ES2617336T3 - Procedimiento para la fabricación de degarelix y sus productos intermedios - Google Patents

Abstract

Procedimiento en fase líquida para preparar degarelix que tiene la fórmula Ac-AA1-AA10-NH2:**Fórmula** una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo; que comprende la etapa de acoplar (P4)Ac-AA1-AA4 con (Pε)AA5-AA10NH2 o acoplar Ac-AA1-AA3 con (P4)(Pε)10 AA4-AA10NH2 en un disolvente orgánico que comprende los dos péptidos, un reactivo de acoplamiento de péptidos y una base de amina orgánica disueltos en el mismo en el que Pε es un grupo protector de ε-amino y P4 es un grupo protector de hidroxilo o hidrógeno, en el que el agente de acoplamiento de péptidos en el caso de acoplar (P4)Ac-AA1-AA4 con (Pε)AA5-AA10NH2 se selecciona de uno o más de hexafluorofosfato de o-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU) y hexafluorofosfato de 2-(benzotriazol-1-il)oxi-1,3-dimetilimidazolidinio (BOP), y estando los péptidos representados a continuación:**Fórmula** para proporcionar un precursor de degarelix protegido que tiene la fórmula (P4)(Pε)AC-AA1-AA10-NH2: **Fórmula** y que comprende la etapa de escindir el grupo protector de ε-amino Pε de un precursor de degarelix según la fórmula (P4)(Pε)Ac-AA1-AA10-NH2 en un disolvente orgánico que comprende el precursor y un agente de escisión disueltos en el mismo para proporcionar degarelix.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para la fabricacion de degarelix y sus productos intermedios [Campo tecnico]

La presente invencion se refiere a un procedimiento de fabricacion en fase Ifquida (o de disolucion) para preparar el decapeptido degarelix, su precursor protegido con amino, y otros productos intermedios utiles. La invencion se refiere ademas a polipeptidos utiles en el procedimiento de fabricacion en fase de disolucion y a la purificacion del propio degarelix.

[Antecedentes de la invencion]

El cancer de prostata es una causa principal de morbimortalidad en hombres en el mundo industrializado. Degarelix, tambien conocido como FE200486, es un antagonista del receptor de la hormona de liberacion de gonadotropina (GnRH) de tercera generacion (un bloqueante de GnRH) que se ha desarrollado y aprobado recientemente para pacientes con cancer de prostata que necesitan terapia de ablacion de androgenos (Doehn et al., Drugs 2006, vol. 9, n.° 8, pags. 565-571; documento WO 09846634). Degarelix actua mediante el bloqueo inmediato y competitivo de receptores de GnRH en la hipofisis y, como otros antagonistas de GnRH, no provoca una estimulacion inicial de produccion de hormona luteinizante a traves del eje hipotalamo-pituitaria-gonada y, por tanto, no provoca aumento de testosterona ni crisis clmica (Van Poppel, Cancer Management and Research, 2010:2 39-52; Van Poppel et al., Urology, 2008, 71(6), 1001-1006); James, E.F. et al., Drugs, 2009, 69(14), 1967-1976).

Degarelix es un decapeptido lineal sintetico que contiene siete aminoacidos no naturales, cinco de los cuales son D- aminoacidos. Tiene diez centros quirales en la estructura principal del decapeptido. El residuo de aminoacido en la posicion 5 en la secuencia tiene un centro quiral adicional en la sustitucion de cadena quiral que da once centros quirales en total. Su numero de registro CAS es 214766-78-6 (de base libre) y esta disponible comercialmente con la marca registrada Firmagon™. El principio activo se denomina qmmicamente D-alaninamida, N-acetil-3-(2-naftalenil)- D-alanil-4-cloro-D-fenilalanil-3-(3-piridinil)-D-alanil-L-seril-4-[[[(4S)-hexahidro-2,6-dioxo-4-pirimidinil]carbonil]amino]-L- fenilalanil-4-[(aminocarbonil)amino]-D-fenilalanil-L-leucil-N6-(1-metiletil)-L-lisil-L-prolil- y se representa mediante la estructura qmmica a continuacion:

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La estructura de degarelix tambien puede representarse como:

Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2

en la que Ac es acetilo, 2Nal es 2-naftilalanina, 4Cpa es 4-clorofenilalanina, 3Pal es 3-piridilalanina, Ser es serina, 4Aph es 4-aminofenilalanina, Hor es hidroorotilo, Cbm es carbamoMo, Leu es leucina, Lys(iPr) es N6-isopropilisina, Pro es prolina y Ala es alanina.

Con el fin de describir esta invencion, a cada aminoacido en degarelix se le dara la notacion abreviada tal como sigue:

AA1 es D-2Nal, AA2 es D-4Cpa, AA3 es D-3Pal, AA4 es Ser, AA5 es 4Aph(L-Hor), AA6 es D-Aph(Cbm), AA7 es Leu, AAs es Lys(iPr), AAg es Pro y AA10 es D-Ala.

Por tanto, como ejemplo, el degarelix puede representarse como Ac-AA1-AA10-NH2, el tetrapeptido Ac-D-2Nal-D- 4Cpa-D-3Pal-Ser puede representarse como Ac-AA1-AA4 y el hexapeptido 4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)- Pro-D-Ala-NH2 como AA5-AA10-NH2.

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El degarelix se ha preparado previamente usando la metodologfa de smtesis de peptidos en fase solida (SPPS) con Boc tal como se notifico en el documento WO 98/46634 y Jiang et al., J. Med. Chem. 2001, 44, 453-467. Basicamente, D-Ala protegida con Boc se acopla en primer lugar a una resina de MBHA en dimetilformamida (DMF)/CH2Cl2 usando diisopropilcarbodiimida (DIC) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) como agentes de activacion de acoplamiento. Una vez que se ha acoplado la D-Ala a la resina, la smtesis continua lavando, desbloqueando y luego acoplando el siguiente residuo de aminoacido hasta que se ha completado el decapeptido. Los grupos amino primarios de cadena lateral de 4Aph en la posicion 5 y de D-4Aph en la posicion 6 se protegen con Fmoc cuando se anaden y se modifican con L-Hor y Cbm respectivamente, antes de que se anada el siguiente aminoacido en la cadena. Esto requiere las etapas adicionales de retirar, en primer lugar, la proteccion de cadena lateral con piperidina, hacer reaccionar el grupo amino recien liberado en la peptido-resina con isocianato de terc-butilo o acido L-hidroorotico, garantizar que la reaccion esta completa con una prueba de ninhidrina y despues lavar el peptido- resina antes de anadir el siguiente residuo de aminoacido (vease tambien Sorbera et al., Drugs of the Future 2006, vol. 31, n.° 9, pags. 755-766).

Aunque la metodologfa de SPPS con Boc ha proporcionado cantidades suficientes de degarelix hasta ahora, la creciente demanda de este polipeptido significa que se requieren cantidades aun mayores. La SPPS con Boc, que requiere escision de HF, no es adecuada para smtesis industrial a gran escala. En efecto, el documento WO 98/46634 menciona que la SPPS solamente es adecuada para cantidades limitadas de hasta 1 kg, mientras que se prefiere la smtesis de peptidos en disolucion clasica, o la smtesis de peptidos en fase lfquida (LPPS), para cantidades mas grandes de producto. El documento WO 98/46634 no especifica como debe realizarse tal smtesis. Tambien estan los gastos atribuibles al gran exceso de reactivos de acoplamiento, aditivos y aminoacidos requeridos para la SPPS. Aunque se ha notificado la existencia de una smtesis de peptidos en fase lfquida de degarelix [informe de la EMEA: Assessment Report for Firmagon™ (Degarelix): ref. del documento EMEA/CHMP/635761/2008], hasta ahora no se han divulgado publicamente los detalles de un procedimiento de este tipo.

Los documentos WO 97/34923 y WO 99/26964 son publicaciones de solicitud internacional que se refieren a procedimientos en fase lfquida para la preparacion de peptidos biologicamente activos. El documento WO 99/26964 se refiere particularmente a la smtesis en fase lfquida de decapeptidos que tienen actividad como antagonistas de GnRH. El documento WO 99/26964 enumera varias limitaciones inherentes de la metodologfa de SPPS para producir antagonistas de GnRH incluyendo la capacidad limitada de la resina, los grandes excesos de reactivos y aminoacidos requeridos, asf como la necesidad de proteger todas las cadenas laterales reactivas tales como el grupo hidroxilo en Ser, los grupos amino aromaticos en Aph y D-Aph, el grupo g-i-propilamino en Lys(i-Pr).

La publicacion de solicitud internacional n.° WO 99/26964 describe un procedimiento en fase lfquida que implica preparar en primer lugar los fragmentos de peptido centrales de las posiciones 5 y 6 de un decapeptido con las cadenas laterales totalmente elaboradas y despues ensamblar el peptido mediante un patron de ensamblaje de fragmentos “4-2-4”, “3-3-4” o “3-4-3”. Por ejemplo, en la preparacion del antagonista de GnRH, azalina B, se acopla un tetrapeptido con un hexapeptido para formar el decapeptido deseado. Cuando se intenta el mismo patron de ensamblaje de fragmentos para degarelix, se produce racemizacion del aminoacido serina (AA4) que da como resultado aproximadamente el 20 % de impureza de L-Ser. Esta impureza se transmite en el decapeptido final y es diffcil de eliminar. Ademas, cuando se prepara el tetrapeptido AA1-AA4 anadiendo la unidad de Ser al tripeptido AA1- AA3 siguiendo el procedimiento descrito en el documento WO 99/26964, no pudieron eliminarse completamente los iones de tetrabutilamonio de la hidrolisis del grupo ester bendlico durante las operaciones posteriores y se transmitieron hasta el producto final. Ademas, se encontro que en la smtesis de degarelix, el grupo L-hidroorotilo se reordena para dar su analogo hidantoma-acetilo cuando se acopla acido L-dihidroorotico con 4Amp para preparar AA5. Estos y otros problemas con la smtesis en fase de disolucion de degarelix no se han superado y por primera vez se divulga en este documento una nueva smtesis de polipeptido en fase de disolucion de este decapeptido.

[Sumario de la invencion]

Actualmente se han superado los problemas de los metodos de SSPS para preparar degarelix y las desventajas de los metodos de LLPS tal como se describio en los documentos WO 97/34923 y Wo 99/26964 y son el objeto de esta invencion.

En general, esta invencion se refiere a una smtesis en fase lfquida del decapeptido degarelix.

En un aspecto, la invencion se refiere a un procedimiento en fase lfquida para preparar degarelix que tiene la formula Ac-AA1-AA10-NH2:

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o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo;

5 que comprende la etapa de acoplar (P4)Ac-AAi-AA4 con (Pg)AA5-AAioNH2 o acoplar AC-AA1-AA3 con (P4)(Pe)AA4- AA10NH2 en un disolvente organico que comprende los dos peptidos, un reactivo de acoplamiento de peptidos y una base de amina organica disueltos en el mismo, en el que Pe es un grupo protector de g-amino y P4 es un grupo protector de hidroxilo o hidrogeno, en el que el agente de acoplamiento de peptidos en el caso de acoplar (P4)Ac- AA1-AA4 con (Pe)AA5-AAioNH2 se selecciona de uno o mas de hexafluorofosfato de o-(7-azabenzotriazol-1-il)- 10 1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU) y hexafluorofosfato de 2-(benzotriazol-1-il)oxi-1,3-dimetilimidazolidinio (BOP),

y estando los peptidos representados a continuacion:

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y

que comprende la etapa de escindir el grupo protector de e-amino Pe de un precursor de degarelix segun la formula 10 (P4)(Pe)Ac-AA1-AA10-NH2 en un disolvente organico que comprende el precursor y un agente de escision disueltos

en el mismo para proporcionar degarelix.

P4 es un grupo protector de hidroxilo o hidrogeno, preferiblemente, tBu, (yPro) (es decir pseudo-prolina), o hidrogeno. Si P4 es un grupo protector de hidroxilo, el procedimiento tambien comprende la etapa de escindir el 15 grupo protector de hidroxilo P4 del precursor de degarelix. El grupo protector P4 se selecciona preferiblemente de tal manera que esta etapa de escision puede llevarse a cabo simultaneamente con la escision del grupo protector de amino Pe. Este es, por ejemplo, el caso si tanto P4 como Pe son BOC.

Un aspecto adicional se refiere al procedimiento en fase lfquida para preparar un producto intermedio de degarelix 20 que tiene la formula (P4)Ac-AAi-AA4:

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o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo, que comprende la etapa de hidrolizar un compuesto que tiene la formula (P4)Ac-AAi-AA4-R con un hidroxido alcalino, en la que R representa un grupo protector de 5 carboxilo, preferiblemente bencilo o alquilo C1-C4, P4 representa hidrogeno o un grupo protector de hidroxilo:

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y en el que el hidroxido alcalino es LiOH.

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Un aspecto adicional se refiere a un procedimiento para preparar el compuesto (P4)Ac-AAi-AA4-R acoplando Ac- AA1-AA3 con (P4)AA4-R o acoplando Ac-AAi-AA2 con (P4)AA3-AA4-R, estando los peptidos representados a continuacion

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En una cada de las formulas descritas anteriormente, de AAi a AA10, P4 y Ps tiene los mismos significados que en la

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formula II, y R representa un grupo protector de carboxilo, preferiblemente bencilo o alquilo C1-C4.

En un aspecto adicional, el tetrapeptido (P4)Ac-AAi-AA4 no se prepara mediante smtesis en fase lfquida, sino mediante smtesis en fase solida. Esta invencion, por tanto, tambien se refiere a un procedimiento en fase solida para preparar un producto intermedio de degarelix que tiene la formula (P4)Ac-AAi-AA4:

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o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo, que comprende las etapas:

a) hacer reaccionar (PN)AA2 con (P4)AA3-AA4-RESINA para proporcionar (P4,PN)AA2-AA4-RESINA;

b) retirar PN de (P4,PN)AA2-AA4-RESINA para proporcionar (P4)AA2-AA4-RESINA;

c) hacer reaccionar (PN)AAi con (P4)AA2-AA4-RESINA para proporcionar (P4,PN)AAi-AA4-RESINA;

d) si PN no es acetilo, retirar PN de (P4,PN)AAi-AA4-RESINA para proporcionar (P4)AAi-AA4-RESINA y posteriormente acetilar (P4)AAi-AA4-RESINA para proporcionar (P4)Ac-AAi-AA4-RESINA; y

e) escindir (P4)Ac-AAi-AA4-RESINA para proporcionar (P4)Ac-AAi-AA4.

en el que P4 es H o un grupo protector de hidroxilo en AA4, y PN es un grupo protector de amino.

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un procedimiento en fase lfquida para preparar el hexapeptido (Pg)AA5-AAioNH2 que comprende el acoplamiento de (Pg)AA6-AAioNH2 y (Px)AA5, en el que Px es un grupo protector de amino y AA5 a AAio y Pe tienen el mismo significado que anteriormente, para proporcionar (Px)(Pe)AA5-AAioNH2, y la escision de Px con TFA para proporcionar (Pe)AA5-AAioNH2, estando los peptidos representados a continuacion:

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Debe entenderse que en el procedimiento de preparacion de degarelix segun esta invencion, pueden combinarse cualquiera de las etapas de procedimiento anteriores. Por ejemplo, esta invencion tambien realiza un procedimiento en el que (P4)Ac-AAi-AA4 se prepara en primer lugar a partir de (P4)Ac-AAi-AA4-R segun el tercer aspecto de la invencion o segun el quinto aspecto de la invencion antes de acoplarse con (Pe)AA5-AA10-NH para formar el precursor protegido (P4)(Ps)Ac-AAiAAio-NH2 segun el segundo aspecto de la invencion. El precursor (P4)(Pe)Ac- AA1-AA10-NH2 formado por un procedimiento de este tipo puede entonces desprotegerse segun el primer aspecto de la invencion, dando finalmente un unico procedimiento para preparar degarelix que incorpora el primer, segundo y tercero o quinto aspecto de la invencion.

Naturalmente, cualquiera de las etapas de purificacion para degarelix que se describen en el presente documento puede incorporarse en cualquier procedimiento en el que degarelix sea el producto final.

[Figuras]

Figura 1. Preparacion en fase lfquida del tetrapeptido Ac-AAi-AA4.

Figura 2. Preparacion del hexapeptido AA5-AA10NH2 protegido con Pe en el que Pe es Fmoc.

Figura 3. Condensacion de segmentos y desproteccion para producir degarelix.

Figura 4: Preparacion en fase solida del tetrapeptido Ac-AA1-AA4 con un grupo protector de pseudoprolina en AA4.

Figura 5: Preparacion en fase solida del tetrapeptido Ac-AA1-AA4 con un grupo protector de tBu en AA4.

Figura 6: Preparacion en fase solida de AA5-AA7 protegido con BOC.

Figura 7: Preparacion en fase solida de AA8-AA10NH2 protegido con Fmoc.

[Descripcion detallada de la invencion]

La presente invencion se describira ahora en mas detalle.

Desproteccion del precursor de degarelix

En un primer aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento en fase lfquida para preparar degarelix que tiene la formula Ac-AA1-AA1o-NH2 o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo, tal como se describe en las reivindicaciones. El procedimiento comprende la etapa de escindir un grupo protector de e-amino Pe de un precursor de degarelix segun la formula (P4)(Pe)AA1-AA10 en una disolucion organica que comprende el precursor y un agente de escision disueltos en la misma.

En este caso, Pe es cualquier grupo protector de cadena lateral conocido en la tecnica tal como los descritos en E. Gross & J. Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology, vol. 3: Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis (Academic Press, N.Y., 1981). Los ejemplos adecuados incluyen 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), CBZ, y CBZ sustituido, tal como, por ejemplo, p-clorobenciloxicarbonilo, p-6-nitrobenciloxicarbonilo, p- bromobenciloxicarbonilo y p-metoxibenciloxicarbonilo, o-clorobenciloxicarbonilo, 2,4-diclorobenciloxicarbonilo, 2,6-

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diclorobenciloxicarbonilo, y similares; grupos protectores de tipo uretano alifatico, tales como t-butiloxicarbonilo (Boc), t-amiloxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, 2-(p-bifenilil)-isopropiloxicarbonilo, y similares; grupos protectores de tipo cicloalquiluretano, tales como ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo y ciclohexiloxicarbonilo; aliloxicarbonilo (Alloc). Grupos protectores preferidos son Fmoc, Boc y Alloc, siendo Fmoc el mas preferido.

Si se requiere, el grupo hidroxilo de Ser tambien podna protegerse, aunque esto no se prefiere. En este caso, P4 no es hidrogeno, sino un grupo protector de hidroxilo tal como, por ejemplo, un alquilo C4-C6 (por ejemplo, t-butilo, ciclohexilo), tritilo, bencilo, un bencil eter tal como p-metoxibencilo, u otros bencilos sustituidos tales como p- nitrobencilo, p-clorobencilo, o-clorobencilo, 2,6-diclorobencilo, o (yPro), (pseudoprolina). Si Ser se protege, se prefiere particularmente t-butilo, bencilo y 9-fluorenil metil eteres, siendo t-butilo el mas preferido. P4 es H, tBu, o (yPro), preferiblemente tBu o (yPro).

El agente de escision usado para retirar el grupo protector de e-amino o el grupo protector de hidroxilo de Ser depende de la naturaleza del grupo protector y se conoce bien en la tecnica. En una realizacion preferida, se usa el mismo agente de escision para tanto el grupo protector de e-amino como el grupo protector de hidroxilo de Ser, si estuvieran presentes.

Agentes de escision preferidos para el grupo protector de hidroxilo de Ser son:

• acido trifluoroacetico (TFA), HCl, o acido metanosulfonico, particularmente para t-butil eter como grupo protector

• H2/Pd-C, HF, o acido trifluorometano-sulfonico, particularmente para bencil eter como grupo protector, y

• SiCl4/anisol, particularmente para 2-(metilsulfinil)bencil eter como grupo protector;

Agentes de escision preferidos para el grupo protector de e-amino son:

• acido trifluoroacetico (TFA), HCl o acido metanosulfonico, particularmente para carbamatos de t-butilo como grupo protector

• H2/Pd-C, HF, o acido trifluorometano-sulfonico, particularmente para carbamatos de bencilo como grupo protector, y

• piperidina, DBU y DEA, particularmente para Fmoc como grupo protector Los disolventes preferidos incluyen DCM, DMF, NMP, dioxano, EtOH, HF puro y TFA.

Particularmente preferidas son las diferentes condiciones de escision indicadas en la siguiente tabla 1:

Tabla 1: Condiciones de escision

Grupo protector

Grupo protegido Reactivo de escision Disolvente

Abreviatura

Nombre

t-Bu

t-Butil eteres y esteres t- butflicos -OH y -CO2H TFA HCl Acido metanosulfonico DCM Dioxano DCM

Bzl

Bencil eteres y esteres bendlicos -OH y -CO2H H2/Pd-C HF Acido trifluorometano- sulfonico EtOH/agua Puro DCM

MsOb

4-(Metilsulfinil)-bencil eter -OH SiCl4/anisol TFA

Tce

Esteres de 2,2,2- tricloroetilo -CO2H Zn AcOH/H2O

Cbz o Z

Benciloxicarbonilo -NH2 H2/Pd-C HF Acido trifluorometano- sulfonico EtOH/Agua/acido Puro DCM

Boc

Terc-butoxicarbonilo -NH2 TFA HCl Acido metanosulfonico DCM Dioxano DCM

Fmoc

9-Fluorenilmetoxicarbonilo -NH2 piperidina DBU (1,8- diazabiciclo[5.4.0]-undec- DMF DMF

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7-eno) DEA (dietilamina) DMF

Trt

Tritilo (Trt) -OH -NH2 TFA al 1 %-DCM DCM

TBDMS

Terc-butil-dimetil-sililo -OH TFA ACOH-THF-H2O (3:1:1), 18 h TBAF 0,1 M en THF THF

Ciclohexilo (CHX o CHx)

Ciclohexilo -OH HF o TFSMA HF puro o DCM

Troc

2,2,2-Tricloroetoxicarbonilo -NH2 Zn AcOH/H2O

Bibliograffa: Chem. Rev. 2009, 109, 2465-2504 (por Albert Isidro-Llobet et al.)

Normalmente, un agente de escision tal como piperidina se disuelve en un disolvente organico tal como DMF, NMP bajo una atmosfera inerte tal como N2 o argon y se enfna hasta una temperatura de entre -20 y 0 °C, preferiblemente -10 y -2 °C, por ejemplo, aproximadamente -5 °C. Se anade el producto intermedio protegido (Pe)AA1-AA-io y entonces se agita la mezcla de reaccion a una temperatura de entre -20 y 25 °C, preferiblemente -10 y 10 °C y mas preferiblemente 0 y 5 °C. Cuando se ha retirado el grupo protector (preferiblemente el rendimiento es un rendimiento >95 %, lo mas preferiblemente >99 %), el degarelix en bruto puede precipitarse, filtrase y despues lavarse con eter. Por ejemplo, el degarelix en bruto puede precipitarse anadiendolo a eter, tal como metil t-butil eter (MTBE) o DIPE, y agitando durante de 10 a 30 minutos. El precipitado puede lavarse entonces con eter (preferiblemente DIPE). Posteriormente, el solido puede llevarse a, por ejemplo, acetato de etilo y agitarse durante algun tiempo a temperatura ambiente. El solido fino obtenido puede entonces filtrarse, lavarse (por ejemplo, con acetato de etilo) y secarse a vacm.

Se ha encontrado que periodos de reaccion prolongados no son perjudiciales para la calidad de la reaccion y que no se observa un aumento significativo (rendimiento <0,03 % tal como se determina mediante HPLC) en la impureza de hidantoma si se permite que la reaccion continue durante hasta 24 horas. Ademas, particularmente en el caso de piperidina como agente de escision, no se observa impureza de hidantoma si se realiza la reaccion en presencia del 5 % en volumen de agua por volumen de disolvente (por ejemplo, 0,1 ml de agua por 2 ml de disolvente tal como DMF) durante hasta 20 horas. Esto demuestra la robustez de esta reaccion de desproteccion para la LPPS de degarelix.

Acoplamiento 4+6 y acoplamiento 3+7

El procedimiento de la invencion comprende la etapa de acoplar un producto intermedio de tetrapeptido segun la formula (P4)Ac-AA-i-AA4 con un producto intermedio de hexapeptido segun la formula (Pe)AA5-AA-io o la etapa de acoplar un producto intermedio de tripeptido segun la formula Ac-AA1-AA3 con un producto intermedio de heptapeptido segun la formula (P4)(Pe)AA4-AA-io. En cualquier caso, el grupo protector Pe puede ser cualquier grupo protector de e-amino tal como se comento previamente. El grupo hidroxilo de Ser tambien puede protegerse si se requiere (es decir, en este caso, P4 no es hidrogeno, sino un grupo protector de hidroxilo). La reaccion de acoplamiento se realiza en una disolucion organica en la que los dos peptidos, un reactivo de acoplamiento de peptidos y una base de amina organica se disuelven en la misma. Tambien puede estar presente un aditivo de acoplamiento de peptidos.

El disolvente organico, el reactivo de acoplamiento de peptidos, el aditivo de acoplamiento de peptidos y la base de amina organica pueden ser cualquiera de los conocidos en la tecnica de LPPS.

Disolventes organicos tfpicos son THF, NMP (N-metilpirrolidona), DCM, DMF, DMSO, y mezclas de los mismos.

Reactivos de acoplamiento de peptidos tfpicos son uno o mas de hexafluorofosfato de o-(7-azabenzotriazol-1-il)- 1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU), hexafluorofosfato de o-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU), tetrafluoroborato de o-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (TBTU), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi- tris(dimetilamino)fosfonio (BOP), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio (Py-BOP), dicloruro de N,N-bis-(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfonico (BOP-Cl), hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfonio (PYBroP), iso-butilcloroformiato (IBCF), 1,3 diciclohexilcarbodiimida (DCC), 1,3-diisopropil-carbodiimida (DIC), clorhidrato de 1- (dimetilaminapropil)-3-etilcarbadiimida (WSCDI), N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidraquinolina (EEDQ), isopropilcloroformiato (IPCF), tetrafluoroborato de 2-(5-norbornen-2,3-dicarboximido)-1,1,3,3-tetrametiluronio (TNTU), anhudrido de acido propanofosfonico (PPAA) y tetrafluoroborato de 2-succinimido-1,1,3,3-tetrametiluronio (TSTU). Agentes de acoplamiento preferidos son DIC, HATU, HBTU y BOP.

Aditivos de acoplamiento de peptidos tfpicos son 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (HOOBt), 1 -hidroxi- 1H-benzotriazol (HOBt), 6-cloro-HOBt y 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt). Particularmente preferidos son HOBt y

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HOAt.

Bases de amina organicas tipicas son NMM, DIPEA, TE y colidina. Particularmente preferida es DIPEA.

Particularmente preferido es el uso combinado de HATU, HOAt y DIPEA. Otra realizacion preferida se refiere al uso combinado de dIc, 6-cloro-HOBt, opcionalmente en combinacion con sales de cobre.

Sorprendentemente, se ha hallado que la eleccion del disolvente organico, el reactivo/aditivo de acoplamiento de peptidos y la base de amina organica tiene un efecto sobre los rendimientos de los productos deseados y sobre la racemizacion del aminoacido Ser en la estructura principal del polipeptido.

Por ejemplo, aunque THF, NMP, DCM, DMF y mezclas de los mismos pueden usarse como disolventes para estas reacciones de acoplamiento, el uso de DMF, o bien solo o bien en mezcla (por ejemplo, con DCM), aumenta el rendimiento del producto final deseado mientras que al mismo tiempo reduce cualquier impureza de D-Ser. El uso de DMF aumenta aparentemente el rendimiento y reduce impurezas de D-Ser. La activacion es rapida en un disolvente polar tal como DMF pero lenta en un disolvente no polar tal como DCM. La combinacion de HATU/HOAt conduce a un acoplamiento altamente eficaz en parte por la rapida activacion por una base tal como DIEA o NMM seguido de rapido acoplamiento en presencia de la misma base en un disolvente polar como DMF. El efecto de diferentes disolventes se ilustra en la tabla 2.

Tabla 2. Examen de diferentes disolventes durante el acoplamiento de los segmentos AA1-AA4 y AA5-AA10

Entrada

Disolvente Reactivo y aditivo de acoplamiento Rendimiento (%) Pureza por HPLC (%) Comentarios

Producto CDEG-1

Impureza (D-Ser)

1

THF EDC.HCl 35 62,42 16,29 NMM como base; Contenido en CLEU-15 26,5 %

2

NMP EDC.HCl 35 62,42 16,29 NMM como base; Contenido en CLEU-15 0,17 %

3

DCM-DMF EDC.HCl 55 47,81 10,39 Contenido en CLEU-15 25,54 %

4

DMF EDC.HCl 65 72 92 Colidina como base

5

DMF HATU/HOAt 74 84,4 1,91 Se usan 3,0 equiv. de DIEA

6

DMF HATU/HOAt 74 85,3 1,44 Se usan 3,0 equiv. de DIEA

7

DMF HATU/HOAt 87 83,65 1,44 Se usan 3,0 equiv. de DIEA

La eleccion del reactivo y aditivo de acoplamiento tambien tiene un gran efecto sobre el rendimiento y el grado de racemizacion. Se realizaron reacciones de acoplamiento usando HBTU, HCTU, TBTU, BOP y HATU y se hallo que HBTU y HATU daban los mejores rendimientos globales. Sin embargo, se hallo que las reacciones de acoplamiento usando BOP o HATU como reactivo de acoplamiento condudan a mucha menos racemizacion del aminoacido Ser.

La adicion de un aditivo de acoplamiento mejora significativamente el rendimiento del polipeptido deseado. En muchos casos, el aditivo de acoplamiento tambien reduce aun mas el grado de racemizacion del aminoacido Ser, conduciendo por tanto a un producto con menos impurezas. Las combinaciones de reactivo y aditivo de acoplamiento que aumentan el rendimiento son TBTU/HOAt, HATU/HOAt y HATU/HOBt. Sorprendentemente, la combinacion de TBTU/HOAt o HATU/HOAt aumenta el rendimiento mientras que al mismo tiempo reduce la racemizacion, actuando HATU/HOAt mejor de entre todas las combinaciones sometidas a prueba.

El efecto de diferentes agentes y aditivos de acoplamiento se ilustra en las siguientes tablas 3 y 4.

Tabla 3. Examen de diferentes reactivos de acoplamiento para controlar la racemizacion

Entrada

Base Reactivo y aditivo de acoplamiento Rendimiento de CDEG-1 (%) Pureza por HPLC (%) Comentarios

CDEG-1

Impureza (D-Ser)

1

NMM EDC.HCl/HOBt 67 65 20 La racemizacion es mayor

2

NMM EDC.HCl/HOBt 67 65 18,9 La racemizacion es mayor

3

DIEA TBTU 39 67,93 13,34 Permanece el 1,3 % de CLEU-15.

4

DIEA HBTU 53 54,9 20,49 Permanece el 1,9 % de

CLEU-15

5

DIEA EDC.HCl 51 - - Permanece el 68,9 % de CLEU-15.

6

NMM HBTU 78 61,42 15,16 Permanece el 9,8 % de CLEU-15

7

NMM HCTU 60 51,63 15,92 Permanece el 7,32 % de CLEU-15

8

NMM TBTU 53 62,78 14,73 Permanece el 3,75 % de CLEU-15

9

NMM BOP 51 46,3 8,92 Permanece el 11,93 % de CLEU-15

10

NMM HATU 74 65,97 10,62 Permanece el 4,52 % de CLEU-15

11

DIEA TBTU/HOAt 98 76,26 6,8 Permanece el 0,14 % de CLEU-15

12

DIEA DIC/HOAt - 20,49 1,18 Permanece el 45,9 % de CLEU-15

13

DIEA HATU/HOAt 74 83,16 2,9 CLEU-15 sin reaccionar

14

NMM HATU/HOAt 81 64,0 13,32 Permanece el 7,1 % de CLEU-15

15

NMM HATU/HOBt 89 65,0 13,14 Permanece el 4,35 % de CLEU-15

16

NMM EDC.HCl/HOAt 74 70,38 13,66 CLEU-15 sin reaccionar

17

DIEA HATU/HOAt 79 79,79 2,3 Esta reaccion se repitio a mayor escala

18

DIEA TBTU/HOAt 84 75,8 7,2 La reaccion se repitio a mayor escala

19

DIEA HATU/HOAt 74 84,4 1,91 “

20

DIEA HATU/HOAt 74 85,3 1,44 “

21

DIEA HATU/HOAt 87 84 1,44 “

22

DIEA HATU/HOAt 79 84,5 1,37 “

Tabla 4. Examen de diferentes aditivos para controlar la racemizacion durante el acoplamiento de los segmentos AA1-AA4 y AA5-AA10

Entrada

Reactivo de acoplamiento Aditivo Base Rendimiento de CDEG-1 (%) Pureza por HPLC ________(%_______ Comentarios

CDEG-1

Impureza (D-Ser)

1

TBTU HOAt DIEA 98 76,26 6,8 Permanece el 0,14 % de CLEU-15

2

DIC HOAt DIEA - 20,49 1,18 Permanece el 45,9 % de CLEU-15

3

HATU HOAt DIEA 74 83,16 2,9 Finalizacion de la reaccion

4

HATU HOAt NMM 80 64,0 13,32 Permanece el 7,1 % de CLEU-15

5

HATU HOBt NMM 89 65,0 13,14 Permanece el 4,3 % de CLEU-15

6

EDC.HCl HOAt NMM 74 70,38 13,66 CLEU-15 sin reaccionar

7

HATU HOAt DIEA 79 79,79 2,3 Repetir la reaccion.

8

TBTU HOAt DIEA 84 75,8 7,2 Repetir la reaccion

9

HATU HOAt DIEA 74 84,4 1,91 Se usan 3,0 equiv. de base

10

HATU HOAt DIEA 74 65,3 1,44 Se usan 3,0 equiv. de base

11

HATU HOAt DIEA 87 83,65 1,44 Se usan 3,0 equiv. de base

12

EDC.HCl HOBt NMM 67 65 20 La racemizacion es mayor

13

EDC.HCl HOBt NMM 64 65 17,9 La racemizacion es mayor

14

EDC.HCl HOBt NMM 67 65 18,9 La racemizacion es mayor

15

HOSu NMM - - - La reaccion no continuo

La eleccion de base de amina organica tambien afecta a la reaccion. Para la presente invencion, se prefieren NMM y DIEA ya que permiten que se obtenga el polipeptido deseado en los mejores rendimientos. DIEA se prefiere mas

puesto que esta base reduce el grado de racemizacion de Ser. Tambien se ha hallado que la cantidad de base afecta a la reaccion. Cuando se usa una base tal como DIEA, se hallo que cuanta mas base estuviera presente, menor sena el rendimiento y mayor el grado de racemizacion. Por ejemplo, seis equivalentes de base (con respecto a A51-A10) conducen a un aumento de dos veces del producto de racemizacion con respecto a cuando se usan tres 5 equivalentes de base. Por tanto, se prefiere usar 1-5 equivalentes de base, mas preferiblemente 2-4 equivalentes de base y lo mas preferiblemente de 2,5 a 3,5 equivalentes de base en estas reacciones de acoplamiento. El efecto de las diferentes bases y sus cantidades se muestra en las siguientes tablas 5 y 6.

Tabla 5. Examen de diferentes bases para controlar la racemizacion durante el acoplamiento de los segmentos AA1- 10 AA4 y AA5-AA10

Entrada

Reactivo de acoplamiento Aditivo Base Rendimiento de CDEG-1 (%) Pureza por HPLC ________(%)_______ Comentarios

CDEG-1

(D-Ser)

1

TBTU HOAt DIEA 98 76,26 6,8 Permanece el 0,14 % de CLEU-15

2

DIC HOAt DIEA - 20,49 1,18 Permanece el 45,9 % de CLEU-15

3

HATU HOAt DIEA 74 83,16 2,9 No permanece CLEU-15

4

HATU HOAt NMM 80 64,0 13,32 Permanece el 7,1 % de CLEU-15

5

HATU HOBt NMM 89 65,0 13,14 Permanece el 4,35 % de CLEU-15

6

EDC.HCl HOAt NMM 74 70,38 13,66 No permanece CLEU-15

7

HATU HOAt DIEA 79 79,79 2,3

8

TBTU HOAt DIEA 84 75,8 7,2

9

HATU HOAt DIEA 74 84,4 1,91 Se usan 3,0 equiv. de base

10

HATU HOAt DIEA 74 85,3 1,44 Se usan 3,0 equiv. de base

11

HATU HOAt DIEA 87 83,65 1,44 Se usan 3,0 equiv. de base

12

EDC.HCl HOBt Colidina 65 72 9,2

13

EDC.HCl HOBt NMM 67 65 20 La racemizacion es mayor

14

EDC.HCl HOBt NMM 64 65 17,9 La racemizacion es mayor

15

EDC.HCl HOBt NMM 67 65 18,9 La racemizacion es mayor

Tabla 6. Seleccion de equivalencia de base para controlar la racemizacion durante el acoplamiento de los segmentos AA1-AA4 y AA5-AA10 15

Entrada

Cantidad de DIEA (equiv.) Reactivo y aditivo de acoplamiento Rendimiento de CDEG-1 (%) Pureza por HPLC (%)

Producto CDEG-1

Impureza (D-Ser)

1

6,0 HATU/HOAt 62 74,19 1,5

2

5,0 HATU/HOAt 69 79,00 3,88

3

4,5 HATU/HOAt 68 84,12 1,18

4

4,0 HATU/HOAt 70 82,64 1,19

5

3,0 HATU/HOAt 74 84,4 1,91

6

3,0 HATU/HOAt 74 85,3 1,44

7

3,0 HATU/HOAt 87 83,65 1,44

La temperatura a la que se realiza la reaccion de acoplamiento tambien influye en el rendimiento y el grado de racemizacion del producto final. Se hallo que una reaccion que se lleva a cabo a -15 °C produce un mayor rendimiento, pureza mas alta y menor racemizacion del producto final que la reaccion equivalente llevada a cabo a 20 -5 °C. Por tanto, es preferible llevar a cabo estas reacciones de acoplamiento a temperaturas menores de -5 °C,

preferiblemente menores de -10 °C y lo mas preferiblemente a -15 °C o menos. El tiempo de reaccion de estas reacciones de acoplamiento es habitualmente de 2-3 horas.

Debe indicarse que al controlar la temperatura de reaccion y la cantidad de base anadida, tambien es posible reducir 25 cualquier formacion de impureza de hidantoma. El contenido en hidantoma es preferiblemente de menos del 0,5 % en peso, mas preferiblemente menos del 0,3 % en peso. Por tanto, se prefiere usar de 2,5 a 3,5 equivalentes de base a temperaturas de -10 °C o menos en estas reacciones.

Finalmente, el orden de adicion de los diversos reactivos tambien desempena un papel en el rendimiento, la pureza

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y la cantidad de racemizacion finales. Si los peptidos y el aditivo de acoplamiento se disuelven en primer lugar en el disolvente organico antes de que se anadan el reactivo de acoplamiento y la amina organica, el rendimiento global del producto deseado es significativamente mas alto. Ademas, la cantidad de racemizacion se reduce drasticamente.

Fragmento (P4)Ac-AAi-AA4

La presente invencion proporciona diferentes metodos para preparar (P4)Ac-AAi-AA4.

La invencion se refiere a un procedimiento en fase lfquida para preparar un producto intermedio de degarelix que tiene la formula (P4)Ac-AAi-AA4:

imagen12

o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo, en el que P4 es hidrogeno o un grupo protector de hidroxilo, preferiblemente hidrogeno.

Cuando se prepara (P4)Ac-AAi-AA4, se prepara en primer lugar un ester que tiene la formula (P4)Ac-AAi-AA4-R, en la que R es un grupo protector de carboxilo, tal como un grupo bencilo, preferiblemente, sin embargo, un grupo alquilo Ci-C4. Normalmente, se usa un ester bendlico de serina, retirandose entonces el grupo bencilo mediante hidrolisis con hidroxido de tetrabutilamonio (vease, por ejemplo, el documento WO 99/26964). Sin embargo, se hallo que en la preparacion de degarelix, los iones de tetrabutilamonio no se eliminaron completamente durante operaciones posteriores y se transmitfan al producto final. Este problema se supero usando un ester alqrnlico Ci-C4 de serina (por ejemplo, ester metilico de serina). Se hallo que el ester alqrnlico podfa hidrolizarse facilmente usando un hidroxido alcalino que es LiOH. El rendimiento y la calidad del tetrapeptido no resultaron afectados por este cambio y se elimino el problema de los iones de tetrabutilamonio.

Por ejemplo, un compuesto segun la formula (P4)Ac-AAi-AA4-R puede suspenderse en un disolvente organico tal como THF y despues agitarse y enfriarse hasta una temperatura de entre -20 y 5 °C, y mas preferiblemente -5 y 0 °C. Se anade entonces una disolucion acuosa de LiOH a la disolucion enfriada. El LiOH acuoso se anade a una velocidad que mantiene la temperatura de la disolucion enfriada en el intervalo de -5 a 0 °C o inferior. La disolucion (a menudo turbia) se agita durante hasta i2 horas, preferiblemente hasta 3 horas, antes de anadirse, con buena agitacion, a agua con una temperatura de 5 °C o inferior, o preferiblemente una mezcla de hielo y agua. En este punto, cualquier precipitado se elimina mediante filtracion. Despues se ajusta el pH a pH 4,i-4,3, de manera preferible aproximadamente 4,2 usando cualquier agente de ajuste del pH conocido. Se prefiere HCl, por ejemplo, HCl 2 M. El precipitado que se forma tras ajustar el pH se recoge mediante filtracion. El precipitado puede purificarse adicionalmente lavandolo con agua, y/o agitando una suspension del mismo en MeOH a reflujo y/o una mezcla de MeOH/MeCN antes de recogerlo mediante filtracion y despues secandolo para producir (P4)Ac-AAi-AA4.

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un procedimiento para preparar el compuesto (P4)Ac-AAi-AA4-R acoplando Ac-AAi-AA3 con (P4)AA4-R o acoplando Ac-AAi-AA2 con (P4)AA3-AA4-R, en el que R es un alquilo Ci-C4 y P4 es hidrogeno o un grupo protector de hidroxilo, preferiblemente hidrogeno. Para la reaccion de acoplamiento, pueden usarse esencialmente los mismos reactivos y condiciones que los descritos anteriormente.

En un aspecto adicional, esta invencion se refiere a un procedimiento en fase solida para preparar un producto intermedio de degarelix que tiene la formula (P4)Ac-AAi-AA4:

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o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo, que comprende las etapas:

a) hacer reaccionar (PN)AA2 con (P4)AAb-AA4-RESINA para proporcionar (P4,PN)AA2-AA4-RESINA;

b) retirar PN de (P4,PN)AA2-AA4-RESINA para proporcionar (P4)AA2-AA4-RESINA;

c) hacer reaccionar (PN)AA1 con (P4)AA2-AA4-RESINA para proporcionar (P4,PN)AA-i-AA4-RESINA;

d) si PN no es acetilo, retirar PN de (P4,PN)AA-i-AA4-RESINA para proporcionar (P4)AA1-AA4-RESINA y posteriormente acetilar (P4)AA1-AA4-RESINA para proporcionar (P4)Ac-Aa1-AA4-RESINA; y

e) escindir (P4)Ac-AAi-AA4-RESINA para proporcionar (P4)Ac-AAi-AA4.

en el que P4 es H o un grupo protector de hidroxilo en AA4, y PN es un grupo protector de amino.

PN es preferiblemente Fmoc, que se retira preferiblemente con piperidina/NMP.

P4 es preferiblemente tBu o (yPro). Particularmente preferida es la combinacion de (yPro) para P4 y Fmoc para PN.

Cada etapa de acoplamiento se lleva a cabo preferiblemente de manera conocida per se, preferiblemente, sin embargo, usando hAtU (o HBTU) y DIPEA y aditivos de acoplamiento.

El material de partida (P4)AA3-AA4-RESINA puede preparase acoplando (PN, P4)AA3-AA4 a una resina, por ejemplo a una resina de 2-ClTrt, y entonces retirando PN, o acoplando (PN, P4)AA4 para obtener (PN, P4)aA4-rEsiNa, retirando PN, y entonces haciendo reaccionar (PN)AA3 con (P4)AA4-RESINA para proporcionar (PN,P4)AA3-AA4- RESINA, y entonces retirando PN. Esto se ilustra en las figuras 4 y 5.

Las resinas (RESINA) adecuadas incluyen tritilo, 2-ClTrt y SASRIN.

En el caso de que P4 sea (yPro) y PN sea Fmoc, (PN, P4)AA3-AA4 puede prepararse siguiendo J.Am.Chem.Soc. 1996, 118, 9218-9227. Es decir, se activa AA3 protegido con Fmoc; se hace reaccionar con serina o una sal de la misma, y posteriormente se hace reaccionar con acetona o dimeticetal de acetona, tal como se ilustra a continuacion. Fmoc-D3Pal-Ser((yMe,MePro)-OH se prefiere particularmente como (PN, P4)AA3-AA4.

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imagen14

Fragmento (Px)(Ps)AA5-AAiqNH2

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un procedimiento en fase Kquida para preparar el hexapeptido (Pb)AA5-AAiqNH2 que comprende el acoplamiento de (Pe)AA6-AA1oNH y (Px)AA5, en el que Px es un grupo protector de amino y AA5 a AAiq y Pe tienen el mismo significado que antes, para proporcionar (Px)(Ps)AA5-AAiqNH2, y la escision de Px con TFA para proporcionar (Pb)AA5-AAiqNH2.

Un aspecto adicional de la invencion se refiere a un procedimiento en fase Kquida para preparar el hexapeptido (Pb)AA5-AAioNH2 acoplando (P5)AA5-AA7 con (Pb)AA8-AAiqNH2 para proporcionar (P5,Pb)AA5-AAiqNH2, y posteriormente escindiendo P5 para proporcionar (Pb)AA5-AAiqNH2 (en el que P5 es un grupo protector de amino en AA5).

El grupo protector P5 es preferiblemente BOC. Pe es preferiblemente 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La reaccion de acoplamiento se lleva a cabo preferiblemente en presencia de HATU.

(P5)AA5-AA7 y (Pb)AA8-AAioNH2 se sintetizan preferiblemente mediante smtesis de peptidos en fase solida, por ejemplo, tal como se ilustra en las figuras 6 y 7, respectivamente. Se prefieren las siguientes combinaciones de P5 y

Pe:

P5

Pe

Boc

Fmoc

Cbz

Boc

Troc

Boc

Es decir, (P5)AA5-AA7OH puede preparase acoplando AA7 protegido a una resina; retirando el grupo protector (por ejemplo, Fmoc); haciendo reaccionar AA6 protegido con el producto obtenido; retirando el grupo protector (por ejemplo, Fmoc); haciendo reaccionar AA5 protegido (por ejemplo, BOC protegido) con el producto obtenido; y escindiendo la resina. Esto se ilustra en la figura 6.

(Pe)AA8-AAioNH2 puede prepararse acoplando AAiq protegido a una resina, por ejemplo, una resina de amida de Rink; retirando el grupo protector (por ejemplo, Fmoc); haciendo reaccionar AAg protegido con el producto obtenido; retirando el grupo protector (por ejemplo, Fmoc); haciendo reaccionar AA8 protegido (preferiblemente protegido con Boc en el grupo alfa-amino y protegido con Fmoc en la cadena lateral) con el producto obtenido; retirando el grupo protector de alfa-amino; y escindiendo la resina. Esto se ilustra en la figura 7.

(Pe)AA8-AAioNH2 tambien puede prepararse haciendo reaccionar AA10-NH2 con AAg protegido (por ejemplo, con BOC); retirando el grupo protector; haciendo reaccionar AAg-AAioNH2 con AA8 protegido (preferiblemente protegido con Boc en el grupo alfa-amino y protegido con Fmoc en la cadena lateral); y retirando el grupo protector en el grupo

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alfa-amino.

En un aspecto adicional, la divulgacion se refiere a la purificacion de degarelix. La purificacion puede llevarse a cabo de manera conocida por el experto en la tecnica, por ejemplo, mediante cromatograffa preparativa.

Por ejemplo, se logra la primera purificacion de degarelix con una fase estacionaria de PLRP-S, pH 2,25 usando TEAP como tampon y MeCN (75:25) como fase movil. Puede obtenerse una pureza de hasta el 95 % con esta etapa. Si se requiriese, puede llevarse a cabo una segunda purificacion usando una combinacion de columnas C8 y C18 (por ejemplo, Zorbax) para lograr una pureza del 99 % y superior.

Ejemplos

Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren un procedimiento para la smtesis LPPS de degarelix. Se hace referencia a las figuras 1 y 2 para comprobar las estructuras de cada peptido y polipeptido descrito en el presente documento.

CLEU-2:

Se disolvio L-Cbz-prolina (50,0 g) en 2-propanol (500 ml s 10 V) y se enfrio la disolucion hasta 15 °C. Se anadio entonces N-metilmorfolina (25 ml s 0,5 V) lentamente. Tras agitar la disolucion durante 15 minutos, se anadieron 28,49 g (1,04 equiv.) de cloroformiato de iso-butilo gota a gota a -15 °C. Se anadio una disolucion de D-ala-NH2.HCl (27,48 g, 1,1 equiv.) y NMM (25 ml s 0,5 V) en agua (250 ml s 5 V) a la mezcla de reaccion a -15 °C. Se agito la mezcla durante 30 minutos a la misma temperatura y despues se calento hasta 25 °C y se agito durante 3-5 h. Se extinguio la mezcla de reaccion anadiendo acetato de etilo (1000 ml s 20 V) y agua (10 V) que contema NaCl (25 g) y NaHCO3 (25 g). Se separaron las fases organicas, se lavaron con agua (2 x 500 ml s 10 V) y entonces se secaron sobre sulfato de sodio. Se concentro la fase organica hasta 4 volumenes a vado por debajo de 40 °C. Se diluyo la disolucion con acetato de etilo (250 ml s 5 V) y se anadio n-hexano (375 ml s 7,5 V) gota a gota para obtener un solido blanco. Se separo por filtracion el solido y se seco para proporcionar el producto.

Produccion: 35,2 g; Rendimiento: 54,7 %; [a]25D: -13,0° [CHCls, Informe de bibliograffa: -11,2° (US 5,710, 246)]). Pureza por HPLC: 99,44 %

CLEU-4:

Se llevo CLEU-2 (19,5 g) a 2-propanol (129 ml s 6,5 V) en un matraz de hidrogenacion de Parr y se anadio una disolucion de acido p-toluenosulfonico en agua (20 ml s 1,0 V) al mismo. Se anadio Pd/C al 10 % (el 5 % en p/p) a la mezcla de reaccion y entonces se hidrogeno la mezcla a 40 psi (275,79 kPa) durante 2 h. Cuando la CCF mostro la desaparicion del material de partida, se filtro el catalizador y se lavo con 2-propanol (79 ml s 4 V) y agua (8,75 ml s 0,5 V). Se concentro el filtrado a vacfo y se separo con acetonitrilo (4 x 254 ml s 13 V). Se llevo el residuo a un matraz y se anadio acetonitrilo (215 ml s 11 V) seguido de Boc-Lys(Cbz)-OH (25,5 g s 1,1 equiv.) y HOBt (9,9 g s 1,2 equiv.). Se enfrio la suspension hasta -5 °C y se anadio NMM (14,95 g s 2,45 equiv.) lentamente. Finalmente, se anadio una disolucion de EDC.HCl (15,3 g s 1,3 equiv.) en acetonitrilo (120 ml s 6 V). Entonces se calento la mezcla de reaccion hasta 25 °C y se agito durante 10-12 h a la misma temperatura. Se retiro el disolvente a vacfo por debajo de 40 °C y se diluyo con agua (120 ml s 6 V). Se extrajo el producto con acetato de etilo (878 ml s 45 V), agua (120 ml s 6 V), y carbonato de sodio al 10 % (110 ml s 5,7 V). Se extrajo la fase acuosa con acetato de etilo (2 x 430 ml s 2 x 22 V) y se combinaron las fases organicas y se lavaron con disolucion de acido cftrico al 10 % (2 x 105 ml), disolucion de carbonato de sodio al 10 % (2 x 110 ml s 2 x 5 V ), agua (120 ml s 6 V) y se secaron sobre sulfato de sodio. Se concentro la fase organica hasta 10-12 volumenes a vacfo por debajo de 40 °C, se separo con acetato de etilo (3 x 20 V) y se mantuvieron los 10-12 volumenes finales en cada separacion. Se anadio N-hexano (14 V) gota a gota a la masa concentrada para obtener un solido blanco. Se separo por filtracion el solido y se seco para proporcionar el producto.

Produccion: 29,2 g; Rendimiento: 86,6 %; Pureza 99,18 %, [a]26D: -26,0° (c 1, CHCh)

CLEU-5:

Se llevo CLEU-4 (16,3 g) a una mezcla de metanol (163 ml s 10 V), acetona (22 ml s 1,4 V) en un matraz de hidrogenacion de acero inoxidable de Parr. Se anadio Pd/C al 10 % (el 10 % en p/p) y se hidrogeno la mezcla (60 psi (413,69 kPa)) durante 8-12 h a 25 °C. Una vez que el material de partida habfa desaparecido (CCF), se filtro el catalizador a traves de Celite y se lavo con metanol (163 ml s 10 V). Se concentro el filtrado a vacfo por debajo de 40 °C y se separo el residuo con acetato de etilo (3 x 143 ml s 3 x 9 V). Entonces el residuo se llevo a acetato de etilo (51 ml s 3 V) y se anadio n-hexano (20,4 ml s 1,25 V). Se agito la mezcla durante 2-3 h para obtener un solido libre. Se separo por filtracion el solido, se lavo con n-hexano (38 ml s 2 V), y se seco a vacfo por debajo de 40 °C.

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Produccion: 12,3 g; Rendimiento: 90,8 %; Pureza: 98,9 %

CLEU-6:

Se anadio CLEU-5 (12,2 g) a THF (40 ml s 3,3 V) y se enfrio la mezcla hasta 0 °C. Se anadio disolucion de carbonato de sodio al 10 % (34 ml s 2,7 V) a la mezcla durante 20 minutos. Se anadio entonces Fmoc-Cl (8,63 g s 1,2 equiv.) en THF (12,2 ml s 1,0 V) lentamente durante 15-20 minutos a 0 °C. Se agito la mezcla de reaccion durante 1 ha la misma temperatura y se diluyo con agua (134,2 ml s 11 V). Se extrajo el producto con acetato de etilo (269 ml s 22 V). Se lavo la fase organica con agua (134,2 ml s 11 V), disolucion de acido cftrico al 10 % (2 x 134 ml s 2 x 11 V) y agua (134,2 ml s 11 V). Se concentro la fase organica a vado por debajo de 40 °C y se purifico el producto en bruto mediante cromatograffa en columna.

Produccion: 13,3 g; Rendimiento: 73,2 %; Pureza: 98,2 %

CLEU-7:

Se cargo CLEU-6 (9,0 g) en una disolucion de TFA (61 ml s 6,75 V) y m-cresol (0,61 ml) a -5 °C. Se agito la mezcla de reaccion durante 2 h a 0 °C y entonces se concentro a vado por debajo de 35 °C. Se eliminaron trazas de TFA mediante destilacion conjunta con tolueno (2 x 45 ml). Se cristalizo el producto en una mezcla de MTBE (9 ml s 1 V), y DIPE (90 ml s 10 V). Se separo por filtracion el solido bajo nitrogeno, se lavo con DIPE (180 ml s 20 V) y se seco a vado para obtener CLEU-7 puro.

Produccion: 8,8 g; Rendimiento: 90,4 %; Pureza: 98,3 %.

Comentario: el material de CLEU-7 es de naturaleza higroscopica y, por tanto, debe manejarse con cuidado.

CLEU-8:

Se llevo CLEU-7 (8,5 g) a acetonitrilo (85 ml s 10 V). Se anadieron Boc-Leu-OH (3,12 g s 1,1, equiv.), HOBt (2,31 g s 1,39 equiv.) y NMM (1,4 ml s 1,03 equiv.) a la disolucion. Se enfrio la disolucion hasta -2 °C y se trato con NMM (1,4 m s 1,03 equiv.) y EDC.HCl (2,58 g s 1,1 equiv.). Se agito la mezcla de reaccion durante 2-3 h a 0 °C y se retiro el disolvente mediante destilacion a vado. Se anadieron acido cftrico al 10 % (85 ml s 10 V) y acetato de etilo (213 ml s 25 V) al residuo. Se separo la fase organica y se lavo con disolucion de acido cftrico al 10 % (2 x 85 ml s 2 x

10.0 V), agua desmineralizada (85 ml s 10 V), y disolucion de bicarbonato de sodio al 5 % (3 x 85 ml s 3 x 10,0 V) y de nuevo con agua desmineralizada (85 ml s 10 V). Finalmente, se seco la fase organica sobre sulfato de sodio y se concentro a vado por debajo de 35 °C para obtener el producto en bruto. Se cristalizo el producto en bruto en MTBE (68 ml x 8 V) y n-hexano (34 ml s 4 V). Se seco el solido a vado por debajo de 35 °C.

Produccion: 7,8 g; Rendimiento: 81,2 %; Pureza: 97,5 %.

CLEU-9:

Se cargo CLEU-8 (7,5 g) en una disolucion de TFA (54 ml s 7,2 V) y m-cresol (0,2.7 ml) a -5 °C. Se agito la mezcla de reaccion durante 2,0 h a 0 °C y entonces se concentro a vado por debajo de 35 °C. Se eliminaron trazas de TFA mediante destilacion conjunta con tolueno (2 x 38 ml, se cristalizo el producto en MTBE (75 ml s 10 V) y n-hexano (413 ml s 15 V). Se separo por filtracion el solido bajo nitrogeno, se lavo con n-hexano (37,5 ml s 5 V), y se seco a vado para producir CLEU-9 puro.

Produccion: 7,2 g; Rendimiento: 94,8 %; Pureza: 97,2 %

CLEU-12:

Se llevo CLEU-9 (10,5 g) a acetonitrilo (158 ml s 15 V) bajo atmosfera de nitrogeno. Se anadieron CMAP-5A (4,2 g s

1.0 equiv.), HOBt (2,11 g s 1,2 equiv.) en la suspension y se enfrio la mezcla hasta 0 °C. Se anadio EDC.HCl (2,73 g s 1,1 equiv.) en la suspension seguido de adicion lenta de NMM (1,38 g s 1,05 equiv.). Se agito la mezcla de reaccion durante 0,5 h a 0 °C, se calento hasta condiciones ambientales y entonces se continuo la agitacion durante 3 h. Se retiro el disolvente a vado por debajo de 35 °C y se llevo el residuo a una mezcla de acido cftrico al 10 % (105 ml s 10 V) y acetato de etilo (263 ml s 25 V). Se separo la fase organica y se lavo con disolucion de acido cftrico al 10 % (105 ml s 10 V), agua desmineralizada (105 ml s 10 V), disolucion de bicarbonato de sodio al 5 % (3 x 105 ml s 3 x 10 V), y agua desmineralizada (105 ml s 10 V). Se seco la fase organica sobre sulfato de sodio y se concentro a vado por debajo de 35 °C. Se precipito el producto en bruto con n-hexano (84 ml s 8 V), se lavo con n- hexano (2 x 84 ml s 2 x 8 V), y se seco a vado a 35 °C.

Produccion: 10,5 g; Rendimiento: 80,7 %; Pureza: 92,1 %

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CLEU-13:

Se cargo CLEU-12 (10,5 g) en una disolucion de TFA (78,8 ml s 7,5 V) y m-cresol (0,4 ml) a -5 °C. Se agito la mezcla de reaccion durante 2 h a 0 °C y entonces se concentro a vado por debajo de 35 °C. Se eliminaron trazas de TFA mediante destilacion conjunta con tolueno (2 x 52 ml). Se llevo el residuo a acetato de etilo (105 ml s 10 V) y se anadio n-hexano (158 ml s 15 V) para precipitar el producto. Se separo por filtracion el solido bajo nitrogeno y se lavo con n-hexano (53 ml s 5 V). Se seco el compuesto a vado a 35 °C.

Produccion: 9,6 g; Rendimiento: 90,5 %; Pureza: 91,9 %.

CLEU-14:

Se disolvio CLEU-13 (9,5 g) en DMF (95 ml s 10 V) bajo una atmosfera de nitrogeno. Se anadieron NMM (1,0 g s 1,05 equiv.), CSER-2 (3,95 g s 1,0 equiv.) y HOBt (1,4 g s 1,1 equiv.) a la disolucion y se enfrio la masa de reaccion hasta 0 °C. Se anadieron EDC.HCl (2,0 g s 1,1 equiv.) y NMM (1,0 g s 1,05 equiv.) posteriormente en la mezcla. Se agito la masa de reaccion durante 5 h a 0 °C y entonces se vertio en agua enfriada con hielo (950 ml s 100 V) y se agito durante 30 minutos. Se separo por filtracion el solido precipitado y se lavo con agua (20 V), acido dtrico al 10 % (10 V), de nuevo con agua (190 ml s 20 V), disolucion de NaHCO3 al 5 % (95 ml s 10 V) y agua (95 ml s 10 V). Se seco el producto final a vado por debajo de 35 °C.

Produccion: 10,3 g; Rendimiento: 84,40 %; Pureza: 90,4 %.

CLEU-15:

Se cargo CLEU-14 (10,0 g) en una disolucion de TFA (75 ml s 7,5 g) y m-cresol (0,37 ml) a -5 °C. Se agito la mezcla de reaccion durante 2 h a 0 °C y entonces se concentro a vado por debajo de 35 °C. Se eliminaron trazas de TFA mediante evaporacion conjunta con tolueno (2 x 50 ml). Se llevo el residuo a acetato de etilo (100 ml s 10 V) y se anadio n-hexano (60 ml s 6 V) para precipitar el producto. Se separo por filtracion el solido bajo nitrogeno, se lavo con n-hexano (2 x 30 ml s 6 V) y entonces se seco a vado a 35 °C.

Produccion: 9,6 g; Rendimiento: 95,0 %; Pureza: 91,5 %.

CSER-2:

A una disolucion con agitacion de acido L-hidroorotico (23,4 g, 148 mmol) y N-hidroxisuccinimida (18,14 g s

1.1 equiv.) en DMF seca (585 ml s 25 V) se le anadio DIC (20,5 g s 1,1 equiv.) con enfriamiento de agua helada externo. Se agito la mezcla de reaccion a temperatura ambiente durante 13-14 h. Se separo por filtracion el precipitado y se evaporo el filtrado. Se lavo el residuo aceitoso con diisopropil eter (94 ml s 4 V) y se disolvio en DMF seca (293 ml s 12,5 V). Se anadio N-Boc-L-4-aminofenilalanina (41,5 g s 1,0 equiv.) a la disolucion anterior. Se anadio DIEA (22,97 g s 1,2 equiv.) a 0 °C y se agito la mezcla de reaccion durante 22 h y entonces se evaporo el disolvente. Se mezclo el residuo con agua (702 ml s 30 V) y se ajusto el pH de la suspension resultante a 9,0 con disolucion saturada de bicarbonato de sodio. Se separo por filtracion el precipitado de diisopropilurea y se lavo el filtrado con acetato de etilo (70,2 ml s 3 V). Se acidifico la fase acuosa hasta pH 2,5 con HCl 6 N y se recogio el precipitado resultante mediante filtracion. Se obtuvo el producto como solido amarillo.

Produccion: 40,0 g; Rendimiento 64 %; pf 270 °C, [a]25D = +62,5 (c 1,0, 1 % NaHCOs); Pureza 95 %.

CBBC-2B:

Se disolvio el fragmento-A (20,0 g) (adquirido de Chirotech, R.U.) en DMF (300 ml s 15 V) a 30-35 °C y entonces se enfrio de -10° C a 5 °C en donde se anadio HOBt (5,06 g s 1,1 equiv.) a la mezcla, se agito durante 30 minutos antes de anadir ester metflico de L-serina (5,29 g s 1,0 equiv.) a la suspension. Se agito la mezcla durante 30 minutos, se trato con NMM (7,23 g s 2,1 equiv.) y entonces se agito durante 30 minutos. Se anadio entonces EDC.HCl (7,18 g s

1.1 equiv.) a la suspension y se agito la mezcla de reaccion durante 5 h a -5 °C hasta 0 °C. Se vertio la mezcla de reaccion en agua desmineralizada helada (1,5 l o 1500 ml s 75 V) y se agito durante 30 minutos. Se precipito el producto agitando a 0-5 °C. Tras 1 h, se recogio el solido resultante mediante filtracion. Se lavo la torta de filtrado con agua (200 ml s 10 V), acido dtrico al 10 % (200 ml s 10 V), de nuevo con agua (200 ml s 10 V), disolucion de NaHCO3 al 5 % (200 ml s 10 V), agua (200 ml s 10 V) y entonces se seco el solido a vado durante 4 h. Se suspendio el producto en metanol (300 ml s 15 V) y se agito durante 1 h. Se filtro la suspension y se lavo la torta con metanol (100 ml s 5 V) entonces se seco a vado a 30-35 °C hasta un peso constante.

Produccion: 22 g; Rendimiento: 93,8 %.

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CBBC-3B:

Se suspendio CBBC-2B (20,0 g) en THF (500 ml s 25 V) y entonces se agito y se enfrio hasta un intervalo de -5 °C a 0 °C. A la disolucion enfriada se le anadio una disolucion acuosa de hidroxido de litio (3,65 g s 3,0 equiv.) a una velocidad tal que se mantuvo la temperatura de reaccion a de entre -5 °C y 0 °C (aproximadamente 30 min). Se anadio el solido disuelto tras la base para proporcionar una disolucion ligeramente turbia. Se continuo la agitacion durante otras 2 h por debajo de -5 °C hasta 0 °C. Tras 3 h, se anadio lentamente la mezcla de reaccion turbia, con buena agitacion, en hielo/agua (700 ml s 35 V) a 5 °C por lo cual cualquier partfcula no disuelta se filtro a vado. Mientras se agita, se ajusto el pH hasta 4,2 usando HCl 2 M («40 ml s «2 V). Se recogio el precipitado blanco espeso mediante filtracion y se lavo la torta humeda con 200 ml s 10 V de agua, se seco al aire a vado brevemente, se suspendio en 400 ml s 20 V de metanol y entonces se agito bajo reflujo. Se filtro la suspension y se lavo la torta humeda de nuevo con 200 ml, 10 V de metanol, entonces se seco a vado. Entonces se llevo la torta humeda a metanol (400 ml s 20 V) y acetonitrilo (200 ml s 10 V) y se agito bajo reflujo. Se filtro la suspension en caliente y se lavo la torta humeda con 200 ml s 10 V de metanol, entonces se seco a vado. Se seco el producto final a vado a 35 °C hasta un peso constante para proporcionar el acido del tetrapeptido Ac-(AA1-AA4).

Produccion: 12,0 g; Rendimiento: 62,0 %; Pureza: 97,1 %.

CDEG-1:

Se cargaron CLEU-15 (4,3 g), CBBC-3A (2,24 g s 1,0 equiv.) y HOAt (0,56 g s 1,2 equiv.) en un matraz de fondo redondo que contema DMF (~26 ml s 6 V). Se agito la mezcla durante 15-30 minutos para producir una disolucion transparente a 25 °C y entonces se trato con DIPEA (1,71 g s 4,0 equiv.). Entonces se enfno la reaccion hasta -15 °C y se anadio HATU (1,57 g s 1,25 equiv.) a la mezcla. Se agito la mezcla de reaccion durante 2 ha -10 °C, se calento hasta 20 °C y entonces se agito durante 1 ha la misma temperatura. Se anadio la masa de reaccion a la disolucion de acido dtrico al 10 % (270 ml s 60 V) y se agito durante 30 minutos a 10 °C. Se separo por filtracion el solido precipitado, se lavo con agua (270 ml s 30 V), disolucion de NaHCO3 al 5 % (130 ml s 30 V) y de nuevo con agua (270 ml s 60 V). Se seco el solido a vado a 35 °C.

Produccion: 4,0 g; Rendimiento: 65,1 %; Pureza 79,25 %.

CDEG:

Se cargo piperidina al 20 % en DMF (25 ml s 5 V) en un matraz de fondo redondo bajo una atmosfera de nitrogeno. Se enfrio la disolucion hasta -5 °C y se anadio CDEG-1 (5,0 g). Se agito la mezcla de reaccion durante 45 minutos a 0 °C. Se vertio la mezcla de reaccion en DIPE (250 ml s 50 V) y entonces se agito durante 15 minutos. Se separo por filtracion el solido precipitado bajo nitrogeno y se lavo con DIPE (50 ml s 10 V). Entonces el solido se llevo a acetato de etilo (125 ml s 25 V) y se agito durante 1 h a 25 °C. Se separo por filtracion el solido fino obtenido, se lavo con acetato de etilo (50 ml s 10 V), y entonces se seco a vado.

Produccion: 4,7 g; Rendimiento: cuantitativo, Pureza: 87,6 %, impureza de D-Ser 1,5 %, impureza de hidantoma 0,16 %.

Condicion de HPLC para CDEG:

Columna: YMC basic (250 mm x 3,0 mm), 5 |i Fase movil A: TFA al 0,1 % en ACN Fase movil B: TFA al 0,1 % en H2O

Longitud de onda: 226 nm, Diluyente: Fase movil A: M.P.B =27:73 Temperatura de columna: 50 °C, vol. inyect. 50 |il Gradiente T/%A = 0/73, 18/70, 41/30, 43/73, 50/73 Velocidad de flujo 0,5 ml/min

Claims (10)

1.

5

10

15

REIVINDICACIONES

Procedimiento en fase Kquida para preparar degarelix que tiene la formula AC-AA1-AA10-NH2:

imagen1

que comprende la etapa de acoplar (P4)Ac-AArAA4 con (Pe)AA5-AA-ioNH2 o acoplar A&AA1-AA3 con (P4)(Ps)AA4-AAioNH2 en un disolvente organico que comprende los dos peptidos, un reactivo de acoplamiento de peptidos y una base de amina organica disueltos en el mismo en el que Pe es un grupo protector de e-amino y P4 es un grupo protector de hidroxilo o hidrogeno, en el que el agente de acoplamiento de peptidos en el caso de acoplar (P4)Ac-AAi-AA4 con (Pe)AA5-AAioNH2 se selecciona de uno o mas de hexafluorofosfato de o-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU) y hexafluorofosfato de 2-(benzotriazol-1-il)oxi-1,3-dimetilimidazolidinio (BOP),

y estando los peptidos representados a continuation:

imagen2

5

10

15

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25

imagen3

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y que comprende la etapa de escindir el grupo protector de e-amino Pe de un precursor de degarelix segun la formula (P4)(Pe)Ac-AAi-AAio-NH2 en un disolvente organico que comprende el precursor y un agente de escision disueltos en el mismo para proporcionar degarelix.

Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que el agente de escision es acido trifluoroacetico y/o piperidina.

Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que Pe se selecciona del grupo que consiste en t-butoxicarbonilo (Boc), 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) y aliloxicarbonilo (Alloc).

Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el grupo protector Pe es Fmoc y/o en el que el disolvente organico es DMF.

Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que en el caso de acoplar Ac-AAr AA3 con (P4)(Pe)AA4-AA10NH2, el reactivo de acoplamiento de peptidos se selecciona de uno o mas de hexafluorofosfato de o-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU), hexafluorofosfato de o- (benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU) y tetrafluoroborato de o-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3- tetrametiluronio (TBTU), y clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC.HCl), hexafluorofosfato de (2-(6-cloro-1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio) (HCTU), hexafluorofosfato de 2-(benzotriazol-1-il)oxi-1,3-dimetilimidazolidinio (BOP) y diisopropilcarbodiimida (DIC).

6. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 5, en el que la base de amina organica se selecciona de uno o mas de N,N'-diisopropiletilamina (DIPEA), N-metilmorfolina (NMM), trietilamina (TEA) o 2,4,6-trimetilpiridina.

5 7. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la disolucion comprende

ademas un aditivo de acoplamiento seleccionado de 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (HOOBt), 1-hidroxi-7-aza-benzotriazol (HOAt) o 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) disuelto en el mismo.

8.

10

15

9.

20 10.

11.

25

12.

30

35

Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la base de amina organica es DIPEA y el reactivo de acoplamiento de peptidos es HATU, y/o en el que la base de amina organica es DIPEA y el aditivo de acoplamiento de peptidos es HOAt, y/o en el que el reactivo de acoplamiento de peptidos es HATU y el aditivo de acoplamiento de peptidos es HOAt, y/o en el que la base de amina organica es DIPEA, el reactivo de acoplamiento de peptidos es HATU y el aditivo de acoplamiento de peptidos es HOAt.

Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la base de amina organica se usa en una cantidad de 2,5 a 3,5, de manera preferible aproximadamente 3, equivalentes molares del hexapeptido AA5-AA10.

Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el disolvente organico se enfna hasta una temperatura de -10 °C o menos, preferiblemente -15 °C o menos, y entonces se realiza la reaccion a esa temperatura.

Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que los peptidos y el aditivo de acoplamiento se disuelven en primer lugar en el disolvente organico antes de anadir el reactivo de acoplamiento y la amina organica.

Procedimiento en fase lfquida para preparar un producto intermedio de degarelix que tiene la formula (P4)Ac-AA1-AA4:

imagen5

o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo, que comprende la etapa de hidrolizar un compuesto que tiene la formula (P4)Ac-AA-i-AA4-R con un hidroxido alcalino, en la que R representa un grupo protector de carboxilo, preferiblemente un bencilo o alquilo C1-C4, P4 representa hidrogeno o un grupo protector de hidroxilo:

imagen6

y en el que el hidroxido alcalino es LiOH.

10

14. 15

15.

Procedimiento en fase lfquida para preparar el hexapeptido (Ps)AA5-AA-ioNH2 que comprende el acoplamiento de (Ps)AA6-AA-ioNH2 y (Px)AA5, en el que Px es un grupo protector de amino y AA5 a AA10 y Ps tiene el mismo significado que en la reivindicacion 1, para proporcionar (Px)(Ps)AA5-AA-ioNH2, y la escision de Px con TFA para proporcionar (Ps)AA5-AA-ioNH2, en el que (Px)(Ps)AA5-AA-ioNH2, (Ps)AA6-AA-ioNH2 y (Px)AA5 tienen las siguientes estructuras:

imagen7

Procedimiento segun la reivindicacion 12 y/o 13 seguido por cualquiera de los procedimientos en las reivindicaciones 1 a 13.

Procedimiento segun las reivindicaciones 12 o 14, en el que el compuesto que tiene la formula Ac-AA1-AA4- R se prepara en primer lugar acoplando Ac-AA1-AA3 con (P4)AA4-R o acoplando Ac-AA1-AA2 con (P4)AA3- AA4-R, estando los peptidos representados a continuacion

5 16.

17.

imagen8

Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 12 y 14 a 15, en el que R es metilo o bencilo. Polipeptidos intermedios segun las formulas:

imagen9

5

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en las que R es un grupo protector de carboxilo, preferiblemente un bencilo o alquilo C1-C4, Ps es un grupo protector de amino, y P4 es hidrogeno o un grupo protector de hidroxilo.

10 18. Procedimiento en fase solida para preparar un producto intermedio de degarelix que tiene la formula (P4)Ac-

AA1-AA4:

imagen11

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20

o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo, que comprende las etapas:

a) hacer reaccionar (PN)AA2 con (P4)AA3-AA4-RESINA para proporcionar (P4,PN)AA2-AA4-RESINA;

b) retirar PN de (P4,PN)AA2-AA4-RESINA para proporcionar (P4)AA2-AA4-RESINA;

c) hacer reaccionar (PN)AA1 con (P4)AA2-AA4-RESINA para proporcionar (P4,PN)AA1-AA4-RESINA;

d) si PN no es acetilo, retirar PN de (P4,PN)AA1-AA4-RESINA para proporcionar (P4)AA1-AA4-RESINA y posteriormente acetilar (P4)AA1-AA4-RESINA para proporcionar (P4)Ac-AA1-AA4-RESInA; y

e) escindir (P4)Ac-AA1-AA4-RESINA para proporcionar (P4)Ac-AA1-AA4.

en el que P4 es H o un grupo protector de hidroxilo en AA4, y PN es un grupo protector de amino.

19. Procedimiento en fase lfquida para preparar el hexapeptido (Pb)AA5-AA1oNH2 acoplando (P5)AA5-AA7 con (Pb)AA8-AA1oNH2 para proporcionar (P5,Pb)AA5-AA1oNH2, y posteriormente escindiendo P5 para proporcionar (Pb)AA5-AA1oNH2. (en el que P5 es un grupo protector de amino en AA5 y Pb es un grupo protector de amino de cadena lateral en AA6), en el que se prosigue opcionalmente el procedimiento acoplando (P4)Ac-AA1-AA4 a (Pb)AA5-AA1oNH2, en el que AA1 a AA10 tienen el mismo significado que en la reivindicacion 1.