SK285381B6

SK285381B6 - Peptid antagonistický k hormónu uvoľňujúcemu gonadotropín (GnRH), farmaceutický prostriedok s jeho obsahom, jeho použitie a medziprodukt

Info

Publication number: SK285381B6
Application number: SK1396-99A
Authority: SK
Inventors: Graeme Semple; Guangcheng Jiang; Jean E. F. Rivier
Original assignee: Ferring B.V.
Priority date: 1997-04-11
Filing date: 1998-04-13
Publication date: 2006-12-07
Also published as: JP4249806B2; US6214798B1; NL300395I1; SK139699A3; CZ358699A3; ES2260833T3; MY114811A; CN1230442C; AU728642B2; SI1003774T1; EP1003774B1; US5925730A; CA2286190C; CZ299097B6; KR20010006233A; EE03974B1; UA58547C2; DE122009000033I2; NO2009016I2; FR09C0028I2

Abstract

Sú opísané peptidy s dlhodobými antagonistickými vlastnosťami k GnRH. Uvedené antagonisty sú použiteľné na reguláciu plodnosti a na liečbu nádorov závislých od steroidov a na ďalšie krátkodobé a dlhodobé liečebné indikácie. Opísané antagonisty majú v polohe 5- alebo v polohách 5- a 6- derivát aminoPhe alebo jeho ekvivalent. Tento derivát je modifikovaný tak, aby obsahoval karbamoylovú skupinu alebo heterocyklickú skupinu vrátane štruktúrneho zoskupenia močoviny vo vedľajšom reťazci. Veľmi účinné sú dekapeptidy, majúce zásadné potláčanie sekrécie LH po 96 hodinách po injekcii, vzorca Ac-D-2Nal-D-4Cpa- D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Aph(acetyl)-Leu-Lys(izopropyl)- Pro-D-Ala-NH2 a Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydro-orotyl)- D-4Amf(Q2)-Leu-Lys-(izopropyl)-Pro-Xaa10, kde Q2 je Cbm alebo MeCbm a Xaa10 je D-Ala-NH2, D-Ala-ol alebo Ala-ol.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa vo všeobecnosti týka peptidov, ktoré sú antagonistami ľudského gonadotropín uvoľňujúceho hormónu (gonadotropin releasing hormone - GnRH) a ktoré majú výhodné fyzikálne, chemické a biologické vlastnosti. Bližšie sa vynález týka dekapeptidov, ktoré dlhodobo inhibujú gonadálnu funkciu a uvoľňovanie steroidných hormónov progesterónu a testosterónu; vynález sa ďalej týka spôsobov podávania farmaceutických prostriedkov, obsahujúcich uvedené dekapeptidy na uvedené účely a najmä na zvládnutie stavov vyplývajúcich z hypersekrécie gonadálnych steroidov.

Doterajší stav techniky

Folikulostimulačný hormón (FSH) a luteinizačný hormón (LH), niekedy označované ako gonadotropíny alebo gonadotrópne hormóny sú uvoľňované podmozgovou žľazou, ktorá je spojená s podlôžkom mozgu (hypotalamus).

Uvoľňovanie hormónu predným lalokom podmozgovej žľazy zvyčajne vyžaduje najprv uvoľnenie hormónov produkovaných podlôžkom, ako je napríklad GnRH dekapeptid.

Na potlačenie sekrécie gonadotroplnov u cicavcov a na potlačenie alebo oneskorenie ovulácie sa doteraz všeobecne podávajú analógy GnRH, ktoré sú antagonistické k normálnej funkcii GnRH.

Vyhľadávanie lepších antagonistov GnRH viedlo k vytvoreniu Antidu, čo je [Ac-D-ŽNal¹, D-4ClPhe², D-3Pal³, Lys(Nic)⁵, D-LysfNic)'¹, ILys⁸, D-Ala¹⁰] -GnRH, a Cetrorelixu, čo je [Ac-D-2Naľ, D-4ClPhe², D-3Pal³, D-Cit⁶, D-Ala^,0]-GnRH. Patent USA č. 5 516 887 opisuje antagonisty GnRH, o ktorých uvádza, že sú účinnejšie na potláčanie plazmového testosterónu ako Antid, napríklad [Ac-D-Nal¹, D-4ClPhe², D-3Pal³, D-N⁶-karbamoyl Lys⁶, ILys⁸, D-Ala¹⁰]-GnRH, ktorý sa označuje ako Antarelix.

Patent USA 5 296 468, zverejnený 2. marca 1994, opisuje návrh a syntézu viacerých antagonistov, v ktorých vedľajšie reťazce vybraných zvyškov sa reakciou upravili tak, aby sa vytvorili kyanoguanidínové zoskupenia; niektoré z nich následne spontánne konvertujú na vyžadovanú heterocyklická skupinu, napríklad na skupinu 3-amino1,2,4-triazol (atz). Tieto kyanoguanidínové štruktúrne zoskupenia sú viazané na omega-amínovú skupinu vo vedľajšom reťazci aminokyseliny, ako je lyzín, omitín, 4-aminofenylalanín (4Aph) alebo ich rozšírená verzia reťazca, ako je 4-amino-homofenylalanín (4Ahp). Antagonisty GnRH s takými významne modifikovanými alebo neprirodzenými aminokyselinami v polohách 5- alebo 6- majú dobrú biologickú účinnosť a všeobecne sa považujú za výhodné tie, ktoré sú vybudované na Aph. Výhodný je najmä Azalín B, čo je [Ac-D-2Nal’, D-4ClPhe², D-3Pal³, 4Aph(atz)⁵, D-4Aph(atz)⁶, ILys⁸, D-Ala¹⁰]-GnRH. V patente USA 5 506 207 sa zverejňujú biopotenciálne antagonisty, v ktorých aminosubstituované fenyl-alanínové vedľajšie reťazce zvyškov sú v polohách 5- a 6-acylované; výnimočne účinný dekapeptid je Acylín, čo je [Ac-D-2Nal', D-4ClPhe², D-3Pal³,4Aph(Ac)⁵, D-4Aph(Ac)⁶, ILys⁸, D-Ala^,0]-GnRH.

Napriek veľmi zaujímavým vlastnostiam tejto skupiny antagonistov GnRH výskum pokračuje vo vyhľadávaní zlepšených antagonistov GnRH, najmä takých, ktoré majú dlhotrvajúci biologický účinok. Často môže byť dôležité, aby peptidový analóg mal dlhodobú účinnosť vzhľadom na sekréciu LH; je to vlastnosť, ktorú možno podporiť odolnosťou peptidu proti proteolytickej enzymatickej degradácii v tele tak pre krátkodobé, ako aj pre dlhodobé liečebné indikácie. Na uľahčenie podávania týchto zlúčenín cicavcom, najmä človekovi, sa za mimoriadne výhodné považujú také dekapeptidy antagonistické k GnRH, ktoré majú vysokú rozpustnosť vo vode s normálnym fyziologickým pH, to znamená okolo pH 5 do približne pH 7,4 a ktoré nepodliehajú významnému gélovateniu prípravku.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu sú zlúčeniny, ktoré pri podávaní vykazujú veľmi výhodné vlastnosti z hľadiska dlhodobej biologickej účinnosti a ktoré sú výsledkom určitých iných modifikácií zvyšku v polohe 5, alebo zvyškov v polohách 5- a 6-, v podskupine antagonistov GnRH, ktorá zahŕňa Cetrorelix, Antarelix, Acylín, Antid a ďalšie. Uvedené modifikácie sú vykonané na zvyšku 4aminoPhe (4Aph) alebo jeho ekvivalente 4Ahp, alebo na 4-aminometylfenylalaníne (4Amf), v ktorých je primárna amínová skupina viazaná na metylovú skupinu, pripojenú v polohe 4- alebo v parapolohc. V týchto modifikáciách sa nechá reagovať aminoskupina vedľajšieho reťazca s izokyanátom za vzniku močovinovej skupiny, alebo sa nechá reagovať s heterocyklickou karboxylovou skupinou, obsahujúcou najmenej dva dusíkové atómy usporiadané tak, aby vytvárali močovinový štruktúrny motív. Výhodné heterocyklické reaktanty sú Dalebo L-kyselina hydroorotová (Hor)(C₄N₂H₅(0)₂COOH) a D- alebo L-2-imidazolidón-4-karboxylová kyselina (Imz)(C₄N₂H₅(O)₂COOH).

Podstatou vynálezu sú dekapeptidy antagonistické k GnRH, ktoré majú ďalej uvedený vzorec:

X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa⁵-Xaa⁶-Leu-Xaa⁸-Pro-Xaa¹⁰, v ktorom:

X je acylová skupina, ktorá nemá viac ako 7 atómov uhlíka, alebo Q, pričom

Qje

O

II

- C -NHR a R je H alebo nižší alkyl;

A je 4C1, 4F, 4Br, 4NO₂, 4CIT₃, 4OCH₃, 3,4C1₂, alebo C^aMe4Cl;

Xaa⁵ je Aph(Q') alebo Amf(Q'), pričom Q¹ je cII ⁰ (D- alebo L-Imz)

Xaa⁶ je D-Aph(Q²), D-Amf(Q²), D-Lys(Nic), D-Cit, D-Hci, alebo D-Pal, pričom Q² je For, Ac, 3-amino-l,2,4-triazol, Q, alebo Q¹;

Xaa⁸ je Lys(ipr), Arg, Har, Arg(Et2), alebo Har(Et2); a Xaa¹⁰ je D-Ala-NH2, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH₂CH₃, Gly-NH₂, AzaGly-NH₂, Ala-NH₂, Agl-NH₂, D-Agl-NH₂, Agl(Me)-NH₂, alebo D-Agl(Me)-NH₂ za predpokladu, že cc-amínová skupina Xaa⁵ môže byť voliteľne metylovaná; a ďalej za predpokladu: ak Xaa⁶ obsahuje D- alebo L-Hor, alebo D- alebo L- Imz, Xaa₅ môže mať ako Q¹ skupinu Ac, For, alebo 3-amino-l,2,4-triazol; a ak Xaa⁶ obsahuje Q, potom Xaa⁵ môže tiež obsahovať Q;

ich blízko príbuzné analógy a ich farmaceutický prijateľné soli, ktoré majú vo všeobecnosti zlepšené farmakologické vlastnosti, najmä dlhotrvajúci biologický účinok.

Z iného hľadiska vynález poskytuje použitie peptidu antagonistického k GnRH na výrobu lieku na diagnostikovanie in vivo alebo in vitro stavu, v ktorom GnRH vyvoláva nadmernú hormonálnu sekréciu alebo rast nádoru; uvedené diagnostikovanie zahŕňa podávanie peptidu antagonistického k GnRH opísaného typu a monitorovanie hormonálnej sekrécie alebo množenia nádorových buniek.

Z ešte iného hľadiska vynález zahŕňa medziprodukt na prípravu peptidu antagonistického k GnRH, ktorý má vzorec:

X’-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-(X²)-Xaa⁵-Xaa⁶-Leu-Lys(ipr)(X⁴)-Pro-X³, v ktorom:

X¹ je ochranná skupina oc-amínovej skupiny;

Aje4Cl alebo 4 F;

X² je H alebo ochranná skupina hydroxylovej skupiny;

Xaa⁵ je Aph(Q’), alebo AmfjQ¹), pričom Q¹ je D-izomér, L-izomér, alebo D/L-zmes izomérov alebo o

alebo (Dalebo L-Hor)

(D- alebo L-Imz)

Xaa⁶ je D-Aph(Q²), D-Amf(Q²), alebo D-Pal, pričom Q² je Ac, Q¹, karbamoyl, alebo metylkarbamoyl;

X⁴ je proti kyselinám nestála ochranná skupina amínovej skupiny; a

X⁵ je D-Ala, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl, Agl(Me), alebo D-Agl(Me) živicový základ (nosič); N(Et)-živicový nosič; amid kyseliny D-Ala-, Gly, alebo Ala; etylamid; AzaGly-NH₂; alebo OH, ale za predpokladu, že α-amínová skupina Xaa⁵ môže byť voliteľne metylovaná.

Uvedené antagonisty sú užitočné najmä na potláčanie sekrécie gonadotropínov a ako regulátory ľudskej fertility, pretože sa vyznačujú dlhodobým účinkom, to znamená, že po podaní pokračuje podstatné zníženie LH sekrécie počas najmenej približne 4 dní. Majú zlepšenú rozpustnosť vo vodných tlmivých roztokoch s fyziologickým pH a prijateľné vedľajšie účinky vzhľadom na stimuláciu uvoľňovania histamínu, to znamená lepšie ako GnRH superagonisty, ktoré sa doteraz klinicky používajú; v účinných koncentráciách majú tiež iba minimálne gélovatenie na subkutánne (sc) injekcie. Uvedené GnRH antagonisty sa tiež dobre správajú pri anafylaktoidnej skúške, keďže poskytujú pomerne malý pruh. Výsledkom je, že tieto peptidy nachádzajú značné využitie pri podávaní cicavcom, najmä ľuďom, na reguláciu plodnosti a na liečbu patologických stavov, ako je predčasné dospievanie, hormónovo závislá neoplazia, bolestivá menštruácia, endometritída, steroidne závislé nádory a ďalšie uvedené krátkodobé alebo dlhodobé indikácie. Uvedené antagonisty sú užitočné aj diagnosticky.

Pretože tieto antagonisty GnRH sú ľahko rozpustné v oblasti fyziologických pH medzi približne 5 do približne 7,4, môžu sa formulovať a podávať v koncentrovanej forme, najmä medzi pH približne 5 až 7. Pretože majú polárny charakter, sú veľmi vhodné na použitie v prípravkoch s pomalým uvoľňovaním, založených na známych kopolyméroch. Pretože tieto antagonisty účinne potláčajú LH a FSM dlhší čas, sú veľmi účinné na antikoncepčnú liečbu samcov cicavcov (s voliteľným podávaním testosterónu) a na liečbu steroidne závislých nádorov.

Počas posledných 10 až 12 rokov boli do hĺbky študované vlastnosti každého z 10 zvyškov v sekvencii GnRH z hľadiska vytvorenia účinného antagonistu. Výsledkom týchto štúdií bolo zistenie skutočnosti, že jestvujú rôzne zvyšky, ktoré sú vzájomne ekvivalentné a že substitúcie jedného z týchto ekvivalentov za iný významne neznižuje biologickú účinnosť dekapeptidových antagonistov GnRH. Túto ekvivalentnú substitúciu v antagonistoch GnRH možno vykonať podľa tohto vynálezu.

Všeobecne sa uznáva, že napríklad vloženie zvyšku para-substituovaného D-Phe alebo 2,4-dichlórsubstituovaného D-Phe alebo D-C“Me4ClPhe alebo D-penta-metyl(Me₅)Phe do polohy 2 významne prispieva k účinnosti GnRH antagonistu; špecifická identita kruhového substituenta bude ale iba málo dôležitá, ak sa substituent vyberie zo skupiny: chlór, fluór, bróm, nitro, metyl a alkoxy. Preto také zvyšky v polohe 2 sa považujú za ekvivalentné zvyšku D-4CIPhe, ktorý sa bežne používa. Phe⁷ sa považuje za ekvivalentný k Leu⁷. N-terminál je výhodne N-acylovaný, výhodne s acetylom (Ac), ale tiež inými acylovými skupinami, ktoré majú až do 7 uhlíkových atómov, ako je napríklad formyl (For), akrylyl (Acr), n-propionyl (Pn), butyryl (By), valeryl (VI), vinylacetyl (Vac) a benzoyl (Bz); voliteľne môže byť modifikovaný substituovaným alebo nesubstituovaným karbamoylom. Za ekvivalentné sa považujú aj ďalšie dlhšie acylové skupiny, ale sú menej výhodné. Uvedená a-amínová skupina v polohe 5 zvyšku môže byť voliteľne metylovaná na zvýšenie rozpustnosti vo vode, čo zverejňuje patent USA 5 110 904; uvedená modifikácia môže mať ale za následok skrátenie trvania supresie LH a väčší potenciál uvoľňovania histamínu. Výhodné C-zakončenie je D-Ala-NH₂, D-Ala-ol, alebo Ala-ol; miesto nich možno ale použiť zvyšky Gly-NH₂, NHCH₂CH₃, AzaGly-NH₂, Ala-NH₂, Agl-NH₂, D-Agl-NH₂, Agl(Me)-NH₂ a D-Agl(Me)-NH₂, pretože sú považované za známe ekvivalenty.

Ako už bolo uvedené, tento vynález zahŕňa skupinu GnRH antagonistov, charakterizovaných nasledujúcim vzorcom:

X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa⁵-Xaa⁶-Leu-Xaa⁸-Pro-Xaa¹⁰a ich farmaceutický prijateľné soli; v uvedenom vzorci: X znamená For, Ac, Acr, Pn, By, VI, Vac, Bz alebo Q, pričom Q je

O

II

- C -NHR a R znamená H alebo nižší alkyl;

A je 4C1,4F,Br, 4NO₂,4CH₃,4OCH₃, 3,4C1₂ lebo C“Me4Cl; Xaa⁵ je Aph(Q’) alebo Amf(Q’), pričom Q¹ je

O

alebo (D- alebo L-Hor)

(D- alebo L-Imz)

Xaa⁶ je D-Aph(Q²), D-Amf(Q²), D-Lys(Nic), D-Cit, D-Hci, alebo D-Pal, pričom Q² znamená For, Ac, 3-amino-1,2,4-triazol, Q alebo Q¹;

Xaa⁸ je Lys(ipr), Arg, Har, Arg(Et₂), alebo Har(Et₂); a

Xaa¹⁰ je D-Ala-NH₂, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH₂CH₃, Gly-NH₂, AzaGly-NH₂, Ala-NH₂, Agl-NH₂, D-Agl-NH₂, Agl(Me)-NH₂ alebo D-Alg(Me)-NH₂, ale za predpokladu, že α-amínová skupina Xaa⁵ môže byť voliteľne metylovaná.

Vo veľmi príbuznej skupine GnRH antagonistov môže Xaa⁵ mať ako Q¹ skupinu Ac, For, alebo 3-amino-1,2,4-triazol a v tom prípade Xaa⁶ zahŕňa Q² vo forme D- alebo L- Hor, alebo D- alebo L- Imz.

V inej veľmi príbuznej skupine GnRH antagonistov, v ktorej Xaa⁶ zahŕňa Q, Xaa⁵ tiež zahŕňa Q.

Výraz D-Nal znamená D-izomér alanínu, ktorý je substituovaný naftylovou skupinou na β-uhlíkovom atóme; tiež je označovaný ako β-D-Nal alebo 3-D-Nal. Výhodný D-2Nal je taký, v ktorom je pripojenie k naftalénu v polohe 2 na štruktúre kruhu; možno ale použiť aj D-lNal. D-Cpa znamená chlór-D-Phe, výhodný je D-4ClPhe tzn. D-4Cpa. D-Pal znamená D-izomér alanínu, ktorý bol substituovaný pyridylom na β-uhlíkovom atóme; výhodné je, ak spojenie nastalo k polohe 3 pyridínového kruhu, to znamená D-3Pal (β-3-pyridyl-D-Ala), hoci miesto neho by bolo možné použiť tiež D-2Pal (β-2-pyridyl-D-Ala).

Výrazom 4Aph sa rozumie 4NH₂Phc, v ktorom je aminový substituent na fenylovom kruhu v polohe 4; v týchto analógoch sa za jeho ekvivalent považuje 3NH₂Phr (3Aph). Navyše sa predpokladá, že z hľadiska biopotencie ekvivalentom je tiež 2NH₂Phe. Výrazom 4Amf sa rozumie 4NH₂CH₂Phe, v ktorom je metylénové spojenie medzi kruhom a aminoskupinou vo vedľajšom reťazci; za ekvivalent sa považuje 3NH₂CH₂Phe(3Amf). Výraz Hor alebo L-Hor znamená L-hydroorotyl a výraz Imz alebo L-Imz znamená L-2-imidazolidón-4-karbonyl-, ktorý sa môže použiť tiež ako D-izomér alebo zmes D/L izomérov. Výraz atz znamená 3-amino-l,2,4-triazol. Aph(atz) je známy tiež pod presnejším chemickým označením 4-(3'-amino-l//-ľ,2',4'-triazoyl-5'-yl)aminofenylalanín. Výraz Lys(Nic) znamená A-nikotinoyllyzín, t. j. ε-amínová skupina Lys je acylovanú s 3-karboxypyridínom. Výrazom D-Cit sa rozumie D-izomér citrulínu a výrazom D-Hci sa rozumie D-izomér homocitrulínu, čo je D-V-karbamoyllyzín. Výraz ILys alebo Lys(ipr) znamená M-izopropyllyzín, t. j. ε-amínová skupina Lys je alkylovaná. Výrazom Ala-ol sa rozumie alaninol, t. j. CH₃CH(NH₂)CH₂OH, a výrazom AzaGly-NH₂ sa rozumie a-aminoglycín. Výraz Cbm znamená karbamoyl, výraz MeCbm znamená metylkarbamoyl alebo -CONHCH₃. Výrazom nižší alkyl sa rozumie C] až C₅, výhodne C, až C₃, ešte výhodnejšie C, alebo C₂ alkylová skupina, t. j. metyl (Me) alebo etyl (Et).

Hoci sa tu výhodné D-izoméry na zabudovanie v polohe 6 týchto GnRH antagonistov uvádzajú špecificky, je zrejmé, že v dôsledku rozsiahleho výskumu v uvedenej oblasti v posledných dvoch desaťročiach je známych veľa ďalších ekvivalentných D-izomérov. Doterajšie D-izomérové substitúcie môžu byť kompatibilné a nemusia znižovať biopotenciu, vnášanú špecifickými substitúciami v polohe 5 podľa tohto vynálezu a môžu sa voliteľne využiť.

Výhodná podskupina GnRH antagonistov má vzorec:

X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa⁵-Xaa⁶-Leu-Lys(ipr)-Pro-Xaa'“ a ich farmaceutický prijateľné soli, v ktorom

X is For, Ac, Acr, Pn, By, VI, Vac, Bz, alebo Q, pričom Q je

O

II

- C -NHR a R je vodík alebo nižší alkyl,

A je 4C1 alebo 4F;

Xaa⁵ je Aph(Q’) alebo Amf(Q'), pričom Q¹ je

(D- alebo

L-Imz)

Xaa⁶ je D-Aph(Q²), D-Amf(Q²), D-cit, D-Lys(Nic), alebo D-Pal, pričom Q² znamená For, Ac, Q alebo Q¹; a

Xaa¹⁰ je D-Ala-NH₂, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH₂CH₃ alebo Gly-NH₂.

Ďalšia výhodná podskupina GnRH antagonistov má vzorec:

X-D-Nal-D-4Cpa-D-Pal-Ser-Xaa⁵-Xaa⁶-Leu-Lys(ipr)-Pro-Xaa¹⁰ a ich farmaceutický prijateľné soli, v ktorom

X je Ac, alebo Q, pričom Q je

O

II

- C -NHR a R je vodík alebo metyl;

Xaa⁵je Aph(Q’) alebo Amf(Q'), pričom Q¹ je

Υη alebo (D- X ⁰ (D-alebo

I I ° alebo L-Hor) \ Á L-Imz)

H O

Xaa⁶ je D-Aph(Q²), D-Amf(Q²), alebo D-Pal, pričom Q²znamená Ac, Q alebo Q¹; a

Xaa¹⁰ je D-Ala-NH₂, D-Ala-ol, alebo Ala-ol.

Ďalšia výhodná podskupina GnRH antagonistov má vzorec:

MeCbm-D-2Na!4MCpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-Xaa⁽’-Leu-ILys-PrO-Xaa¹¹¹ a ich farmaceutický prijateľné soli, v ktorom: D-Xaa⁶je D-4Amf(Q’), D-4Amf(Q²), alebo D-3Pal, pričom Q¹ je D-Hor alebo

O

II

- C -NHR pričom R je vodík alebo nižší alkyl, výhodne vodík alebo metyl;

Xaa¹⁰ je D-Ala-NH₂, D-Ala-ol, alebo Ala-ol.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu možno syntetizovať tradičnou roztokovou peptidovou syntézou; tento spôsob je výhodný na prípravu veľkých množstiev produktov. Na prípravu iba obmedzeného množstva, napríklad menej ako 1 kg produktu, môže byť výhodné syntetizovať uvedené zlúčeniny použitím spôsobu syntézy v tuhej fáze. Ochranné skupiny vedľajších reťazcov, ako je v odbore dobre známe, sú výhodne zahrnuté ako súčasť každej aminokyseliny, ktorá má pri reakcii na nosnej živici veľmi reaktívny alebo nestály vedľajší reťazec. Uvedený spôsob syntézy poskytuje plne chránenú medziproduktovú peptidoživicu, ako je X¹-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser(X²)-Xaa⁵-Xaa⁶-Leu-Lys(ipr)(X⁴)-Pro-X⁵.

Príklad chemického medziproduktu, ktorý by sa mohol použiť na syntézu GnRH antagonistu s vyžadovanými zvyškami v polohách 5- a 6-, obsahujúci hydroorotyl alebo podobnú skupinu je charakterizovaný vzorcom: X'-D-Nal-D-4Cpa-D-Pal-Ser(X²)-Aph(X³)-Leu-ILys(X⁴)-Pro-X⁵.

Pri syntetizovaní peptidových medziproduktov s uvedeným vzorcom a ďalších analógov, môžu sa využiť skupiny X¹ až X³, ako sa uvádza v ďalšom texte.

X¹ je ochranná skupina α-amínovej skupiny; ochranná skupina je takého typu, ktorý je v odbore známy ako použiteľný a užitočný v postupnej syntéze polypeptidov a keď X je vo vyžadovanom zložení peptidu najmä ako acylová skupina, môže sa táto skupina použiť ako ochranná skupina. X¹ zahŕňa skupinu α-amino ochranných skupín, v ktorej sú (1) ochranné skupiny typu acylu, ako je napríklad formyl (For), trifluóracetyl, ftaloyl, p-toluénsulfonyl (Tos), benzoyl (Bz), benzén-sulfonyl, ditiasukcinoyl (Dts), o-nitrofenylsulfenyl (Nps), tritylsulfenyl, o-nitrofcnoxyacetyl, akrylyl (Acr), chlóracetyl, acetyl (Ac) a γ-chlórbutyryl; (2) aromatické ochranné skupiny uretánového typu, ako je napríklad benzyloxykarbonyl (Z), fluorenylmetyloxykarbonyl (Fmoc) a substituovaný benzyloxykarbonyl, ako je p-chlórbenzyloxykarbonyl (C1Z), p-nitrobenzyloxykarbonyl, p-brómbenzyloxykarbonyl a p-metoxybenzyloxykarbonyl; (3) alifatické uretánové ochranné skupiny, ako je napríklad terc-butyloxykarbonyl (Boe), diizopropylmetoxykarbonyl, izopropyloxykarbonyl, etoxykarbonyl a alyloxykarbonyl; (4) cykloalkylové ochranné skupiny uretánového typu, ako je napríklad cyklopentyloxykarbonyl, adamantyloxykarbonyl a cyklohexyloxykarbonyl; (5) tiouretánový typ ochranných skupín, ako je napríklad fenyltiokarbonyl; (6) ochranné skupiny alkylového typu, ako je napríklad alyl (Aly), trifenylmetyl (trityl) a benzyl (Bzl); (7) trialkylsilánové skupiny, ako je trimetylsilán. Výhodná α-amínová ochranná skupina je Boe.

X² je ochranná skupina pre hydroxyl vedľajšieho reťazca Ser, napríklad skupiny Ac, Bz, trityl, 2,6-dichlórbenzyl (DCB) alebo benzyléter (Bzl); výhodná ochranná skupina pre hydroxylovú skupinu je Bzl.

X³ je ochranná skupina pre aminoskupinu vedľajšieho reťazca, ktorá sa neodstráni, keď sa odstránia ochranné skupiny α-amínovej skupiny alebo inej aminoskupiny. Príklady na ozrejmenie zahŕňajú (1) skupiny nestále v zásaditom prostredí, ako je napríklad Fmoc, alebo niektoré ďalšie skupiny stále v slabých kyselinách aromatického uretánového typu; (2) skupiny nestále v tióle, ako je ditiasukcinoyl (Dts), ktorý možno odstrániť alebo štiepiť tiolýzou; (4) nukleofllne nestále skupiny, ako je o-nitrofenylsulfenylová skupina (Nps) a podobné, ktoré sa štiepia tioacetamidom alebo slabými kyselinami alebo ich soľami; (5) fotonestále skupiny, ktoré sa štiepia fotolýzou; a (6) skupiny, ktoré sú selektívne odstrániteľné redukciou, ako je Dts. Na syntézu podľa Boe SPPS stratégiou je výhodné, ak skupina X³ je skupina Fmoc.

X⁴ je ochranná skupina, nestála v kyseline, na ochranu primárnej alebo sekundárnej amínovej skupiny vedľajšieho reťazca, ako je napríklad Z alebo 2C1Z.

X³ môžu byť skupiny D-Ala-, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl-, Agl(Me)- alebo D-Agl(Me)-NH-[živičný základ], alebo N(Et)-[živičný základ]; X³ môže tiež byť amid alebo Gly alebo Ala alebo D-Ala, nižším alkylom substituovaný amid, priamo viazaný na Pro, AzaGly-NľD, alebo -OH (voľná kyselina). Ak X⁵ je voľná kyselina, medziproduktom potom je nonapeptidový fragment, ktorý je určený na viazanie k D alebo L-alaninolu za vzniku dekapeptidu, ktorý má na C-zakončení alkoholovú skupinu.

Kritériom pri výbere ochranných skupín X² až X⁴ vo vedľajších reťazcoch je požiadavka, aby ochranná skupina bola vo všeobecnosti stála k reaktantu v reakčných podmienkach, zvolených na odstránenie ochrannej skupiny a

-amínovej skupiny (výhodne Boe) v každom kroku syntézy. Tieto ochranné skupiny sa vo všeobecnosti nemôžu odštiepiť v reakčných podmienkach syntézy, ale musia byť odstrániteľné po ukončení syntézy vyžadovanej aminokysclinovej sekvencie v reakčných podmienkach, ktoré nemenia peptidový reťazec. Ochranné skupiny, spočiatku používané na zvyšky v polohách 5- a 6-, sa po reakcii výhodne odstránia a vykoná sa selektívna reakcia pred odštiepením konečného peptidu od živice, ako sa uvádza v ďalšom texte. Ak sa dekapeptidový medziprodukt syntetizuje uvedeným spôsobom, môže sa vyžadovať, aby sa ochranná skupina X³dala jednotlivo odstrániť.

Ak je skupinou X⁵ zoskupenie D-Ala-NH-[živicový základ], amidová väzba spája D-Ala k BHA živici, alebo k MBH živici; toto je podobný prípad, ako keď sa na C-zakončení použije Agl alebo D-Agl. Ak je skupinou X⁵ zoskupenie N(Et)-[živicový základ], etylamidová väzba spája Pro s N-alkylaminometylovou živicou (NAAM).

Keď sa má napríklad N-zakončenie acetylovať, možno použiť acetyl ako ochrannú skupinu X¹ α-aminovej skupiny β-D-Nal v polohe 1 jeho pridaním k aminokyseline pred jej väzbou k peptidovému reťazcu; reakcia sa ale výhodne vykoná s peptidovým medziproduktom na živici. Po odstránení ochrany na α-amínovej skupine, ak sa súčasne vyžaduje, aby skupiny na vedľajšom reťazci zostali chránené, acylácia sa výhodne vykoná reakciou s acetanhydridom; táto reakcia sa môže voliteľne vykonať s použitím kyseliny octovej za prítomnosti diizopropyl- alebo dicyklohexylkarbimidu (D1C alebo DCC), alebo sa acylácia uskutoční niektorou inou vhodnou acylačnou reakciou, známou v odbore. Obdobný postup sa vykoná, ak sa vyžaduje, aby na N-zakončení bola viazaná karbamoylová alebo substituovaná karbamoylová skupina. Keď aminokyseliny vedľajšieho reťazca, zbavené ochranných skupín, sú modifikované, pričom aminokyselinový zvyšok je časťou peptidového reťazca, reakcia sa môže uskutočniť použitím príslušného izokyanátu v prítomnosti príslušnej zásady, napríklad N,N-diizopropyletylamínu (D1EA); použitie takej zásady je iba voliteľné. Ak sa vyžaduje, aby v konečnom produkte bola nesubstituovanú karbamoylová skupina, nechránený amínový vedľajší reťazec môže reagovať s benzylizokyanátom, p-tosylizokyanátom, trimetylsilylizokyanátom alebo terc-butylizokyanátom; výhodné je použitie naposledy uvedenej látky. Využitím uvedenej stratégie sa ŕerc-butylové štruktúrne zoskupenie odstráni od živice odštiepením za vzniku karbamoylovej skupiny.

Vynález tiež zahŕňa spôsob prípravy takých GnRH antagonistov, ktoré majú napríklad vzorec: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-ProD-Ala-NH₂, pričom uvedený spôsob zahŕňa:

a) vytvorenie peptidového medziproduktu, ktorý má vzorec: Boc-D-Aph(X³)-Leu-ILys(X⁴)-Pro-X⁵, v ktorom skupina X³ je proti zásadám a proti hydrazínu nestála, alebo iná vhodne nestála ochranná skupina aminoskupiny; X⁴ je proti kyseline nestála ochranná skupina aminoskupiny vedľajšieho reťazca; X⁵ je D-Ala-NH-[živicový základ];

b) odstránenie X³ z D-4Aph s cieľom zbaviť primárnu aminoskupinu uvedeného aminokyselinového zvyšku vedľajšieho reťazca peptidového medziproduktu ochrannej skupiny;

c) reakcie nechránenej primárnej amínovej skupiny vedľajšieho reťazca s anhydridom kyseliny octovej;

d) ukončenie elongácie reťazca za vzniku medziproduktu X‘-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(X²)-4Aph(X³)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys(X⁴)-Pro-X⁵, v ktorom X¹ je vodík a5 lebo ochranná skupina α-aminokyseliny a X* je vodík alebo ochranná skupina hydroxylovej skupiny zoskupenia Ser;

e) odblokovanie cc-amínovej skupiny na N-zakončení a acetylácia;

f) odstránenie X³ z 4Aph a reakcia nechránenej primárnej amínovej skupiny s kyselinou hydroorotovou; a

g) odštiepenie všetkých ostávajúcich ochranných skupín a/alebo odštiepenie od živicového základu vrátane X⁵.

Záverečné čistenie peptidu sa uskutoční chromatograficky, výhodne použitím RP-HPLC spôsobmi, ktoré sú v odbore známe; pozri J. Riviér, et al., J. Chromatography 288, 303 až 328 (1984) a C. Miller a J. Riviér, Biopolymers (Peptide Science) 40,265 až 317 (1996)).

Za účinnú hladinu antagonistov GnRH podľa tohto vynálezu sa považuje hladina nižšia ako 100 mikrogramov na kilogram telesnej hmotnosti potkana pri subkutánnom podávaní približne na poludnie v deň pred ovuláciou na zabránenie ovulácie samičky. Na predĺženú supresiu ovulácie môže byť nevyhnutné používať hladiny dávkovania v rozmedzí od približne 0,1 do približne 2,5 miligramov na kilogram telesnej hmotnosti. Uvedené antagonisty sú pri pravidelnom podávaní samcom cicavcov účinné na zastavenie spermatogenézy; môžu sa tak používať ako antikoncepčné látky. Pretože uvedené zlúčeniny znižujú hladiny testosterónu a tým libido (neželané dôsledky u normálneho, sexuálne aktívneho samca) môže sa vyžadovať, aby sa spolu s GnRH antagonistmi podávali aj náhradné dávky testosterónu na dosiahnutie azoospermie pri udržaní libida. Tieto antagonisty možno použiť tiež na reguláciu produkcie gonadotropínov a pohlavných steroidov a na iné dlhodobé a krátkodobé indikácie, ako bolo uvedené vpredu; môžu byť použité na veterinárne účely ako antikoncepcia pre domáce zvieratá.

Peptidy podľa tohto vynálezu sú dobre rozpustné vo vodnom prostredí v rozsahu fyziologických pH prostredia a môžu sa na podávanie pripraviť vo forme pomerne koncentrovaných roztokov, najmä na subkutánne injekcie. Uvedené peptidy sú v tele dobre znášané a pri subkutánnom podávaní pri účinných koncentráciách nemajú sklon na gélovatenie. Všeobecne, farmaceutické kompozície zahŕňajúce uvedené peptidy a vhodné, farmaceutický prijateľné ďalšie zložky sa môžu podávať iv, ip, subkutánne alebo podobne na hladinách medzi približne 0,001 mg do približne 2,5 mg na kilogram telesnej hmotnosti na deň, pričom 0,5 mg.kg'deiT¹ býva zvyčajne postačujúca úroveň.

Príslušne chránené aminokyseliny, obsahujúce D- alebo L-hydroorotyl-, karbamoyl- a/alebo D- alebo L-imidazolidónkarbonyl- sa môžu najprv syntetizovať a potom použiť pri syntéze peptidu predlžovaním (elongáciou) peptidového reťazca. Rovnako opodstatnená je ale aj syntéza s počiatočným zabudovaním vhodne chránených Aph, D-Aph, Amf, alebo D-Amf zvyškov do vyžadovanej polohy peptidového medziproduktu; naposledy uvedený spôsob syntézy môže byť vhodný najmä ako laboratórny spôsob, ak sa najprv vyžaduje príprava iba malých množstiev medziproduktu. Táto stratégia sa uskutoční s nasledujúcim odstránením ochranných skupín (naraz alebo postupne v priebehu syntézy) a potom reakciou nechránených aminoskupín s vyžadovaným reaktantom.

V ďalšom texte sa vynález opisuje príkladmi.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Je známe, že peptid, ktorý má vzorec: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-Lys(Nic)-D-Lys(Nic)-Leu-lLys-Pro-D-Ala-NHj (Antid) má veľmi dobré biologické vlastnosti ako GnRH antagonista také, aké má peptid v súčasnosti ozna čovaný ako Acylín a ktorý sa odlišuje od Antidu iba v polohách 5- a 6-. V súčasnosti sa zistilo, že použitie týchto molekúl ako východiskových látok a vykonaním ďalších substitúcií v polohách 5- a 6-Antidu, alebo v polohe 5-dekapeptidu Acylínu, sa čas biologickej účinnosti in vivo predĺži. Čo sa týka polôh 1 až 4 a 7 až 10 treba poznamenať, že Antid, Acylín a Azalín sú presne rovnaké.

V ďalšom texte uvedený dekapeptid [4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(Cbm)⁶]-Antid, alebo [Ac-D-2NaP, D-4Cpa², D-3Pal³, 4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(Cbm)⁶, ILys⁸, D-Ala¹⁰]-GnRH sa syntetizoval syntézou s tuhou fázou. Tento peptid má vzorec: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Aph(karbamoyl)-Leu-Lys(izopropyl-Pro-D-Ala-NH₂.

Najprv sa použilo približne 0,5 g (0,54 milimolov na gram) živice MBHA (Bachem). Počas asi 2 hodín v prostredí dimetylformamidu (DMF)/CH₂C1₂ sa D-Ala chránený s Boe viazal na živicu, pričom sa použilo 0,65 milimolov derivátu Boe, diizopropylkarbodiimid (DIC) a bezvodý 1-hydroxybenztriazol (HOBt) ako aktivátor a reaktant. Zvyšok D-Ala sa viazal na MBHA amidovou väzbou. Po pripojení každého z aminokyselinových zvyškov sa vykonalo premývanie, deblokácia (odstránenie ochrannej skupiny) a potom zasa väzba zvyšku ďalšej aminokyseliny podľa nasledujúceho návodu na postup syntézy z 0,5 až 1 gramu východiskovej živice:

Reakčný krok	Reaktanty a operácie	Čas miešania v minútach
1	Metanolové (MeOH) premývanie 15 ml, 2x	1
2	CH₂C1₂ (DCM) - premývanie, 25 ml, 2x	1
3	50 %-ný TFA + 1 %-ný m-krezol v DCM, 25 ml, 2x	5,20
4	Izopropanol, premývanie, 20 ml, 2 x	1
5	Trietylamín 10 %-ný v DCM, 20 ml, 2 x	2
6	MeOH, premývanie, 15 ml, 2 x	1
7	DCM, premývanie, 20 ml, 3 x	1
8	Boc-aminokyselina (0,5 až 1,0 mmol) a HOBt (0,5 až 1,0 mmolu) v 10 až 20 ml dimetylformamidu (DMF): DCM alebo N-metylpyrolidónu (NMP) : : DCM, v závislosti od rozpustnosti jednotlivej chránenej aminokyseliny, plus DIC alebo DCC (0,5 až 1,0 mmol) v DCM	1-17 hodín
9	MeOH, premývanie, 15 ml, 2x	1
10	DCM, premývanie, 20 ml, 3x	1

Uvedená schéma postupu sa použila na viazanie každej aminokyseliny peptidu podľa tohto vynálezu po tom, čo bola naviazaná prvá aminokyselina. Na každej aminokyseline, pripájanej počas syntézy sa použila N“Boc ochrana. N’Boc-p-D-2Nal sa pripravila spôsobom v odbore známym, napríklad spôsobom opisovaným v patente USA 4 234 571; táto látka je dostupná aj komerčne od firmy SyntheTech, Oregon, USA. Primáme aminoskupiny vedľajšieho reťazca 4Aph v polohe 5- a D-4Aph v polohe 6- sú chránené použitím Fmoc. Na ochranu hydroxylovej skupiny vedľajšieho reťazca Ser sa výhodne sa použil benzyléter (Bzl); Ser možno ale viazať aj bez ochrany vedľajšieho reťazca. Na 8-polohový zvyšok sa použil N“Boc-Lys(ipr,Z).

Po pridaní D-4Aph vo forme N“Boc-D-4Aph(Fmoc) na 6-polohový zvyšok je prítomný medziprodukt: Boc-D-4Aph(Fmoc)-Leu-Lys(ipr,Z)-Pro-D-Ala-NH-[MBHA živicový základ], Aminoskupina vo vedľajšom reťazci na 6-polohovom zvyšku sa potom modifikuje najprv odstránením ochrany vedľajšieho reťazca. Ochranná skupina Fmoc sa odstráni postupným spracovaním vždy s 25 %-ným piperidínom v DMF (10 ml) počas asi 15 minút. Po premytí peptidoživice s DMF sa novouvoľnená aminoskupina nechá reagovať s 20-násobným nadbytkom /erc-butylizokyanátu v DMF pri teplote miestnosti 12 hodín, alebo až do ukončenia reakcie, kontrolovanej ninhydrínovou skúšky. Peptidoživica sa potom bežným spôsobom premyje, odstráni sa Boe a môže sa pripojiť ďalší zvyšok.

5-polohový zvyšok sa potom pripojí ako N“Boc-4Aph(Fmoc). Jeho vedľajší reťazec sa potom zbaví ochrany, ako je uvedené, a uskutoční sa reakcia s 0,10 g (0,66 mmolu) L-hydroorotovej kyseliny, 90 mg (0,66 mmolu) HOBt a 0,66 mmolu DIC v DMF pri teplote miestnosti počas približne 8 hodín, alebo až do ukončenia reakcie, kontrolovanej bežnou ninhydrínovou skúškou. Po premytí a odstránení N“Boc sa syntéza dekapeptidu postupne dokončí reakciami s N“Boc-Ser(Bzl), N^aBoc-D-3Pal, N“Boc-4Cpa a N“Boc-d-2Nal.

Po uvoľnení od ochranných skupín pomocou trifluóroctovej kyseliny (TFA) sa α-aminoskupina na N-zakončeni acetyluje 30 minút použitím veľkého nadbytku anhydridu kyseliny octovej v dichlórmetáne (DCM). Ochranná skupina Fmoc na 4Aph sa voliteľne odstráni až po acetylácii N-zakončenia a potom sa uskutoční reakcia s kyselinou L-hydroorotovou.

Peptidoživica sa suší, nasleduje pridanie anizolu (0,5 ml) ako radikálového akceptora, odštiepenie peptidu od živice; odstránenie ochranných skupín vedľajších reťazcov Ser a Lys sa vykoná pri 0 °C s 15 ml HF, 1,5 hodiny a súčasne sa odstránia všetky ostávajúce ŕerc-butylové štruktúrne zoskupenia. Po odstránení HF vo vákuu sa živica dva razy premyje s 100 ml etyléteru. Odštiepený peptid sa extrahuje 0,2 %-ným CH₃CN v H₂O, postup sa zopakuje vždy so 100 ml roztoku. Extrakty sa spoja a lyofílizujú, čím sa získa približne 600 mg surového peptidového prášku.

Čistenie peptidu sa potom vykoná preparatívnou vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou s reverznou fázou (RP-HPCL) tak, ako je bežne známe v danom odbore a ako je uvedené v J. Riviér, et al., J. Chromatography 288. 303 až 328 (1984). Pri prvej preparatívnej separácii RPHPLC sa použije TEAP (trietylamóniumfosfátový) tlmivý systém, a posledná separácia sa vykoná s použitím gradientu 0,1 %-nej TFA (trifluóroctová kyselina); tento postup sa podrobne opisuje v už uvedenom článku v J. Chromatography.

Peptid (približne 30 mg) (v ďalšom texte označovaný ako Peptid č.l) bol podľa kapilárnej zonálnej elektroforézy (CZE) hodnotený ako v podstate homogénny a čistota sa stanovila na úrovni 98 %. Aminokyselinová analýza čisteného peptidu súhlasí so vzorcom pripravovanej štruktúry. Molekulová hmotnosť tohto peptidu sa stanovovala kvapalinovou sekundárnou hmotnostnou spektrometriou (LSIMS) s výsledkom 1 631,9 Da, čo je v súlade s predpokladanou hmotnosťou 1 631,8 Da.

Hydrofilnosť sa skúšala meraním retenčného času na RP-HPLC s gradientom od 40 % tlmivého roztoku B až po 70 % tlmivého roztoku B v počas 30 minút s tlmivým roztokom A, ktorý je TEAP s pH 7,0 a tlmivý roztok B je 70 % CH₃CN a 30 % tlmivého roztoku A. Peptid č.l je viac hydrofilný ako Acylín, eluuje sa skôr ako Acylín. Pri porovnávaní s inými zlúčeninami s obdobným biologickým účin kom, rozpustnosť peptidu č. 1 vo vodných tlmivých roztokoch pri pH od približne 5 do 7 a jeho odolnosť proti gélovaniu in vivo spolu s dlhodobou biopotenciou potláčať LH hladinu, ako už bolo uvedené, zaraďuje tento peptid medzi výhodné látky na podávanie subkutánnou injekciou.

Peptid č.l sa posudzoval in vivo stanovením jeho účinnosti na potláčanie sekrécie LH u potkanov. Vykonávali sa merania hladiny cirkulujúceho LH kastrovaných samčekov potkana Sprague-Dawley, po subkutánnom podaní uvedeného peptidu; práca je zverejnená v C. Riviér et al., Biol. Reproduc. 29, 374 až 378 (1983). Peptidy sa najprv rozpustili na koncentrácie 1,0 alebo 10 mg.mľ¹ v baktériostatickej vode a potom sa ďalej riedili s 0,04 molovým fosforečnanovým tlmivým roztokom, obsahujúcim 0,1 % BSA. Postupné riedenia sa tiež vykonávali uvedeným tlmivým roztokom. Roztoky peptidu sa injektovali sc do 5 potkanov; vzorky krvi (300 μΐ) sa odoberali pod znecitlivením metotánom. V sérach (50 pl) sa dvojmo stanovovala hladina LH s použitím činidiel, dodaných z národného programu National Pituitary and Hormone Distribution Program od NIDDK. Výsledky skúšok ukázali, že po 96 hodinách od injekcie dávky 50 pg peptidu na potkana, nastalo potlačenie LH sekrécie na úroveň, ktorá je oveľa nižšia ako 50 % kontrolných hladín. V porovnaní s podobnými meraniami s Acylínom boli hladiny LH merané po 96 hodinách po injekcii peptidu iba 30 % z úrovne zaznamenanej u potkanov, ktoré dostali dávku 50 pg Acylínu na potkana. Peptid č.l sa považuje za prípravok s dlhotrvajúcim účinkom. Skúšky s potkanmi ukázali, že uvedený peptid je organizmom tolerovaný, a pri injekcii sa nezistilo nijaké významné gélovanie.

Skúsenosti získané zo skúšok veľkého počtu GnRH antagonistov ukazujú, že peptid vykazujúci dlhodobú supresiu LH by pri skúške in vivo u dospelých samčekov potkanov Sprague-Dawley celkom blokoval ovuláciu pri dávke 2,5 pg.

Príklad 1A

Opakuje sa syntéza ako v príklade 1 ale N“Boc-D-4Aph(Fmoc) sa nahradí s N“Boc-D-4Amf(Fmoc). Po odstránení ochranných skupín vedľajšieho reťazca D-4Amf sa rovnakým spôsobom ako v príklade 1 vykoná reakcia s ŕerc-butylizokyanátom. Odštiepenie od živice a odstránenie ochranných skupín, nasledované čistením sa opäť vykoná ako v príklade 1. Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-d-4Amí(karbamoyl)-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH₂; produkt bol v podstate homogénny, stanovená čistota bola vyššia ako 99 %. MS analýzou sa zistila molekulová hmotnosť 1 645,9 Da, ktorá veľmi dobre súhlasí s predpokladanou hmotnosťou 1 645,8 Da. Z výsledkov HPLC možno usudzovať, že tento peptid je viac hydrofilný ako Acylín.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo sa zistilo, že v potláčaní hladiny LH bol peptid pri dávke 50 mikrogramov účinný ako Acylín v deň 1, 2 a 3. Po 96 hodinách bola hladina LH pri použití pripraveného peptidu 1A iba približne 25 % z hladiny LH potkana, ktorému bol injektovaný Acylín. Peptid 1A sa považuje za peptid s veľmi dlhodobým účinkom.

Príklad 1B

Na vytvorenie analógu [4Aph(Hor)⁵]-Acylínu sa opakovala syntéza tak, ako sa uvádza v príklade 1, ale na reakciu v polohe 6-nechráneného vedľajšieho reťazca sa terc-butylizokyanát nahradil anhydridom kyseliny octovej. Odštiepenie dekapeptidu od živice a odstránenie ochranných skupín, nasledované čistením sa vykonalo obdobne ako v príklade 1. Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Aph(acetyl)-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH₂. Produkt sa posúdil ako v podstate homogénny a stanovila sa jeho čistota na úrovni lepšej ako 99 %. MS analýzou sa stanovila molekulová hmotnosť 1 630,6 Da, ktorá súhlasí s vypočítanou hmotnosťou 1 630,8 Da.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo sa postupom ako v príklade 1 zistilo, že v potláčaní hladiny LH bol peptid pri dávke 50 mikrogramov bioaktívny a približne rovnako účinný ako Acylín v deň 1 až 4. Tento peptid sa považuje za peptid s veľmi dlhodobým potláčaním LH.

Príklad 1C

Opakovala sa syntéza tak, ako v príklade IB ale L-hydroorotová kyselina sa nahradila D/L hydroorotovou kyselinou, aby sa získali izoméme dekapeptidy.

Odštiepenie dekapeptidu od živice a odstránenie ochranných skupín, nasledované čistením sa vykonalo obdobne ako v príklade L Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D/L-hydroorotyl)-D-4Aph(acetyl)-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH₂.

Produkt sa posúdil ako v podstate homogénny a bez iných nečistôt. MS analýzou sa stanovila molekulová hmotnosť 1 630,6 Da, ktorá súhlasí s vypočítanou hmotnosťou 1 630,8 Da.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo sa postupom ako v príklade 1 zistilo, že v potláčaní hladiny LH bol peptid pri dávke 50 mikrogramov bioaktívny a približne rovnako účinný ako Acylín v deň 1 až 4. Tento peptid sa považuje za peptid s dlhodobým potláčaním LH.

Príklad ID

Opakovala sa syntéza ako v príklade IB ale L-hydroorotová kyselina sa nahradila D-hydroorotovou kyselinou, aby sa získal izomémy dekapeptid.

Odštiepenie dekapeptidu od živice a odstránenie ochranných skupín, nasledované čistením, sa vykonalo obdobne ako v príklade 1. Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-hydroorotyl)-D-4Aph(acetyl)-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH₂. Produkt sa posúdil ako v podstate homogénny a čistota sa stanovila na úrovni viac ako 98 %. MS analýzou sa stanovila molekulová hmotnosť 1 630,8 Da, ktorá súhlasí s vypočítanou hmotnosťou 1 630,8 Da.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo sa postupom ako v príklade 1 zistilo, že v potláčaní hladiny LH bol peptid pri dávke 50 mikrogramov dlhodobo bioaktívny a približne rovnako účinný ako Acylín v deň 1 až 4.

Príklad 1E

Opakovala sa syntéza tak, ako v príklade IB ale N^aBoc-D-4ClPhe sa nahradil s N“Boc-D-4FPhe, aby sa získal dekapeptid [D-4FPhe², 4Aph(Hor)⁵]-Acylín. Odštiepenie dekapeptidu od živice a odstránenie ochranných skupín, nasledované čistením sa vykonalo obdobne ako v príklade 1. Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Fpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-hydroorotyl)-D-4Aph(acetyl)-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH₂. Produkt sa posúdil ako v podstate homogénny a čistota sa stanovila na úrovni viac ako 99 %. MS analýzou sa stanovila molekulová hmotnosť 1 615,1 Da, ktorá súhlasí s vypočítanou hmotnosťou 1 614,8 Da.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo sa postupom ako v príklade 1 zistilo, že v potláčaní hladiny LH bol peptid pri dávke 50 mikrogramov bioaktívny a približne rovnako účinný ako Acylín v deň 1 až 4. Tento peptid sa považuje za peptid s dlhodobým účinkom potláčania LH.

Príklad 1F

Opakovala sa syntéza ako v príklade 1B ale N“Boc-D-4Aph(Fmoc) sa nahradil s NBoc-D-4Amf(Fmoc), aby sa vytvoril dekapeptid [4Amf(Hor)⁵]-Acylín. Odštiepenie od živice a odstránenie ochranných skupín, nasledované čistením, sa opäť vykoná ako v príklade L Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-hydroorotyl)-D-4Aph(acetyl)-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH₂; produkt bol v podstate homogénny, stanovená čistota bola vyššia ako 98 %. MS analýzou sa zistila molekulová hmotnosť 1 644,7 Da, ktorá dobre súhlasí s predpokladanou hmotnosťou 1 644,8 Da. Z výsledkov HPLC možno usudzovať, že pripravený peptid je viac hydrofílný ako Acylín.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo sa zistilo, že v potláčaní hladiny LH bol peptid pri dávke 50 mikrogramov bioaktívny a približne taký účinný ako Acylín v deň 1 až 4. Pripravený peptid sa považuje za peptid s dlhodobým účinkom potláčania LH.

Príklad 1G

Opakuje sa syntéza ako v príklade 1, ale miesto reakcie aminoskupiny D-4Aph vedľajšieho reťazca s terc-butylizokyanátom sa vykoná simultánne reakcia D-4Aph a 4Aph s kyselinou hydroorotovou za vzniku dekapeptidu [4Aph(Hor]⁵, D-4Aph(Hor)⁶]-Antidu. Odštiepenie od živice a odstránenie ochranných skupín, nasledované čistením, sa vykoná opäť ako v príklade 1. Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Aph(L-hydroorotyl)-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH₂; produkt bol v podstate homogénny, stanovená čistota bola vyššia ako 99 %. MS analýzou sa zistila molekulová hmotnosť 1 728,4 Da, ktorá veľmi dobre súhlasí s predpokladanou hmotnosťou 1 728,8 Da. Z výsledkov HPLC možno usudzovať, že tento peptid je viac hydrofílný ako Azalin B, ktorý je zasa viac hydrofílný ako Acylín.

Táto syntéza sa opakovala ale N“Boc-D-4Aph(Fmoc) sa nahradil s N“Boc-D-4Amf(Fmoc), aby sa vytvoril dekapeptid [4Aph(Hor)⁵, D-4Amf(Hor)⁶ ]-Antid, ktorý je všeobecne biopotentný pri potláčaní sekrécie LH.

Príklad 1H

Opakuje sa syntéza ako v príklade 1, ale miesto reakcie amino skupiny D-4Aph vedľajšieho reťazca s terc-butylizokyanátom sa vykoná reakcia s kyselinou D-hydroorotovou za vzniku dekapeptidu [4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(Hor)⁶]-Antidu. Odštiepenie od živice a odstránenie ochranných skupín, nasledované čistením sa opäť vykoná ako v príklade 1. Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Aph(D-hydroorotyl)-Leu-Lys(izo-propyl)-Pro-D-Ala-NH₂; produkt bol v podstate homogénny, stanovená čistota bola vyššia ako 98 %. MS analýzou sa zistila molekulová hmotnosť 1 728,7 Da, ktorá veľmi dobre súhlasí s predpokladanou hmotnosťou 1 728,8 Da. Z výsledkov HPLC možno usudzovať, že tento peptid je viac hydrofílný ako Azalín B, ktorý je zasa viac hydrofilný ako Acylín.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo sa zistilo, že v potláčaní hladiny LH bol peptid pri dávke 50 mikrogramov účinný ako Acylín v deň 1 až 3. Pripravený peptid je podstatne účinnejší v 4. deň ako Acylín a považuje za peptid s veľmi dlhodobým účinkom na potláčanie LH.

Príklad 1J

Vykonala sa syntéza dekapeptidu [MeCbm-D-2Nal', 4Aph(Hor)⁵]-Acylínu obdobne, ako sa uvádza v príklade 1B, ale miesto okamžitého odstránenia Fmoc- ochrannej skupiny po pridaní N“Boc-4Aph(Fmoc) sa reakcia najprv dokončila na živici. Potom, po odblokovaní N-terminálu, sa miesto reakcie s anhydridom kyseliny octovej vykonala reakcia N-terminálu s metylizokyanátom za vzniku metylkarbamoylu. Potom sa odstránila ochranná skupina Fmoc a aminoskupina vedľajšieho reťazca sa nechala reagovať s L-hydroorotovou kyselinou obdobne, ako sa uvádza v príklade 1B. Odštiepenie od živice, odstránenie ochranných skupín a nasledujúce čistenie sa vykoná rovnako ako v príklade L Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid metylakarbamoyl-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Aph(acetyl)-Leu-Lys(izopropyl)-pro-D-Ala-NH₂; produkt bol v podstate homogénny, stanovená čistota bola vyššia ako 99 %. MS analýzou sa zistila molekulová hmotnosť 1 645,7 Da, ktorá veľmi dobre súhlasí s predpokladanou hmotnosťou 1 645,8 Da. Z výsledkov HPLC možno usudzovať, že pripravený peptid je viac hydrofílný ako Azalín B, ktorý je zasa viac hydrofílný ako Acylín.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo ako v príklade 1 sa zistilo, že pri dávke 50 mikrogramov bol peptid v potláčaní hladiny LH bioaktívny a účinný ako Acylín v deň 1 až 3. Pripravený peptid je približne o 50 % účinnejší v 4. deň ako Acylín a považuje za peptid s veľmi dlhodobým účinkom na potláčanie LH.

Príklad 1K

Opakovala sa syntéza ako v príklade 1B, ale N“Boc-D-4Aph(Fmoc) sa nahradil s N“Boc-D-3Pal a vynechala sa následná reakcia s t-BuNCO, čím sa vytvoril dekapeptid [4Aph(Hor)⁵, D-3Pal⁶]-Antid. Odštiepenie od živice a odstránenie ochranných skupín, nasledované čistením sa vykoná opäť ako v príklade 1. Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid acetyl-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-3Pal-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH₂; produkt bol v podstate homogénny, stanovená čistota bola vyššia ako 99 %. MS analýzou sa zistila molekulová hmotnosť 1 574,7 Da, ktorá dobre súhlasí s predpokladanou hmotnosťou 1 574,7 Da. Z výsledkov HPLC možno usudzovať, že tento peptid je viac hydrofílný ako Acylín.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo ako v príklade 1 sa zistilo, že v potláčaní hladiny LH bol peptid pri dávke 50 mikrogramov bioaktívny a približne taký účinný ako Acylín v deň 1 až 3. Po 96 hodinách vykazoval ale potláčanie hladiny LH na úroveň približne 35 % hladiny pri použití Acylínu. Tento peptid sa považuje za peptid s veľmi dlhodobým účinkom potláčania LH.

Príklad 1L

Syntéza sa vykoná rovnako ako v príklade 1G s náhradou Zerc-butylizo-kyanátu hydroorotovou kyselinou a vzniká peptid [4Aph(Cbm)⁵, D-4Aph(Cbm)⁶]-Antid. Odštiepenie od živice a odstránenie ochranných skupín, nasledované čistením sa vykoná opäť ako v príklade 1. Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(karbamoyl)-D-4Aph(karbamoyl)-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH₂; produkt bol v podstate homogénny, stanovená čistota bola vyššia ako 99 %. MS analýzou sa zistila molekulová hmotnosť 1 534,9 Da, ktorá dobre súhlasí s predpokladanou hmotnosťou 1 534,7 Da. Z výsledkov HPLC možno usudzovať, že tento peptid je viac hydrofílný ako Acylín.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo ako v príklade 1 sa zistilo, že v potláčaní hladiny LH bol peptid pri dávke 50 mikrogramov bioaktívny a približne taký účinný ako Acylín v deň 1 až 4.Tento peptid sa považuje za peptid s dlhodobým účinkom potláčania LH.

Príklad IM

Syntéza sa vykoná rovnako ako v príklade 1G s náhradou metylizokyanátu hydroorotovou kyselinou a vzniká dekapeptid (4Aph(MeCbm)⁵, D-4Aph(MeCbm)⁶]-Antid. Odštiepenie od živice a odstránenie ochranných skupín, nasledované čistením sa opäť vykoná ako v príklade 1. Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2NaI-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(metylkarbamoyl)-D-4Aph(metylkarbamoyl)-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH₂; produkt bol v podstate homogénny, stanovená čistota bola vyššia ako 99 %. MS analýzou sa zistila molekulová hmotnosť 1 562,8 Da, ktorá dobre súhlasí s predpokladanou vypočítanou hmotnosťou 1 562,8 Da.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo ako v príklade 1 sa zistilo, že v potláčaní hladiny LH bol peptid pri dávke 50 mikrogramov bioaktívny a približne taký účinný ako Acylín v deň 1 a 2 a potom jeho účinnosť začala trocha klesať.

Príklad 2

Syntetizoval sa peptid [4Aph(Hor)⁵, D-Cit⁶]-Antid, čo je analóg peptidu Cetrorelixu, ktorý má vzorec Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-Cit-leu-Ilys-Pro-D-Ala-NH₂; príprava sa vykonala obdobne, ako sa uvádza v príklade 1, ale miesto N“Boc-D-4Aph sa v polohe 6 viazal N^aBoc-D-Cit. Voliteľne sa do polohy 6 viazal N“Boc-D-Om(Fmoc) a predlžovanie reťazca sa zastavilo pri vzniku peptidového medziproduktu: Boc-D-Om(Fmoc)-Leu-Lys(ipr,Z)-Pro-D-Ala-NH-[MBHA živicový základ]. Amínový vedľajší reťazec na zvyšku Om sa potom zbavil ochrany odstránením Fmoc obdobne ako v príklade 1. Uvedený peptidový medziprodukt sa nechal reagovať 6 hodín s nadbytkom /erc-butylizokyanátu v DMF pri teplote miestnosti na zreagovanie s vedľajším reťazcom zvyšku Om. Ukončenie syntézy dekapaptidového medziproduktu sa vykonalo ako v príklade 1.

Peptidoživica sa potom premyla, štiepila a čistila tak, ako sa uvádza v príklade 1. Čistením RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-Cit-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH₂; produkt bol v podstate homogénny, stanovená čistota bola vyššia ako 99 %. MS analýzou sa zistila molekulová hmotnosť 1 583,7 Da ktorá dobre súhlasí s predpokladanou vypočítanou hmotnosťou 1 583,8 Da.

Pripravený peptid bol viac hydrofílný ako Cetrorelix a pri skúške in vivo na potláčanie sekrécie LH skúškou ako v príklade 1 je dlhšie bioaktívny ako Cetrorelix. Mal o niečo lepšie vlastnosti ako Cetrorelix pri potláčaní LH sekrécie v

3. deň a významne lepšie po 96 hodinách.

Príklad 2A

Spôsobom uvedeným v príklade 1 patentu USA 5 169 935 sa syntetizoval peptid [4Aph(Hor)’]-Antid, čo je analóg peptidu Antidu. Po naviazaní N^aBoc-D-Lys(Fmoc) do polohy 6 sa peptid nechal reagovať s nadbytkom kyseliny nikotínovej v DMF a nasledovalo odstránenie ochrannej skupiny. Potom sa do polohy 5 naviazal N°Boc-D-4Aph(Fmoc) a odstránila sa ochranná skupina amínovej skupiny vedľajšieho reťazca na zvyšku Aph obdobne, ako sa uvádza v príklade 1. Medziprodukt sa nechal reagovať s kyselinou L-hydroorotovou v DMF a syntéza dekapeptidu sa dokončila rovnako ako v príklade 1.

Nasledovalo bežné premývanie, odštiepenie od živice, odstránenie ochranných skupín a čistenie tak, ako sa uvádza v príklade 1. Spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-Lys(Nicj-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NHj. Pripravený peptid bol viac hydrofilný ako Cetrorelix a pri skúške prejavoval bioaktívny účinok potláčania sekrécie LH rovnako dlho ako Centrorelix.

Príklad 3

Obdobným spôsobom, ako sa uvádza v príklade 1B sa syntetizoval analóg [4Aph(D/L-Imz)⁵] -Acylínu s výnimkou, že miesto L-Hor sa použil D/L-Imz. Potom po odstránení ochrannej skupiny z polohy 5- 4Aph sa medziprodukt nechal reagovať v nadbytku D/L-2-imidazolidón-4-karboxylovej kyseliny, 90 mg HOBt a približne 0,66 mmolov DIC v roztoku DMF počas približne 6 hodín pri teplote miestnosti. Dokončenie syntézy dekapeptidového medziproduktu sa vykonalo ako v príklade 1.

Nasledovalo bežné premývanie, odštiepenie od živice, odstránenie ochranných skupín a čistenie tak, ako sa uvádza v príklade 1. Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D/L-2-imidazilidón-4-karbonyl)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH₂. Pripravený peptid bol hodnotený ako homogénna zmes dvoch zlúčenín bez iných nečistôt. Analýzou LSIMS sa stanovila molekulová hmotnosť 1 602,7 Da, čo je v dobrom súhlase s vypočítanou hodnotou molekulovej hmotnosti 1 602,8 Da tohto peptidu.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo ako v príklade 1 sa zistilo, že v potláčaní hladiny LH mal peptid pri dávke 50 míkrogramov bioaktívny a dlhotrvajúci účinok. Po troch dňoch a po 96 hodinách mal o niečo lepší účinok ako Acylín.

Príklad 3A

Opakovala sa syntéza ako v príklade 3, ale v nadbytku L-2-imidazolidón-4-karboxylovej kyseliny miesto D/L-2-imidazolidón-4-karboxylovej kyseliny. Výsledný peptid bol hodnotený ako homogénny a jeho čistota sa stanovila na úrovni približne 99 %. Analýzou LSIMS sa stanovila molekulová hmotnosť 1 602,5 Da, čo je v dobrom súhlase s vypočítanou hodnotou molekulovej hmotnosti 1 602,8 Da tohto peptidu. Peptid bol viac rozpustný ako Acylín.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo ako v príklade 1 sa zistilo, že v potláčaní hladiny LH mal peptid pri dávke 50 mikrogramov bioaktívny a dlhotrvajúci účinok. Po 96 hodinách mal približne rovnaký účinok ako Acylín.

Príklad 3B

Opakovala sa syntéza podľa príkladu 3 a použitím nadbytku D-2-imidazolidón-4-karboxylovej kyseliny miesto D/L-Imz. Získal sa výsledný peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-Imz)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH₂. Analýzou LSIMS sa stanovila molekulová hmotnosť 1 602,6 Da, čo je v dobrom súhlase s vypočítanou hodnotou molekulovej hmotnosti 1 602,8 Da tohto peptidu. Peptid bol viac rozpustný vo vode ako Acylín.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo ako v príklade 1 sa zistilo, že v potláčaní hladiny LH mal peptid pri dávke 50 mikrogramov bioaktívny účinok. Peptid potláčal sekréciu LH.

Príklad 3C

Syntetizoval sa peptid [4Aph(Imz)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶]-Acylín; použila sa kombinácia spôsobu podľa príkladu 1A (na zavedenie D-4-Amf(Cbm)⁶) a spôsobu podľa Príkladu 3A (na zavedenie 4Aph(Imz)⁵). Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Imz)-D-4Aph(karbamoyl)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH₂. Peptid sa hodnotil ako homogénny a jeho čistota sa stanovila na úrovni 98 %. Analýzou LSIMS sa stanovila molekulová hmotnosť 1 617,8 Da, čo je v dobrom súhlase s vypočítanou hodnotou molekulovej hmotnosti 1 617,8 Da tohto peptidu.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo ako v príklade 1 sa zistilo, že v potláčaní hladiny LH mal peptid pri dávke 50 mikrogramov dlhotrvajúci bioaktívny účinok. Peptid potláčal sekréciu LH. Účinok tohto peptidu bol po troch dňoch rovnaký ako Acylínu, ale bol o niečo lepší po 96 hodinách.

Príklad 4

Syntetizoval sa peptid [4Aph(Hor)⁵, D-4Amf(MeCbm)⁶]-Antid, ktorý má vzorec Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Amf(MeCbm)-Leu-ILys-Pro-DAla-NH₂; použil sa spôsob podľa príkladu 1A. Miesto reakcie s D-4Amf v polohe 6- s nadbytkom terc-butylizokyanátu v DMF sa reakcia uskutočnila s metylízokyanátom. Dokončenie syntézy sa vykonalo tak, ako sa uvádza v príklade 1A.

Peptidoživica sa premyla, štiepila, zbavila ochranných skupín a čistila ako v príklade 1. Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Amf(MeCbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH₂; pripravený peptid sa hodnotil ako v podstate homogénny a jeho čistota sa stanovila ako lepšia ako 99 %. Analýzou LSIMS sa stanovila molekulová hmotnosť 1 659,8 Da, čo je v dobrom súhlase s vypočítanou hodnotou molekulovej hmotnosti 1 659,8 Da tohto peptidu.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo ako v príklade 1 sa zistilo, že v potláčaní hladiny LH peptid č. 4 pri dávke 50 mikrogramov lepšie potláčal sekréciu LH ako Acylín a bol posúdený ako peptid s veľmi dlhotrvajúcim bioaktívnym účinkom.

Príklad 4A

Opakovala sa syntéza, opísaná v príklade 4, ale so zámenou metylizokyanátu anhydridom kyseliny octovej s cieľom vytvoriť peptid (4Aph(Hor)⁵, D-4Amf(Ac)⁶]-Antid. Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal uvedený peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Amf(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH₂; pripravený peptid bol posúdený ako v podstate homogénny a jeho čistota, stanovená analýzou bola vyššia ako 99 %. Molekulová hmot nosť podľa LSIMS analýzy bola 1 644,5 Da, čo je v dobrom súhlase s predpokladanou vypočítanou molekulovou hmotnosťou 1 644,8 Da tohto peptidu.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo ako v príklade 1 sa zistilo, že peptid má pri dávke 50 mikrogramov dlhotrvajúcu bioaktivitu. Zistilo sa, že počas 3 dní potláča sekréciu LH rovnako ako Acylín a po 96 hodinách je mierne lepší ako Acylín.

Príklad 4B

Vykonala sa úprava dekapeptidu, syntetizovaného a hodnoteného v príklade 1 A; úprava záležala v nahradení D-alanylamidu na C-termináli D-alaninolom. Najprv sa syntetizoval nonapeptidový fragment, ktorý mal na C-termináli prolín ako voľnú kyselinu, pričom sa vo všeobecnosti použil postup syntézy, opísaný k príkladu 1A, ale s použitím Merrifieldovej živice (chlórmetylovaný zosieťovaný polystyrén), ktorá je dostupná od firmy Bachem, Inc. Po odštiepení, odstránení ochranných skupín a čistení sa získal nonapeptid: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-OH. 0,15 milimolu HPLC-čisteného nonapeptidu, celkom zbaveného ochranných skupín sa rozpustilo v 3 ml suchého DMF spolu s 3,0 milimolmi D-alaninolu (Lancaster Chemical). Potom sa pridalo 0,60 milimolu PyBOP (Novabiochem) vo forme tuhej látky ako kopulačného činidla a reakčná zmes sa 30 minút miešala pri teplote miestnosti. Reakcia sa zastavila pridaním 200 ml vody, vytvorila sa emulzia, ktorá sa premenila na číry roztok úpravou pH na 2,5 použitím ľadovej kyseliny octovej. Výsledný dekapeptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-ol sa čistil preparatívnou HPLC s použitím TEAP (pH 2,3) ako tlmivého roztoku a následne ešte ďalším čistením s použitím 0,1 %-ného TFA ako tlmivého roztoku. Výsledný peptid bol hodnotený ako v podstate homogénny a jeho stanovená čistota bola lepšia ako približne 99 %. MS analýzou sa zistila molekulová hmotnosť 1 632,9 Da, ktorá súhlasí s vypočítanou hmotnosťou 1 632,8 Da tohto peptidu.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo ako v príklade 1 sa zistilo, že pri dávke 50 mikrogramov má peptid dlhotrvajúcu bioaktivitu a že táto bioaktivita pokračuje najmenej 96 hodín. Peptid sa hodnotil ako peptid s dlhotrvajúcim účinkom.

Príklad 4C

Opakovala sa syntéza z príkladu 4B, ale s náhradou pôvodného D-alaninolu v reakčnej zmesi L-alaninolom (Aldrige Chemicals). Výsledný dekapeptid sa čistil tak, ako sa opisuje v príklade 4B; hodnotil sa ako v podstate homogénny peptid a jeho čistota, stanovená analýzou bola lepšia ako 98 %. Analýzou MS sa zistila molekulová hmotnosť 1 632,9 Da, čo je v súlade s predpokladanou vypočítanou molekulovou hmotnosťou 1 632,8 Da.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo ako v príklade 1 sa zistilo, že pri dávke 50 mikrogramov má peptid dlhotrvajúcu bioaktivitu a že táto bioaktivita pretrváva najmenej 96 hodín. Peptid sa hodnotil ako peptid s dlhotrvajúcim účinkom.

Príklad 4D

Vykonala sa úprava dekapeptidu, syntetizovaného v príklade 1; úprava záležala v nahradení D-alanylamidu na C-termináli D-alaninolom. Najprv sa syntetizoval nanopeptidový fragment, ktorý mal ako voľnú kyselinu na C-termináli prolín, pričom sa vo všeobecnosti použil postup syntézy, opísaný k príkladu 1, ale s použitím SPPS na Mer rifieldovej živici. Po odštiepení, odstránení ochranných skupín a čistení sa získal nanopeptid: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-OH. Čistený nanopeptid potom reagoval s D-alaninolom ako v príklade 4B. Výsledný dekapeptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-ol sa čistil preparatívnou HPLC, ako sa opisuje v príklade 4B s výnimkou, že sa použil TEAP pri pH 6,5 miesto pH 2,3. Výsledný peptid bol hodnotený ako v podstate homogénny a jeho stanovená čistota bola lepšia ako 99 %. MS analýzou sa zistila molekulová hmotnosť 1 618,9 Da, ktorá súhlasí s vypočítanou hmotnosťou 1 618,8 Da tohto peptidu. Zistilo sa, že tento peptid pri skúškach in vivo bol bioaktívny.

Príklad 4E

Opakovala sa syntéza z príkladu 4D, ale s náhradou D-alaninolu L-alaninolom. Výsledný dekapeptid: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-ol sa čistil preparatívnou HPLC, ako sa opisuje v príklade 4D. Výsledný peptid bol hodnotený ako v podstate homogénny a jeho stanovená čistota bola lepšia ako 99 %. MS analýzou sa zistila molekulová hmotnosť 1 618,9 Da, ktorá súhlasí s vypočítanou hmotnosťou 1 618,8 Da tohto peptidu. Pri skúškach in vivo sa zistilo, že tento peptid je bioaktívny.

Príklad 5

Obdobne, ako v príklade 1A, sa syntetizoval peptid [4Aph(Hor)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶]-Antid, ktorý má vzorec: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-hydroorotyl)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH₂. Miesto reakcie 4Aph v polohe 5- s L-hydroorotovou kyselinou sa vedľajší reťazec nechal reagovať s D-hydroorotovou kyselinou. Príprava dekapeptidového medziproduktu sa dokončila rovnako ako v príklade 1A.

Peptidoživica sa potom podrobila bežnému premývaniu, odštiepeniu živice, odstráneniu ochranných skupín a čisteniu tak, ako sa opisuje v príklade 1. Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-hydroorotyl)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH₂. Peptid bol posúdený ako v podstate homogénny a jeho čistota bola stanovená na úrovni lepšej ako 98 %. LSIMS analýzou sa stanovila molekulová hmotnosť 1 645,8 Da, ktorá súhlasí s predpokladanou vypočítanou molekulovou hmotnosťou 1 645,8 tohto peptidu.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie sekrécie LH potkana in vivo ako v príklade 1 sa zistilo, že peptid pri dávke 50 mikrogramov vykazuje bioaktivitu na potláčanie sekrécie LH počas dvoch dní podobne ako Acylín a jeho vplyv pokračuje aj po 72 a 96 hodinách, hoci v trocha menšej miere.

Príklad 5A

Opakovala sa syntéza, opísaná v príklade 5, ale miesto reakcie vedľajšieho reťazca 4Amf (po zbavení ochrannej skupiny) s Zerc-izokyanátom sa uskutočnila reakcia s anhydridom kyseliny octovej. Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-hydroorotyl)-D-4Amf(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH₂; pripravený peptid bol posúdený ako v podstate homogénny a jeho čistota, stanovená analýzou bola vyššia ako 99 %. Molekulová hmotnosť podľa LSIMS analýzy bola 1 644,7 Da, čo je v dobrom súhlase s predpokladanou vypočítanou molekulovou hmotnosťou 1 644,8 Da tohto peptidu.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo ako v príklade 1 sa zistilo, že peptid má pri dávke 50 mikrogramov po troch dňoch rovnakú bioaktivitu ako Acylín; po 96 hodinách je mierne lepší ako Acylín.

Príklad 6

Opakovala sa syntéza z príkladu 1 F, ale s výnimkou, že na syntézu dekapeptidu [4Amf(Hor)⁵, D-4Amf(Ac)⁶]-Antidu sa v polohe 6- miesto N“Boc-D-4Aph(Fmoc) použil N“Boc-D-4Amf(Fmoc). Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-hydroorotyl)-D-4Amf(acetyl)-Leu-Lys-(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH₂; pripravený peptid bol posúdený ako v podstate homogénny a jeho čistota, stanovená analýzou bola vyššia ako 99 %. Molekulová hmotnosť podľa LSIMS analýzy bola 1 658,7 Da, čo je v dobrom súhlase s predpokladanou vypočítanou molekulovou hmotnosťou 1 658,8 Da tohto peptidu.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo ako v príklade 1 sa zistilo, že peptid má pri dávke 50 mikrogramov dlhotrvajúcu bioaktivitu na potláčanie sekrécie LH. Zistilo sa, že počas 2 dní má biopotenciu približne rovnakú ako Acylín a po 3 a 4 dňoch takmer rovnakú ako Acylín.

Príklad 6A

Opakovala sa syntéza, opísaná v príklade 6, ale miesto reakcie vedľajšieho reťazca 4Amf (po zbavení ochrannej skupiny) s anhydridom kyseliny octovej sa uskutočnila reakcia s ŕerc-izokyanátom ako v príklade 1 za vzniku peptidu [4Amf(Hor)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶]-Antidu. Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal dekapeptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-hydroorotyl)-D-4Aph(karbamoyl)-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH₂; pripravený peptid bol posúdený ako v podstate homogénny a jeho čistota, stanovená analýzou bola približne 99 %. Molekulová hmotnosť podľa LSIMS analýzy bola 1 659,6 Da, čo je v dobrom súhlase s predpokladanou vypočítanou molekulovou hmotnosťou 1 659,8 Da tohto peptidu.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo ako v príklade 1 sa zistilo, že pri dávke 50 mikrogramov je peptid po jednom dni rovnako aktívny a po dvoch dňoch približne rovnako aktívny ako Acylín; po 3 dňoch je o niečo menej aktívny, ale po 4 dňoch má rovnakú aktivitu ako Acylín.

Príklad 6B

Opakovala sa syntéza z príkladu 6A s výnimkou, že sa reakcia vykonala s metylizokyanátom miesto íerc-butylizokyanátu; reakciou vzniká peptid [4Amf(Hor)⁵, D-4Amf(McCbm)⁶]-Antid. Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-hydroorotyl)-D-4Aph(metylkarbamoyl)-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH₂; pripravený peptid bol posúdený ako v podstate homogénny a jeho čistota, stanovená analýzou bola približne 99 %. Molekulová hmotnosť podľa LSIMS analýzy bola 1 673,6 Da, čo je v dobrom súhlase s predpokladanou vypočítanou molekulovou hmotnosťou 1 673,8 Da tohto peptidu.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo ako v príklade 1 sa zistilo, že pri dávke 50 mikrogramov je peptid po jednom dni rovnako aktívny a po dvoch dňoch približne rovnako aktívny ako Acylín; po 3 a 4 dňoch nastáva podstatne menšie potláčanie sekrécie LH ako v prípade použitia Acylínu.

Príklad 6C

Opakovala sa syntéza z príkladu 6 s výnimkou, že sa reakcia vykonala s kyselinou D-hydroorotovou miesto ky seliny L-hydroorotovej; reakciou vzniká peptid [4Amf(Hor)⁵, D-4Amf(Ac)^ó]-Antid. Čistením spôsobom RP-HPLC sa získal peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(D-hydroorotyl)-D-4Amf(acetyl)-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH₂; pripravený peptid bol posúdený ako v podstate homogénny a jeho čistota, stanovená analýzou bola lepšia ako 99 %. Molekulová hmotnosť podľa LSIMS analýzy bola 1 658,7 Da, čo je v dobrom súhlase s predpokladanou vypočítanou molekulovou hmotnosťou 1 658,8 Da tohto peptidu.

Pri skúškach tohto peptidu bežnou skúškou na potláčanie hladiny LH u potkana in vivo ako v príklade 1 sa zistilo, že peptid je pri dávke 50 mikrogramov po jednom a dvoch dňoch v podstate rovnako aktívny ako Acylín; po 3 dňoch nastáva podstatne menšie potláčanie sekrécie LH ako v prípade použitia Acylínu a potom sa biopotencia ďalej znižuje·

Príklad Ί

Spôsobmi, uvedenými v príkladoch 1 až 5 ako všeobecné postupy, sa pripravili aj ďalej uvedené GnRH antagonistické peptidy:

[4Aph(Hor)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶, Pro⁹NHCH2CH3]-Antid [4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(Cbm)⁶, Pro⁹NHCH2CH₃]-Antid [Acr-D-2Nal', 4FD-Phe², 4Aph(Hor)⁵]-Acylín [Bz-D-2Naľ, 4NO2-D-Phe²,4Aph(Hor)⁵, D4Aph(Hor)⁶]-Antid [For-D-2Nal', 4OCH3-D-Phe², 4Amf(Hor)⁵, D-4Aph(D-Hor)⁶]-Antid [Acr-D-2Nal’, 4Br-D-Phe²,4Aph(Imz)⁵, D-4Aph(Imz)'’]-Antid [Pn-D-2Nal', 4CH₃-D-Phe², 4Aph(D-Imz)⁵, D-4Aph(D-Hor)⁶]-Antid [By-D-2Nal’, 3,4C1₂-D-Phe²,4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(Hor)^fr]-Antid [Vl-D-2Nal', 4NO₂-D-Phe², 4Aph(Hor)³, D-4Aph(Cbm)⁶]-Antid [Vac-D-2Nal', C“Me4Cl-D-Phe²,4Aph(Hor)⁵, Gly¹⁰]-Acylín [Pn-D-2Nal', 3Aph(Imz)⁵, D-3Amf(D-Hor)⁶-Agl^,()]-Antid [Acr-D-2Nal', 4Aph(Hor)⁵, Arg-(Et2)⁸, D-Agl(Me)¹⁰]-Acylín [MeCbm-D-2Nal’, 4Aph(Hor)⁵, Arg⁸, Agl(Me)¹⁰]-Acylín [Cbm-D-ŽNal¹, 3Amf(Imz)⁵, Ala'°]-Acylín [EtCbm-D-ŽNal¹,4Atnf(Hor)⁵, Pro⁹NHCH2CH₃]-Acylín [Acr-D-2Nal', 4Aph(Imz)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶, Arg^s]-Antid [Cbm-D-ŽNal¹, 4Aph(MeCbm)⁵, D-4Amf(MeCbm)⁶, Arg(Et₂)⁸]-Antid [4Ahp(Hor)⁵, D-4Ahp(Imz)⁶ D-Agl'°]-Antid [Ac-D-lNal¹, 4Amf(Hor)⁵, D-4Amf(D-Hor)^č, Arg⁸]-Antid [PrCbm-D-2Nal', 4Amf(Imz)⁵, D-4Ahp(EtCbm)⁶, Pro’NHCH₂CH₃]-Antid [4Amf(Hor)⁵, D-Lys(Nic)⁶, AzaGly^l0]-Antid [4Amf(Hor)⁵, D-Cit⁶, Har(Et2)⁸]-Antid [4Aph(Hor) , D-Lys(Nic)⁶, D-Agl¹⁰]-Antid [4Aph(Hor)⁵, D-Hci⁶, Agl(Me)’°]-Antid [4Aph(Hor)⁵, D-3Pal⁶, Har^s, Agl'°]-Antid [4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(For)⁶, D-Agl(Me)^l0]-Antid [4Aph(Hor)⁵, D-Aph(atz)⁶, Har(Et2)⁸]-Antid [4Aph(Hor)^s, D-4Aph(iprCbm)⁶, D-Agl¹⁰]-Antid [For-D-lNa¹,4Amf(Hor)⁵, D-4Amf(atz)^s, Gly'°]-Antid [4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(Cbm)⁶, Ala¹⁰-ol ]-Antid Tieto peptidy majú biopotenciu inhibovať sekréciu LH.

Príklad 8

Spôsobmi, uvedenými v príkladoch 1 až 5 ako všeobecné postupy a v patente USA číslo 5 491 217, sa pripravili aj ďalej uvedené GnRH antagonistické peptidy: [N“Me4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(Cbm)⁶]-Antid [N“Mc4Aph(Hor)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶]-Antid [N“Me4Aph(Hor)⁵]-Acylín [N^aMe4Aph(D-Hor)⁵]-Acylín [D-4FPhe², N“Me4Aph(Hor)⁵]-Acylin [N^aMe4Amf(Hor)⁵] -Acylin [N“Me4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(Hor)⁶]-Antid [N^aMe4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(D-Hor)^s]-Antid [MeCbm-D-ŽNa¹, N“Me4 Aph(Hor)⁵]-Acyl ín [N^aMe4Aph(Hor)⁵, D-3Pal⁶]-Antid [N^aMe4Aph(Cbm)⁵, D-4Aph(Cbm)⁶] -Antid [N“Me4Aph(MeCbm)⁵, D-4Aph(MeCbm)⁶]-Antid [N^aMe4Aph(Hor)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶, Ala'°-ol]-Antid [N“Me4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(Cbm)⁶, D-Ala'°-ol]-Antid [N“Me4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(Cbm)⁶, Ala¹⁰-ol]-Antid [N^aMe4Aph(Hor)⁵, D-Cit⁶]-Antid [N°Me4Aph(Hor)⁵, D-Lys(Nic)⁶] -Antid [N“Me4Aph(D/L-Imz)⁵]-Acylín [N“Me4Aph(L-Imz)⁵] -Acylin [N“Me4Aph(D-Imz)⁵]-Acylín [N“Me4Aph(L-Imz)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶]-Acylín [N“Me4Aph(Hor)⁵, D-4Amf(MeCbm)⁶]-Antid [N“Me4Aph(Hor)⁵, D-4Amf(Ac)⁶]-Antid [N“Me4Aph(Hor)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶, D-Ala'°-ol]-Antid [N“Me4Aph(Hor)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶]-Antid [N“Me4Aph(D-Hor)⁵, D-4Amf(Ac)⁶] - Antid [N“Me4Amf(Hor)⁵, D-4Amf(Ac)⁶]-Antid [N“Me4Amf(Hor)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶]-Antid [N^aMe4Amf(Hor)⁵, D-4Amf(MeCbm)⁶]-Antid [N“Me4Amf(D-Hor)⁵, D-4Amf(Ac)⁶]-Antid

Tieto peptidy majú biopetenciu inhibície sekrécie LH a majú veľmi dobrú rozpustnosť vo vode pri fyziologickom pH.

Uvedené zlúčeniny sa skúšali a pri skúškach preukázali biopotenciu potláčania LH v takom rozsahu, ktorý je prinajmenšom porovnateľný s biopotenciou príslušného GnRH antagonistického peptidu Antidu; uvedené zlúčeniny sa považujú za analógy Antidu. Výsledkom rozsiahlych skúšok v tejto oblasti, trvajúcich vyše dekády je záver, že stanovená biopotencia touto široko uznávanou skúškou merania potláčania LH je uznaná za dôkaz, že uvedené zlúčeniny majú schopnosť potláčať gonadotropínovú sekréciu a tým majú užitočné antigonadálne proti-ovulačné účinky. Vychádzajúc z vynikajúcej rozpustnosti uvedených zlúčenín, odolnosti proti gélovateniu in vivo, dlhotrvajúcej bioaktivite a ďalším vlastnostiam považujú sa tieto zlúčeniny za všeobecne použiteľné ako antigonadálne látky na potláčanie sekrécie gonadotropínov a na inhibíciu uvoľňovania steroidov gonadmi, napríklad ako antiovulačné látky.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu sa často podávajú vo forme farmaceutický prijateľných, netoxických solí, ako sú adičné soli s kyselinami, alebo ako kovové komplexy; výhodné môžu byť octany a pamoáty, soli kyseliny pamoovej. Ak sa má aktívna zložka podávať vo forme tabliet, tableta môže obsahovať farmaceutický prijateľný, netoxický nosič, ktorý zahŕňa spojivo, ako jc napríklad tragakant, kukuričný škrob alebo želatína, látku, ktorá napomáha rozpadaniu tablety, ako je napríklad kyselina algínová, a lubrikačnú látku, ako je napríklad stearan horečnatý. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu možno vhodne podávať tiež v intravenóznej forme v izotonickom soľnom roztoku, tlmenom fosforečnanovým tlmivým roztokom alebo v podobných roztokoch.

Farmaceutické prostriedky budú zvyčajne obsahovať účinné množstvo peptidu v spojení s bežným, farmaceutický prijateľným nosičom alebo riedidlom. Veľkosť dávky pri intravenóznom podávaní bude zvyčajne od približne 10 mikrogramov do približne 2,5 miligramov peptidu na kilogram telesnej hmotnosti príjemcu. Podstata týchto zlúčenín dovoľuje účinné orálne podávanie; orálne dávkovanie by malo byť ale vyššie. Celkovo sa liečba subjektov týmito peptidmi uskutoční rovnakým spôsobom ako klinická liečba s použitím iných antagonistov GnRH, s použitím vhodného nosiča, v ktorom je príslušná zlúčenina rozpustná a podáva sa v takej dávke, ktorá postačuje na potláčanie LH a FSH hladín pacienta.

Môže sa tiež vyžadovať, aby sa GnRH analóg podával v dlhších časových intervaloch, napríklad po jednom týždni až po jednom roku na jedno podanie a aby sa pomaly uvoľňoval, na čo sa môžu využiť zásobné alebo implantované dávkové formy prípravkov.

Na dosiahnutie inhibície a/alebo kontroly plodnosti cicavcov možno uvedené zlúčeniny podľa tohto vynálezu podávať intravenózne, subkutánne, intramuskuláme, orálne, perkutánne, intranazálne, intrapulmonáme, intrarektálne alebo intra-vaginálne; uvedené zlúčeniny možno podávať uvedenými spôsobmi aj v prípadoch, vyžadujúcich vratnú supresiu gonadálnej aktivity, ako napríklad na zvládnutie predčasnej puberty, alebo počas radiačnej terapie alebo chemoterapie. Uvedené zlúčeniny sú tiež užitočné na liečbu steroidne-závislých nádorov. Účinné dávky sa budú meniť v závislosti od liekovej formy podávaného prípravku a jednotlivých druhov liečených cicavcov. Niektoré z týchto zlúčenín majú vysokú rozpustnosť, až 50 mg.mľ¹ a môžu sa bežne používať ako roztoky s koncentráciou 5 až 10 mg.mľ¹ pri pH 5,4. Príkladom typickej dávkovej liekovej formy je bakteriostatický vodný roztok s pH približne 6, obsahujúci peptid; roztok sa podáva parenterálne tak, aby poskytol dávku v rozmedzí od približne 0,1 do 2,5 mg.kg’¹telesnej hmotnosti na deň. Uvedené zlúčeniny sú považované za dobre znesiteľné in vivo v organizme a za látky, ktoré odolávajú vzniku gélov. Podľa uvedeného sa teda uvedené zlúčeniny považujú za veľmi vhodné na podávanie formou subkutánnych injekcií v bakteriostatickom vodnom roztoku približne 5 %-ného manitolu pri pH približne 4,9 v príslušných koncentráciách, nad približne 0,75 mg.mľ¹, výhodnejšie nad približne 1,0 mg.mľ¹ bez nebezpečia, že by roztoky v mieste injekcie vytvárali gél.

Uvedené GnRH antagonistické peptidy sú užitočné tiež na diagnostické účely tak in vivo, ako aj in vitro. Tieto peptidy sa môžu injektovať in vivo a následne sa môže sledovať krvný obeh pacienta s cieľom stanoviť rozsah poklesu hormonálnej sekrécie, napríklad sekrécie LH. Skúšky in vitro sa môžu uskutočňovať určovaním, či sú určité nádorové bunky citlivé k GnRH. V týchto skúškach sa na kultúry nádorových buniek pôsobí GnRH antagonistickými peptidmi a potom sa monitoruje hormonálna sekrécia a množenie buniek.

Vynález je opísaný z hľadiska jeho výhodných uskutočnení a je zrejmé, že odborník v danej oblasti môže vykonať rôzne bežné úpravy a zmeny bez toho, aby sa vzdialil od podstaty a rozsahu tohto vynálezu, ako sú uvedené v priložených nárokoch. N-zakončenie sa necháva nesubstituované alebo sa substituuje s použitím ekvivalentných acylačných skupín; v druhom prípade je výhodná substitúcia acetylovou skupinou alebo substituovanou alebo nesubstituovanou karbamoylovou skupinou. V polohách 5- a 6možno miesto Aph alebo D-Aph použiť Ahp alebo D-Ahp. Miesto Aph(Ac) možno použiť skupinu aminoPhe acylovanú voliteľným acylačným činidlom, ako sa opisuje v patente USA 5 506 207, ako je napríklad kyselina mravčia, β-Ala(atz) a kyselina y-aminomaslová(atz), čim podobne vzniknú GnRH antagonisty, ktoré majú dlhotrvajúci účinok; potom sa uvedené zvyšky považujú za ekvivalentné D- a L-4Aph(Ac). Obidva Lys(Bu) a Lys(Et₂) sa považujú za ekvivalentné ILys; najvýhodnejší je ale ILys. Ďalšie hydrofóbne zvyšky aminokyselín možno použiť aj polohách 1 - a 6- (ako sa uvádza), výhodne vo forme D-izomé rov, a tieto zvyšky sa považujú tiež za ekvivalentné už určeným zvyškom.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Peptid antagonistický k hormónu uvoľňujúcemu gonadotropín (GnRH) vzorca:

X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa⁵-Xaa⁶-Leu-Xaa⁸-Pro-Xaa^I() a jeho farmaceutický prijateľné soli, pričom:

X je acylová skupina, ktorá nemá viac ako 7 atómov uhlíka, alebo Q, pričom Q je

O

II

- C -NHR a R je H alebo C] až C₃ alkyl;

A je 4C1, 4F, 4Br, 4NO₂, 4CH₃, 4OCH₃, 3,4C1₂, alebo C“Me4Cl;

Xaa⁵ je Aph(Q’) alebo Amf(Q’), pričom Q¹ je alebo (Dalebo L-Hor) (D- alebo L-Imz)

Xaa⁶ je D-Aph/Q²), D-Amf(Q²), D-Lys(Nic), D-Cit, D-Hci, alebo D-Pal, pričom Q² je For, Ac, 3-amino-l,2,4-triazol, Q, alebo Q¹;

Xaa⁸ je Lys(ipr), Arg, Har, Arg(Et₂), alebo Har(Et₂); a

Xaa¹⁰ je D-Ala-NH2, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH2CH3, Gly-NH2, AzaGly-NH2, Ala-NH2, Agl-NH2, D-Agl-NH2, Agl(Me)-NH2, alebo D-Agl(Me)-NH2, ale za predpokladu, že cc-amínová skupina Xaa⁵ môže byť voliteľne metylovaná; a ďalej za predpokladu, ak Xaa⁶ obsahuje D- alebo L-Hor, alebo D- alebo L- Imz, Xaa⁵ môže mať ako Q¹ skupinu Ac, For, alebo 3-amino-l,2,4-triazol( a ak Xaa⁶ obsahuje Q, potom Xaa⁵ môže tiež obsahovať Q.
2. Peptid antagonistický k GnRH podľa nároku I, v ktorom

X, A a Xaa⁶ sú definované v nároku 1,

Q je karbamoyl alebo metylkarbamoyl,

D-Pal je D-3Pal,

Xaa⁵ je 4Aph(Q’) alebo 4Amf(Q’), pričom Q¹ je o

H alebo (Dalebo L-Hor) (D- alebo L-Imz)

Xaa⁶ je D-4Aph(Q²), D-4Amí(Q²), pričom Q² je D- alebo L- Hor, alebo D- alebo L- Imz, za predpokladu, že Q² je Q, potom Q¹ môže byť tiež Q, a

Xaa¹⁰ je D-Ala-NH₂, D-Ala-ol alebo Ala-ol.
3. Peptid antagonistický k GnRH podľa nároku 1 alebo 2, v ktorom Q¹ je L-Hor alebo D-Hor.
4. Peptid antagonistický k GnRH podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, v ktorom X je Ac, Xaa⁸ je Lys(ipr) a Xaa¹⁰ je D-Ala-NH₂.
5. Peptid antagonistický k GnRH podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, v ktorom Xaa⁵ je 4Aph(L- alebo D- Hor) a Xaa⁶ je D-4Aph(Ac), D-4Aph(atz) alebo D-3Pal.
6. Peptid antagonistický k GnRH podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, v ktorom Xaa⁵ je 4Aph(L- alebo D- Hor) a Q² je Q a R je H alebo metyl.
7. Peptid antagonistický k GnRH podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, v ktorom Xaa⁵ je 4Aph(L- alebo D- Hor) a Xaa⁶ je D-Cit alebo D-Hci.
8. Peptid antagonistický k GnRH podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, v ktorom Xaa⁶ je D-4Aph(D-Hor).
9. Peptid antagonistický k GnRH podľa nároku 1, v ktorom:

X je For, Ac, Acr, Pn, By, VI, Vac, Bz alebo Q, pričom Q je definované v nároku 1;

A je 4C1 alebo 4F;

D-Pal je D-3Pal;

Xaa⁵ je Aph(Q') alebo Amf(Q’), pričom Q¹ je alebo Hor, alebo Imz vo forme D-izomérov, L-izomérov, alebo D/L izomémych zmesí;

Xaa⁶ je D-Aph(Q²), D-Amf(Q²), D-Cit, D-Lys(Nic) alebo D-Pal, pričom Q² je For, Ac, Q alebo Q¹.

Xaa⁸ je Lys(ipr); a

Xaa¹⁰ je D-Ala-NH₂, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH₂CH₃ alebo Gly-NH₂.
10. Peptid antagonistický k GnRH podľa nároku 9, v ktorom Q¹ je L- alebo D- Hor a Xaa⁶ je D-4Amf(Q), pričom R je H alebo metyl.
11. Peptid antagonistický k GnRH podľa nároku 9, kde X je Ac alebo Q, R je H alebo metyl, Xaa⁶ je D-4Aph(Q2), D-Amf(Q2) alebo D-3Pal, pričom Q² je Ac, Q alebo Q¹ a Xaa¹⁰ je D-Ala-NH2.
12. Peptid antagonistický k GnRH podľa nároku 1, ktorý má vzorec: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)Xaa⁶-Leu-Lys(ipr)-Pro-Xaa¹⁰, kde Xaa⁶ je D-4Aph(Ac), D-3Pal, D-4Aph(karbamoyl), D-4Amf(karbamoyl), D-4Amf(metylkarbamoyl) alebo D-4Aph(D-Hor) a Xaa¹⁰ je D-Ala-NH₂, D-Ala-ol alebo Ala-ol.
13. Peptid antagonistický k GnRH podľa nároku 12, ktorý má vzorec: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(karbamoyl)-Lcu-Lys(ipr)-Pro-D-Ala-NH₂alebo jeho farmaceutický prijateľná soľ.
14. Farmaceutický prostriedok na inhibíciu sekrécie gonadotropinov cicavcov, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ako aktívnu látku účinné množstvo peptidu antagonistického k GnRH podľa niektorého z nárokov 1 až 13 spolu s netoxickým rozpúšťadlom.
15. Použitie peptidu antagonistického k GnRH podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 13 na výrobu lieku na diagnostikovanie in vivo alebo in vitro nadmernej hormonálnej sekrécie alebo rastu nádoru spôsobeného GnRH.
16. Použitie peptidu antagonistického k GnRH podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 13 na výrobu lieku na inhibíciu sekrécie gonadotropinov cicavcov.
17. Medziprodukt na prípravu peptidu antagonistického k GnRH, ktorý má vzorec:

X^l-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-(X²)-Xaa⁵-Xaa⁶-Leu-Lys(iprXX⁴)-Pro-X⁵ v ktorom:

X¹ je ochranná skupina α-amínovej skupiny;

A je 4C1 alebo 4 F;

X* je H alebo ochranná skupiny hydroxylovej skupiny;

Xaa⁵ je Aph(Q'), alebo Amf(Q‘), pričom Q’ je D-izomér, L-izomér, alebo D/L-zmes izomérov alebo alebo (Dalebo L-Hor) (D- alebo L-Imz)

Xaa⁶ je D-Aph(Q²), D-Amf(Q²), alebo D-Pal, pričom Q² je Ac, Q¹, karbamoyl, alebo metylkarbamoyl;

X⁴ je proti kyselinám nestála ochranná skupina amínovej skupiny; a

X⁵ je D-Ala, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl, Agl(Me), alebo D-Agl(Me) živicový základ (nosič); N(Et)-živicový nosič; amid kyseliny D-Ala-, Gly, alebo Ala; etylamid; AzaGly-NH₂; alebo OH, ale za predpokladu, že α-amínová skupina Xaa⁵ môže byť voliteľne metylovaná.