄ−４ＦＰｈｅ^２、Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５］−アシリン
［Ｎ^αＭｅ４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）^５］−アシリン
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^６］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｄ−Ｈｏｒ）^６］−アンチド
［ＭｅＣｂｍ−Ｄ−２Ｎａｌ^１、Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５］−アシリン
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−３Ｐａｌ^６］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）^６］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（ＭｅＣｂｍ）^５、Ｄ−４Ａｐｈ（ＭｅＣｂｍ）^６］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）^６、Ａｌａ^１０−ｏｌ］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）^６、Ｄ−Ａｌａ^１０−ｏｌ］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）、Ｄ−４Ａｐｈ（Ｃｂｍ）^６、Ａｌａ^１０−ｏｌ］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−Ｃｉｔ^６］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−Ｌｙｓ（Ｎｉｃ）^６］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｄ／Ｌ−Ｉｍｚ）^５］−アシリン
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｌ−Ｉｍｚ）^５］−アシリン
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｄ−Ｉｍｚ）^５］−アシリン
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｌ−Ｉｍｚ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）^６］−アシリン
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（ＭｅＣｂｍ）^６］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（Ａｃ）^６］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｈｏｒ）、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）^６、Ｄ−Ａｌａ^１０−ｏｌ］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｄ−Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）^６］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｐｈ（Ｄ−Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（Ａｃ）^６］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（Ａｃ）^６］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（Ｃｂｍ）^６］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｍｆ（Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（ＭｅＣｂｍ）^６］−アンチド
［Ｎ^αＭｅ４Ａｍｆ（Ｄ−Ｈｏｒ）^５、Ｄ−４Ａｍｆ（Ａｃ）^６］−アンチド
これらのペプチドは、ＬＨ分泌を抑制する生物作用能を有し、かつ生理的ｐＨの水に極めて良好な溶解性を有する。

アッセイした前述の化合物は、対応するアンチドとして知られるＧｎＲＨ拮抗物質ペプチドに少なくとも概ね匹敵する程度のＬＨ抑制生物作用能を示すことが示され、これらはアンチドのアナログであると考えられる。この地域での１０年にわたる熱心な検査の結果として、広く受け入れられているＬＨ抑制測定検査で測定した生物作用能は、ゴナドトロピン分泌を抑制する、したがって有用な抗生殖効果、抗排卵効果を示す、このような化合物の能力についての証拠として受け入れられてきた。優れた溶解性、ｉｎｖｉｖｏでのゲル化に対する抵抗性、長時間持続する生物活性、およびその他の特性に基づき、これらの化合物は、ゴナドトロピン分泌を抑制し、生殖腺によるステロイドの放出を阻害する抗生殖剤として（例えば抗排卵剤として）、一般的に有用であると考えられる。本発明の化合物は、薬剤学的に許容可能な、酸付加塩などの無毒性の塩の形態、または金属錯体の形態でしばしば投与される。好ましくは酢酸塩と、パモ酸（ｐａｍｏｉｃａｃｉｄ）の塩であるパモエートとが好ましい。薬効成分を錠剤の形態で投与した場合、その錠剤は、トラガカント、コーンスターチ、もしくはゼラチンなどの結合剤、アルギン酸などの崩壊剤、またはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤を含む、薬剤学的に許容可能な無毒性の希釈剤を含んでいてもよい。等張生理的食塩水またはリン酸緩衝液などに入れて静脈投与すると効果があるだろう。

医薬品組成物には、通常、慣用的な薬剤学的に許容可能な担体または希釈剤とともに、有効量のペプチドを含むこととする。通常、用量は、静脈投与する場合、被験体の体重１ｋｇあたり約１０マイクログラムから約２．５ミリグラムのペプチドとする。これらの化合物の性質より、経口投与も効果的なものとすることができる。しかしながら、経口での用量は多くなるであろう。総合すると、一般にこれらのペプチドによる被験者の治療は、化合物が溶解しやすい適当な担体を用い、患者のＬＨレベルおよびＦＳＨレベルを抑制するのに充分な用量を投与するといった、他のＧｎＲＨ拮抗物質を用いた臨床的治療と同様の方法で行う。

長時間にわたって（例えば１回の投与から、１週間から１年間にかけて）、ＧｎＲＨアナログが運ばれることが望ましく、除放投与形態、貯留（ｄｅｐｏｔ）投与形態、または移植投与形態を利用することができる。

これらの化合物は、哺乳動物に静脈内に、皮下的に、筋肉内に、経口的に、経皮的に、鼻腔内に、肺内に、直腸内に、または腟内に投与することにより、受胎能の抑制および／または制御をすることができ、性早熟症の管理などの生殖腺活性の可逆的抑制が必用となる用途において投与したり、または放射線治療あるいは化学治療の際に投与したりできる。それらは、ステロイド依存性腫瘍の治療にも有用である。効果的な用量は、投与形態および治療される哺乳動物の特定の種類により変化する。これらの化合物は、５０ｍｇ／ｍｌの溶解性を有するものがあり、一般的にはｐＨ５．４の溶液５〜１０ｍｇ／ｍｌとしてこれを用いることができる。ある典型的な投与形態の例は、該ペプチドを含有するｐＨ約６の静菌水溶液であり、その溶液は、１日当たり約０．１／ｋｇ体重から２．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量を与えるように非経口的に投与される。これらの化合物はｉｎｖｉｖｏで非常に耐性であって、ゲル化に抵抗性があると考えられる。したがって、注射点におけるゲル化の危険を伴わずに、ｐＨ約４．９、適当な濃度（約０．７５ｍｇ／ｍｌ以上、さらには約１．０ｍｇ／ｍｌ以上）の約５％マンニトール静菌水溶液に入れて、皮下注射投与することに特に良く適していると考えられる。

これらのＧｎＲＨ拮抗物質ペプチドは、ｉｎｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｔｒｏでの両方の診断にも有用である。これらのペプチドをｉｎｖｉｖｏで注射し、続いてホルモン分泌、例えばＬＨ分泌の減少の程度を測定するために患者の血流をアッセイすることができる。ｉｎｖｉｔｒｏアッセイを行って、ある種の腫瘍細胞がＧｎＲＨに対して感受性であるか否かを測定することができる。このようなアッセイでは、腫瘍細胞培養物をＧｎＲＨ拮抗物質ペプチドで処理し、次いでホルモン分泌や細胞増殖をモニタする。

本発明は、その好ましい実施形態に関して述べてきたが、本明細書付属の請求の範囲で述べられている本発明の範囲から逸脱することなく、当技術分野における通常の技術を有する者に明らかな改変や変更をしてもよいものであることを理解しておくべきである。Ｎ末端は非置換のままてもよいし、あるいは他の等価なアシル化基を用いることもできるが、アセチル、置換カルバモイル、または非置換カルバモイルのいずれかが好ましい。５位および６位に、ＡｐｈまたはＤ−Ａｐｈの代わりにＡｈｐまたはＤ−Ａｈｐをそれぞれ、用いることができる。Ａｐｈ（Ａｃ）の代わりに、アミノＰｈｅ基を、米国特許第５，５０６，２０７号で開示されているように、ギ酸、β−Ａｌａ（ａｔｚ）、およびガンマ−アミノ酪酸（ａｔｚ）などの他のアシル化剤で処理し、これにより同様に、長時間の作用を示すＧｎＲＨ拮抗物質を得ることができる。したがって、得られる残基は、Ｄ−４Ａｐｈ（Ａｃ）およびＬ−４Ａｐｈ（Ａｃ）の等価体であると考えられる。Ｌｙｓ（Ｂｕ）およびＬｙｓ（Ｅｔ_２）双方は、ＩＬｙｓの等価体であると考えられる。しかしながら、ＩＬｙｓが最も好ましい。その他の疎水性アミノ酸残基も、好ましくはＤ−異性体形で、１位および６位に用いることができる（前述の通り）が、これらは明細書中で述べられたものと等価体であると考えられる。

Claims

下記式で表されるヒトゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）拮抗ペプチドまたは薬剤的に許容可能なその塩。