TW201302776A - 用於製造地蓋瑞利（ｄｅｇａｒｅｌｉｘ）及其中間產物的方法（一） - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種用以製備十胜肽地蓋瑞利、其胺基經保護的前驅物及其它有用的中間產物之液(或溶液)相製造方法。本發明進一步關於在該溶液相製造方法中有用的多胜肽，及關於地蓋瑞利其自身之純化。該製造方法包括在包含該前驅物及一溶解在其中的切割試劑之有機溶劑中，從根據式(P4)(Pε)Ac-AA1-AA10-NH2的地蓋瑞利前驅物中切割ε-胺基保護基團Pε之步驟：□其中P4係羥基保護基團或氫，較佳為氫。

Description

用於製造地蓋瑞利(DEGARELIX)及其中間產物的方法(一) 發明領域
本發明係關於一種用以製備十胜肽地蓋瑞利、其胺基經保護的前驅物及其它有用的中間產物之液(或溶液)相製造方法。本發明進一步關於在該溶液相製造方法中有用的多胜肽，及關於地蓋瑞利其自身之純化。
 發明背景
前列腺癌係工業化世界中導致男性發病及致死的原因。地蓋瑞利(亦已知為FE200486)係第三代促性腺素釋素(GnRH)受體拮抗劑(GnRH阻斷劑)，其已經發展且最近已批准用於需要雄性激素去除療法(androgen ablation therapy)之前列腺癌患者(多恩(Doehn)等人，藥物(Drugs)，2006，vol. 9，No. 8，pp. 565-571；WO 09846634)。地蓋瑞利藉由在腦垂體中直接及競爭性阻斷GnRH受體而作用，且如其它GnRH拮抗劑般，不經由下視丘-腦垂體-性腺軸造成促黃體素製造之初始刺激，因此不造成睪固酮潮放或臨床熱紅(凡波佩(Van Poppel)，癌管理及研究(Cancer Management and Research)，2010：239-52；凡波佩等人，泌尿科學(Urology)，2008，71(6)，1001-1006)；詹姆斯(James)，E.F.等人，藥物，2009，69(14)，1967-1976)。
地蓋瑞利係一種包含七種非天然胺基酸(其五種係D-胺基酸)的合成線性十胜肽。其在該十胜肽的骨架中具有十個對掌性中心。在該序列中的5位置處，於側鏈取代中之胺基酸殘基具有額外的對掌性中心，總共提供十一個對掌性中心。其CAS登記編號係214766-78-6(自由態鹽基)及其可以商標弗馬供(Firmagon)TM商業購得。該藥品物質化學標示為D-丙胺醯胺，N-乙醯基-3-(2-萘基)-D-丙胺醯基-4-氯-D-苯基丙胺醯基-3-(3-吡啶基)-D-丙胺醯基-L-絲胺醯基-4-[[[(4S)-六氫-2,6-二側氧-4-嘧啶基]羰基]胺基]-L-苯基丙胺醯基-4-[(胺基羰基)胺基]-D-苯基丙胺醯基-L-白胺醯基-N6-(1-甲基乙基)-L-離胺醯基-L-脯胺醯基-，及由下列化學結構表示：
地蓋瑞利的結構亦可表示為：Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2
其中Ac係乙醯基，2Nal係2-萘基丙胺酸，4Cpa係4-氯苯基丙胺酸，3Pal係3-吡啶基丙胺酸，Ser係絲胺酸，4Aph係4-胺基苯基丙胺酸，Hor係氫乳清酸基(hydroorotyl)，Cbm係胺甲醯基，Leu係白胺酸，Lys(iPr)係N6-異丙基離胺酸，Pro係脯胺酸及Ala係丙胺酸。
為了描述本發明的目的，在地蓋瑞利中之每個胺基酸將提供如下的速記標記：AA1係D-2Nal，AA2係D-4Cpa，AA3係D-3Pal，AA4係Ser，AA5係4Aph(L-Hor)，AA6係D-Aph(Cbm)，AA7係Leu，AA8係Lys(iPr)，AA9係Pro及AA10係D-Ala。
因此，作為實施例，地蓋瑞利可表示為Ac-AA1-AA10-NH2，四胜肽Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser可表示為Ac-AA1-AA4及六胜肽4Aph(L-Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2如為AA5-AA10-NH2。
地蓋瑞利先前已使用Boc-固相胜肽合成(SPPS)方法來製備，如在WO 98/46634及江(Jiang)等人，J. Med. Chem. 2001，44，453-467中所報導。基本上，首先在二甲基甲醯胺(DMF)/CH2Cl2中，使用二異丙基碳二醯亞胺(DIC)及1-羥基苯并三唑(HOBt)作為活化或偶合劑，將經Boc保護的D-Ala偶合至MBHA樹脂。一旦D-Ala偶合至該樹脂，藉由洗滌、去阻礙，然後偶合下一個胺基酸殘基繼續進行合成，直到已經完成十胜肽。在5-位置中的4Aph及在6-位置中的D-4Aph之側鏈主要胺基，當加入它們時，其係由Fmoc保護，及在該鏈中加入下一個胺基酸前各別以L-Hor及Cbm改質。此需要下列額外步驟：首先以哌啶移除該側鏈保護，讓該新近釋放在胜肽樹脂(peptidoresin)上的胺基與異氰酸三級丁酯或L-氫乳清酸反應，以寧海準檢驗保證該反應完成，然後，在加入下一個胺基酸殘基前洗滌該胜肽樹脂(亦參見梭貝拉(Sorbera)等人，未來藥物(Drugs of the Future)，2006，Vol. 31，No. 9，pp 755-766)。
雖然Boc-SPPS方法至今已獲得足夠量的地蓋瑞利，對此多胜肽增加需求意謂著不斷需要較大的量。需要HF切割的Boc-SPPS不適合於大規模工業合成。更確切來說，WO 98/46634提到SPPS僅合適於最高1公斤的限制量，同時標準胜肽溶液合成或液相胜肽合成(LPPS)對較大量的產物來說係較佳。WO 98/46634未詳細指明此合成應該如何進行。再者，對SPPS來說，需要可歸因於大過量偶合劑、添加劑及胺基酸的代價。雖然已經報導出存在有地蓋瑞利的液相胜肽合成[EMEA報導：對弗馬供TM(地蓋瑞利)的評估報導：Doc. Ref. EMEA/CHMP/635761/2008]，但截至現在，尚未公開地揭示出此方法之細節。
WO 97/34923及WO 99/26964係國際申請案公告，其關於用以製備生物活性的胜肽之液相方法。WO 99/26964特別關於具有作為GnRH拮抗劑的活性之十胜肽的液相合成。WO 99/26964列出一些用來製造GnRH拮抗劑的SPPS方法之固有限制，包括該樹脂的限制容量、需要大過量的試劑及胺基酸、和需要保護全部反應性側鏈(諸如在Ser中的羥基、在Aph及D-Aph中的芳香族胺基、在Lys(i-Pr)中的ε-異丙基胺基)。
國際申請案公告案號WO 99/26964描述出一種液相方法，其包括首先製備十胜肽的5及6位置具有完全精製的側鏈之中心胜肽片段，然後經由"4-2-4"、"3-3-4"或"3-4-3"片段組合圖譜來組合該胜肽。例如，在GnRH拮抗劑阿剎林B(Azaline B)之製備時，讓一四胜肽與一六胜肽偶合來形成想要的十胜肽。當地蓋瑞利嘗試相同的片段組合圖譜時，絲胺酸胺基酸(AA4)的外消旋發生而產生約20%之L-Ser雜質。此雜質繼續存在至最後十胜肽中並難以移除。再者，當遵循在WO 99/26964中所描述的程序，將Ser單元加入至三胜肽AA1-AA3來製備四胜肽AA1-AA4時，來自苄基酯基團水解的四丁基銨離子會無法在隨後的操作期間完全移除且會被帶至最後產物。已進一步發現在地蓋瑞利合成時，當讓L-二氫乳清酸與4Amp偶合來製備AA5時，L-氫乳清酸基會重組成其尿囊素乙醯基類似物。地蓋瑞利之溶液相合成的這些及其它問題現在已克服，且於此第一次揭示出此十胜肽的新型溶液相多胜肽合成。
 發明概要
如在WO 97/34923及WO 99/26964中所描述之用來製備地蓋瑞利的SSPS方法之問題及LLPS方法的缺點現在已克服，且其係本發明之目標。
通常來說，本發明係關於十胜肽地蓋瑞利之液相合成。
在一個觀點中，本發明係關於一種用以製備具有式Ac-AA1-AA10-NH2的地蓋瑞利或其醫藥可接受的鹽或溶劑化物之液相方法，其包括在包含該前驅物與一溶解在其中的切割試劑之有機溶劑中，從根據式(P4)(Pε)Ac-AA1-AA10-NH2的地蓋瑞利前驅物中切割ε-胺基保護基團Pε的步驟：
P4係羥基保護基團或氫，以tBu、(ΨPro)(即，假脯胺酸)或氫為較佳。若P4係羥基保護基團時，該方法亦包括從地蓋瑞利前驅物中切割該羥基保護基團P4的步驟。以此切割步驟可與該胺基保護基團Pε的切割同步進行之此方式來選擇該保護基團P4為較佳。此係例如若P4及Pε二者皆係Boc的情況。
在第二觀點中，本發明亦關於一種用以製備具有式(P4)(Pε)Ac-AA1-AA10-NH2之經保護的地蓋瑞利前驅物或其醫藥可接受的鹽或溶劑化物之液相方法，其包括在一有機溶劑(其包含該二種胜肽、一胜肽偶合劑及一溶解在其中的有機胺鹼)中偶合(P4)Ac-AA1-AA4與(Pε)AA5-AA10-NH2或偶合Ac-AA1-AA3與(P4)(Pε)AA4-AA10-NH2的步驟，其中Pε係胺基保護基團。該胜肽係表示在下列：
第三觀點關於一種用以製備具有式(P4)Ac-AA1-AA4之地蓋瑞利中間產物或其醫藥可接受的鹽或溶劑化物之液相方法：
其包括下列步驟：以鹼性氫氧化物水解具有式(P4)Ac-AA1-AA4-R的化合物，其中R代表羧基保護基團，以C1-C4烷基或苄基為較佳：
第四觀點關於一種用以製備化合物(P4)Ac-AA1-AA4-R的方法，其係藉由讓Ac-AA1-AA3與(P4)AA4-R偶合或讓Ac-AA1-AA2與(P4)AA3-AA4-R偶合，該胜肽係表示在下列。
在上述的每個式中，AA1至AA10、P4及Pε具有與在式II中相同的意義，及R代表羧基保護基團，以C1-C4烷基或苄基為較佳。
在第五觀點中，不藉由液相合成，但是藉由固相合成來製備該四胜肽(P4)Ac-AA1-AA4。因此，本發明亦關於一種用以製備具有式(P4)Ac-AA1-AA4的地蓋瑞利中間產物：
或其醫藥可接受的鹽或溶劑化物之固相方法，其包括下列步驟：
a)讓(PN)AA2與(P4)AA3-AA4-反應以提供(P4,PN)AA2-AA4-；
b)從(P4,PN)AA2-AA4-移除PN以提供(P4)AA2-AA4-；
c)讓(PN)AA1與(P4)AA2-AA4-反應以提供(P4,PN)AA1-AA4-；
d)若PN非為乙醯基時，從(P4,PN)AA1-AA4-移除PN以提供(P4)AA1-AA4-，隨後乙醯化(P4)AA1-AA4- 以提供(P4)Ac-AA1-AA4-：及
e)切割(P4)Ac-AA1-AA4-以提供(P4)Ac-AA1-AA4。
其中P4係在AA4上的H或羥基保護基團，及PN係胺基保護基團。
本發明的第六觀點關於一種用以製備六胜肽(Pε)AA5-AA10NH2之液相方法，其包括讓(Pε)AA6-AA10NH2與(Px)AA5偶合，其中Px係胺基保護基團，及AA5至AA10及Pε具有與上述相同的意義，以提供(Px)(Pε)AA5-AA10NH2，及以TFA切割Px以提供(Pε)AA5-AA10NH2，該胜肽係表示在下列：
本發明的第七觀點關於一種用以製備六胜肽(Px)(Pε)AA5-AA10NH2之液相方法，其包括讓(Px)AA5-AA7與(Pε)AA8-AA10NH2偶合。
本發明的第八觀點關於一種用來純化地蓋瑞利的方法，諸如藉由製備型HPLC，使用PLRP-S及/或C8及C18管柱。
應瞭解在根據本發明之製備地蓋瑞利的方法中，可結合任何上述製程步驟。例如，本發明亦具體化一種方法，其中在與(Pε)AA5-AA10-NH2偶合前，首先從根據本發明的第三觀點或根據本發明的第五觀點之(P4)Ac-AA1-AA4-R來製備(P4)Ac-AA1-AA4，以形成根據本發明的第二觀點之經保護的前驅物(P4)(Pε)Ac-AA1-AA10-NH2。然後，可根據本發明的第一觀點去保護藉由此方法所形成的前驅物(P4)(Pε)Ac-AA1-AA10-NH2，最終提供一用以製備地蓋瑞利之單一方法(其併入本發明的第一、第二及第三或第五觀點)。
自然地，可將於此所描述之用於地蓋瑞利的任何純化步驟併入地蓋瑞利係最後產物之任何方法中。
圖式簡單說明
第1圖係四胜肽Ac-AA1-AA4之液相製備。
第2圖係經Pε保護的六胜肽AA5-AA10NH2之製備，其中Pε係Fmoc。
第3圖係斷片縮合及去保護以產生地蓋瑞利。
第4圖係在AA4上具有假脯胺酸保護基團的四胜肽Ac-AA1-AA4之固相製備。
第5圖係在AA4上具有tBu保護基團的四胜肽Ac-AA1-AA4之固相製備。
第6圖係經Boc保護的AA5-AA7之固相製備。
第7圖係經Fmoc保護的AA8-AA10NH2之固相製備。
 較佳實施例之詳細說明
現在將更詳細地描述本發明。
地蓋瑞利前驅物之去保護
在第一觀點中，本發明係關於一種用以製備具有式Ac-AA1-AA10-NH2的地蓋瑞利或其醫藥可接受的鹽或溶劑化物之液相方法。該方法包括在一包含該前驅物與一溶解於其中的切割試劑之有機溶液中，從根據式(P4)(Pε)AA1-AA10的地蓋瑞利前驅物中切割ε-胺基保護基團Pε的步驟。
於此情況中，Pε係在技藝中已知的任何側鏈保護基團，諸如描述在E.葛羅斯(Gross)及J.梅恩厚弗(Meienhofer)，胜肽：分析、結構、生物學(The Peptides: Analysis,Structure,Biology)，第3冊：在胜肽合成中的官能基之保護(Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis)(學術出版社(Academic Press)，N.Y.，1981)中的那些。合適的實施例包括9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)、CBZ及經取代的CBZ，諸如例如，對-氯苄氧基羰基、對-6-硝基苄氧基羰基、對-溴苄氧基羰基及對-甲氧基苄氧基羰基、鄰-氯苄氧基羰基、2,4-二氯苄氧基羰基、2,6-二氯苄氧基羰基及其類似基團；脂肪族胺基甲酸酯型式保護基團，諸如三級丁氧基羰基(Boc)、三級戊氧基羰基、異丙基氧基羰基、2-(對-聯苯基)-異丙基氧基羰基及其類似基團；環烷基胺基甲酸酯型式保護基團，諸如環戊氧基羰基、金剛烷基氧基羰基及環己氧基羰基；烯丙基氧基羰基(Alloc)。較佳的保護基團係Fmoc、Boc及Alloc，且Fmoc係最佳。
若需要時，Ser的羥基亦可經保護，雖然此非為較佳。於此情況中，P4非為氫而是羥基保護基團，諸如例如，C4-C6烷基(例如三級丁基、環己基)、三苯甲基、苄基、苄基醚(諸如對-甲氧基苄基)、或其它經取代的苄基，諸如對-硝基苄基、對-氯苄基、鄰-氯苄基、2,6-二氯苄基或(ΨPro)(假脯胺酸)。若Ser係經保護時，三級丁基、苄基及9-茀基甲基醚類係特別佳，三級丁基係最佳。P4係H、tBu或(ΨPro)，以tBu或(ΨPro)為較佳。
使用來移除ε-胺基保護基團或Ser羥基保護基團之切割試劑依保護基團的本質而定且在技藝中熟知。在較佳的具體實例中，對ε-胺基保護基團及Ser羥基保護基團(若存在的話)二者使用相同的切割試劑。
對Ser羥基保護基團來說，較佳的切割試劑係：
‧三氟醋酸(TFA)、HCl或甲磺酸，特別對三級丁基醚作為保護基團來說；
‧H2/Pd-C、HF或三氟甲磺酸，特別對苄基醚作為保護基團來說；及
‧SiCl4/苯基甲基醚，特別對2-(甲基亞碸基)苄基醚作為保護基團來說；
對ε-胺基保護基團來說，較佳的切割試劑係：
‧三氟醋酸(TFA)、HCl或甲磺酸，特別對胺基甲酸三級丁酯類作為保護基團來說；
‧H2/Pd-C、HF或三氟甲磺酸，特別對胺基甲酸苄酯類作為保護基團來說；及
‧哌啶、DBU及DEA，特別對Fmoc作為保護基團來說。
較佳的溶劑包括DCM、DMF、NMP、二氧六圜、EtOH、純淨的HF及TFA。
在下列表1中指示出特別佳的不同切割條件：
典型來說，於惰性環境(諸如N2或氬)中，將切割試劑(諸如哌啶)溶解在有機溶劑(諸如DMF、NMP)中，及將其冷卻至溫度在-20至0℃間，較佳為-10至-2℃(例如約-5℃)。加入經保護的中間產物(Pε)AA1-AA10，然後，在溫度於-20至25℃間攪拌該反應混合物，較佳為-10至10℃及更佳為0至5℃。當該保護基團已經移除(以產率>95%產率為較佳，最佳為>99%)時，可析出、過濾然後以醚清洗該粗產物地蓋瑞利。例如，該粗產物地蓋瑞利可藉由將其加入至醚(諸如甲基三級丁基醚(MTBE)或DIPE)，及攪拌10至30分鐘析出。然後，可以醚(較佳為DIPE)清洗該析出物。隨後，可將該固體溶解在例如醋酸乙酯中並於室溫下攪拌一些時間。然後，可過濾所獲得的細固體，清洗(例如，以醋酸乙酯)及在真空下乾燥。
已發現延長反應時期不會損傷反應品質，且觀察到若允許反應繼續進行最高24小時，乙內醯脲雜質的增加不明顯(產率<0.03%，如藉由HPLC測量)。再者，特別在哌啶作為切割試劑的情況中，觀察到若反應於每體積溶劑5體積%的水存在下(例如0.1毫升水每2毫升溶劑諸如DMF)進行最高20小時，並無乙內醯脲雜質。此闡明此去保護反應對地蓋瑞利之LPPS的穩健性。
4+6偶合及3+7偶合
在第二觀點中，本發明係關於一種用以製備具有式(P4)(Pε)AA1-AA10之經保護的地蓋瑞利前驅物或其醫藥可接受的鹽或溶劑化物之液相方法。此方法可包括偶合根據式(P4)Ac-AA1-AA4之四胜肽中間產物與根據式(Pε)AA5-AA10之六胜肽中間產物的步驟。其亦可包括偶合根據式Ac-AA1-AA3的三胜肽中間產物與根據式(P4)(Pε)AA4-AA10的七胜肽中間產物之步驟。在任一情況中，該保護基團Pε可為任何如先前討論的ε-胺基保護基團。若需要的話(即，於P4非為氫而是羥基保護基團的此情況中)，Ser之羥基亦可經保護。在有機溶液(於其中已溶解二種胜肽、胜肽偶合劑及有機胺鹼)中進行該偶合反應。亦可存在有胜肽偶合添加劑。
有機溶劑、胜肽偶合劑、胜肽偶合添加劑及有機胺鹼可為在LPPS技藝中已知的那些之任何。
典型的有機溶劑有THF、NMP(N-甲基吡咯啶酮)、DCM、DMF、DMSO及其混合物。
典型的胜肽偶合試劑係下列之一或多種：0-(7-吖苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HATU)、o-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)、o-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)、苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基胺基)膦鎓六氟磷酸鹽(BOP)、苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯啶膦鎓六氟磷酸鹽(PyBOP)、N,N-雙-(2-側氧-3-唑啶基)膦酸二氯鹽(BOC-Cl)、溴-三-吡咯啶基-膦鎓六氟磷酸鹽(PyBroP)、異-丁基氯甲酸鹽(IBCF)、1,3二環己基碳二醯亞胺(DCC)、1,3-二異丙基-碳二醯亞胺(DIC)、1-(二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽(WSCDI)、N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉(EEDQ)、異丙基氯甲酸鹽(IPCF)、2-(5-降烯-2,3-二羧亞醯胺基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TNTU)、酐(PPAA)及四氟硼酸2-琥珀醯亞胺基-1,1,3,3-四甲基脲鎓丙烷膦酸鹽(TSTU)。較佳的偶合試劑有DIC、HATU、HBTU及BOP。
典型的胜肽偶合添加劑有3,4-二氫-3-羥基-4-側氧-1,2,3-苯并三(HOOBt)、1-羥基-1H-苯并三唑(HOBt)、6-氯-HOBt及1-羥基-7-吖苯并三唑(HOAt)。特別佳有HOBt及HOAt。
典型的有機胺鹼有NMM、DIPEA、TEA及柯林鹼。DIPEA係特別佳。
結合使用HATU、HOAt及DIPEA係特別佳。另一個較佳的具體實例係關於結合使用DIC、6-氯-HOBt，選擇性與銅鹽組合。
已驚人地發現，有機溶劑、胜肽偶合劑/添加劑及有機胺鹼之選擇在想要的產物之產率上及在多胜肽骨架中的Ser胺基酸之外消旋上具有效應。
例如，雖然可使用THF、NMP、DCM、DMF及其混合物作為溶劑用於這些偶合反應，但使用DMF(單獨或以混合物(例如，與DCM))會增加想要的最後產物之產率，然而同時減少任何D-Ser雜質。使用DMF明顯增加產率及減少D-Ser雜質。在極性溶劑(諸如DMF)中活化快速，但是在非極性溶劑(諸如DCM)中變慢。HATU/HOAt組合導致高效率的偶合，部分因為由鹼(諸如DIEA或NMM)快速活化，接著於相同鹼存在下，在極性溶劑(如DMF)中快速偶合。不同溶劑的效應闡明在表2中。
偶合劑及添加劑之選擇亦在外消旋的產率及程度上具有大的效應。進行使用HBTU、HCTU、TBTU、BOP及HATU之偶合反應且發現HBTU及HATU提供最好的整體產率。但是，已發現使用BOP或HATU作為偶合劑之偶合反應導致更少的Ser胺基酸之外消旋。
加入偶合添加劑明顯改善想要的多胜肽之產率。在許多情況中，該偶合添加劑亦減低Ser胺基酸的外消旋程度，因此甚至進一步導致產物具有較少雜質。增加產率的偶合劑與添加劑之組合有TBTU/HOAt、HATU/HOAt及HATU/HOBt。驚人的是，TBTU/HOAt或HATU/HOAt之組合會增加產率，然而同時減少外消旋，且在所測試的全部組合中，HATU/HOAt表現最好。
不同偶合劑及添加劑之效應闡明在下列表3及4中。
有機胺鹼之選擇亦影響該反應。對本發明來說，NMM及DIEA較佳，如它們允許以最好的產率獲得想要的多胜肽。DIEA係更佳，因為此鹼減低Ser的外消旋程度。亦已發現鹼的量會影響反應。當使用鹼(諸如DIEA)時，已發現鹼存在愈多，產率愈低及外消旋的程度愈高。例如，六當量的鹼(相關於A51-A10)導致外消旋產物增加二倍(如與使用三當量的鹼比較)。因此，在這些偶合反應中，以使用1-5當量的鹼為較佳，更佳為2-4當量的鹼及最佳為2.5至3.5當量的鹼。不同鹼及其量的效應顯示在下列表5及6中。
進行偶合反應的溫度亦影響最後產物之外消旋的產率及程度。已發現在-15℃下進行反應比在-5℃下進行相等反應提供較高產率、較高純度及較少外消旋的最後產物。因此，以在溫度低於-5℃下進行這些偶合反應為較佳，較佳為低於-10℃及最佳為在-15℃或較低下。這些偶合反應的反應時間通常為2-3小時。
應注意的是，藉由控制該反應溫度及加入的鹼量，亦可減少任何乙內醯脲雜質形成。該乙內醯脲含量以少於0.5重量%為較佳，更佳為少於0.3重量%。因此，以在溫度-10℃或較低下，於這些反應中使用2.5至3.5當量的鹼為較佳。
最後，多種試劑的加入順序亦在最後產率、純度及外消旋之量上扮演一定角色。若在加入偶合劑及有機胺前，首先將胜肽及偶合添加劑溶解於有機溶劑中，想要的產物之整體產率明顯較高。再者，外消旋的量激烈減低。
片段(P4)Ac-AA1-AA4
本發明提供用以製備(P4)Ac-AA1-AA4的不同方法。
在第三觀點中，本發明係關於一種用以製備具有式(P4)Ac-AA1-AA4之地蓋瑞利中間產物或其醫藥可接受的鹽或溶劑化物之液相方法：
其中P4係氫或羥基保護基團，以氫為較佳。
當製備(P4)Ac-AA1-AA4時，首先製備具有式(P4)Ac-AA1-AA4-R的酯，其中R係羧基保護基團，諸如苄基，但是較佳為C1-C4烷基。正常來說，使用絲胺酸的苄基酯，然後藉由以氫氧化四丁基銨水解移除苄基(參見例如，WO 99/26964)。但是，已發現在地蓋瑞利之製備中，四丁基銨離子無法在隨後的操作期間完全移除且會被攜帶至最後產物。此問題藉由使用絲胺酸的C1-C4烷基酯(例如，絲胺酸甲基酯)克服。已發現烷基酯可容易地使用鹼性氫氧化物(諸如LiOH)水解。四胜肽的產率及品質不受此改變影響，且消除四丁基銨離子雜質的問題。
例如，可將根據式(P4)Ac-AA1-AA4-R的化合物懸浮在有機溶劑(諸如THF)中，然後攪拌及冷卻至溫度在-20至5℃間，及更佳為-5至0℃。然後，將LiOH水溶液加入至該經冷卻的溶液。以將該經冷卻的溶液之溫度維持在範圍-5至0℃或低於的速率來加入LiOH水溶液。在伴隨著好的攪拌下加入至具有溫度5℃或低於的水(或較佳為冰與水之混合物)前，攪拌該溶液(往往混濁)最高12小時，以最高3小時為較佳。藉由過濾移除在此點處之任何析出物。然後，使用任何已知的pH調節劑將pH調整至pH 4.1-4.3，較佳為約4.2。較佳為HCl，例如2M HCl。藉由過濾收集在調整pH後所形成之析出物。該析出物可在藉由過濾收集其然後乾燥其以產生(P4)Ac-AA1-AA4前，藉由以水洗滌其，及/或在迴流MeOH及/或MeOH/MeCN混合物中攪拌其料漿來進一步純化。
本發明的第四觀點係關於一種用以製備化合物(P4)Ac-AA1-AA4-R之方法，其係藉由偶合Ac-AA1-AA3與(P4)AA4-R或偶合Ac-AA1-AA2與(P4)AA3-AA4-R，其中R係C1-C4-烷基及P4係氫或羥基保護基團，較佳為氫。對該偶合反應來說，可使用與上述那些基本上相同的試劑及條件。
在第五觀點中，本發明係關於一種用以製備具有式(P4)Ac-AA1-AA4的地蓋瑞利中間產物或其醫藥可接受的鹽或溶劑化物之固相方法：
其包括下列步驟：
a)　讓(PN)AA2與(P4)AA3-AA4-反應以提供(P4,PN)AA2-AA4-；
b)　從(P4,PN)AA2-AA4-移除PN以提供(P4)AA2-AA4-；
c)　讓(PN)AA1與(P4)AA2-AA4-反應以提供(P4,PN)AA1-AA4-；
d)若PN非為乙醯基時，從(P4,PN)AA1-AA4-移除PN以提供(P4)AA1-AA4-，隨後乙醯化(P4)AA1-AA4- 以提供(P4)Ac-AA1-AA4-；及
e)切割(P4)Ac-AA1-AA4-以提供(P4)Ac-AA1-AA4。
其中P4係在AA4上的H或羥基保護基團，及PN係胺基保護基團。
PN以Fmoc為較佳，其以哌啶/NMP移除為較佳。
P4以tBu或(ΨPro)為較佳。以(ΨPro)用於P4及Fmoc用於PN的組合為特別佳。
以本身已知的方式進行每個偶合步驟係較佳，但是以使用HATU(或HBTU)及DIPEA及偶合添加劑為較佳。
可藉由下列方式製備起始材料(P4)AA3-AA4-起始：將(PN,P4)AA3-AA4偶合至樹脂(例如，至2-ClTrt樹脂)，然後移除PN；或藉由將(PN,P4)AA4偶合至以獲得(PN,P4)AA4-，移除PN，然後讓(PN)AA3與(P4)AA4- 反應以提供(PN,P4)AA3-AA4-，然後移除PN。此闡明在第4及5圖中。
合適的樹脂()包括三苯甲基、2-ClTrt及SASRIN。
在P4係(ΨPro)及PN係Fmoc的情況中，(PN,P4)AA3-AA4可遵循J. Am. Chem. Soc. 1996，118，9218-9227來製備。也就是說，活化經Fmoc保護的AA3；與絲胺酸或其鹽反應，隨後與丙酮或丙酮二甲基縮酮醇反應，如在下列闡明。Fmoc-D3Pal-Ser((ΨMe,MePro)-OH作為(PN,P4)AA3-AA4特別佳。
本發明的第六觀點關於一種用以製備六胜肽(Pε)AA5-AA10NH2的液相方法，其包括偶合(Pε)AA6-AA10NH2與(Px)AA5，其中Px係胺基保護基團，及AA5至AA10及Pε具有與上述相同的意義，以提供(Px)(Pε)AA5-AA10NH2，及以TFA切割Px以提供(Pε)AA5-AA10NH2。
本發明的第七觀點關於一種用以製備六胜肽(Pε)AA5-AA10NH2的液相方法，其藉由偶合(P5)AA5-AA7與(Pε)AA8-AA10NH2以提供(P5,Pε)AA5-AA10NH2，及隨後切割P5以提供(Pε)AA5-AA10NH2。(其中P5係在AA5上的胺基保護基團)。
P5保護基團以BOC為較佳。Pε以9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)為較佳。該偶合反應以於HATU存在下進行為較佳。
藉由固相胜肽合成來合成(P5)AA5-AA7及(Pε)AA8-AA10NH2係較佳，例如，如各別在第6及7圖中闡明。下列P5及Pε之組合係較佳：
也就是說，可藉由下列方式來製備(P5)AA5-AA7OH：將經保護的AA7偶合至樹脂；移除該保護基團(例如，Fmoc)；讓經保護的AA6與所獲得的產物反應；移除保護基團(例如，Fmoc)；讓經保護的AA5(例如，經Boc保護)與所獲得的產物反應；及從該樹脂切割。此闡明在第6圖中。
可藉由下列方式來製備(Pε)AA8-AA10NH2：將經保護的AA10偶合至樹脂，例如，潤克(Rink)醯胺樹脂；移除該保護基團(例如，Fmoc)；讓經保護的AA9與所獲得的產物反應；移除該保護基團(例如，Fmoc)；讓經保護的AA8(較佳為在α-胺基上經Boc保護及在側鏈上經Fmoc保護)與所獲得的產物反應；移除該α-胺基保護基團；及從該樹脂切割。此闡明在第7圖中。
亦可藉由下列方式來製備(Pε)AA8-AA10NH2；讓AA10NH2與經保護的(例如，Boc)AA9反應；移除該保護基團；讓AA9-AA10NH2與經保護的AA8(較佳為在α-胺基上經Boc保護及在側鏈上經Fmoc保護)反應；及移除在α-胺基上的保護基團。
在第八觀點中，本發明係關於地蓋瑞利之純化。該純化可以由熟知技藝之人士已知的方式進行，例如，藉由製備型色層分析法。
例如，以PLRP-S靜相，pH 2.25，使用TEAP作為緩衝劑及MeCN(75：25)作為動相達成地蓋瑞利的第一純化。以此步驟可獲得最高95%的純度。若需要，可使用C8與C18管柱(例如，肉貝斯(Zorbax))之組合進行第二純化，以達成99%及大於的純度。
實驗
下列實施例想要闡明用於地蓋瑞利之LPPS合成的方法。於此所描述的每種胜肽及多胜肽之結構係參照第1及2圖。
CLEU-2：
將L-Cbz-脯胺酸(50.0克)溶解在2-丙醇(500毫升10V)中及將該溶液冷卻至15℃。然後，慢慢加入N-甲基嗎福啉(25毫升0.5V)。在攪拌該溶液15分鐘後，於-15℃下逐滴加入28.49克(1.04當量)的氯甲酸異丁酯。於-15℃下，將在水(250毫升5V)中之D-ala-NH2.HCl(27.48克，1.1當量)及NMM(25毫升0.5V)溶液加入至該反應混合物。在相同溫度下攪拌該混合物30分鐘，然後升溫至25℃及攪拌3-5小時。該反應混合物係藉由加入醋酸乙酯(1000毫升20V)及包含NaCl(25克)與NaHCO3(25克)的水(10V)中止反應。分離有機層，以水(2×500毫升10V)清洗，然後在硫酸鈉上乾燥。在低於40℃之真空下，將有機層濃縮至4倍體積。以醋酸乙酯(250毫升5V)稀釋該溶液及逐滴加入正己烷(375毫升7.5V)以獲得白色固體。過濾出固體及乾燥，以獲得產物。
輸出：35.2克；產率：54.7%；[α]25 D：-13.0°[CHCl3，文獻報導：-11.2°(US 5,710,246)]。HPLC純度：99.44%。
CLEU-4：
讓CLEU-2(19.5克)進入在帕爾(Parr)氫化燒瓶中的2-丙醇(129毫升6.5V)中，及將在水(20毫升1.0V)中的對-甲苯磺酸溶液加入至其。將10% Pd/C(5%w/w)加入至該反應混合物，然後，在40磅/平方英寸下氫化該混合物2小時。當TLC顯示出起始材料消失時，過濾觸媒及以2-丙醇(79毫升4V)與水(8.75毫升0.5V)清洗。在真空下濃縮濾出液及以乙腈(4x254毫升13V)剝離。讓殘餘物進入燒瓶中及加入乙腈(215毫升11V)，接著Boc-Lys(Cbz)-OH(25.5克1.1當量)及HOBt(9.9克1.2當量)。將該懸浮液冷卻至-5℃及慢慢加入NMM(14.95克2.45當量)。最後，加入在乙腈(120毫升6V)中的EDC.HCl(15.3克1.3當量)溶液。然後，將該反應混合物升溫至25℃及在相同溫度下攪拌10-12小時。在低於40℃之真空下移除溶劑及以水(120毫升6V)稀釋。以醋酸乙酯(878毫升45V)、水(120毫升6V)及10%碳酸鈉(110毫升5.7V)萃取產物。以醋酸乙酯(2x430毫升2x22V)萃取水層，及結合有機層，並以10%檸檬酸溶液(2x105毫升)、10%碳酸鈉溶液(2x110毫升2x5V)、水(120毫升6V)清洗，及在硫酸鈉上乾燥。在低於40℃之真空下將該有機層濃縮至10-12體積，以醋酸乙酯剝離(3x20V)及在每次剝離中維持該最後10-12體積。將正己烷(14V)逐滴加入至該濃縮物主體以獲得白色固體。過濾出固體及乾燥，以獲得產物。
輸出29.2克；產率：86.6%；純度99.18%，[α]26 D：-26.0°(c 1，CHCl3)。
CLEU-5：
讓CLEU-4(16.3克)進入在不銹鋼帕爾氫化燒瓶中的甲醇(163毫升10V)、丙酮(22毫升1.4V)之混合物中。加入10% Pd/C(10%w/w)及在25℃下氫化(60磅/平方英寸)該混合物8-12小時。在起始材料已經消失(TLC)後，讓觸媒過濾過塞里塑料及以甲醇(163毫升10V)清洗。在低於40℃之真空下濃縮濾出液及以醋酸乙酯(3x143毫升3x9V)剝離殘餘物。然後，讓殘餘物進入醋酸乙酯(51毫升3 V)中及加入正己烷(20.4毫升1.25V)。攪拌該混合物2-3小時以獲得自由態固體。過濾該固體，以正己烷(38毫升2V)清洗，及在低於40℃之真空下乾燥。
輸出：12.3克；產率：90.8%；純度：98.9%。
CLEU-6：
將CLEU-5(12.2克)加入至THF(40毫升3.3V)及將該混合物冷卻至0℃。在20分鐘期間，將10%碳酸鈉溶液(34毫升2.7V)加入至該混合物。然後，在15-20分鐘期間，於0℃下，慢慢加入在THF(12.2毫升1.0V)中的Fmoc-Cl(8.63克1.2當量)。在相同溫度下攪拌該反應混合物1小時及以水(134.2毫升11V)稀釋。以醋酸乙酯(269毫升22V)萃取產物。以水(134.2毫升11V)、10%檸檬酸溶液(2x134毫升2x11V)及水(134.2毫升11V)清洗有機層。在低於40℃之真空下濃縮有機層及藉由管柱層析法純化粗產物。
輸出：13.3克；產率：73.2%；純度：98.2%。
CLEU-7：
在-5℃下，將CLEU-6(9.0克)充入至TFA(61毫升6.75V)及間-甲酚(0.61毫升)溶液。在0℃下攪拌該反應混合物2小時，然後在低於35℃之真空下濃縮。藉由與甲苯(2x45毫升)共蒸餾移除微量TFA。從MTBE(9毫升1V)與DIPE(90毫升10V)之混合物結晶產物。
在氮氣下過濾出固體，以DIPE(180毫升20V)清洗及在真空下乾燥以獲得純CLEU-7。
輸出：8.8克；產率：90.4%；純度：98.3%。
註釋：CLEU-7材料本質具吸濕性，因此應該小心處理。
CLEU-8：
讓CLEU-7(8.5克)進入乙腈(85毫升10V)中。將Boc-Leu-OH(3.12克1.1當量)、HOBt(2.31克1.39當量)及NMM(1.4毫升1.03當量)加入至該溶液。將該溶液冷卻至-2℃及以NMM(1.4毫升1.03當量)與EDC.HCl(2.58克1.1當量)處理。在0℃下攪拌該反應混合物2-3小時及藉由在真空下蒸餾移除溶劑。將10%檸檬酸(85毫升10V)及醋酸乙酯(213毫升25V)加入至該殘餘物。分離有機層，及以10%檸檬酸溶液(2x85毫升2x10.0V)、DM水(85毫升10V)及5%碳酸氫鈉溶液(3x85毫升3x10.0V)及再次以DM水(85毫升10V)清洗。最後，在硫酸鈉上乾燥有機層及在低於35℃之真空下濃縮以獲得粗產物。從MTBE(68毫升8V)及正己烷(34毫升4V)結晶粗產物。在低於35℃之真空下乾燥固體。
輸出：7.8克；產率：81.2%；純度：97.5%。
CLEU-9：
在-5℃下，將CLEU-8(7.5克)充入至TFA(54毫升7.2V)及間-甲酚(0.27毫升)溶液。在0℃下攪拌該反應混合物2.0小時，然後在低於35℃之真空下濃縮。藉由與甲苯(2x38毫升)共蒸餾移除微量TFA，從MTBE(75毫升10V)與正己烷(413毫升15V)結晶產物。在氮氣下過濾固體，以正己烷(37.5毫升5V)清洗，及在真空下乾燥以產生純CLEU-9。
輸出：7.2克；產率：94.8%；純度：97.2%。
CLEU-12：
在氮環境下，讓CLEU-9(10.5克)進入乙腈(158毫升15V)中。將CMAP-5A(4.2克1.0當量)、HOBt(2.11克1.2當量)加入至懸浮液中及將該混合物冷卻至0℃。將EDC.HCl(2.73克1.1當量)加入至懸浮液中，接著慢慢加入NMM(1.38克1.05當量)。在0℃下攪拌該反應混合物0.5小時，升溫至週圍條件，然後繼續攪拌3小時。在低於35℃之真空下移除溶劑，及讓殘餘物進入10%檸檬酸(105毫升10V)與醋酸乙酯(263毫升25V)之混合物中。分離有機層，及以10%檸檬酸溶液(105毫升10V)、DM水(105毫升10V)、5%碳酸氫鈉溶液(3x105毫升3x10V)及DM水(105毫升10V)清洗。在硫酸鈉上乾燥有機層，及在低於35℃之真空下濃縮。以正己烷(84毫升8V)析出粗產物，以正己烷(2x84毫升2x8V)清洗，及在35℃之真空下乾燥。
輸出：10.5克；產率：80.7%；純度：92.1%。
CLEU-13：
在-5℃下，將CLEU-12(10.5克)充入至TFA(78.8毫升7.5V)及間-甲酚(0.4毫升)溶液。在0℃下攪拌該反應混合物2小時，然後在低於35℃之真空下濃縮。藉由與甲苯(2x52毫升)共蒸餾移除微量TFA。將殘餘物溶解在醋酸乙酯(105毫升10V)中，及加入正己烷(158毫升15V)以析出產物。在氮氣下過濾出固體及以正己烷(53毫升5V)清洗。在35℃之真空下乾燥該化合物。
輸出：9.6克；產率：90.5%；純度：91.9%。
CLEU-14：
在氮環境下，將CLEU-13(9.5克)溶解於DMF(95毫升10V)中。將NMM(1.0克1.05當量)、CSER-2(3.95克1.0當量)及HOBt(1.4克1.1當量)加入至該溶液及將該反應物料冷卻至0℃。隨後，將EDC.HCl(2.0克1.1當量)及NMM(1.0克1.05當量)加入該混合物中。在0℃下攪拌該反應物料5小時，然後傾入冰冷卻的水(950毫升100V)中及攪拌30分鐘。過濾出析出的固體，及以水(20V)、10%檸檬酸(10V)、再次以水(190毫升20V)、5%NaHCO3溶液(95毫升10V)及水(95毫升10V)清洗。在低於35℃之真空下乾燥產物。
輸出：10.3克；產率：84.40%；純度：90.4%。
CLEU-15：
在-5℃下，將CLEU-14(10.0克)充入至TFA(75毫升7.5克)及間-甲酚(0.37毫升)溶液。在0℃下攪拌該反應混合物2小時，然後在低於35℃之真空下濃縮。藉由與甲苯(2x50毫升)共蒸餾移除微量TFA。將殘餘物溶解在醋酸乙酯(100毫升10V)中，及加入正己烷(60毫升6V)以析出產物。在氮氣下過濾出固體，以正己烷(2x30毫升6V)清洗，然後在35℃之真空下乾燥。
輸出：9.6克；產率：95.0%；純度：91.5%。
CSER-2：
在L-氫乳清酸(23.4克，148毫莫耳)及N-羥基琥珀醯亞胺(18.14克1.1當量)於乾DMF(585毫升25V)中之攪拌溶液中，加入DIC(20.5克1.1當量)，伴隨著外部冰水冷卻。在室溫下攪拌該反應混合物13-14小時。過濾出析出物及蒸餾濾出液。以二異丙基醚(94毫升4V)清洗該油狀殘餘物及將其溶解在乾DMF(293毫升12.5V)中。將N-Boc-L-4-胺基苯基丙胺酸(41.5克1.0當量)加入至上述溶液。在0℃下加入DIEA(22.97克1.2當量)及攪拌該反應混合物22小時，然後蒸發溶劑。讓殘餘物與水(702毫升30V)混合及以飽和的碳酸氫鈉溶液將所產生的懸浮液之pH調整至9.0。過濾出二異丙基脲之析出物及以醋酸乙酯(70.2毫升3V)清洗濾出物。以6N HCl將水層酸化至pH 2.5及藉由過濾收集所產生的析出物。獲得產物，如為黃色固體。
輸出：40.0克；產率64%；mp-270℃，[α]25 D=+61.5(c 1.0，1%NaHCO3)；純度95%。
CBBC-2B：
在30-35℃下，將片段-A(20.0克)(從英國的奇洛科技(Chirotech)購買)溶解在DMF(300毫升15V)中，然後冷卻到-10℃至5℃，其中將HOBt(5.06克1.1當量)加入至該混合物，且在將L-絲胺酸甲基酯(5.29克1.0當量)加入至該懸浮液前攪拌30分鐘。攪拌該混合物30分鐘，以NMM(7.23克2.1當量)處理，然後攪拌30分鐘。然後，在-5℃至0℃下，將EDC.HCl(7.18克1.1當量)加入至該懸浮液及攪拌該反應混合物5小時。將該反應混合物傾入冷凝的DM水(1.5升或1500毫升75V)中及攪拌30分鐘。藉由在0-5℃下攪拌以析出產物。在1小時後，藉由過濾收集所產生的固體。以水(200毫升10V)、10%檸檬酸(200毫升10V)、再次以水(200毫升10V)、5%NaHCO3溶液(200毫升10V)、水(200毫升10V)清洗濾餅，然後在真空下乾燥該固體4小時。在甲醇(300毫升15V)中漿體化該產物及攪拌1小時。過濾懸浮液及以甲醇(100毫升5V)清洗塊餅，然後在30-35℃之真空下乾燥至固定重量。
輸出：22克；產率：93.8%。
CBBC-3B：
將CBBC 2B(20.0克)懸浮於THF(500毫升25V)中，然後攪拌及冷卻到-5℃至0℃。在該經冷卻的溶液中，以將反應溫度維持在-5℃至0℃間之此速率加入氫氧化鋰水溶液(3.65克3.0當量)(約30分鐘)。在加入鹼後，該固體溶解而獲得稍微混濁的溶液。在低於-5℃至0℃下繼續攪拌另外2小時。在3小時後，於5℃下，伴隨著好的攪拌，將該混濁的反應混合物慢慢加入冰/水(700毫升35V)，藉此在真空下過濾任何不溶解的顆粒。當攪拌時，使用2M HCl(40毫升2V)將pH調整至4.2。藉由過濾收集該厚的白色析出物，及以200毫升10V的水清洗該潮溼的塊餅，在真空下簡短地風乾，在400毫升20V的甲醇中漿體化，然後在迴流下攪拌。過濾該懸浮液及再次以200毫升10V的甲醇清洗該潮溼的塊餅，然後在真空下乾燥。然後，讓該潮溼的塊餅進入甲醇(400毫升20V)及乙腈(200毫升10V)中，及在迴流下攪拌。熱過濾該懸浮液及以200毫升10V的甲醇清洗該潮溼的塊餅，然後在真空下乾燥。在35℃之真空下乾燥該產物至固定重量，以獲得四胜肽酸Ac-(AA1-AA4)。
輸出：12.0克；產率：62.0%；純度：97.1%。
CDEG-1：
將CLEU-15(4.3克)、CBBC-3A(2.24克1.0當量)及HOAt(0.56克1.2當量)充入包含RBF的DMF(~26毫升6V)中。在25℃下攪拌該混合物15-30分鐘以產生透明的溶液，然後以DIPEA(1.71克4.0當量)處理。然後，將該反應冷卻至-15℃及將HATU(1.57克1.25當量)加入至混合物。在-10℃下攪拌該反應混合物2小時，升溫至20℃，然後在相同溫度下攪拌1小時。將該反應物料加入至10%檸檬酸溶液(270毫升60V)及在10℃下攪拌30分鐘。過濾所析出的固體，以水(270毫升30V)、5%NaHCO3溶液(130毫升30V)及再次以水(270毫升60V)清洗。在35℃之真空下乾燥該固體。
輸出：4.0克；產率：65.1%；純度79.25%。
CDEG：
在氮環境下，將20%在DMF(25毫升5V)中的哌啶充入RBF中。將該溶液冷卻至-5℃及加入CDEG-1(5.0克)。在0℃下攪拌該反應混合物45分鐘。將該反應混合物傾入DIPE(250毫升50V)中，然後攪拌15分鐘。在氮氣下過濾出所析出的固體及以DIPE(50毫升10V)清洗。然後，在25℃下將該固體溶解於醋酸乙酯(125毫升25V)中及攪拌1小時。過濾所獲得的細微固體，以醋酸乙酯(50毫升10V)清洗，然後在真空下乾燥。
輸出：4.7克；產率：定量，純度：87.6%，D-Ser雜質1.5%，乙內醯脲雜質0.16%。
用於CDEG的HPLC條件：
管柱：YMC基本(250毫米x3.0毫米)，5微米
動相A：0.1%TFA在ACN中
動相B：0.1%TFA在H2O中
波長：226奈米；稀釋劑：動相A：M.P.B27：73
管柱溫度：50℃，注射體積：50微升
梯度T/%A=0/73，18/70，41/30，43/73，50/73
流速：0.5毫升/分鐘
第1圖係四胜肽Ac-AA1-AA4之液相製備。
第2圖係經Pε保護的六胜肽AA5-AA10NH2之製備，其中Pε係Fmoc。
第3圖係斷片縮合及去保護以產生地蓋瑞利。
第4圖係在AA4上具有假脯胺酸保護基團的四胜肽Ac-AA1-AA4之固相製備。
第5圖係在AA4上具有tBu保護基團的四胜肽Ac-AA1-AA4之固相製備。
第6圖係經Boc保護的AA5-AA7之固相製備。
第7圖係經Fmoc保護的AA8-AA10NH2之固相製備。

Claims (27)

  1. 一種用以製備具有式Ac-AA1-AA10-NH2的地蓋瑞利或其醫藥上可接受的鹽或溶劑化物之液相方法： 其包括在有機溶劑中，自如式(P4)(Pε)Ac-AA1-AA10-NH2的地蓋瑞利前驅物中切割ε-胺基保護基團Pε之步驟，該有機溶劑包含該前驅物及一溶解在該有機溶劑中的切割試劑： 其中P4係羥基保護基團或氫。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該切割試劑係三氟醋酸及/或哌啶。
  3. 一種用以製備具有式(P4)(Pε)Ac-AA1-AA10-NH2之經保護的地蓋瑞利前驅物或其醫藥上可接受的鹽或溶劑化物之液相方法： 其包括在有機溶劑中，偶合(P4) Ac-AA1-AA4與(Pε)AA5-AA10NH2或偶合Ac-AA1-AA3與(P4)(Pε)AA4-AA10NH2的步驟，該有機溶劑包含二種胜肽、胜肽偶合劑及溶解在該有機溶劑中的有機胺鹼，其中Pε係ε-胺基保護基團且P4係羥基保護基團或氫，及該胜肽係如下所示：
  4. 如申請專利範圍第1至3項之任一項的方法，其中Pε係選自於由三級丁氧基羰基(Boc)、9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)及烯丙氧基羰基(Alloc)所組成之群。
  5. 如申請專利範圍第1至4項之任一項的方法，其中該Pε保護基團係Fmoc。
  6. 如申請專利範圍第1至5項之任一項的方法，其中該有機溶劑係DMF。
  7. 如申請專利範圍第3至6項之任一項的方法，其中該胜肽偶合劑係選自於下列之一或多者：o-(7-吖苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HATU)、o-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)及o-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓(TBTU)四氟硼酸鹽、及1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)、(2-(6-氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基銨)六氟磷酸鹽(HCTU)、2-(苯并三唑-1-基)氧基-1,3-二甲基咪唑啶鎓六氟磷酸鹽(BOP)及二異丙基碳二醯亞胺(DIC)。
  8. 如申請專利範圍第3或7項之任一項的方法，其中該有機胺鹼係選自於下列之一或多者：N,N’-二異丙基乙基胺(DIPEA)、N-甲基嗎福啉(NMM)、三乙基胺(TEA)或2,4,6-三甲基吡啶。
  9. 如申請專利範圍第3至8項之任一項的方法，其中該溶液進一步包括一選自於下列溶解在其中的偶合添加劑：3,4-二氫-3-羥基4-側氧-1,2,3-苯并三(HOOBt)、1-羥基-7-吖-苯并三唑(HOAt)或1-羥基苯并三唑(HOBt)。
  10. 如申請專利範圍第3至9項之任一項的方法，其中該有機胺鹼係DIPEA及該胜肽偶合劑係HATU。
  11. 如申請專利範圍第3至10項之任一項的方法，其中該有機胺鹼係DIPEA及該胜肽偶合添加劑係HOAt。
  12. 如申請專利範圍第3至11項之任一項的方法，其中該胜肽偶合劑係HATU及該胜肽偶合添加劑係HOAt。
  13. 如申請專利範圍第3至12項之任一項的方法，其中該有機胺鹼係DIPEA，該胜肽偶合劑係HATU及該胜肽偶合添加劑係HOAt。
  14. 如申請專利範圍第3至13項之任一項的方法，其中該有機胺鹼的使用量係AA5-AA10六胜肽之2.5至3.5莫耳當量，較佳為約3莫耳當量。
  15. 如申請專利範圍第3至14項之任一項的方法，其中將該有機溶劑冷卻至溫度-10℃或-10℃以下，較佳為-15℃或-15℃以下，然後在該溫度下進行反應。
  16. 如申請專利範圍第3至15項之任一項的方法，其中在加入該偶合劑及該有機胺前，首先將該該胜肽及該偶合添加劑溶解在該有機溶劑中。
  17. 一種用以製備具有式(P4)Ac-AA1-AA4的地蓋瑞利中間產物或其醫藥上可接受的鹽或溶劑化物之液相方法： 其包括以鹼性氫氧化物水解具有式(P4)Ac-AA1-AA4-R的化合物之步驟，其中R代表羧基保護基團，較佳為C1-C4烷基或苄基，且P4代表氫或羥基保護基團：
  18. 一種用以製備六胜肽(Pε)AA5-AA10NH2之液相方法，其包括偶合(Pε)AA6-AA10NH2與(Px)AA5以提供(Px)(Pε)AA5-AA10NH2，其中Px係胺基保護基團，且AA5至AA10及Pε具有與在申請專利範圍第11項中相同的意義；及，以TFA切割Px以提供(Pε) AA5-AA10NH2，其中(Px)(Pε) AA5-AA10NH2、(Pε)AA6-AA10NH2及(Px)AA5具有下列結構：
  19. 如申請專利範圍第17及/或18項之方法，其係接續進行如申請專利範圍第3至15項之任一項的方法，及選擇性地接續進行如申請專利範圍第1或2項之任一項的方法。
  20. 如申請專利範圍第17及/或19項之方法，其中該具有式Ac-AA1-AA4-R的化合物係首先藉由偶合Ac-AA1-AA3與(P4)AA4-R或偶合Ac-AA1-AA2與(P4)AA3-AA4-R來製備，該胜肽係係如下所示：
  21. 如申請專利範圍第17項及19至20項之任一項的方法，其中R係甲基或苄基。
  22. 如申請專利範圍第17至19至21項之任一項的方法，其中該鹼性氫氧化物係LiOH。
  23. 一種根據下式之中間產物多胜肽： 其中R係羧基保護基團，較佳為C1-C4烷基或苄基；Pε係胺基保護基團；且P4係氫或羥基保護基團。
  24. 一種用於純化地蓋瑞利的方法，其包括藉由製備型HPLC進行的純化步驟，該HPLC使用PLRP-S管柱。
  25. 一種用以製備具有下式之地蓋瑞利中間產物或其醫藥上可接受的鹽或溶劑化物之固相方法： 其包括下列步驟：a)將(PN)AA2與(P4)AA3-AA4-反應以提供(P4,PN)AA2-AA4-；b)從(P4,PN)AA2-AA4-移除PN以提供(P4)AA2-AA4-；c)將(PN)AA1與(P4)AA2-AA4-反應以提供(P4,PN)AA1-AA4-；d)若PN非為乙醯基時，從(P4,PN)AA1-AA4-移除PN以提供(P4)AA1-AA4-，隨後乙醯化(P4)AA1-AA4-以提供(P4)Ac-AA1-AA4-；及e)切割(P4)Ac-AA1-AA4-以提供(P4)Ac-AA1-AA4。其中P4係在AA4上的H或羥基保護基團，且PN係胺基保護基團。
  26. 一種用以製備六胜肽(Pε)AA5-AA10NH2之液相方法，其藉由偶合(P5)AA5-AA7與(Pε)AA8-AA10NH2以提供(P5,Pε)AA5-AA10NH2，隨後切割P5以提供(Pε)AA5-AA10NH2，其中P5係在AA5上的胺基保護基團且Pε係在AA6上的側鏈胺基保護基團。
  27. 如申請專利範圍第26項之液相方法，接著將(P4)Ac-AA1-AA4偶合至(Pε)AA5-AA10NH2。
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