KR20010006233A - 5 및 6 위치에서 변형되는 지엔알에이치 길항제 - Google Patents

5 및 6 위치에서 변형되는 지엔알에이치 길항제 Download PDF

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Abstract

GnRH 길항성의 지속기간이 향상된 펩타이드가 제공된다. 이러한 길항제는 수정률의 조절 및 스테로이드-의존성 종양의 치료 및 기타 단기 및 장기 치료 조치용으로 사용될 수 있다. 이러한 길항제는 5 위치 또는 5 및 6 위치에 아미노 Phe 유도체 또는 이의 등가물을 갖는다. 이러한 유도체는 자체 측쇄에 우레아 잔기를 포함하여 카바모일 그룹 또는 헤테로사이클을 함유하도록 변형된다. 주사 후 96 시간에 LH 분비의 매우 상당한 억제를 계속 보이는 특히 효과적인 데카펩타이드는 하기 서열식으로 표시된다.
Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-하이드로오로틸)-D-4Aph(아세틸)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2,및 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-하이드로오로틸)-D-4Amf(Q2)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-Xaa10(여기에서, Q2는 Cbm 또는 MeCbm이고 Xaa10은 D-Ala-NH2, D-Ala-ol 또는 Ala-ol이다).

Description

5 및 6 위치에서 변형되는 지엔알에이치 길항제{GnRH ANTAGONISTS BEING MODIFIED IN POSITIONS 5 AND 6}
종종 고나도트로핀 또는 성선자극호르몬으로 불리는 여포 자극 호르몬(FSH) 및 황체형성 호르몬(LH)은 경상부(莖狀部)에 의해 시상하부에 부착되어 있는 뇌하수체에 의해 방출된다.
뇌하수체 전엽에 의한 호르몬 방출은 통상적으로 GnRH 데카펩타이드와 같이 시상하부에 의해 생성된 호르몬의 선행 방출을 요한다.
GnRH의 정상적인 기능에 길항적인 GnRH 동족체의 투여방법이 일반적으로 포유류에서 고나도트로핀의 분비 억제 및 배란의 억제 또는 지연에 사용되어 왔다.
개선된 GnRH 길항제에 대한 탐구는 Antide, 즉 [Ac-D-2Nal1, D-4ClPhe2, D-3Pal3, Lys(Nic)5, D-Lys(Nic)6, ILys8, D-Ala10]-GnRH; 및 Cetrorelix, 즉 [Ac-D-2Nal1, D-4ClPhe2, D-3Pal3, D-Cit6, D-Ala10]-GnRH의 제조로 귀착되었다. 미국 특허 제5,516,887호는 혈장 테스토스테론 억제에 있어 Antide보다 더욱 효과적이라는 GnRH 길항제, 즉 Antarelix로 불리는 [Ac-D-2Nal1, D-4ClPhe2, D-3Pal3, D-N6-카바모일 Lys6, ILys8, D-Ala10]-GnRH에 대해 기술하고 있다.
1994년 3월 22일자로 허여된 미국 특허 제5,296,468호는 선택된 잔기의 측쇄가 반응되어 시아노구아니디노 잔기(이의 일부는 추후에 목적하는 헤테로사이클, 예를 들면, 3-아미노-1,2,4-트리아졸(atz)로 자발적으로 전환된다)를 생성하는 다수의 GnRH 길항제의 디자인과 합성을 기재하고 있다. 이러한 시아노구아니디노 잔기는 라이신, 오르니틴, 4-아미노 페닐알라닌(4Aph) 또는 이의 연장된 쇄 버전, 예를 들면 4-아미노 호모페닐알라닌(4Ahp)과 같은 아미노산 측쇄내 오메가-아미노 그룹에 구축된다. 5 및 6 위치에 상당히 변형되거나 비천연 아미노산이 있는 GnRH 길항제는 양호한 생물학적 잠재력을 보이며, Aph에 구축된 것들이 일반적으로 바람직한 것으로 생각된다. 특히 바람직한 것은 Azaline B, 즉 [Ac-D-2Nal1, D-4ClPhe2, D-3Pal3, 4Aph(atz)5, D-4Aph(atz)6, ILys8, D-Ala10]-GnRH이다. 미국 특허 제5,506,207호는 5 및 6 위치에 있는 잔기의 아미노-치환 페닐알라닌 측쇄가 아실화된 생물학적 효능이 있는 GnRH 길항제를 기재하고 있으며; 특히 잠재력이 있는 하나의 데카펩타이드는 Acyline, 즉 [Ac-D-2Nal1, D-4ClPhe2, D-3Pal3, 4Aph(Ac)5, D-4Aph(Ac)6, ILys8, D-Ala10]-GnRH이다.
GnRH 길항제의 이러한 그룹의 매력적인 성질에도 불구하고, 여전히 더욱 개선된 GnRH 길항제, 특히 생물학적 작용의 장기 지속을 보이는 것들에 대한 탐구가 지속되어 왔다. 펩타이드 동족체가 LH 분비에 대하여 활성의 장기 지속, 즉 단기 및 장기 치료 조치 모두에 대하여 체내에서의 단백질 분해효소 분해에 대한 펩타이드의 내성에 의해 증진될 수 있는 성질을 보여야 함이 빈번하게 중요할 수 있다. 또한, 포유류, 특히 인간에 심각한 겔화 없이 이들 화합물의 투여를 촉진하기 위해서는, 이러한 GnRH 길항성 데카펩타이드가 정상적인 생리 pH, 즉 약 pH 5 내지 약 pH 7.4에서 높은 수중 용해도를 보유하도록 하는 것이 매우 유리할 것으로 생각된다.
발명의 개요
본 발명에 이르러 비로서, Cetrorelix, Antarelix, Acyline, Antide 및 기타의 것들을 포함한 GnRH 길항제의 이러한 아류에서 5 위치 잔기, 또는 5 및 6 위치 잔기에 대한 특정의 다른 변형으로 피하투여시 생물학적 활성의 특히 유리한 장기 지속성을 보이는 화합물이 예기치 않게도 생성됨이 발견되었다. 이러한 변형을 4-아미노Phe 또는 이의 등가물인 4Ahp에 또는 4-아미노메틸 페닐알라닌(4Amf)(여기에서, 1차 아미노 그룹은 4- 또는 파라 위치에 부착된 메틸 그룹에 결합된다)에 가하였다. 이러한 변형에서, 측쇄의 아미노 그룹은 이소시아네이트와 반응하여 우레아 그룹을 형성하거나 우레아 잔기를 구성하도록 배열된 적어도 2개의 질소원자를 함유하는 헤테로사이클릭 카복실산과 반응하였다. 바람직한 헤테로사이클릭 반응물은 D- 또는 L-하이드로오로틴산(Hor)(C4N2H5(O)2COOH) 및 D- 또는 L-2-이미다졸리돈-4-카복실산(Imz)(C3N2H5(O)COOH)이다.
일반적으로, 하기 서열식의 GnRH 길항제 데카펩타이드, 및 밀접하게 관련된 동족체 및 약학적으로 허용되는 염이 개선된 약리학적 성질, 특히 생물활성의 장기 지속성을 지닌 것으로 밝혀졌다:
X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Xaa8-Pro-Xaa10
상기에서,
X는 7개 이하의 탄소원자를 갖는 아실 그룹 또는 Q이고 Q는이며, R은 H 또는 저급 알킬이며;
A는 4Cl, 4F, 4Br, 4NO2, 4CH3, 4OCH3, 3,4Cl2또는 CαMe4Cl이며;
Xaa5는 Aph(Q1) 또는 Amf(Q1)이며 Q1은
이며,
Xaa6은 D-Aph(Q2), D-Amf(Q2), D-Lys(Nic), D-Cit, D-Hci 또는 D-Pal이며, Q2는 For, Ac, 3-아미노-1,2,4 트리아졸, Q 또는 Q1이며;
Xaa8는 Lys(ipr), Arg, Har, Arg(Et2) 또는 Har(Et2)이며;
Xaa10은 D-Ala-NH2, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH2CH3, Gly-NH2, AzaGly-NH2, Ala-NH2, Agl-NH2, D-Agl-NH2, Agl(Me)-NH2또는 D-Agl(Me)-NH2이며, 단 Xaa5의 α-아미노 그룹은 임의로 메틸화될 수 있다.
이와 달리, Xaa6가 D- 또는 L-Hor 또는 D- 또는 L-Imz를 함유할 때, Xaa5는 Ac, For 또는 3-아미노-1,2,4-트리아졸을 Q1으로서 가질 수 있고, Xaa6가 Q를 함유할 때 Xaa5는 또한 Q를 함유할 수 있다.
다른 일면으로서, 본 발명은 GnRH가 과도한 호르몬 분비 또는 종양 증식을 일으키는 증상의 생체내 또는 시험관내 진단법을 제공하며, 이 방법은 전술한 유형의 GnRH 길항제 펩타이드를 투여하고 호르몬 분비나 종양 세포 증식을 모니터링 하는 단계를 포함한다.
다른 일면으로서, 본 발명은 하기 서열식의 GnRH 길항제 펩타이드 제조를 위한 중간체를 제공한다.
X1-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser(X2)-Xaa5-Xaa6-Leu-Lys(ipr)(X4)-Pro-X5
상기에서,
X1은 α-아미노 보호그룹이고;
A는 4Cl 또는 4F이며;
X2는 H 또는 하이드록시-보호그룹이며;
Xaa5는 Aph(Q1) 또는 Amf(Q1)이며 Q1은
의 D-이성체, L-이성체 또는 D/L 이성체 혼합물이며;
Xaa6는 D-Aph(Q2), D-Amf(Q2) 또는 D-Pal이며, Q2는 Ac, Q1, 카바모일 또는 메틸카바모일이며;
X4는 산-불안정 아미노 보호그룹이며;
X5는 D-Ala-, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl-, Agl(Me)-, 또는 D-Agl(Me)-수지 지지체; N(Et)-수지 지지체; D-Ala, Gly 또는 Ala의 아미드; 에틸아미드; AzaGly-NH2; 또는 OH이며, 단 Xaa5의 α-아미노 그룹은 메틸화될 수 있다.
이들 길항제는 활성의 장기 지속, 즉 적어도 약 4일간 LH 분비를 실질적으로 지속적으로 억제하기 때문에 인간에 있어서 고나도트로핀 분비의 억제 및 수정률 조절제로서 특히 유용하다. 이들은 생리 pH에서 수성 완충제내 개선된 용해도 및 히스타민 방출의 자극에 대해 허용할 만한 부작용, 즉 현재 임상적으로 사용되는 GnRH 수퍼효능제보다 양호하며; 이들은 또한 유효농도에서 피하(sc)주사시 최소한의 겔화를 보인다. 이들 GnRH 길항제는 또한 비교적 적은 부스럼을 일으키는 유과민성 분석에서 잘 듣는다. 결과적으로, 이들 펩타이드는 포유류, 특히 인간 투여에 있어서 수정률 조절제로서 및 성조발증, 호르몬-의존성 신생물 형성, 월경곤란증, 자궁내막증식증, 스테로이드-의존성 종양, 및 전술한 기타 장단기 전조의 치료용으로 특히 유용하다. 이들은 또한, 진단학적으로도 유용하다.
이들 GnRH 길항제가 약 5 내지 약 7.4의 생리학적 pH 범위에서 용이하게 가용성이기 때문에, 이들은 특히 약 5 내지 약 7의 pH에서 제형되어 농축형태로 투여될 수 있다. 이들의 극성으로 해서, 이들은 공지의 공중합체를 기본으로 하는 서방제에 사용하기에 특히 적당하다. 이들 GnRH 길항제는 장기간 LH 및 FSH의 유효한 억제를 보이므로, 이들은 또한 포유류 수컷의 피임처리(테스토스테론의 임의 투여와 함께) 및 스테로이드-의존성 종양의 치료에 특히 유용하다.
본 발명은 일반적으로 인간 고나도트로핀 방출 호르몬(GnRH)의 길항제이고 유리한 물리적, 화학적 및 생물학적 성질을 지닌 펩타이드에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명은 생식선 기능 및 스테로이드 호르몬인 프로제스테론과 테스토스테론의 방출을 좀더 긴 지속기간 동안 억제하는 데카펩타이드, 및 이러한 목적을 위한 그러한 데카펩타이드를 함유하는 약학 조성물의 투여방법 및 특히 생식선 스테로이드의 과분비로부터 연유하는 증상을 관리하는 것이다.
최근 10 내지 12년 동안, GnRH의 서열내 10개의 잔기 각각의 특별한 성질이 유효 길항제 창출관점에서, 심도있게 연구되어 왔으며, 연구 결과 선택될 수 있는 각종 등가의 잔기가 존재하고 이들 등가물 중 하나를 다른 것으로 치환하여도 데카펩타이드 GnRH 길항제의 생물학적 효능을 심각하게 일탈시키지는 않음을 발견하였다. 이러한 등가 치환이 본 발명의 GnRH 길항제에 수행될 수 있다.
예를 들면, 2 위치에서 파라-치환 D-Phe 또는 2,4 디클로로-치환 D-Phe 또는 D-CαMe4ClPhe 또는 D-펜타메틸(Me5)Phe 잔기의 포함은 GnRH 길항제에 현저하게 길항제 활성을 부가하는 것으로 일반적으로 받아들여지고 있지만; 환 치환체의 특이적 동질성은 클로로, 플루오로, 브로모, 니트로, 메틸 및 알콕시 중에서 선택될 때 비교적 중요성이 적다. 따라서, 2 위치의 이러한 잔기는 통상적으로 사용되고 있는 D-4ClPhe의 등가물인 것으로 생각된다. Phe7는 Leu7과 동등한 것으로 생각된다. N 말단은 바람직하게는 N-아실화되며, 바람직하게는 아세틸(Ac)로, 그러나 또한 7개 이하의 탄소원자를 갖는 기타 아실 그룹, 예를 들면, 포밀(For), 아크릴릴(Acr), n-프로피오닐(Pn), 부티릴(By), 발레릴(V1), 비닐아세틸(Vac) 및 벤조일(Bz)로 아실화되거나; 이와 달리, 치환되거나 비치환된 카바모일로 변형시킬 수 있다. 기타 긴 아실 그룹도 동등한 것으로 생각되지만 덜 바람직하다. 5 위치 잔기 상의 α-아미노 그룹은 수중 용해도를 증가시키기 위해 미국 특허 제5,110,904호에 기재된 바와 같이 임의로 메틸화될 수 있지만, 이러한 변형은 LH 억제 지속기간의 단축 및 히스타민 방출에 대한 좀더 큰 잠재력을 가져올 수 있다. C 말단은 바람직하게는 D-Ala-NH2, D-Ala-ol 또는 Ala-ol이지만; Gly-NH2, NHCH2CH3, AzaGly-NH2, Ala-NH2, Agl-NH2, D-Agl-NH2, Agl(Me)-NH2및 D-Agl(Me)-NH2도 이들이 공지의 등가물인 것으로 생각됨에 따라 대신 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 하기 서열식의 GnRH 길항제 계통 및 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공하는 것으로 생각된다.
X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Xaa8-Pro-Xaa10
상기에서,
X는 For, Ac, Acr, Pn, By, Vl, Vac, Bz 또는 Q이며, Q는이며, R은 H 또는 저급 알킬이며;
A는 4Cl, 4F, 4Br, 4NO2, 4CH3, 4OCH3, 3,4Cl2또는 CαMe4Cl이며;
Xaa5는 Aph(Q1) 또는 Amf(Q1)이며 Q1은
이며,
Xaa6은 D-Aph(Q2), D-Amf(Q2), D-Lys(Nic), D-Cit, D-Hci 또는 D-Pal이며, Q2는 For, Ac, 3-아미노-1,2,4 트리아졸, Q 또는 Q1이며;
Xaa8은 Lys(ipr), Arg, Har, Arg(Et2) 또는 Har(Et2)이며;
Xaa10은 D-Ala-NH2, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH2CH3, Gly-NH2, AzaGly-NH2, Ala-NH2, Agl-NH2, D-Agl-NH2, Agl(Me)-NH2또는 D-Agl(Me)-NH2이며, 단 Xaa5의 α-아미노 그룹은 임의로 메틸화될 수 있다.
GnRH 길항제의 밀접히 관련된 계통에서, Xaa5는 Ac, For 또는 3-아미노-1,2,4-트리아졸을 Q1으로서 가질 수 있고, 이 경우 Xaa6은 D- 또는 L-Hor 또는 D- 또는 L-Imz 형태로 Q2를 포함한다.
Xaa6이 Q를 포함하는 GnRH 길항제의 다른 밀접히 관련된 계통에서, Xaa5는 또한 Q를 포함한다.
D-Nal이란 β-탄소원자상에서 나프틸로 치환되는 알라닌의 D-이성체를 의미하며, 즉 또한 β-D-Nal 또는 3-D-Nal로 언급된다. 바람직하게는, 환 구조상 2 위치에서 나프탈렌에 부착된 D-2Nal이 사용된다; 그러나, D-1Nal도 사용될 수 있다. D-Cpa는 클로로-D-Phe, 및 D-4ClPhe를 나타내며, 즉 D-4Cpa가 바람직하다. D-Pal은 β-탄소원자상에서 피리딜로 치환된 알라닌의 D-이성체를 나타내며; 바람직하게는, 피리딘 환상의 3 위치에 결합되며, 즉 D-3Pal (β-3-피리딜-D-Ala)일 수 있지만, D-2Pal(β-2-피리딜-D-Ala)이 대신 사용될 수도 있다. 4Aph란 페닐 환상의 아미노 치환체가 4 위치에 있는 4NH2Phe를 의미하며; 3NH2Phe(3Aph)는 이들 동족체에서 이의 등가물인 것으로 생각된다. 또한, 2NH2Phe도 생물학적 효능면에서 동등한 것으로 추측된다. 4Amf란 측쇄 아미노 그룹에 메틸렌 결합된 4NH2CH2Phe를 의미하며; 3NH2CH2Phe(3Amf)는 동등한 것으로 생각된다. Hor 또는 L-Hor은 L-하이드로오로틸을 의미하고, Imz 또는 L-Imz이란 L-2-이미다졸리돈-4-카보닐을 의미하며 -- 이 중 하나는 또한 D 이성체 또는 D/L 혼합물로 사용될 수 있다. atz이란 3-아미노-1,2,4-트리아졸을 의미한다. Aph(atz)은 또한 더 정확한 화학명 4-(3´-아미노-1H-1´,2´,4´-트리아졸릴-5´-일)아미노페닐알라닌으로 알려져 있다. Lys(Nic)란 Nε-니코티노일 라이신을 의미하고, 즉 Lys의 ε-아미노 그룹은 3-카복시피리딘으로 아실화된다. D-Cit란 시트룰린의 D-이성체를 의미하며, D-Hci란 D-Nε-카바모일 라이신이기도 한 호모시트룰린의 D-이성체를 의미한다. ILys 또는 Lys(ipr)이란 Lys의 ε-아미노 그룹이 알킬화되는 Nε-이소프로필 라이신을 의미한다. Ala-ol이란 알라니놀, 즉 CH3CH(NH2)CH2OH를 의미하며, AzaGly-NH2는 NHNHCONH2를 의미한다. Har은 호모아르기닌을 의미한다. Agl이란 α-아미노글라이신을 의미한다. Cbm이란 카바모일을 의미하고, MeCbm이란 메틸카바모일 또는 -CONHCH3를 의미한다. 저급 알킬이란 C1내지 C5, 바람직하게는 C1내지 C3, 더욱 바람직하게는 C1또는 C2, 즉 메틸(Me) 또는 에틸(Et)을 의미한다.
비록 이러한 GnRH 길항제의 6 위치에 혼입하기에 바람직한 D-이성체가 구체적으로 기재되어 있지만, 과거 20년간에 걸쳐서 이 분야에서 광범위한 연구결과로 다수의 공지된 동등한 D-이성체가 존재함을 숙지하여야 한다. 이러한 선행기술 D-이성체 치환은 본원에 기재한 특정 5 위치 치환에 의해 제공된 생물효능과 부합되고 이로부터 일탈하지 않으며, 선택적으로 사용될 수 있다.
GnRH 길항제의 바람직한 아류 및 이의 약학적으로 허용되는 염은 하기 서열식을 갖는다.
X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Lys(ipr)-Pro-Xaa10
상기에서,
X는 For, Ac, Acr, Pn, By, Vl, Vac, Bz 또는 Q이며, Q는이며, R은 H 또는 저급 알킬이며;
A는 4Cl 또는 4F이며;
Xaa5는 Aph(Q1) 또는 Amf(Q1)이며 Q1은
이며,
Xaa6은 D-Aph(Q2), D-Amf(Q2), D-Cit, D-Lys(Nic) 또는 D-Pal이며, Q2는 For, Ac, Q 또는 Q1이며;
Xaa10은 D-Ala-NH2, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH2CH3또는 Gly-NH2이다.
GnRH 길항제의 추가의 바람직한 아류 및 이의 약학적으로 허용되는 염은 하기 서열식을 갖는다.
X-D-Nal-D-4Cpa-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Lys(ipr)-Pro-Xaa10
상기에서,
X는 Ac 또는 Q이며, Q는이며, R은 H 또는 메틸이며;
Xaa5는 Aph(Q1) 또는 Amf(Q1)이며 Q1은
이며,
Xaa6은 D-Aph(Q2), D-Amf(Q2) 또는 D-Pal이며, Q2는 Ac, Q 또는 Q1이며;
Xaa10은 D-Ala-NH2, D-Ala-ol 또는 Ala-ol이다.
GnRH 길항제의 추가의 바람직한 아류 및 이의 약학적으로 허용되는 염은 하기 서열식을 갖는다.
MeCbm-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-Xaa6-Leu-ILys-Pro-Xaa10
상기에서,
D-Xaa6는 D-4Amf(Q1), D-4Aph(Q1) 또는 D-3Pal이며 Q1은 D-Hor 또는이며,
R은 H 또는 저급 알킬, 바람직하게는 H 또는 메틸이며;
Xaa10은 D-Ala-NH2, D-Ala-ol 또는 Ala-ol이다.
본 발명의 화합물은 통상적인 펩타이드 용액 합성법으로 합성될 수 있으며, 이러한 합성법은 대량 산물에 바람직하다. 한정된 양, 예를 들면, 1 kg 미만을 수득하기 위해서는, 고체상 기술을 이용하여 합성하는 것이 바람직할 수 있다. 당해분야에 익히 공지되어 있는 측쇄 보호그룹이 바람직하게는, 수지에 구축되는 쇄 중으로 커플링될 때 특히 반응성을 띠거나 불안정한 측쇄를 갖는 아미노산의 일부로서 포함된다. 이러한 합성에 의해 X1-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser(X2)-Xaa5-Xaa6-Leu-Lys(ipr)(X4)-Pro-X5와 같은 완전 보호된 중간체 펩티도수지가 제공된다.
하이드로오로틸 등을 함유하는 5 및 6 위치에 목적하는 잔기를 갖는 GnRH 길항제의 합성에 사용될 수 있는 화학적 중간체의 일례는 하기 서열식으로 표현된다.
X1-D-Nal-D-4Cpa-D-Pal-Ser(X2)-Aph(X3)-D-Aph(X3)-Leu-ILys(X4)-Pro-X5.
이러한 서열식의 펩타이드 중간체 및 동족체 합성시, 이하에 기술되는 바와 같은 그룹 X1내지 X5가 사용될 수 있다.
X1은 당해분야에서 폴리펩타이드의 단계별 합성에 유용한 것으로 알려져 있는 유형의 α-아미노 보호그룹이며 목적하는 펩타이드 조성내 X가 특정 아실 그룹일 경우, 그 그룹은 보호그룹으로 사용될 수 있다. X1에 의해 포괄되는 α-아미노 보호그룹의 부류로는 (1) 아실형 보호그룹, 예를 들면, 포밀(For), 트리플루오로아세틸, 프탈로일, p-톨루엔설포닐(Tos), 벤조일(Bz), 벤젠설포닐, 디티아석시노일(Dts) o-니트로페닐설페닐(Nps), 트리틸설페닐, o-니트로페녹시아세틸, 아크릴릴(Acr), 클로로아세틸, 아세틸(Ac) 및 γ-클로로부티릴; (2) 방향족 우레탄형 보호그룹, 예를 들면, 벤질옥시카보닐(Z), 플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 및 치환된 벤질옥시카보닐, 예를 들면, p-클로로벤질옥시-카보닐(ClZ), p-니트로벤질옥시카보닐, p-브로모벤질옥시카보닐 및 p-메톡시벤질옥시카보닐; (3) 지방족 우레탄 보호그룹, 예를 들면, t-부틸옥시카보닐(Boc), 디이소프로필메톡시카보닐, 이소프로필옥시카보닐, 에톡시카보닐 및 알릴옥시카보닐; (4) 사이클로알킬 우레탄형 보호그룹, 예를 들면, 사이클로펜틸옥시카보닐, 아다만틸옥시카보닐 및 사이클로헥실옥시카보닐; (5) 티오우레탄형 보호그룹, 예를 들면, 페닐티오카보닐; (6) 알킬형 보호그룹, 예를 들면, 알릴(Aly), 트리페닐메틸(트리틸) 및 벤질(Bzl); (7) 트리알킬실란 그룹, 예를 들면, 트리메틸실란을 들 수 있다. 바람직한 α-아미노 보호그룹은 Boc이다.
X2는 Ser의 하이드록실 측쇄에 대한 보호그룹, 예를 들면, Ac, Bz, 트리틸, 2,6-디클로로벤질(DCB) 또는 벤질 에테르(Bzl)이며, 바람직하게는 Bzl이다.
X3는 α-아미노 보호그룹 또는 다른 아미노 보호그룹이 제거될 때 제거되지 않는 측쇄 아미노 그룹에 대한 보호그룹이다. 이러한 예로는 (1)염기-불안정 그룹, 예를 들면, Fmoc, 또는 일부 다른 약산 안정성 방향족 우렌탄형 보호그룹; (2)티올-불안정 그룹, 예를 들면, 티올분해에 의해 제거되거나 분할될 수 있는 디티아석시노일(Dts); (3)하이드라진-불안정 그룹, 예를 들면, 하이드라진분해에 의해 분할되는 프탈로일(Pht); (4)친핵-불안정 그룹, 예를 들면, 티오아세트아미드 또는 약산 또는 이의 염에 의해 분할되는 o-니트로페닐설페닐(Nps) 등; (5) 광분해에 의해 분할되는 광-불안정 그룹; 및 (6) 환원에 의해 선택적으로 제거가능한 그룹, 예를 들면, Dts가 포함된다. Fmoc가 Boc SPPS 전략용으로 바람직하다.
X4는 Z 또는 2ClZ와 같이, 1차 또는 2차 아미노 측쇄 그룹에 대한 산-불안정 보호그룹이다.
X5는 D-Ala-, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl-, Agl(Me)- 또는 D-Agl(Me)-NH-[수지 지지체], 또는 N(Et)-[수지 지지체]일 수 있고; X5는 Gly 또는 Ala 또는 D-Ala의 아미드, Pro에 직접 결합된 저급 알킬 치환 아미드, AzaGly-NH2, 또는 -OH(유리산)일 수 있다. X5가 유리산일 경우, 중간체는 C 말단에 알콜을 갖는 데카펩타이드를 제공하기 위하여 D- 또는 L-알라니놀과 커플링되도록 디자인되는 노나펩타이드 단편이다.
측쇄 보호그룹 X2내지 X4의 선택기준은 각각의 합성단계에서 α-아미노 보호그룹(바람직하게는 Boc) 제거를 위해 선택된 반응조건하에 보호그룹이 일반적으로 시약에 안정하여야 한다는 점이다. 이들 보호그룹은 일반적으로 커플링 조건하에서 분할되지 않아야 하지만 펩타이드 쇄를 변형시키게 될 반응조건하에서 목적하는 아미노산 서열의 합성 완료시 제거될 수 있어야 한다. 후술되는 바와 같이, 5 및 6 위치 잔기에 대해 초기에 사용된 보호그룹은 바람직하게는 제거되고 선택성 반응은 수지로부터 최종 펩타이드의 절단에 앞서 수행된다. 데카펩타이드 중간체가 전술한 바와 같이 합성되면, X3보호그룹은 바람직하게는 개별적으로 제거시킬 수 있다.
X5그룹이 D-Ala-NH-[수지 지지체]일 때, 아미드 결합은 D-Ala을 BHA 수지 또는 MBHA 수지에 연결시키며; 이는 Agl 또는 D-Agl이 C 말단에 사용될 때에도 마찬가지이다. X5가 N(Et)-[수지 지지체]일 때, 에틸아미드 결합은 Pro를 N-알킬아미노메틸 수지(NAAM)에 연결시킨다.
예를 들면, N 말단이 아세틸화될 때, 1 위치에서 β-D-Nal의 α-아미노 그룹에 대한 X1보호그룹으로서 아세틸은 펩타이드 쇄에 커플링되기 전에 이를 아미노산에 첨가함으로써 사용하는 것이 가능하다; 그러나, 반응은 바람직하게는 수지상에서 펩타이드 중간체를 사용하여 수행된다. α-아미노 그룹을 탈블로킹한 후 및 목적하는 측쇄 그룹을 보호한 채로, 아세틸화를 바람직하게는 아세트산 무수물과 반응시킴으로써 수행하거나, 이와 달리 반응은 아세트산을 이용하여, 디이소프로필 또는 디사이클로헥실 카보디이미드(DIC 또는 DCC)의 존재하에, 또는 당해분야에 공지된 기타 일부 적당한 아실화 반응에 의해 수행한다. 카바모일 또는 치환된 카바모일 그룹을 N 말단에 소망하는 경우 유사한 절차가 수행된다. 탈보호된 측쇄 아미노 그룹이 잔기가 펩타이드 쇄의 일부인 채로 변형될 때, 반응은 적당한 염기, 예를 들면, N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA)의 존재하에 적당한 이소시아네이트를 사용하여 수행될 수 있지만, 이러한 염기의 사용은 선택적이다. 비치환 카바모일 그룹을 최종 산물에서 소망하는 경우, 탈보호된 아미노 측쇄는 벤질 이소시아네이트, p-토실 이소시아네이트, 트리메틸실릴 이소시아네이트 또는 3급-부틸 이소시아네이트와 반응시킬 수 있으며, 후자가 바람직하다. 이러한 전략을 사용하여, t-부틸 잔기는 수지로부터 절단하는 동안 제거되며, 카바모일 그룹이 남게된다.
본 발명은 또한 예를 들면, (a)서열식:Boc-D-4Aph(X3)-Leu-ILys(X4)-Pro-X5(여기에서, X3는 아미노 그룹에 대한 염기-불안정, 하이드라진-불안정 또는 기타 적절히 불안정한 보호그룹이고; X4는 아미노 측쇄에 대한 산-불안정 보호그룹이며; X5는 D-Ala-NH-[수지 지지체]이다)의 중간체 펩타이드를 형성시키고; (b) D-4Aph로부터 X3를 제거하여 중간체 펩타이드의 이러한 아미노산 잔기의 측쇄 1차 아미노 그룹을 탈보호시키며; (c) 탈보호된 측쇄 1차 아미노 그룹을 아세트산 무수물과 반응시키며; (d) 쇄 연장을 완료하여 중간체 X1-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(X2)-4Aph(X3)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys(X4)-Pro-X5(여기에서, X1은 수소 또는 α-아미노 보호그룹이고 X2는 수소 또는 Ser의 하이드록실 그룹에 대한 보호그룹이다)를생성시키며; (e) N 말단에서 α-아미노 그룹을 탈블로킹하여 아세틸화하며; (f) 4Aph로부터 X3를 제거하고 탈보호된 1차 아미노 그룹을 하이드로오로틴산과 반응시킨 다음; (g) 잔류 보호그룹을 분할하고/하거나 X5에 포함된 수지 지지체로부터 절단하는 단계를 포함하는, 서열식: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2의 GnRH 길항제의 신규 제조방법을 제공한다.
펩타이드의 최종 정제는 크로마토그래피로, 바람직하게는 당해분야에 공지된 RP-HPLC로 수행된다[참조문헌:J. Rivier, et al. J. Chromatography, 288, 303-328 (1984), and C. Miller and J. Rivier, Biopolymers(Peptide Science), 40, 265-317 (1996)].
본 발명의 GnRH 길항제는 래트 암컷에서의 배란을 방지하기 위하여 발정기전 날 대략 정오에 피하투여시 체중 1 kg당 100 마이크로그램 이하 수준에서 유효한 것으로 생각된다. 배란의 장기 억제를 위해, 체중 1 kg당 약 0.1 내지 약 2.5 밀리그램 범위의 용량 수준으로 사용하는 것이 필요할 수 있다. 길항제는 또한 정규적으로 포유류 수컷에 투여시 정세포생성 저지에 유효하고 따라서 피임제로서 사용될 수 있다.
이들 화합물은 테스토스테론 수준 및 따라서 성적충동을 감소시키게 될 것이므로(정상적이고 성적으로 활동적인 수컷에서 원치않는 결과), 성적충동을 유지시키면서 무정자증을 달성하기 위하여 GnRH 길항제와 함께 테스토스테론의 대체 용량을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 길항제는 고나도트로핀과 성 스테로이드 생성 조절 및 전술한 바와 같이 장기 및 단기 조치에 대해 사용될 수 있고, 이들은 애완 동물용 피임제로서 수의학적 적용에 사용될 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 펩타이드는 생리 pH에서 특히 가용성이고 투여, 특히 피하 주사용의 비교적 농축된 용액으로 제조될 수 있다. 이들 펩타이드는 체내에 잘 용인되며 유효농도에서 피하투여될 때 겔로 되는 경향이 없다. 이러한 펩타이드 및 적당한 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 일반적인 약학 조성물은 체중 1 kg당 1일 약 0.001 내지 약 2.5 mg 수준으로 정액내, 복막내, 피하투여 등으로 투여될 수 있으며, 보통 0.5 mg/kg/일이면 충분하다.
적당히 보호된 D- 또는 L-하이드로오로틸-함유, 카바모일-함유 및/또는 D- 또는 L-이미다졸리돈-카보닐-함유 아미노산이 제조되어 쇄 연장 펩타이드 합성에 사용될 수 있다. 그러나, 적당히 보호된 Aph, D-Aph, Amf 또는 D-Amf 잔기를 펩타이드 중간체내 원하는 위치에 초기 혼입함으로써 동등하게 유효한 합성이 수행되고, 이는 소량만을 초기에 원하는 경우 선택되는 실험실 방법일 수 있다. 이러한 후자의 전략은 특정 잔기를 후속 탈보호하고(합성중에 즉시 또는 후속적으로) 이어서 탈보호된 측쇄 아미노 그룹을 목적하는 시약과 반응시킴으로써 달성된다.
본 발명은 하기 실시예로 좀더 구체적으로 설명된다.
실시예 1
서열식: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-Lys(Nic)-D-Lys(Nic)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2(Antide)의 펩타이드는 현재 Acyline로 언급되며 5 및 6 위치에서만 Antide와 상이한 펩타이드에서와 같이, GnRH 길항제로서 매우 양호한 생물학적 성질을 보이는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에 이르러 비로서, 이러한 분자를 출발점으로 사용하고 데카펩타이드 Acyline의 5 및 6 위치에 또는 5 위치에 다른 치환을 일으킴으로써, 생체내 생물활성의 지속기간이 향상된 GnRH 길항제가 수득됨이 밝혀졌다. 위치 1 내지 4 및 7 내지 10에 대해, Antide, Acyline 및 Azaline이 모두 정확하게 동일함이 주지된다.
하기의 데카펩타이드 [4Aph(Hor)5, D-4Aph(Cbm)6]-Antide 또는 [Ac-D-2Nal1, D-4Cpa2, D-3Pal3, 4Aph(Hor)5, D-4Aph(Cbm)6, ILys8, D-Ala10]-GnRH는 고체상 합성법으로 합성된다. 이러한 펩타이드는 하기의 서열식을 갖는다.
Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-하이드로오로틸)-D-4Aph(카바모일)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2
MBHA 수지(Bachem) 약 0.50 g(0.54 mmol/g)을 초기에 사용하고, Boc 유도체 약 0.65 밀리몰 및 디이소프로필카보디이미드(DIC)와 무수 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt)을 활성화 또는 커플링 시약으로 사용하여 디메틸포름아미드(DMF)/CH2CL2중에서 약 2 시간에 걸쳐서 수지에 Boc-보호된 D-Ala를 커플링시킨다. D-Ala 잔기는 아미드 결합에 의해 MBHA 잔기에 결합된다.
각각의 아미노산 잔기를 커플링한 뒤에, 후속 아미노산 잔기의 세척, 탈블로킹 및 이어서 커플링을 출발수지 약 0.5 내지 1 g에 대해 하기 수동 합성 스케쥴에 따라 수행한다:
단계 시약 및 작동 혼합시간(분)
1 메탄올(MeOH) 세척-15 ml (2회) 1
2 CH2CL2(DCM) 세척-30 ml (3회) 1
3 DCM-25 ml 중의 50% TFA + 1% m-크레졸 (2회) 5, 20
4 이소프로필 알콜 세척-20 ml (2회) 1
5 DCM-20 ml 중의 트리에틸아민 10% (2회) 2
6 MeOH 세척-15 ml (2회) 1
7 DCM 세척-20 ml (3회) 1
8 디메틸포름아미드(DMF) 10 내지 20 ml 중 Boc-아미노산(0.5 내지 1.0 mmol) 및 HOBt(0.5 내지 1.0 mmol): DCM 또는 N-메틸피롤리돈(NMP):DCM, 특정의 보호된 아미노산의 용해도에 따라, + DCM 중의 DIC 또는 DCC(0.5-1.0 mmol) 1-17 시간
9 MeOH 세척-15 ml (2회) 1
10 DCM 세척-20 ml (3회) 1
첫 번째 아미노산이 부착된 후 본 발명의 펩타이드의 아미노산 각각의 커플링에 상기 스케쥴을 사용한다. 합성 전반에 걸쳐 커플링된 아미노산 각각에 대해 NαBoc 보호를 이용한다. NαBoc-β-D-2Nal은 당해 공지된 방법으로, 예를 들면, 미국 특허 제4,234,571호에 상세히 기술된 바와 같이 제조되며; 또한 SyntheTech(미국 오레곤 소재)에서 시판하고 있다. 5 위치에서 4Aph 및 6 위치에서 D-4Aph의 측쇄 1차 아미노 그룹은 Fmoc로 보호된다. 벤질 에테르(Bzl)가 바람직하게는 Ser의 하이드록실 그룹에 대한 측쇄 보호그룹으로 사용되지만; Ser이 측쇄 보호없이 커플링될 수 있다. NαBoc-Lys(ipr, Z)가 8 위치 잔기용으로 사용된다.
NαBoc-D-4Aph(Fmoc)로서 6 위치 잔기에 대한 D-4Aph를 가한 후, 하기 중간체가 존재한다:
Boc-D-4Aph(Fmoc)-Leu-Lys(ipr, Z)-Pro-D-Ala-NH-[MBHA 수지 지지체]. 먼저 측쇄보호를 제거한 후 6 위치 잔기 상의 측쇄 아미노 그룹을 이어서 변형시킨다. Fomc 보호그룹은 각각 약 15분간 DMF(10 ml) 중의 25% 피페리딘으로 연속 처리함으로써 제거된다. 펩티도수지를 DMF로 세척한 후, 새로이 자유롭게된 아미노 그룹을 실온에서 약 12 시간 동안 DMF 중의 3급-부틸 이소시아네이트 20배 과량으로, 또는 닌히드린 시험을 이용하여 체크하여 완료될 때까지 처리한다. 이어서, 펩티도수지를 표준세척하고, Boc를 제거하여 후속 잔기를 첨가한다.
이어서, 5 위치 잔기를 NαBoc-4Aph(Fmoc)로서 가한다. 이의 측쇄를 이어서 전술한 바와 같이 탈보호시키고, 반응을 DMF 3 ml 중의 L-하이드로오로틴산 0.10 g(0.66 mmol), HOBt 90 mg(0.66 mmol) 및 DIC 0.66 mmol로 실온에서 약 8 시간 동안, 또는 표준 닌히드린 시험을 이용하여 체크하여 완료될 때까지 수행한다. 세척 및 NαBoc 제거 후, NαBoc-Ser(Bzl), NαBoc-D-3Pal, NαBoc-4Cpa, 및 NαBoc-D-2Nal과 순차적으로 반응시킴으로써 데카펩타이드 합성을 완료한다.
트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 N 말단에서 α-아미노 그룹을 탈보호한 후, 디클로로메탄(DCM) 중의 아세트산 무수물 대과량을 사용하여 약 30분간 아세틸화를 달성한다. 이와 달리, 4Aph의 Fmoc 보호는 N 말단의 아세틸화 후까지 제거되지 않으며, 이어서 L-하이드로오로틴산과의 반응을 수행한다.
펩티도수지를 건조시키고, 스캐빈저로서 아니솔(0.5 ml) 첨가, 수지로부터 펩타이드 절단 및 Ser 및 Lys 측쇄 탈보호를 약 0℃에서, 약 1.5 시간 동안 HF 15 ml로 수행하고, 잔류 t-부틸 잔기가 제거된다. 진공하에 HF 제거 후, 수지를 에틸 에테르 100 ml로 2회 세척한다. 절단된 펩타이드를 공정을 반복하면서 각회 100 ml를 사용하여 25% CH3CN/H2O 중 0.2% TFA로 추출한다. 추출물을 모아 동결건조시키며, 이들은 조 펩타이드 분말 약 600 mg을 제공한다.
당해분야 및 문헌[참조: J.Rivier, et al. J. Chromatography, 288, 303-328(1984)]에 상세히 공지되어 있듯이, 예비 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 펩타이드의 정제를 수행한다. 제 1 예비 RP-HPLC 분리는 TEAP(트리에틸암모늄 포스페이트) 완충액 시스템을 사용하고, 최종 분리는 0.1% TFA(트리플루오로아세트산) 구배를 사용하여 수행되며, 둘 모두 J.Chromatography 논문에 상세히 기재되어있다.
펩타이드(약 30 mg)(이하 펩타이드 번호 1로 언급됨)는 모관 지대 전기영동(CZE)을 이용하면 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 약 98%로 평가된다. 정제된 펩타이드의 아미노산 분석은 제조된 구조에 대한 구조식과 일치한다. 액체 2차 이온 질량 스펙트로메트리(LSIMS)로 측정된 분자량은 1631.9 Da이며, 이는 이 펩타이드에 대한 기대치 질량 1631.8 Da과 일치한다.
친수성은 30분에 걸쳐 40% 완충액 B에서 70% 완충액 B의 구배를 지닌 RP-HPLC를 이용하여 보유 시간을 측정하여 시험되며, 여기서 완충액 A는 TEAP pH 7.0이고 완충액 B는 70% CH3CN 및 30% 완충액 A이다. 펩타이드 번호 1은 Acyline보다 친수성이 커서, Acyline보다 빠르게 용출된다. 약 5 내지 약 7의 pH의 수성 완충액에서의 용해도 및 생체내 겔화에 대한 저항성은 하기에 기재된 순환 LH 수준을 억제시키는 장기-작용 생물효능과 함께, 일반적으로 비교 가능한 생물학적 효능의 기타 화합물에 비해 피하 주사에 의한 투여에 특히 적당하도록 해준다.
펩타이드를 생체내 분석하여 래트에서 LH의 분비를 억제시키는 효과를 측정한다. 이 펩타이드로 피하 처리된 거세된 수컷 Sprague-Dawley 래트에서의 순환 LH 수준의 측정을 문헌[참조: C. Rivier et al., Biol. Reproduc., 1983, 29, 374-378]에서 보고된 바대로 수행한다. 펩타이드를 우선 정균수에서 1.0 또는 10 mg/㎖의 농도로 용해시킨 다음 0.1% BSA를 함유하는 0.04 M 포스페이트 완충액에서 추가로 희석한다. 추후 희석은 포스페이트 완충액에서 행해진다. 펩타이드를 5 마리의 래트에 주사하고, 혈액 샘플(300 ㎕)을 메토탄 마취하에 수집한다. NIDDK의 국제 점액 및 호르몬 분배 프로그램에서 제공하는 시약을 이용하여 LH 수준에 대해 이중으로 혈청(50 ㎕)을 시험한다. 시험은 래트당 펩타이드 50 ㎍의 양이 LH 분비를 주사 이후 96-시간에 걸쳐 50% 이하의 억제 수준으로 억제시킴을 보여준다. 또한, 96시간 후에 측정된 수준은 Acyline 50 마이크로그램의 용량으로 유사하게 주사된 래트에서 나타난 LH 수준의 단지 약 30%이다. 펩타이드 번호 1은 매우 장시간 동안 작용하는 것으로 여겨진다. 래트를 검사한 결과 주사 지점에서 유의할 만한 겔화가 검출됨이 없이, 펩타이드가 매우 우수하게 허용되어짐을 보여준다.
다수의 GnRH 길항제의 시험에서 얻어진 경험은 LH의 장기-작용 억제를 보이는 펩타이드가, 성숙한 암컷 Sprague-Dawley 래트에서 생체내 분석시, 2.5 마이크로그램 용량으로 배란을 완전히 차단함을 보여준다.
실시예 1A
NαBoc-D-4Aph(fmoc) 대신 NαBoc-D-4Amf(Fmoc)를 사용하여, 실시예 1에 기재된 합성을 반복한다. D-4Amf 측쇄를 탈보호한 후, t-부틸 이소시아네이트와의 반응을 앞서와 같이 수행한다. 실시예 1에 기재된 바와같이 수지로부터 분할 및 탈보호에 이어, 정제를 행한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-하이드로오로틸)-D-4Amf(카바모일)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2가 RP-HPLC 정제에서 얻어지고 실질적으로는 균질한 것으로 판단되며, 순도는 99% 이상으로 평가된다. MS 분석은 기대치 질량 1645.8 Da과 비교하여 유리하게도 1645.9 Da의 질량을 보인다. HPLC 결과로부터, 이 펩타이드가 Acyline보다 친수성이 큼을 알 수 있다.
표준 생체내 래트 LH 억제 시험에서 이 펩타이드의 분석은 50 마이크로그램의 용량에서, 1, 2 및 3일째에 LH 수준을 억제함에 있어 이것이 Acyline만큼 효과적임을 보여준다. 96시간 째에는, LH 수준은 Acyline이 주사된 래트의 것의 단지 약 25%이다. 펩타이드 번호 1A는 매우 장기-작용적인 것으로 간주된다.
실시예 1B
동족체 [4Aph(Hor)5]-Acyline을 형성하기 위해, 탈보호된 위치 6 측쇄와의 반응을 위해 t-부틸 이소시아네이트 대신 아세트산 무수물을 사용하여 실시예 1에 기재된 합성을 반복한다. 실시예 1에 기재된 바와같이 수지로부터 데카펩타이드의 분할 및 탈보호에 이어, 정제를 행한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-하이드로오로틸)-D-4Aph(아세틸)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2가 RP-HPLC 정제에서 얻어진다. 이는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 99% 이상으로 평가된다. MS 분석은 1630.6 Da의 질량을 보이고, 계산치 질량 1630.8 Da과 일치한다.
실시예 1과 같이 표준 생체내 래트 시험에서 이 펩타이드의 분석은 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드가 생물활성적이고 1일 내지 4일째에 대략적으로 Acyline만큼 효과적임을 보여준다. 이는 LH의 억제를 위해 매우 긴-작용 기간을 나타내는 것으로 여겨진다.
실시예 1C
L-하이드로오로틴산 대신 D/L 하이드로오로틴산을 사용하여 실시예 1B에 기재된 바와같이 합성을 반복하여 이성체 데카펩타이드를 형성한다. 실시예 1에 기재된 바와같이 수지로부터 분할 및 탈보호에 이어, 정제를 수행한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D/L-하이드로오로틸)-D-4Aph(아세틸)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2가 RP-HPLC 정제에서 얻어진다. 이는 기타 불순물 없이 두 화합물의 균질한 혼합물인 것으로 판단된다. MS 분석은 1630.6 Da의 질량을 보이고, 이는 계산치 질량 1630.8 Da과 일치한다.
실시예 1에서와 같이 표준 생체내 래트 시험에서 이 펩타이드의 분석은 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드가 생물활성적이고 1일 내지 4일째에 Acyline 만큼 효과적임을 보여준다. 이는 LH의 억제를 위해 긴-작용 기간을 나타내는 것으로 여겨진다.
실시예 1D
L-하이드로오로틴산 대신 D-하이드로오로틴산을 사용하여 실시예 1B에 기재된 합성을 반복하여 이성체 데카펩타이드를 형성한다. 실시예 1에 기재된 바와같이 수지의 분할 및 탈보호에 이어, 정제를 수행한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-하이드로오로틸)-D-4Aph(아세틸)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2가 RP-HPLC 정제에서 얻어진다. 이는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 98% 이상인 것으로 평가된다. MS 분석은 1630.8 Da의 질량을 보여주는데, 이는 계산치 질량 1630.8 Da과 일치한다.
실시예 1에서와 같이 표준 생체내 래트 시험에서 이 펩타이드의 분석은 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드가 LH 억제를 위해 장기 작용의 생물활성을 나타내고, 이는 1일 내지 4일째에 Acyline과 대략적으로 동일한 효과임을 보여준다.
실시예 1E
NαBoc-D-4ClPhe 대신 NαBoc-D-4FPhe를 사용하여 실시예 1B에 기재된 합성을 반복하여 데카펩타이드 [D-4FPhe2, 4Aph(Hor)5]-Acyline을 형성한다. 실시예 1에 기재된 바와같이 수지의 분할 및 탈보호에 이어, 정제를 수행한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Fpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-하이드로오로틸)-D-4Aph(아세틸)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2가 RP-HPLC 정제에서 얻어진다. 이는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 99% 이상인 것으로 평가된다. MS 분석은 1615.1 Da의 질량을 보여주는데, 이는 계산치 질량 1614.8 Da과 일치한다.
실시예 1에서와 같이 표준 생체내 래트 시험에서 이 펩타이드의 분석은 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드가 생물활성적이고 1일 내지 4일째에 Acyline과 대략적으로 동일하게 효과적임을 보여준다. 이는 LH의 억제를 위해 긴-작용 기간을 나타내는 것으로 간주된다.
실시예 1F
NαBoc-D-4Aph(fmoc) 대신 NαBoc-4Amf(Fmoc)를 사용하여 실시예 1B에 기재된 합성을 반복하여 데카펩타이드 [4Amf(Hor)5]-Acyline을 형성한다. 실시예 1에 기재된 바와같이 수지의 분할 및 탈보호에 이어, 정제를 수행한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-하이드로오로틸)-D-4Aph(아세틸)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2가 RP-HPLC 정제에서 얻어진다. 이는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 98% 이상인 것으로 평가된다. MS 분석은 1644.7 Da의 질량을 보여주는데, 이는 계산치 질량 1644.8 Da과 일치한다.
실시예 1에서와 같이 표준 생체내 래트 시험에서 이 펩타이드의 분석은 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드가 생물활성적이고 1일 내지 4일째에 Acyline과 대략적으로 동일하게 효과적임을 보여준다. 이는 LH의 억제를 위해 긴-작용 기간을 나타내는 것으로 간주된다.
실시예 1G
실시예 1에 기재된 합성을 반복하지만, D-4Aph의 측쇄 아미노를 t-부틸 이소시아네이트와 반응시키는 대신, 이와 4Aph 잔기는 하이드로오로틴산과 동시에 반응하여 데카펩타이드[4Aph(Hor5), D-4Aph(Hor)6]-Antide를 형성한다. 실시예 1에 기재된 바와같이 수지의 분할 및 탈보호에 이어, 정제를 수행한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-하이드로오로틸)-D-4Aph(L-하이드로오로틸)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2가 RP-HPLC 정제에서 얻어진다. 이는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 99% 이상인 것으로 평가된다. MS 분석은 1728.4 Da의 질량을 보여주는데, 이는 계산치 질량 1728.4 Da과 일치한다. RP-HPLC의 결과는 이 펩타이드가 Azaline B보다 친수성이고 Azaline B는 또한 Acyline보다 친수성임을 보여준다.
실시예 1에서와 같이 표준 생체내 래트 시험에서 이 펩타이드의 분석은 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드가 생물활성적이고 1일 내지 4일째에 Acyline과 대략적으로 동일하게 효과적임을 보여준다. 이는 LH의 억제를 위해 긴-작용 기간을 나타내는 것으로 간주된다.
NαBoc-D-4Aph(Fmoc)대신 NαBoc-D-4Amf(Fmoc)를 사용하여 이러한 합성을 반복하여 데카펩타이드 [4Aph(Hor)5, D-Amf(Hor)6]-Antide를 생성하며, 이는 일반적으로 LH의 분비를 억제하는데 생물학적 효능을 가진다.
실시예 1H
실시예 1에 기재된 합성을 반복하지만, D-4Aph의 측쇄 아미노를 t-부틸 이소시아네이트와 반응시키는 대신, 이는 D-하이드로오로틴산과 반응하여 데카펩타이드[4Aph(Hor5), D-4Aph(Hor)6]-Antide를 형성한다. 실시예 1에 기재된 바와같이 수지의 분할 및 탈보호에 이어, 정제를 수행한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-하이드로오로틸)-D-4Aph(D-하이드로오로틸)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2가 RP-HPLC 정제에서 얻어진다. 이는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 98% 이상인 것으로 평가된다. MS 분석은 1728.7 Da의 질량을 보여주는데, 이는 계산치 질량 1728.8 Da과 일치한다. RP-HPLC의 결과는 이 펩타이드가 Azaline B보다 친수성이고 Azaline B는 또한 Acyline보다 친수성임을 보여준다.
실시예 1에서와 같이 표준 생체내 래트 시험에서 이 펩타이드의 분석은 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드가 생물활성적이고 1일 내지 3일째에 Acyline과 대략적으로 동일하게 효과적임을 보여준다. 이는 4일째에 Acyline보다 실질적으로 좀더 효과적이고 LH의 억제를 위해 매우 긴-작용 기간을 나타내는 것으로 간주된다.
실시예 1J
일반적으로 1B에 기재된 바대로 진행하여 데카펩타이드 [MeCbm-D-2Nal1, 4Aph(Hor)5]-Acyline의 합성을 수행하지만, NαBoc-4Aph(Fmoc)를 첨가한 후 Fmoc-보호 그룹을 즉시 제거하는 대신, 수지상의 데카펩타이드의 합성을 완료한다. 다음, N-말단을 탈블로킹한 후, 아세트산 무수물과 반응시키는 대신, 메틸 이소시아네이트와 반응을 수행하여 N-말단에 메틸카바모일을 형성한다. 다음, Fmoc를 제거하고 실시예 1B와 같이 4Aph의 측쇄 아미노를 L-하이드로오로틴산과 반응시킨다. 실시예 1에 기재된 바와같이 수지의 분할 및 탈보호에 이어, 정제를 수행한다. 펩타이드 메틸카바모일-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-하이드로오로틸)-D-4Aph(아세틸)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2가 RP-HPLC 정제에서 얻어진다. 이는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 약 99%인 것으로 평가된다. MS 분석은 1645.7 Da의 질량을 보여주는데, 이는 계산치 질량 1645.8 Da과 일치한다. RP-HPLC의 결과는 이 펩타이드가 Azaline B보다 친수성이고 Azaline B는 또한 Acyline보다 친수성임을 보여준다.
실시예 1에서와 같이 표준 생체내 래트 시험에서 이 펩타이드의 분석은 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드가 생물활성적이고 1일 내지 3일째에 Acyline과 대략적으로 동일하게 효과적이며 96시간 이후에는 거의 50% 정도 좀더 효과적임을 보여준다. 이는 LH의 억제를 위해 매우 긴-작용 기간을 나타내는 것으로 간주된다.
실시예 1K
NαBoc-D-4Aph(Fmoc)대신 NαBoc-D-3Pal을 사용하고 t-BuNCO와의 추후 반응을 생략하여 실시예 1에 기재된 합성을 반복하면 데카펩타이드[4Aph(Hor)5, D-3Pal6]-Antide가 형성된다. 실시예 1에 기재된 바와같이 수지의 분할 및 탈보호에 이어, 정제를 수행한다. 펩타이드 아세틸-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-하이드로오로틸)-D-3-Pal-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2가 RP-HPLC 정제에서 얻어진다. 이는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 99% 이상인 것으로 평가된다. MS 분석은 1574.7 Da의 질량을 보여주는데, 이는 계산치 질량 1574.7 Da과 일치한다.
실시예 1에서와 같이 표준 생체내 래트 시험에서 이 펩타이드의 분석은 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드가 생물활성적이고 1일 내지 3일째에 Acyline과 대략적으로 동일하게 효과적이지만; 96시간 후에는, LH의 수준을 Acyline의 약 35% 값으로 억제시킴을 보여준다. 이는 LH의 억제를 위해 매우 긴-작용 기간을 나타내는 것으로 간주된다.
실시예 1L
하이드로오로틴산 대신 t-부틸 이소시아네이트를 사용하여 실시예 1G에 기재된 합성을 반복하여 데카펩타이드[4Aph(Cbm)5, D-4Aph(Cbm)6]-Antide를 형성한다. 실시예 1에 기재된 바와같이 수지의 분할 및 탈보호에 이어, 정제를 수행한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(카바모일)-D-4Aph(카바모일)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2가 RP-HPLC 정제에서 얻어진다. 이는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 99% 이상인 것으로 평가된다. MS 분석은 1534.9 Da의 질량을 보여주는데, 이는 계산치 질량 1534.7 Da과 일치한다.
실시예 1에서와 같이 표준 생체내 래트 시험에서 이 펩타이드의 분석은 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드가 생물활성적이고 4일에 걸쳐 Acyline과 대략적으로 동일하게 효과적임을 보여준다. 이는 LH의 억제를 위해 긴-작용 기간을 나타내는 것으로 간주된다.
실시예 1M
하이드로오로틴산 대신 메틸 이소시아네이트를 사용하여 실시예 1G에 기재된 합성을 반복하여 데카펩타이드[4Aph(MeCbm)5, D-4Aph(MeCbm)6]-Antide를 형성한다. 실시예 1에 기재된 바와같이 수지의 분할 및 탈보호에 이어, 정제를 수행한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(메틸카바모일)-D-4Aph(메틸카바모일)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2가 RP-HPLC 정제에서 얻어진다. 이는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 99% 이상인 것으로 평가된다. MS 분석은 1562.8 Da의 질량을 보여주는데, 이는 계산치 질량 1562.8 Da과 일치한다.
실시예 1에서와 같이 표준 생체내 래트 시험에서 이 펩타이드의 분석은 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드가 생물활성적이고 2일간 Acyline과 대략적으로 동일하게 효과적이고 이후 LH의 억제가 다소 떨어지기 시작함을 보여준다.
실시예 2
일반적으로 실시예 1에 기재된 합성을 이용하여 서열식 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-하이드로오로틸)-D-Cit-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2를 지닌 펩타이드 Cetrorelix의 동족쇄 펩타이드 [4Aph(Hor)5, D-Cit6]-Antide를 합성한다. NαBoc-D-4Aph 대신, NαBoc-D-Cit가 6 위치에서 커플링된다. 달리, NαBoc-D-Orn(Fmoc)는 6 위치에서 커플링되고, 쇄 연장은 하기 펩타이드 중간체: Boc-D-Orn(Fmoc)-leu-Lys(ipr, Z)-Pro-D-Ala-NH-[MBHA 수지 지지체]를 생성한 후에 일시 중단된다. Orn 잔기상의 아미노 측쇄는 실시예 1에서처럼 Fmoc 보호의 제거에 의해 탈보호되고, 중간체는 실온에서 약 6시간 동안 DMF중의 과량의 t-부틸 이소시아네이트로 처리된다. 실시예 1과 같이 데카펩타이드 중간체 합성을 완료한다.
펩티도수지를 실시예 1과 같이 세척, 분할 및 탈보호한 다음 정제한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-하이드로오로틸)-D-Cit-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2가 RP-HPLC 정제에서 얻어진다. 이는 실질적으로는 균질한 것으로 판단되고, 순도는 99% 이상인 것으로 평가된다. LSIMS 분석은 측정치 질량 1583.7 Da를 보이고 이는 이 펩타이드에 대한 계산치 질량 1583.8 Da과 일치한다.
펩타이드는 Cetrorelix보다 좀더 친수성이고 실시예 1에서 처럼 LH 분비 억제를 위해 생체내에서 시험할 경우 Cetrorelix와 같이 장기간의 생물활성을 나타낸다. 이는 3일 째에 근소한 차이로 보다 우수한 억제를 가지고 96시간 째에는 실질적으로 보다 우수하다.
실시예 2A
일반적으로 미국 특허 5,169,935의 실시예 1에 기재된 바와같은 합성을 이용하여 펩타이드 Antide의 동족체, 즉, [4Aph(Hor)5]-Antide를 합성한다. 6 위치에서 NαBoc-D-Lys(Fmoc)를 커플링한 후, 이를 DMF중의 과량의 니코틴산과 반응시킨 다음 탈보호시킨다. 다음, NαBoc-Aph(Fmoc)를 5 위치에서 커플링하고, Aph 잔기상의 아미노 측쇄를 실시예 1과 같이 탈보호시킨다. 중간체를 DMF에서 L-하이드로오로틴산과 반응시키고, 데카펩타이드 중간체의 합성을 실시예 1과 같이 완료한다.
표준 세척에 이어, 수지의 분할, 탈보호 및 정제를 실시예 1과 같이 완료한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-하이드로오로틸)-D-Lys(Nic)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2가 RP-HPLC 정제에서 얻어진다. 이는 Cetrorelix보다 좀더 친수성이고 LH의 분비 억제를 위한 Cetrorelix와 같이 장기간의 생물활성을 나타내는 것으로 여겨진다.
실시예 3
L-Hor 대신 D/L-Imz가 사용되는 것을 제외하고는 실시예 1B에서 일반적으로 기재된 방법에 따라 동족체[4Aph(D/L-Imz)5]-Acyline를 합성한다. 따라서, 5 위치에서 4Aph의 탈보호에 이어, 중간체를 실온에서 약 6시간 동안 과량의 D/L-2-이미다졸리돈-4-카복실산, 약 90 mg의 HOBt 및 약 0.66 mmol의 DIC로 처리한다. 실시예 1에서와 같이 데카펩타이드 중간체 합성을 완료한다.
펩티도수지를 실시예 1에 기재된 바와같이 세척, 분할 및 탈보호한 다음 정제한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D/L-이미다졸리돈-4-카보닐)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2가 RP-HPLC 정제에서 얻어진다. 이는 기타 불순물이 없이 두 화합물의 균질한 혼합물인 것으로 판단된다. LSIMS 분석은 측정치 질량 1602.7 Da을 보여주는데 이는 이 펩타이드의 경우 계산치 질량 1602.8 Da과 일치한다.
실시예 1에서 처럼 표준 생체내 래트 시험을 이용한 펩타이드 분석은 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드가 LH 분비의 억제를 장기간 동안 나타냄을 보여준다. 이는 3일째에 근소한 차이로 보다 우수한 억제를 보이고 96시간 째에는 Acyline보다 높다.
실시예 3A
D/L-Imz 대신 과량의 L-2-이미다졸리돈-4-카복실산을 이용하여 실시예 3의 합성을 반복한다. 생성된 펩타이드는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고 순도는 약 99%인 것으로 평가된다. LSIMS 분석은 측정치 질량 1602.5 Da를 보여주고, 이는 이 펩타이드에 대한 계산치 질량 1602.8 Da과 일치한다. 펩타이드는 Acyline보다 물에 잘 용해된다.
실시예 1과 같이 분석을 수행하면, 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드는 LH 분비 억제를 장기간 동안 나타내며, 이는 96시간에 걸쳐 Acyline과 대략적으로 동일하다.
실시예 3B
D/L-Imz 대신 과량의 D-2-이미다졸리돈-4-카복실산을 이용하여 실시예 3의 합성을 반복한다. 결과적으로 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-imz)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2가 얻어진다. LSIMS 분석은 측정치 질량 1602.6 Da를 보여주고, 이는 이 펩타이드에 대한 계산치 질량 1602.8 Da과 일치한다. 펩타이드는 Acyline보다 물에 잘 용해된다.
실시예 1과 같이 분석을 수행한다. 펩타이드는 생물활성적이고 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드는 LH 분비 억제를 나타낸다.
실시예 3C
실시예 1A(D-4Amf(Cbm)6도입을 위해) 및 3A(4Aph(Imz)5도입을 위해)에 기재된 방법을 조합하여 펩타이드[4Aph(Imz)5, D-4Amf(Cbm)6]-Acyline를 합성한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-imz)-D-4Amf(카바모일)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2가 RP-HPLC 정제에서 얻어진다. 이는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 98% 이상인 것으로 평가된다. LSIMS 분석은 측정치 질량 1617.6 Da를 보여주고, 이는 이 펩타이드에 대한 계산치 질량 1617.8 Da과 일치한다. 펩타이드는 실시예 1과 같이 분석되고, 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드는 장기간의 LH 분비 억제를 나타낸다. 이는 3일에 걸쳐서는 Acyline과 실질적으로 동일하고 96시간째에 다소 우수한 억제를 가진다.
실시예 4
일반적으로 실시예 1A에서 기재된 바와같은 합성을 이용하여 서열식 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-하이드로오로틸)-D-4Amf(MeCbm)-Leu-Ilys-Pro-D-Ala-NH2를 지닌 펩타이드 [4Aph(Hor)5, D-4Amf(MeCbm)6]-Antide를 합성한다. 6 위치의 D-4Amf를 과량의 DMF중의 t-부틸 이소시아네이트와 반응시키는 대신, 이를 메틸 이소시아네이트와 반응시킨다. 실시예 1A와 같이 데카펩타이드 중간체 합성을 완료한다.
실시예 1에 기재된 바와같이 펩티도수지를 세척, 분할 및 탈보호 및 정제를 행한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-하이드로오로틸)-D-4Amf(MeCbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2가 RP-HPLC 정제에서 얻어진다. 이는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 99% 이상인 것으로 평가된다. LSIMS 분석은 측정치 질량 1659.8 Da를 보여주고, 이는 이 펩타이드에 대한 계산치 질량 1659.8 Da과 일치한다.
표준 생체내 래트 시험에서 펩타이드 분석은 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드 번호 4가 Acyline보다 우수한 LH 분비 억제를 보이고 이는 매우 장기간의 생물활성을 나타내는 것으로 여겨진다.
실시예 4A
메틸 이소시아네이트 대신 아세트산 무수물을 사용하여 실시예 4의 합성을 반복하여 펩타이드 [4Aph(Hor)5, D-4Amf(Ac)6]-Antide를 생성한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-하이드로오로틸)-D-4Amf(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2가 RP-HPLC 정제에서 얻어진다. 이는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 99% 이상인 것으로 평가된다. LSIMS 분석은 측정치 질량 1644.5 Da를 보여주고, 이는 이 펩타이드에 대한 계산치 질량 1644.8 Da과 일치한다.
펩타이드는 실시예 1과 같이 50 마이크로그램의 용량에서 분석되고, 이는 장기간의 생물활성을 나타낸다. 이는 3일 동안 Acyline과 동일한 LH 분비 억제를 보여주고 96시간 째에 Acyline보다 약간 우수하다.
실시예 4B
D-알라닐아미드 대신 C 말단에서 D-알라니놀을 지니도록 실시예 1A에서 합성되고 시험된 데카펩타이드를 변형한다. Bachem, Inc.에서 입수 가능한 메리필드 수지(클로로메틸화된 가교 결합 폴리스티렌)를 이용하는 것을 제외하고는, 일반적으로 실시예 1A에서 기재된 합성을 이용하여 C 말단에 유리산으로 프롤린을 지닌 노나펩타이드 단편을 우선 합성한다. 분할, 탈보호 및 정제에 이어, 하기 노나펩타이드를 얻는다: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-OH. 완전히 탈보호되고 HPLC-정제된 노나펩타이드 0.15 mmol을 D-알라니놀 3.0 mmol과 함께 건조 DMF 3 ㎖에 용해시킨다(Lancaster Chemical). 다음, PyBOP(Novabiochem), 고체 0.60 mmol을 커플링제로서 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 30분간 교반한다. 200 ㎖의 물을 첨가하면 반응이 중단되고, 빙초산을 이용하여 pH를 2.5로 맞추어 맑은 용액으로 전환되는 에멀션을 생성한다. TEAP(pH 2.3)을 완충액으로 이용하는 예비 RP-HPLC를 이용하여 생성된 데카펩타이드, Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-ol을 정제한 다음, 0.1% TFA를 완충액으로 이용하여 추가 정제를 행한다. 생성된 펩타이드는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 약 99% 이상으로 평가된다. MS 분석은 1632.9 Da의 질량을 보여주고 이는 계산치 질량 1632.8 Da과 일치한다.
실시예 1에서와 같이, 표준 생체내 래트 시험에서 이 펩타이드 분석은 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드가 생물활성이 있고, 이러한 생물 활성이 최소 96시간 동안 지속됨을 보여준다. 펩타이드는 매우 장기간 동안 작용하는 것으로 간주된다.
실시에 4C
반응 혼합물에서 D-알라니놀 대신 L-알라니놀(Aldridge Chemical) 3.0 mmol을 이용하여 실시예 4B의 합성을 반복한다. 생성된 데카펩타이드를 실시예 4B에서 처럼 정제하면 이는 실질적으로 균일하고, 약 98% 이상인 것으로 평가된 순도를 지니는 것으로 판단된다. MS 분석은 1632.9 Da의 질량을 보여주고 이는 계산치 질량 1632.8 Da과 일치한다.
실시예 1에서와 같이, 표준 생체내 래트 시험에서 이 펩타이드 분석은 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드가 생물활성이 있고, 이러한 생물 활성이 최소 96시간 동안 지속됨을 보여준다. 펩타이드는 매우 장기간 동안 작용하는 것으로 간주된다.
실시예 4D
D-알라닐아미드 대신 C 말단에 D-알라니놀을 지니도록 실시예 1에서 합성되고 시험된 데카펩타이드를 변형한다. 메리필드 수지상의 SPPS를 이용하여 C 말단에 유리산으로 프롤린을 지닌 노나펩타이드 단편을 합성하는데, 달리 언급이 없으면 일반적으로 실시예 1에 기재된 바에 따른다. 분할, 탈보호 및 정제에 이어, 하기 노나펩타이드를 얻는다: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-OH. 정제된 노나펩타이드를 실시예 4B에서 처럼 D-알라니놀과 반응시키고, pH 2.3에서 TEAP 대신 pH 6.5에서 TEAP를 이용하는 것을 제외하고, 실시예 4B에 기재된 예비 RP-HPLC를 이용하여 생성된 데카펩타이드, Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-ol을 정제한다. 생성된 펩타이드는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 약 99% 이상으로 평가된다. MS 분석은 1618.9 Da의 질량을 보여주고 이는 계산치 질량 1618.8 Da과 일치한다. 생체내 펩타이드 분석은 이것이 생물활성이 있음을 보여준다.
실시예 4E
D-알라니놀 대신 L-알라니놀을 사용하여, 실시예 4D에 기재된 합성을 반복한다. 생성된 데카펩타이드: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-Ala-ol을 실시예 4D에 기재된 바와같이 예비 RP-HPLC를 이용하여 정제하면, 생성된 펩타이드는 약 99% 이상으로 평가된 순도를 지니면서, 실질적으로 균질한 것으로 판단된다. MS 분석은 1618.9 Da의 질량을 보여주고 이는 계산치 질량 1618.8 Da와 일치한다. 생체내 펩타이드 분석은 이것이 생물활성이 있음을 보인다.
실시예 5
서열식 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-하이드로오로틸)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2를 지닌 펩타이드 [4Aph(D-Hor)5, D-4Amf(Cbm)6]-Antide를 실시예 1A에서 일반적으로 기재된 바와같은 합성을 이용하여 합성한다. 5 위치의 4Aph를 L-하이드로오로틴산과 반응시키는 대신, 측쇄를 D-하이드로오로틴산과 반응시킨다. 실시예 1A와 같이 데카펩타이드 중간체의 합성을 완료한다.
펩티도수지를 표준 세척하고, 실시예 1에 기재된 바와같이 수지로부터 분할 및 탈보호에 이어 정제를 행한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-하이드로오로틸)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2를 RP-HPLC 정제에서 얻는다. 이는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 98% 이상으로 평가된다. LSIMS 분석은 측정치 질량 1645.8 Da를 보여주고 이는 이 펩타이드에 대한 계산치 질량 1645.8 Da과 일치한다.
표준 생체내 래트 시험을 이용하는 펩타이드 분석은 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드가 2 일에 걸친 LH 분비 억제에 있어 Acyline만큼 긴 생물활성 기간을 나타내고 72 및 96시간 째에 약간 낮은 정도의 억제를 유지함을 보여준다.
실시예 5A
4Amf의 탈보호된 측쇄를 t-부틸 이소시아네이트와 반응하는 대신, 아세트산 무수물과 반응하는 것을 제외하고는 실시예 5의 합성을 반복한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-하이드로오로틸)-D-4Amf(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2를 RP-HPLC 정제에서 얻는다. 이는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 99% 이상으로 평가된다. LSIMS 분석은 측정치 질량 1644.7 Da를 보여주고 이는 이 펩타이드에 대한 계산치 질량 1644.8 Da과 일치한다.
펩타이드를 실시예 1에서처럼 분석하면, 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드는 3일에 걸쳐서는 Acyline과 실질적으로 동일한 LH 분비 억제를 나타내고; 96시간 째에, 이는 Acyline보다 다소 우수한 LH 억제를 나타낸다.
실시예 6
6 위치 잔기로서 NαBoc-D-4Aph(Fmoc) 대신 NαBoc-D-4Amf(Fmoc)를 사용하는 것을 제외하고는 일반적으로 실시예 1F에 기재된 합성을 반복하여 데카펩타이드 [4Amf(Hor)5, D-4Amf(Ac)6]-Antide를 형성한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-하이드로오로틸)-D-4Amf(아세틸)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2를 RP-HPLC 정제에서 얻는다. 이는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 99% 이상으로 평가된다. MS 분석은 1658.7 Da의 질량을 보여주고, 이는 계산치 질량 1658.8 Da과 일치한다.
펩타이드를 실시예 1에서처럼 분석하면, 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드는 LH 분비 억제에 있어 긴-작용 기간을 지니고 있음이 밝혀졌다. 이는 최초 2 일에 걸쳐 Acyline과 대략 동일하고 3, 4일에 걸쳐서는 Acyline과 거의 동일한 생물효능을 지닌다.
실시예 6A
D-4Amf의 탈보호된 측쇄를 아세트산 무수물과 반응시키는 대신, 실시예 1에서 처럼 t-부틸 이소시아네이트와 반응시켜 펩타이드 [4Amf(Hor)5, D-4Amf(Cbm)6]-Antide를 형성하는 것을 제외하고는 실시예 6의 합성을 반복한다. 데카펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-하이드로오로틸)-D-4Aph(카바모일)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2를 RP-HPLC 정제에서 얻는다. 이는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 약 99%로 평가된다. MS 분석은 질량 1659.6 Da를 보여주고, 이는 계산치 질량 1659.8 Da과 일치한다.
펩타이드를 실시예 1에서처럼 분석하면, 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드는 1일 후에 LH 분비 억제면에서 Acyline과 동일한 활성을 보이고; 2일 후에는 활성이 거의 동일하다. 이는 3일 이후에는 다소 활성이 떨어지지만 4일 후에는 Acyline과 거의 동일한 활성을 나타낸다.
실시예 6B
t-부틸 이소시아네이트 대신 메틸 이소시아네이트와 반응시켜 펩타이드 [4Amf(Hor)5, D-4Amf(MeCbm)6]-Antide를 형성하는 것을 제외하고는, 실시예 6A의 합성을 반복한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-하이드로오로틸)-D-4Aph(메틸카바모일)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2를 RP-HPLC 정제에서 얻는다. 이는 실질적으로 균질한 것으로 판단되고, 순도는 대략 99%로 평가된다. MS 분석은 질량 1673.6 Da를 보여주고, 이는 계산치 질량 1673.8 Da과 일치한다.
펩타이드를 실시예 1에서처럼 분석 시험하면, 50 마이크로그램의 용량에서, 펩타이드는 1일 후에 LH 분비 억제면에서 Acyline과 동일한 활성을 보이고; 2일 후에는 활성이 거의 동일하다. 3, 4일 후, 이는 Acyline보다 LH 분비 억제가 상당한 정도로 계속 떨어진다.
실시예 6C
L-하이드로오로틴산 대신 D-하이드로오로틴산을 사용하여 실시예 6의 합성을 반복하여, 펩타이드 [4Amf(D-Hor)5, D-4Amf(Ac)6]-Antide를 형성한다. 펩타이드 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(D-하이드로오로틸)-D-4Amf(아세틸)-Leu-Lys(이소프로필)-Pro-D-Ala-NH2를 RP-HPLC 정제에서 얻는다. 이는 실질적으로는 균질한 것으로 판단되고, 순도는 99% 이상으로 평가된다. MS 분석은 질량 1658.8 Da를 나타내고, 이는 계산치 질량 1658.8 Da과 일치한다.
실시예 1과 같이 펩타이드를 분석하고, 50 마이크로그램의 용량에서, 이는 실질적으로는 1, 2일 동안 Acyline과 동일하게 효과적이다. 3일 째에, 이는 Acyline보다 실질적으로는 덜 효과적이고 이후 생물효능이 상당한 정도로 계속 감소된다.
실시예 7
일반적으로 실시예 1 내지 5에 기재된 과정을 이용하여, 하기의 GnRH 길항 제 펩타이드를 제조한다:
이들 펩타이드는 LH의 분비를 억제하는데 생물학적 효능이 있다.
실시예 8
일반적으로 실시예 1-5 및 미국 특허 5,491,217에 기재된 과정을 이용하여, 하기의 GnRH 길항제 펩타이드를 제조한다:
이들 펩타이드는 LH 분비를 억제하는데 생물학적 효능이 있고 생리적 pH에서 물에 대해 매우 우수한 용해도를 가진다.
시험된 상기 화합물들은 LH 억제면에서 일반적으로 동족체로 간주되는 Antide로 알려진 상응하는 GnRH 길항제 펩타이드와 최소한 필적할 만한 정도의 생물학적 효능을 나타낸다. 10여년간 이 분야에서의 광범위한 연구 결과, LH의 억제를 평가하는 널리 수용된 시험에서 측정된 생물효능은 성선자극호르몬 분비를 억제시켜 유용한 항생식 항-배란 효과를 나타내는 이러한 화합물의 능력에 대한 증거로서 채택되어왔다. 우수한 용해도, 생체내 겔화에 대한 저항성, 장기간의 생물활성 및 기타 특성을 근거로, 이들 화합물이 일반적으로 예를 들어, 항-배란제와 같이 성선자극호르몬의 분비를 억제하고 생식선에 의한 스테로이드의 방출을 억제하는 항생식제로서 유용한 것으로 간주된다.
본 발명의 화합물은 약학적으로 허용가능한 형태, 산 첨가 염과 같은 무독성 염, 또는 금속 착물 형태로 종종 투여되며; 아세테이트 및 파모에이트, 파모산염이 바람직할 수 있다. 활성 성분이 정제 형태로 투여되면, 정제는 트라가칸트 고무, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 알긴산과 같은 붕해제; 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제를 포함하는 약학적으로-허용가능한, 무독성 희석제를 함유할 수 있다. 등장염, 포스페이트 완충액 등에서는 혈관내 투여가 효과적일 수 있다.
약학 조성물은 일반적으로 기존의, 약학적으로-허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 유효량의 펩타이드를 함유할 것이다. 일반적으로, 용량은 혈관내로 투여할 경우 숙주의 체중 kg에 대해 약 10 마이크로그램 내지 약 2.5 밀리그램의 펩타이드일 것이다. 이들 화합물의 성질은 효과적인 경구 투여를 허용할 수 있지만; 경구 투여량은 이보다 높을 수 있다. 전반적으로, 이들 펩타이드를 이용한 대상체의 치료는 일반적으로 화합물이 가용성인 적당한 담체를 이용하고 환자에게서 LH 및 FSH 수준을 억제하기에 충분한 양을 투여하는 GnRH의 기타 길항제를 이용하는 임상 치료와 동일한 방법으로 수행된다.
장기간에 걸쳐, 예를 들면 1회 투여로부터, 1주 내지 1년 동안, GnRH 동족체를 전달함이 바람직할 수 있고, 느린 방출, 저장 또는 이식 용량형이 이용될 수 있다.
이들 화합물은 생식억제 및/또는 억제를 위해 포유동물의 혈관내, 피하, 근육내, 경구, 경피, 비내, 폐내, 직장내 또는 질내 투여될 수 있고 성조발증 통제와 같은 생식 활성의 가역적 억제를 요구하는 적용 또는 방사선요법 또는 화학요법 동안 이용될 수 있다. 이들은 또한 스테로이드-의존성 종양의 치료에 유용하다. 효과적인 용량은 주사 형태 및 치료될 특정 포유동물 종에 따라 달라질 것이다. 이들 화합물 중 몇몇은 50 mg/㎖만큼 높은 용해도를 가지고, 이들은 보통 pH 5.4에서 5 내지 10 mg/㎖ 용액 형태로 사용될 수 있다. 전형적인 용량형의 예는 펩타이드를 함유하는 약 6 pH에서의 정균 수용액으로, 이 용액은 비경구 투여되어 약 0.1 내지 2.5 mg/㎏ 체중/일 범위의 양으로 제공된다. 이들 화합물은 생체내에서 익히-허용되고 겔화를 방지하는 것으로 간주되며; 따라서, 이들은 주사 지점에서 겔화의 위험없이, 약 4.9의 pH에서, 적절한 농도, 약 0.75 mg/㎖이상 및 약 1.0 mg/㎖ 이상으로 약 5% 만니톨의 정균 수용액에서 피하 주사에 의한 투여에 특히 매우 적절한 것으로 간주된다.
이들 GnRH 길항제 펩타이드도 생체내 및 시험관내 진단에 유용하다. 이들 펩타이드는 생체내에서 주사된 다음 호르몬 분비, 예를 들어 LH 분비의 감소 정도를 측정하기 위해 환자의 혈액을 분석할 수 있다. 시험관내 분석은 특정 종양 세포가 GnRH에 민감한지 여부를 측정하기 위해 수행될 수 있다. 이러한 분석에서, 종양 세포 배양액은 GnRH 길항제 펩타이드로 처리된 다음 호르몬 분비 및 세포 증식을 위해 모니터링된다.
본 발명은 바람직한 양태로 설명되지만, 첨부된 청구항에 기재된 본 발명의 범위에서 벗어남이 없이 당업자에 의해 변화 및 수정이 행해질 수 있다. N-말단이 비치환될 수 있거나 기타 등가의 아실화 그룹이 사용될 수 있다는 사실에 비추어 볼때, 아세틸 또는 치환 또는 비치환 카바모일이 바람직하다. Aph 또는 D-Aph 대신, Ahp 또는 D-Ahp가 5 및 6 위치에 각각 사용될 수 있다. Aph(Ac) 대신, 아미노Phe 그룹은 미국 특허 5,506,207에 기재된 대체 아실화제, 예를 들어 포름산, β-Ala(atz) 및 감마-아미노부티르산(atz)로 처리될 수 있고, 이는 또한 긴-작용 기간을 나타내는 GnRH 길항제를 생성하며; 이로인해, 생성된 잔기는 D- 및 L-4Aph(Ac)의 등가물로 간주된다. Lys(Bu) 및 Lys(Et2) 모두 ILys의 등가물로 간주되지만; ILys가 가장 바람직하다. 기타 소수성 아미노산 잔기도 1 위치 및 6 위치(앞서 언급된 것과 같음)에서, 바람직하게는 D-이성체 형태로 이용될 수 있고 명시된 것들의 등가물로 간주된다.

Claims (16)

  1. 하기 서열식의 GnRH 길항제 펩타이드 및 이의 약학적으로 허용되는 염.
    X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Xaa8-Pro-Xaa10
    상기에서,
    X는 탄소수 7 이하의 아실 그룹 또는 또는 Q이며, Q는이며, R은 H 또는 저급 알킬이며;
    A는 4Cl, 4F, 4Br, 4NO2, 4CH3, 4OCH3또는 3,4Cl2또는 CαMe4Cl이며;
    Xaa5는 Aph(Q1) 또는 Amf(Q1)이며 Q1은 Q 또는
    이며,
    Xaa6은 D-Aph(Q2), D-Amf(Q2), D-Lys(Nic), D-Cit, D-Hci 또는 D-Pal이며, Q2는 For, Ac, 3-아미노-1,2,4 트리아졸, 또는 Q1이며;
    Xaa8은 Lys(ipr), Arg, Har, Arg(Et2) 또는 Har(Et2)이며;
    Xaa10은 D-Ala-NH2, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH2CH3, Gly-NH2, Ala-NH2, AzaGly-NH2, Agl-NH2, D-Agl-NH2, Agl(Me)-NH2또는 D-Agl(Me)-NH2이며, 단 Xaa5가 Q를 함유할 때 Xaa6는 또한 Q를 함유하며, 또한 Xaa5의 α-아미노 그룹은 임의로 메틸화될 수 있다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    X, A 및 Xaa8가 제 1 항에서 정의한 바와 같고;
    Q가 카바모일 또는 메틸카바모일이며;
    D-Pal이 D-3Pal이며;
    Xaa5가 4Aph(Q1) 또는 4Amf(Q1)이며 Q1은 Q,
    이며,
    Xaa6가 D-4Aph(Q2), D-4Amf(Q2)이며, Q2는 Q 또는 D- 또는 L-Hor 또는 D- 또는 L-Imz이며; 단 Q1이 Q일 때, Q2또한 Q이며,
    Xaa10이 D-Ala-NH2, D-Ala-ol 또는 Ala-ol인 GnRH 길항제 펩타이드.
  3. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, Q1이 L-Hor 또는 D-Hor인 GnRH 길항제.
  4. 제 1 항 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, X가 Ac이고, Xaa8이 Lys(ipr)이며 Xaa10이 D-Ala-NH2인 GnRH 길항제.
  5. 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa5가 4Aph(L- 또는 D-Hor)이고 Xaa6가 D-4Aph(AC), D-4Aph(atz), 또는 D-3Pal인 GnRH 길항제.
  6. 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa5가 4Aph(L- 또는 D-Hor)이고 Q2가 Q이며 R이 H 또는 메틸인 GnRH 길항제.
  7. 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa5가 4Aph(L- 또는 D-Hor)이고 Xaa6가 D-Cit 또는 D-Hci인 GnRH 길항제.
  8. 제 1 항 내지 4 항 중 어느 한 항에 있어서, Xaa6가 D-4Aph(D-Hor)인 GnRH 길항제.
  9. 제 1 항에 있어서,
    X가 For, Ac, Acr, Pn, By, Vl, Vac, Bz 또는 Q이며, Q는 제 1 항에서 정의한 바와 같으며;
    A가 4Cl 또는 4F이며;
    D-Pal이 D-3Pal이며;
    Xaa5가 Aph(Q1) 또는 Amf(Q1)이며 Q1은 Hor 또는 Imz의 D-이성체, L-이성체, 또는 D/L-이성체 혼합물이며;
    Xaa6이 D-Aph(Q2), D-Amf(Q2), D-Cit, D-Lys(Nic) 또는 D-Pal이며, Q2는 For, Ac, Q 또는 Q1이며;
    Xaa8은 Lys(ipr)이며;
    Xaa10은 D-Ala-NH2, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH2CH3, Gly-NH2인 GnRH 길항제 펩타이드.
  10. 제 9 항에 있어서, Q1이 L- 또는 D-Hor이고 Xaa6가 D-4Amf(Q)이며, R이 H 또는 메틸인 GnRH 길항제.
  11. 제 9 항에 있어서, X가 Ac 또는 Q이고; R이 H 또는 메틸이며; Xaa6이 D-4Aph(Q2), D-4Amf(Q2) 또는 D-3Pal이며, Q2가 Ac, Q 또는 Q1이며; Xaa10이 D-Ala-NH2인 GnRH 길항제 펩타이드.
  12. 제 1 항에 있어서, 서열식: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-Xaa6-Leu-Lys(ipr)-Pro-Xaa10(여기에서, Xaa6는 D-4Aph(Ac), D-3Pal, D-4Aph(카바모일), D-4Amf(카바모일), D-4Amf(메틸카바모일) 또는 D-4Aph(D-Hor)이며 Xaa10이 D-Ala-NH2, D-Ala-ol 또는 Ala-ol인 GnRH 길항제.
  13. 활성성분으로 유효량의 제 1 항 내지 12 항 중 어느 한 항에 따른 GnRH 길항제를 무독성 희석제와 함께 포함하는, 포유류에서의 고나도트로핀 분비 억제용 약학 조성물.
  14. GnRH가 과도한 호르몬 분비 또는 종양 증식을 일으키는 증상의 생체내 또는 시험관내 진단법에 있어서, 제 1 항 내지 13 항 중 어느 한 항에 따른 GnRH 길항제 펩타이드를 투여하고 호르몬 분비나 종양 세포 증식을 모니터링 하는 단계를 포함하는 방법.
  15. LH 및 FSH 수준의 상당한 감소를 초래하는 양의 제 13 항에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유류에서의 고나도트로핀 분비 억제방법.
  16. 하기 서열식을 갖는 GnRH 길항제 펩타이드 제조용 중간체.
    X1-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser(X2)-Xaa5-Xaa6-Leu-Lys(ipr)(X4)-Pro-X5
    상기에서,
    X1은 α-아미노 보호그룹이고;
    A는 4Cl 또는 4F이며;
    X2는 H 또는 하이드록시-보호그룹이며;
    Xaa5는 Aph(Q1) 또는 Amf(Q1)이며 Q1은
    의 D-이성체, L-이성체 또는 D/L 이성체 혼합물이며;
    Xaa6는 D-Aph(Q2), D-Amf(Q2) 또는 D-Pal이며, Q2는 Ac, Q1, 카바모일 또는 메틸카바모일이며;
    X4는 산-불안정 아미노 보호그룹이며;
    X5는 D-Ala-, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl-, Agl(Me)-, 또는 D-Agl(Me)-수지 지지체; N(Et)-수지 지지체; D-Ala, Gly 또는 Ala의 아미드; 에틸아미드; AzaGly-NH2; 또는 OH이며, 단 Xaa5의 α-아미노 그룹은 임의로 메틸화될 수 있다.
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