ES2260833T3

ES2260833T3 - Antagonistas de gnrh modificados en las posiciones 5 y 6.

Info

Publication number: ES2260833T3
Application number: ES98915539T
Authority: ES
Inventors: Guangcheng Jiang; Graeme Semple; Jean E.F. Dr. Rivier
Original assignee: Ferring BV
Current assignee: Ferring BV
Priority date: 1997-04-11
Filing date: 1998-04-13
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2018-04-13
Also published as: CN1230442C; JP3645255B1; US6214798B1; BR9808523B1; CY2009008I1; CZ358699A3; JP4249806B2; AU6969898A; NO994906L; RU2199549C2; AR011217A1; JP2001523229A; HUP0002704A2; NO994906D0; DK1003774T3; PL194509B1; UA58547C2; PL336213A1; NO2009016I2; SK285381B6

Abstract

La invención se refiere a péptidos que tienen propiedades de antagonistas de la hormona de liberación de la gonadotropina (GnRH) de granduración. Estos antagonistas pueden servir para regular la fertilidad y para tratar los tumores dependientes de los esteroides así como en otras indicaciones terapéuticas a corto plazo y a largo plazo. Estos antagonistas tienen un derivado de aminoPhe o su equivalente en la posición 5 y 6.Este derivado se modifica de manera a contener un grupo carbamoilo o heterociclo, incluido una fracción de urea en su cadena lateral. Unos decapéptidos particularmente eficaces que siguen produciendo una supresión muy sensible de la secreción de LH 96 horas después de la inyección, se representan por las fórmulas: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hidroorotil)-D-4Aph(acetil)-Leu-Lys(isopropil)-Pro-D-Ala-NH{sub,2}, y Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hidroorotil)-D-4Amf(Q2-Leu-Lys(isopropil)-Pro-Xaa10, donde Q2 representa Cbm o MeCbm y Xaa10 representa D-Ala-NH{sub,2}, D-Ala-ol o Ala-ol.

Description

Antagonistas de GnRH modificados en las posiciones 5 y 6.

Esta invención se refiere en forma general a péptidos que son antagonistas de la hormona liberadora de gonadotropina humana (GnRH), y que tienen ventajosas propiedades físicas, químicas y biológicas. Más particularmente, la presente invención se refiere a decapéptidos los cuales inhiben la función gonodal y la liberación de las hormonas esteroidales progesterona y testosterona, por períodos de más larga duración, y a métodos de administración de composiciones farmacéuticas que contienen tales decapéptidos para dicho propósito y particularmente para controlar las condiciones resultantes de la hipersecreción de esteroides gonodales.

Antecedentes de la invención

Las hormonas de estimulación folicular (FSH) y hormonas luteinizantes (LH), algunas veces aludidas como gonadotropinas o hormonas gonadotrópicas, son liberadas por la glándula pituitaria que está ligada por un filamento al hipotálamo.

La liberación de hormonas por el lóbulo anterior de la glándula pituitaria normalmente requiere antes la liberación de hormonas producidas por el hipotálamo, como el decapéptido GnRH.

La administración de análogos de GnRH que son antagonistas de la función normal de los GnRH ha sido usada generalmente en mamíferos para suprimir la secreción de gonadotropinas, y para suprimir o retrasar la ovulación.

La búsqueda de una mejora en los GnRH-antagonistas ha resultado en la síntesis de Antida, esto es [Ac-D-2Nal^{1},D-4ClPhe^{2}, D-3Pal^{3}, Lys(Nic)^{5}, D-Lys(Nic)^{6}, Ilys^{8}, D-Ala^{10}]-GnRH; y de Cetrorelix, esto es [Ac-D-2Nal^{1}, D-4ClPhe^{2}, D-3Pal^{3}, D-Cit^{6}, D-Ala^{10}]-GnRH. La Patente U.S. Nº 5,516,887 describe GnRH-antagonistas los cuales se dice que son más efectivos que la Antida en suprimir la testosterona en plasma, por ejemplo [Ac-D-2Nal^{1}, D-4ClPhe^{2}, D-3Pal^{3}, D-N^{\varepsilon}-cabamoil Lys^{6}, Ilys^{8}, D-Ala^{10}]-GnRH, el cual es aludido como Antarelix.

La Patente U.S. Nº 5,296,468, emitida el 22 de marzo de 1994, describe el diseño y la síntesis de un número de GnRH-antagonistas en donde las cadenas laterales de restos seleccionados se hacen reaccionar para crear restos cianoguanidino, algunos de los cuales posteriormente se convierten espontáneamente en un heterociclo deseado, por ejemplo, un 3-amino-1,2,4-triazol(atz). Dichos restos cianoguanidino están construidos sobre el grupo omega-amino en una cadena lateral de un aminoácido, como la lisina, la ornitina, la 4-aminofenilalanina (4Aph) o una versión de cadena extendida de la misma, como la 4-aminohomofenilalanina (4Ahp). GnRH-antagonistas teniendo dichos aminoácidos significativamente modificados o no-naturales en las posiciones 5- y 6- exhiben una buena potencia biológica, y los construidos sobre Aph se consideran generalmente preferidos. Uno especialmente preferido es Azalina B, es decir [Ac-D-2Nal^{1}, D-4ClPhe^{2}, D-3Pal^{3}, 4Aph(atz)^{5}, D-4Aph(atz)^{6}, Ilys^{8}, D-Ala^{10}]-GnRH. La patente U.S. Nº 5,506,207 describe GnRH-antagonistas biopotentes en donde las cadenas laterales de fenilalanina amino-sustituidas de restos en las posiciones 5- y 6- están aciladas; un decapéptido particularmente potente es Acylina, esto es [Ac-D-2Nal^{1,} D-4ClPhe^{2},D-3Pal^{3}, 4Aph(Ac)^{5}, D-4Aph(Ac)^{6}, Ilys^{8}, D-Ala^{10}]-GnRH.

La publicación internacional WO 96/40757 describe el diseño y síntesis de GnRH-antagonistas adicionales donde el resto en la posición 6 puede ser un de los siguientes: D-Lys(Imdac), D-Lys(Ppic), D-Lys(Dodac), D-Lys(pGlu), D-Lys(Otac) o D-Lys(Onic) o se selecciona de un amplio grupo de potenciales candidatos incluyendo D-Lys(Orotic). No hay indicación de que ninguno de estos péptidos podría exhibir propiedades de larga actuación.

A pesar de las atractivas propiedades de este grupo de GnRH-antagonistas, la investigación ha continuado para generar GnRH-antagonistas mejorados, particularmente los que muestran actividad biológica de larga duración. Con frecuencia puede ser importante que un péptido análogo exhiba una actividad de larga duración respecto a la secreción de LH, una propiedad que puede ser acentuada por la resistencia de los péptidos a la degradación de la enzima proteolítica en el cuerpo para el tratamiento de ambas, indicaciones de período largo y corto. Además, para facilitar la administración de estos compuestos a mamíferos, particularmente humanos, sin gelificación significativa, se considera extremadamente ventajoso para dichos decapéptidos GnRH-antagónicos, tener alta solubilidad en agua a pH fisiológico normal, esto es, aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 7.4.

Compendio de la invención

Ahora se ha encontrado que ciertas modificaciones en la posición 5- del resto, o en las posiciones 5- y 6- de los restos en esta subclase de GnRH-antagonistas, la cual incluye Cetrorelix, Antarelix, Acilina, Antida y otros, inesperadamente resultan en compuestos que cuando son administrados exhiben la propiedad particularmente ventajosa de una larga duración de la bioactividad. Estas modificaciones se hacen sobre restos de 4aminoPhe o su equivalente 4Ahp, o sobre 4-aminometilfenilalanina (4Amf) en donde el grupo amino-primario está enlazado al grupo metil unido en la posición 4- o para-. En tales modificaciones, el grupo amino del de la cadena lateral se hace reaccionar con un isocianato para formar un grupo urea, o con un ácido carboxílico heterocíclico que contenga al menos 2 átomos de nitrógeno organizados para constituir un resto urea. Los reactivos heterocíclicos preferidos son el ácido D- o L-hidroorótico (Hor)(C_{4}N_{2}H_{5}(O)_{2}COOH) y el ácido D- o L-2-Imidazolidona-4-carboxil (Imz)(C_{3}N_{2}H_{5}(O)COOH).

Generalmente, los decapéptidos GnRH-antagonistas que tienen la siguiente fórmula, y sus análogos estrechamente relacionados y sales farmacéuticamente aceptables, se encuentra que tienen propiedades farmacológicas mejoradas, particularmente larga duración de bioactividad:

X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa_{5}-Xaa_{6}-Leu-Xaa_{8}-Pro-Xaa_{10},

en donde:

X es un grupo acilo que contiene hasta 7 átomos de carbono, o Q,

siendo Q:

\hskip0.5cm

---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- NHR,

y R siendo H o un grupo inferior;

A es 4Cl, 4F, 4Br, 4NO_{2}, 4CH_{3}, 4OCH_{3}, 3,4Cl_{2} o C^{\alpha}Me4Cl;

Xaa_{5} es Aph(Q_{1}), o Amf(Q_{1}), siendo Q_{1}

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1

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Xaa_{6} es D-Aph(Q_{2}), D-Amf(Q_{2}), D-Lys(Nic), D-Cit, D-Hci o D-Pal, Q_{2} siendo For, Ac, 3-amino-1,2,4 triazol, Q o Q_{1};

Xaa_{8} es Lys(ipr), Arg, Har, Arg(Et_{2}) o Har(Et_{2}); y

Xaa_{10} es D-Ala-NH_{2}, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH_{2}CH_{3}, Gly-NH_{2}, AzaGly-NH_{2}, Ala-NH_{2}, Agl-NH_{2}, D-Agl-NH_{2}, Agl(Me)-NH_{2} o D-Agl(Me)-NH_{2}, siempre que sin embargo el grupo \alpha-amino de Xaa_{5} opcionalmente pueda estar metilado.

Alternativamente, cuando Xaa_{6} contiene D- o L-Hor o D- o L-Imz, Xaa_{5} puede tener Ac, For o 3-imino-1,2,4-triazol como Q_{1}, y cuando Xaa_{6} contiene Q, Xaa_{5} puede también contener Q.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para el diagnóstico, in vivo o in vitro, de una condición en la que el GnRH está causando una secreción hormonal excesiva o el crecimiento de un tumor, en donde dicho método comprende la administración de un péptido GnRH-antagonista del tipo descrito arriba y hacer un seguimiento de la secreción hormonal o de la proliferación de células tumorales.

En otro aspecto adicional, la invención proporciona un intermedio para hacer el péptido GnRH-antagonista teniendo la fórmula

X^{1}-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser(X^{2})-Xaa_{5}-Xaa_{6}-Leu-Lys(ipr)(X^{4})-Pro-X^{5}

en donde:

X^{1} es un grupo \alpha-amino-protector;

A es 4Cl o 4F;

X^{2} es H o un grupo protector de hidroxilo;

\newpage

Xaa_{5} es Aph(Q_{1}) o Amf(Q_{1}) siendo Q_{1} un isómero D-, un isómero L- o una mezcla de isómeros D/L- de ya sea

2

Xaa_{6} es D-Aph(Q_{2}), D-Amf(Q_{2}) o D-Pal, siendo Q_{2} Ac, Q_{1}, carbamoilo o metilcarbamoilo;

X^{4} es un grupo protector del grupo amino, lábil en ácido; y

X^{5} es un soporte resínico D-Ala-, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl-, Agl(Me)- o D-Agl(Me)-; un soporte resínico N(Et)-; una amida de D-Ala, Gly o Ala; etilamida; AzaGly-NH_{2}; u OH-, siempre que sin embargo el grupo \alpha-amino de Xaa_{5} pueda estar opcionalmente metilado.

Estos antagonistas son particularmente útiles para suprimir la secreción de gonadotropinas y como regulares de la fertilidad en humanos porque exhiben actividad de larga duración, esto es, continuando la supresión sustancial de la secreción de LH durante al menos aproximadamente 4 días. Han mejorado su solubilidad en tampones acuosos a pH fisiológicos y aceptables efectos secundarios con respecto a la estimulación de liberación de histaminas, es decir, mejores que los GnRH-superagonistas que están siendo actualmente clínicamente usados; también muestran mínima gelificación en inyecciones subcutáneas (sc) a concentraciones efectivas. Estos GnRH-antagonistas también funcionan adecuadamente en un ensayo anafiláctico causando una pápula relativamente pequeña. Como resultado, estos péptidos encuentran un particular uso en la administración a mamíferos, especialmente humanos, como reguladores de la fertilidad y para el tratamiento de situaciones patológicas como son la pubertad precoz, la neoplasia hormona-dependiente, la dismenorrea, la endometriosis, tumores estoroide-dependientes, y las otras indicaciones de larga duración y de corta duración mencionadas aquí anteriormente. También diagnósticamente son útiles.

Dado que estos GnRH-antagonistas son fácilmente solubles en el intervalo de pH fisiológico de aproximadamente 5 a aproximadamente 7.4, pueden ser formulados y administrados en formas concentradas, particularmente a pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 7. Dado su carácter polar, son particularmente apropiados para su uso en preparaciones de liberación lenta basadas en co-polímeros conocidos. Dado que estos GnRH-antagonistas muestran una efectiva supresión de LH y FSH de larga duración, también son particularmente efectivos para tratamientos anticonceptivos en mamíferos machos (con la administración opcional de testosterona) y para el tratamiento de tumores esteroide-dependientes.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Durante los últimos 10 a 12 años, las propiedades particulares de cada uno de los 10 restos en la secuencia del GnRH, desde el punto de vista de la creación de un antagonista efectivo, han sido estudiadas en profundidad, y como resultado de estos estudios, se ha descubierto que hay diversos restos equivalentes que pueden ser elegidos y que substituciones de estos equivalentes por otros no desmejoraban significativamente la potencia biológica de los decapéptidos GnRH-antagonistas. Tales sustituciones equivalentes se pueden hacer en los GnRH-antagonistas descritos en la presente invención.

Por ejemplo, se ha convertido en generalmente aceptado que la inclusión del resto D-Phe para-sustituído, o D-Phe 2,4-dicloro-sustituído o D-C^{\alpha}Me4ClPhe o D-pentametil(Me_{5})Phe en la posición 2-, agregan significativamente actividad GnRH-antagonista; sin embargo, la identidad específica del sustituyente del anillo es solamente de relativa menor importancia cuando es seleccionado de entre los siguientes: cloro, fluoro, bromo, nitro, metil y alcoxy. En consecuencia, tales restos en la posición 2- son considerados como equivalentes del D-4ClPhe, comúnmente usado ahí. El Phe^{7} se considera equivalente al Leu^{7}. El extremo N-terminal está preferiblemente N-acilado, preferiblemente por acetil (Ac), pero también por otros grupos acilo que tengan hasta 7 átomos de carbono, por ejemplo: formilo (For), acrililo (Acr), n-propionilo (Pn), butirilo (By), valerilo (Vl), vinilacetilo (Vac) y benzoilo (Bz); alternativamente, puede estar modificado por un carbamoilo sustituido o no sustituido. Otros grupos acilo más largos son considerados equivalentes, pero son menos preferidos. El grupo \alpha-amino en el resto de la posición 5- puede estar opcionalmente metilado, como se describe en la Patente U.S. No.5,110,904, para incrementar la solubilidad en agua, pero dicha modificación puede resultar en un acortamiento del tiempo de supresión de LH y en un mayor potencial de liberación de histaminas. El extremo C-terminal es preferiblemente D-Ala-NH_{2}, D-Ala-ol o Ala-ol; sin embargo, Gly-NH_{2}, NHCH_{2}CH_{3}, AzaGly-NH_{2}, Ala-NH_{2}, Agl-NH_{2}, D-Agl-NH_{2}, Agl(Me)-NH_{2} y D-Agl(Me)-NH_{2} pueden ser usados en su lugar dado que se consideran equivalentes conocidos.

Como se dijo antes, se considera que la presente invención proporciona una familia de GnRH-antagonistas representados por la siguiente fórmula:

X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa_{5}-Xaa_{6}-Leu-Xaa_{8}-Pro-Xaa_{10}

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos en donde:

X es For, Ac, Acr, Pn, By, Vl, Vac, Bz o Q,

siendo Q:

\hskip0.5cm

---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- NHR,

R siendo H o un alquilo inferior;

A es 4Cl, 4F, 4Br, 4NO_{2}, 4CH_{3}, 4OCH_{3}, 3,4Cl_{2} o C^{\alpha}MeCl;

Xaa_{5} es Aph(Q_{1}) o Amf(Q_{1}) siendo Q_{1}

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3

\vskip1.000000\baselineskip

Xaa_{6} es D-Aph(Q_{2}), D-Amf(Q_{2}), D-Lys(Nic), D-Cit, D-Hci o D-Pal, siendo Q_{2} For, Ac, 3-amino-1,2,4-triazol, Q o Q_{1};

Xaa_{8} es Lys(ipr), Arg, Har, Arg(Et_{2}); y

Xaa_{10} es D-Ala-NH_{2}, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH_{2}CH_{3}, Gly-NH_{2}, AzaGly-NH_{2}, Ala-NH_{2}, Agl-NH_{2}, D-Agl-NH_{2}, Agl(Me)-NH_{2} o D-Agl(Me)-NH_{2}.

En una familia de GnRH-antagonistas estrechamente relacionada, Xaa_{5} puede tener Ac, o For o 3-amino-1,2,4-triazol como Q_{1}, y cuyo caso Xaa_{6} incluye Q_{2} en la forma de D- o L-Hor, o D- o L-Imz.

En otras familias de GnRH-antagonistas estrechamente relacionadas donde Xaa_{6} incluye Q, Xaa_{5} también incluye Q.

Por D-Nal se entiende el isómero D- de la alanina la cual está sustituida por naftilo en el átomo de carbono \beta, es decir, referido como \beta-D-Nal o 3-D-Nal. Preferiblemente, se emplea D-2Nal en donde el enlace al naftaleno está en la posición 2- de la estructura de anillo; no obstante, D-1Nal puede también ser usado. D-Cpa representa el cloro-D-Phe, y D-4ClPhe, es decir, el D-4Cpa es preferido. D-Pal representa el isómero D de la alanina que ha sido sustituido por piridilo en el átomo de Carbono \beta; preferiblemente, el enlace es a la posición 3- del anillo de la piridina, esto es, D-3Pal (\beta-3-piridil-D-Ala), aunque el D-2Pal (\beta-2-piridil-D-Ala)podría ser usado en su lugar. Por 4Aph se entiende 4NH_{2}Phe en donde el sustituyente amino sobre el anillo fenilo está en la posición 4-; 3NH_{2}Phe(3Aph) es considerado su equivalente en estos análogos. Además, también se sabe que el 2NH_{2}Phe es también un equivalente desde el punto de vista de la biopotencia. Por 4Amf se entiende 4NH_{2}CH_{2}Phe donde hay un grupo metileno enlazado al grupo amino de la cadena lateral; 3NH_{2}CH_{2}Phe(3Amf) es considerado también un equivalente. Por Hor o L-Hor se entiende L-hidroorotilo, y por Imz o L-Imz se entiende L-2-imidazolidona-4-carbonilo -, cualquiera de los cuales puede ser usado, como isómeros D- o la mezcla D/L. Por atz se entiende 3-amino-1,2,4-triazol. Aph(atz) se conoce también por el nombre químico más preciso 4-(3'-amino-1H-1',2',4'-triazoil-5'-ilo)aminofenilalanina. Por Lys(Nic) se entiende N^{\varepsilon}-nicotinoil lisina, es decir, el grupo \varepsilon-amino de Lys es acilado con 3-carboxipiridina. Por D-Cit se entiende el isómero D de la citrulina, y por D-Hci se entiende el isómero D de la homocitrulina, el cual es también D-N^{\varepsilon}-carbamoilo lisina. Por Ilys o Lys(ipr) se entiende N^{\varepsilon}-isopropil lisina donde el grupo \varepsilon-amino de Lys está alquilado. Por Ala-ol se entiende alaninol, esto es CH_{3}CH(NH_{2})CH_{2}OH, y por AzaGly-NH_{2} se entiende el NHNHCONH_{2}. Por Har se entiende homoarginina. Por Agl se entiende \alpha-aminoglicina. Por Cbm se entiende carbamoilo, y por MeCbm se entiende metilcarbamoilo o -CONHCH_{3}. Por alquilo inferior se entiende C_{1} a C_{5}, preferentemente C_{1} a C_{3}, y más preferentemente aún C_{1} o C_{2}, es decir, metilo (Me) o etilo (Et).

Aunque los isómeros D- preferidos para incorporar en la posición 6- de estos GnRH-antagonistas están específicamente descritos, se debe entender que, como resultado de la extensa investigación en el campo en las dos últimas décadas, hay muchos isómero D- conocidos. Estas sustituciones del isómero D- del estado de la técnica pueden ser compatibles y no disminuir la biopotencia ofrecida por las sustituciones específicas en la posición 5- aquí descritas, por lo que pueden ser utilizadas opcionalmente.

Un subgénero de GnRH-antagonistas preferido tiene la siguiente fórmula:

X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa_{5}-Xaa_{6}-Leu-Lys(ipr)-Pro-Xaa_{10}

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde:

X es For, Ac, Acr, Pn, By, Vl, Vac, Bz o Q,

siendo Q:

\hskip0.5cm

---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- NHR,

R siendo H o un alquilo inferior,

A es 4Cl o 4F;

Xaa_{5} es Aph(Q_{1}) o Amf(Q_{1}), siendo Q_{1}

4

Xaa_{6} es D-Aph(Q_{2}), D-Amf(Q_{2}), D-Cit, D-Lys(Nic) o D-Pal, siendo Q_{2} For, Ac, Q o Q_{1}; y

Xaa_{10} es D-Ala-NH_{2}, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH_{2}CH_{3} o Gly-NH_{2}.

Un subgénero adicional preferido de GnRH-antagonistas tiene la fórmula:

X-D-Nal-D-4Cpa-D-Pal-Ser-Xaa_{5}-Xaa_{6}-Leu-Lys(ipr)-Pro-Xaa_{10}

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde:

X es Ac o Q

siendo Q:

\hskip0.5cm

---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- NHR,

R siendo H o metilo;

Xaa_{5} es Aph(Q_{1}) o Amf(Q_{1}), siendo Q_{1}

5

Xaa_{6} es D-Aph(Q_{2}), D-Amf(Q_{2}) o D-Pal, siendo Q_{2} Ac, Q o Q_{1}; y

Xaa_{10} es D-Ala-NH_{2}, D-Ala-ol o Ala-ol.

Otro subgénero preferido de GnRH-antagonistas tiene la fórmula:

MeCbm-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-Xaa_{6}-Leu-Ilys-Pro-Xaa_{10}

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde

D-Xaa_{6} es D-4Amf(Q_{1}), D-4Aph(Q_{1}) o D-3Pal,

siendo Q_{1} D-Hor o

\hskip0.5cm

---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- NHR,

y R siendo H o un alquilo inferior, y preferentemente H o grupo metilo; y en donde Xaa_{10} es D-Ala-NH_{2}, D-Ala-ol o Ala-ol.

Los compuestos de la presente invención pueden ser sintetizados mediante síntesis peptídica en disolución clásica, y tal síntesis es preferida para grandes cantidades de producto. Para obtener cantidades limitadas, por ejemplo, menos que 1 kg, puede ser preferible sintetizarlos usando técnicas de fase sólida. Grupos protectores de cadenas laterales, como los que se conocen bien en la técnica, son preferiblemente incluidos como parte de cualquier aminoácido el cual tiene una cadena lateral particularmente reactiva o lábil cuando está siendo unida a la cadena que se está construyendo sobre la resina. Dicha síntesis proporciona una péptidoresina intermedia completamente protegida, tal como X^{1}-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser(X^{2})-Xaa_{5}-Xaa_{6}-Leu-Lys(ipr)(X^{4})-Pro-X^{5}.

Un ejemplo de intermedio químico que puede ser usado para sintetizar un GnRH-antagonista teniendo los restos deseados en las posiciones 5- y 6- conteniendo hidroorotilo o similar, está representado por la fórmula: X^{1}-D-Nal-D-4Cpa-D-Pal-Ser(X^{2})-Aph(X^{3})-D-Aph(X^{3})-Leu-ILys(X^{4})-Pro-X^{5}. Al sintetizar intermedios peptídicos teniendo esta fórmula y otros análogos, los grupos X^{1} a X^{5} expuestos a continuación pueden utilizarse.

X^{1} es un grupo protector \alpha-amino del tipo conocido en la técnica para ser usado en la síntesis por etapas de polipéptidos y cuando X en la composición péptida deseada es un grupo acilo particular, este grupo puede ser usado como el grupo protector. Entre las clases de grupos protectores \alpha-amino cubiertas por X^{1} son (1) grupos protectores tipo acilo tales como formilo (For), trifluoracetilo, ftaloilo, p-toluensulfonilo (Tos), benzoilo (Bz), benzenosulfonilo, ditiasuccinoilo (Dts) o-nitrofenilsulfenilo (Nps), tritilsulfenilo, o-nitrofenoxiacetilo, acrililo (Acr), cloroacetilo, acetilo (Ac) y \gamma-clorobutirilo; (2) grupos protectores aromáticos tipo uretano tales como benciloxicarbonilo (Z), fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc), y benciloxicarbonilo sustituidos, como p-clorobenciloxi-carbonilo (ClZ), p-nitrobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo y p-metoxibenciloxicarbonilo; (3) grupos protectores alifáticos tipo uretano tales como tertbutiloxicarbonilo (Boc), diisopropilmetoxicarbonil, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonil y aliloxicarbonilo; (4) grupos protectores cicloalquilo tipo uretano tales como: ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo y ciclohexiloxicabonilo; (5) grupos protectores tipo tiouretanos tales como feniltiocarbonilo; (6) grupos protectores tipo alquilos tales como allilo (Aly), trifenilmetilo (trityl) y bencilo (Bzl); (7) grupos trialquilsilano como el trimetilsilano. El grupo protector \alpha-amino preferido es Boc.

X^{2} es un grupo protector para la cadena lateral hidroxilo del Ser, como Ac, Bz, tritilo, 2,6-diclorobencilo (DCB) o éter bencílico (Bzl) y es preferentemente el Bzl.

X^{3} es un grupo protector para la cadena lateral amino el cual no se quita cuando el grupo protector \alpha-amino o cualquier otro grupo protector amino se quita. Ejemplos ilustrativos incluyen (1)grupos lábiles a base tales como: Fmoc, o algunos otros estables en ácido débil, grupos protectores aromáticos tipo uretano; (2) grupos lábiles a tioles, tales como ditiasuccinoilo (Dts) que se puede quitar o escindir mediante tiolisis; (3) grupos lábiles a hidracina tales como: ftaloilo (Pht) que se escinde mediante hidrazinolisis; (4) grupos lábiles a nucleófilos tales como o-nitrofenil-sulfenilo (Nps) y similares los cuales se pueden escindir mediante tioacetamidas o por ácidos lábiles o sus sales; (5) grupos foto-lábiles los cuales se escinden por fotólisis; y (6) grupos selectivamente quitables mediante reducción, tales como Dts. Fmoc es preferido para una estrategia SPPS Boc.

X^{4} es un grupo protector para un grupo amino primario o secundario de la cadena lateral lábil en ácido, tal como Z o 2ClZ.

X^{5} puede ser D-Ala-, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl-, Agl(Me)- o D-Agl(Me)-NH-[soporte resínico], o N(Et)-[soporte resínico]; X^{5} puede también ser una amida, bien de Gly o de Ala o de D-Ala, una amida sustituida por grupos alquilo inferiores enlazada directamente al Pro, AzaGly-NH_{2}, u -OH. Cuando X_{5} es un ácido libre, el intermediario es un fragmento nonapéptido el cual es diseñado para ser enlazado al D- o L-alaninol para proporcionar un decapéptido que tiene un alcohol en el extremo C-terminal.

El criterio para seleccionar los grupos protectores de cadenas laterales X^{2} a X^{4} es que el grupo protector debería ser generalmente estable bajo las condiciones de reacción seleccionadas para extraer el grupo protector \alpha-amino (preferiblemente Boc) en cada paso de la síntesis. Estos grupos protectores generalmente no deberían escindirse bajo las condiciones de acoplamiento, pero deberían ser extraíbles tras completar la síntesis de la secuencia de aminoácidos deseada, bajo condiciones de reacción que no alteren la cadena peptídica formada. Los grupos protectores inicialmente empleados para los restos de las porciones de 5- y 6- son preferentemente extraídos y reacciones selectivas se llevan a cabo antes de separar el péptido definitivo de la resina, tal y como se explica más adelante. Si un decapéptido intermediario es sintetizado como se dijo más arriba, el grupo protector X^{3} preferiblemente puede ser removible individualmente.

Cuando el grupo X^{5} es D-Ala-NH-[soporte resínico], un enlace amida que conecta a D-Ala con una resina BDA o a una resina MBHA; esto también es probable cuando Agl o D-Agl es usado en el extremo C-terminal. Cuando X^{5} es N(Et)-[soporte resínico], un enlace etilamídico conecta a Pro con una resina N-alquilaminometílica (NAAM).

Cuando el extremo N-terminal será acetilado, por ejemplo, es posible emplear acetilo como grupo protector X^{1} para proteger el grupo \alpha-amino del \beta-D-Nal en la posición 1- añadiéndolo al aminoácido antes de su acoplamiento a la cadena peptídica; sin embargo, se prefiere realizar la reacción con los péptidos intermediarios en la resina. Después de desbloquear el grupo \alpha-amino y mientras los grupos deseados de las cadenas laterales permanecen protegidos, la acetilación preferiblemente se lleva a cabo reaccionando con anhídrido acético, alternativamente, la reacción se puede realizar con ácido acético en presencia de diisopropil o diciclohexil carbodiimida (DIC o DCC), o mediante alguna otra acilación adecuada como las que se conocen en la técnica. Un procedimiento similar se lleva a cabo cuando se desea un carbamoilo o un grupo carbamoiloio sustituído en el extremo N-terminal. Cuando los grupos desprotegidos de la cadena lateral los grupos amino son modificados, mientras el resto es parte de la cadena peptídica, la reacción puede ser llevada a cabo usando un isocianato apropiado en presencia de una base apropiada, por ejemplo, N,N-diisopropiletilenamina (DIEA), aunque el uso de tales bases es opcional. Cuando se desea un grupo carbamoilo no-sustituido en el producto final, la cadena lateral desprotegida con el amino se puede hacer reaccionar con bencilisocianato, p-tosilisocianato, trimetilsililisocianato o tertbutilisocianato, siendo preferido el último. Utilizando esta estrategia, el resto t-butilo se extrae durante la separación de la resina, dejando el grupo carbamoilo.

La invención también proporciona un novedoso método para construir tales GnRH-antagonistas que tienen, por ejemplo, la fórmula:

Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Ac)-Leu-Ilys-Pro-D-Ala-NH_{2}, dicho método comprendiendo (a) formar un péptido intermedio de fórmula: Boc-D-4Aph(X^{3})-Leu-Ilys(X^{4})-Pro-X^{5} donde X^{3} es lábil a una base, lábil a una hidrazina, u otros grupos protectores apropiados lábiles de un grupo amino; X^{4} es un grupo protector lábil al ácido para una cadena lateral amino; y X^{5} es D-Ala-NH-[soporte resínico]; (b) quitar X^{3} del D-4Aph para desproteger el grupo primario amino de la cadena lateral de este resto del aminoácido del péptido intermedio; (c) hacer reaccionar este grupo amino primario de la cadena lateral con anhídrido acético; (d) completar la elongación de la cadena para crear el intermedio X^{1}-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(X^{2})-4Aph(X^{3})-D-4Aph(Ac)-Leu-Ilys(X^{4})-Pro-X^{5}, donde X^{1} es hidrógeno o un grupo protector del \alpha-amino y X^{2} es hidrógeno o un grupo protector para un grupo hidroxilo de Ser; (e) desbloquear el grupo \alpha-amino en el extremo N-terminal y acetilar; (f) quitar X^{3} del 4Aph y reaccionar el grupo amino primario desprotegido con ácido hidroorótico; y (g) quitar cualquier grupo protector restante y/o escindir del soporte resínico incluido en X^{5}.

La purificación final del péptido es efectuada por cromatografía y preferiblemente usando RP-HPLC, como se conoce en la técnica; ver J. Riever, et al. J. Chromatography, 288, 303-328 (1984), y C. Miller and J.Riever, Biopolymers (Peptide Science), 40, 265-317 (1996).

Los GnRH-antagonistas de la invención se consideran efectivos en niveles menores de 100 microgramos por kilogramo de peso corporal cuando se administran subcutáneamente alrededor de medio día en el día de proestrus para prevenir la ovulación en ratas hembras. Para una supresión prolongada de la ovulación, puede ser necesario usar niveles de dosis en el intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 2.5 miligramos por kilogramo de peso corporal. Los antagonistas son también efectivos para detener la espermatogénesis cuando se administran a mamíferos machos de forma regular y pueden ser de este modo usados como anticonceptivos. Dado que estos compuestos reducirán los niveles de testosterona y de este modo la libido (una consecuencia indeseada en el macho normal, sexualmente activo), puede ser deseable administrar dosis de testosterona de reemplazo junto con el GnRH-antagonista para conseguir azoospermia mientras se mantiene la libido. Estos antagonistas pueden también ser usados para regular la producción de gonadotropinas y esteroides sexuales, y para otras administraciones de larga y corta duración como se indicó más atrás, y pueden ser usados en aplicaciones veterinarias como anticonceptivos para mascotas.

Los péptidos proporcionados por la invención son particularmente solubles en pHs fisiológicos y pueden ser preparados para su administración en soluciones relativamente concentradas, particularmente para inyección subcutánea. Estos péptidos son bien tolerados en el cuerpo y no tienden a gelatizarse cuando son administrados subcutáneamente en concentraciones efectivas. Generalmente composiciones farmacéuticas conteniendo tales péptidos y un excipiente adecuado farmacéuticamente aceptable pueden ser administrados iv, ip, subcutáneamente o similares en niveles de entre aproximadamente 0.001 mg y aproximadamente 2.5 mgs por kg de peso corporal por día, usualmente siendo suficiente 0.5 mg/kg/día.

Los aminoácidos apropiadamente protegidos que contienen D- o L-hidroorotilo, carbamoilo y/o D- o L-imidazolidona-carbonil pueden ser sintetizados y empleados después en una síntesis de cadenas peptídicas por elongación. No obstante, una síntesis igualmente válida puede se efectúa incorporando un resto Aph, D-Aph, Amf o D-Amf protegidos apropiadamente, en la posición deseada en el péptido intermedio, y este puede ser el procedimiento de laboratorio de elección en donde sólo inicialmente solo se desean pequeñas cantidades. Esta última estrategia se consigue desprotegiendo a continuación el resto en particular (bien inmediatamente o bien posteriormente durante la síntesis) y después hacer reaccionar el grupo amino de la cadena lateral desprotegida con el reactivo deseado.

La presente invención es descripta adicionalmente por los ejemplos que siguen.

Ejemplo 1

El péptido de fórmula: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-Lys(Nic)-D-Lys(Nic)-Leu-Ilys-Pro-D-Ala-NH_{2} (Antida) ha exhibido muy buenas propiedades biológicas como GnRH-antagonista, igual que el péptido al que actualmente se refiere como Acilina y que difiere de la Antida solamente en las posiciones 5- y 6-. Se ha descubierto ahora que usando estas moléculas como producto de partida y haciendo otras substituciones en las posiciones 5- y 6- o en la posición 5- del decapéptido Acilina, se obtienen GnRH-antagonistas que tiene una duración mejorada de bioactividad in vivo. Con respecto a las posiciones 1-4 y 7-10 es notorio que la Antida, la Acilina y la Azalina son todos exactamente los mismos.

El siguiente decapéptido [4Aph(Hor)^{5}, D-4Aph(Cbm)^{6}]-Antida o [Ac-D-2Nal^{1}, D-4Cpa^{2}, D-3Pal^{3}, 4Aph(Hor)^{5}, D-4Aph(Cbm)^{6}, Ilys^{8}, D-Ala^{10}]-GnRH es sintetizado por síntesis en fase sólida. Este péptido tiene la siguiente fórmula:

Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hidroorotilo)-D-4Aph(carbamoilo)-Leu- Lys(isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2}.

Aproximadamente 0.50 g (0.54 mmol/g) de resina MBHA (Bachem) son inicialmente usadas, y un D-Ala protegida con Boc es acoplada a la resina por un periodo de aproximadamente 2 horas en dimetilformamida(DMF)/CH_{2}Cl_{2} usando aproximadamente 0.65 milimoles de derivado de Boc y diisopropilcarbodimida (DIC) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) como reactivo activador o de acoplamiento. La porción D-Ala se une a la porción MBHA mediante un enlace amida.

Tras el acoplamiento de cada porción del aminoácido, el lavado, desbloqueo y posterior acoplamiento del próximo resto de aminoácido se realiza de acuerdo con el siguiente esquema de síntesis para aproximadamente de 0.5 a 1 gramo de la resina de inicio:

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Paso	Reactivos y Operaciones	Tiempo de mezcla
		(Min)
1	Lavado con 15 ml de Metanol (MeOH) (2 veces)	1
2	Lavado con 30 ml de CH_{2}Cl_{2} (DCM) (3 veces)	1
3	50% TFA más 1% m-cresol en 25 ml de DCM (2 veces)	5, 20
4	Lavado con 20 ml de alcohol Isopropílico (2 veces)	1
5	Trietilamina al 10% en 20 ml de DCM (2 veces)	2
6	Lavado con 15 ml de MeOH (2 veces)	1
7	Lavado con 20 ml de DCM (3 veces)	1
8	\begin{minipage}[t]{110mm} Ácido Boc-amino (0.5-1.0 mmoles) y HOBt (0.5-1.0 mmoles) en 10-20 ml de dimetilformamide(DMF):DCM o N-metilpyrrolidona(NMP):DCM, dependiendo de la solubilidad del aminoácido protegido en particular, más DIC o DCC (0.5-1.0 mmoles) en DCM\end{minipage}	1-17 horas
9	Lavado con 15 ml de MeOH (2 veces)	1
10	Lavado con 20 ml de DCM (3 veces)	1

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El esquema anterior es usado para acoplar cada uno de los aminoácidos del péptido de la invención después de unir el primer aminoácido. Una protección tipo N^{\alpha}Boc es usada para cada uno de los aminoácidos acoplados a lo largo de la síntesis. N^{\alpha}Boc-\beta-D-2Nal es preparado mediante un método conocido en la técnica, por ejemplo, tal y como ha sido descrito en detalle en la Patente U.S. No. 4,234,571; también está comercialmente disponible en SyntheTech, Oregon, U.S.A. Los grupos primarios amino de la cadena lateral de 4Aph en la posición 5- y de D-4Aph en la posición 6- están protegidos por Fmoc. El éter bencílico (Bzl) es preferentemente usado como un grupo protector para el grupo hidroxilo de la cadena lateral de Ser; sin embargo, Ser puede ser acoplado sin protección de la cadena lateral. N^{\alpha}Boc-Lys(ipr,Z) es usado para la porción de posición 8-.

Después de añadir D-4Aph para el residuo de la posición 6- como N^{\alpha}Boc-D-4Aph(Fmoc), el siguiente intermediario está presente: Boc-D-4Aph(Fmoc)-Leu-Lys(ipr,Z)-Pro-D-Ala-NH-[soporte resínico MBHA]. El grupo amino de la cadena lateral en la del residuo en posición 6- es modificado a continuación después de quitar la protección de la cadena lateral. EL grupo protector Fmoc es quitado mediante sucesivos tratamientos con piperidina al 25% en DMF (10 ml) por aproximadamente 15 minutos cada vez. Después de lavar la peptidoresina con DMF, el grupo amino recientemente liberado es tratado con un exceso de 20 veces de tert-butil isocianato en DMF en una cámara térmica durante aproximadamente 12 horas, o hasta completar según la prueba de la ninhidrina. La peptidoresina es sometida a un lavado normal, y Boc es quitado para añadir el siguiente resto.

El residuo en posición 5- es entonces adicionado como N^{\alpha}Boc-4Aph(Fmoc). Su cadena lateral es desprotegida igual que antes, y una reacción se lleva a cabo con 0.10 g (0.66 mmol) de ácido L-hidroorótico, 90 mg (0.66 mmol) de HOBt y 0.66 mmol de DIC en 3 ml de DMF a temperatura ambiente durante aproximadamente 8 horas, o hasta completar tal y como se comprueba usando una prueba estándar de ninhidrina. Después de lavar y quitar el N^{\alpha}Boc, la síntesis del decapéptido se completa reaccionando secuencialmente con N^{\alpha}Boc-Ser(Bzl), N^{\alpha}Boc-D-3Pal, N^{\alpha}Boc-4Cpa, y N^{\alpha}Boc-D-2Nal.

Después de desbloquear el grupo \alpha-amino en el extremo N-terminal usando ácido trifluoracético (TFA), se consigue la acetilación usando un gran exceso de anhídrido acético en diclorometano (DCM) durante aproximadamente 30 minutos. Alternativamente, la protección Fmoc de 4Aph no es quitada hasta después de la acetilación del extremo N-terminal, y entonces se efectúa la reacción con ácido L-hidroorótico.

La peptidoresina es secada y, después de la adición de 0.5 ml de anisol como neutralizador, se realiza la escisión del péptido y la desprotección de las cadenas laterales del Ser y el Lys, a aproximadamente 0ºC con 15 ml de HF durante aproximadamente 1,5 horas, con la eliminación de cualquier resto t-butil restante. Después de quitar bajo vacío el HF, la resina se lava dos veces con 100 ml de éter etílico. El péptido escindido es extraído con TFA al 0.2% en 25% de CH_{3}CN/H_{2}O, repitiendo el proceso usando 100 ml de la mezcla cada vez. Los extractados se combinan y liofilizan, y proporcionan aproximadamente 600 mg de polvo de péptido crudo.

La purificación del péptido es efectuada mediante cromatografía líquida de alto rendimiento en fase reversa (RP-HPLC), tal como se conoce en la técnica y específicamente presentada en J. Rivier, et al. J. Chromatography, 288, 303-328 (1984). La primera separación preparativa mediante RP-HPLC usa un sistema tampón TEAP (fosfato de trietilamonio), y una separación final es realizada usando un gradiente de TFA (ácido trifluoracético) al 0.1%, tal como se describe en detalle en el artículo del J. Chromatography.

Se juzga que el péptido (aproximadamente 30 mg) (en adelante referido como Péptido Nº 1) es sustancialmente homogéneo usando electroforesis capilar (CZE), se estima que la pureza es de aproximadamente un 98%. El análisis de los aminoácidos del péptido purificado es consistente con la fórmula de la estructura preparada. El peso molecular determinado mediante espectrometría de masas de ión secundario líquido (LSI-MS) es 1631.9 Da, lo cual es consistente con la masa esperada de 1631.8 Da para este péptido.

La hidroafinidad se comprueba midiendo el tiempo de retención usando RP-HPLC con un gradiente de 40% a 70% de solución tampón B durante 30 minutos, siendo TEAP el tampón A a pH 7.0 y siendo el tampón B 70% CH_{3}CN y 30% de tampón A. El Péptido Nº 1 es más hidrófilo que la Acilina, eluyendo más rápidamente que la Acilina. Su solubilidad en tampones acuosos a un pH entre aproximadamente 5 y aproximadamente 7, y su resistencia a la gelatización in vivo, junto a la biopotencia de larga duranción para suprimir niveles de circulación de LH como se describe más adelante, lo hacen particularmente adecuado para administración por inyección subcutánea, comparado con otros compuestos de eficacia biológica comparable.

Se ensaya el péptido in vivo para determinar su efectividad para suprimir la secreción de LH en ratas. La medición de los niveles de LH circulantes en machos castrados de ratas Sprague-Dawley tratados subcutaneamente con el péptido realizada tal y como se describe en C. Rivier y et al. en Biol.Reproduc., 1983, 29, 374-378. Los péptidos son primeramente disueltos en una concentración de 1.0 o 10 mg/ml en agua bacteriostática, y después diluidos adicionalmente en un tampón fosfato 0.04 M conteniendo BSA al 0.1%. Se realizan ulteriores diluciones en tampón fosfato. Los péptidos son inyectados sc en 5 ratas, y muestras de sangre (300 \mul) son tomadas bajo anestesia de metotano. 50 \mul de suero son analizados en duplicado para determinar los niveles LH utilizando los reactivos suministrados por el Programa Nacional de Distribución de Hormonas y Pituitaria de la NIDDK. Los análisis muestran que una dosis de 50 \mug de péptidos por rata suprimen la secreción de LH a niveles que son significativamente inferiores al 50% de los niveles de control a lo largo del periodo de 96 horas tras la inyección. Aún más, los niveles medidos después de las 96 horas son aproximadamente de sólo 30% de los niveles de LH exhibidos por ratas inyectadas de forma similar con una dosis de 50 microgramos de Acilina. Se considera el Péptido Nº 1 de acción muy prolongada. El examen de las ratas muestra que el péptido fue muy bien tolerado, sin poder detectarse gelatización significativa en el punto de
inyección.

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La experiencia obtenida de ensayos sobre un gran número de GnRH-antagonistas muestran que un péptido que presenta supresión de LH tan prolongada, si se ensaya in vivo ratas Sprgue-Dawley hembras maduras, bloquea completamente la ovulación dosis de 2.5 microgramos.

Ejemplo 1A

La síntesis mostrada en el Ejemplo 1 es repetida, sustituyendo el N^{\alpha}Boc-D-4Amf(Fmoc) por el N^{\alpha}Boc-D-4Aph(Fmoc). Después de la desprotección de la cadena lateral de D-4Amf, se lleva a cabo una reacción con t-butil asocianato, como antes. La escisión de la resina y su desprotección seguida de purificación se efectúa tal como se describe en el Ejemplo 1. El péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hidroorotilo)-D-4Amf(carbamoilo)-Leu-Lys(isopropilo)-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido de la purificación mediante RP-HPLC y se juzga sustancialmente homogéneo, estimando que su pureza es mayor del 99%. El análisis por espectrometría de masas muestra una masa de 1645,9 Da el cual concuerda favorablemente con la masa esperada de 1645,8 Da. De los resultados de la HPLC se puede ver que este péptido es más hidrofílico que la Acilina.

Ensayando este péptido en el ensayo normal de supresión de LH in vivo en ratas se muestra que, a una dosis de 50 microgramos, es tan efectivo como la Acilina en la supresión de los niveles de LH en 1,2 y 3 días. En 96 horas, los niveles de LH son solo de aproximadamente el 25% de aquellos en los que las ratas ha sido inyectadas con Acilina. El Péptido Nº 1 A se considera de muy larga duración.

Ejemplo 1B

Para formar el análogo [4Aph(Hor)^{5}]-Acilina, la síntesis presentada en el Ejemplo 1 es repetida sustituyendo el anhídrido acético por t-butil isocianato para la reacción con la posición 6- de la cadena lateral desprotegida. La escisión del decapéptido de la resina y su desprotección, seguida de la purificación, se llevan a cabo tal como fueron descriptas en el Ejemplo 1. El péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hidroorotilo)-D-4Aph(acetil)-Leu-Lys(isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido mediante purificación por RP-HPLC. Se juzga sustancialmente homogéneo y se estima que su pureza es mayor del 99%. El análisis por espectrometría de masas muestra una masa de 1630,6 Da lo cual concuerda con la masa calculada de 1630,8 Da.

Ensayando este péptido en exámenes in vivo estándar sobre ratas al igual que en el Ejemplo 1, muestra que, en dosis de 50 microgramos, el péptido es bioactivo y aproximadamente tan efectivo como la Acilina entre el día 1 y el día 4. Se considera que muestra una muy larga duración en la supresión del LH.

Ejemplo 1C

La síntesis presentada en el Ejemplo 1B es repetida sustituyendo el ácido D/L-hidroorótico por el ácido L-hidroorótico para formar decapéptidos isoméricos. La escisión de la resina y su desprotección, seguida por la purificación, son llevadas a cabo tal como fueron descriptas en el Ejemplo 1. El péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D/L-hidroorotilo)-D-4Aph(acetil)-Leu-Lys(isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación por RP-HPLC. Se juzga que es una mezcla homogénea de dos compuestos sin otras impurezas. El análisis por espectrometría de masas muestra una masa de 1630,6 Da que concuerda con la masa calculada de 1630,8 Da.

Ensayando este péptido en el examen in vivo estándar sobre ratas como en el Ejemplo 1, se muestra que, en dosis de 50 microgramos, el péptido es bioactivo y aproximadamente tan efectivo como la Acilina entre el día 1 y el día 4. Se considera que muestra una muy larga duración en la supresión del LH.

Ejemplo 1D

La síntesis presentada en el Ejemplo 1B es repetida sustituyendo el ácido D-hidroorótico por el ácido L-hidroorótico para formar decapéptidos isoméricos. La escisión de la resina y su desprotección, seguida por la purificación, son llevadas a cabo tal como fueron descriptas en el Ejemplo 1. El péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-hidroorotilo)-D-4Aph(acetil)-Leu-Lys(isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación por RP-HPLC. Se juzga que es sustancialmente homogéneo, y se estima que su pureza es superior al 98%. El análisis por espectrometría de masas muestra una masa de 1630,8 Da que concuerda con la masa calculada de 1630,8 Da.

Ejemplo 1E

La síntesis mostrada en el Ejemplo 1B es repetida, sustituyendo el N^{\alpha}Boc-D-4FPhe por el N^{\alpha}Boc-D-4ClPhe para formar el decapéptido [D-4FPhe^{2}, 4Aph(Hor)^{5}]-Acilina. La escisión de la resina y su desprotección, seguida por la purificación, son llevadas a cabo tal como fueron descriptas en el Ejemplo 1. El péptido Ac-D-2Nal-D-4Fpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hidroorotilo)-D-4Aph(acetil)-Leu-Lys(isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación por RP-HPLC. Se juzga que es sustancialmente homogéneo, y se estima que su pureza es superior al 99%. El análisis por espectrometría de masas muestra una masa de 1615,1 Da que concuerda con la masa calculada de 1614,8 Da.

Ejemplo 1F

La síntesis mostrada en el Ejemplo 1B es repetida, sustituyendo el N^{\alpha}Boc-D-4Amf(Fmoc) por el N^{\alpha}Boc-D-4Aph(Fmoc) para formar el decapéptido [4Amf(Hor)^{5}]-Acilina. La escisión de la resina y su desprotección, seguida por la purificación, son llevadas a cabo tal como fueron descriptas en el Ejemplo 1. El péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(D-hidroorotilo)-D-4Aph(acetil)-Leu-Lys(isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación por RP-HPLC. Se juzga que es sustancialmente homogéneo, y se estima que su pureza es superior al 98%. El análisis por espectrometría de masas muestra una masa de 1644,7 Da que concuerda con la masa calculada de 1644,8 Da.

Ejemplo 1G

La síntesis mostrada en el Ejemplo 1 es repetida; sin embargo, en lugar de hacer reaccionar el grupo amino en la cadena lateral del D-4Aph con t-butil isocianato, éste y el resto 4Aph se hacen reaccionar simultáneamente con ácido hidroorótico para formar el decapéptido [4Aph(Hor)^{5}, D-4Aph(Hor)^{6}]-Antida. La escisión de la resina y su desprotección, seguida por la purificación, son llevadas a cabo tal como fueron descriptas en el Ejemplo 1. El péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hidroorotilo)-D-4Aph(L-hidroorotilo)-Leu-Lys(isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación por RP-HPLC. Se juzga que es sustancialmente homogéneo, y se estima que su pureza es superior al 99%. El análisis por espectrometría de masas muestra una masa de 1728,4 Da, que concuerda con la masa calculada de 1728,8 Da. Los resultados del RP-HPLC muestran que el péptido es más hidrofílico que la Azilina B, la cual por su parte es más hidrofílica que la Acilina.

Esta síntesis se repite sustituyendo el N^{\alpha}Boc-D-4Amf(Fmoc) por N^{\alpha}Boc-D-4Aph(Fmoc) para crear el decapéptido [4Aph(Hor)^{5}, D-Amf(Hor)^{6}]-Antida, que es en general igualmente biopotente en la supresión de la secreción del LH.

Ejemplo 1H

La síntesis mostrada en el Ejemplo 1 es repetida; sin embargo, en lugar de hacer reaccionar el grupo amino en la cadena lateral del D-4Aph con t-butil isocianato, se hace reaccionar con ácido D-hidroorótico para formar el decapéptido [4Aph(Hor)^{5}, D-4Aph(D-Hor)^{6}]-Antida. La escisión de la resina y su desprotección, seguida por la purificación, son llevadas a cabo tal como fueron descriptas en el Ejemplo 1. El péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hidroorotilo)-D-4Aph(D-hidroorotilo)-Leu-Lys(isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación por RP-HPLC. Se juzga que es sustancialmente homogéneo, y se estima que su pureza es superior al 98%. El análisis por espectrometría de masas muestra una masa de 1728,7 Da, que concuerda con la masa calculada de 1728,8 Da. Los resultados del RP-HPLC muestran que el péptido es más hidrofílico que la Azilina B, la cual por su parte es más hidrofílica que la Acilina.

Ensayando este péptido en el examen in vivo estándar sobre ratas como en el Ejemplo 1, se muestra que, en dosis de 50 microgramos, el péptido es bioactivo y aproximadamente tan efectivo como la Acilina entre el día 1 y el día 3. Es sustancialmente más efectivo que la Acilina en el día 4 y se considera que muestra una muy larga duración en la supresión del LH.

Ejemplo 1J

La síntesis del decapéptido [MeCbm-D-2Nal^{1}, 4Aph(Hor)^{5}]-Acilina es llevada a cabo según el procedimiento general mostrado en el Ejemplo 1B; sin embargo, en lugar de quitar inmediatamente el grupo protector Fmoc después de añadir el N^{\alpha}Boc-4Aph(Fmoc), se completa la síntesis del decapéptido sobre la resina. Entonces, después de desbloquear los extremos N-terminales, en lugar de reaccionar con anhídrido acético, se efectúa una reacción con metil-isocianato para formar el metilcarbamoilo en el extremo N-terminal. Entonces, se quita el Fmoc y el grupo amino en la cadena lateral del 4Aph se hace reaccionar con ácido L-hidroorótico como se mostró en el Ejemplo 1B. La escisión de la resina y su desprotección, seguida por la purificación, son llevadas a cabo tal como fueron descriptas en el Ejemplo 1. El péptido metilcarbamoilo-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hidroorotilo)-D-4Aph(acetil)-Leu-Lys(isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación por RP-HPLC. Se juzga que es sustancialmente homogéneo, y se estima que su pureza es superior al 99%. El análisis por espectrometría de masas muestra una masa de 1645,7 Da, que concuerda con la masa calculada de 1645,8 Da. Los resultados del RP-HPLC muestran que el péptido es más hidrofílico que la Azilina B, la cual por su parte es más hidrofílica que la Acilina.

Ensayando este péptido en el examen in vivo estándar sobre ratas como en el Ejemplo 1, se muestra que, en dosis de 50 microgramos, el péptido es bioactivo y aproximadamente tan efectivo como la Acilina entre el día 1 y el día 3 y más efectivo en cerca de más del 50% después de 96 horas. Se considera que muestra una muy larga duración en la supresión del LH.

Ejemplo 1K

La síntesis mostrada en el Ejemplo 1B es repetida, sustituyendo el N^{\alpha}Boc-D-3Pal por el N^{\alpha}Boc-D-4Aph(Fmoc) y omitiendo la subsiguiente reacción con tBuNCO para formar el decapéptido [4Aph(Hor)^{5}, D-3Pal^{6}]-Antida. La escisión de la resina y su desprotección, seguida por la purificación, son llevadas a cabo tal como fueron descriptas en el Ejemplo 1. El péptido Acetil-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hidroorotilo)-D-3Pal-Leu-Lys(isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación por RP-HPLC. Se juzga que es sustancialmente homogéneo, y se estima que su pureza es superior al 99%. El análisis por espectrometría de masas muestra una masa de 1574,7 Da que concuerda con la masa calculada de 1574,7 Da.

Ensayando este péptido en el examen in vivo estándar sobre ratas como en el Ejemplo 1, se muestra que, en dosis de 50 microgramos, el péptido es bioactivo y aproximadamente tan efectivo como la Acilina a lo largo de tres días; sin embargo, después de 96 horas, exhibe una supresión del nivel de LH a valores de aproximadamente el 35% con respecto a los de la Acilina. Se considera que muestra una muy larga duración en la supresión del LH.

Ejemplo 1L

La síntesis mostrada en el Ejemplo 1G es repetida, sustituyendo el t-butil-isocianato por el ácido hydroorótico para formar el decapéptido [4Aph(Cbm)^{5}, D-4Aph(Cbm)^{6}]-Antida. La escisión de la resina y su desprotección, seguida por la purificación, son llevadas a cabo tal como fueron descriptas en el Ejemplo 1. EL péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(carbamoíl)-D-4Aph(carbamoíl)-Leu-Lys(isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación por RP-HPLC. Se juzga que es sustancialmente homogéneo, y se estima que su pureza es superior al 99%. El análisis por espectrometría de masas muestra una masa de 1534,9 Da que concuerda con la masa calculada de 1534,7 Da.

Ensayando este péptido en el examen in vivo estándar sobre ratas como en el Ejemplo 1, se muestra que, en dosis de 50 microgramos, el péptido es bioactivo y aproximadamente tan efectivo como la Acilina a lo largo de cuatro días. Se considera que muestra una muy larga duración en la supresión del LH.

Ejemplo 1M

La síntesis mostrada en el Ejemplo 1G es repetida, sustituyendo el metil-isocianato por el ácido hydroorótico para formar el decapéptido [4Aph(MeCbm)^{5}, D-4Aph(MeCbm)^{6}]-Antida. La escisión de la resina y su desprotección, seguida por la purificación, son llevadas a cabo tal como fueron descriptas en el Ejemplo 1. EL péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(metilcarbamoíl)-D-4Aph(metilcarbamoíl)-Leu-Lys(isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación por RP-HPLC. Se juzga que es sustancialmente homogéneo, y se estima que su pureza es superior al 99%. El análisis por espectrometría de masas muestra una masa de 1562,8 Da que concuerda con la masa calculada de 1562,8 Da.

Ensayando este péptido en el examen in vivo estándar sobre ratas como en el Ejemplo 1, se muestra que, en dosis de 50 microgramos, el péptido es bioactivo y aproximadamente tan efectivo como la Acilina a lo largo de dos días y después empieza a bajar sensiblemente en su supresión de LH.

Ejemplo 2

El péptido [4Aph(Hor)^{5}, D-Cit^{6}]-Antida, un análogo del péptido Cetrorelix que tiene por fórmula Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hidroorotilo)-D-Cit-Leu-Ilys-Pro-D-Ala-NH_{2} es sintetizado usando el procedimiento presentado de forma general en el Ejemplo 1. En lugar del N^{\alpha}Boc-D-4Aph, el N^{\alpha}Boc-D-Cit es acoplado en la posición 6-. Alternativamente, N^{\alpha}Boc-D-Orn(Fmoc) es acoplado en la posición 6-, y la elongación de la cadena es temporalmente detenida después de haber obtenido el siguiente péptido intermedio: Boc-D-Orn(Fmoc)-Leu-Lys(ipr,Z)-Pro-D-Ala-NH-[soporte resínico MBHA]. Se desprotege entonces el grupo amino de la cadena lateral sobre el resto Orn quitando la protección Fmoc como en el Ejemplo 1, y se trata el intermedio con exceso de t-butil-isocianato en DMF aproximadamente 6 horas a temperatura ambiente para que se produzca la reacción con el resto Orn de la cadena lateral. Se completa la síntesis del decapéptido intermedio de la misma manera en que se realizó el Ejemplo 1.

La peptidoresina es lavada, escindida y desprotegida y después purificada como se describe en el Ejemplo 1. El péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hidroorotilo)-D-Cit-Leu-Ilys-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación por RP-HPLC. Se juzga que es sustancialmente homogéneo, y se estima que su pureza es superior al 99%. El análisis LSIMS muestra una masa medida de 1583,7 Da que concuerda con la masa calculada para este péptido de 1583,8 Da.

El péptido es más hydrofílico que el Cetrorelix y exhibe una bioactividad de duración tan larga como la del Cetrorelix cuando se prueba la supresión de la secreción de LH in vivo como en el Ejemplo 1. Tiene una mejor supresión marginal a los 3 días y sustancialmente mejor a las 96 horas.

Ejemplo 2A

Un análogo del péptido Antida, tal como el [4Aph(Hor)^{5}]-Antida es sintetizado usando el procedimiento presentado de forma general en el Ejemplo 1 de la Patente U.S. Nº 5,169,935. Después de acoplar N^{\alpha}Boc-D-Lys(Fmoc) en la posición 6-, se le hace reaccionar con un exceso de ácido nicotínico en DMF siguiendo la desprotección. Después, el N^{\alpha}Boc-Aph(Fmoc) se acopla en la posición 5-, y el grupo amino en la cadena lateral sobre el resto Aph se desprotege como en el Ejemplo 1. El intermedio se hace reaccionar con ácido L-hidroorotíco en DMF, y la síntesis del decapéptido intermedio se completa como en el Ejemplo 1.

Después de el lavado estándar, escisión de la resina, se realiza la desprotección y la purificación como se describe en el Ejemplo 1. El péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hidroorotilo)-D-Lys(Nic)-Leu-Ilys-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación por RP-HPLC. Se considera que es más hydrofílico que el Cetrorelix y que exhibe una bioactividad de duración tan larga como la del Cetrorelix para la supresión de la secreción de
LH.

Ejemplo 3

El análogo [4Aph (D/L-Imz)^{5}]-Acilina es sintetizado siguiendo el procedimiento general presentado de forma general en el Ejemplo 1B, excepto que D/L-Imz es sustituido por L-Hor. Por tanto, después de la desprotección del 4Aph en la posición 5-, el péptido intermedio es tratado con un exceso de ácido D/L-2-Imidazolidona-4-carboxílico, aproximadamente 90 mg de HOBt y aproximadamente 0.66 mmoles de DIC en una solución DMF durante aproximadamente 6 horas a temperatura ambiente. Se completa la síntesis del decapéptido intermedio de la misma manera en que se realizó el Ejemplo 1.

La péptidoresina se lava, escinde y desprotege y purifica como se describe en el Ejemplo 1. El péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D/L-2-imidazolidona-4-carbonil)-D-4Aph(Ac)-Leu-Ilys-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación por RP-HPLC. Se juzga que es mezcla sustancialmente homogénea de dos compuestos, sin impurezas. El análisis LSIMS muestra una masa medida de 1602.5 Da, que concuerda con la masa calculada para este péptido de 1602.8 Da. El péptido es más soluble en agua que la Acilina.

Los ensayos se realizan como en el Ejemplo 1, y a dosis de 50 microgramos, el péptido exhibe larga duración en la supresión de secreción de LH. Tiene una supresión marginal mejor a los 3 días y a las 96 horas, que la Acili-
na.

Ejemplo 3A

La síntesis del Ejemplo 3 es repetida usando un exceso de ácido L-2-imidazolidona-4-carboxílico en lugar de D/L-Imz. Se juzga sustancialmente homogéneo y se estima que su pureza es de aproximadamente 99%. El análisis LSIMS muestra una masa medida de 1602,5 Da que concuerda con la masa calculada para este péptido de 1602,8 Da. El péptido es más soluble en agua que la Acilina.

Ensayando el péptido utilizando el examen in vivo estándar sobre ratas como en el Ejemplo 1, se muestra que, en dosis de 50 microgramos, el péptido exhibe larga duración en la supresión del LH, siendo aproximadamente la misma que la Acilina por un período de 96 horas.

Ejemplo 3B

La síntesis del Ejemplo 3 es repetida usando un exceso de ácido D-2-imidazolidona-4-carboxílico en lugar de D/L-Imz. El péptido resultante Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-Imz)-D-4Aph(Ac)-Leu-Ilys-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido. El análisis LSIMS muestra una masa medida de 1602,6 Da, que concuerda con la masa calculada para este péptido de 1602,8 Da. El péptido es más soluble en agua que la Acilina.

Los ensayos se llevan a cabo como en el Ejemplo 1. El péptido es bioactivo y en dosis de 50 microgramos, el péptido exhibe supresión de la secreción de LH.

Ejemplo 3C

El péptido [4Aph(Imz)^{5}, D-4Amf(Cbm)^{6}]-Acilina es sintetizado usando una combinación de los métodos presentados en el Ejemplo 1 A (para introducir D-4Amf(Cbm)^{6}) y en el Ejemplo 3A (para introducir 4Aph(Imz)^{5}). El péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Imz)-D-4Amf(carbamoilo)-Leu-Ilys-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación por RP-HPLC. Se juzga que es sustancialmente homogéneo, y se estima que su pureza es superior al 98%. El análisis LSIMS muestra una masa medida de 1617,6 Da que concuerda con la masa calculada para este péptido de 1617,8 Da. El péptido se ensaya como en el Ejemplo 1, y a dosis de 50 microgramos, exhibe una larga duración en la supresión de la secreción de LH. Es sustancialmente igual a la Acilina a los 3 días y tiene una supresión ligeramente superior a las 96 horas.

Ejemplo 4

El péptido [4Aph(Hor)^{5}, D-4Amf(MeCbm)^{6}]-Antida, teniendo la fórmula Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hidroorotilo)-D-4Amf(MeCbm)-Leu-Ilys-Pro-D-Ala-NH_{2} es sintetizado usando la síntesis presentada de forma general en el Ejemplo 1 A. En lugar de hacer reaccionar D-4Amf en la posición 6- con exceso t-butil-isocianato en DMF, se hace reaccionar con metil-isocianato. Se completa la síntesis del decapéptido intermedio de la misma manera en que se realizó el Ejemplo 1A.

La péptidoresina se lava, se escinde y se desprotege y purifica como se describe en el Ejemplo 1. El péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hidroorotilo)-D-4Amf(MeCbm)-Leu-Ilys-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación por RP-HPLC. Se juzga que es sustancialmente homogéneo, y se estima que su pureza es superior al 99%. El análisis LSIMS muestra una masa medida de 1659,8 Da que concuerda con la masa calculada para este péptido de 1659,8 Da.

Ensayando este péptido en el examen in vivo estándar sobre ratas, se muestra que, en dosis de 50 microgramos, el péptido nº 4 exhibe una mejor supresión de la secreción de LH que la Acilina y se considera que exhibe una bioactividad de muy larga duración.

Ejemplo 4A

La síntesis del Ejemplo 4 es repetida sustituyendo el anhídrido acético por el metil-isocianato para crear el péptido [4Aph(Hor)^{5}, D-4Amf(Ac)^{6}]-Antida. El péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hidroorotilo)-D-4Amf(Ac)-Leu-Ilys-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación por RP-HPLC. Se juzga que es sustancialmente homogéneo, y se estima que su pureza es superior al 99%. El análisis LSIMS muestra una masa medida de 1644,5 Da, que concuerda con la masa calculada para este péptido de 1644,8 Da.

El péptido es ensayado como en el Ejemplo 1 a una dosis de 50 microgramos, y exhibe una bioactividad de larga duración. Exhibe una supresión de LH igual a la de la Acilina por 3 días y a las 96 horas es ligeramente superior a la Acilina.

Ejemplo 4B

Se realiza una modificación del decapéptido sintetizado y probado en el Ejemplo 1A teniendo D-alaninol en el extremo C-terminal, en lugar de D-alanilamida. Un fragmento no-péptido es sintetizado primero teniendo prolina como ácido libre en el extremo C-terminal usando una síntesis descrita de forma general con respecto al Ejemplo 1A, pero usando Resina Merrifield (poliestireno clorometilado entrecruzado) como la disponible de Bachem, Inc. Después de la escisión, desprotección y purificación, el siguiente nonapéptido es obtenido: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Amf(Cbm)-Leu-Ilys-Pro-OH. 0.15 mmoles del nonapéptido completamente desprotegido y purificado por HPLC es disuelto en 3 ml de DMF seco junto con 3.0 mmoles de D-alaninol (Lancaster Chemical). Después, 0.60 mmoles de PyBOP (Novabiochem), un sólido, fue añadido como un agente acoplante, y la mezcla de reacción fue agitada en una cámara térmica, durante 30 minutos. La reacción fue neutralizada añadiendo 200 ml de agua, creándose una emulsión que fue convertida en una solución límpida ajustando del pH a 2.5 usando ácido acético glacial. El decapéptido resultante, Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Amf(Cbm)-Leu-Ilys-Pro-D-Ala-ol, fue purificado utilizando RP-HPLC preparativa usando TEAP (pH 2.3) como tampón, seguida por una purificación adicional usando TFA al 0.1% como tampón. Se juzga que el péptido resultante es sustancialmente homogéneo, y se estima que su pureza es superior a aproximadamente el 99%. El análisis de MS muestra una masa de 1632,9 Da, que concuerda con la masa calculada de 1632,8 Da.

Ensayando este péptido en el examen in vivo estándar sobre ratas, como en el Ejemplo 1, muestra que, a dosis de 50 microgramos, el péptido es biactivo, y dicha bioactividad continúa durante al menos 96 horas. Se considera que el péptido es de muy larga duración.

Ejemplo 4C

La síntesis del Ejemplo 4B es repetido sustituyendo 3.0 mmoles de L-alaninol (Aldridge Chemical) por D-alaninol en la mezcla de reacción. El decapéptido resultante es purificado como en el Ejemplo 4B y se juzga que es sustancialmente homogéneo, y se estima que su pureza es superior al 98%. El análisis por espectrometría de masas muestra una masa de 1632,9 Da que concuerda con la masa calculada de 1632,8 Da.

Ensayando este péptido en el examen in vivo estándar sobre ratas como en el Ejemplo 1, se muestra que, en dosis de 50 microgramos, el péptido es bioactivo, y dicha bioactividad continúa durante al menos 96 horas. Se considera que el péptido es de acción muy prolongada.

Ejemplo 4D

Una modificación del decapéptido sintetizado y probado en el Ejemplo 1 consiste se hace poniendo D-alaninol en el extremo C-terminal, en lugar de D-alanilamida. Un fragmento nonapéptido es sintetizado teniendo prolina como un ácido libre en el extremo C-terminal usando SPPS en una Resina Merrifield, siendo por lo demás tal y como se describe en el Ejemplo 1. Después de la escisión, desprotección y purificación, el siguiente nonapéptido es obtenido: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Ilys-Pro-OH. El nonapéptido purificado se hace reaccionar a continuación con D-alaninol como en el Ejemplo 4B, y el decapéptido resultante, Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Ilys-Pro-D-Ala-ol, es purificado usando RP-HPLC preparativo como se describe en el Ejemplo 4B, con la excepción de que se usa TEAP a pH 6.5 en lugar de TEAP a pH 2.3. Se juzga que el péptido resultante es sustancialmente homogéneo, teniendo una pureza que se estima mayor del 99%. El análisis por espectrometría de masas muestra una masa de 1618,9 Da la cual concuerda con la masa calculada de 1618,8 Da. Las pruebas del péptido in vivo, muestran que es sustancialmente bioactivo. Ensayando este péptido en pruebas in vivo muestra ser bioactivo.

Ejemplo 4E

La síntesis descrita en el Ejemplo 4D es repetida sustituyendo el L-alaninol por D-alaninol. El decapéptido resultante: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-Ala-ol, es purificado usando RP-HPLC preparativo como se describe en el Ejemplo 4D y se juzga que el péptido resultante es sustancialmente homogéneo, teniendo una pureza que se estima mayor del 99%. El análisis por espectrometría de masas muestra una masa de 1618,9 Da, la cual concuerda con la masa calculada de 1618,8 Da.

Ensayando este péptido en pruebas in vivo muestra ser bioactivo.

Ejemplo 5

El péptido [4Aph(D-Hor)^{5}, D-4Amf(Cbm)^{6}]-Antida, uno que tiene la fórmula Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-hidroorotilo)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH_{2} es sintetizado usando la síntesis como se muestra de forma general en el ejemplo 1A. En lugar de hacer reaccionar 4Aph en la posición 5- con ácido L-hidroorótico, la cadena lateral se hace reaccionar con ácido D-hidroorótico. Después, la finalización de la síntesis del decapéptido intermediario se lleva a cabo como se muestra en el Ejemplo 1A.

Después se somete a la péptidoresina a un lavado normal, y la escisión de la resina y desprotección, seguido de purificación se llevan a cabo tal y como se describe en el Ejemplo 1. El péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-
3Pal-Ser-4Aph(D-hidroorotilo)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación me-
diante RP-HPLC. Se juzga sustancialmente homogéneo, y se estima que se pureza es mayor del 98%. El aná-
lisis por LSIMS muestra una masa medida de 1645,8 Da, la cual concuerda con la masa calculada de 1645,8
Da.

Ensayando este péptido usando el ensayo estándar in vivo en ratas se muestra que, a una dosis de 50 microgramos, el péptido exhibe una duración de la bioactividad en la supresión de la secreción de LH por encima de los 2 días aproximadamente tan largo como la Acilina y continúa afectando la secreción en menor medida a las 72 y a las 96 horas.

Ejemplo 5A

La síntesis del Ejemplo 5 es repetida excepto que, en lugar de hacer reaccionar la cadena lateral desprotegida de 4Amf con t-butil-isocianato, se hace reaccionar con anhídrido acético. El péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-hidroorotilo)-D-4Amf(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación mediante RP-HPLC. Se juzga sustancialmente homogéneo, y se estima que se pureza es mayor del 99%. El análisis por LSIMS muestra una masa medida de 1644,7 Da, la cual concuerda con la masa calculada de 1644,8 Da para ese pépti-
do.

El péptido es ensayado como en el Ejemplo 1, y en dosis de 50 microgramos, el péptido exhibe una supresión de la secreción de LH sustancialmente igual a la Acilina durante 3 días; a las 96 horas, exhibe un supresión de LH ligeramente superior a la Acilina.

Ejemplo 6

La síntesis como se muestra de forma general en el Ejemplo 1F es repetida con la excepción de que N^{\alpha}Boc-D-4Amf(Fmoc) es usado para el resto de la posición 6- en lugar de N^{\alpha}Boc-D-4Aph(Fmoc) para formar el decapéptido [4Amf(Hor)^{5}, D-4Amf(Ac)^{6}]-Antida. El péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-hidroorotilo)-D-4Amf(acetil)-Leu-Lys(isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación mediante RP-HPLC. Se juzga sustancialmente homogéneo, y se estima que se pureza es mayor del 99%. El análisis por espectroscopia de masas muestra una masa de 1658,7 Da, la cual concuerda con la masa calculada de 1658,8 Da.

El péptido es ensayado como en el Ejemplo 1, y en dosis de 50 microgramos, se encuentra que el péptido tiene una actividad de larga duración en la supresión de la secreción de LH. Es aproximadamente la misma que la de la Acilina durante los primeros dos días y exhibe una biopotencia casi igual a la de la Acilina durante los días 3 y 4.

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Ejemplo 6A

La síntesis del Ejemplo 6 es repetida, excepto que en lugar de hacer reaccionar la cadena lateral desprotegida de D-4Amf con anhídrido acético, se hace reaccionar con t-butil-isocianato como en el Ejemplo 1 para formar el péptido [4Amf(Hor)^{5}, D-4Amf(Cbm)^{6}]-Antida. El decapéptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-hidroorotilo)-D-4Aph(carbamoíl)-Leu-Lys(isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación mediante RP-HPLC. Se juzga sustancialmente homogéneo, y se estima que se pureza es mayor del 99%. El análisis por espectroscopia de masas muestra una masa de 1659,6 Da, la cual concuerda con la masa calculada de 1659,8 Da.

El péptido es ensayado como en el Ejemplo 1, y en dosis de 50 microgramos, es tan activo como la Acilina en la supresión de la secreción de LH después de 1 día y aproximadamente tan activo después de 2 días. Es ligeramente menos activo después de 3 días pero exhibe aproximadamente la misma actividad que la Acilina después de 4 días.

Ejemplo 6B

La síntesis del Ejemplo 6 A es repetida, excepto que la reacción es llevada a cabo con metil-isocianato en lugar de t-butil-isocianato para crear el péptido [4Amf(Hor)^{5}, 4Amf(MeCbm)^{6}]-Antida. El péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-hidroorotilo)-D-4Aph(metilcarbamoíl)-Leu-Lys(isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación mediante RP-HPLC. Se juzga sustancialmente homogéneo, y se estima que su pureza es mayor del 99%. El análisis por espectroscopia de masas muestra una masa de 1673,6 Da, la cual concuerda con la masa calculada de 1673,8 Da.

El péptido es probado como en el ensayo mostrado en el Ejemplo 1, y en dosis de 50 microgramos, el péptido es tan activo como la Acilina en la supresión de la secreción de LH después de 1 día y aproximadamente tan activo después de 2 días. En los días 3 y 4, continúa afectando la supresión de la secreción de LH en un grado significativamente superior al de la Acilina.

Ejemplo 6C

La síntesis del Ejemplo 6 es repetida sustituyendo el ácido D-hidroorótico por el ácido L-hidrorótico para formar el péptido [4Amf(Hor)^{5}, D-4Amf(Ac)^{6}]-Antida. El péptido Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(D-hidroorotilo)-D-4Amf(acetil)-Leu-Lys(isopropil)-Pro-D-Ala-NH_{2} es obtenido en la purificación mediante RP-HPLC. Se juzga sustancialmente homogéneo, y se estima que su pureza es mayor del 99%. El análisis por espectroscopia de masas muestra una masa de 1658,7 Da, la cual concuerda con la masa calculada de 1658,8 Da.

El péptido es ensayado como en el Ejemplo 1, y en dosis de 50 microgramos, es sustancialmente tan efectivo como la Acilina en los días 1 y 2. En el día 3, es sustancialmente menos efectivo que la Acilina y continúa bajando significativamente en biopotencia a partir de entonces.

Ejemplo 7

Usando los procedimientos generales presentados en los Ejemplos de 1 a 5, los siguientes péptidos GnRH-antagonistas son también preparados:

[4Aph(Hor)^{5}, D-4Amf(Cbm)^{6}, Pro^{9}NHCH_{2}CH_{3}]-Antida

[4Aph(Hor)^{5}, D-4Aph(Cbm)^{6}, Pro^{9}NHCH_{2}CH_{3}]-Antida

[Acr-D-2Nal^{1}, 4FD-Phe^{2}, 4Aph(Hor^{5})]-Acilina

[Bz-D-2Nal^{1}, 4NO_{2}D-Phe^{2}, 4Aph(Hor^{5}), D-4Aph(Hor)^{6}]-Antida

[For-D-2Nal^{1}, 4OCH_{3}D-Phe^{2}, 4Amf(Hor)^{5}, D-4Aph(D-Hor)^{6}]-Antida

[Acr-D-2Nal^{1}, 4BrD-Phe^{2}, 4Aph(Imz)^{5}, D-4Aph(Imz)^{6}]-Antida

[Pn-D-2Nal^{1}, 4CH_{3}D-Phe^{2}, 3Aph(D-Imz)^{5}, D-4Aph(D-Hor)^{6}]-Antida

[By-D-2Nal^{1}, 3,4Cl_{2}D-Phe^{2}, 4Aph(Hor)^{5}, D-4Aph(Hor)^{6}]-Antida

[Vl-D-2Nal^{1}, 4NO_{2}D-Phe^{2}, 4Aph(Hor)^{5}, D-3Aph(Cbm)^{6}]-Antida

[Vac-D-2Nal^{1}, C^{\alpha}Me4ClD-Phe^{2}, 4Aph(Hor)^{5}, Gly^{10}]-Acilina

[Pn-D-2Nal^{1}, 3Aph(Imz)^{5}, D-3Amf(D-Hor)^{6}-Agl^{10}]-Antida

[Acr-D-2Nal^{1}, 4Aph(Hor)^{5}, Arg(Et_{2})^{8}, D-Agl(Me)^{10}]-Acilina

[MeCbm-D-2Nal^{1}, 4Aph(Hor)^{5}, Arg^{8}, Agl(Me)^{10}]-Acilina

[Cbm-D-2Nal^{1}, 3Amf(Imz)^{5}, Ala^{10}]-Acilina

[EtCbm-D-2Nal^{1}, 4Amf(Hor)^{5}, Pro^{9}NHCH_{2}CH_{3}]-Acilina

[Acr-D-2Nal^{1}, 4Aph(Imz)^{5}, D-4Amf(Cbm)^{6}, Arg^{8}]-Antida

[Cbm-D-2Nal^{1}, 4Aph(MeCbm)^{5}, D-4Amf(MeCbm)^{6}, Arg(Et_{2})^{8}]-Antida

[4Ahp(Hor)^{5}, D-4Ahp(Imz)^{6},D-Agl^{10}]-Antida

[Ac-D-1Nal^{1}, 4Amf(Hor)^{5}, D-4Amf(D-Hor)^{6}, Arg^{8}]-Antida

[PrCbm-D-2Nal^{1}, 4Amf(Imz)^{5}, D-4Ahp(EtCbm)^{6},Pro^{9}NHCH_{2}CH_{3}]-Antida

[4Amf(Hor)^{5}, D-Lys(Nic)^{6}, AzaGly^{10}]-Antida

[4Amf(Hor)^{5}, D-Cit^{6}, Har(Et_{2})^{8}]-Antida

[4Aph(Hor)^{5}, D-Lys(Nic)^{6},D-Agl^{10}]-Antida

[4Aph(Hor)^{5}, D-Hci^{6}, Agl(Me)^{10}]-Antida

[4Aph(Hor)^{5}, D-3Pal^{6}, Har^{8}, Agl^{10}]-Antida

[4Aph(Hor)^{5}, D-4Aph(For)^{6}, D-Agl(Me)^{10}]-Antida

[4Aph(Hor)^{5}, D-4Aph(atz)^{6}, Har(Et_{2})^{8}]-Antida

[4Aph(Hor)^{5}, D-4Aph(iprCbm)^{6}, D-Agl^{10}]-Antida

[For-D-1Nal^{1}, 4Amf(Hor)^{5}, D-4Amf(atz)^{6}, Gly^{10}]-Antida

[4Aph(D-Hor)^{5}, D-4Aph(Cbm)^{6}, Ala^{10}-ol]-Antida

Estos péptidos son biopotentes en la inhibición de la secreción de LH.

Ejemplo 8

Usando los procedimientos generales presentados en los Ejemplos de 1 a 5 y en la solicitud de patente en EEUU nº5,491,217, los siguientes péptidos GnRH-antagonistas son también preparados:

[N^{\alpha}Me4Aph(Hor)^{5}, D-4Aph(Cbm)^{6}]-Antida

[N^{\alpha}Me4Aph(Hor)^{5}, D-4Amf(Cbm)^{6}]-Antida

[N^{\alpha}Me4Aph(Hor)^{5}]-Acilina

[N^{\alpha}Me4Aph(D-Hor)^{5}]-Acilina

[D-4FPhe^{2}, N^{\alpha}Me4Aph(Hor)^{5}]-Acilina

[N^{\alpha}Me4Amf(D-Hor)^{5}]-Acilina

[N^{\alpha}Me4Aph(Hor)^{5}, D-4Aph(Hor)^{6}]-Antida

[N^{\alpha}Me4Aph(Hor^{5}), D-4Aph(Hor)^{6}]-Antida

[MeCbm-D-2Nal^{1},N^{\alpha}Me4Aph(Hor)^{5}]-Acilina

[N^{\alpha}Me4Aph(Hor)^{5}, D-3Pal^{6}]-Antida

[N^{\alpha}Me4Aph(Cbm)^{5}, D-4Aph(Cbm)^{6}]-Antida

[N^{\alpha}Me4Aph(MeCbm)^{5}, D-4Aph(MeCbm)^{6}]-Antida

[N^{\alpha}Me4Aph(Hor)^{5}, D-4Amf(Cbm)^{6}, Ala^{10}-ol]-Antida

[N^{\alpha}Me4Aph(Hor), D-4Aph(Cbm)^{6}, D-Ala^{10}-ol]-Antida

[N^{\alpha}Me4Aph(Hor), D-4Aph(Cbm)^{6}, Ala^{10}-ol]-Antida

[N^{\alpha}Me4Aph(Hor)^{5}, D-Cit^{6}]-Antida

[N^{\alpha}Me4Aph(Hor)^{5}, D-Lys(Nic)^{6}]-Antida

[N^{\alpha}Me4Aph(D/L-Imz)^{5}]-Acilina

[N^{\alpha}Me4Aph(L-Imz)^{5}]-Acilina

[N^{\alpha}Me4Aph(D-Imz)^{5}]-Acilina

[N^{\alpha}Me4Aph(L-Imz)^{5}, D-4Amf(Cbm)^{6}]-Acilina

[N^{\alpha}Me4Aph(Hor)^{5}, D-4Amf(Cbm)^{6}]-Antida

[N^{\alpha}Me4Aph(Hor)^{5}, D-4Amf(Ac)^{6}]-Antida

[N^{\alpha}Me4Aph(Hor)^{5}, D-4Amf(Cbm)^{6}, D-Ala^{10}-ol]-Antida

[N^{\alpha}Me4Aph(D-Hor)^{5}, D-4Amf(Cbm)^{6}]-Antida

[N^{\alpha}Me4Aph(D-Hor)^{5}, D-4Amf(Ac)^{6}]-Antida

[N^{\alpha}Me4Amf(Hor)^{5}, D-4Amf(Ac)^{6}]-Antida

[N^{\alpha}Me4Amf(Hor)^{5}, D-4Amf(Cbm)^{6}]-Antida

[N^{\alpha}Me4Amf(Hor)^{5}, D-4Amf(MeCbm)^{6}]-Antida

[N^{\alpha}Me4Amf(D-Hor)^{5}, D-4Amf(Ac)^{6}]-Antida

Estos péptidos son biopotentes en la inhibición de la secreción de LH y tienen una muy buena solubilidad en agua a pH fisiológico.

Los compuestos precedentes que fueron probados mostraron potencia biológica en la supresión de LH en un grado al menos comparable de forma general al correspondiente péptido GnRH-agonista conocido como Antida, del cual se consideran que son análogos. Como resultado de extensas pruebas en esta área a lo largo de una década, la biopotencia determinada en estos ampliamente aceptados ensayos de medida de la supresión de la secreción de LH, ha sido aceptada como evidencia de la habilidad de estos compuestos para suprimir la secreción de gonadotropina y por tanto de exhibir efectos antigonádales anti-ovulatorios útiles. Basados en la superior solubilidad, la resistencia a la gelatización in vivo, la prolongada duración de bioactividad y otras propiedades, se considera que estos compuestos son de utilidad general como agentes antigonodales para suprimir la secreción de gonadotropinas e inhibir la liberación de esteroides por las gónadas, por ejemplo, como agentes anti-ovulatorios.

Los compuestos de la invención son a menudo administrados en forma de sales farmacéuticamente aceptables, no-tóxicas, tales como sales ácidas de adición, o de complejos metálicos; acetatos y pamoatos, la sal del ácido pamoico, pueden ser preferidos. Si el principio activo es para ser administrado en forma de comprimido, el comprimido puede contener un diluyente farmacéuticamente aceptable no-tóxico que incluye un agragante, tal como tragacant, almidón de maíz o gelatina; un agente desintegrante tal como el ácido algínico y un lubricante tal como estearato de magnesio. Se puede efectuar la administración intravenosa en solución salina isotónica, en una solución tampón de fosfato o parecidos.

Las composiciones farmacéuticas normalmente contendrán una cantidad efectiva del péptido junto con un portador o un diluyente convencionales, farmacéuticamente aceptables. Usualmente, la dosis serán desde aproximadamente 10 microgramos a aproximadamente 2.5 miligramos del péptido por kilogramo de peso corporal del huesped cuando es administrada en forma intravenosa. La naturaleza de estos compuestos permite administración oral efectiva; sin embargo, las dosis orales podrían ser más altas. En definitiva, el tratamiento de individuos con estos péptidos es generalmente llevado a cabo de la misma manera que un tratamiento clínico usando otros GnRH-antagonistas, usando un portador adecuado en el cual el compuesto es soluble y administrando una dosis suficiente para suprimir los niveles de LH y FSH en el paciente.

Puede ser también deseable proporcionar el análogo de GnRH por un período de tiempo prolongado, por ejemplo, por períodos de una semana a un año pudiendo utilizarse formas desde una administración única, de liberación lenta, depot o dosis de implante.

Estos compuestos pueden ser administrados a mamíferos en forma intravenosa, subcutánea, intramuscular, oral, percutánea, intranasal, intrapulmonar, intrarectal o intravaginal para conseguir inhibición y/o control de la fertilidad, y también en aplicaciones que requieren la supresión reversible de actividad gonodal, tales como el manejo de la pubertad precoz, o durante radiao o quimioterapia. Son también útiles para el tratamiento de tumores esteroide-dependientes. La dosis efectiva variará con la forma de administración y la especie particular de mamífero tratado. Alguno de estos compuestos tiene solubilidades tan altas como 50 mg/ml, y comúnmente pueden ser usados como soluciones de 5-10 mg/ml a pH 5.4. Un ejemplo de una típica forma de dosificación es una solución de agua bacteriostática en un pH aproximado de 6 conteniendo el péptido, que es administrada parenteralmente para suministrar una dosis en el rango de aproximadamente 0.1 a 2.5 mg/kg de peso corporal por día. Se considera que estos compuestos están bien tolerados in vivo y son resistentes a la gelatización; consecuentemente, se consideran particularmente adecuados para la administración por inyección subcutánea en una solución de agua bacteriostática de aproximadamente 5% de mannitol a un pH de aproximadamente 4.9, en concentraciones apropiadas, por encima de aproximadamente 0.75 mg/ml e incluso por encima de aproximadamente 1.0 mg/ml, sin peligro de gelatización en el punto de inyección.

Estos péptidos GnRH-antagonistas son también útiles para el diagnóstico, ambos, in vivo e in vitro. Estos péptidos pueden ser inyectados in vivo seguidos por un ensayos del flujo sanguíneo del paciente para determinar el grado de disminución de secreción hormonal, por ejemplo, de la secreción de LH. Ensayos in vitro pueden ser llevados a cabo para determinar si ciertas células tumorales son sensibles al GnRH. En tales ensayos, cultivos de células tumorales son tratados con péptidos GnRH-antagonistas y después controlados respecto a la secreción hormonal y la proliferación celular.

Aunque la invención ha sido descrita en referencia a sus realizaciones preferidas, se debería entender que se pueden hacer cambios y modificaciones que fuesen obvios para aquellos con una habilidad ordinaria en este campo sin desviarse del alcance de la invención, el cual se presenta en las reivindicaciones adjuntas aquí. Mientras que el extremo N-terminal puede dejarse no sustituído u otros grupos acilantes equivalentes pueden ser usados, tanto acetil o carbamoíl sustituido o no sustituido es preferido. En lugar de Aph o D-Aph, Ahp o D-Ahp pueden ser usados en las posiciones 5- y 6- respectivamente. En lugar de Aph(Ac), el grupo aminoPhe puede ser tratado con agentes acilantes alternativos como se describe en la Patente U.S. Nº 5,506,207, tales como ácido fórmico, \beta-Ala(atz) y ácido \gamma-aminobutírico(atz), los cuáles análogamente resultan en GnRH-antagonistas que presentan una acción de larga duración; por lo tanto, los restos resultantes son consideradas equivalentes de D- y L-4Aph(Ac). Ambos, Lys(Bu) y Lys(Et_{2}) son considerados equivalentes de Ilys; no obstante, Ilys es más preferido. Otros restos de aminoácidos hidrofóbicos puede también ser empleados en la posición 1- y en la posición 6- (como se mencionó aquí anteriormente), preferentemente en forma isomérica D, y se consideran equivalentes de aquellos especificados.

Claims

1. Un péptido GnRH-antagonista de fórmula

X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa_{5}-Xaa_{6}-Leu-Xaa_{8}-Pro-Xaa_{10}

y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo en donde:

X es un grupo acilo conteniendo no más de 7 átomos de carbono o Q,

siendo Q:

\hskip0.5cm

---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- NHR,

y R siendo H o un alquilo inferior;

A es 4Cl, 4F, 4Br, 4NO_{2}, 4CH_{3}, 4OCH_{3}, 3,4Cl_{2}, o C^{\alpha}Me4Cl;

Xaa_{5} es Aph(Q_{1}) o Amf(Q_{1}) con Q_{1} siendo

6

\vskip1.000000\baselineskip

Xaa_{6} es D-Aph(Q_{2}), D-Amf(Q_{2}), D-Lys(Nic), D-Cit, D-Hci o D-Pal, con Q_{2} siendo For, Ac, 3-amino-1,2,4-triazol, Q o Q_{1};

Xaa_{8} es Lys(ipr), Arg, Har, Arg(Et_{2}) o Har(Et_{2}); y

Xaa_{10} es D-Ala-NH_{2}, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH_{2}CH_{3}, Gly-NH_{2}, Ala-NH_{2}, AzaGly-NH_{2}, Agl-NH_{2}, D-Agl-NH_{2}, Agl(Me)-NH_{2} o D-Agl(Me)-NH_{2}, siempre que sin embargo el grupo \alpha-amino de Xaa_{5} opcionalmente pueda estar metilado; siempre que adicionalmente cuando Xaa_{6} contenga D- o L-Hor, o D- o L-Imz, Xaa_{5} pueda tener Ac, For o 3-amino-1,2,4-triazol como Q_{1} y que cuando Xaa_{6} contenga Q, Xaa_{5} también contenga Q.

2. Un péptido GnRH-antagonista de acuerdo con la reivindicación 1 en donde X, A y Xaa_{8} son como se definen en la reivindicación 1;

Q es carbamoilo o metilcarbamoilo;

D-Pal es D-3Pal;

Xaa_{5} es 4Aph(Q_{1}) o 4Amf(Q_{1}) con Q_{1} siendo

7

\vskip1.000000\baselineskip

Xaa_{6} es D-4Aph(Q_{2}), D-4Amf(Q_{2}), con Q_{2} siendo Q o D- o L-Hor, o D- o L-Imz; siempre que cuando Q_{2} es Q, Q_{1} también puede ser Q, y

Xaa_{10} es D-Ala-NH_{2}, D-Ala-ol o Ala-ol.

3. Un GnRH-antagonista de acuerdo con ya sea la reivindicación 1 o la 2 en donde Q_{1} es L-Hor o D-Hor.

4. Un GnRH-antagonista de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3 en donde X es Ac, Xaa_{8} es Lys(ipr) y Xaa_{10} es D-Ala-NH_{2}.

5. Un GnRH-antagonista de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4 donde Xaa_{6} es D-4Aph(D-Hor).

6. Un GnRH-antagonista de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1-4 en donde Xaa_{5} es 4Aph(L- o D-Hor) y Q_{2} es Q y R es H o metilo.

7. Un GnRH-antagonista de acuerdo con la reivindicación 1 en donde Xaa_{5} es 4Aph(L- o D-Hor) y Xaa_{6} es D-4Aph(Ac), D-4Aph(atz) o D-3Pal.

8. Un GnRH-antagonista de acuerdo con la reivindicación 1 en donde Xaa_{5} es 4Aph(L- o D-Hor) y Xaa_{6} es D-Cit o D-Hci.

9. Un péptido GnRH-antagonista de acuerdo con la reivindicación 1 en donde:

X es For, Ac, Acr, Pn, By, Vl, Vac, Bz o Q con Q estando definido como en la reivindicación 1;

A es 4Cl o 4F;

D-Pal es D-3Pal;

Xaa_{5} es Aph(Q_{1}) o Amf(Q_{1}) con Q_{1} siendo un isómero D-, un isómero L-, o una mezcla de isómeros D/L de ya sea Hor o Imz;

Xaa_{6} es D-Aph(Q_{2}), D-Amf(Q_{2}), D-Cit, D-Lys(Nic) o D-Pal, con Q_{2} siendo For, Ac, Q o Q_{1};

Xaa_{8} es Lys(ipr); y

Xaa_{10} es D-Ala-NH_{2}, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH_{2}CH_{3} o Gly-NH_{2}.

10. Un GnRH-antagonista de acuerdo con la reivindicación 9 en donde Q_{1} es L- o D-Hor y Xaa_{6} es D-4Amf(Q), con R siendo H o metilo.

11. Un péptido GnRH-antagonista de acuerdo con la reivindicación 9 en donde X es Ac, o Q; R es H o metilo; Xaa_{6} es D-4Aph(Q_{2}), D-4Amf(Q_{2}) o D-3Pal, con Q_{2} siendo Ac Q o Q_{1}; y Xaa_{10} es D-Ala-NH_{2}.

12. Un GnRH-antagonista de acuerdo con la reivindicación 1 teniendo la fórmula: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-Xaa_{6}-Leu-Lys(ipr)-Pro-Xaa_{10}, en donde Xaa_{6} es D-4Aph(Ac), D-3Pal, D-4Aph(carbamoilo), D-4Amf(carbamoilo), D-4Amf(metilcarbamoilo) o D-4Aph(D-Hor) y Xaa_{10} es D-Ala-NH_{2}, D-Ala-ol o Ala-ol.

13. Un GnRH-antagonista de acuerdo con la reivindicación 12, en donde Xaa_{6} es D-4Aph(Ac) o D-4Aph(carbamoilo) o D-4Amf(carbamoilo).

14. Un GnRH-antagonista de acuerdo con la reivindicación 12, teniendo la fórmula: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(carbamoilo)-Leu-Lys(ipr)-Pro-D-Ala-NH_{2}.

15. Una composición farmacéutica para inhibir la secreción de gonadotropinas en mamíferos que comprende, como un ingrediente activo, una cantidad efectiva de un GnRH-antagonista de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 14 en asociación con un diluyente no tóxico.

16. Un intermedio para hacer un péptido GnRH-antagonista que tiene la fórmula:

en donde:

X^{1} es un grupo \alpha-amino-protector;

A es 4Cl o 4F;

X^{2} es H o un grupo protector de hidroxilo;

\newpage

Xaa_{5} es Aph(Q_{1}) o Amf(Q_{1}) con Q_{1} siendo un isómero D-, un isómero L- o una mezcla de isómeros D/L- de ya sea

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Xaa_{6} es D-Aph(Q_{2}), D-Amf(Q_{2}) o D-Pal, con Q_{2} siendo Ac, Q_{1}, carbamoilo o metilcarbamoilo;

X^{4} es un grupo protector del grupo amino lábil en ácido; y

X^{5} es un soporte resínico D-Ala-, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl-, Agl(Me)- o D-Agl(Me)-; soporte resínico N(Et)-; una amida de D-Ala, Gly o Ala; etilamida; AzaGly-NH_{2}; u OH-, siempre que sin embargo el grupo \alpha-amino de Xaa_{5} pueda estar opcionalmente metilado.