JP4249806B2 - 5位および6位で修飾されているGnRH拮抗物質 - Google Patents
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Description
発明の背景
ゴナドトロピンまたは性腺刺激ホルモンと呼ばれることもある、卵胞刺激ホルモン(FSH)および黄体化ホルモン(LH)は、柄によって視床下部に付いている下垂体から放出される。
通常、下垂体前葉からホルモンが放出されるには、例えばGnRHデカペプチドなどの、視床下部で産生されるホルモンが予め放出される必要がある。
一般に哺乳動物においてゴナドトロピンの分泌を抑制するために、また排卵を抑制または遅延するために、GnRHの正常な作用に拮抗するGnRHアナログの投与が用いられてきた。
改善されたGnRH拮抗物質の探求の結果、アンチド(Antide)すなわち[Ac−D−2Nal1,D−4ClPhe2,D−3Pal3,Lys(Nic)5,D−Lys(Nic)6,ILys8,D−Ala10]−GnRH;およびセトロレリックス(Cetrorelix)すなわち[Ac−D−2Nal1,D−4ClPhe2,D−3Pal3,D−Cit6,D−Ala10]−GnRHが生成された。米国特許第5,516,887号には、血漿テストステロンの抑制においてアンチドより有効であると言われるGnRH拮抗物質、例えばアンタレリックス(Antarelix)と呼ばれる[Ac−D−2Nal1,D−4ClPhe2,D−3Pal3,D−Nε−カルバモイルLys6,ILys8,D−Ala10]−GnRHについて記載されている。
1994年3月22日発行の米国特許第5,296,468号には、多くのGnRH拮抗物質の設計および合成について開示されているが、ここでは、選択された残基の側鎖は反応してシアノグアニジノ部分を生じ、その一部は続いて自発的に所望の複素環に変換するものであり、例えば3−アミノ−1,2,4−トリアゾール(atz)がある。このようなシアノグラニジノ部分は、リジン、オニチン、4−アミノフェニルアラニン(4Aph)、または4Aphの延長鎖型である4−アミノホモフェニルアラニン(4Ahp)などのアミノ酸側鎖のオメガアミノ基において形成される。このように有意に修飾されたアミノ酸または非天然アミノ酸を5位および6位に有するGnRH拮抗物質は、良好な生物学的な効力を呈し、シアノグラニジノ部分がAph上に作られているものが一般に好ましいとされている。特に好ましいGnRH拮抗物質は、アザリン(Azaline)B、すなわち[Ac−D−2Nal1,D−4ClPhe2,D−3Pal3,4Aph(atz)5,D−4Aph(atz)6,ILys8,D−Ala10]−GnRHである。米国特許第5,506,207号には、5位および6位の残基のアミノ置換フェニルアラニン側鎖がアシル化されている生物作用能が大きいGnRH拮抗物質が開示されているが、特に効力の大きいデカペプチドは、アシリン(Acyline)、すなわち[Ac−D−2Nal1,D−4ClPhe2,D−3Pal3,4Aph(Ac)5,D−4Aph(Ac)6,ILys8,D−Ala10]−GnRHである。
これら一群のGnRH拮抗物質が有する魅力ある特性にもかかわらず、より一層改善されたGnRH拮抗物質、特に生物学的作用が長時間持続するGnRH拮抗物質の探求は今日まで続いている。ペプチドアナログは、短期および長期の治療適応症のいずれの場合も、LH分泌に対する活性の持続時間が長いものであること、すなわち体内でのタンパク質分解酵素に対する分解ペプチドの抵抗性によって助長される特性を呈することがしばしば重要となる。さらに、これらの化合物をゲル化することなしに、哺乳動物、特にヒトに対して投与することを容易にするには、このようなGnRH拮抗物質デカペプチドが、通常の生理学的pH、すなわち約pH5から約pH7.4において、水に対する溶解度が高いことが非常に有利であると考えられる。
発明の概要
セトロレリックス、アンタレリックス、アシリン、アンチドなどを含むGnRH拮抗物質のサブクラスにおいて、5位の残基または5位および6位の残基に別のある修飾を施すと、意外なことに、皮下投与したときに生物活性の持続期間が長いという特に有利な特性を呈する化合物が得られることが判明した。このような修飾は、4アミノPhe残基もしくはそれの等価な4Ahp残基、または第一級アミノ基が4位もしくはパラ位にあるメチル基に結合している4−アミノメチルフェニルアラニン(4Amf)に対して行われる。このような修飾においては、側鎖のアミノ基はイソシアネートと反応して尿素基を形成するか、あるいは尿素部分を構成するように配置された少なくとも2個の窒素原子を含有する複素環式カルボン酸と反応する。好ましい複素環反応物は、D−ヒドロオロト酸またはL−ヒドロオロト酸(Hor)(C4N2H5(O)2COOH)、およびD−イミダゾリドン−4−カルボン酸またはL−イミダゾリドン−4−カルボン酸(Imz)(C3N2H5(O)COOH)である。
一般に、式:
X−D−Nal−(A)D−Phe−D−Pal−Ser−Xaa5−Xaa6−Leu−Xaa8−Pro−Xaa10
を有するGnRH拮抗物質デカペプチド、密接に関連するそのアナログ、および薬剤学的に許容可能なその塩は、特に生物活性持続期間が長いという改善された薬理学的特性を有することが判明している:
上式で、
Xは、最高で7個の炭素原子を有するアシル基、またはQであって、該Qは
であり、式中Rは、Hまたは低級アルキルであり、
Aは、4Cl、4F、4Br、4NO2、4CH3、4OCH3、3,4Cl2またはCαMe4Clであり、
Xaa5は、Aph(Q1)またはAmf(Q1)であって、式中Q1は
であり、
Xaa6は、D−Aph(Q2)、D−Amf(Q2)、D−Lys(Nic)、D−Cit、D−Hci、またはD−Palであって、式中Q2はFor、Ac、3−アミノ−1,2,4−トリアゾール、Q、またはQ1であり、
Xaa8は、Lys(ipr)、Arg、Har、Arg(Et2)、またはHar(Et2)であり、そして
Xaa10は、D−Ala−NH2、D−Ala−ol、Ala−ol、NHCH2CH3、Gly−NH2、AzaGly−NH2、Ala−NH2、Agl−NH2、D−Agl−NH2、Agl(Me)−NH2、またはD−Agl(Me)−NH2であり、
ただし、Xaa5のα−アミノ基は、任意選択でメチル化されていてもよく、さらにXaa6がD−HorもしくはL−HorまたはD−ImzもしくはL−Imzを含有するとき、Xaa5はAc、For、または3−アミノ−1,2,4−トリアゾールをQ1として有してもよく、Xaa6がQを含有するとき、Xaa5もQを含有していてもよい。
別の態様において、本発明は、GnRHが過剰なホルモン分泌または腫瘍の増殖を引き起こしている状態をin vivoまたはin vitroで診断する方法を提供するものであり、該方法には、前記種類のGnRH拮抗物質ペプチドを投与することと、ホルモン分泌および腫瘍細胞の増殖をモニタすることとが含まれる。
さらに別の態様において、本発明は、式:
X1−D−Nal−(A)D−Phe−D−Pal−Ser(X2)−Xaa5−Xaa6−Leu−Lys(ipr)(X4)−Pro−X5
を有するGnRH拮抗物質ペプチドを生成するための中間体を提供し、
上式で、
X1は、α−アミノ保護基であり、
Aは、4Clまたは4Fであり、
X2は、Hまたはヒドロキシル保護基であり、
Xaa5は、Aph(Q1)またはAmf(Q1)であって、式中Q1は、下式のいずれかのD−異性体、L−異性体、またはD/L−異性体混合物であり、
であり、
Xaa6は、D−Aph(Q2)、D−Amf(Q2)、またはD−Palであって、式中Q2は、Ac、Q1、カルバモイル、またはメチルカルバモイルであり、
X4は、酸に不安定なアミノ保護基であり、そして
X5は、D−Ala−、Gly−、Ala−、Agl−、D−Agl−、Agl(Me)−、もしくはD−Agl(Me)−樹脂保持体;N(Et)−樹脂保持体;D−Ala、Gly、もしくはAlaのアミド;エチルアミド;AzaGly−NH2;またはOHであり、
ただし、Xaa5のα−アミノ基は、任意選択でメチル化されていてもよい。
これらの拮抗物質は、活性の持続期間が長いために、すなわち少なくとも約4日間にわたってLHの分泌を有意に抑制しつづけるために、ヒトでのゴナドトロピンの分泌の抑制、および受胎能調整剤として特に有効である。は非常によく、ヒスタミン放出の刺激に関する副作用も許容でき、すなわち現在使用されているGnRHスーパーアゴニストに比べてより良好である。さらに、有効濃度において皮下(SC)注射してもゲル化は最小限しか認められない。これらのGnRH拮抗物質は、比較的小さな膨疹を引き起こすアナフィラキシーアッセイ(anaphylactoid assay)においても良好に機能する。その結果、これらのペプチドを、受胎能調整剤として、あるいは性的早熟庄、ホルモン依存性腫瘍形成、月経困難症、子宮内膜症、ステロイド依存性腫瘍、およびその他本明細書で先に言及した短期適応症もしくは長期適応症の治療用に、哺乳動物、特にヒトへの投与において、特に用いることが見出される。これらは診断にも有用である。
これらのGnRH拮抗物質は、約5から約7.4の生理学的pH範囲で容易に溶解するため、特にpH約5からpH約7において濃縮された形態で製剤化および投与することができる。その極性ゆえに、既知コポリマーをベースとした徐放性調製品での使用に特に適している。これらのGnRH拮抗物質は、長期にわたってLHおよびFSHの抑制に有効であるため、雄哺乳動物の避妊治療に(テストステロンを任意選択で投与しながら)、およびステロイド依存性腫瘍の治療に、特に有効でもある。
好ましい実施形態の詳細な説明
最近10年から12年の間、有効な拮抗物質をつくるという観点から、GnRH配列における10個の残基それぞれの特性について徹底した研究がなされてきた。その結果、等価な残基として選択し得る種々の残基があること、およびこれらの等価な残基の1つを別の等価な残基と置換してもデカペプチドGnRH拮抗物質の生物作用能が有意に損なわれることはないことが分かった。本発明のGnRH拮抗物質において、このような等価な置換を行うことができる。
例えば、パラ−置換D−Phe、2,4ジクロロ−置換D−Phe、D−CαMe4ClPhe、またはD−ペンタメチル(Me5)Phe残基を2位に有するようにすると、GnRH拮抗物質の活性は有意に増すが、環置換基の特有の独自性は、クロロ、フルオロ、ブロモ、ニトロ、メチル、およびアルコキシの中から選択した場合には、あまり重要でないことが一般に認められている。したがって、2位のこのような残基は、一般的に用いるD−4ClPheの等価体であると考えられる。Phe7は、Leu7の等価体と考えられる。N末端は、好ましくはアセチル(Ac)により、N−アシル化されていることが好ましいが、例えばホルミル(For)、アクリリル(Acr)、n−プロピオニル(Pn)、ブチリル(By)、バレリル(Vl)、ビニルアセチル(Vac)、およびベンゾイル(Bz)などの炭素原子を最高で7個有するその他のアシル基により、N−アシル化されていても好ましい。あるいは、置換カルバモイルまたは非置換カルバモイルによって修飾されていてもよい。その他のより長いアシル基も等価体であると考えられるが、あまり好ましくない。米国特許第5,110,904号に開示されているように、5位の残基のα−アミノ基を任意選択でメチル化して水溶性を高めることもできるが、このような修飾を行うとLH抑制持続期間が短縮され、ヒスタミン放出の可能性が大きくなる。C末端は、D−Ala−NH2、D−Ala−ol、またはAla−olであることが好ましいが、Gly−NH2、NHCH2CH3、AzaGly−NH2、Ala−NH2、Agl−NH2、D−Agl−NH2、Agl(Me)−NH2、およびD−Agl(Me)−NH2も、既知の等価体と考えられることから、代わりに使用することができる。
本明細書で先に述べたように、本発明は、次式:
X−D−Nal−(A)D−Phe−D−Pal−Ser−Xaa5−Xaa6−Leu−Xaa8−Pro−Xaa10
で表わされるGnRH拮抗物質のファミリー、および薬剤学的に許容可能なその塩を提供することを意図し、
上式で、
Xは、For、Ac、Acr、Pn、By、Vl、Vac、Bz、またはQであって、該Qは
であり、式中Rは、Hまたは低級アルキルであり、
Aは、4Cl、4F、4Br、4NO2、4CH3、4OCH3、3,4Cl2、またはCαMe4Clであり、
Xaa5は、Aph(Q1)またはAmf(Q1)であって、式中Q1は、
であり、
Xaa6は、D−Aph(Q2)、D−Amf(Q2)、D−Lys(Nic)、D−Cit、D−Hci、またはD−Palであって、式中Q2は、For、Ac、3−アミノ−1,2,4−トリアゾール、Q、またはQ1であり、
Xaa8は、Lys(ipr)、Arg、Har、Arg(Et2)、またはHar(Et2)であり、そして
Xaa10は、D−Ala−NH2、D−Ala−ol、Ala−ol、NHCH2CH3、Gly−NH2、AzaGly−NH2、Ala−NH2、Agl−NH2、D−Agl−NH2、Agl(Me)−NH2、またはD−Agl(Me)−NH2であり、
ただし、Xaa5のα−アミノ基は、任意選択でメチル化していてもよい。
GnRH拮抗物質と密接に関連するファミリーでは、Xaa5は、Q1としてAc、For、または3−アミノ−1,2,4−トリアゾールのいずれかを有していてよく、この場合Xaa6は、D−HorもしくはL−Hor、またはD−ImzもしくはL−ImzであるQ2を含んでいる。
別のGnRH拮抗物質と密接に関連するファミリーでは、Xaa6はQを含み、Xaa5もQ含んでいる。
D−Nalは、β−炭素原子でナフチルが置換したアラニンのD−異性体を意味し、すなわちβ−D−Nalまたは3−D−Nalともいう。ナフタレンとの結合が環構造上の2位である、D−2Nalを用いることが好ましいが、D−1Nalを用いることもできる。D−CPaは、クロローD−Pheを表わしており、D−4ClPheすなわちD−4CPaが好ましい。D−Palは、β−炭素原子でピリジルが置換したアラニンのD−異性体を表わし、ピリジン環の3位に結合していること、すなわちD−3Pal(β−3−ピリジル−D−Ala)であることが好ましいが、D−2Pal(β−2−ピリジル−D−Ala)を代わりに用いることもできる。4Aphは、フェニル環上のアミノ置換基が4位にある4NH2Pheを意味し、3NH2Phe(3Aph)は、これらアナログ中に含まれる、それの等価体であると考えられる。さらに、2NH2Pheも生物作用能の観点から等価体であると考えられる。4Amfは、側鎖アミノ基にメチレンが結合している4NH2CH2Pheを意味し、3NH2CH2Phe(3Amf)は、等価体であると考えられる。HorまたはL−Horは、L−ヒドロオロチルを意味し、ImzまたはL−ImzはL−2−イミダゾリドン−4−カルボニルを意味し、いずれもD−異性体またはD/L混合物として用いることもできる。atzは、3−アミノ−1,2,4−トリアゾールを意味する。4Aph(atz)は、より正確な化学名である4−(3′−アミノ−1H−1′,2′,4′−トリアゾール−5′−イル)アミノフェニルアラニンでも知られている。Lys(Nic)は、Nε−ニコチノイルリジンを意味し、すなわちLysのε−アミノ基が3−カルボキシピリジンでアシル化されている。D−Citは、シトルリンのD−異性体を意味し、D−Hciは、D−Nε−カルバモイルリジンでもある、ホモシトルリンのD−異性体を意味する。ILysまたはLys(ipr)は、Lysのε−アミノ基がアルキル化されているNε−イソプロピルリジンを意味する。Ala−olは、アラニノール、すなわちCH3CH(NH2)CH2OHを意味し、AzaGly−NH2は、NHNHCONH2を意味する。Harは、ホモアルギニンを意味する。Aglは、α−アミノグリシンを意味する。Cbmは、カルバモイルを意味し、MeCbmは、メチルカルバモイルまたは−CONHCH3を意味する。低級アルキルは、C1からC5を意味し、好ましくはC1からC3を、さらに好ましくはC1またはC2、すなわちメチル(Me)またはエチル(Et)を意味する。
これらGnRH拮抗物質の6位に組み込まれる好ましいD−異性体を具体例によって開示したが、過去20年にわたる当該技術分野の広範な研究の結果、多くの既知の等価なD−異性体が存在する。このような従来技術のD−異性体置換によっても、本明細書に開示した特定の5位の置換によって得られる生物作用能に合致するものであって、これが損なわれることはなく、したがって該置換を任意選択で用いることができる。
GnRH拮抗物質の好ましい下位部類(subgenus)は、式:
X−D−Nal−(A)D−Phe−D−Pal−Ser−Xaa5−Xaa6−Leu−Lys(ipr)−Pro−Xaa10を有し、および薬剤学的に許容可能なその塩であり
上式で、
Xは、For、Ac、Acr、Pn、By、Vl、Vac、Bz、またはQであって、該Qは
であり、式中Rは、Hまたは低級アルキルであり、
Aは、4Clまたは4Fであり、
Xaa5は、Aph(Q1)またはAmf(Q1)であって、式中Q1は
であり、
Xaa6は、D−Aph(Q2)、D−Amf(Q2)、D−Cit、D−Lys(Nic)、またはD−Palであって、式中Q2は、For、Ac、Q、またはQ1であり、そして
Xaa10は、D−Ala−NH2、D−Ala−ol、Ala−ol、NHCH2CH3、またはGly−NH2である。
別のGnRH拮抗物質の好ましい下位部類は、式:
X−D−Nal−4Cpa−D−Pal−Ser−Xaa5−Xaa6−Leu−Lys(ipr)−Pro−Xaa10
を有し、および薬剤学的に許容可能なその塩であり、
上式で、
Xは、AcまたはQであって、該Qは
であり、式中Rは、Hまたはメチルであり、
Xaa5は、Aph(Q1)またはAmf(Q1)であって、式中Q1は、
であり、
Xaa6は、D−Aph(Q2)、D−Amf(Q2)、またはD−Palであって、式中Q2は、Ac、Q、またはQ1であり、そして
Xaa10は、D−Ala−NH2、D−Ala−ol、またはAla−olである。
別のGnRH拮抗物質の好ましい下位部類は、式:
MeCbm−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph−(Hor)−D−Xaa6−Leu−ILys−Pro−Xaa10
を有し、および薬剤学的に許容可能なその塩である。
上式で、
D−Xaa6は、D−4Amf(Q1)、D−4Aph(Q1)、またはD−3Palであって、式中Q1は、D−Horまたは
であり、式中Rは、Hまたは低級アルキルであり、好ましくはHまたはメチルであり、
Xaa10は、D−Ala−NH2、D−Ala−ol、またはAla−olである。
本発明の化合物は、古典的なペプチド溶液合成によって合成することができ、このような合成は、大量の製品を合成するのに好ましい。例えば1kg未満の限られた量を得るためには、固相技術を利用して合成することが好ましい。当技術分野で周知であるように、側鎖の保護基は、アミノ酸が樹脂上につくられる鎖にカップリングするときに著しく活性な側鎖または不安定な側鎖を有する任意アミノ酸の一部として、含まれていることが好ましい。このような合成によって、X1−D−Nal−(A)D−Phe−D−Pal−Ser(X2)−Xaa5−Xaa6−Leu−Lys(ipr)(X4)−Pro−X5などの、充分保護された中間体ペプチド樹脂が得られる。
5位および6位に所望のヒドロオロチルなどを含有する残基を有するGnRH拮抗物質の合成に用いる化学中間体の一例は、式:X1−D−Nal−D−4Cpa−D−Pal−Ser(X2)−Aph(X3)−D−Aph(X3)−Leu−ILys(X4)−Pro−X5で表わされる。この式を有するペプチド中間体およびその他のアナログの合成には、後述するような基X1およびX5を用いることができる。
X1は、ポリペプチドの段階的合成に有用であることが当技術分野において知られている型のα−アミノ保護基であり、所望のペプチド組成物中のXが特定のアシル基である場合、その基を保護基として用いることができる。X1に含まれるα−アミノ保護基の種類は、(1)ホルミル(For)、トリフルオロアセチル、フタロイル、p−トルエン−スルホニル(Tos)、ベンゾイル(Bz)、ベンゼンスルホニル、ジチアスクシノイル(Dts)、o−ニトロフェニルスルフェニル(Nps)、トリチルスルフェニル、o−ニトロフェノキシアセチル、アクリリル(Acr)、クロロアセチル、アセチル(Ac)、およびγ−クロロブチリルなどの、アシル型保護基、(2)ベンジルオキシカルボニル(Z)、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、ならびにp−クロロベンジルオキシ−カルボニル(ClZ)、p−ニトロベンジルオキシカルボニル、p−ブロモベンジルオキシカルボニル、およびp−メトキシベンジルオキシカルボニルなどの置換ベンジルオキシカルボニルなどの、芳香族ウレタン型保護基、(3)tert−ブチルオキシカルボニル(Boc)、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、およびアリルオキシカルボニルなどの、脂肪族ウレタン型保護基、(4)シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、およびシクロヘキシルオキシカルボニルなどの、シクロアルキルウレタン型保護基、(5)フェニルチオカルボニルなどの、チオウレタン型保護基、(6)アリル(Aly)、トリフェニルメチル(トリチル)、およびベンジル(Bzl)などの、アルキル型保護基、(7)トリメチルシランなどの、トリアルキルシラン基である。好ましいα−アミノ保護基は、Bocである。
X2は、Ac、Bz、トリチル、2,6−ジクロロベンジル(DCB)、またはベンジルエーテル(Bzl)などの、Serのヒドロキシル側鎖の保護基であり、Bzlであることが好ましい。
X3は、α−アミノ保護基または別のアミノ保護基を除去するときに除去されない側鎖アミノ基の保護基である。具体例には、(1)Fmocまたはその他の弱酸性に安定な芳香族ウレタン型保護基などの塩基に不安定な基、(2)チオール分解により除去または切断することができるジチアスクシノイル(Dts)などのチオールに不安定な基、(3)ヒドラジン分解によって切断されるフタロイル(Pht)などのヒドラジンに不安定な基、(4)チオアセトアミドまたは弱酸もしくはその塩によって切断されるo−ニトロフェニルスルフェニル(Nps)などの求核試薬に不安定な基、(5)光分解によって切断される光に不安定な基、および(6)Dtsなどの還元によって選択的に取り除かれる基などが含まれる。Fmocは、Boc SPPSストラテジーに好ましい。
X4は、Zまたは2ClZなどの、第一級または第二級アミノ側鎖基に用いる酸に不安定な保護基である。
X5は、D−Ala−、Gly−、Ala−、Agl−、D−Agl−、Agl(Me)−、もしくはD−Agl(Me)−NH−[樹脂保持体]であってもよいし、N(Et)−[樹脂保持体]であってもよい。X5は、GlyもしくはAlaもしくはD−Alaのいずれかのアミド、Proに直接付いている低級アルキル置換アミド、AzaGly−NH2、または−OH(遊離酸)とすることもできる。X5が遊離酸のとき、中間体は、D−アラニノールまたはL−アラニノールにカップリングさせてC末端にアルコールを有するデカペプチドを得るように設計されている、ノナペプチドフラグメントである。
側鎖保護基X2〜X4の選択基準は、合成の各段階におけるα−アミノ保護基(Bocが好ましい)の除去用に選択される反応条件下で、保護基が試薬に対して概ね安定であることである。これらの保護基は、一般にカップリング条件下で分離されるようなことがあってはならないが、所望のアミノ酸配列の合成が完了したときに、ペプチド鎖に変化を生ずることのないような反応条件下で取り除くことが可能でなければならない。5位および6位の残基に最初に用いた保護基は、取り除かれることが好ましく、本明細書中で後述するが、該選択的反応は、樹脂から最終段階のペプチドを切断する前に行う。前述したデカペプチド中間体を合成する場合、X3保護基は、個別的に除去可能であることが望ましい。
X5基がD−Ala−NH−[樹脂保持体]であるとき、保護基D−Alaは、アミド結合によってBHA樹脂またはMBHA樹脂に結合するが、このことはAglまたはD−AglをC末端に用いた場合も同様である。X5基がN(Et)−[樹脂保持体]のとき、Proは、エチルアミド結合によってN−アルキルアミノメチル樹脂(NAAM)に結合する。
N末端をアセチル化する場合に、例えば、1位のβ−D−Nalのα−アミノ基に対するX1保護基としてアセチルを用いることが可能であるが、このことは、β−D−Nalをペプチド鎖にカップリング前にアセチルを該アミノ酸に加えることにより可能となる。しかしながら、樹脂上のペプチド中間体を用いて反応を行うことが好ましい。α−アミノ保護基を脱保護した後、所望の側鎖が保護されたまま状態で、無水酢酸を用いた反応によってアセチル化を行うことが好ましい。あるいは、ジイソプロピルカルボジイミドまたはジシクロヘキシルカルボジイミド(DICまたはDCC)の存在下で、酢酸を用いて反応を行うこともでき、あるいは当技術分野で知られているその他の適当なアシル化反応によって行うこともできる。N末端にカルバモイル基または置換カルバモイル基を所望する場合も、同様の手順が行われる。残基がペプチド鎖の一部となっている状態で、脱保護した側鎖アミノ基を修飾する場合には、例えばN,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)などの適当な塩基の存在下、適当なイソシアネートを用いて反応を行う。ただし、このような塩基の使用は任意選択である。最終製品に非置換カルバモイル基が所望される場合、脱保護したアミノ側鎖をベンジルイソシアネート、p−トシルイソシアネート、トリメチルシリルイソシアネート、またはtert−ブチルイソシアネートと反応させてもよいが、tert−ブチルイソシアネートと反応させることが好ましい。このようなストラテジーを用い、t−ブチル部分を樹脂から切断される際に取り除き、カルバモイル基が残される。
本発明はさらに、例えば、式:Ac−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(Hor)−D−4Aph(Ac)−Leu−ILys−Pro−D−Ala−NH2を有するGnRH拮抗物質を生成する新規方法を提供するものであって、該方法には、(a)式:Boc−D−4Aph(X3)−Leu−ILys(X4)−Pro−X5(式中、X3は、塩基に不安定なアミノ基保護基、ヒドラジンに不安定なアミノ基保護基、またはその他の適当な不安定なアミノ基保護基であり;X4は、酸に不安定なアミノ側鎖保護基であり;X5は、D−Ala−NH−[樹脂保持体]である。)を有する中間ペプチドを生成すること、(b)D−4AphからX3を取り除いて、中間ペプチドのアミノ酸残基の側鎖第一級アミノ基を脱保護すること(c)この脱保護した側鎖第一級アミノ基と、無水酢酸とを反応させること、(d)鎖の延長を完了して、中間体X1−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser(X2)−4Aph(X3)−D−4Aph(Ac)−Leu−ILys(X4)−Pro−X5(上式で、X1は、水素またはα−アミノ保護基、X2は、水素またはSerのヒドロキシル基を保護するための保護基である。)を生成すること、(e)N末端のアミノ基を脱保護してアセチル化すること、(f)4AphからX3を取り除いて、脱保護された第一級アミノ基とヒドロオロト酸とを反応させること、ならびに(g)残存するすべての保護基を分離すること、および/またはX5に含まれる樹脂保持体から切断することとが含まれる。
ペプチドの最終的な精製は、当技術分野で知られているクロマトグラフィーにより、好ましくはRP−HPLCを用いて行うことが好ましい。J.Rivier他、J.Chromatography、288巻、303〜328頁、1984年;ならびにC.MillerおよびJ.Rivier、Biopolymers(Peptide Science)、40巻、265〜317頁、1996年を参照のこと。
本発明のGnRH拮抗物質は、雌ラットの排卵を防止するために、発情前期の正午頃に皮下投与した場合、体重1kg当たり100マイクログラム未満のレベルで有効であると考えられる。排卵抑制期間を長くするには、体重1kg当たり約0.1ミリグラムから約2.5ミリグラムの範囲の用量レベルを使用する必要がある。この拮抗物質を哺乳動物の雄に規則的に投与すると、精子形成の停止にも有効であり、したがって避妊薬としても使用できる。これらの化合物はテストステロンレベルを低下させ、したがってリビドーをも低下させるため(正常な性的活動力のある雄にとっては望ましくない結果)、リビドーを維持しながら無精子症を達成するためには、GnRH拮抗物質と併用して補充用量(replacement dosage)のテストステロンを投与することが望ましかろう。この拮抗物質は、ゴナドトロピンおよび性ステロイドの調整に用いることもでき、本明細書で先に述べたようなその他の長期および短期の適応症にも用いることもでき、これをペットの避妊薬として獣医学にも適用できる。
本発明によって提供されるペプチドは、生理学的pH値において著しい溶解性があり、したがって比較的高濃度の投与液剤として、特に皮下注射剤として調製することができる。これらのペプチドは体内で充分耐性であり、有効濃度で皮下投与する場合に容易にはゲル化しない。一般に、このようなペプチドと、医薬品として容認可能な好適な賦形剤とを含有する医薬品組成物を、1日に体重1kg当たり約0.001mgから約2.5mgの間のレベルで、静脈、腹腔、皮下などに投与することができ、通常は1日体重1kg当たり0.5mgで充分である。
適正に保護されたD−もしくはL−ヒドロオルチル−含有アミノ酸、カルバモイル−含有アミノ酸、および/またはD−もしくはL−イミダゾリドン−カルボニル−含有アミノ酸を合成し、次いで鎖延長ペプチド合成で用いることができる。しかしながら、等しく有効な合成は、適正に保護されたAph残基、D−Aph残基、Amf残基、またはD−Amf残基を、ペプチド中間体の所望の位置に最初に組込むことによって達成され、このような方法は、最初はわずか少量だけが望まれる実験室向けの方法として選択することができよう。この方法における最後のストラテジーは、特定の残基を順次に脱保護し(合成の際に直ちにまたは順次のいずれか)、次いで脱保護した側鎖アミノ基を所望の試薬と反応させることによって達成される。
本発明を以下の実施例でさらに説明する。
実施例1
式:Ac−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−Lys−(Nic)−D−Lys(Nic)−Leu−ILys−Pro−D−Ala−NH2(アンチド)を有するペプチドは、GnRHの拮抗物質として非常に良好な生物学的性質を示し、アンチドとは5位および6位のみが異なる、現在アシリンと呼ばれているペプチドも同様であることが判明している。現在では、これらの分子を出発点として用いることにより、およびデカペプチドアシリンの5位もしくは6位またはデカペプチドアシリンの5位に他の置換を施すことにより、in vivoでの生物活性持続時間が改善されたGnRH拮抗物質が得られることが判明している。1〜4位および7〜10位に関しては、アンチド、アシリン、およびアザリンのいずれも全く同じであることに注意する。
以下のデカペプチド[4Aph(Hor)5、D−4Aph(Cbm)6]−アンチド、または[Ac−D−2Nal1、D−4Cpa2、D−3Pal3、4Aph(Hor)5、D−4Aph(Cbm)6、ILys8、D−Ala10]−GnRHは、固相合成法によって合成される。このペプチドは以下の式を有する:Ac−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(L−ヒドロオロチル)−D−4Aph(カルバモイル)−Leu−Lys(イソプロピル)−Pro−D−Ala−NH2。
MBHA樹脂(Bachem)約0.50グラム(0.54mmol/g)を最初に用い、ジメチルホルムアミド(DMF)/CH2Cl2中で、活性化試薬またはカップリング試薬として約0.65ミリモルのBoc誘導体、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、および無水1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)を用い、約2時間かけて、Boc−保護D−Alaを該樹脂にカップリングさせる。D−Ala残基は、アミド結合によりMBHA残基と結合する。
各アミノ酸残基のカップリングの後、出発樹脂約0.5グラムから1グラムに対し、洗浄、脱保護、次いで次のアミノ酸残基のカップリングを以下の合成計画要覧に従って行う。
前記の計画は、最初のアミノ酸を結合した後、本発明ペプチドの各アミノ酸のカップリングに用いる。NαBoc保護は、合成全体を通して、カップリングされる各アミノ酸に用いる。NαBoc−β−D−2Nalは、例えば米国特許第4,234,571号で詳述されているように、当技術分野で知られている方法によって調製することができるし、米国オレゴン州SyntheTech社から市販されてもいる。5位における4Aph、および6位におけるD−4Aphの側鎖の第一級アミノ基は、Fmocによって保護する。ベンジルエーテル(Bzl)をSerのヒドロキシル基の側鎖保護基として用いることが好ましいが、Serは側鎖の保護を行わずにカップリングすることができる。NαBoc−Lys(ipr、Z)を8位残基に用いる。
6位残基にNαBoc−D−4Aph(Fmoc)としてD−Aphを付加すると、以下の中間体:Boc−D−4Aph(Fmoc)−Leu−Lys(ipr、Z)−Pro−D−Ala−NH−[MBHA樹脂保持体]が得られる。6位残基の側鎖アミノ基を、まず側鎖保護基を除去した後に修飾する。25%ピペリジンのDMF溶液(10ml)を用いて、それぞれ約15分間、連続的に処理することによって、Fmoc保護基を除去する。ペプチド樹脂をDMFで洗浄した後、DMF中の20倍の過剰なtert−ブチルイソシアネートを用いて、室温で、約12時間またはニンヒドリン試験で検査しながら反応が完了するまで、新しく遊離したアミノ基を処理する。次いでペプチド樹脂を標準的に洗浄し、次の残基を付加するためにBocを除去する。
次いで、5位の残基をNαBoc−4Aph(Fmoc)として付加する。次いで、前述のようにこの側鎖を脱保護して、L−ヒドロオロチン酸0.10g(0.66mmol)、HoBt90mg(0.66mmol)、およびDIC0.66mmolのDMF溶液3mlを用いて、室温で、約8時間、または標準的ニンヒドリン試験を用いて検査しながら反応が完了するまで、反応を行う。洗浄し、NαBocを除去した後、NαBoc−Ser(Bzl)、NαBoc−D−3Pal、NαBoc−4Cpa、およびNαBoc−D−2Nalを用いて逐次反応を行い、デカペプチドの合成を完了する。
N末端のα−アミノ基をトリフルオロ酢酸(TFA)で脱保護した後、約30分間、ジクロロメタン(DCM)中の大過剰の無水酢酸を用いて、アセチル化を行う。あるいは、N末端のアセチル化後まで4AphのFmoc保護を除去せず、次いでL−ヒドロオロチン酸との反応を行う。
ペプチド樹脂を乾燥し、不純物除去剤としてアニソール(0.5ml)を添加した後、残存するt−ブチル部分を除去しながら、樹脂からのペプチドの切断と、Ser側鎖およびLys側鎖の脱保護とを、HF15mlを用いて、約0℃で約1.5時間行う。真空下でHFを除去した後、エチルエーテル100mlで樹脂を2回洗浄する。切断されたペプチドは、0.2%TFAの25%CH3CN/H2O溶液で毎回100mlずつ繰り返し抽出する。抽出液を集め、凍結乾燥して、粗ペプチド粉末約600mgを得る。
次いで、ペプチドを、当技術分野で知られており、J.Rivier他、J.Chromatography、288巻、303〜328頁、1984年で具体的に述べられている、分取用逆相高速液体クロマトグラフィ(RP−HPLC)により精製する。RP−HPLC分離による最初の分取ではTEAP(リン酸トリエチルアンモニウム)を用い、最終の分離は、J.Chromatographyの文献にすべて詳述されているように、0.1%TFA(トリフルオロ酢酸)勾配を用いて行う。
ペプチド(約30mg)(以後ペプチド番号1と称する)は、キャピラリゾーン電気泳動(CZE)を用いて実質的に均質であると判断され、その純度は約98%と推定される。精製されたペプチドのアミノ酸分析は、調製された構造式と一致する。液体二次イオン質量分析計(LSIMS)によって測定した分子量は、1631.9Daとして測定され、これはこのペプチドの期待される分子量1631.8Daと一致する。
親水性は、緩衝液AをpH7.0のTEAPとし、緩衝液BをCH3CN70%および緩衝液A30%とし、30分間にわたり緩衝液B40%から緩衝液B70%の濃度勾配としたRP−HPLCを用いて保持時間を測定することにより、検査した。ペプチド番号1は、アシリンより親水性であって、アシリンより速く溶出する。pH約5から約7の水性緩衝液での溶解度、およびin vivoでのゲル化抵抗性により、循環LHレベルを抑制する長時間作用生物作用能(後述)を有しながら、概ね同等の生物学的効力を有する化合物に比べて、特に皮下注射による投与に適するものとなる。
ラットでのLH分泌抑制効果を測定するために、ペプチドをin vivoでアッセイした。ペプチドで皮下処理したスプラーグ−ダウレー(Sprague−Dawley)ラットの精巣除去した雄における循環LHレベルの測定を、C.Rivier他、Biol.Reproduc.、29巻、374〜378頁、1983年に報告されているように行う。ペプチドをまず1.0mg/mlまたは10mg/mlの濃度で静菌水に溶解し、次いでさらに0.1%BSAを含むリン酸緩衝液0.04Mで希釈する。以後の希釈はリン酸緩衝液で行う。ペプチドを5匹のラットに皮下注射し、メトタン麻酔して血液試料(300μl)を集める。血清(50μl)のLHレベルを、National Pituitary and Hormone Distribution Program(NIDDK)から提供された試薬を用いて2回検査する。検査により、ラット当たりペプチド50μgの用量で、LHレベルを注射後96時間の間、コントロールレベルの50%よりかなり低いレベルに抑制することが示される。さらに、96時間後に測定されたレベルは、アシリンを50マイクログラムの用量で同様に注射したラットで示されるLHレベルの約30%にすぎない。ペプチド番号1は非常に長時間作用すると考えられる。ラットの実験により、該ペプチドは、注射箇所における著しいゲル化は検出できず、耐性が良好であることがあることが示された。
数多くのGnRH拮抗物質の検査から得られた経験から、このような長時間LHの抑制作用を表すペプチドは、成熟したスプラーグ−ダウレーラットのメスでin vivoで測定した場合、2.5マイクログラムの用量で完全に排卵を遮断することが示される。
実施例1A
NαBoc−D−4Amf(Fmoc)をNαBoc−D−4Aph(Fmoc)の代わりに用いて、実施例1で述べた合成を繰り返す。D−4Amf側鎖の脱保護の後、前述のようにしてt−ブチルイソシアネートとの反応を行う。実施例1に述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドAc−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(L−ヒドロオロチル)−D−4Amf(カルバモイル)−Leu−Lys(イソプロピル)−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られ、実質的に均質であると判断され、その純度は99パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析によって、質量1645.9Daが示されるが、これは期待される質量1645.8Daに良く相当する。HPLCの結果から、このペプチドがアシリンよりも親水性であることを示すことができる。
このペプチドをラットの標準in vivoLH抑制試験でアッセイすることにより、50マイクログラムの用量で、1、2、および3日目におけるLHレベルの抑制はアシリンと同等の効果を有することが示される。96時間後、LHレベルは、アシリンを注射したラットのLHレベルの約25%に過ぎない。ペプチド番号1Aは、非常に作用時間が長いと考えられる。
実施例1B
アナログ[4Aph(Hor)5]−アシリンを形成するために、脱保護される6位側鎖との反応に無水酢酸をt−ブチルイソシアネートの代わりに用いて、実施例1で述べた合成を繰り返す。実施例1に述べたように、樹脂からデカペプチドを切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドAc−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(L−ヒドロオロチル)−D−4Aph(アセチル)−Leu−Lys(イソプロピル)−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は99パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析により、質量1630.6Daが示され、これは計算値質量である1630.8Daに相当する。
このペプチドを実施例1のようにラットの標準in vivo試験でアッセイすることにより、このペプチドは50マイクログラムの用量で生物活性を有し、1日目から4日目までアシリンとほぼ同等の効果を有することが示される。非常に長時間LHを抑制する作用を示すと考えられる。
実施例1C
D/Lヒドロオロチン酸をL−ヒドロオロチン酸の代わりに用いて実施例1Bで述べた合成を繰り返し、異性体デカペプチドを形成する。実施例1に述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドAc−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(D/L−ヒドロオロチル)−D−4Aph(アセチル)−Leu−Lys(イソプロピル)−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。他の不純物が入っていない、2つの化合物の均質な混合物であると判断される。質量スペクトル分析により、質量1630.6Daが示され、これは計算値質量である1630.8Daと一致する。
このペプチドを実施例1のようにラットの標準in vivo試験でアッセイすることにより、このペプチドは50マイクログラムの用量で生物活性を有し、1日目から4日目までアシリンとほぼ同等の効果を有することが示される。長時間LHを抑制する作用を示すと考えられる。
実施例1D
D−ヒドロオロチン酸をL−ヒドロオロチン酸の代わりに用いて実施例1Bで述べた合成を繰り返し、異性体デカペプチドを形成する。実施例1で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドAc−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(D−ヒドロオロチル)−D−4Aph(アセチル)−Leu−Lys(イソプロピル)−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は98パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析により、質量1630.8Daが示され、これは計算値質量である1630.8Daと一致する。
このペプチドを実施例1のようにラットの標準in vivo試験でアッセイすることにより、このペプチドは50マイクログラムの用量で長時間LHを抑制する生物活性を有し、1日目から4日目までアシリンとほぼ同等の効果であることが示される。
実施例1E
NαBoc−D−4FpheをNαBoc−D−4ClPheの代わりに用いて実施例1Bで述べた合成を繰り返し、デカペプチド[D−4FPhe2、4Aph(Hor)5]−アシリンを形成する。実施例1で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドAc−D−2Nal−D−4Fpa−D−3Pal−Ser−4Aph(L−ヒドロオロチル)−D−4Aph(アセチル)−Leu−Lys(イソプロピル)−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は99パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析によって、質量1615.1Daが示され、これは計算値質量である1614.8Daと一致する。
このペプチドを実施例1のようにラットの標準in vivo試験でアッセイすることにより、このペプチドは50マイクログラムの用量で生物活性を有し、1日目から4日目までアシリンとほぼ同等の効果であることが示される。長時間LHを抑制する作用を示すと考えられる。
実施例1F
NαBoc−4Amf(Fmoc)をNαBoc−4Aph(Fmoc)の代わりに用いて実施例1Bで述べた合成を繰り返し、デカペプチド[4Amf(Hor)5]−アシリンを形成する。実施例1で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドAc−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Amf(L−ヒドロオロチル)−D−4Aph(アセチル)−Leu−Lys(イソプロピル)−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製で得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は98パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析により、質量1644.7Daで、これは計算値質量1644.8Daと一致する。
このペプチドを実施例1のようにラットの標準in vivo試験でアッセイすることにより、50マイクログラムの用量で生物活性を有し、1日目から4日目までアシリンとほぼ同等の効果であることが示される。長時間LHを抑制する作用を示すと考えられる。
実施例1G
実施例1で述べた合成を繰り返すが、D−4Aphの側鎖アミノをt−ブチルイソシアネートと反応させる代わりに、それと4Aph残基を同時にヒドロオロチン酸と反応させて、デカペプチド[4Aph(Hor)5、D−4Aph(Hor)6]−アンチドを形成する。実施例1で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドAc−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(L−ヒドロオロチル)−D−4Aph(L−ヒドロオロチル)−Leu−Lys(イソプロピル)−Pro−D−Ala−NH2がRP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は99パーセント以上であることが推定される。質量スペクトル分析により、質量1728.4Daが示され、これは計算値質量1728.8Daと一致する。RP−HPLCの結果により、このペプチドは、アシリンより親水性であるアザリンBよりも、さらに親水性であることが示される。
このペプチドを実施例1で述べたようにして、ラットの標準in vivo試験でアッセイすることにより、このペプチドは50マイクログラムで生物活性を有しており、1日目から4日目までアシリンとほぼ同等の効果があることが示される。長時間LHを抑制する作用を示すことが考えられる。
NαBoc−D−4Amf(Fmoc)をNαBoc−D−4Aph(Fmoc)の代わりに用いてこの合成を繰り返し、デカペプチド[4Aph(Hor)5、D−Amf(Hor)6]−アンチドを生成し、これは一般にLH分泌を抑制する生物作用能を有する。
実施例1H
実施例1で述べた合成を繰り返すが、D−4Aphの側鎖アミノ基をt−ブチルイソシアネートと反応させる代わりに、D−ヒドロオロチン酸と反応させて、デカペプチド[4Aph(Hor)5、D−4Aph(D−Hor)6]−アンチドを形成する。実施例1で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドAc−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(L−ヒドロオロチル)−D−4Aph(D−ヒドロオロチル)−Leu−Lys(イソプロピル)−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は98パーセント以上であることが推定される。質量スペクトル分析により、質量1728.7Daが示され、計算値質量である1728.8Daと一致する。RP−HPLCの結果によって、このペプチドが、アシリンよりも親水性のアザリンBよりも、さらに親水性であることが示される。
このペプチドを実施例1に述べたようにラットの標準in vivo試験でアッセイすることにより、このペプチドは50マイクログラムの用量で生物活性を有しており、1日目から3日目までアシリンとほぼ同等の効果があることが示される。4日目ではアシリンよりもかなり効果があり、LHを抑制する作用が非常に長時間にわたると考えられる。
実施例1J
デカペプチド[MeCbm−D−2Nal1、4Aph(Hor)5]−アシリンの合成は、実施例1Bで述べた通常の方法によって行うが、NαBoc−4Aph(Fmoc)を付加後に直ちにFmoc−保護基を除去せずに、樹脂上でのデカペプチドの合成を完了させる。次いで、N末端を脱保護した後、無水酢酸と反応させる代わりに、メチルイソシアネートと反応させて、N末端にメチルカルバモイルを形成する。次いで、Fmocを除去し、実施例1Bのようにして4Aphの側鎖アミノ基をL−ヒドロオロチン酸と反応させる。実施例1で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドメチルカルバモイル−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(L−ヒドロオロチル)−D−4Aph(アセチル)−Leu−Lys(イソプロピル)−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は99パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析によって、質量1645.7Daであり、これは計算値質量である1645.8Daと一致する。RP−HPLCの結果によって、このペプチドは、アシリンよりも親水性であるアザリンBよりも、さらに親水性であることが示される。
このペプチドをラットの標準in vivo試験でアッセイすることにより、50マイクログラムの用量で、生物活性を有しており、1日目から3日目までアシリンとほぼ同等の効果を有し、96時間後にはより大きな効果(50%に近い効果)を有することが示される。非常に長時間LHを抑制する作用を示すと考えられる。
実施例1K
NαBoc−D−3PalをNαBoc−D−4Aph(Fmoc)の代わりに用いて実施例1に述べた合成を繰り返し、次いでのt−BuNCOとの反応を除いて、デカペプチド[4Aph(Hor)5、D−3Pal6]−アンチドを形成する。実施例1で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドアセチル−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(L−ヒドロオロチル)−D−3Pal−Leu−Lys(イソプロピル)−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は99パーセント以上であることが推定される。質量スペクトル分析により、質量1574.7Daが示され、これは計算値質量である1574.7Daと一致する。
このペプチドを実施例1のようにラットの標準in vivo試験でアッセイすることにより、50マイクログラムの用量で、生物活性を有しており、3日間アシリンとほぼ同等の効果を有することが示されたが、96時間後ではLHレベルの抑制はアシリンの場合の約35%である。非常に長時間LHを抑制する作用を示すと考えられる。
実施例1L
t−ブチルイソシアネートをヒドロオロチン酸の代わりに用いて実施例1Gで述べた合成を繰り返し、デカペプチド[4Aph(Cbm)5、D−4Aph(Cbm)6]−アンチドを形成する。実施例1で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドAc−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(カルバモイル)−D−4Aph(カルバモイル)−Leu−Lys(イソプロピル)−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は99パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析により、質量1534.9Daが示され、これは計算値質量である1534.7Daと一致する。
このペプチドを実施例1のようにラットの標準in vivo試験でアッセイすることにより、50マイクログラムの用量で、このペプチドが生物活性を有し、4日間アシリンとほぼ同等の効果を有することが示される。長時間LHを抑制する作用があると考えられる。
実施例1M
メチルイソシアネートをヒドロオロチン酸の代わりに用いて実施例1Gで述べた合成を繰り返し、デカペプチド[4Aph(MeCbm)5、D−4Aph(MeCbm)6]−アンチドを形成する。実施例1で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドAc−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(メチルカルバモイル)−D−4Aph(メチルカルバモイル)−Leu−Lys(イソプロピル)−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は99パーセント以上であることが推定される。質量スペクトル分析によって、質量1562.8Daが示され、これは計算値質量である1562.8Daと一致する。
このペプチドを実施例1のようにラットの標準in vivo試験でアッセイすることにより、50マイクログラムの用量で、このペプチドが生物活性を有し、2日間アシリンとほぼ同等の効果を有し、次いでLH抑制がやや減少し始めることが示される。
実施例2
ペプチド[4Aph(Hor)5、D−Cit6]−アンチドは、式Ac−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(L−ヒドロオロチル)−D−Cit−Leu−ILys−Pro−D−Ala−NH2を有するペプチドであるセトロレリックスのアナログで、実施例1に概要を述べた合成法で合成する。NαBoc−D−4Aphの代わりに、NαBoc−D−Citを6位にカップリングさせる。あるいは、NαBoc−D−Orn(Fmoc)を6位にカップリングさせて、次式のペプチド中間体:Boc−D−Orn(Fmoc)−Leu−Lys(ipr、Z)−Pro−D−Ala−NH−[MBHA樹脂保持体]が得られた後、一時的に鎖延長を中断する。次いで、Orn残基のアミノ側鎖を、実施例1のようにFmocを除去することにより脱保護し、中間体を過剰のt−ブチルイソシアネートのDMF溶液で約6時間室温で処理して、Orn残基の側鎖と反応させる。次いで、実施例1のようにデカペプチド中間体の合成を完了する。
次いで、実施例1で述べたようにして、このペプチド樹脂を洗浄し、樹脂から切断し、脱保護し、次いで精製する。ペプチドAc−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(L−ヒドロオロチル)−D−Cit−Leu−ILys−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は99パーセント以上であることが推定される。LSIMS分析により、質量が1583.7Daが示され、これはこのペプチドの計算値質量である1583.8Daと一致する。
このペプチドはセトロレリックスよりも親水性で、実施例1で述べたようにしてLH分泌の抑制をin vivoで検査すると、セトロレリックスと同等の時間、生物活性が示される。3日目でセトロレリックスよりはわずかに良好な抑制があり、96時間後にはかなり良好な抑制が見られる。
実施例2A
米国特許第5,169,953号の実施例1で述べられた合成法を用いて、ペプチドであるアンチドのアナログ、すなわち[4Aph(Hor)5]アンチドを合成する。6位にNαBoc−D−Lys(Fmoc)をカップリングさせた後、過剰のニコチン酸のDMF溶液を脱保護後に反応させる。次いで、5位にNαBoc−Aph(Fmoc)をカップリングさせ、次いで実施例1のようにAph残基のアミノ側鎖を脱保護する。中間体をL−ヒドロオロチン酸のDMF溶液と反応させて、実施例1のようにデカペプチド中間体の合成を完了させる。
標準洗浄の後、実施例1で述べたように、樹脂から切断して脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドAc−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(L−ヒドロオロチル)−D−Lys(Nic)−Leu−ILys−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。セトロレリックスよりも親水性であって、セロトリックスと同等の時間、LH分泌を抑制する生物活性を表すと考えられる。
実施例3
D/L−ImzをL−Horの代わりに用いたことを除き、実施例1Bで概要を述べた方法に従って、アナログ[4Aph(D/L−Imz)5]−アシリンを合成する。したがって、5位にある4Aphの脱保護の後で、中間体を過剰のD/L−2−イミダゾリドン−4−カルボン酸、HOBt約90mg、およびDIC約0.66mmolのDMF溶液で、室温で約6時間処理する。次いで、実施例1のようにデカペプチド中間体の合成を完了させる。
実施例1で述べたように、ペプチド樹脂を洗浄し、切断して脱保護し、精製を行う。ペプチドAc−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(D/L−2−イミダゾリドン−4−カルボニル)−D−4Aph(Ac)−Leu−ILys−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。他の不純物のない、2つの化合物の均質な混合物であると判断される。LSIMS分析により、測定質量1602.7Daが示され、このペプチドの計算値質量である1602.8Daと一致する。
実施例1のようにラットの標準in vivo試験を用いてこのペプチドをアッセイすることによって、50マイクログラムの用量で、長時間LH分泌を抑制することが示される。3日目および96時間後ではアシリンよりわずかに良好な抑制が見られる。
実施例3A
D/L−Imzの代わりに過剰のL−2−イミダゾリドン−4−カルボン酸を用いて、実施例3の合成を繰り返す。結果として得られたペプチドは実質的に均質であると判断され、その純度は約99パーセントであることが推定される。LSIMS分析により測定質量1602.5Daが示され、このペプチドの計算値質量である1602.8Daと一致する。このペプチドはアシリンよりも水によく溶ける。
実施例1のようにアッセイを行うことにより、このペプチドは50マイクログラムの用量で、長時間LH分泌を抑制し、96時間にわたってアシリンとほぼ同等の効果を示す。
実施例3B
D/L−Imzの代わりに過剰のD−2−イミダゾリドン−4−カルボン酸を用いて、実施例3の合成を繰り返す。結果としてペプチドAc−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(D−Imz)−D−4Aph(Ac)−Leu−ILys−Pro−D−Ala−NH2が得られる。LSIMS分析により測定質量1602.6Daが示され、これはこのペプチドの計算値質量である1602.8Daと一致する。このペプチドはアシリンよりも水に溶けやすい。
実施例1のようにアッセイを行う。このペプチドは50マイクログラムの用量で生物活性を有し、LH分泌の抑制を示す。
実施例3C
実施例1A(D−4Amf(Cbm)6を導入するため)および実施例3A(4Aph(Imz)5を導入するため)で述べられた方法を組み合わせて用いることにより、ペプチド[4Aph(Imz)5、D−4Amf(Cbm)6]−アシリンを合成する。ペプチドAc−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(L−Imz)−D−4Amf(カルバモイル)−Leu−ILys−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は98パーセント以上であることが推定される。LSIMS分析により測定質量1617.6Daが示され、このペプチドの計算値質量である1617.8Daと一致する。実施例1のようにアッセイをすることにより、このペプチドは50マイクログラムで長時間のLH分泌抑制を示す。3日間にわたってアシリンと実質的に同等の抑制を示し、96時間後ではやや優れた抑制を示す。
実施例4
ペプチド[4Aph(Hor)5、D−4Amf(MeCbm)6]−アンチドは、式Ac−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(L−ヒドロオロチル)−D−4Amf(MeCbm)−Leu−ILys−Pro−D−Ala−NH2を有し、実施例1Aで概要を述べた合成を用いて合成される。6位のD−4AmfにDMF中で過剰のt−ブチルイソシアネートを反応させる代わりに、メチルイソシアネートを反応させる。次いで、実施例1Aのようにして、デカペプチド中間体の合成を完了する。
実施例1で述べたように、ペプチド樹脂を洗浄、切断して脱保護し、精製する。ペプチドAc−D−Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(L−ヒドロオロチル)−D−4Amf(MeCbm)−Leu−ILys−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は99パーセント以上であることが推定される。LSIMS分析により測定質量1659.8Daが示され、このペプチドの計算値質量1659.8と一致する。
このペプチドをラットの標準in vivo試験でアッセイすることにより、ペプチドNo.4は、50マイクログラムでアシリンよりも良好なLH分泌抑制を示し、非常に長時間作用する生物活性を示すと考えられる。
実施例4A
無水酢酸をメチルイソシアネートの代わりに用いて実施例4の合成を繰り返し、ペプチド[4Aph(Hor)5、D−4Amf(Ac)6]−アンチドを形成する。ペプチドAc−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(L−ヒドロオロチル)−D−4Amf(Ac)−Leu−ILys−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は99パーセント以上であることが推定される。LSIMS分析により測定質量1644.5Daが示され、これはこのペプチドの計算値質量である1644.8Daと一致する。
このペプチドを実施例1のように50マイクログラムの用量でアッセイすることにより、長時間作用する生物活性が示される。LH分泌抑制は、3日間アシリンと同等で、96時間後ではアシリンよりわずかに優れていることが示される。
実施例4B
実施例1Aで合成しアッセイしたデカペプチドに変更を加えて、C末端をD−アラニルアミドの代わりにD−アラニノールとする。実施例1Aで概要を述べた合成を用いるが、Bachem.Inc社から購入可能なメリフィールド樹脂(クロロメチル化された架橋ポリスチレン)を用いて、まず、C末端に遊離酸としてプロリンを有するノナペプチド断片を合成する。切断、脱保護および精製の後、以下のノナペプチド:Ac−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(Hor)−D−4Amf(Cbm)−Leu−ILys−Pro−OHが得られる。完全に脱保護されてHPLCで精製されたノナペプチド0.15mmolを、D−アラニノール(Lancaster Chemical)3.0mmolとともに、乾燥DMF3mlに溶解する。次いで、PyBOP(Novabiochem社)0.60mmolを固体で、カップリング試薬として添加し、反応混合液を室温で30分間攪拌した。水200mlを加えて反応を冷却するとエマルジョンが得られ、このエマルジョンは、氷酢酸を用いてpHを2.5に調製することにより透明な溶液に変わった。得られたデカペプチド、Ac−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(Hor)−D−4Amf(Cbm)−Leu−ILys−Pro−D−Ala−olを、TEAP(pH2.3)を緩衝液として用いた分取RP−HPLCによって精製し、続いて0.1%TFAを緩衝液として用いてさらに精製した。得られたペプチドは実質的に均質であると判断され、その純度は99%以上であると推定される。質量スペクトル分析によって、質量1632.9Daが示され、これは計算値質量である1632.8Daと一致する。
このペプチドを実施例1のようにラットの標準in vivo試験でアッセイすることにより、50マイクログラムの用量で、このペプチドは生物活性を示し、この生物活性は少なくとも96時間持続することが示される。このペプチドは非常に作用時間が長いと考えられる。
実施例4C
D−アラニノールの代わりにL−アラニノール(Aldridge Chemical社)3.0mmolを反応混合物中に用いて、実施例4Bの合成を繰り返す。得られたデカペプチドは、実施例4Bのように精製され、実質的に均質であると判断され、約98%より大きな純度を有すると推定される。質量スペクトル分析によって、質量1632.9Daが示され、これは計算値質量である1632.8Daと一致する。
このペプチドを実施例1のようにラットの標準in vivo試験でアッセイすることにより、50マイクログラムの用量で、このペプチドは生物活性を有し、この生物活性は少なくとも96時間持続することが示される。このペプチドは非常に作用時間が長いと考えられる。
実施例4D
実施例1で合成し検査したデカペプチドに変更を加えて、C末端をD−アラニルアミドの代わりにD−アラニノールとする。メリフィールド樹脂上でSPPSを用いるが、その他は実施例1に関して概要を述べた通りにして、C末端に遊離酸としてプロリンを有するナペプチド断片を合成する。切断、脱保護、および精製の後、以下のノナペプチド:Ac−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(Hor)−D−4Aph(Cbm)−Leu−ILys−Pro−OHが得られる。次いで、実施例4Bで述べたようにして、精製されたノナペプチドをD−アラニトールとを反応させ、得られたデカペプチド、Ac−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(Hor)−D−4Aph(Cbm)−Leu−ILys−Pro−D−Ala−olを、TEAPをpH2.3の代わりにpH6.5で用いること以外は実施例4Bで述べたようにして、分取RP−HPLCを用いて精製する。得られたペプチドは、実質的に均質であると判断され、約99%以上の純度を有する。質量スペクトル分析によって、質量1618.9Daが示され、これは計算値質量1618.8Daと一致する。このペプチドをin vivoでアッセイすることにより、生物活性を有することが示される。
実施例4E
L−アラニノールをD−アラニノールの代わりに用いて、実施例4Dで述べた合成を繰り返す。得られたデカペプチド:Ac−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(Hor)−D−4Aph(Cbm)−Leu−ILys−Pro−Ala−olを、実施例4Dで述べたようにして、分取RP−HPLCを用いて精製した。得られたペプチドは、実質的に均質であると判断され、約99%以上の純度を有する。質量スペクトル分析によって、質量1618.9Daが示され、これは計算値質量1618.8Daと一致する。このペプチドをin vivoでアッセイすることにより、生物活性を有することが示される。
実施例5
実施例1Aで概要を述べた合成を用いて、式Ac−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(D−ヒドロオロチル)−D−4Amf(Cbm)−Leu−ILys−Pro−D−Ala−NH2を有するペプチド[4Aph(D−Hor)5,D−4Amf(Cbm)6]−アンチドを合成する。5位の4AphをL−ヒドロオロチン酸と反応させる代わりに、この側鎖をD−ヒドロオロチン酸と反応させる。次いで、実施例1Aのようにして、このデカペプチド中間体の合成を完了する。
次いで、実施例1で述べたようにして、ペプチド樹脂を、標準洗浄し、樹脂から切断し、脱保護し、続いて精製を行う。ペプチドAc−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(D−ヒドロオロチル)−D−4Amf(Cbm)−Leu−ILys−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は98パーセントより高いと推定される。LSIMS分析により測定された質量、1645.8Daが示され、これはこのペプチドの計算値質量である1645.8Daと一致する。
このペプチドをラットの標準のin vivo試験でアッセイすることにより、50マイクログラムの用量で、このペプチドは、アシリンとほぼ同等の2日間にわたってLH分泌を抑制する生物活性を示し、72時間後および96時間後において抑制の効果はアシリンよりいくらか少ない程度で持続している。
実施例5A
4Amfの脱保護され側鎖をt−ブチルイソシアネートと反応させる代わりにこれを無水酢酸と反応させることを除いて、実施例5の合成を繰り返す。ペプチドAc−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(D−「ヒドロオロチル)−D−4Amf(Ac)−Leu−ILys−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は99パーセントより高いと推定される。LSIMS分析により、実測質量1644.7Daが示され、これはこのペプチドの計算値質量である1644.8Daと一致する。
このペプチドを実施例1のようにアッセイして、50マイクログラムの用量で、このペプチドは、3日間にわたって実質的にアシリンと同等のLH分泌抑制があり、96時間後には、アシリンよりやや優れたLH抑制があることが示される。
実施例6
NαBoc−D−4Aph(Fmoc)の代わりにNαBoc−D−4Amf(Fmoc)を6位の残基に用いることを除いて、実施例1Fに概要を述べた合成を繰り返し、デカペプチド[4Amf(Hor)5、D−4Amf(Ac)6]−アンチドを形成する。ペプチドAc−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Amf(L−ヒドロオロチル)−D−4Amf(アセチル)−Leu−Lys(イソプロピル)−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は99パーセント以上であることが推定される。質量スペクトル分析により、質量1658.7Daが示され、これは計算値質量である1658.8Daと一致する。
ペプチドを実施例1のようにアッセイし、50マイクログラムの用量で、このペプチドはLH分泌を抑制する作用時間が長いことが分かる。その作用は最初の2日間はアシリンとほぼ同等であり、3日目から4日目にかけてはアシリンとほとんど等しい生物作用能を示す。
実施例6A
実施例1のようにD−4Amfの脱保護した側鎖を無水酢酸と反応させる代わりにこれをt−ブチルイソシアネートと反応させることを除いて、実施例6の合成を繰り返し、ペプチド[4Amf(Hor)5、D−4Amf(Cbm)6]−アンチドを形成する。デカペプチドAc−D−2Nal−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Amf(L−ヒドロオロチル)−D−4Aph(カルバモイル)−Leu−Lys(イソプロピル)−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は約99パーセントであると推定される。質量スペクトル分析によって、質量1659.6Daが示され、これは計算値質量である1659.8Daと一致する。
ペプチドを実施例1のようにアッセイし、50マイクログラムの用量で、このペプチドは、1日後ではアシリンと同等の、2日後ではアシリンとほとんど同等のLH分泌抑制活性を有する。3日後にやや活性が弱まるが、4日後でもアシリンとほぼ同等の活性が示される。
実施例6B
t−ブチルイソシアネートの代わりにメチルイソシアネートと反応させることを除いて、実施例6Aの合成を繰り返し、ペプチド[4Amf(Hor)5、D−4Amf(MeCbm)6]−アンチドを生成する。ペプチドAc−D−2Nal−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Amf(L−ヒドロオロチル)−D−4Aph(メチルカルバモイル)−Leu−Lys(イソプロピル)−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は約99パーセントであると推定される。質量スペクトル分析によって、質量1673.6Daが示され、これは計算値質量である1673.8Daと一致する。ペプチドを実施例1のようにアッセイし、50マイクログラムの用量で、このペプチドは、1日後ではアシリンと同等の、2日後ではアシリンとほぼ同等のLH分泌抑制活性を有する。3日目および4日目では、LH分泌抑制の効果はアシリンより著しく少ない程度で持続している。
実施例6C
D−ヒドロオロチン酸をL−ヒドロオロチン酸の代わりに用いて実施例6の合成を繰り返し、ペプチド[4Amf(D−Hor)5、D−4Amf(Ac)6]−アンチドを形成する。ペプチドAc−D−2Nal−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Amf(L−ヒドロオロチル)−D−4Amf(アセチル)−Leu−Lys(イソプロピル)−Pro−D−Ala−NH2が、RP−HPLC精製によって得られる。実質的に均質であると判断され、その純度は99パーセントより高いと推定される。質量スペクトル分析によって、質量1658.7Daが示され、これは計算値質量である1658.8Daと一致する。
ペプチドを実施例1のようにアッセイし、50マイクログラムの用量で、このペプチドは、1日目および2日目ではアシリンと実質的に同じ効果である。3日目では、アシリンより実質的に少ない効果が示され、その後著しく生物作用能が下がり続ける。
実施例7
実施例1から5で概要を述べた手順を用いて、以下のGnRH拮抗物質ペプチドも調製する:
[4Aph(Hor)5、D−4Amf(Cbm)6、Pro9NHCH2CH3]−アンチド
[4Aph(Hor)5、D−4Aph(Cbm)6、Pro9NHCH2CH3]−アンチド
[Acr−D−2Nal1、4FD−Phe2、4Aph(Hor)5]−アシリン
[Bz−D−2Nal1、4NO2D−Phe2、4Aph(Hor)5、D−4Aph(Hor)6]−アンチド
[For−D−2Nal1、4OCH3D−Phe2、4Amf(Hor)5、D−4Aph(D−Hor)6]−アンチド
[Acr−D−2Nal1、4BrD−Phe2、4Aph(Imz)5、D−4Aph(Imz)6]−アンチド
[Pn−D−2Nal1、4CH3D−Phe2、3Aph(D−Imz)5、D−4Aph(D−Hor)6]−アンチド
[By−D−2Nal1、3、4Cl2D−Phe2、4Aph(Hor)5、D−4Aph(Hor)6]−アンチド
[Vl−D−2Nal1、4NO2D−Phe2、4Aph(Hor)5、D−3Aph(Cbm)6]−アンチド
[Vac−D−2Nal1、CαMe4ClD−Phe2、4Aph(Hor)5、Gly10]−アシリン
[Pn−D−2Nal1、3Aph(Imz)5、D−3Amf(D−Hor)6−Agl10]−アンチド
[Acr−D−2Nal1、4Aph(Hor)5、Arg(Et2)8、D−Agl(Me)10]−アシリン
[MeCbm−D−2Nal1、4Aph(Hor)5、Arg8、Agl(Me)10]−アシリン
[Cbm−D−2Nal1,3Amf(Imz)5,Ala10]−アシリン
[EtCbm−D−2Nal1、4Amf(Hor)5、Pro9NHCH2CH3]−アシリン
[Acr−D−2Nal1、4Aph(Imz)5、D−4Amf(Cbm)6、Arg8]−アンチド
[Cbm−D−2Nal1、4Aph(MeCbm)5、D−4Amf(MeCbm)6、Arg(Et2)8]−アンチド
[4Aph(Hor)5,D−4Ahp(Imz)6,D−Alg10]−アンチド
[Ac−D−1Nal1、4Amf(Hor)5、D−4Amf(D−Hor)6、Arg8]−アンチド
[PrCbm−D−2Nal1、4Amf(Imz)5、D−4Ahp(EtCbm)6、Pro9NHCH2CH3]−アンチド
[4Amf(Hor)5、D−Lys(Nic)6、AzaGly10]−アンチド
[4Amf(Hor)5、D−Cit6、Har(Et2)8]−アンチド
[4Aph(Hor)5、D−Lys(Nic)6、D−Agl10]−アンチド
[4Aph(Hor)5、D−Hci6、Agl(Me)10]−アンチド
[4Aph(Hor)5、D−3Pal6、Har8、Agl10]−アンチド
[4Aph(Hor)5、D−4Aph(For)6、D−Agl(Me)10]−アンチド
[4Aph(Hor)5、D−4Aph(atz)6、Har(Et2)8]−アンチド
[4Aph(Hor)5、D−4Aph(iprCbm)6、D−Agl10]−アンチド
[For−D−1Nal1、4Amf(Hor)5、D−4Amf(atz)6、Gly10]−アンチド
[4Aph(D−Hor)5、D−4Aph(Cbm)6、Ala10−ol]−アンチド
これらのペプチドはLHの分泌を阻害する生物作用能を有する。
実施例8
実施例1から5、および米国特許第5、491、217号に概要を述べた手順を用いて、以下のGnRH拮抗物質ペプチドも調製する:
[NαMe4Aph(Hor)5、D−4Aph(Cbm)6]−アンチド
[NαMe4Aph(Hor)5、D−4Amf(Cbm)6]−アンチド
[NαMe4Aph(Hor)5]−アシリン
[NαMe4Aph(D−Hor)5]−アシリン
[D−4FPhe2、NαMe4Aph(Hor)5]−アシリン
[NαMe4Amf(Hor)5]−アシリン
[NαMe4Aph(Hor)5、D−4Aph(Hor)6]−アンチド
[NαMe4Aph(Hor)5、D−4Aph(D−Hor)6]−アンチド
[MeCbm−D−2Nal1、NαMe4Aph(Hor)5]−アシリン
[NαMe4Aph(Hor)5、D−3Pal6]−アンチド
[NαMe4Aph(Cbm)5、D−4Aph(Cbm)6]−アンチド
[NαMe4Aph(MeCbm)5、D−4Aph(MeCbm)6]−アンチド
[NαMe4Aph(Hor)、D−4Amf(Cbm)6、Ala10−ol]−アンチド
[NαMe4Aph(Hor)、D−4Aph(Cbm)6、D−Ala10−ol]−アンチド
[NαMe4Aph(Hor)、D−4Aph(Cbm)6、Ala10−ol]−アンチド
[NαMe4Aph(Hor)5、D−Cit6]−アンチド
[NαMe4Aph(Hor)5、D−Lys(Nic)6]−アンチド
[NαMe4Aph(D/L−Imz)5]−アシリン
[NαMe4Aph(L−Imz)5]−アシリン
[NαMe4Aph(D−Imz)5]−アシリン
[NαMe4Aph(L−Imz)5、D−4Amf(Cbm)6]−アシリン
[NαMe4Aph(Hor)5、D−4Amf(MeCbm)6]−アンチド
[NαMe4Aph(Hor)5、D−4Amf(Ac)6]−アンチド
[NαMe4Aph(Hor)、D−4Amf(Cbm)6、D−Ala10−ol]−アンチド
[NαMe4Aph(D−Hor)5、D−4Amf(Cbm)6]−アンチド
[NαMe4Aph(D−Hor)5、D−4Amf(Ac)6]−アンチド
[NαMe4Amf(Hor)5、D−4Amf(Ac)6]−アンチド
[NαMe4Amf(Hor)5、D−4Amf(Cbm)6]−アンチド
[NαMe4Amf(Hor)5、D−4Amf(MeCbm)6]−アンチド
[NαMe4Amf(D−Hor)5、D−4Amf(Ac)6]−アンチド
これらのペプチドは、LH分泌を抑制する生物作用能を有し、かつ生理的pHの水に極めて良好な溶解性を有する。
アッセイした前述の化合物は、対応するアンチドとして知られるGnRH拮抗物質ペプチドに少なくとも概ね匹敵する程度のLH抑制生物作用能を示すことが示され、これらはアンチドのアナログであると考えられる。この地域での10年にわたる熱心な検査の結果として、広く受け入れられているLH抑制測定検査で測定した生物作用能は、ゴナドトロピン分泌を抑制する、したがって有用な抗生殖効果、抗排卵効果を示す、このような化合物の能力についての証拠として受け入れられてきた。優れた溶解性、in vivoでのゲル化に対する抵抗性、長時間持続する生物活性、およびその他の特性に基づき、これらの化合物は、ゴナドトロピン分泌を抑制し、生殖腺によるステロイドの放出を阻害する抗生殖剤として(例えば抗排卵剤として)、一般的に有用であると考えられる。本発明の化合物は、薬剤学的に許容可能な、酸付加塩などの無毒性の塩の形態、または金属錯体の形態でしばしば投与される。好ましくは酢酸塩と、パモ酸(pamoicacid)の塩であるパモエートとが好ましい。薬効成分を錠剤の形態で投与した場合、その錠剤は、トラガカント、コーンスターチ、もしくはゼラチンなどの結合剤、アルギン酸などの崩壊剤、またはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤を含む、薬剤学的に許容可能な無毒性の希釈剤を含んでいてもよい。等張生理的食塩水またはリン酸緩衝液などに入れて静脈投与すると効果があるだろう。
医薬品組成物には、通常、慣用的な薬剤学的に許容可能な担体または希釈剤とともに、有効量のペプチドを含むこととする。通常、用量は、静脈投与する場合、被験体の体重1kgあたり約10マイクログラムから約2.5ミリグラムのペプチドとする。これらの化合物の性質より、経口投与も効果的なものとすることができる。しかしながら、経口での用量は多くなるであろう。総合すると、一般にこれらのペプチドによる被験者の治療は、化合物が溶解しやすい適当な担体を用い、患者のLHレベルおよびFSHレベルを抑制するのに充分な用量を投与するといった、他のGnRH拮抗物質を用いた臨床的治療と同様の方法で行う。
長時間にわたって(例えば1回の投与から、1週間から1年間にかけて)、GnRHアナログが運ばれることが望ましく、除放投与形態、貯留(depot)投与形態、または移植投与形態を利用することができる。
これらの化合物は、哺乳動物に静脈内に、皮下的に、筋肉内に、経口的に、経皮的に、鼻腔内に、肺内に、直腸内に、または腟内に投与することにより、受胎能の抑制および/または制御をすることができ、性早熟症の管理などの生殖腺活性の可逆的抑制が必用となる用途において投与したり、または放射線治療あるいは化学治療の際に投与したりできる。それらは、ステロイド依存性腫瘍の治療にも有用である。効果的な用量は、投与形態および治療される哺乳動物の特定の種類により変化する。これらの化合物は、50mg/mlの溶解性を有するものがあり、一般的にはpH5.4の溶液5〜10mg/mlとしてこれを用いることができる。ある典型的な投与形態の例は、該ペプチドを含有するpH約6の静菌水溶液であり、その溶液は、1日当たり約0.1/kg体重から2.5mg/kg体重の範囲の用量を与えるように非経口的に投与される。これらの化合物はin vivoで非常に耐性であって、ゲル化に抵抗性があると考えられる。したがって、注射点におけるゲル化の危険を伴わずに、pH約4.9、適当な濃度(約0.75mg/ml以上、さらには約1.0mg/ml以上)の約5%マンニトール静菌水溶液に入れて、皮下注射投与することに特に良く適していると考えられる。
これらのGnRH拮抗物質ペプチドは、in vivoおよびin vitroでの両方の診断にも有用である。これらのペプチドをin vivoで注射し、続いてホルモン分泌、例えばLH分泌の減少の程度を測定するために患者の血流をアッセイすることができる。in vitroアッセイを行って、ある種の腫瘍細胞がGnRHに対して感受性であるか否かを測定することができる。このようなアッセイでは、腫瘍細胞培養物をGnRH拮抗物質ペプチドで処理し、次いでホルモン分泌や細胞増殖をモニタする。
本発明は、その好ましい実施形態に関して述べてきたが、本明細書付属の請求の範囲で述べられている本発明の範囲から逸脱することなく、当技術分野における通常の技術を有する者に明らかな改変や変更をしてもよいものであることを理解しておくべきである。N末端は非置換のままでもよいし、あるいは他の等価なアシル化基を用いることもできるが、アセチル、置換カルバモイル、または非置換カルバモイルのいずれかが好ましい。5位および6位に、AphまたはD−Aphの代わりにAhpまたはD−Ahpをそれぞれ、用いることができる。Aph(Ac)の代わりに、アミノPhe基を、米国特許第5,506,207号で開示されているように、ギ酸、β−Ala(atz)、およびガンマ−アミノ酪酸(atz)などの他のアシル化剤で処理し、これにより同様に、長時間の作用を示すGnRH拮抗物質を得ることができる。したがって、得られる残基は、D−4Aph(Ac)およびL−4Aph(Ac)の等価体であると考えられる。Lys(Bu)およびLys(Et2)双方は、ILysの等価体であると考えられる。しかしながら、ILysが最も好ましい。その他の疎水性アミノ酸残基も、好ましくはD−異性体形で、1位および6位に用いることができる(前述の通り)が、これらは明細書中で述べられたものと等価体であると考えられる。
Claims (14)
- 式:X−D−Nal−(A)D−Phe−D−Pal−Ser−Xaa5−Xaa6−Leu−Xaa8−Pro−Xaa10:
(ここで、
Xは7個以下の炭素原子を有するアシル基またはQであり、ただし該QはRがHまたは低級アルキルである式−CONHRであり、
Aは4Cl、4F、4Br、4NO2、4CH3、4OCH3、3,4Cl2またはCαMe4Clであり、
Xaa5はAph(Q11)またはAmf(Q12)であり、ただし該Q11は
Xaa6はD−Aph(Q2)、D−Amf(Q2)、D−Lys(Nic)、D−CitまたはD−Palであり、ただし該Q2はAc、QまたはQ12であり、
Xaa8はLys(ipr)、Arg、Har、Arg(Et2)またはHar(Et2)であり、そして
Xaa10はD−Ala−NH2、D−Ala−ol、Ala−ol、NHCH2CH3、Gly−NH2、Ala−NH2、AzaGly−NH2、Agl−NH2、D−Agl−NH2、Agl(Me)−NH2またはD−Agl(Me)−NH2であり、
ただし、Xaa6がQを含有するときはXaa5もQを含有してもよい)
を有する、ただし式:Ac−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(L−Hor)−D−4Aph(カルバモイル)−Leu−Lys(ipr)−Pro−D−Ala−NH2を除く、GnRH拮抗物質ペプチドまたは薬剤学的に許容可能なその塩。 - Q11がL−HorまたはD−Horである、請求項1または請求項2に記載のGnRH拮抗物質ペプチド。
- XがAcであり、Xaa8がLys(ipr)であり、Xaa10がD−Ala−NH2である、請求項1から請求項3のいずれか一項に記載のGnRH拮抗物質ペプチド。
- Xaa6がD−4Aph(D−Hor)である、請求項1から請求項4のいずれか一項に記載のGnRH拮抗物質ペプチド。
- Xaa5が4Aph(L−HorまたはD−Hor)であり、Q2がQであり、RがHまたはメチルである、請求項1から請求項4のいずれか一項に記載のGnRH拮抗物質ペプチド。
- Xaa5が4Aph(L−HorまたはD−Hor)であり、Xaa6がD−Aph(Ac)またはD−3Palである、請求項1に記載のGnRH拮抗物質ペプチド。
- Xaa5が4Aph(L−HorまたはD−Hor)であり、Xaa6がD−Citである、請求項1に記載のGnRH拮抗物質ペプチド。
- Xは、For、Ac、Acr、Pn、By、Vl、Vac、BzまたはQであり、ただし該Qは請求項1で定義したものであり、
Aは4Clまたは4Fであり、
D−PalはD−3Palであり、
Xaa5はAph(Q11)またはAmf(Q12)であり、ただし該Q11又はQ12で表されるHorまたはImzは、D−異性体、L−異性体またはD/L−異性体混合物であり、
Xaa6はD−Aph(Q2)、D−Amf(Q2)、D−Cit、D−Lys(Nic)またはD−Palであり、ただし該Q2はAc、QまたはQ12であり、
Xaa8はLys(ipr)であり、そして
Xaa10はD−Ala−NH2、D−Ala−ol、Ala−ol、NHCH2CH3またはGly−NH2である、請求項1に記載のGnRH拮抗物質ペプチド。 - Q11がL−HorまたはD−Horであり、Xaa6がD−4Amf(Q)であり、RがHまたはメチルである、請求項9に記載のGnRH拮抗物質ペプチド。
- XがAcまたはQであり、RがHまたはメチルであり、Xaa6がD−4Aph(Q2)、D−Amf(Q2)またはD−3Palであり、該Q2がAc、QまたはQ12であり、Xaa10がD−Ala−NH2であることを特徴とする、請求項9に記載のGnRH拮抗物質ペプチド。
- 式:Ac−D−2Nal−D−4Cpa−D−3Pal−Ser−4Aph(L−Hor)−Xaa6−Leu−Lys(ipr)−Pro−Xaa10:(ここで、Xaa6はD−4Aph(Ac)、D−3Pal、D−4Aph(カルバモイル)、D−4Amf(カルバモイル)、D−4Amf(メチルカルバモイル)またはD−4Aph(D−Hor)であり、Xaa10はD−Ala−NH2、D−Ala−olまたはAla−olであることを特徴とする、請求項1に記載のGnRH拮抗物質ペプチド。
- Xaa6がD−4Aph(Ac)、D−4Aph(カルバモイル)またはD−4Amf(カルバモイル)である、請求項12に記載のGnRH拮抗物質ペプチド。
- 無毒性希釈剤とともに、有効成分として請求項1から請求項13のいずれか一項に記載のGnRH拮抗物質を有効量含む、哺乳動物でのゴナドトロピン分泌を抑制するための医薬品組成物。
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