CZ299097B6 - Peptid antagonizující GnRH - Google Patents

Abstract

Peptidy s prodlouženým trváním antagonistického úcinku na GnRH. Tyto antagonizující peptidy mohou být použity pro regulaci plodnosti a pro lécbu tumoru závislých na steroidech a pro další indikace krátkodobého a dlouhodobého lécení. Tyto antagonizující peptidy mají v polohách 5- nebo 5- a 6- derivát amino Phe nebo jeho ekvivalent. Tento derivát jemodifikován tak, aby obsahoval ve svém postrannímretezci karbamoylovou skupinu nebo heterocykl, vcetne mocovinové skupiny. Zvlášte úcinné dekapeptidy, které zpusobují velmi podstatné potlacení sekrece LH v 96 h po injekci mají vzorce: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Aph(acetyl)-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH.sub.2.n. a Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Amf(Q.sub.2.n.)-Leu-Lys(izopropyl)-ProXaa.sub.10.n., kdeQ.sub.2.n. je Cbm nebo MeCbm a Xaa.sub.10.n. je D-Ala-NH.sub.2.n., D-Ala-ol nebo Ala-ol.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká obecně peptidů, které jsou antagonisty lidského hormonu uvolňujícího gonadotropin (gonadotropin releasing hormone, GnRH), a které mají výhodné fyzikální, chemické a biologické vlastnosti. Vynález se zvláště týká dekapeptidů, které inhibují funkci pohlavních žláz a uvolňování steroidních hormonů progesteronu a testosteronu po delší dobu a způsobu podávání farmaceutických prostředků obsahujících tyto dekapeptidy k těmto účelům a zvláště zvládnutí stavů vzniklých v důsledku hypersekrece gonádových steroidů.

Dosavadní stav techniky

Hormon stimulující folikuly (follicle stimulating hormone, FSH) a luteinizační hormon (LH), které se někdy označují jako gonadotropiny nebo gonadotropní hormony, jsou uvolňovány podvěskem mozkovým, který je připojen stopkou k hypothalamu.

Hormon uvolňovaný vnitřním lalokem podvěsku mozkového obvykle vyžaduje předběžné uvolnění hormonů produkovaných hypotalamem, jako je dekapeptid GnRH.

Podávání analogů GnRH, které antagonizují normální funkci GnRH, bylo používáno pro potlačení sekrece gonadotropinů obecně u savců a pro potlačení opožděné ovulace.

Výzkum zlepšených anatgonistů GnRH vedl k výrobě látky Antide, tj. [Ac-D-2Nal', D-4ClPhe², D-3Pal³, Lys(Nic)⁵, D-Lys(Nic)⁶, ILys⁸, D-Ala¹⁰]-GnRH; a Cetrorelix, tj. [Ac-D-2Nal’, D-4CIPhe², D-3-Pal³, D-Cit⁶, D-Ala¹⁰]-GnRH. Patent US 5 516 887 popisuje anatgonisty GnRH, o kterých se uvádí, že jsou účinnější než látka Antide při potlačování plazmatického testosteronu; jde například o [Ac-D-2Nal^I, D-4ClPPhe², D-3Pal³, D-N⁸-karbamoyl Lys⁶, ILys⁸, D-Ala’°]-GnRH, který se označuje jako Antarelix.

Patent US 5 296 468, vydaný 22. března 1994, popisuje návrh a syntézu řady antagonistů GnRH, ve kterých byly na vedlejších řetězcích zvolených zbytků provedeny reakce pro vytvoření kyanoguanidinových skupin, z nichž některé potom spontánně přecházejí na požadovaný heterocykl, například 3-amino-l,2,4-triazol (atz). Tyto kyanoguanidinové skupiny jsou vytvořeny na omegaaminoskupině v postranním řetězci aminokyseliny, jako lyzin, omithin, 4-aminofenylalanin (4 Aph) nebo jejich verze s prodlouženým řetězcem, jako je 4-aminohomofenylalanin (4 Ahp). Látky s antagonistickým účinkem na GnRH, které obsahují tyto značně modifikované a nepřirozené aminokyseliny v polohách 5- a 6- mají dobrou biologickou účinnost, přičemž látky vytvořené na bázi Aph jsou obecně považovány za výhodnější. Jedna z těchto látek, která je zvláště výhodná, je Azaline B, tj. [Ac-D-2Nal’, D-4CIPPhc², D-3Pal³, 4Aph(atz)⁵, D-4Aph(atz)⁶, ILys⁸, D-Ala¹⁰]-GnRH. Patent US 5 506 207 popisuje biologicky účinné antagonisty GnRH, ve kterých jsou aminosubstituované postranní řetězce fenylalaninu zbytků v po45 lohách 5- a 6- acylovány; jedním zvláště účinným dekapeptidem je Acyline, tj. [Ac-D-2Nal’, D-4ClPhe², D-3Pal³, 4Ahp(ac)⁵, D-4Aph(Ac)⁶, ILys⁸, D-Ala'°]-GnRH.

Bez ohledu na přitažlivé vlastnosti této skupiny antagonistů GnRH výzkum pokračoval směrem k dalšímu zlepšení antagonistů GnRH, zvláště těch, které se vyznačují dlouhým trváním biologického působení. Často může být důležité, aby peptidový analog vykazoval dlouhodobé působení vzhledem k sekreci LH, což je vlastnost, která může být zlepšena pro indikace jak krátkodobého, tak i dlouhodobého léčení odolností peptidu na degradaci proteolytickými enzymy v těle. Navíc je považováno pro umožnění podávání těchto sloučenin savcům, zvláště člověku bez výrazného gelovatění za zvláště výhodné, aby měly tyto dekapeptidové sloučeniny

-1 CZ 299097 B6 s antagonistickým účinkem naGnRH při normálním fyziologickém pH, tj. pH přibližně 5 až přibližně pH 7,4, vysokou rozpustnost ve vodě.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že některé jiné modifikace zbytku v poloze 5- nebo zbytků v polohách 5- a 6- v této podtřídě antagonistů GnRH, ke kterým patří Cetrorelix, Antarelix, Acyline, Antide a jiné, poskytuje neočekávaně sloučeniny, které při podkožním podávání mají zvláště výhodné ío vlastnosti z hlediska dlouhodobého biologického působení. Tyto modifikace se provádějí na zbytku 4aminoPhe nebo jeho ekvivalentu 4Ahp nebo 4-aminomethylfenylalaninu(4Amf), přičemž primární aminoskupina se naváže na methylovou skupinu připojenou v poloze 4- nebo para. U těchto modifikací reaguje aminoskupina postranního řetězce s izokyanátem za vytvoření močovinové skupiny nebo reaguje s heterocyklickou karboxylovou kyselinou obsahující alespoň dva atomy dusíku uspořádané tak, aby tvořily močovinovou skupinu. Výhodnými heterocyklickými reakčními složkami jsou kyselina D- nebo L-hydroorotová (Hor), (C4N₂H₅(O)₂COOH) a kyselina D- nebo L-2-imidazolidon-4-karboxylová (Imz), (C₃N₂H₅(O)COOH).

Obecně mají dekapeptidy s antagonistickým účinkem na GnRH následující vzorec a zjišťuje se, že blízce příbuzné analogy a farmaceuticky přijatelné soli mají zlepšené farmakologické vlastnosti, zvláště dlouhé trvání biologického účinku:

X-D-Nal-ÁAjD-Phe-D-Pal-Ser-Xaaj-Xaag-Leu-Xaag-Pro-Xaaio, kde:

X je acylová skupina s až 7 atomy uhlíku nebo Q, kde Q je skupina

O —C—NHR, a kde R je H nebo nižší alkyl;

A je 4C1, 4F, 4Br, 4NO₂, 4CH₃, 4OCH₃, 3,4C1₂ nebo C“Me4Cl; Xaa₅ je Aph(Qi) nebo Amf(Qi), kde Qi je

cil

O (D- nebo L- Hor) (D- nebo L- Imz)

Xaa^je A-Aph(Q₂), D-Amf(Q₂), D-Fys(Nic), D-Cit, D-Hci nebo D-Pal, kde Q₂ je For, Ac, 3-amino-l,2,4-triazol, Q nebo Qj;

Xaa₈ je Fys(ipr), Arg, Har, Arg(Et₂) nebo Har(Et₂); a

-2CZ 299097 B6

Xaaio je D-Ala-NH₂, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH₂CH₃, Gly-NH₂, AzaGly-NH₂, Ala-NH₂,

Agl-NH₂, D-Agl-NH₂, Agl(Me)-NH₂ nebo D-Agl(Me)-NH₂, za předpokladu, že a-aminoskupina skupiny Xaa₅ může být popřípadě methylována; a dále za předpokladu, že pokud skupina Xaa₆ obsahuje D- nebo L-Hor nebo D- nebo L-Imz, Xaa₅ může jako skupinu Q, obsahovat Ac,

For nebo 3-amino-l,2,4-triazol, a pokud Xaa₆ obsahuje skupinu Q, Xaa₅ může také obsahovat skupinu Q.

V dalším provedení poskytuje vynález způsobu in vivo nebo in vitro diagnózy stavu, při kterém způsobuje GnRH nadměrnou hormonální sekreci nebo růst tumoru, kde tento způsob zahrnuje ío podávání peptidu výše popsaného typu s antagonistickým účinkem na GnRH a monitorování hormonální sekrece nebo proliferace tumorových buněk.

V ještě dalším provedení poskytuje vynález meziprodukt pro výrobu peptidu s antagonistickým účinkem na GnRH vzorce:

X'-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser(X²)-Xaa₅-Xaa_í-Leu-Lys(ipr)(X⁴)-Pr(^X⁵, kde:

X¹ je ochranná skupina a-aminoskupiny;

A je 4C1 nebo 4F;

X je H nebo ochranná skupina hydroxylové skupiny;

Xaa₅ je Aph(Qi) nebo Amf(Qi), kde Qi je D-izomer, L-izomer nebo směs D/L-izomerů látek buď

nebo

(D- nebo L- Hor) (D- nebo L· Imz)

Xaa^ je D-Aph(Q₂), D-Amf(Q₂) nebo D-Pal, kde Q₂ je Ac, Qi, karbamoyl nebo methylkarbamoyl;

X⁴ je ochranná skupina aminoskupiny labilní v kyselém prostředí; a

X⁵ je D-Ala, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl-, Agl(Me)- nebo D-Agl(Me)- navázané na pryskyřičný nosič; N(Et)- navázaný na pryskyřičný nosič; amid D-Ala, Gly nebo Ala; ethylamid; AzaGly30 NH₂; nebo OH, avšak za předpokladu, že α-aminoskupina skupiny Xaa₅ může být popřípadě methylována.

Tyto látky s antagonistickým účinkem jsou využitelné zvláště pro potlačení sekrece gonadotropinů jako regulátorů plodnosti u lidí, protože mají dlouhodobé působení, tj. podstatné potlačení sekrece LH trvá alespoň přibližně 4 dny. Mají zlepšenou rozpustnost ve vodných pufrech při hodnotách fyziologického pH a přijatelnou míru vedlejších účinků co se týče stimulace uvolňování histaminu, tj. jsou lepší než superantagonisté GnRH, které se v současnosti klinicky používají; v účinných koncentracích vykazují také minimální gelovatění po subkutánní (se) injekci. Tyto látky s antagonistickým účinkem na GnRH se také dobře chovají při anafylaktoidním testu, při kterém způsobují relativně malý pupen. V důsledku těchto vlastností jsou uvedené peptidy zvláště výhodné při podávání savcům, zvláště lidem, jako látky regulující plodnost a pro léčení patologických stavů jako jsou například předčasná puberta, nádorový růst závislý na hormonech,

-3CZ 299097 B6 bolestivá menstruace, endometrióza, tumory závislé na steroidech a jiné výše uvedené krátkodobé a dlouhodobé indikace. Tyto látky jsou použitelné také diagnosticky.

Protože jsou tyto látky s antagonistickým účinkem na GnRH snadno rozpustné v rozmezí fyziologického pH od přibližně 5 do přibližně 7,4, mohou být formulovány a podávány v koncentrované formě, zvláště při hodnotě pH mezi přibližně 5 a přibližně 7. Pro jejich polární charakter jsou zvláště vhodné pro použití v prostředcích s pomalým uvolňováním, založených na známých kopolymerech. Protože tyto látky s antagonistickým účinkem na GnRH účinně potlačují LH a FSH po dlouhou dobu, jsou také zvláště účinné pro antikoncepční působení u samců savců (s případným podáváním testosteronu) a pro léčení tumorů závislých na steroidech.

Podrobný popis vynálezu

V průběhu posledních 10 až 12 let byly do hloubky studovány zvláštní vlastnosti každého z deseti zbytků v sekvenci GnRH z hlediska vytvoření účinného antagonisty a jako výsledek těchto studií bylo zjištěno, že existují různé ekvivalentní zbytky, které mohou být zvoleny, a že substituce jednoho z těchto ekvivalentů za jiný výrazně nezhoršuje biologickou účinnost dekapeptidu s antagonistickým účinkem na GnRH. Tyto ekvivalentní substituce mohou být prováděny u antagonistů GnRH podle předkládaného vynálezu.

Nyní se například obecně přijímá, že zavedení parasubstituovaného D-Phe nebo 2,4-dichlorsubstituovaného D-Phe nebo D-C“Me4CIPhe nebo D-pentamethyl(Me₅)Phe v poloze 2podstatně zvýší aktivitu antagonisty GnRH; konkrétní totožnost substituentu kruhu má však pouze relativně menší důležitost, pokud se volí z následujících skupin: chlor, fluor, brom, nitro, methyl a alkoxy. Proto jsou tyto zbytky v poloze 2- považovány za ekvivalenty D-4CIPhe, který se na tomto místě běžně používá. Phe⁷ je považován za ekvivalent Leu⁷. N-konec je s výhodou N-acylován, s výhodou acetylem (Ac), ale také jinými acylovými skupinami s až 7 atomy uhlíku, jako je například formyl (For), akrylyl (Aer), n-propionyl (Pn), butyryl (By), valeryl (VI), vinyl30 acetyl (Vac) a benzoyl (Bz); alternativně může být modifikován substituovaným nebo nesubstituovaným karbamoylem. Za ekvivalentní jsou považovány také jiné delší acylové skupiny, které jsou však méně výhodné, α-aminoskupina v poloze zbytku 5 může být popřípadě methylována, jako se popisuje v patentu US 5 110 904, pro zvýšení rozpustnosti ve vodě, avšak taková modifikace může vést ke zkrácení doby potlačení LH a větší schopnosti histamin. C-konec je s výhodou

D-Ala-NH₂, D-Ala-ol nebo Ala-ol; avšak namísto nich mohou být použity skupiny Gly-NH₂, NHCH₂CH₃, AzaGly-NH₂, Ala-NH₂ Agl-NH₂, D-Ala-NH₂, Agl(Me)-NH₂ a D-Agl(Me)-NH₂, které jsou považovány za známé ekvivalenty. Jak bylo uvedeno výše, předkládaný vynález poskytuje skupinu antagonistů GnRH následující vzorce:

X—D—Nal-(A)D—Phe—D—Pal—Ser—Xaa₅—Xaaé—Leu—Xaag—Pro—Xaa,o a farmaceuticky přijatelné soli, kde

X je For, Ac, Aer, Pn, By, VI, Vac, Bz nebo Q,

A kde skupina Q je

O

II —C—-NHR, a kde Rje H nebo nižší alkyl;

A je 40, 4F, 4Br, 4NO₂, 4CH₃,4OCH₃, 3,4CI₂ nebo C“Me4CI;

Xaa₅ je Aph(Qj) nebo Amf(Q]), kde Qi je

-4CZ 299097 B6

HN NH

II

O il (D- nebo L- Imz) (D- nebo L- Hor)

Xaaé je D-Aph(Q₂), D-Amf(Q₂), D-Lys(Nic), D-Cit, D-Hci nebo D-Pal, kde Q₂ je For, Ac,

3- amino-l,2,4-triazol, Q nebo Qp

Xaa_g je Lys(ipr),Arg, Har, Arg(Et₂) nebo Har(Et₂); a

Xaaio je D-Ala-NH₂, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH₂CH₃, Gly-NH₂, AzaGly-NH₂, Ala-NH₂, Agl-NH₂, D-Agl-NH₂, Agl(Me)-NH₂ nebo D-Agl(Me)-NH₂, avšak za předpokladu, že aaminoskupina Xaa₅ může být popřípadě methylována.

V úzce příbuzné skupině antagonistů GnRH může mít skupina Xaa₅ buď Ac,For, nebo 3-amino1,2,4-triazol jako Qi, přičemž v tomto případě Xaa<, zahrnuje Q₂ ve formě D- nebo L-Hor nebo D nebo L-Imz.

V další blízce příbuzné skupině antagonistů GnRH, kde Xaa_ň zahrnuje Q, zahrnuje skupina Xaa₅ také skupinu Q.

Označením D-Nal se míní D-izomer alaninu, který je substituován naftylem nebo atomem β-uhlíku, tj. označovaný také β-D-Nal nebo 3-D-Nal. Skupina D-2Nal se s výhodou používá, jestliže navázání na naftalen je provedeno v poloze 2- struktury kroku; může však být také použito D-lNal, D-Cpa znamená chlor-D-Phe, a D-4ClPhe, tj. D-4Cap je výhodná skupina. D-Pal znamená D-izomer alaninu, který byl substituován skupinou pyridyl na atomu β-uhlíku; s výhodou vede toto propojení k poloze 3- pyridinového kruhu, tj. D-3Pal, (β-3-pyridyl-DAla), ačkoliv D-2Pal, (β-2-pyridyl-D-Ala), by mohl být použit namísto této skupiny také.

Označením 4Aph je míněn 4NH₂Phe, kde aminový substituent na fenylovém kruhu je v poloze

4- ; 3NH₂Phe, (3Aph), je považován v případě těchto analogů za jeho ekvivalent. Navíc se předpokládá, že 2NH₂Phe je také ekvivalentní z hlediska biologické účinnosti. Označením 4Amf je míněna skupina 4NH₂CH₂Phe, kde existuje methylenové spojení k postrannímu řetězci aminové skupiny; 3NH₂CH₂Phe, (3Amf), je považován za ekvivalent. Označení Hor nebo L—Hor znamenají L-hydroorol a označení Imz nebo L-Imz znamenají L-2-imidazolidon-3-karbonyl, přičemž každá z těchto skupin může být také použita jako D-izomer nebo směs izomerů D/L. Označení atz znamená 3-amino-l,2,4-triazol. Aph(atz) je také znám pod přesnějším chemickým názvem 4-(3'-amino-1 H-l ',2',4'-triazol-5'yl)aminofenylalanin. Název (LysfNic) znamená N⁸-nikotinoyllyzin, tj. ε-aminoskupina lyzinu je acylována 3-karboxypyridinem. Název D-Cit znamená D-izomer citrulinu a D-Hci znamená D-izomer homocitrulinu, který je také D-N^ekarbamoyllyzin. Názvy ILys nebo Lys(ipr) znamenají N^e-izopropyllyzin, kde ε-aminoskupina lyzinu je alkylována. Ala-ol znamená alaninol, tj. CH₃CH(NH₂)CH₂OH, a označení AzaGlyNH₂ znamená NHNHCONH₂. Har znamená homoarginin. Agl znamená a-aminoglycin. Označení Cbm znamená karbamoyl a MeCbm methylkarbamoyl nebo -CONHCH₃. Nižší alkyl znamená Ci až C₅, s výhodou C] až C₃ a výhodněji C, až C₂, tj. methyl(Me) nebo ethyl(Et).

Ačkoliv se pro zavedení do polohy 6- těchto antagonistů GnRH zvláště popisují výhodné D-izomery, rozumí se, že v důsledku širokého výzkumu v oboru v průběhu uplynulých dvou dekád bylo zjištěno mnoho známých ekvivalentních D-izomerů. Tyto substituce D-izomery

-5 CZ 299097 B6 mohou být kompatibilní a nemusí snižovat biologickou účinnost poskytovanou specifickými substituenty v poloze 5- uváděnými v této přihlášce a mohou být popřípadě také použity.

Výhodná podskupina antagonistů GnRH má vzorec:

X-D-Nal(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Lys(ipr)-Pro-Xaaio a patří sem i farmaceuticky přijatelné soli, přičemž:

X znamená For, Ac, Aer, Pn, By, VI, Vac, Bz nebo Q. io kde Q je skupina

O

II —C—NHR, a kde R je H nebo nižší alkyl;

A je 40 nebo 4F;

Xaa₅ je Aph(Qi) nebo Amf(Qi), kde Qi je skupina

(D- nebo L- Hor) (D- nebo L- Imz)

Xaas je D-Aph(Q₂), D-Amf(Q₂), D-Cit, D-Lys(Nic) nebo D-Pal, kde Q₂ je For, Ac,Q nebo Q₍; a

Xaa,₀ je D-Ala-NH₂, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH₂CH₃ nebo Gly-NH₂.

Další výhodnou podskupinou antagonistů GnRH jsou sloučeniny vzorce:

X-D-Nal-D-4Cpa-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Lys(ipr)-Pro-Xaa,o ajejich farmaceutiky přija25 telné soli, kde

X e Ac nebo Q, kde Q znamená

O

II —C—NHR, a kde R je H nebo methyl;

Xaa₅ je Aph(Q)i) nebo Amf(Qi), kde Qi je

-6CZ 299097 B6

(D- nebo L- Imz) (D- nebo L- Hor)

Xaa6 je D-Aph(Q₂), D-Amf(Q₂) nebo D-Pal, kde Q₂ je Ac, Q nebo Q,; a Xaaio je Da-Ala-NH₂, D-Ala-ol nebo Ala-ol.

Další výhodná podtřída antagonistů GnRH jsou sloučeniny vzorce:

MeCbm-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-Xaa₆-Leu-ILys-Pro-Xaaio a jejich farmaceuticky přijatelné soli, kde

D-Xaae je D-4Amf(Qi), D-4Aph(Qi) nebo D-3Pal, kde Qi je D-Hor nebo

O

II —C—NHR, a kde Rje H nebo nižší alkyl, s výhodou H nebo methyl;

a kde Xaaio je D-Ala-NH₂, D-Ala-ol nebo Ala-ol.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být syntetizovány klasickou syntézou peptidů v roztoku, kde tato syntéza je výhodná pro velká množství produktu. Pro získání menších množství, například méně než 1 kg, může být výhodná jejich syntéza metodou pevné fáze. Ochranné skupiny postranních řetězců jsou velmi dobře známé v oboru a s výhodou jsou zahrnuty jako část jakékoli aminokyseliny, která má zvláště reaktivní nebo labilní postranní řetězec, když se navazuje na řetězec vytvářený na pryskyřici. Tento způsob syntézy poskytuje úplně chráněný meziprodukt peptidové pryskyřice, jako je X¹-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser(X²)-Xaa5-Xaa₆-LeuFys(ipr)(X⁴)-Pro-X⁵.

Jeden příklad chemického meziproduktu, který by mohl být použit pro syntézu antagonisty GnRH, a který má požadovaný zbytek v polohách 5- a 6- obsahující hydroorotyl apod. je reprezentován vzorcem: X’-D-Nal-D-4Cpa-D-Pal-Ser(X²)-Aph(X³)-D-Aph(X³)-LeuILys(X⁴)-Pro-X⁵. Při syntéze peptidových meziproduktů tohoto vzorce a jiných analogů mohou být použity skupiny X¹ a X⁵, jak bude uvedeno dále.

X¹ je ochranná skupina α-aminoskupiny známého typu, využitelná v oboru při postupné syntéze polypeptidů a jestliže X je v požadovaném peptidovém prostředku zvláště acylová skupina, tato skupina může být použita jako ochranná skupina. Do skupiny ochranných skupin a-aminoskupin spadajících do X¹ patří (1) ochranné skupiny acylového typu, jako je formyl (For), trifluoracetyl, ftaloyl, p-toluensulfonyl (Tos), benzoyl (Bz), benzensulfonyl, dithiasukcinoyl (Dts), o-nitrofenylsulfenyl (Nps), tritylsulfenyl, o-nitrofenoxyacetyl, akrylyl (Aer), chloracetyl, acetyl (Ac) a γ-chlorbutyryl; (2) aromatické ochranné skupiny urethanového typu, například benzyloxykarbonyl (Z), fluorenylmethyloxykarbonyl (Fmoc) a substituovaný benzyloxykarbonyl,

-7CZ 299097 B6 jako je p-chlorbenzyloxykarbonyl (C1Z), p-nitrobenzyloxykarbonyl, p-brombenzyloxykarbonyl a p-methoxybenzyloxykarbonyl; (3) alifatické urethanové ochranné skupiny, jako je tercbutyloxykarbonyl (Boc), diizopropylmethoxykarbonyl, izopropyloxykarbonyl, ethoxykarbonyl a allyloxykarbonyl; (4) ochranné skupiny cykloalkylurethanového typu, jako je cyklopentyloxykarbo5 nyl, adamantyloxykarbonyl a cyklohexyloxykarbonyl; (5) ochranné skupiny thiourethanového typu, jako je fenylthiokarbonyl; (6) ochranné skupiny alkylového typu, jako je allyl (Aly), trifenylmethyl(trityl) a benzyl (Bzl); (7) trialkylsilanové skupiny, jako je trimethylsilan. Výhodnou ochrannou skupinou α-aminoskupiny je Boc.

ίο X² je ochranná skupina hydroxylového postranního řetězce Ser, např. Ac, Bz, trityl, 2,6—dichlorbenzyl (DCB) nebo benzylether (Bz) a s výhodou Bzl.

X³ je ochranná skupina postranní aminoskupiny, která se neodstraňuje, jestliže se odstraňuje ochranná skupina jiné α-aminoskupiny. Mezi ilustrativní příklady patří (1) skupiny labilní v bazickém prostředí, jako je Fmoc, nebo některé jiné ochranné skupiny stabilní ve slabě kyselém prostředí typu aromatických urethanů; (2) thiol—labilní skupiny jako je dithiasulcinoyl (Dts), který může být odstraněn nebo odštěpen thiolýzou; (3) skupiny labilní vůči hydrazinu jako je ftaloyl (Pht), který se odštěpuje hydrazinolýzou; (4) skupiny labilní vůči nukleofilním činidlům, jako je o-nitrofenylsulfenyl (Nps) apod., které se odštěpují thioacetamidem nebo slabými kyseli20 námi nebo jejich solemi; (5) fotolabilní skupiny odštěpované fotolýzou; a (6) skupiny, které je možno selektivně odstranit redukcí, jako je například Dts. Pro strategii Boc SPPS je výhodná skupina Fmoc.

X⁴ je ochranná skupina skupiny postranního řetězce primárního nebo sekundárního aminu labilní v kyselém prostředí, jako jez nebo 2C1Z.

X⁵ může být D-Ala, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl-, Agl(Me) nebo D-Agl(Me)-NH-[pryskyřičný nosič]; X⁵ může také být amid aminokyselin Gly nebo Ala nebo D-Ala, amid substituovaný nižším alkylem navázaným přímo na Pro, AzaGly-NH₂ nebo -OH (volná kyselina). Jestliže X₅ je volná kyselina, meziprodukt je nonapeptidový fragment, který je navržený pro navázání na Dnebo L-alaninol pro získání dekapeptidu, který má na C-konci alkohol.

Kritérium pro volbu ochranných skupin postranního řetězce X² až X⁴ je takové, že by ochranné skupiny měly být obecně stabilní vůči reakčním činidlům za podmínek reakce zvolené pro odstranění ochranné skupiny α-aminoskupiny (s výhodou Boc) ve všech krocích syntézy. Tyto ochranné skupiny by obecně neměly být odštěpovány za podmínek vazebných reakcí, ale mělo by být možné je odstranit po ukončení syntézy požadované sekvence aminokyselin za reakčních podmínek, které nebudou měnit peptidový řetězec. Ochranné skupiny použité na počátku pro zbytky v polohách 5- a 6- se s výhodou odstraňují a selektivní reakce se provádějí před odštěpením hotového peptidu z pryskyřice, jak bude vysvětleno dále. Jestliže se syntetizuje dekapeptidový meziprodukt jak je uvedeno výše, ochranné skupiny X³ mohou být v případě potřeby odstranitelné individuálně.

Jestliže je skupina X⁵ D-Ala-NH-[pryskyřičný nosič], D-Ala připojuje na pryskyřici BHA nebo na pryskyřici MBHA; to je podobné tomu případu, jestliže se použije na C-konci Agl nebo D-Agl. Jestliže X⁵ je N(Et)-[pryskyřičný nosič], Pro je připojen na N-alkylaminomethylovou pryskyřici (NAAM) prostřednictvím ethylamidové vazby.

Jestliže se má N-konec acylovat, je například možné použít jako ochrannou skupinu X¹ cc-ami50 noskupiny látky β-D-Nal v poloze 1- acetyl stím, že se k aminokyselině přidá před jejím navázáním na peptidový řetězec. Reakce se však s výhodou provádí s peptidovým meziproduktem navázaným na pryskyřici. Po odblokování α-aminoskupiny, zatímco zůstávají chráněné požadované skupiny postranních řetězců, se s výhodou provádí acetylace reakcí s acetanhydridem; reakce může být alternativně prováděna s kyselinou octovou v přítomnosti

-8CZ 299097 B6 diizopropyl- nebo dicyklohexylkarbodiimidu (DIC nebo DCC), nebo nějakou jinou vhodnou acylační reakcí známou v oboru. Podobný postup se provádí, jestliže je na N-konci požadovaná karbamoylová nebo substituovaná karbamoylová skupina. Jestliže se postranní řetězce aminoskupiny, u kterých byly odstraněny ochranné skupiny modifikují, přičemž zbytek je částí peptidového řetězce, reakce se může provádět s použitím vhodného izokyanátu v přítomnosti vhodné báze, například Ν,Ν-diizopropylethylaminu (DIEA), ačkoliv použití takové báze není nutné. Jestliže se požaduje přítomnost nesubstituované karbamoylové skupiny ve finálním produktu, aminový postranní řetězec s odstraněnými ochrannými skupinami může reagovat s benzylizokyanátem, p-tosylizokyanátem, trimethylsilylizokyanátem nebo terc-butylizokyanátem, přičemž poslední sloučenina je výhodná. Použitím této strategie se v průběhu odštěpování z pryskyřice odstraní t-butylová skupina, čímž se uvolní karbamoylová skupina.

Vynález také poskytuje nový způsob výroby takového antagonisty GnRH, například následujícího vzorce:

Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Al_a-NH₂, kde tento způsob zahrnuje (a) vytvoření peptidového meziproduktu vzorce: Boc-D-4Aph(X³)-LeuILys(X⁴)-Pro-X⁵, kde X³ je v alkalickém prostředí labilní, v přítomnosti hydrazinu labilní, nebo jiným způsobem vhodně labilní ochranná skupina aminoskupiny; X⁴ je ochranná skupina amino20 vého postranního řetězce labilní v kyselém prostředí; a X⁵ je D-Ala-NH-[pryskyřičný nosič]; (b) odstranění X³ z D-4Aph pro odstranění ochranné skupiny z postranního řetězce primární aminoskupiny tohoto aminokyselinového zbytku peptidového meziproduktu; (c) reakci tohoto postranního řetězce primární aminoskupiny s odstraněnou ochrannou skupinou s acetanhydridem;

(d) ukončení prodlužování řetězce za vytvoření meziproduktu X'-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal25 Ser(X²)4Aph(X³)-D^lAph(Ac)-Leu-ILys(X⁴)-Pro-X⁵, kde X¹ je atom vodíku nebo ochranná skupina α-aminoskupiny a X² je atom vodíku nebo ochranná skupiny hydroxylové skupiny Ser;

(e) odblokování α-aminoskupiny na N-konci acetylaci; (f) odstranění X³ z 4Aph a reakci primární aminové skupiny s odstraněnou ochrannou skupinou s kyselinou hydroorotovou; a (g) odštěpení jakýchkoliv zbylých ochranných skupin a/nebo odštěpení z pryskyřičného nosiče, včetně X⁵.

Konečná purifikace peptidu se provádí chromatografií a zvláště použitím RP-HPLC, jak je v oboru známo například z literatury, viz J. River a Další, J. Chromatography, 288, 303-328 (1984), a C. Miller aj. Rivier, Biopolymers (Peptide Science), 40, 265-317 (1996).

Látky s antagonistickým účinkem na GnRH podle vynálezu jsou pokládány za účinné v hladinách méně než 100 pg na kg tělesné hmotnosti, jestliže se podávají subkutánně přibližně v poledne v den proestru, pro zabránění ovulace u samic krys. Pro prodloužené potlačení ovulace může být nutné používat dávek v od přibližně 0,1 do přibližně 2,5 mg na kg tělesné hmotnosti.

Tyto látky s antagonistickým účinkem na GnRH jsou také pravidelně účinné pro zabránění spermatogeneze při podávání samcům savců a mohou tak být použity jako antikoncepční látky. Protože tyto sloučeniny budou snižovat hladiny testosteronu a tím i libido (nežádoucí důsledek u normálních, sexuálně aktivních samců), může být žádoucí podávání náhradních dávek testosteronu spolu s antagonistou GnRH, aby bylo dosaženo azoospermie při zachování libida. Tyto antagonistické látky mohou být také použity pro regulaci produkce gonadotropinů a pohlavních steroidů a pro jiné dlouhodobé nebo krátkodobé indikace jak bylo uvedeno výše a mohou být také použity ve veterinárních aplikacích jako antikoncepční prostředky pro domácí zvířata.

Peptidy poskytované vynálezem jsou zvláště rozpustné při fyziologických hodnotách pH a mohou být připraveny pro podávání jako relativně koncentrované roztoky, zvláště pro subkutánní injekce. Tyto peptidy jsou v těle dobře tolerovány a nevedou k tvorbě gelu při subkutánním podávání v účinných koncentracích. Obecně mohou být farmaceutické prostředky s obsahem těchto peptidů a vhodné farmaceuticky přijatelné pomocné látky podávány iv, ip, subkutánně apod. v dávkách mezi přibližně 0,001 mg do přibližně 2,5 mg na kg tělesné hmotnosti za den, přičemž obvykle dostačuje množství 0,5 mg/kg/den.

-9CZ 299097 B6

Vhodně chráněné aminokyseliny obsahující D- nebo L-hydroorotyl, karbamoyl a/nebo D- nebo L-imidazolinkarbonyl mohou být syntetizovány a potom použity při syntéze peptidů prodlužováním řetězce. Stejně fungující syntéza se uskutečňuje počátečním zavedením vhodně chráně5 ného zbytku Aph, D-Aph, Amf nebo D-Amf do požadované polohy v peptidovém meziproduktu, přičemž tento způsob může být alternativní laboratorní metodou, pokud se na počátku požadují pouze malá množství. Tato strategie se uskutečňuje postupným odstraňováním ochranných skupin z konkrétních zbytků (buď ihned, nebo postupně v průběhu syntézy) a potom reakcí aminoskupiny s odstraněnou ochrannou skupinou s požadovaným činidlem.

Předkládaný vynález je dále popisován na následujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Bylo zjištěno, že peptid vzorce: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-Lys(Nic)-D-Lys(Nic)-Leu20 ILys-Pro-D-Ala-NH₂ (Antide) má velmi dobré biologické vlastnosti jako antagonista GnRH stejně jako peptid, který se v současnosti označuje jako Acyline a který se odlišuje od peptidu Antide pouze v polohách 5- a 6- Nyní bylo zjištěno, že použitím těchto molekul jako výchozích látek a provedením jiných substitucí v polohách 5- a 6- nebo v poloze 5- dekapeptidu Acyline, se získají látky s antagonistickým účinkem na GnRH s prodlouženým trváním biologické účinnosti in vivo. Co se týče poloh 1 - 4 a 7 - 10, uvádí se, že látky Antide, Acyline a Azaline jsou všechny přesně stejné.

Následující dekapeptid [4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(Cbm)⁶]-Antide nebo [Ac-D-2Nal', D^4Cpa², D-3Pal³, 4Aph(Cmb)⁶, ILys⁸, D-Ala'°]-GnRH se syntetizuje technikou pevné fáze. Tento peptid má následující vzorec: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hydroorotyl)-D-4Aph(karbamoyl)-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH₂.

Přibližně 0,50 g (0,54 mmol/g) pryskyřice MBHA (Bachem) se použije na počátku a na tuto pryskyřici se v průběhu přibližně 2 h naváže Boc-chráněný D-Ala v prostředí dimethyl35 formamidu (DMF)/CH₂C1₂ s použitím přibližně 0,65 mmol derivátu Boc a diizopropylkarbodiimid (DIC) a bezvodého 1-hydroxybenztriazolu (HOBt) jako aktivačních nebo vazebných činidel. Zbytek D-Ala se navazuje n zbytek MBHA amidovou vazbou.

Po navázání každého aminokyselinového zbytku se provede promytí, odblokování a potom navázání dalšího aminokyselinového zbytku podle následujícího schématu ruční syntézy pro přibližně 0,5 až 1 g výchozí pryskyřice:

-10CZ 299097 B6

Krok	Činidla a operace	Min. doby míchání
1	Promytí methanolem (MeOH) -15 ml (2 x)	1
2	Promytí CH2CI2 (DCM) - 30 ml (3 x)	1
3	50 % TFA plus 1 % m-kresol v DCM - 25 ml (2 x)	5, 20
4	Promytí izopropylalkoholem - 20 ml (2 x)	1
5	Triethylamin 10 % v DCM - 20 ml (2 x)	2
6	Promytí v MeOH - 15 ml (2 x)	1
7	Promytí DCM 20 ml (3 x)	1
8	Boc-aminokyselina (0,5 - 1,0 mmol) a HOBt (0,5 - 1,0 mmol) v 10 - 20 ml dimethylformamidu (DMF): DCM nebo N-methylpyrrolidon (NMP) ; DCM, v závislosti na rozpustnosti konkrétní chráněné aminokyseliny, pfus DIC nebo DCC (0,5 - 1,0 mmol) v DCM	1 - 17 hod
9	Promytí MeOH 15 ml (2 x)	1
10	Promytí DCM 20 ml (3 x)	1

Výše uvedené schéma se používá pro vazbu všech aminokyselin peptidu podle vynálezu poté, co byla navázána první aminokyselina. Pro každou aminokyselinu navazovanou v průběhu syntézy se používá ochrana N“Boc. N“Boc-p-D-2Nal se připravuje v oboru známým způsobem, jak se například podrobněji popisuje v patentu US 4 234 571; tato látka je také komerčně dostupná u firmy SyntheTech, Oregon, USA. Postranní řetězec primárních aminoskupin 4Aph v poloze 5a D—4Aph v poloze 6— se chrání skupinou Fmoc. Jako ochranná skupina postranních řetězců pro Ser se s výhodou používá benzylether (Bzl); Ser však může být navazován bez ochrany postranního řetězce. N“Boc-Lys (ipr, Z) se používá pro zbytek v poloze 8-.

Po přidání D—4Aph pro zbytek v poloze 6—jako N“Boc—D-4Aph (Fmoc) je přítomen následující meziprodukt: Boc-D-4Aph (Fmoc)-Leu-Lys (ipr, Z)-Pro-D-Ala-NH-[pryskyřičný nosič MBHA], Postranní řetězec aminoskupiny v poloze 6- se potom modifikuje po prvním odstranění ochranné skupiny vedlejšího řetězce. Ochranná skupina Fmoc se odstraňuje postupným působe15 ním 25 % piperidinem v DMF (10 ml), vždy přibližně 15 min. Po promytí peptidové pryskyřice DMF se na nově uvolněnou aminoskupinu působí dvacetinásobným přebytkem terc-butylizokyanátu v DMF při pokojové teplotě po dobu přibližně 12 h nebo do ukončení reakce, přičemž kontrola se provádí ninhydridovým testem. Peptidová pryskyřice se potom standardním způsobem promyje a skupina Boc se odstraní, aby bylo možno navázat další zbytek.

- 11 CZ 299097 B6

Potom se přidá zbytek v poloze 5- jako NBoc-4Aph (Fmoc). Jeho postranní řetězec se potom zbaví ochranné skupiny jako dříve a reakce se provede s 0,10 g (0,66 mmol) kyseliny L-hydroorotové, 90 mg (0,66 mmol) HOBt a 0,66 mmol DIC ve 3 ml DMF při pokojové teplotě 8 h nebo až do ukončení reakce při sledování standardním ninhydrinovým testem. Po promytí a odstranění N“Boc se ukončí syntéza dekapeptidu postupnou reakcí s N“Boc-Ser(Bzl), N“Boc-D-3Pal, N“Boc-ACpa a N“Boc-D-2Nal.

Po odblokování α-aminoskupiny v N-konci použitím kyseliny trifluoroctové (TFA) se dosáhne acetylace použitím velkého přebytku acetanhydridu v dichlormethanu (DCM) po dobu 30 min. ío Alternativně se ochrana Fmoc skupiny 4Aph neodstraňuje, dokud se neprovede acetylace

N-konce, a potom se provede reakce s kyselinou L-hydroorotovou.

Peptidová pryskyřice se suší a po přidání anisolu (0,5 ml) jako vychytávače, se provede odštěpení peptidů z pryskyřice a odstranění ochranných skupin z postranních řetězců Ser a Lys při přibližně

0° C 15 ml HF po dobu 1,5 h, s odstraněním případně zbylé t-butylové skupiny. Po odstranění

HF ve vakuu se pryskyřice dvakrát promyje 100 ml ethyletheru. Odštěpený peptid se extrahuje

0,2 % TFA v 25 % CH3CN/H2O a potom se postup opakuje vždy s použitím 100 ml. Extrakty se spojí a lyofilizují za poskytnutí přibližně 600 mg prášku surového peptidů.

Čištění peptidů se potom provede vysoce účinnou preparativní kapalinovou chromatografií s reverzní fází (RP-HPLC), což je způsob známý v oboru, uvedený zvláště v J. Rivier a další, J. Chromatography, 288, 303-328(1984). První preparativní separace RP-HPLC používá jako pufračního systému TEAP (triethylamoniumfosfát) a konečná separace se provádí v gradientu 0,1% TFA (kyselina trifluoroctová), jak je popsáno podrobně v uvedeném článku

J. Chromatography.

Tento peptid (přibližně 30 mg) (dále označovaný jako peptid No. 1) se ukazuje použitím analýzy kapilární zónovou elektroforézou (CZE) jako v podstatě homogenní a jeho čistota se odhaduje na přibližně 98 %. Analýza aminokyselin čištěného peptidů je v souladu se vzorcem připravované struktury. Molekulová hmotnost při stanovení hmotnostní spektrometrií kapalných sekundárních iontů (liquid secondary ion mass spectrometry, LSIMS) byla zjištěna jako 1631,9 Da, což je v souladu s očekávanou hmotností tohoto peptidů 1631,8 Da.

Hydrofilnost se testuje měřením retenčního času při použití RP-HPLC s gradientem 40 % pufr B až 70 % pufr B v průběhu 30 min, přičemž pufr A je TEAP pH 7,0 a pufr B je 70 % CH₃CN a 30 % pufr A. Peptid No. 1 je hydrofílnější než Acyline, proto se eluuje dříve než Acyline. Jeho rozpustnost ve vodných pufrech při pH od přibližně 5 do přibližně 7 a jeho odolnost proti gelovatění in vivo spolu s dlouhodobou biologickou účinností při potlačení hladiny cirkulujícího LH jak bylo popsáno výše ve srovnání s jinými sloučeninami s obecně porovnatelnou biologickou účinností přispívají ke zvláštní vhodnosti této látky pro podávání podkožní injekcí.

Tento peptid se analyzuje in vivo pro stanovení jeho účinnosti při potlačování sekrece LH u krys. Měření hladin cirkulujícího LH u vykastrovaných samců krys kmene Sprague-Dawley, kterým se podkožně podává tento peptid, se provádí podle metody uvedené v C. Rivier a Další, Biol.

Reproduc., 1983, 29, 374-378. Peptidy se nejprve rozpustí při koncentraci 1,0 nebo 10 mg/ml v bakteriostatické vodě a potom se dále ředí v 0,04 M fosfátovém pufru s obsahem 0,1 % BSA. Další ředění se provádějí ve fosfátovém pufru. Peptidy se vstříknou sc 5 krysám a v metothanové anestézii se odebírají vzorky krve (300 pl). Séra (50 pl) se testují na hladiny LH v duplikátech použitím činidel poskytnutých organizací National Pituitary and Hormone Distribution Program of the NIDDK. Testy ukazují, že dávka 50 pg na krysu potlačuje v průběhu 96 hodin po injekci sekreci LH na hladiny, které jsou Daleko nižší než 50 % kontrolních hladin. Navíc jsou hladiny změřené po 96 hodinách pouze přibližně 30 % hladin LH dosažených u krys, kterým se podobně vstříkne dávka 50 pg Acylinu. Peptid No. 1 se považuje za látku s velmi dlouhým působením. Vyšetření kiys ukazuje, že peptid byl velmi dobře tolerován s žádným významným gelovatěním v místě injekce.

- 12CZ 299097 B6

Zkušenost získaná z testování velkého množství antagonistů GnRH ukazuje, že peptidy vykazující takto dlouhodobé potlačení hladin LH by při analýze in vivo u dospělých samic krys kmene Sprague-Dawley úplně blokovaly ovulaci při dávce 2,5 pg.

Příklad IA

Opakuje se syntéza popsaná v příkladu 1, přičemž N“Boc-D-4Amf (Fmoc) se nahradí za io N“Boc-D—4Aph (Fmoc). Po odstranění ochranné skupiny z postranního řetězce D-4Amf se provede reakce s t-butylizokyanátem jak bylo uvedeno dříve. Potom se stejně jako v příkladu 1 provede odštěpení pryskyřice a odstranění ochranných skupin a potom čištění. Purifikací RP-HPLC se získá peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Amf(karbamoyl)Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH2, který je podle testů v podstatě homogenní s odhadovanou čistotou vyšší než 99 %. Analýza MS ukazuje hmotnost 1 645,9 Da, která dobře souhlasí s očekávanou hmotností 1645,8 Da. Z výsledků HPLC je vidět, že tento peptid je hydrofilnější než Acyline.

Při testování tohoto peptidů ve standardním testu potlačení LH u krysy in vivo test ukazuje, že při snížení hladin LH v prvním, druhém a třetím dnu je tato sloučenina v dávce 50 pg stejně účinná jako Acyline. V čase 96 hod jsou hladiny LH pouze přibližně 25 % hladin dosahovaných u krys, kterým byl podán Acyline. Peptid No. 1A je považován za látku s velmi dlouhým působením.

Příklad 1B

Pro vytvoření analogu [4Aph(Hor)⁵]-Acyline se opakuje syntéza popsaná v příkladu 1, přičemž se použije acetanhydrid namísto t-butylizokyanátu pro reakci s postranním řetězcem v poloze 6s odstraněnou ochrannou skupinou. Odštěpení dekapeptidu z pryskyřice a odstranění ochranných skupin s následným čištěním se provádí jak bylo popsáno v příkladu 1. Čištění RP-HPLC poskytne peptid Ac-D-2NaI-D-4Cpa-D-3 Pal-Ser-4 Aph(L-hydroorotyl)-D-4Aph(acetyl)Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH2. Podle analýzy jev podstatě homogenní a jeho čistota se odhaduje na více než 99%. Analýza MS ukazuje hmotnost 1630,6 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1630,8 Da.

Testování tohoto peptidů ve standardním testu na krysách in vivo jako v příkladu 1 ukazuje, že v dávce 50 pg má peptid biologickou aktivitu a ve dnech 1 až 4 má přibližně stejnou účinnost jako Acyline. Je považován za látku s velmi dlouhou dobou působení při potlačování LH.

Příklad IC

Opakuje se syntéza uvedená v příkladu 1B, přičemž kyselina L-hydroorotová se nahradí za kyselinu D/L hydroorotovou pro vytvoření izomemích dekapeptidů. Odštěpení z pryskyřice a odstranění ochranných skupin s následným čištěním se provádí jak bylo popsáno v příkladu 1. Peptid Ac—D-2Nal—D-4Cpa-D-3Pal—Ser—4Aph(D/L—hydroorotyl)—D—4Aph(acetyl—Leu—Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 se získá čištěním RP-HPLC. Testy ukazují, že jde o homogenní směs dvou sloučenin bez dalších nečistot. Analýza MS ukazuje hmotnost 1630,6 Da, což souhlasí s vypočtenou hmotností 1630,8 Da.

Testování tohoto peptidů ve standardním testu na krysách in vivo jako v příkladu 1 ukazuje, že v dávce 50 pg má peptid biologickou účinnost přibližně stejnou jako Acyline ve dnech 1 až 4. Je považován za látku dlouhodobě snižující hladinu LH .

- 13 CZ 299097 B6

Příklad ID

Opakuje se syntéza uvedená v příkladu 1B, přičemž kyselina L-hydroorotová se nahradí za kyselinu D-hydroorotovou za vytvoření izomemího dekapeptidu. Odštěpení z pryskyřice a odstranění ochranných skupin s následným čištěním se provádí jak bylo popsáno v příkladu 1. Čištěním RP-HPLC se získá peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-hydroorotyl)D-4Aph(acetyl)-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH₂. Podle výsledků analýzy je v podstatě homogenní a jeho čistota se odhaduje na vyšší než 98 %. Analýza MS ukazuje hmotnost

1630,8 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1630,8 Da.

Testování tohoto peptidu ve standardním testu na krysách in vivo jako v příkladu 1 ukazuje, že v dávce 50 pg má peptid dlouhodobé působení při snižování hladiny LH, přičemž ve dnech 1 až 4 je přibližně stejně účinný jako Acyline.

Příklad 1E

Opakuje se syntéza popsaná v příkladu 1B s použitím N“Boc-D-4FPhe namísto N“Boc-D4ClPhe za vytvoření dekapeptidu [D-4Fphe², 4Aph(Hor)⁵]-Acyline. Odštěpení z piyskyřice a odstranění ochranných 20 skupin s následným čištěním se provádí jak bylo popsáno v příkladu 1. Peptid Ac-D-2Nal-D-4Fpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Aph(acetyl-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 se získává čištěním RP-HPLC. Podle testů je v podstatě homogenní, přičemž čistota se odhaduje na více než 99 %. Analýza MS ukazuje hmotnost 1615,1 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1614,8 Da.

Testování tohoto peptidu ve standardním testu na krysách in vivo jako v příkladu 1 ukazuje, že peptid má biologickou aktivitu v dávce 50 pg a ve dnech 1 až 4 má přibližně stejnou účinnost jako Acyline. Je považován za látku dlouhodobě snižující hladinu LH.

Příklad 1F

Opakuje se syntéza uvedená v příkladu 1B, přičemž se použije N“Boc-4Amf(Fmoc) namísto N“Boc-4Aph(Fmoc) za získání dekapeptidu [4Amf(Hor)⁵]-Acyline. Odštěpení z pryskyřice a odstranění ochranných skupin s následným čištěním se provádí jako v příkladu 1. Peptid Ac-D2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-hydroorotyl)-D-4Aph(acetyl)-Leu-Lys(izopropyl)-ProD-Ala-NH₂ se získá čištěním RP-HPLC. Analýzy ukazují, že je v podstatě homogenní a jeho čistota je více než 98 %. Analýza MS ukazuje hmotnost 1644,7 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1644,8 Da.

Testováním tohoto peptidu ve standardním testu na krysách in vivo jako v příkladu 1 ukazuje, že v dávce 50 pg má peptid biologickou účinnost a ve dnech 1 až 4 je přibližně stejně účinný jako Acyline. Je pokládán za látku dlouhodobě působící při snižování hladiny LH.

Příklad 1G

Opakuje se syntéza uvedená v příkladu 1, ale namísto reakce aminoskupiny vedlejšího řetězce D-4Aph s t-butylizokyanátem, reaguje tato skupina a zbytek 4-Aph současně s kyselinou hydro50 orotovou za vytvoření dekapeptidu [4Aph(Hor⁵), D-4Aph(Hor)⁶]-Antide. Odštěpení z pryskyřice a odstranění ochranných skupin s následným čištěním se provádí jak bylo popsáno v příkladu 1. Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Aph(L-hydroorotyl)-LeuLys(izopropyl)—Pro—D—Ala—NH₂ se získá purifíkací RP-HPLC. Podle výsledků analýz je v podstatě homogenní a jeho čistota se odhaduje na vyšší než 99 %. Analýza MS ukazuje

- 14CZ 299097 B6 hmotnost 1728,4 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1728,8 Da. Výsledky RP-HPLC ukazují, že tento peptid je hydrofilnější než Azaline B, který je zase hydrofilnější než Acyline.

Testování tohoto peptidu ve standardním testu na krysách in vivo jako v příkladu 1 ukazuje, že 5 v dávce 50 pg má peptid biologickou účinnost a ve dnech 1 až 4 je přibližně stejně účinný jako

Acyline. Je považován za látku s dlouhodobým snižováním hladiny LH.

Syntéza se opakuje s použitím N“Boc-D-4Amf(Fmoc) místo N“Boc-DXAph(Fmoc) za vytvoření dekapeptidu [4Aph(Hor)⁵, D-Amf(Hor)⁶]-Antide, který má při snižování sekrece LH obecně ío stejnou biologickou účinnost.

Příklad 1H

Opakuje se syntéza uvedená v příkladu 1; namísto reakce aminoskupiny postranního řetězce D-4Aph s t-butyl izokyanátem reaguje tato skupina s kyselinou D-hydroorotovou za poskytnutí dekapeptidu [4Aph(Hor⁵), DXAph(D-Hor)⁶]-Antide. Odštěpení z pryskyřice a odstranění ochranných skupin s následným čištěním se provádí jak bylo popsáno v příkladu 1. Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Aph(D-hydroorotyl)-Feu-Lys20 (izopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 se získává čištěním RP-HPLC. Podle výsledků měření je v podstatě homogenní ajeho čistota je odhadována na více než 98 %. Analýza MS ukazuje hmotnost 1728,7 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1728,8 Da. Výsledky RP-HPLC ukazují, že tento peptid je hydrofilnější než Azaline B, který je zase hydrofilnější než Acyline.

Testování tohoto peptidu ve standardním testu na krysách in vivo jak bylo uvedeno v příkladu 1 ukazuje, že peptid je biologicky účinný v dávce 50 pg a ve dnech 1 až 3 přibližně stejně účinný jako Acyline. Čtvrtý den je v podstatě účinnější než Acyline a považuje se za látku s velmi dlouhým působením při snižování hladiny LH.

Příklad IJ

Syntéza dekapeptidu [MeCbm-D-2Nal’, 4Aph(Hor)⁵]-Acyline se provádí jak je uvedeno v příkladu 1B; namísto odstranění ochranné skupiny Fmoc po přidání NBoc-4Aph(Fmoc), se však syntéza dekapeptidu na pryskyřici ukončí. Potom po odblokování N-konce se namísto reakce s acetanhydridem provede reakce s methyl izokyanátem za vytvoření skupiny methylkarbamoyl na N-konci. Potom se skupina Fmoc odstraní a vedlejší aminový řetězec skupiny 4Aph se ponechá reagovat s kyselinou L-hydroorotovou jako v příkladu 1B. Odštěpení z pryskyřice a odstranění ochranných skupin s následným čištěním se provádí podle popisu v příkladu 1. Peptid methylkarbamoyl-D-2Nal-D—4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-DXAph(acetyl)-LeuLys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 se získá purifikaci RP-HPLC. Podle výsledků analýzy je v podstatě homogenní a jeho čistota se odhaduje na více než 99 %. Analýza MS ukazuje hmotnost 1645,7 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1645,8 Da. Výsledky RP-HPLC ukazují, že tento peptid je hydrofilnější než Azaline B, který je zase hydrofilnější než Acyline.

Testování tohoto peptidu ve standardním testu na krysách in vivo jako v příkladu 1 ukazuje, že v dávce 50 pg má peptid biologickou účinnost a ve dnech 1 až 3 je přibližně stejně účinný jako Acyline a po 96 h je účinnější téměř o 50 %. Je považován za látku s velmi dlouhým působením při potlačení LH.

Příklad 1K

Opakuje se syntéza uvedená v příkladu 1, přičemž se použije N“Boc-D-3Pal namísto N“Boc-D55 4Aph(Fmoc) a vynechá se následující reakce s t-BuNCO za vytvoření dekapeptidu [4Aph(Hor)^s,

-15 CZ 299097 B6

D-3Pal⁶]-Antide. Odštěpení z pryskyřice, odstranění ochranných skupin a následující čištění se provádějí jak bylo popsáno v příkladu 1. Peptid acetyl-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-3Aph(Lhydroorotyl)-D-3Pal-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 se získá čištěním RP-HPLC. Podle výsledků testů je v podstatě homogenní a odhaduje se, že má čistotu více než 99 %. Analýza MS ukazuje hmotnost 1574,7 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1574,7 Da.

Testování tohoto peptidu ve standardním testu na krysách in vivo jako v příkladu 1 ukazuje, že v dávce 50 pg je peptid biologicky účinný a v průběhu 3 dnů má přibližně stejnou účinnost jako Acyline; po 96 h však potlačuje hladinu LH na hodnoty přibližně 35 % ve srovnání s Acylinem.

io Je považován za látku s velmi dlouhou dobou působení při potlačování LH.

Příklad IL

Opakuje se syntéza uvedená v příkladu 1G, přičemž se použije t-butylizokyanát namísto kyseliny hydroorotové za vytvoření dekapeptidu [4Aph(Cbm)⁵, D-4Aph(Cbm)⁶]-Antide. Odštěpení z pryskyřice a odstranění ochranných skupin s následným čištěním se provádějí jak bylo popsáno v příkladu 1. Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(karbamoyl)-D-4Aph(karbamoyl)-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 se získá čištěním RP-HPLC. Podle výsledků testů je v podstatě homogenní a čistota se odhaduje na více než 99 %. Analýza MS ukazuje hmotnost

1534,9 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1534,7 Da.

Testování tohoto peptidu standardním testem na krysách in vivo jako v příkladu 1 ukazuje, že v dávce 50 pg má peptid biologickou účinnost a v průběhu 4 dnů má přibližně stejnou účinnost jako Acyline. Je pokládán za látku s dlouhodobým potlačováním LH.

Příklad 1M

Opakuje se syntéza uvedená v příkladu 1G, přičemž se použije methylizokyanát místo kyseliny hydroorotové za poskytnutí dekapeptidu [4Aph(Cbm)⁵, D-4Aph(MeCbm)⁶]-Antide. Odštěpení z pryskyřice a odstranění ochranných skupin s následným čištěním se provádí podle popisu v příkladu 1. Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-AAph(methylkarbamoyl)-D-4Aph(methylkarbamoyl)-Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 se získá čištěním RP-HPLC. Podle výsledků testů je v podstatě homogenní a jeho čistota se odhaduje na více než 99 %. Analýza MS ukazuje hmotnost 1562,8 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1562,8 Da.

Testováním tohoto peptidu ve standardním testu na krysách in vivo jako v příkladu 1 ukazuje, že peptid má v dávce 50 pg biologickou účinnost, která je 2 dny přibližně stejná jako Acyline, ale potom začíná potlačení LH pomalu klesat.

Příklad 2

Peptid [4Aph(Hor)⁵, D-Cit⁶]-Antide, analog peptidu Cetrorelix vzorce Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-Cit-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 se syntetizuje použitím syntézy uvedené obecně v příkladu 1. Namísto N“Boc-D-4Aph, se v poloze 6- naváže N“Boc-DCit. Alternativně se v poloze 6— naváže N“Boc—D—Om(Fmoc) a prodlužování řetězce se dočasně zastaví po získání následujícího peptidového meziproduktu: Boc-D-Om(Fmoc)-Leu-Lys(ipr,

Z)-Pro-D-Ala-NH-[MBHA pryskyřičný nosič]. Aminový postranní řetězec zbytku Om se potom zbaví ochranné skupiny odstraněním Fmoc jako v příkladu 1 a k meziproduktu se přidává nadbytek t—butylizokyanátu v DMF po dobu přibližně 6 h při pokojové teplotě pro reakci postranního řetězce zbytku Om. Ukončení syntézy dekapeptidového meziproduktu se provede stejnějako v příkladu 1.

- 16CZ 299097 B6

Pryskyřice s navázaným peptidem se potom promyje, odštěpí a zbaví ochranných skupin a potom čistí jak bylo popsáno v příkladu 1. Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-Cit-Leu-lLys-Pro-D-Ala-NH₂ se získá čištěním RP-HPLC. Podle výsledků analýzy je v podstatě homogenní a jeho čistota se odhaduje na více než 99 %. Analýza LSIMS ukazuje změřenou hmotnost 1583,7 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1583,8 Da tohoto peptidu.

Tento peptid je hydrofilnější než Cetrorelix a má dlouhé trvání biologické účinnosti jako Cetrorelix při testování in vivo potlačení sekrece LH jako v příkladu 1. Okrajově má lepší potlačení ve třech dnech a podstatně lepší v 96 h.

Příklad 2A

Analog peptidu Antide, tj. [4Aph(Hor)⁵]-Antide se syntetizuje pomocí syntézy uvedené obecně 15 v příkladu 1 patentu US 5 169 935. Po navázání N“Boc-D-Lys(Fmoc) v poloze 6- se provede reakce s nadbytkem kyseliny nikotinové v DMF po odstranění ochranných skupin. Potom se naváže N“Boc-Aph(Fmoc) v poloze 5- a odstraní se ochranná skupina z aminového postranního řetězce zbytku Aph. Meziprodukt reaguje s kyselinou L-hydroorotovou v DMF a syntéza dekapeptidového meziproduktu se ukončí jako v příkladu 1.

Po standardním promytí, odštěpení z pryskyřice, odstranění ochranných skupin a čištění jak bylo popsáno v příkladu 1, se provede čištění RP-HPLC za získání peptidu Ac-D-2Nal-D^tCpa-D3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-Lys(Nic)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2. Ten je považován za hydrofilnější než Cetrorelix a má stejně dlouhé trvání biologické účinnosti při potlačování sekrece LH jako Cetrorelix.

Příklad 3

Analog [4Aph(D/L-Imz)⁵]-Acyline se syntetizuje způsobem uvedeným obecně v příkladu IB s tím rozdílem, že se použije D/L-Imz namísto L-Hor. Po odstranění ochranné skupiny z 4Aph v poloze 5- se na meziprodukt působí nadbytkem kyseliny D/L-2-imidazolidon-4-karboxylové, přibližně 90 mg HOBt a přibližně 0,66 mmol DIC v roztoku DMF přibližně 6 h při pokojové teplotě. Ukončení syntézy dekapeptidového meziproduktu se potom provede jako v příkladu 1.

Pryskyřice s navázaným peptidem se promyje, peptid se odštěpí a provede se odstranění ochranných skupin jako v příkladu!. Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3 Pal-Ser-4 Aph(D/L-2-imidazolidon-4-karbonyl)-D—4-Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH₂ se získá čištěním RP-HPLC. Podle výsledků měření jde o homogenní směs dvou sloučenin bez dalších nečistot. Analýza

LSIMS ukazuje změřenou hmotnost 1602,7 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1602,8 Da tohoto peptidu.

Testování peptidu standardním testem na krysách in vivo jako v příkladu 1 ukazuje, že v dávce 50 pg peptid dlouhodobě potlačuje sekreci LH. Okrajově má lepší potlačení ve třech dnech a v 96 hodinách než Acyline.

Příklad 3A

Opakuje se syntéza z příkladu 3 s použitím nadbytku kyseliny L-2-imidazolidon^l-karboxylové namísto D/L-lmz. Výsledný peptid je podle analýzy v podstatě homogenní a jeho čistota se odhaduje na přibližně 99%. Analýza LSIMS ukazuje změřenou hmotnost 1602,5 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností tohoto peptidu 1602,8 Da. Peptid má vyšší rozpustnost ve vodě než Acyline.

- 17CZ 299097 B6

Při testech prováděných podle příkladu 1 a v dávce 50 pg peptid dlouhodobě potlačuje sekreci LH přibližně se stejnou účinností jako Acyline v průběhu 96 h.

Příklad 3B

Opakuje se syntéza z příkladu 3 použitím nadbytku kyseliny D-2-imidazolidon^t-karboxylové namísto D/L-Imz. Tak se získá peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-AAph(Dio Imz)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2. Analýza LSIMS ukazuje změřenou hmotnost

1602,6 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností tohoto peptidu 1602,8 Da. Peptid má vyšší rozpustnost ve vodě než Acyline. Testování se provádí jako v příkladu 1. Peptid má v dávce 50 pg biologickou účinnost při potlačování vylučování LH.

Příklad 3C

Peptid [4Aph(Imz)⁵, D-4Anf(Cbm)⁶]-Acyline se syntetizuje kombinací způsobů uvedených v příkladech 1A (zavedení D-4Amf(Cbm)⁶) a 3A (zavedení 4Aph(Imz)⁵). Peptid Ac-D-2Nal-D20 4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Imz)-D^lAmf(karbamoyl)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 se získá purifikaci RP-HPLC. Podle výsledků analýzy je v podstatě homogenní a jeho čistota se odhaduje na více než 98%. Analýza LSIMS ukazuje změřenou hmotnost 1617,6 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností tohoto peptidu 1617,8 Da. Peptid se testuje jako v příkladu 1 a v dávce 50 pg vykazuje dlouhodobé potlačování sekrece LH. Je v podstatě stejný jako Acyline v průběhu tří dnů a má poněkud lepší potlačení v 96 h.

Příklad 4

Peptid [4Aph(Hor)⁵, D-4Amf(MeCbm)⁶]-Antide vzorce Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Amf(MeCbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 se syntetizuje způsobem popsaným obecně v příkladu 1A. Namísto reakce D-4Amf v poloze 6- s t-butylizokyanátem v DMF se provede reakce s methylizokyanátem. Potom se provede ukončení syntézy dekapeptidového meziproduktu jako v příkladu 1 A.

Peptid navázaný na pryskyřici se promyje, odstraní se ochranné skupiny a provede se purifikace podle popisu v příkladu 1. Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D4Amf(MeCbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 se získá čištěním RP-HPLC. Podle výsledků analýz je v podstatě homogenní a čistota se odhaduje na více než 99 %. Analýza LSIMS ukazuje změře40 nou hmotnost 1659,8 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností tohoto peptidu 1659,8 Da.

Testováním tohoto peptidu standardním testem na krysách in vivo ukazuje, že v dávce 50 pg, má peptid No. 4 lepší potlačení sekrece LH než Acyline a je považován za látku s velmi dlouhým trváním biologické účinnosti.

Příklad 4A

Opakuje se syntéza z příkladu 4 s použitím acetanhydridu namísto methylizokyanátu za vytvoření peptidu [4Aph(Hor)⁵, D-4Amf(Ac)⁶]-Antide. Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Amf(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 se získá čištěním RP-HPLC. Podle výsledků analýz je v podstatě homogenní a čistota se odhaduje na více než 99 %. Analýza LSIMS ukazuje změřenou hmotnost 1644,5 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností tohoto peptidu 1644,8 Da.

- 18CZ 299097 B6

Tento peptid se testuje jako v příkladu 1 při dávce 50 pg a dosahuje velmi dlouhého trvání biologické účinnosti. Potlačení sekrece LH je tři dny stejné jako u Acyline a v 96 h je mírně vyšší než pro Acyline.

Příklad 4B

Připravuje se modifikace dekapeptidů syntetizovaného a testovaného v příkladu 1 A, který má na C-konci D-alaninol namísto D-alanylamidu. Nejprve se syntetizuje nonapeptidový fragment, ío který má jako volnou kyselinu na C-konci prolin, s použitím syntézy popsané obecně v příkladu

IA, ale s použitím Merrifieldovy pryskyřice (chlormethylovaný zesítěný polystyren) dostupné u firmy Bachem, lne. Po odštěpení, odstranění ochranných skupin a čištění se získá následující nonapeptid: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-OH. 0,15 mmol nonapeptidu úplně zbaveného ochranných skupin a čištěného HPLC se rozpustí ve

3 ml suchého DMF spolu s 3,0 mmol D-alaninolu (Lancaster Chemical). Potom se přidá jako vazebné činidlo 0,60 mmol PyBOP (Novabiochem) jako pevné látky a reakční směs se míchá při pokojové teplotě 30 min. Reakce se ukončí přídavkem 200 ml vody za vytvoření emulze, která se převede na čirý roztok nastavením pH 2,5 s použitím ledové kyseliny octové. Získaný dekapeptid, Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-ol, byl čištěn s použitím pufru 0,1 % TFA. Získaný peptid je podle výsledků analýzy v podstatě homogenní a jeho čistota se odhaduje na více než přibližně 99 %. Analýza MS ukazuje hmotnost

1632,9 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1632,8 Da.

Testování tohoto peptidu standardním testem na krysách in vivo podle příkladu 1 ukazuje, že dávka 50 pg peptidu má biologickou účinnost a tato biologická účinnost trvá alespoň 96 h. Peptid je považován za látku s velmi dlouhým působením.

Příklad 4C

Opakuje se syntéza z příkladu 4B s použitím 3,0 mmol L-alaninolu (Aldridge Chemical) namísto D-alaninolu v reakční směsi. Získaný dekapeptid se čistí jako v příkladu 4B a podle výsledků analýz je v podstatě homogenní, přičemž odhadovaná čistotaje větší než přibližně 98 %. Analýza MS ukazuje hmotnost 1632,9 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1632,8 Da.

Testování tohoto peptidu standardním testem na krysách in vivo jako v příkladu 1 ukazuje, že dávka 50 pg peptidu je biologicky účinná a tato biologická účinnost trvá alespoň 96 h. Tento peptid je považován za látku s velmi dlouhým trváním účinku.

Příklad 4D

Připraví se modifikace dekapeptidů syntetizovaného a testovaného v příkladu 1, která má na C-konci D-alaninol namísto D-alanylamidu. Syntetizuje se nonapeptidový fragment s prolinem jako volnou kyselinou na C-konci s použitím SPPS na Merrifieldově pryskyřici, ale jinak obecně stejně jak bylo popsáno v příkladu 1. Po odštěpení, odstranění ochranných skupin a čištění se získá následující nonapeptid: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D—4Aph(Cbm)Leu-ILys-Pro-OH. Vyčištěný nonapeptid potom reaguje s D-alaninolem jako v příkladu 4B a získaný dekapeptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys50 Pro-D-Ala-ol se čistí preparativní RP-HPLC jak bylo popsáno v příkladu B s výjimkou použití TEAP při pH 6,5 namísto TEAP při pH 2,3. Získaný peptid je podle výsledků analýz v podstatě homogenní, přičemž čistota se odhaduje na více než přibližně 99%. Analýza MS ukazuje hmotnost 1618,9 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1618,8 Da.

Testování peptidu in vivo ukazuje, že peptid je biologicky účinný.

-19CZ 299097 B6

Příklad 4E

Opakuje se syntéza popsaná v příkladu 4D, přičemž se použije L-alaninol namísto D-alaninolu. Získaný dekapeptid: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D^lAph(Cbm)-Leu-ILysPro-Ala-ol, se čistí preparativní RP-HPLC jak bylo popsáno v příkladu 4D a získaný peptid se podle analýzy ukazuje jako v podstatě homogenní s čistotou odhadovanou na více než přibližně 98%. Analýza MS ukazuje hmotnost 1618,9 Da, která je v souladu s vypočtenou hmotností

1618,8 Da.

Testy peptidů in vivo ukazují na jeho biologickou účinnost.

Příklad 5

Peptid [4Aph(D-Hor)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶]-Antide, vzorce Ac-D-2Nal-D^tCpa-D-3Pal-Ser4Aph(D-hydroorotyl)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2, se syntetizuje postupem obecně popsaným v příkladu 1A. Namísto reakce 4Aph v poloze 5- s kyselinou L-hydroorotovou reaguje postranní řetězec s kyselinou D-hydroorotovou. Ukončení syntézy dekapepti20 dového meziproduktu se potom provede jako v příkladu 1 A.

Peptidová pryskyřice se potom standardním způsobem promyje, odštěpí se z pryskyřice a ochranné skupiny se odstraní a potom se provede čištění jak bylo popsáno v příkladu 1. Peptid Ac-D2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-AAph(D-hydroorotyl)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH₂ se získá čištěním RP-HPLC. Podle analýz je v podstatě homogenní a jeho čistota se odhaduje na více než 98%. Analýza LSIMS ukazuje změřenou hmotnost 1645,8 Da, která je v souladu s vypočtenou hmotností tohoto peptidů 1645,8 Da.

Testováním peptidů standardním testem na krysách in vivo ukazuje, že v dávce 50 pg má peptid dobu trvání biologické účinnosti při potlačování sekrece LH více než 2 dny, což je přibližně stejně dlouho jako Acyline a účinek pokračuje v poněkud menší míře potlačování v 72 a 96 h.

Příklad 5 A

Byla opakována syntéza z příkladu 5 s tím rozdílem, že namísto reakce postranního řetězce 4Amf zbaveného ochranné skupiny s t-butylizokyanátem reaguje tato skupina s acetanhydridem. Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-hydroorotyl)-D-4Amf(Ac)- Leu-ILys-Pro-D-AlaNH₂ se získá purifikací RP-HPLC. Podle testů je v podstatě homogenní a jeho čistota se odhaduje na více než 99%. Analýza LSIMS ukazuje změřenou hmotnost 1644,7 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností tohoto peptidů 1644,8 Da.

Peptid se testuje stejným způsobem jako v příkladu 1; v dávce 50 pg má v podstatě stejné potlačení sekrece LH jako Acyline v průběhu tří dnů; v 96 h vykazuje poněkud lepší potlačení LH než

Acyline

Příklad 6

Opakuje se syntéza uvedená obecně v příkladu 1F stím rozdílem, že se použije N“Boc-D50 4Amf(Fmoc) v poloze 6- namísto N“Boc-D-4Aph(Fmoc) za vytvoření dekapeptidu [4Amf(Hor)⁵, D-4Amf(Ac)⁶]-Antide. Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-hydroorotyl)-D-4Amf(acetyl)-Leu-Lys-(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH₂ se získá čištěním RP-HPLC. Podle výsledků testů je v podstatě homogenní a odhadovaná čistota je vyšší než 99 %. Analýza MS ukazuje hmotnost 1658,7 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1658,8 Da.

-20CZ 299097 B6

Peptid se testuje jako v příkladu 1 a bylo zjištěno, že v dávce 50 pg má dlouhé trvání účinnosti při potlačování sekrece LH. Účinnost je přibližně stejná jako u látky Acyline v průběhu prvních dvou dnů a téměř stejná jako u látky Acyline ve dnech 3 a 4.

Příklad 6A

Opakuje se syntéza podle příkladu 6 s tím rozdílem, že namísto reakce postranního řetězce io D-4Amf zbaveného ochranných skupin s acetanhydridem se provede reakce s t-butyl izokyanátem jako v příkladu 1 za vytvoření peptidů [4Amf(Hor)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶-Antide. Dekapeptid

Ac-D-2Nal-D-HCpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-hydroorotyl)-D-4Aph(karbamoyl)-Leu-Lys-(izopropylj-Pro-D-Ala-NPF se získá čištěním RP-HPLC. Tato látka je podle zjištění v podstatě homogenní, přičemž čistota je odhadována na přibližně 99 %. Analýza MS ukazuje hmotnost

1659,6 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1659,8 Da.

Peptid se testuje jako v příkladu 1, přičemž bylo zjištěno, že v dávce 50 pgje při potlačení sekrece LH stejně účinný jako Acyline po jednom dni a téměř stejně účinný po dvou dnech. Po třech dnech vykazuje poněkud menší účinnost, ale po čtyřech dnech má přibližně stejnou účinnost jako

Acyline.

Příklad 6B

Opakuje se syntéza z příkladu 6A s tím rozdílem, že reakce se provádí s methylizokyanátem namísto t-butylizokyanátu pro vytvoření peptidů [4Amf(Hor)⁵, D-4Amf(MeCbm)⁶]-Antide. Peptid Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-hydroorotyl)-D-4Aph(methylkarbamoyl)Leu-Lys(izopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 se získá čištěním RP-HPLC. Podle analýz je v podstatě homogenní a odhadovaná čistota je přibližně 99%. Analýza MS ukazuje hmotnost 1673,6 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1673,8 Da.

Peptid se testuje stejným testem jak bylo uvedeno v příkladu 1; v dávce 50 pgje při potlačování sekrece LH stejně účinný jako Acyline po jednom dni a přibližně stejně účinný po dvou dnech. Po třech a čtyřech dnech je účinek při potlačování sekrece LH podstatně nižší než u látky

Acyline.

Příklad 6C

Opakuje se syntéza podle příkladu 6 za použití kyseliny D—hydroorotové namísto kyseliny L— hydroorotové za vytvoření peptidů [4Amf(D-Hor)⁵, D-4Amf(Ac)⁶]-Antide. Peptid Ac-D-2NalD-4Cpa-D-3Pal-Ser-HAmf(D-hydroorotyl)—D-4Amf(acetyl)- Leu-Lys(izopropyl)- Pro- DAla-NH₂ se získá purifikaci RP-HPLC. Podle výsledků analýz je v podstatě homogenní a čistota se odhaduje jako více než 99%. Analýza MS ukazuje hmotnost 1658,7 Da, což je v souladu s vypočtenou hmotností 1658,8 Da.

Peptid se testuje jako v příkladu 1, přičemž v dávce 50 pg má v podstatě stejnou účinnost ve dnech 1 a 2 jako Acyline. Třetí den je podstatně méně účinný než Acyline, přičemž dále dochází ještě k významnému poklesu biologické účinnosti.

Příklad 7

Použitím způsobů uvedených obecně v příkladech 1 až 5 se také připravují následující látky s antagonistickým účinkem na GnRH:

-21 CZ 299097 B6 [4Aph(Hor)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶, Pro⁹NHCH2CH3]-Antide [4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(Cbm)⁶, Pro⁹NHCH2CH₃]-Antide [Aer- D-2Nal¹, 4FD-Phe², 4Aph(Hor⁵)]-Acyline [Bz-D-2Nal¹, 4NO2D-Phe², 4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(Hor)⁶ J-Antide [For-D-2Nal¹, 4OCH3D-Phe², 4Amf(Hor)⁵, D-4Aph(D-Hor)⁶]-Antide [Acr-D-2Nal¹, 4BrD-Phe², 4Aph(lmz)⁵, D-4Aph(lmz)⁶]-Antide [Pn-D-2Na!¹, 4CH3D-Phe², 3Aph(D-lmz)⁵, D-4Aph(D-Hor)⁶]-Antide [By-D-2Nal¹, 3,4CI2D-Phe², 4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(Hor)⁶]-Antide [VI-D-2Nal¹, 4NO2D-Phe², 4Aph(Hor)⁵, D-3Aph(Cbm)⁶]-Antide [Acr-D-2Nal¹, 4BrD-Phe², 4Aph(lmz)⁵, D-4Aph(lmz)⁶]-Antide [Vac-D-2Nal¹, C“Me4CID-Phe², 4Aph(Hor)⁵, Gly¹⁰]-Acyline [Pn-D-2Nal¹, 3Aph(lmz)⁵, D’3Amf(D-Hor)⁶-Agl¹⁰]-Antide [MeCbm-D-2Nal¹, 4Aph(Hor)⁵, Arg⁸, Agl(Me)¹⁰]-Acyline [Cbm-D-2Nal¹, 3Amf(lmz)⁵, Ala¹⁰]-Acyiine [EtCbm-D-2Nal¹, 4Amf(Hor)⁵, Pro⁹NHCH2CH₃]-Acyline [Acr-D-2Nal¹, 4Aph(lmz)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶, Arg⁸]-Antide [Cbm-D-2Nal¹, 4Aph(MeCbm)⁵, D-4Amf(MeCbm)⁶, Arg(Et₂)⁸]-Antide [4Aph(Hor)⁵, D-4Ahp(lmz)⁶, D-Agl¹⁰]-Antide [Ac-D-1Nal¹, 4Amf(Hor)⁵, D-4Amf(D-Hor)⁶, Arg⁸]-Antide [PrCbm-D-2Nal¹, 4Amf(lmz)⁵, D-4Ahp(EtCbm)^s, Pro⁹NHCH₂CH₃]-Antide [4Amf(Hor)^s, D-Lys(Nic)⁶, AzaGly¹⁰]-Antide [4Amf(Hor)^s, D-Cit⁶m Har(Et2)⁸]-Antide [4Aph(Hor)⁵, D-Lys(Nic)⁶, D-Agl¹⁰]-Antide (4Aph(Hor)⁵, D-Hci⁶, AgJ(Me)¹⁰]-Antide [4Aph(Hor)⁵, D-3Pal⁶, Har⁸, Agl¹⁰]-Antide [4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(For)^s, D-Agl(Me)¹⁰]-Antide [4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(atz)⁶, Har(Et2)⁸l-Antide [4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(iprCbm)⁶, D-Agl¹⁰]-Antide [For-D-1Nal¹, 4Amf(Hor)⁵, D-4Amf(atz)⁶, Gly¹⁰]-Antide [4Aph(D-Hor)⁵, D-4Aph(Cbm)⁶, Ala¹⁰-ol]-Antide

Tyto peptidy jsou biologicky účinné při inhibici vylučování LH.

-22CZ 299097 B6

Příklad 8

Použitím způsobů uvedených obecně v příkladech 1 až 5 a v patentu US 5 491 117 byly také připraveny následující sloučeniny s antagonistickým účinkem na GnRH:

[N“Me4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(Cbm)⁶]-Antide [N^aMe4Aph(Hor)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶]-Antide [N^aMe4Aph(Hor)⁵]-Acyline [N^aMe4Aph(D-Hor)⁵]-Acyline [D-4FPhe², N^aMe4Aph(Hor)⁵]-Acyline [N^aMe4Amf(Hor)⁵]-Acyline [N“Me4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(Hor)⁶J-Antide [N^aMe4Aph(Hor)⁵, D-4Aph(D-Hor)®j-Antide [MeCbm-D-2Nal¹, N“Me4Aph(Hor)⁵]-Acyline [N^aMe4Aph(Hor)⁵, D-3Pal⁶]-Antide [N^aMe4Aph(Cbm)⁵, D-4Aph(Cbm)⁶]-Antide [N^aMe4Aph(MeCbm)⁵, D-4Aph(MeCbm)⁶]-Antide [N“Me4Aph(Hor), D-4Amf(Cbm)⁶, AIa¹⁰-ol]-Antide [N“Me4Aph(Hor), D-4Aph(Cbm)⁶, D-Ala¹⁰-ol]-Antide [N^aMe4Aph(Hor), D-4Aph(Cbm)⁶, Ala¹⁰-ol]-Antide [N“Me4Aph(Hor)⁵, D-Cit⁶]-Antide [N^aMe4Aph(Hor)⁵, D-Lys(Nic)⁶J-Antide [N^aMe4Aph(D/L-lmz)⁵]-Acyfine [N“Me4Aph(L-lmz)^s]-Acyline [N^aMe4Aph(D-lmz)^s]-Acyline [N^aMe4Aph(L-Imz)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶]~Acyline [N°Me4Aph(Hor)⁵, D-4Amf(MeCbm)⁶]-Antide [N^aMe4Aph(Hor)⁵, D-4Amf(Ac)⁶]-Antide [N^aMe4Aph(Hor)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶, D-Ala¹⁰-ol]-Antide [N^aMe4Aph(Hor)^s, D-4Amf(Cbm)⁶]-Antide [N“Me4Aph(D-Hor)^s, D-4Amf(Ac)⁶]-Antide [N^aMe4Amf(Hor)^s, D-4Amf(Ac)⁶]-Antide [N^aMe4Amf(Hor)⁵, D-4Amf(Cbm)⁶]-Antide [N^aMe4Amf(Hor)⁵, D-4Amf(MeCbm)⁶]-Antide [N^aMe4Amf(D-Hor)⁵, D-4Amf(Ac)⁵]'Antide

-23CZ 299097 B6

Tyto peptidy jsou biologicky účinné při inhibici sekrece LH a při fyziologickém pH mají velmi dobrou rozpustnost ve vodě.

Předcházející sloučeniny ukázaly při testech biologickou schopnost potlačovat LH do míry alespoň obecně srovnatelné s odpovídajícím antagonistou GnRH, peptidem známým jako Antide, za jehož analogy jsou tyto sloučeniny pokládány. Výsledkem rozsáhlého testování v této oblasti po dobu více než deseti let byla přijata biologická účinnost stanovená tímto široce přijímaným testem měření potlačení LH jako důkaz schopnosti těchto sloučenin potlačovat vylučování gonadotropinu a tím vykazovat využitelné antigonadální antiovulační účinky. Na základě vynikající rozpustnosti, odolnosti ke tvorbě gelu in vivo, dlouhodobému biologickému působení ajiných vlastností, jsou tyto sloučeniny považovány za obecně použitelné jako antigonadální prostředky pro potlačování sekrece ,gonadotropinů a inhibici uvolňování steroidů pohlavními žlázami, například jako antiovulační prostředky.

Sloučeniny podle vynálezu se často podávají ve formě farmaceuticky přijatelných netoxických solí, jako jsou adiční soli s kyselinami, nebo kovových komplexů; formy acetátu a pamoátu a soli kyseliny pamové mohou být výhodné. Jestliže se má účinná látka podávat ve formě tablet, tableta může obsahovat farmaceuticky přijatelné netoxické ředivo, které obsahuje pojivo, jako je tragakant, kukuřičný škrob nebo želatina; dezintegrační prostředek jako je kyselina alginová;

a kluznou látku jako je stearan hořečnatý.intravenózní podávání v izotonickém roztoku, roztocích fosfátového pufru apod. je možno provádět rovněž.

Farmaceutické prostředky budou obvykle obsahovat účinné množství peptidu spolu s běžným farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředivem. Dávka bude obvykle od přibližně 10 pg do přibližně 2,5 mg peptidu na kilogram tělesné hmotnosti hostitele při intravenózním podání. Povaha těchto sloučenin může dovolovat účinné orální podávání; orální dávky by však měly být vyšší, v souhrnu se léčení pacientů těmito peptidy obecně provádí stejným způsobem jako klinické ošetření jinými antagonisty GnRH s použitím vhodného nosiče, ve kterém je sloučenina rozpustná, a podáním dostatečné dávky pro snížení hladin LH a FSH u pacienta.

Může být také žádoucí dodávat analog GnRH po delší časové úseky, například po dobu 1 týdne až 1 roku z jediného podání, a je možno použít dávkovačích forem s pomalým uvolňováním, depotních forem nebo implantátů.

Tyto sloučeniny mohou být savcům podávány intravenózně, subkutánně, intramuskulámě, orálně, perkutánně, intranazálně, intrapulmonámě, intrarektálně nebo intravaginálně pro dosažení inhibice a/nebo řízení plodnosti a také v aplikacích vyžadujících reverzibilní potlačení aktivity pohlavních žláz, jako například při zvládnutí předčasné puberty nebo v průběhu radiační terapie nebo chemoterapie. Jsou také použitelné pro léčení tumorů závislých na steroidech. Účinné dáv40 ky se budou lišit podle formy podávání a konkrétního druhu léčeného savce. Některé z těchto sloučenin mají rozpustnosti až 50 mg/ml a mohou být běžně používány v roztocích s koncentrací 5 až 10 mg/ml roztoku při pH 5,4. Jedním příkladem typické dávkovači formy je bakteriostatický vodný roztok při pH přibližně 6 s obsahem peptidu, kde tento roztok se podává parenterálně pro poskytnutí dávky v rozmezí od přibližně 0,1 do 2,5 mg/kg tělesné hmotnosti na den. Tyto slouče45 niny jsou považovány za dobře tolerované in vivo a za odolné gelovatění; jsou tedy považovány za zvláště vhodné pro podávání subkutánní injekcí ve formě bakteriostatického vodného roztoku přibližně 5 % mannitolu a pH přibližně 4,9, ve vhodných koncentracích, více než přibližně 0,75 mg/ml a dokonce více než 1,0 mg/ml, bez nebezpečí tvorby gelu v místě injekce.

Tyto peptidy s antagonistickým účinkem na GnRH jsou také použitelné diagnosticky, a to jak in vivo, tak i in vitro. Tyto peptidy mohou být podávány in vivo injekcí s následujícím testováním v krvi pacienta pro stanovení míry snížení hormonální sekrece, například sekrece LH. Mohou být prováděny testy in vitro pro zjištění, zda jsou určité tumorové buňky citlivé na GnRH. Při těchto testech se na tumorové buněčné kultury působí peptidy s antagonistickým účinkem na GnRH a monitoruje se hormonální sekrece a proliferace buněk.

-24CZ 299097 B6

Ačkoliv předkládaný vynález byl popsán na výhodných provedeních, mělo by být zřejmé, zeje možno provádět změny a modifikace zřejmé osobám s obvyklou zkušeností v oboru, aniž by došlo k odchýlení od předmětu vynálezu, který se definuje v připojených nárocích. I když může býí N-konec ponechán nesubstituovaný nebo může být použito jiných ekvivalentních acylačních skupin, výhodný je buď acetyl, nebo substituovaný nebo nesubstituovaný karbamoyl. Namísto Aph nebo D-Aph může být použit v poloze 5- a 6- Ahp, popřípadě D-Ahp. Namísto Aph(Ac) může reagovat skupina aminoPhe s alternativními acylačními činidly, jak se popisuje v patentu US 5 506 207, jako je kyselina mravenčí, Ala(atz) a kyselina gama-aminomáselná (atz), což také ío vede k antagonistům GnRH s dlouhodobým působením; získané zbytky jsou tedy považovány za ekvivalenty D- a L-^lAph(Ac). Jak Lys(Bu) tak i Lys(Et2) jsou považovány za ekvivalenty ILys; skupina ILys je však nejvýhodnější. V poloze 1- a v poloze 6- (jakje uvedeno výše) mohou být také použity jiné zbytky hydrofobních aminokyselin, s výhodou ve formě D-izomeru, které jsou považovány za ekvivalenty specifikovaných skupin.

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Peptid antagonizující GnRH vzorce:

   X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Xaa₈-Pro-Xaaio a jeho farmaceuticky přijatelné soli, kde:

   X je acylová skupina, která neobsahuje více než 7 atomů uhlíku nebo skupina Q,

   25 kde Q je skupina

   O

   II —C—NHR, a kde R je H nebo Ci-C₅ alkyl;

   A je 40, 4F, 4Br, 4NO₂, 4CH₃, 4OCH₃, 3,4C1₂ nebo C“Me4Cl;

   Xaa₅ je Aph(Qi) nebo Amf(Q!) kde Qi je skupina

   HN NH

   II

   O cII (D- nebo L- Imz) (D- nebo L- Hor)

   Xaa^ je D-Aph(Q₂), D-Amf(Q₂), D-Lys(Nic), D-Cit, D-Hci nebo D-Pal, kde Q₂ je For, Ac, 3-amino-l,2,4-triazol, skupina Q nebo Qi;

   Xaa₈ je Lys(ipr), Arg, Har, Arg(Et₂) nebo Har(Et₂); a

   Xaa_]0 je D-Ala-NH₂, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH₂CH₃, Gly-NH₂, Ala-NH₂, AzaGly-NH₂, 35 Agl-NH₂, D-Agl-NH₂, Agl(Mej-NH₂ nebo D-Agl(Me)-NH₂, avšak za předpokladu, že α-aminoskupina skupiny Xaa₃ může být popřípadě methylována; a dále za předpokladu, že jestliže Xaa^ obsahuje D- nebo L-Hor nebo D- nebo L-Imz, Xaa₅ může obsahovat Ac, For nebo

   3-amino-l,2,4-triazol jako Qi, ajestliže Xaa₆ obsahuje Q, Xaa₅ může také obsahovat Q.

   -25CZ 299097 B6
2. 2. Peptid antagonizující GnRH podle nároku 1, kde skupiny X, A a Xaa₈ jsou jak definováno v nároku 1; Q je karbamoyl nebo methylkarbamoyl;

   D-Pal je D-3Pal;

   Xaa₅ je 4Aph(Qi) nebo 4Amf(Q₁), kde Qi je

   O

   H

   NH

   C~ li nebo

   II (D- nebo L- Hor) (D- nebo L- Imz)

   Xaa^ je D-4Aph(Q₂), D-4Amf(Q₂), kde Q₂ je Q nebo D- nebo L-Hor nebo D- nebo L-Imz; za předpokladu, že jestliže Q₂ je Q, Q] může také být Q a ío Xaa_]0 je D-Ala-NH₂, D-Ala-ol nebo Ala-ol.
3. 3. Peptid antagonizující GnRH podle nároků 1 nebo 2, kde Qi je L-Hor nebo D-Hor.

   15
4. 4. Peptid antagonizující GnRH podle některého z nároků 1 až 3, kde

   X je Ac, Xaa₈ je Lys(ipr) a Xaa,₀ je D-Ala-NH₂.
5. 5. Peptid antagonizující GnRH podle některého z nároků 1 až 4, kde Xaa^ je D-4Aph(D-Hor).
6. 6. Peptid antagonizující GnRH podle některého z nároků 1 až 4, kde Xaa₅ je 4Aph(L- nebo D-Hor) aQ₂jeQaRjeH nebo methyl.
7. 7. Peptid antagonizující GnRH podle nároku 1, kde

   25 Xaa₅ je 4Aph(L— nebo D—Hor) a Xaa₆ je D-4Aph(Ac), D-4Aph(atz), nebo D—3Pal.
8. 8. Peptid antagonizující GnRH podle nároku 1, kde

   Xaa₅ je 4Aph(L- nebo D-Hor) a Xaa^ je D-Cit nebo D-Hci.

   30
9. 9. Peptid antagonizující GnRH podle nároku 1, kde:

   X je For, Ac, Aer, Pn, By, VI, Vac, Bz nebo Q, kde Q je definováno jako v nároku 1;

   A je 4C1 nebo 4F;

   D-Pal je D-3Pal;

   Xaa₅ je Aph(Q,) nebo Amf(Q,), kde Q, je D-izomer, L-izomer nebo směs D/L-izomerů buď

   35 Hor, nebo Imz;

   Xaa₆ je D-Aph(Q₂), D-Amf(Q₂), D-Cit, D-Lys(Nic) nebo D-Pal, kde Q₂ je For, Ac, Q nebo Q,; Xaa₈ je Lys(ipr); a

   -26CZ 299097 B6

   Xaa,o je D-Ala-NH₂, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH₂CH₃ nebo Gly-NH₂.
10. 10. Peptid antagonizující GnRH podle nároku 9, kde

    Q, je L- nebo D-Hor a Xaa₆ je D-4Amf(Q), kde R je H nebo methyl.
11. 11. Peptid antagonizující GnRH podle nároku 9, kde

    X je Ac nebo Q; R je H nebo methyl; Xaa^ je D-4Aph(Q₂), D-4Amf(Q₂) nebo D-3-Pal, kde Q₂ je Ac, Q nebo Q,; a Xaa,₀ je D-Ala-NH₂.

    ío
12. 12. Peptid antagonizující GnRH podle nároku 1 vzorce Ac-D-2Nal-D^t-Cpa-D-3Pal-Ser4Aph(L-Hor)-Xaa6-Leu-Lys(ipr)-Pro-Xaaio, kde Xaa₆ je D-4Aph(Ac), D-3Pal, D^tAph(karbamoyl), D-4Amf(karbamoyl), D-4Amf(methylkarbamoyl) nebo D-4Aph(D-Hor) a Xaa₁₀ je D-Ala-NH₂, D-Ala-ol nebo Ala-ol.

    15
13. 13. Peptid antagonizující GnRH podle nároku 12, kde Xaa<, je D-4Aph(Ac) nebo D-4Aph(karbamoyl) nebo D-4Amf(karbamoyl).
14. 14. Peptid antagonizující GnRH podle nároku 12 vzorce Ac-D-2Nal-D^l-Cpa-D-3Pal-Ser4Aph(L-Hor)-D-4Aph(karbamoyl)-Leu-Lys(ipr)-Pro-D-Ala-NH2.
15. 15. Farmaceutický prostředek pro inhibici sekrece gonadotropinů u savců, vyznačující se tím, že jako aktivní složku obsahuje účinné množství antagonisty GnRH podle některého z nároků 1 až 14 spolu s netoxickým ředivem.
16. 16. Meziprodukt pro výrobu peptidu antagonizujícího GnRH vzorce:

    X^]-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser(X²)-Xaa5-Xaa6-Leu-Lys(ipr)(X⁴)-Pro-X⁵, kde X¹ je ochranná skupina a-aminoskupiny;

    A je 4C1 nebo 4F;

    X² je H nebo ochranná skupina hydroxylové skupiny;

    Xaa₅ je Aph(Q,) nebo Amf(Q,), kde Q, je D-izomer, L-izomer nebo směs D/L-izomerů buď nebo (D- nebo L- Hor) (D- nebo L- Imz)

    X^aa6 j^e D—Aph(Q₂), D—Amf(Q₂) nebo D—Pal, kde Q₂ je Ac, Q,, karbamoyl nebo methylkarbamoyl;

    X⁴ je ochranná skupina aminoskupiny labilní v kyselém prostředí; a

    35 X⁵ je D-Ala-, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl-, Agl(Me)- nebo D-Agl(Me)-pryskyřičný nosič; N(Et)-pryskyřičný nosič; amid D-Ala, Gly nebo Ala; ethylamid; AzaGly-NH₂; nebo OH, avšak za předpokladu, že a-aminoskupina Xaa₅ může být popřípadě methylována.