CN114456236A - 一种地加瑞克乙酰化杂质的制备方法 - Google Patents

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CN114456236A CN202011237279.7A CN202011237279A CN114456236A CN 114456236 A CN114456236 A CN 114456236A CN 202011237279 A CN202011237279 A CN 202011237279A CN 114456236 A CN114456236 A CN 114456236A
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刘自成
张利香
李新宇
付玉清
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Abstract

本发明提供了一种地加瑞克乙酰化杂质的制备方法，属于多肽药物制备领域。该方法包括以下步骤：1)以氨基树脂为起始树脂，按照地加瑞克肽序合成第n位至第10位的地加瑞克肽片段树脂或地加瑞克肽树脂，其中第4位氨基酸采用Fmoc‑Ser‑OH，其余采用相应的保护氨基酸或片段；2)使用乙酰化试剂进行乙酰化；3)继续偶联剩余氨基酸，获得地加瑞克乙酰化杂质肽树脂；若步骤1)中合成地加瑞克肽树脂时，此步骤可省略；4)裂解，纯化后得到地加瑞克乙酰化杂质：[Ser(Ac)4]degarelix；其中，n＝1、2或3。该方法纯度高，收率高，为地加瑞克原料药及其制剂的杂质分析及研究提供合格的杂质对照品，进一步提高了地加瑞克的生产和用药安全。

Description

一种地加瑞克乙酰化杂质的制备方法
技术领域
本发明属于多肽药物制备领域，特别涉及一种地加瑞克乙酰化杂质的制备方法。
背景技术
地加瑞克为含有7个非天然氨基酸的线性十肽，组成如下：
Ac-D-2Nal1-D-4Cpa2-D-3Pal3-Ser4-4Aph(Hor)5-D-4Aph(Cbm)6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10 -NH2。地加瑞克(Degarelix)，商品名为Firmagon，是由丹麦辉凌(Ferring)公司开发，于2008年12月24日被美国FDA批准上市的一种促性腺激素释放激素(GnRH)受体抑制剂类药物。地加瑞克主要治疗对象为晚期前列腺癌患者，其机制为通过抑制对前列腺癌持续生长至关重要的睾酮，从而达到延缓前列腺癌的生长和恶化的目的。
WO9846634为最早合成地加瑞克的专利，采用Boc保护氨基酸的固相合成方法合成醋酸地加瑞克。因成品的反离子为醋酸盐，在储存过程中，容易产生地加瑞克乙酰化杂质：[Ser(Ac)4]degarelix。该杂质结构式如下所示：
Figure BDA0002767160360000011
CN107569456提供了生产冻干的地加瑞克产品的方法。地加瑞克的物理化学表征显示该十肽具有自聚集的能力，通常需要在6％～40％醋酸水溶液下冻干，但使用高浓度醋酸的样品溶液进行冻干，容易产生地加瑞克乙酰化杂质。原料药的稳定性试验中也容易产生地加瑞克乙酰化杂质。本发明所提到的地加瑞克乙酰化杂质，如无特殊说明均为：[Ser(Ac)4] degarelix。
地加瑞克乙酰化杂质会影响药物的稳定性和安全性，使药物的活性降低，安全性风险升高。地加瑞克的制备、储存过程中都极易产生地加瑞克乙酰化杂质，但目前没有关于地加瑞克原料药及制剂中该杂质合成方法的研究，缺少为地加瑞克的生产和用药安全提供检测方法及判定依据。在合成[Ser(Ac)4]degarelix过程中，有4个容易被乙酰化的氨基酸位点，分别为4位的Ser，5位的Aph(Hor)，6位的D-Aph(Cbm)和8位的Lys(iPr)，也是合成的难点所在。地加瑞克原料药通常采用固相法合成，专利CN104177478采用tBu保护4位Ser侧链羟基、专利CN109575109采用ψMe，Me保护4位Ser侧链羟基、专利CN105524143采用Bzl 保护4位Ser侧链羟基，侧链保护基都是为了防止乙酰化杂质的产生。若按照常规方法将4 位Fmoc-Ser(Ac)-OH进行偶联制备此杂质，该位点在脱Fmoc保护过程中，乙酰基会迁移至氨基上，使得下一步的偶联反应失败。若直接在地加瑞克原料药中进行4位Ser侧链乙酰化，又会带来8位Lys(iPr)侧链乙酰化问题。因此，亟需开发一种高效的制备地加瑞克乙酰化杂质的制备方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种地加瑞克乙酰化杂质的制备方法。技术方案如下所述：
一种地加瑞克乙酰化杂质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以氨基树脂为起始树脂，按照地加瑞克肽序合成第n位至第10位的地加瑞克肽片段树脂或地加瑞克肽树脂，其中第4位氨基酸采用Fmoc-Ser-OH，其余采用相应的保护氨基酸或片段；
2)使用乙酰化试剂进行乙酰化；
3)继续偶联剩余氨基酸，获得地加瑞克乙酰化杂质肽树脂；
若步骤1)中合成地加瑞克肽树脂时，此步骤可省略；
4)裂解，纯化后得到地加瑞克乙酰化杂质：[Ser(Ac)4]degarelix；
其中，n＝1，2或3。
本技术方案的合成方法包括片段偶联和逐步偶联。
在一些实施方案中，当n＝1时，制备方法具体包括以下步骤：
1)以氨基树脂为起始树脂，按照地加瑞克肽序合成地加瑞克肽树脂，其中第4位氨基酸采用Fmoc-Ser-OH，其余采用相应的保护氨基酸或片段；
2)使用乙酰化试剂进行乙酰化；
3)裂解，纯化后得到地加瑞克乙酰化杂质：[Ser(Ac)4]degarelix。
在一些实施方案中，当n＝2时，制备方法具体包括以下步骤：
1)以氨基树脂为起始树脂，按照地加瑞克肽序合成第2位至第10位的地加瑞克肽片段树脂，其中第4位氨基酸采用Fmoc-Ser-OH，其余采用相应的保护氨基酸或片段；
2)使用乙酰化试剂进行乙酰化；
3)继续偶联剩余氨基酸，获得地加瑞克乙酰化杂质肽树脂；
4)裂解，纯化后得到地加瑞克乙酰化杂质：[Ser(Ac)4]degarelix。
在一些实施方案中，当n＝3时，制备方法具体包括以下步骤：
1)以氨基树脂为起始树脂，按照地加瑞克肽序合成第3位至第10位的地加瑞克肽片段树脂，其中第4位氨基酸采用Fmoc-Ser-OH，其余采用相应的保护氨基酸或片段；
2)使用乙酰化试剂进行乙酰化；
3)继续偶联剩余氨基酸，获得保护的地加瑞克乙酰化杂质肽树脂；
4)裂解，纯化后得到地加瑞克乙酰化杂质：[Ser(Ac)4]degarelix。
优选地，乙酰化试剂由A和B组成，其中A选自CH3COOH/DIC/HOBt、CH3COOBt、CH3COOSu、CH3COOPFP、CH3COOPNP中的一种，B为DMAP。
更为优选地，乙酰化试剂中的A选自CH3COOH/DIC/HOBt或CH3COOBt。
进一步优选地，乙酰化试剂中的A为CH3COOH/DIC/HOBt，其摩尔比例为1:1.5:1.2。原位生成的乙酰化活泼酯不易失活，可以有效的进行乙酰化，且试剂容易保存，成本低廉。
所述乙酰化试剂可避免5位Aph(Hor)和6位D-Aph(Cbm)的乙酰化杂质的产生，选择性高。
本发明提供了一种地加瑞克乙酰化杂质的制备方法。所述方法使用侧链不保护的Fmoc-Ser-OH和选择性高的乙酰化试剂进行合成。Ser不含侧链保护基有利于其侧链羟基的乙酰化，选择性高的乙酰化试剂可避免5位Aph(Hor)和6位D-Aph(Cbm)的乙酰化杂质的产生，8位Lys(iPr)具有保护基保护也无乙酰化风险。本发明的技术方案操作简单，纯度高，收率高，为地加瑞克原料药及其制剂的杂质分析及研究提供合格的杂质对照品，进一步提高了地加瑞克的生产和用药安全。
附图说明
图1为实施例5的地加瑞克乙酰化杂质的液相色谱图。
图2为实施例5的地加瑞克乙酰化杂质的质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明。实施例不应限定为对保护范围的限制。
本发明涉及的英文缩写对应的中文名称如表1所示：
表1本发明涉及的英文缩写对应的中文名称
Figure BDA0002767160360000031
Figure BDA0002767160360000041
根据下述实施例，对本发明技术方案进行进一步详细描述。
实施例1 Fmoc-D-Ala-Rink MBHA树脂的合成
称取Rink Amide MBHA树脂(75g，30mmol，替代度：0.40mmol/g)于固相反应合成柱中。加入500mL DMF溶胀30min，抽去DMF。用3*400mL DMF洗涤树脂，抽去DMF。加入400mL的DBLK溶液(20％哌啶/DMF溶液，V/V)，脱保护两次，第一次5min，第二次15min。脱保护结束后，每次用400mL DMF洗涤树脂，洗涤6遍，第4次洗涤完毕，用玻璃棒挑取少许树脂，茚三酮检测呈阳性，表明Fmoc脱除完全。
称取18.68g Fmoc-D-Ala-OH和9.73g HOBt，加入120mL DMF溶解，待完全溶解后，将溶液冷却至5℃以下，然后加入11.36g DIC(预冷至<0℃)，于溶液中活化约3～5min，将活化后的溶液控制加入反应柱中，在20～30℃下反应2～3h，茚三酮检测呈阴性，抽掉反应液，每次加入400mL的DMF洗涤树脂，洗涤6遍。洗毕后，抽除洗涤液，得到 Fmoc-D-Ala-RinkMBHA树脂。
实施例2地加瑞克1-10位肽树脂的合成
称取Fmoc-D-Ala-Rink MBHA树脂(30mmol)于固相反应合成柱中。用3*400mL DMF洗涤树脂，抽去DMF。加入400mL的DBLK溶液(20％哌啶/DMF溶液，V/V)，脱保护两次，第一次5min，第二次15min。脱保护结束后，每次用400mLDMF洗涤树脂，洗涤6 遍，第4次洗涤完毕，用玻璃棒挑取少许树脂，茚三酮检测呈阳性，表明Fmoc脱除完全。
称取20.24g Fmoc-Pro-OH和9.73g HOBt，加入120mL DMF溶解，待完全溶解后，将溶液冷却至5℃以下，然后加入11.36g DIC(预冷至<0℃)，于溶液中活化约3～5min，将活化后的溶液控制加入反应柱中，在20～30℃下反应2～3h，茚三酮检测呈阴性，抽掉反应液，每次加入400mL的DMF洗涤树脂，洗涤6遍。洗毕后，抽除洗涤液，继续下一个氨基酸的偶联。
加入400mL的DBLK溶液(20％哌啶/DMF溶液，V/V)，脱保护两次，第一次5min，第二次15min。脱保护结束后，每次用400mL DMF洗涤树脂，洗涤6遍，第4次洗涤完毕，用玻璃棒挑取少许树脂，Chloranil检测呈阳性，表明Fmoc脱除完全。
称取30.64g Fmoc-ILys(Boc)-OH和9.73g HOBt，加入120mL DMF溶解，待完全溶解后，将溶液冷却至5℃以下，然后加入11.36g DIC(预冷至<0℃)，于溶液中活化约3～5min，将活化后的溶液控制加入反应柱中，在20～30℃下反应2～3h，Chloranil检测呈阴性，抽掉反应液，每次加入400mL的DMF洗涤树脂，洗涤6遍。洗毕后，抽除洗涤液，继续下一个氨基酸的偶联。
每次加入400mL的DBLK溶液(20％哌啶/DMF溶液，V/V)，脱保护两次，第一次5min，第二次15min。脱保护结束后，每次用400mL DMF洗涤树脂，洗涤6遍，第4次洗涤完毕，用玻璃棒挑取少许树脂，茚三酮检测呈阳性，表明Fmoc脱除完全。
称取21.21g Fmoc-Leu-OH和9.73g HOBt，加入120mL DMF溶解，待完全溶解后，将溶液冷却至5℃以下，然后加入11.36g DIC(预冷至<0℃)，于溶液中活化约3～5min，将活化后的溶液控制加入反应柱中，在20～30℃下反应2～3h，茚三酮检测呈阴性，抽掉反应液，每次加入400mL的DMF洗涤树脂，洗涤6遍。洗毕后，抽除洗涤液，继续下一个氨基酸的偶联。
参照Fmoc-Leu-OH偶联步骤，按照地加瑞克氨基酸序列，依次连接Fmoc-D-4Aph(Cbm)-OH(26.73g)、Fmoc-4Aph(Hor)-OH(32.55g)、Fmoc-Ser-OH(19.64 g)、Fmoc-D-3Pal-OH(23.32g)、Fmoc-D-4Cpa-OH(25.31g)、Fmoc-D-2Nal-OH(26.51g)。
加入400mL的DBLK溶液(20％哌啶/DMF溶液，V/V)，脱保护两次，第一次5min，第二次15min。脱保护结束后，每次用400mL DMF洗涤树脂，洗涤6遍，第4次洗涤完毕，用玻璃棒挑取少许树脂，茚三酮检测呈阳性，表明Fmoc脱除完全。
称取4.59gAc2O(1.5eq)和5.82g DIEA(1.5eq)，加入360mL DMF，混匀后，将溶液冷却至5℃以下倒入反应柱中。在0～5℃下反应20min后，茚三酮检测呈阴性，抽掉反应液，每次加入400mL的DMF洗涤树脂，洗涤6遍，得到地加瑞克1-10位肽树脂： Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Rink MBHA树脂。
实施例3地加瑞克乙酰化杂质肽树脂的合成
将实施例2的产物继续反应，称取醋酸18.02g，DMAP 11.00g和HOBt48.64 g，加入120mL DMF溶解，待完全溶解后，将溶液冷却至5℃以下，加入反应柱中，然后加入56.79 gDIC(预冷至<0℃)，在20～30℃下反应3～5h，结束反应，每次加入400mL的DMF洗涤树脂，洗涤6遍。洗毕后，抽除洗涤液，然后用DCM洗涤树脂，每次400mL，洗涤4 遍，得到地加瑞克乙酰化杂质肽树脂： Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(Ac)-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Rink MBHA树脂，树脂在20～30℃下真空抽干至呈流沙状。肽树脂干燥完后为110.22g，树脂增重率为119％。
实施例4地加瑞克乙酰化杂质肽树脂的裂解
取预冷后的1100mL裂解液(不高于10℃)，配比为TFA：TIS：H2O＝92.5：2.5：2.5(V/V/V)，加入实施例3的产物：地加瑞克乙酰化杂质肽树脂，110g，20～30℃反应2.0h，抽滤，TFA洗涤树脂，滤液浓缩至1/2-2/3体积，然后加入10倍体积异丙醚沉降，离心收集沉淀，异丙醚洗涤6次，真空干燥，获得地加瑞克乙酰化杂质粗肽： Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(Ac)-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2，为 43.72g，收率87％。
实施例5地加瑞克乙酰化杂质粗肽的纯化
将实施例4得到的地加瑞克乙酰化杂质粗肽用20％的乙腈/水和醋酸溶解，先用0.5％TEAP(pH2.25)/乙腈体系进行一步纯化，收集纯度大于98％的馏分进行二步转盐，用4g/L醋酸铵/乙腈，1.0％醋酸/乙腈体系转盐，浓缩冻干得到地加瑞克乙酰化杂质19.82g，收率39％，纯度96.4％。地加瑞克乙酰化杂质的液相色谱图见图1；地加瑞克乙酰化杂质的质谱图见图2，其中838.01是[M+2H]2+峰，1675.31是[M+H]+峰。
实施例6地加瑞克1-10位肽树脂的片段合成
参照实施例1～2的操作步骤，称取Rink Amide AM树脂(30g，30mmol，替代度：1.0mmol/g)于固相反应合成柱中，按照地加瑞克氨基酸序列，依次连接Fmoc-Pro-D-Ala-OH(40.24g)、Fmoc-ILys(Boc)-OH(30.64g)、Fmoc-Leu-OH(21.21g)、Fmoc-D-4Aph(Cbm) -OH(26.73g)、Fmoc-4Aph(Hor)-OH(32.55g)、Fmoc-Ser-OH(19.64g)、Fmoc-D-3Pal-OH(23.32g)、Fmoc-D-4Cpa-OH(25.31g)、Ac-D-2Nal-OH(15.43g)，得到地加瑞克1-10位肽树脂：Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc) -Pro-D-Ala-Rink AM树脂。
实施例7地加瑞克乙酰化杂质的制备
将实施例6的产物继续反应，称取CH3COOBt 53.15g，DMAP 11.00g，加入120mL DMF溶解，待完全溶解后，将溶液冷却至5℃以下，加入反应柱中，在20～30℃下反应3～5h，结束反应，每次加入400mL的DMF洗涤树脂，洗涤6遍。洗毕后，抽除洗涤液，然后用 DCM洗涤树脂，每次400mL，洗涤4遍，得到地加瑞克乙酰化杂质肽树脂： Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(Ac)-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Rink AM树脂，树脂在20～30℃下真空抽干至呈流沙状。肽树脂干燥完后为116.27g，树脂增重率为122％。参照实施例4和5，地加瑞克乙酰化杂质肽树脂经裂解和纯化后，冻干得到地加瑞克乙酰化杂质，为20.52g，收率41％，纯度97.6％。地加瑞克乙酰化杂质的液相色谱图、质谱图和实施例5的谱图类似。
实施例8地加瑞克2-10位肽片段树脂的合成
称取Rink Amide MBHA树脂(75g，30mmol，替代度：0.40mmol/g)于固相反应合成柱中。按照实施例1～2的方法依次偶联氨基酸Fmoc-D-Ala-OH(18.68g)、Fmoc-Pro-OH(20.24g)、Fmoc-ILys(Boc)-OH(30.64g)、Fmoc-Leu-OH(21.21g)、Fmoc-D-4Aph(Cbm) -OH(26.73g)、Fmoc-4Aph(Hor)-OH(32.55g)、Fmoc-Ser-OH(19.64g)、Fmoc-D-3Pal-OH(23.32g)、Fmoc-D-4Cpa-OH(25.31g)，偶联完毕后，DMF洗涤，得到地加瑞克2-10位肽片段树脂： Fmoc-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-RinkMBHA树脂。
实施例9地加瑞克2-10位乙酰化杂质肽片段树脂的合成
将实施例8的产物继续反应，称取CH3COOPFP67.83 g，DMAP 11.00g加入120mL DMF溶解，待完全溶解后，将溶液冷却至5℃以下，加入反应柱中，在20～30℃下反应3～5h，结束反应，每次加入400mL的DMF洗涤树脂，洗涤4遍。每次加入400mL的DBLK溶液(20％哌啶/DMF溶液，V/V)，脱保护两次，第一次5min，第二次15min.脱保护结束后，每次用400mLDMF洗涤树脂，洗涤6遍，第4次洗涤完毕，用玻璃棒挑取少许树脂，茚三酮检测呈阳性，表明Fmoc脱除完全，得到地加瑞克2-10位乙酰化杂质肽片段树脂： Fmoc-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(Ac)-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Rink MBHA树脂。
实施例10地加瑞克乙酰化杂质的制备
将实施例9的产物继续反应，偶联Fmoc-D-2Nal-OH(26.51g)后，用Ac2O(4.59g，1.5eq)封端，得到地加瑞克乙酰化杂质肽树脂： Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(Ac)-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Rink MBHA树脂，肽树脂干燥完后为108.35g，树脂增重率为117％。参考实施例4和5，地加瑞克乙酰化杂质肽树脂经裂解和纯化后，冻干得到地加瑞克乙酰化杂质19.83g，收率40％，纯度96.2％。地加瑞克乙酰化杂质的液相色谱图、质谱图和实施例5的谱图类似。
实施例11地加瑞克2-10位肽片段树脂的片段合成
参照实施例1～2的操作步骤，称取Rink Amide AM树脂(30g，30mmol，替代度：1.0mmol/g)于固相反应合成柱中，按照地加瑞克氨基酸序列，依次连接Fmoc-D-Ala-OH(18.68g)、Fmoc-Pro-OH(20.24g)、Fmoc-ILys(Boc)-OH(30.64g)、Fmoc-Leu-OH(21.21g)、 Fmoc-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-OH(44.84g)、Fmoc-Ser-OH(19.64g)、Fmoc-D-3Pal-OH (23.32g)、Fmoc-D-4Cpa-OH(25.31g)，偶联完毕后，DMF洗涤，得到地加瑞克2-10位肽片段树脂： Fmoc-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Rink AM树脂。
实施例12地加瑞克2-10位乙酰化杂质肽片段树脂的合成
将实施例11的产物继续反应，称取醋酸18.02g，DMAP 11.00g和HOBt48.64 g，加入120mL DMF溶解，待完全溶解后，将溶液冷却至5℃以下，加入反应柱中，然后加入56.79 gDIC(预冷至<0℃)，在20～30℃下反应3～5h，结束反应，每次加入400mL的DMF洗涤树脂，洗涤6遍。每次加入400mL的DBLK溶液(20％哌啶/DMF溶液，V/V)，脱保护两次，第一次5min，第二次15min。脱保护结束后，每次用400mL DMF洗涤树脂，洗涤 6遍，第4次洗涤完毕，用玻璃棒挑取少许树脂，茚三酮检测呈阳性，表明Fmoc脱除完全，得到地加瑞克2-10位乙酰化杂质肽片段树脂： Fmoc-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(Ac)-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Rink AM树脂。
实施例13地加瑞克乙酰化杂质的制备
将实施例12的产物继续反应，偶联Ac-D-2Nal-OH(15.43g)，得到地加瑞克乙酰化杂质肽树脂：Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(Ac)-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc) -Pro-D-Ala-Rink AM树脂，肽树脂干燥完后为112.46g，树脂增重率为118％。参考实施例4 和5，地加瑞克乙酰化杂质肽树脂经裂解和纯化后，冻干得到地加瑞克乙酰化杂质20.56g，收率41％，纯度95.8％。地加瑞克乙酰化杂质的液相色谱图、质谱图和实施例5的谱图类似。
实施例14地加瑞克3-10位肽片段树脂的合成
称取Rink Amide MBHA树脂(75g，30mmol，替代度：0.40mmol/g)于固相反应合成柱中。按照实施例1～2的方法依次偶联氨基酸Fmoc-D-Ala-OH(18.68g)、Fmoc-Pro-OH(20.24g)、Fmoc-ILys(Boc)-OH(30.64g)、Fmoc-Leu-OH(21.21g)、Fmoc-D-4Aph(Cbm) -OH(26.73g)、Fmoc-4Aph(Hor)-OH(32.55g)、Fmoc-Ser-OH(19.64g)、Fmoc-D-3Pal-OH(23.32g)，偶联完毕后，DMF洗涤，得到地加瑞克3-10位肽片段树脂： Fmoc-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Rink MBHA树脂。
实施例15地加瑞克3-10位乙酰化杂质肽片段树脂的合成
将实施例14的产物继续反应，称取醋酸18.02g，DMAP 11.00g和HOBt48.64 g，加入120mL DMF溶解，待完全溶解后，将溶液冷却至5℃以下，加入反应柱中，然后加入56.79 gDIC(预冷至<0℃)，在20～30℃下反应3～5h，结束反应，加入400mL的DMF洗涤树脂，洗涤4遍。每次加入400mL的DBLK溶液(20％哌啶/DMF溶液，V/V)，脱保护两次，第一次5min，第二次15min。脱保护结束后，每次用400mL DMF洗涤树脂，洗涤6遍，第4次洗涤完毕，用玻璃棒挑取少许树脂，茚三酮检测呈阳性，表明Fmoc脱除完全，得到地加瑞克3-10位乙酰化杂质肽片段树脂： Fmoc-D-3Pal-Ser(Ac)-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-RinkMBHA树脂。
实施例16地加瑞克乙酰化杂质的制备
将实施例15的产物继续反应，偶联Fmoc-D-4Cpa-OH(25.31g)、Fmoc-D-2Nal-OH(26.51 g)后，用Ac2O(4.59g，1.5eq)封端，得到地加瑞克乙酰化杂质肽树脂： Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(Ac)-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Rink MBHA树脂，肽树脂干燥完后为106.51g，树脂增重率为115％。参考实施例4和5，地加瑞克乙酰化杂质肽树脂经裂解和纯化后，冻干得到地加瑞克乙酰化杂质18.69g，收率38％，纯度95.3％。地加瑞克乙酰化杂质的液相色谱图、质谱图和实施例5的谱图类似。
实施例17地加瑞克3-10位肽片段树脂的片段合成
参照实施例1～2的操作步骤，称取Rink Amide AM树脂(30g，30mmol，替代度：1.0mmol/g)于固相反应合成柱中，按照地加瑞克氨基酸序列，依次连接Fmoc-D-Ala-OH(18.68g)、Fmoc-Pro-OH(20.24g)、Fmoc-ILys(Boc)-OH(30.64g)、Fmoc-Leu-OH(21.21g)、 Fmoc-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-OH(44.84g)、Fmoc-Ser-OH(19.64g)、Fmoc-D-3Pal-OH (23.32g)偶联完毕后，DMF洗涤，得到地加瑞克3-10位肽片段树脂： Fmoc-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Rink AM树脂。
实施例18地加瑞克3-10位乙酰化杂质肽片段树脂的合成
将实施例17的产物继续反应，称取CH3COOBt 53.15g，DMAP 11.00g加入120mL DMF溶解，待完全溶解后，将溶液冷却至5℃以下，加入反应柱中，在20～30℃下反应3～5h，结束反应，加入400mL的DMF洗涤树脂，洗涤4遍。每次加入400mL的DBLK溶液(20％哌啶/DMF溶液，V/V)，脱保护两次，第一次5min，第二次15min。脱保护结束后，每次用400mL DMF洗涤树脂，洗涤6遍，第4次洗涤完毕，用玻璃棒挑取少许树脂，茚三酮检测呈阳性，表明Fmoc脱除完全，得到地加瑞克3-10位乙酰化杂质肽片段树脂： Fmoc-D-3Pal-Ser(Ac)-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Rink AM树脂。
实施例19地加瑞克乙酰化杂质的制备
将实施例18的产物继续反应，继续偶联Ac-D-2Nal-D-4Cpa-OH(26.33g)后，用Ac2O(4.59g，1.5eq)封端，得到地加瑞克乙酰化杂质肽树脂： Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(Ac)-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-Rink AM树脂，肽树脂干燥完后为117.22g，树脂增重率为123％。参考实施例4和5，地加瑞克乙酰化杂质肽树脂经裂解和纯化后，冻干得到地加瑞克乙酰化杂质21.55g，收率42％，纯度97.9％。地加瑞克乙酰化杂质的液相色谱图、质谱图和实施例5的谱图类似。
实施例20地加瑞克乙酰化杂质的制备
将实施例18的产物继续反应，继续偶联Fmoc-D-4Cpa-OH(25.31g)、Fmoc-D-2Nal-OH (26.51g)后，用Ac2O(4.59g，1.5eq)封端，得到地加瑞克乙酰化杂质肽树脂： Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(Ac)-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys(Boc)-Pro-D-Ala-RinkAM树脂，肽树脂干燥完后为110.26g，树脂增重率为116％。参考实施例4和5，地加瑞克乙酰化杂质肽树脂经裂解和纯化后，冻干得到地加瑞克乙酰化杂质20.87g，收率41％，纯度96.8％。地加瑞克乙酰化杂质的液相色谱图、质谱图和实施例5的谱图类似。

Claims (7)

1.一种地加瑞克乙酰化杂质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以氨基树脂为起始树脂，按照地加瑞克肽序合成第n位至第10位的地加瑞克肽片段树脂或地加瑞克肽树脂，其中第4位氨基酸采用Fmoc-Ser-OH，其余采用相应的保护氨基酸或片段；
2)使用乙酰化试剂进行乙酰化；
3)继续偶联剩余氨基酸，获得地加瑞克乙酰化杂质肽树脂；
若步骤1)中合成地加瑞克肽树脂时，此步骤可省略；
4)裂解，纯化后得到地加瑞克乙酰化杂质：[Ser(Ac)4]degarelix；
其中，n＝1，2或3。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，当n＝1时，具体包括以下步骤：
1)以氨基树脂为起始树脂，按照地加瑞克肽序合成地加瑞克肽树脂，其中第4位氨基酸采用Fmoc-Ser-OH，其余采用相应的保护氨基酸或片段；
2)使用乙酰化试剂进行乙酰化；
3)裂解，纯化后得到地加瑞克乙酰化杂质：[Ser(Ac)4]degarelix。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，当n＝2时，具体包括以下步骤：
1)以氨基树脂为起始树脂，按照地加瑞克肽序合成第2位至第10位的地加瑞克肽片段树脂，其中第4位氨基酸采用Fmoc-Ser-OH，其余采用相应的保护氨基酸或片段；
2)使用乙酰化试剂进行乙酰化；
3)继续偶联剩余氨基酸，获得地加瑞克乙酰化杂质肽树脂；
4)裂解，纯化后得到地加瑞克乙酰化杂质：[Ser(Ac)4]degarelix。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，当n＝3时，具体包括以下步骤：
1)以氨基树脂为起始树脂，按照地加瑞克肽序合成第3位至第10位的地加瑞克肽片段树脂，其中第4位氨基酸采用Fmoc-Ser-OH，其余采用相应的保护氨基酸或片段；
2)使用乙酰化试剂进行乙酰化；
3)继续偶联剩余氨基酸，获得地加瑞克乙酰化杂质肽树脂；
4)裂解，纯化后得到地加瑞克乙酰化杂质：[Ser(Ac)4]degarelix。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述乙酰化试剂由A和B组成，其中A选自CH3COOH/DIC/HOBt、CH3COOBt、CH3COOSu、CH3COOPFP、CH3COOPNP中的一种，B为DMAP。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述乙酰化试剂中的A选自CH3COOH/DIC/HOBt或CH3COOBt。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述乙酰化试剂中的A为CH3COOH/DIC/HOBt，其摩尔比为1:1.5:1.2。
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