TW505658B

TW505658B - GnRH antagonists

Info

Publication number: TW505658B
Application number: TW087106980A
Authority: TW
Inventors: Semple Graeme; Guang-Cheng Jiang
Original assignee: Ferring Bv
Priority date: 1997-04-11
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2002-10-11
Also published as: JP4249806B2; US6214798B1; NL300395I1; SK139699A3; CZ358699A3; ES2260833T3; MY114811A; CN1230442C; AU728642B2; SI1003774T1; EP1003774B1; US5925730A; CA2286190C; CZ299097B6; KR20010006233A; EE03974B1; UA58547C2; DE122009000033I2; NO2009016I2; FR09C0028I2

Description

5 6 5 Λ7 B7 五、發明説明（/ ) 本發明廣義地關於做爲人類促性腺素釋放激素 (GnRH)拮抗劑，且具有較有利之物理、化學及生物性質的肽類。更特別地，本發明關於壓制性腺功能及類固醇激素孕酮與睪甾酮釋出，達較長持續時間之十肽類，且關於爲此目的而投藥含有此等十肽類之醫藥組合物的方法，及尤其關於調控因性腺類固醇過度分泌所導致之病況的方法。發明背景促濾泡激素（FSH)與黃體生成素（LH)，有時稱爲促性腺素或促性腺激素，係由經桿部附著至下丘腦之腦垂體所釋放出◊ 由腦垂體前葉所釋出之激素，通常需要先釋放出由，腦丘下部製造之激素，例如GnRH十肽。投藥對GnRH正常功能具有拮抗作用之GnRH 類似物，一般已用於壓制哺乳動物中促性腺素之分泌，以及用於壓制或延遲排卵作用◊ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 硏究經改良之GnRH拮抗劑，已促成製得安泰得（Antide)，亦即[Ac-DJNal1，D-4ClPhe2，D-3Pal3 ，Lys(Nic)5，D_Lys(Nic)6，ILys8，D-Ala10]-GnRH ;與西曲瑞克（Cetrorelix)，亦即[Ac-D-2>Jal1，D-4ClPhe2，D-3Pal3，D-Cit6，D-Ala1()]-GiiRH。美國專利案5,5 1 6,887敘述據稱較安泰得更有效壓制血漿睪甾酮之GnRH拮抗劑，例如[八〇0-21^11，0-4ClPhe2，D-3Pal3，D-Ns-胺甲醯基 Lys6，ILys8，D- ____4_____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 505658 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ7 五、發明説明（：！）

Ala1()]-GnRH，稱之爲安塔瑞克（Antarelix)。美國專利案5,296,468，頒布於1994年3月22 曰，揭示合成許多其中所選殘基側鏈與氰基胍基部分反應，而有些後續會自發轉變爲所希望雑環，例如3-胺基-1，2,4-三唑（atz)的GnRH拮抗劑。此等氰基胍基部分係建立在胺基側鏈，例如賴胺酸、鳥胺酸、4-胺基苯丙胺酸（4Aph)或其突出鏈轉換物，例如4-胺基高苯丙胺酸（4APh)中的咢米力Π-胺基上◊ 於5-及6-位置上具有此等經顯著修飾或非天然胺基酸之GnRH拮抗劑，呈現良好的生物功效，且一般認爲該等建立在Aph上者爲較佳。其中特別較佳者爲阿沙林 B (Azaline B)，亦即[Ac-D·2NaΓ，D-4ClPhe2，D-3Pal3，4Aph(atz)5，D_4Aph(atz)6， ILys8，D-Ala1G]-GnRH。美國專利案 5,5 06,207 揭示其中位於5-及6-位置上殘基之胺基-經取代苯丙胺酸側鏈爲環化之具生物功效GnRH拮抗劑；一種特別有效之十肽爲阿賽林（Acyline)，亦即[Ac-D-2Nal!，D-4ClPhe2 ， D-3Pal3，4Aph(Ac)5，D-4Aph(Ac)6，ILys8，D-Ala10]-GnRH。無論此組GnRH拮抗劑之吸引人特性如何，仍應持續硏究其他改良GnRH拮抗劑，尤其是該等呈現長生物作用持續時間者。往往可能重要的是，肽類似體應呈現長效關於LH分泌之活性，爲一種可藉由該肽用於達短期與長期指示下，對體內蛋白分 __5 ___ 本紙張尺度適用中國國家標準（〇奶）八4規格（210\ 297公漦） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

505658 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ7 五、發明説明U ) 解性酵素分解作用具抗性而增進活性之性質。此外，爲有助於將此等化合物投藥予哺乳動物，尤其是人類，而不會顯著地膠凝化，經考慮相當有利地係，此等GnRH拮抗性十肽類於正常生理pH値，亦即約pH 5至約pH 7.4下具有高的水溶性。發明槪要現已發現，對此次類GnRH拮抗劑（包括西曲瑞克、安塔瑞克、阿賽林、安泰得等）中之5-位置殘基，或5-及6-位置殘基進行某些其他修飾作用，將意外地產生當以皮下投藥時，可呈現特別有利具有長效生物活性之特性的化合物。此等修飾作用係對4胺基Phe或其相等物4Ahp之殘基，或對其中該第一級胺基與接附於4-或對-位置上之甲基結合的4-胺基甲基苯丙胺酸（4Amf)進行。於此等修飾作用中，係將側鏈之胺基與異氰酸酯反應而形成塩基，或與含有至少2個經排列氮原子之雜環羧酸反應而構成塩部分◊較佳之雜環反應物爲D-或L-氫乳淸酸（Ho〇(C4N2H5(0)2COOH)與 D-或 L-2-咪唑啶酮-4-羧酸（Imz) (C3N2H5(0)C00H) ◊ 一般，經發現具有下式之GnRH拮抗劑十肽類，及其密切相關類似體與醫藥上可接受鹽類，具有經改良之醫藥性質，尤其是長的生物活性持續時間 X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu- «—·..— ________...........——— 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公t ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1· 505658 A1 B7 五、發明説明（9) X a a 8 - P r 〇 " X a a 1。’ 其中 * X爲具有至多7個碳原子之醯基，或爲Q，而

Q爲〇 II

-C-NHR ，且R爲Η或低碳數烷基； Α 爲 4(M、4F、4Br、4N02、4CH3、40CH3 ' 3,4C12 或 CaMe4Cl ;

Xaa5 爲 ApWQD或 AmKQi)，而（^爲 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製或 (D-或 L_ Ho〇 (D·或 L- Imz)

Xaa6 爲 D-Aph(Q2)、D-Amf(Q2) ' D-Lys(Nic)、 D-Cit、D-Hci 或 D-Pal，而（^2爲 For' Ac、3-胺基-1，2,4-三唑、Q 或 Qi ;

Xaa8 爲 Lys(ipr)、Arg、Har、Arg(Et2)或 Har(Et2);且

Xaa10 爲 D_Ala-NH2、D-Ala-ol、Ala-ol、 NHCH2CH3、Gly-NH2、AzaGly-NH2、Ala-NH2、 Agl-NH2 ' D-Agl-NH2 > Agl(Me)-NH2 ^ D- Agl(Me)- 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公漦） 5 6 5 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ7 B7 ____ 五、發明説明（JT ) NH2 〇另供選擇地，當Xaa6含有D-或L- Hor或D-或 L- Imz時，則Xaa5可能具有Ac、For或3-胺基-1，2,4-三唑做爲（^，而當又&26含有卩時，則又&心亦可能含有Q。此等拮抗劑尤其可用於壓制促性腺素分泌，及作爲人類生育力調節劑，因爲彼等呈現長的活性持續時間，亦即實質上持續壓制LH分泌達至少約4 天。彼等於水性緩衝液中於生理pH値下具有改良溶解度，且關於刺激組胺酸釋出方面具有可接受之副作用，亦即較現今於臨床上所使用之GnRH超促動劑爲佳；彼等亦於有效濃度之皮下（s〇注射時，呈現最小膠凝作用。此等GnRH拮抗劑亦於產生相對上較小水泡之擬過敏性分析中表現良好。結果，此等肽類發現尤其可用於投藥予哺乳動物，特別是人類，作爲生育力調節劑及用於治療病理病症，例如發身期早發、激素-依賴性贅瘤形成、痛經、子宮內膜組織異位形成、類固醇-依賴性腫瘤、及本文前述之其他短程與長程治療指示上。因爲此等GnRH拮抗劑於約5至約7.4之生理 PH範圍中爲可容易溶解，故彼等可特別在介於5 至約7之pH値下，經調製呈濃縮形式且以其投藥。由於彼等之極性特徵，故其特別適用於以已知共聚物爲基材之低釋出製劑中。因爲此等GnRH拮抗 ___ 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

505658 __—— 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（6 ) 劑呈現長期有效壓制LH與FSH，故彼等亦特別有效用於雄性哺乳動物之避孕處理（伴隨視需要投藥睪甾酮），及用於治療類固醇-依賴性腫瘤。較佳實施例之詳細敘述於過去10至12年期間，已深入硏究GnRH序列中（從製造出有效拮抗劑之起點開始）每1 〇個殘基之特別性質，此等硏究結果已發現到，存在各種可經選擇之相等殘基，及此等相等物其中一種對另一者之取代作用不會顯著減損十肽GnRH拮抗劑之生物功效。此類相等取代作用可於本發明之 GnRH拮抗劑中進行。例如，一般已能接受於2-位置中倂入經對位-取代之D-Phe，或經2,4二氯-取代之D-Phe或D-CaMe4ClPhe或D-五甲基（Me5)Phe殘基，可顯著增力口 GnRH拮抗劑活性；然而，環取代基之特定同一性當其係自下列：氯、氟、溴、硝基、甲基及烷氧基選出時，則相對上較不重要。因此，此類位於2-位置中中之殘基據認爲係慣常用於其中之D-4ClPhe 的相等物。Phe7據認爲與Leu7相等。N-末端較佳經醯基化，較隹經乙醯基（Α.〇，但亦經具有至多7個碳原子之醯基，例如甲醯基（Fo〇、丙烯醯基（Acr) 、正丙醯基（Pn)、丁醯基（By)、戊醯基（VI)、乙烯乙醯基（Vac)及苄醯基（Bz)醯化；另供選擇地，其可由經取代或未經取代之胺甲醯基修飾。考慮其他較 ______9____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) " 丨^--------^------1T-------- (请先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 505658 Λ7 B7 五、發明説明（1 ) 長鏈醯基，但較爲不佳。位於5-位置殘基上之α-胺基可視需要經甲基化，美國專利案5,1 10,904中所揭示，以增加於水中之可溶度，但是此項修飾可能導致LH壓制時間縮短，且導致較多潛在性組織胺釋出◊ C-末端較佳爲 D-Ala-NH2、D-Ala-ol 或 Ala- 〇1 ;然而若考慮爲已知相等物，則亦可使用〇1广 NH2、NHCH2CH3、AzaGly-NH2、Ala_NH2、Agl-NH2 、D-Agl-NH2、Agl(Me)-NH2 及 D- Agl(Me)->JH2。如前文所述，本發明經考慮提供一族由下列分子式所代表之GnRH拮抗劑： X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Xaa8-Pro-Xaa1()，及其醫藥上可接受之鹽類，其中螬 X 爲 For、Aer、Pn、By、VI、Vac' Bz 或 Q， mi Q爲〇

II

-C-NHR 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 且R爲H或低碳數烷基； A 爲 4C卜 4F、4Br、4N02、4CH3、40CH3、 3,4C12 或 CaMe4Cl ;

Xaa5 爲 Aph(Qi)或 Amf(Qi)，而（^爲 ίο 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 505658 Λ7 B7 五、發明説明（s ) 0

(D-或 L-Hor) (D-或 L-Imz)

Xaa6 爲 D-Aph(Q2)、D-Amf(Q2)、D-Lys(Nic)、 D-Cit ' D-Hci 或 D-Pal，而 Q2 爲 For、Ac、3-胺基-1，2,4_三唑 ' Q 或 Qi ;

Xaas 爲 Lys(ipr)、Arg ' Har、Arg(Et2)或 Har(Et2);且 .Xaai〇爲 D-Ala-lSfH]、D_Ala-ol、Ala-ol、 NHCH2CH3、Gly-NH2、AzaGly-NH2、Ala-NH2、 Agl-NH2、D-Agl-NH2、Agl(Me)-NH2 或 D- Agl(Me)麵 NH2 〇經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於一族密切相關之GnRH拮抗劑中，當Xaa6於分子式D -或L- Hor或D -或L- Imz中包括Q2時，

Xaa5可能具有Ac、For或3-胺基·1，2,4-三唑做爲h 〇於另一族密切相關之GnRH拮抗劑中，當Xaa6 包括Q時，則Xaa5亦包括Q。 D_Nal意指於β_碳原子上經萘基取代之丙胺酸的D-異構物，亦即，又稱之爲β-D-Nal或3-D-Nal _ 11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 505658 五、發明説明（7 ) 。較佳地，使用其中係接附至環結構上2-位置處之萘基的D-2Nal ;然而，亦可使用D-lNal。D-Cpa代表氯-D-Phe，且以D-4ClPhe，亦即D-4Cpa爲較佳。D-Pal意指業已於β-碳原子上經吡啶基取代之丙胺酸的D-異構物，亦即，又稱之爲β-D-Nal或3-D-Nal。較佳地，係鍵聯至於該吡啶環上之3-位置處 ;亦即D-3Pal (β-3-吡啶基-D-aLa)，然而亦可使用 D-2Pal (β-2-吡啶基-D-aLa)。4Aph 意指 4NH2Phe，其中該苯環上之胺基取代基係位於4-位置處； 3NH2Phe (3APh)據認爲自其此等類似體中之相等物 ◊然而，據相信從生物功效之觀點而言，2NH2Phe 亦爲相等物。4Amf意指4NH2CH2Phe，其中有一個與側鏈胺基鍵聯之亞甲基；3NH2CH2Phe (3Amf)據認爲係其相等物。Hor或L-Hor意指L-氫乳淸醯基，且Imz或L-Imz意指L-2-咪哩陡酮-4-羰基--其任 —者亦可呈D-異構物或D/L混合物使用。atz意指 3-胺基-1，2,4-三唑◊ Aph(atz)已知較正確之化學名爲4-(3'胺基-111-1’，2’，4^三唑基-5’-基）胺基苯丙胺酸。Lys(Nic)意指-菸鹼醯基賴胺酸，亦即Lys之 ε-胺基經3-羧基吡啶醯化.。D-Cit意指瓜胺酸之D-異構物，且D-Hci意指高瓜胺酸之D-異構物，亦稱爲Ε>-Νε-胺甲醯基賴胺酸。Ilys或LyS(ip〇意指Νε-異丙基賴胺酸，其中Lys之ε-胺基經烷基化◊ Ala-ol 意指丙胺醇，β卩CH3CH(NH2)CH2CH2OH，且 ___12____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公t ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 4. 505658 Λ7 五、發明説明（π ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

AzaGly-NH2意指NHNHCO>iH2。Har意指高精胺酸。Agl意指α-胺基甘胺酸。Cbm意指胺甲醯基，且 MeCbm意指甲基胺甲醯基或-CONHCH3。低碳數烷基意指Ci至C5，較佳係q至C3，且更佳係q或 C2’亦即甲基（Me)或乙基（Et)。雖特別揭示用於倂入此等GtiRH拮抗劑6-位置中之較佳D-異構物，應瞭解歷經過去二十年來，於該領域中充分硏究之結果，存在著許多已知之相等 D-異構物。此類先前技藝D-異構物取代作用可能適用，且生物功效不會受本文揭示特異5_位置取代作用影響，而可視需要的利用之。一較佳次組GnRH拮抗劑具有下列分子式： X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Lys(ipr)-Pro-XaaiQ，及其醫藥上可接受之鹽類，其中： X 爲 For、Ac、A‘er、Pn、By' VI、Vac、Bz 或 Q，而Q爲經濟部中央標準局員工消費合作社印製〇

II

C-NHR 且R爲H或低碳數烷基； A 爲 4C1 或 4F ;

Xaa5 爲 Aph(Qi)或 AmfXQi)，而 Qi 爲 __〇__丨丨一一- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公蝥） 505658 Λ7 _____B7 五、發明説明（I丨）

〇 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) N ^

〇^^N^XC-H 或 (D-或 L_ Hor) (D-或 L- Im2)

Xaa6 爲 D-Aph(Q2)、D-Amf(Q9)、n - AJ-Cit、 D-

Lys(Nic)或 D-Pal，而卩2爲 For、Ac、Q 或 Q .

Xaa8 爲 Lys(iPr) ' Arg、Har、Arg(Et2)或 Har(Et2);且 • Xaa10 爲 D-Ala-NH?、D-Ala-ol ^ Ala-ol -NHCH2CH3 或 Gly-NH2。經濟部中央標準局員工消費合作社印製又一較佳次組GnRH拮抗劑具有下列分子式： X-D-Nal-D-4Cpa-D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-LeU-LyS(ipr)-Pro-Xaa1()，及其醫藥上可接受之鹽類，其中： X爲Ac或Q，而Q爲〇

II

-C-NHR 且R爲Η或甲基；

Xaa5 爲 ApWQD或 AmfXQd，而（^爲 _____14_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 505658 Λ7 五、發明説明（p ) 人

或 (D-或 L- Hor) (D-或 L- Imz)

Xaa6 爲 D-Aph(Q2)、D-Amf(Q2)或 D-Pal，而 Q2 爲Ac、Q或Qi ;且 Xaa!。爲 D-Ala-NH2、D-Ala-ol 或 Ala-ol。另一較佳次組GnRH拮抗劑具有下列分子式： .MeCbm-D-2Nal-4Cpa-3 Pal-Ser-4 Aph( Hor)-D-Xaa^Leu-ILys-Pro-Xaai。，及其醫藥上可接受之鹽類，其中 0-又&&6爲 D-AAmfXQQ、D^ApWQi)或 D-3Pal，而 Qi 爲 D-Hor (請先閱讀背面之注意事項存填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製或

〇 II 一C-NHR 且R爲Η或低碳數烷基，較佳係Η或甲基；而其中 Xaa1()爲 D-Ala-NH2、. D-Ala-ol 或 Ala-ol。本發明化合物可藉由傳統肽溶液合成作用合成得，而此類合成作用較佳用於大量生產。爲獲得有限產量，例如少於1公斤，可較佳使用固相技術合成彼等。若任何胺基酸具有，當其偶合至建立於樹 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

505658 五、發明説明（丨3 ) 脂上之鏈時爲特別據反應性或不穩定的側鏈’則較佳併入該項技藝已熟知之側鏈保護基已作爲胺基酸之一部分。此類合成作用提供經完全保護之中間物肽基樹脂，例如又1-〇氺&1-(八）0-?1^-0邛31-3€1^(又2)-Xaa5-Xaa6-Leu-Lys(ipr)(X4)-Pro-X5 ^ 可供合成一種於5-及6-位置具有所希望，含有氫乳淸醯基或等類之殘基的GnRH拮抗劑之化學中間物實例，係由下列分子式代表：X^D-Nal-D-4Cpa-D-Phe-D-Pal-Ser(X2)-Aph(X~)-D-Aph(X3)-Lcu-ILys(X4)-Pro-X5。於合成具有此分子式之肽中間物及其他類似體時，可使用本文以下所指定之基團X1 至X5。 .X1爲一類已知可用於該項技藝中逐步驟合成多肽類之α-胺基保護基，且當所希望肽組合物中之X 特別是醯基時，可使用該基團作爲保護基。於胺基保護基中由X1所涵蓋者爲（1)醯基-類保護基，例如甲醯基（For)、三氟乙醯基、酞醯基、對-甲苯磺醯基（Tos)、苄醯基（Bz)、苯磺醯基、二硫代號拍醯基 (Dts)、鄰-硝苯氧基磺醯基（Nps)、三苯甲磺醯基、鄰-硝苯氧基乙醯基、丙烯醯基（Acr)、氯乙醯基、乙醯基（Ac)與γ-氯丁醯基；（2)芳族烏拉坦-類保護基，例如苄氧羰基（Ζ)、莽基甲氧羰基（Fmoc)與經取代之苄氧羰基如對-氯苄氧羰基（C1Z)、對-硝基苄氧親基、對-溴苄氧羰基及對-甲氧基苄氧羰基；（3)脂族 ________ 1(5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） '~^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T — 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 505658 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ7 五、發明説明（4) 烏拉坦保護基，例如第三丁氧羰基、二異丙基甲氧羰基、異丙氧羰基、乙氧羰基與烯丙氧羰基；（4)環烷基烏拉坦-類保護基，例如環戊氧羰基、金剛烷氧羰基與環己氧羰基；（5)硫代烏拉坦保護基，例如苯硫基羰基；（6)烷基-類保護基，例如烯丙基（Aly)、三苯基甲基（三苯甲基）與苄基（Bzl) ; (7)三烷基矽烷基，例如三甲基矽烷。較佳之α-胺基保護基爲Boc 〇 X2爲用於Ser之羥基側鏈之保護基，例如Ac、 Bz、三苯甲基、2,6-二氯苄基（DCB)或苄基醚（Bzl) ，且較佳爲Bzl。 X3爲用於側鏈胺基之保護基，其當α-胺基保護基或另一胺基保護基被去除時並未被去除。說明性實例包括（1)鹼-不安定基團，例如Fmoc或某些其他弱酸安定、芳族烏拉坦-類保護基；（2)硫醇-不安定基團，例如二硫代琥珀醯基（Dts)，其可藉由硫分解作用去除或裂解；（3)肼-不安定基團，例如酞醯基 (Pht)，其可藉由肼分解作用裂解；（4)親核劑-不安定基團，例如鄰-硝苯氧基磺醯基（Nps)等類，其可藉由硫乙醯胺或藉由弱酸或其鹽類裂解；（5)光-不安定基團，其可藉由光分解作用裂解；及（6)可選擇性藉由還原作用去除之基團，例如Dts。對於Boc SPPS策略而言，以Fmoc爲較佳。 X4爲用於第二級胺基側鏈基團之酸-不安定性保 ___17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 505658 五、發明説明（α) 護基，例如Z或2C1Z。 X5 可爲 D-Ala-、Gly-、Ala-、Agl-、Agl(Me)-或 D-Agl(Me)-MH-[樹脂撐體]，或N(EtH樹脂撐體]; X5亦可爲Gly或Ala或D-Ala之醯胺、或直接接附至Pro之經低碳數烷基取代之醯胺、AzaGly-NH2S -OH (自由態酸）。當X5爲自由態酸時，中間物爲經設計用以與D-或L-丙胺醇偶合而得，於C-末端具有醇之十肽的九肽片段◊ 選擇側鏈保護基X2至X4之條件爲，該保護基通常應於所選用在各合成步驟中去除心胺基保護基( 較佳爲Boc)之反應條件下，對試劑安定者。此等保護基通常不應於偶合條件下脫除，但應可於完成合成所希望胺基酸序列時，於不會改變該肽鏈之反應條件下去除。較佳係將該等最初用於5-及6-位置之保護基去除，並於將最終肽從樹脂上裂解之前，完成選擇性反應，如本文下述所解釋◊若十肽中間物係如前文所述合成得，則可希望將X3保護基各別去除。當X5基團爲D-Ala-NH-[樹脂撐體]時，則有一個醯胺鍵將D-Ala與BHA樹脂或MBHA樹脂連結 ;此與當將Agl或D-Agl用於C-末端十之個案相同。當X5基團爲N(Et)-[樹脂撐體]時，則有一個乙基醯胺鍵將Pro與N-烷胺基乙基樹脂（NAAM)連結◊ 當N-末端經乙醯化時，例如，可能使用乙醯基 ___ 18 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 505658 五、發明説明（丨u 作爲用於W立置上β-D-Nal之α-胺基的X1保護基，藉由將其於偶合至該肽鏈之前加至該胺基酸；然而，反應較佳係與肽中間物於樹脂上完成。待將α-胺基去阻斷，而所希望之側鏈基團仍保持受保護之後，較佳地藉由與乙酸酐反應而完成乙醯化作用，另供選擇地反應可與醋酸，於二異丙基或二環己基羰二亞胺（DIC或DCC)存在下，或藉由某種其他該項技藝中已知之適宜醯化反應完成。一種類似程序係當於Ν-末端希望爲胺甲醯基或經取代之胺甲醯基時完成。當經去保護之側鏈胺基進行修飾，而該殘基爲肽鏈之一部分時，則反應可使用適當異氰酸酯於適當鹼類，例如Ν，Ν-二異丙基乙胺（DIEA)(然而使用此類鹼爲視需要的）存在下完成。當於最終產物中希望存在經取代之胺甲醯基時，則可將去保護之胺基側鏈與異氰酸苄酯、對甲苯磺醯基異氰酸酯、三甲矽烷基異氰酸酯或基異氰酸第三丁酯（以後者爲較佳）反應◊使用此項策略，係於從樹脂上裂解時將該第三丁基部分去除，而留下胺甲醯基。本發明亦提供用以製造具有，例如，分子式： I- iAc-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-^lAphlAcVLeu-ILys-Pro-D-Ala-NH^ 之 GnRH 拮抗劑方法，該方法包含（a)形成具有分子式：Boc-D-4Aph(X3)-Leu-ILys(X4)-Pro-X5 之中間物肽，其中 X3爲鹼-不安定、肼-不安定或其他用於胺基之適當- ___19___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公漦） ' (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 505658 五、發明説明（（Ί ) 不安定保護基；X4爲於胺基側鏈之酸-不安定保護基；且X5爲D-Ala-NH-[樹脂撐體];(b)將X3從D-4 Aph移除以將此中間物肽之胺基酸殘基的側鏈第一級胺基去保護；（c)將此已去保護之側鏈第一級胺基與醋酸酐反應；（d)完成鏈增長作用而產生中間物 X^D-Nal-D^Cpa-D-Phe-D-Pal-SerCX^-AphCX^-D-Aph(X3)-LeiMLys(X4)-Pr〇-X5，其中 X1 爲氫或 α-胺基保護基，且X2爲氫或用於Ser之羥基之保護基； (幻將位於N-末端之α-胺基去保護並進行乙醯化作用；（0將X3從4Aph移除並將此已去保護之第一級胺基與氫乳淸酸反應；以及（g) ◊將任何殘餘之保護基從包含於X5中之樹脂撐體脫除且/或裂解除。 .該肽之最終純化係藉由層析術，且較佳係藉由使用該項技藝中已知之RP-HPLC完成，參見J.力費爾（Rivier)等人，層析術期刊，288 ， 303-328 (1984)，C·米勒（Miller)與 J·力費爾（Rivier)，半物聚金金_(胜肽科學），扭，265-3 1 7 (1996)。本發明之GnRH拮抗劑據認爲當以皮下於求偶前期之日約中午時，以少於1〇〇毫克每公斤體重之量投藥，可有效防止雌性大鼠排卵◊爲長期壓制排卵作用，可能需要使用範圍從約0.1至約2.5毫克每公斤體重之劑量。該等拮抗劑當以正常基準量投藥予雄性哺乳動物時，亦有效遏制精子生成，而因此可用做爲避孕劑。因爲此等化合物會減低睪甾酮 ____20___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

505658 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ7 五、發明説明（A ) 濃度，且因此導致性慾減低（爲正常、具性活性之雄性中所不希望的結果），故可希望將替代性睪甾酮與GnRH拮抗劑共同投藥，以達到精子缺乏而同時保持性慾。此等拮抗劑亦可用於調節促性腺激素與性類固醇產量，及用於前文所述其他短程與長程治療指示上，且彼等可用於獸醫學應用上作爲寵物之避孕劑。本發明所提供之肽類於生理pH値下尤其可溶，且可製備呈相對上較濃縮之投藥用（特別是皮下注射用）溶液。此等肽類於體內相當具耐受性，且當其以有效濃度進行皮下注射時不易膠凝。通常，包含此等肽類與適宜醫藥上可接受賦形劑之醫藥組合物可經iv、ip、皮下或類似方式，以約0.001毫克至約2.5毫克每公斤體重每天之量投藥，而一般以0.5毫克/公斤/天即已足夠。可合成得經適當保護之含D -或L -氫乳淸醯基、含胺甲醯基及/或含D-或L-咪唑啶酮-羰基胺基酸，然後將其用於鏈增長肽合成作用中。然而一種同樣有效之合成作用係藉由首先將經適當保護之Aph、 D-Aph、Amf或D-Amf殘基倂入位於該肽中間物中所希望位置處，而此可能爲所選最初僅希望少量之實驗室方法◊此後者策略係藉由後續將特別殘基（於合成期間立即或依次）去保護，然後將已去保護之側鏈胺基與所希望試劑反應。 21 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公漦） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 505658 Λ7 五、發明説明（θ) 本發明進一步以下列實施例做進一步說明。眚施例1 已發現具有分于式：人〇-〇-21^3^1-〇-4〇0&_〇-3?3^1-

Ser-Lys(Nic)-D-Lys(Nic)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 之肽（安泰得）呈現非常良好作爲GnRH拮抗劑之生物學性質，與最近稱爲阿賽林之肽類同樣具有 GnRH拮抗劑性質，爲其與安泰得不同處僅在於5-及6-位置處。目前已發現，藉由使用此等分子作爲起始點，並藉由於5-及6-位置處或於十肽阿賽林之 5-位置處製造其他取代作用，可獲得具有改良活體內生物活性持續時間之GnRH拮抗劑◊關於位置ΙΑ 及 7-10 ，應注意到於安泰得、阿賽林及阿沙林中皆完全相同。下列十肽[4Aph(Ho〇5，D-4Aph(Cbm)6]-安泰得或[Ac-DdNal1，D-4Cpa2，D-3Pal3，4Aph(Hor)5， D-4Aph(Cbm)6，ILys8，D-Ala10]-GnRH 係藉由固相合成作用合成得。此肽具有下列分子式：

Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-氫乳淸醯基）-D-4Aph(胺甲醯基）-Leu-Lys(異丙基）-Pr〇-D-Ala-NH2 〇首先使用約〇·50克（0·54毫莫耳/克）之MBHA 樹脂（Bachem)，並將經Boc_保護之D_Ala與該樹脂於二甲基甲醯胺（DMF)/CH2C12中，使用約0.65毫克Boc衍生物及二異丙基羰二亞胺（DIC)與無水1- ___22 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

505658 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（2C)羥基苯并三唑（HOBt)作爲活化劑或偶合劑，歷時約 2小時進行偶合作用。該D-Ala殘基係經由一個醯胺鍵接附至MBHA樹脂上。接著將各個胺基酸殘基偶合、洗滌、去封阻，然後再根據下列適用於約0.5至約1克起始樹脂之合成操作明細表，完成下一胺基酸之偶合： 1 11 ' ' I 1,1,11 Γ 111 Τ，ΊΙ1 Γ ΙΙΓ1·_川111 I τμ r 關潤 ' 1 ^ I ι I …『i.irtl 步驟試劑與操作混合時間分鐘 1 甲醇（MeOH)洗滌-15毫升（2次） 1 2 CH2C12 (DCM)洗滌-30毫升（3次） 1 3 5 0% TFA加1 %間-甲酚存於 DCM· 25毫升（2次） 5，20 4 異丙醇洗滌-20毫升（2次） 1 μ_ 三乙胺10%存於DCM- 20毫升（2次） 2 6 MeOH洗滌-15毫升（2次） 1 DCM洗滌-20毫升（3次） 1 8 Boc·胺基酸（0.5-1.0毫莫耳）與HOBt 1-17 (0.5-1.0毫吴耳）存於10-20毫升二甲基甲醯胺（DMF) : DCM或N-甲基毗咯啶酮（NMP) : DCM，視特別受保護胺基小時酸之溶解度而定，加DIC或DCC (0.5-1·〇毫莫耳）存於DCM 9 MeOH洗滌-15毫升（2次） 1 10 CDM洗滌-20毫升（3次） 1 23 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、-口 i 條豕固 τ 遇反人紙 M 公經濟部中央標準局員工消費合作社印製 505658 ΑΊ 五、發明説明（d ) 上列明細表係用於將本發明肽之各個胺基酸’在第一個胺基酸已接附上後進行偶合° N(XB0C保護作用係用於各個經過該合成作用期間被偶合之胺基酸。NaBoc-P-D-2Nal 係藉由該項技藝中已知之方法，例如詳述於美國專利案 4,234,571 (頒布於1980年11月18日）之方法製備得；其亦可購自SynthTech公司’奧瑞岡州’美國。位於5-位置上 4Aph以及位於6-位置上D-4Aph之側鏈第一級胺基，係由 Fmoc保護。苄基醚(Bzl)較佳係作爲用於Ser之羥基的側鏈保護基；然而，Ser可未經側鏈保護而進行偶合。NaBoc-Lys(ipr，Z)係用於8-位置殘基。待將用於6-位置殘基之〇_4八口11呈]^018〇〇0-4八口11(?111〇〇) 形式添加之後，存在著具下式中間物：NaBoc-D-4Aph(Fmoc)-Leu-Lys(ipr，Z)-Pro-D-Ala_NH-[MBHA樹脂撐體]。然後使位於6-位置上之側鏈胺基，在首先將該側鏈保護作用移除以後，進行修飾。Fmoc保護作用係藉由，連續各以25%存於DMF (10毫升）之六氫吡啶處理約15分鐘而去除。待將胜肽樹脂以DMF洗滌後，將剛成爲自由態之胺基於室溫下，以20-倍過量存於DMF之異氰酸第三丁酯處理約 12小時，或直到以使用寧海準測試檢驗達完全爲止。然後使該胜肽樹脂進行標準洗滌程序，且爲添加下一殘基遂將 Boc去除。然後將5-位置殘基呈NaBoc-4Aph(Fmoc)形式添加入。接著將其側鏈如前所述去保護，並與0.10克(0.66毫莫耳）L-氫乳淸酸、90毫克(0.66毫莫耳）HOBt及0·66毫莫耳DIC於3 ________24____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公簸） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) —裝. 、1Τ 505658 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ7 五、發明説明（>1) 毫升DMF中，於室溫下進行反應約8小時，或直到以使用寧海準測試檢驗達完全爲止。經洗滌及將NaBoc去除後，藉由依序與NaBoc-Ser(Bzl)、NaBoc-D-3Pah NaBoc-4Cpa、及 NaBooD-2Nal反應，而完成該十肽之合成。待使用三氟乙酸將位於N-末端之α-胺基去封阻後，使用大量過量之醋酸酐於二氯甲烷(DCM)中進行乙醯化作用約30分鐘。另供選擇地，係直到進行Ν-末端之乙醯化作用之後，始將4APh之Fmoc保護去除，然後再完成與L-氫乳淸酸之反應。將肽樹脂乾燥，隨後將甲氧苯(0.5毫升)加入作爲淸除劑，將該肽從樹脂上裂解，並於約0°C下與15毫升HF進行 Ser及Lys側鏈之去保護達約1.5小時，並將任何剩餘之第三-丁基部分去除。待於真空下將HF去除後，將樹脂以100毫升乙醚洗滌兩次。將已裂解得之肽以存於25% CH3CN/H20 之0.2% TFA萃取，重複該程序且每次使用100毫升。將萃取物倒出並將其凍乾，其提供約600毫克粗製肽粉末。然後藉由該項技藝中已知，且於J.力費爾（Rivier)等人，層析術期刊，288，303-328 (1984)所特別指定之製備型逆相高效能液相層析術(RP-HPLC)完成。第一次製備型RP-HPLC分離係使用TEAP (磷酸三乙銨）緩衝系統，而最終之分離係使用0.1% TFA (三氟乙酸)梯度完成，所有皆詳細描述於該層析術期刊文童中〇該肽（約30毫克)(以下引述稱爲第1號肽）使用毛細管帶狀電泳術(CZE)確定爲實質上均勻，且經評估其純度爲約 ___25 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 505658 Λ7 五、發明説明（7}) 98%。經純化肽之胺基酸分析，與對應經製備結構之分子式相符◊以液態二級離子質譜分析(LSIMS)測定之分子量經測得爲1631.9 Da，其與對應此肽之預定質量1631.8 Da相符〇親水性係藉由使用以40%緩衝液B至70°/。緩衝液B之梯度歷時30分鐘，而其中緩衝液A爲TEAP pH 7.0且緩衝液B 爲70°/。CH3CN與30%緩衝液A，之RP-HPLC測量遲滯時間而進行測試。第1號肽較阿賽林更具親水性，且較阿賽林更容易溶析出。其於pH値約爲5至約7之下，溶於水性緩衝液中之溶解度，及其對活體內膠凝作用之抗性，以及其如前所述壓制循環性LH濃度之長期作用生物功效，使其較其他具有一般可相比擬生物功效之化合物，尤其適用於藉由皮下注射投藥。該肽於活體內分析以測定其抑制大鼠中LH分泌之功效。於經該肽以皮下注射處理之已閹割Sprague-Dawley大鼠中測量循環性LH之濃度，係如C.力費爾(Rivier)等人， Reproduc.，1983，攻，374-378所報導者完成。首先將肽類以1.0或10毫克/毫升之濃度溶解於抑菌水中，然後進一步稀釋於0.04 Μ含有0.1% BSA之磷酸鹽緩衝液中。接著於磷酸鹽緩衝液中完成系列稀釋。將肽類以皮下注射入5隻大鼠中，並於甲氧氟烷麻醉下收集血液樣本(300微升）。以重複組使用由NIDDK國家腦下垂體與激素分布計劃表所提供之試劑，對血淸（50微升)測試LH濃度。測試顯示出每隻大鼠 50微克該肽之劑量，可經注射後96小時仍壓制LH分泌，達 _______26____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) —裝. .^^木訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 505658 五、發明説明（W) 少於50%對照組濃度甚多之程度。而且，於96小時後所測量得之濃度，僅爲同樣經50微克劑量阿賽林注射之大鼠所呈現LH濃度之30%。故認爲第1號肽具有十分長效之作用。對大鼠之檢驗顯示，該肽耐受性非常良好，於注射點不產生可偵測之顯著膠凝現象。從對大量GnRH拮抗劑進行測試所或得之經驗顯示，呈現此類長效壓制LH之肽類，若於成熟雌性Sprague-Dawley 大鼠中進行活體內分析，可以2.5毫克之劑量完全阻斷排卵〇

實施例1A 重複實施例1所列述之合成，惟以NaBoc-4Amf(Fm〇C)取代NaBoc-4Aph(Fmoc)。於將EMAmf側鏈去保護後，將其如前所述與異氰酸第三-丁酯反應。自樹脂上裂解下並去保護，隨後如實施例1所述完成純化◊於RP-HPLC純化作用中獲得 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D_3Pal-Ser-4Aph(L-氫乳淸醯基）-D-4Amf(胺甲醯基）-Leu-Lys(異丙基）_Pro-D-Ala-NH2，且經確定爲實質上均勻，其純度經評估爲約99%。MS分析顯示質量爲1645.9 Da，其與預定質量1645.8 Da相符° SHPLC結果可得知此肽較阿賽林具高親水性。將此肽於標準活體內大鼠LH壓制測試中進行分析顯示，其於50微克劑量下，於經1、2及3天時對壓制LH濃度方面與阿賽林同樣有效。於96小時，LH濃度僅約經阿賽林注射之大鼠中LH濃度之25% ◊故認爲第1號肽具有十分長效之作用。 ___27_____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

505658 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ7 五、發明説明（分）

實施例1B 爲形成類似體[4APh(Ho〇5]-阿賽林，重複實施例1所列述之合成，惟以醋酸酐取代異氰酸第三-丁酯而用於與去保護之位置-6側鏈反應。將該十肽自樹脂上裂解下並去保護，隨後如實施例1所述完成純化。於RP-HPLC純化作用中獲得 Ac-DdNal-D-ACpa-D-SPal-SerWAplUL，氫乳淸醯基）_D-4Aph(乙醯基）_Leu_Lys(異丙基）-Pro-D_Ala-NH2。其經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於99%。MS分析顯示質量爲1630.6 Da，其與所計算之質量1630.8 Da相符。如實施例1將此肽於標準活體內大鼠測試中進行分析顯示，於50微克劑量下，經1至4天後該肽仍具生物活性且與阿賽林具有大約相同之功效◊認爲其對壓制LH呈現十分長效之作用時間。

實施例1C 重複實施例1B所列述之合成，惟以D/L氫乳淸酸取代L-氫乳淸酸，而形成異構型十肽類◊如實施例1所述完成自樹脂上裂解及去保護，隨後將其純化。於RP-HPLC純化作用中獲得 Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser_4Aph(D/L· 氫乳淸醯基 )-D-4Aph(乙醯基）_Leu-Lys(異丙基）_Pro-D-Ala-NH2。其經確定爲一種均勻之混合物，且無其他雜質存在。MS分析顯示質量爲1630.6 Da，其與所計算之質量1630.8 Da相符。如實施例1將此肽於標準活體內大鼠測試中進行分析顯示，於50微克劑量下，經1至4天後該肽仍具生物活性且與阿賽林具有大約相同之功效。認爲其對壓制LH呈現十分長 _28_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（“）效之作用時間。

實施例1D 重複實施例1B所列述之合成，惟以D-氫乳淸酸取代L-氫乳淸酸，而形成異構型十肽類。如實施例1所述完成自樹脂上裂解及去保護，隨後將其純化◊於RP-HPLC純化作用中獲得 Aph(D-氫乳淸醯基)- D4Aph(乙醯基）-Leu-Lys(異丙基）_Pro-D-Ala-NH2。其經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於98%。MS分析顯示質量爲1630.8 Da，其與所計算之質量1630.8 Da相符。如實施例1將此肽於標準活體內大鼠測試中進行分析顯示’於50微克劑量下，歷經第1至第4天後該肽對壓制LH呈現十分長效之生物活性作用時間，其與阿賽林具有大約相同之:功效。

實施例1E 重複實施例1B所列述之合成，惟以NaBoc-D-4FPhe取 RHaBoc_D-4ClPhe，而形成十肽[D-4FPhe2，4Aph(Hor))]-阿賽林。如實施例1所述完成自樹脂上裂解及去保護，隨後將其純化。於RP-HPLC純化作用中獲得Ac-D-2Nal-D-4Fpa-D_3Pal_SeΓ-4Aph(L-氫乳淸醯基）-D-4Aph(乙醯基）-Leu-Lys( 異丙基)-Pro-D-Ala-NH2。其經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於99%。MS分析顯示質量爲1615.1 Da，其與所計算之質量1614.8 Da相符。如實施例1將此肽於標準活體內大鼠測試中進行分析顯示，於50微克劑量下，經1至4天後該肽仍具生物活性且與 _29_____ 度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210乂 297公:^1 C請先閱讀背面之注意事項存填寫本頁)

505658 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ7 B7 五、發明説明（>7) 阿賽林具有大約相同之功效。認爲其對壓制LH呈現十分長效之作用時間β

實施例IF 重複實施例1B所列述之合成，惟以NaBoc-4Amf(Fmoc) 取代NaBoc-4Aph(Fmoc)，而形成十肽[4Amf(Hor)5]-阿賽林。如實施例1所述完成自樹脂上裂解及去保護，隨後將其純化。於RP-HPLC純化作用中獲得Ac_D_2Nal-D-4Cpa-D-3Pal· Ser-4Amf(L-氫乳淸醯基)_D_4Aph(乙醯基)_Leu_Lys(異丙基 )-Pro-D-Ala-NH2。其經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於98%。MS分析顯示質量爲1644.7 Da，其與所計算之質量1644.8 Da相符。如實施例1將此肽於標準活體內大鼠測試中進行分析顯示，.於50微克劑量下，經1至4天後該肽仍具生物活性且與阿賽林具有大約相同之功效。認爲其對壓制LH呈現十分長效之作用時間。

眚施例1G 重複實施例1所列述之合成；然而，D-4Aph之側鏈胺基不與異氰酸第三丁酯反應，而係將4Aph殘基自發地與氫乳淸酸反應，以形成十肽[4Aph(Hor5)，D-4Aph(Hor)6]-安泰得◊如實施例1所述完成自樹脂上裂解及去保護，隨後將其純化。於RP-HPLC純化作用中獲得Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3?486卜4八？11(1^氫乳淸醯基）-0-4八？11(1^氫乳淸醯基）-1^卜 Lys(異丙基）-Pro-D-Ala-NH2 ◊其經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於99。/。。MS分析顯示質量爲1728.4 Da， 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ 505658

經濟部中央標準局員工消費合作衽印製五、發明説明（4) 其與所計算之質量1728.8 Da相符。RP-HPLC之結果顯示此肽較阿沙林B更具親水性，而其依次又較阿賽林更具親水性。如實施例1將此肽於標準活體內大鼠測試中進行分析顯示，於50微克劑量下，經1至4天後該肽仍具生物活性且與阿賽林具有大約相同之功效。認爲其對壓制LH呈現十分長效之作用時間。重複此合成作用，惟以NaBoc-D-4Amf(Fmoc)取代 NaBoc-D_4Aph(Fmoc)，而產生十肽[4Aph(Hor)5，D-4Amf(H〇r)6]-安泰得，其一般認爲對壓制LH分泌具有生物功效。實施例1H .重複實施例1所列述之合成；然而，D-4Aph之側鏈胺基不與異氰酸第三丁酯反應，而係將其與D-氫乳淸酸反應，以形成十肽[4Aph(Hor5)，D-4Aph(D-Ho〇6]-安泰得。如實施例1所述完成自樹脂上裂解及去保護，隨後將其純化。於 RP-HPLC 純化作用中獲得 Ac-DdNal-D^Cpa-DePal-Ser-4Aph(L-氫乳淸醯基）-D-4Aph(D-氫乳淸醯基VLeu-Lys(異丙基)-Pn>-D-Ala-NH2。其經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於98%。MS分析顯示質量爲1728.7 Da，其與所計算之質量Π28.8 Da相符。RP-HPLC之結果顯示此肽較阿沙林B更具親水性，而其依次又較阿賽林更具親水性◊ 如實施例1將此肽於標準活體內大鼠測試中進行分析顯示，於50微克劑量下，經1至3天後該肽仍具生物活性且與〜_______ 31 __ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱资背v#之注意事項本瓦) .裝. -5 505658 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 Λ7 五、發明説明（θ ) 阿賽林具有大約相同之功效。於第4天時其實質上較阿賽林更有效，故認爲其對壓制LH呈現十分長效之作用時間。

實施例1J 藉由實施例1Β所列述之一般程序完成十肽[MeCbm-D_ 2NW1，4Aph(Ho〇5]-阿賽林之合成；然而，於添力口NaB〇c_ 4Aph(Fmoc)之後，不立即將Fmoc-保護基去除，而係於樹脂上完成該十肽之合成。然後’待將N-末端去封阻後不與醋酸酐反應，而係與異氰酸甲酯反應而於N-末端形成甲基胺甲醯基。接著，如實施例1B所述將Fmoc去除，並將4Aph 之側鏈胺基與L-氫乳淸酸反應。如實施例1所述完成自樹脂上裂解及去保護，隨後將其純化。於RP-HPLC純化作用中獲得甲基胺甲醯基-D-2>ial-DWCpa-D-SPal-SeMAph(L-氫乳淸醯基）-D_4Aph(乙醯基）-Leu_Lys(異丙基）-Pro-D-Ala-NH2 。其經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲約99%。MS 分析顯示質量爲1645.7 Da，其與所計算之質量1645.8 Da相符。RP-HPLC之結果顯示此肽較阿沙林B更具親水性，而其依次又較阿賽林更具親水性。如實施例1將此肽於標準活體內大鼠測試中進行分析顯示，於50微克劑量下，經1至3天後該肽仍具生物活性且與阿賽林具有大約相同之功效，而於96小時後較阿賽林更有效達幾乎50%。故認爲其對壓制LH呈現十分長效之作用時間。

實施例1K 重複實施例1所列述之合成，惟MNaBoc-D_3Pal取代 _______32_____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） C請先閱讀背面之注意事項再本頁} —裴· 鶫本一、一呑 505658 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（？。） NaBoc_4Aph(Fmoc)，並省略後續與t-BuNCO之反應，而形成十肽[4APh(Hor)5，D-3Pal6]-安泰得。如實施例1所述完成自樹脂上裂解及去保護，隨後將其純化。於Rp_HPLC純化作用中獲得乙醯基-D-2Nal-D-4Cpa-D_3Pal-Ser_4Aph(L- 氫乳淸醯基VD-SPal-Leu-Lys(異丙基）_Pro-D-Ala-NH2。其經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於98%。MS分析顯示質量爲1574.7 Da，其與所計算之質量1574·7 Da相符。如實施例1將此肽於標準活體內大鼠測試中進行分析顯示，於50微克劑量下，經第3天後該肽仍具生物活性且與阿賽林具有大約相同之功效；然而經96小時之後’其呈現LH 濃度之抑制値約爲阿賽林所抑制LH濃度之35%。故認爲其對壓制LH呈現十分長效之作用時間。 .實施例1L 重複實施例1G所列述之合成，惟以異氰酸第三·丁酯取代氫乳淸酸，而形成十肽[4Aph(Cbm)5，D-4Aph(Cbm)6l·安泰得。如實施例1所述完成自樹脂上裂解及去保護’隨後將其純化。於RP-HPLC純化作用中獲得肽Ac-DdNal-DWCpa-D-3Pal-Ser-4Aph(胺甲醯基）-D_4Aph(胺甲醯基）-Leu-Lys(異丙基）-Pi*o-D-Ala-NH2。其經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於99%。MS分析顯示質量爲1534.9 Da，其與所計算之質量1534.7 Da相符。如實施例1將此肽於標準活體內大鼠測試中進行分析顯示，於50微克劑量下，經4天後該肽仍具生物活性且與阿賽林具有大約相同之功效。故認爲其對壓制LH呈現十分長效 33 r

I

頁訂尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐 505658 Λ7 五、發明説明（J) 之作用時間。

實施例1M 重複實施例1G所列述之合成，惟以異氰酸甲酯取代氫> 乳淸酸，而形成十肽[4Aph(MeCbni)。，D-4Aph(MeCbm)6]-安泰得。如實施例1所述完成自樹脂上裂解及去保護，隨後將其純化。於RP-HPLC純化作用中獲得肽AoDdNal-D-4Cpa-D-3Pal_Sei-4Aph(甲基胺甲醯基)-D-4Aph(甲基胺甲醯基)-Leu_Lys(異丙基）_Pro-D_Ala-NH2 〇其經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於99%。MS分析顯示質量爲 1562.8〇3，其與所計算之質量1562.8 〇3相符。如實施例1將此肽於標準活體內大鼠測試中進行分析顯示，於50微克劑量下，經2天後該肽仍具生物活性且與阿賽林具有大約相同之功效，然後其對壓制LH開始稍微減低。實施例2 使用實施例1所列述之一般程序，合成得肽[4Aph(Ho〇5 ，D-Cit6]-安泰得，其爲一種具分子式Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal_Se卜4Aph(L-氫乳淸醯基）-D-Cit-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH22肽西曲瑞克的類似體。取RNaBoc-D-4Aph，而係將 NaBoc-D-Cit偶合至6_位置上。另供選擇地，係將NaB〇c-D-Om(Fm〇C)偶合至6-位置上，並使鏈增長作用於已獲得下列肽中間物：Boc-D-Om(Fmoc)-Leu-Lys(ipr，Z)-Pro-D-Ala_ NH-[MBHA樹脂撐體]之後暫時停止。然後將位於〇rn殘基上之胺基側鏈藉由如實施例1所述，將Fmoc保護去除而去保護，並將該中間物以過量存於DMF之異氰酸第三-丁酯於 34 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 本 -i-T> 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） 505658 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（）1) 室溫下處理約6小時，以與位於〇rn殘基上之側鏈反應。然後如實施例1所述完成十肽中間物之合成。接著將該肽樹脂如實施例1所述進行洗滌、裂解及去保護，隨後將其純化。於RP-HPLC純化作用中獲得AoD-SNal-D-ACpa-D-SPal-SerWApha-氫乳淸醯基）-D-Cit-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2。其經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於99%。LISMS分析顯示質量爲1583.7 Da，其與所計算之質量1583.8 Da相符。該肽較西曲瑞克更具親水性，且當如實施例1中測試活體內壓制LH分泌之程度時，呈現與西曲瑞克等長之生物活性持續時間。其於第3天時具有最低限度較佳之壓制作用，而經96小時之後實質上爲較佳。

.奮施例2 A 使用美國專利5，169,935案中實施例1所列述之一般程序合成安泰得之類似體，亦即[4Aph(Hor)5]-安泰得。於將 NaBoc-D-Lys(Fmoc)偶合至6-位置上後，將其與過量存於 DMF之煙鹼酸反應，隨後進行去保護作用。然後，將 NaBoc-Aph(Fmoc)偶合至5-位置上，並將位於Aph殘基上之胺基側鏈藉由如實施例1所述去保護。將該中間物與過量存於DMF之L-氫乳淸酸反應，並如實施例1所述完成十肽中間物之合成。接著將該肽樹脂如實施例1所述進行標準洗滌、裂解及去保護，隨後將其純化。於RP-HPLC純化作用中獲得Ac-D-SNal-DWCpa-DJPal-SeMAplUL· 氫乳淸醯基 H>Lys(Nic)- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

35 ___ 經浐部中呔«.^-^乂丁，消贽合竹，·^卬？^ 505658 A7 B7 五、發明説明（β)

Leu-ILys-Pro-D-Ala_NH2。其經認爲較西曲瑞克更具親水性，且對於壓制LH分泌而言，呈現與西曲瑞克等長之生物活性持續時間。實施例J3 依循實施例1所列述之一般程序合成得類似體 [4Aph(D/L-Imz)5]-阿賽林，爲以D/L-Imz取代L-Hor。因此，於將位於5-位置上之4Aph去保護後，將該中間物以含過量 D/L-2-咪唑咐酮-4-羧酸、約90毫克HOBt及約0.66毫莫耳 DIC溶於DMF之溶液於室溫下處理約6小時。然後如實施例 1所述完成十肽中間物之合成。接著將該肽樹脂如實施例1所述進行洗滌、裂解及去保護，隨後將其純化。於RP-HPLC純化作用中獲得Ac-D-SNal-DWCpa-DePal-Sei^AplUD/Ld-咪唑啉酮 _4_ 羰基）-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2。其經確定爲均勻混合物，且無其他雜質。LISMS分析顯示質量爲1602.7 Da，其與所計算之質量1602.8 Da相符。如實施例1將此肽於標準活體內大鼠測試中進行分析顯示，於50微克劑量下，呈現長效壓制LH分泌之生物活性持續時間。其於第3天時具有最低限度較佳，而經96小時之後較阿賽林爲佳。

實施例3 A 重複實施例3所列述之合成，惟使用過量L-2-咪唑啉酮-4-羧酸取代D/L-Imz。所成之肽經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於99%。LISMS分析顯示質量爲1602.5 Da 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1' 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 505658 五、發明説明（淨），其與對此肽所計算之質量1602.8 Da相符。該肽較阿賽林更具水可溶性。如實施例1中所述完成分析，且於5〇微克劑量下’該肽呈現長效壓制LH分泌之生物活性持續時間，其經96小時約與阿賽林之效果相同。眚施例3Β 重複實施例3所列述之合成，惟使用過量D-2-咪唑啉酮-4-羧酸取代D/L-Imz。獲得所成之肽八〇0-21^1_0-4€?&-0-3Pal-Ser-4Aph(D-Imz)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 。LISMS分析顯示質量爲1602.6 Da，其與對此肽所計算之質量1602.8 Da相符。該肽較阿賽林更具水可溶性。如實施例1中所述完成分析。該肽具生物活性且於5〇微克劑量下，呈現LH分泌之壓制作用。

實施例3C 使用實施例1Α (導入D-4Amf(Cbm)6)與3Α (導入 AAphGmz/)所列述方法之組合，合成得肽[4Aph(Imz)5，D-4Amf(Cbm)6]-阿賽林。於RP-HPLC純化作用中獲得肽Ac-D-2Ν&1-0-40ρ&·0-3Ρα1-8βι-4Αρ}ι(Ι^Ιηιζ)-Β-4ΑηιΓ(胺甲醯基）-Leu-ILys-Pro-D-Ala«NH2。其經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於98%。MS分析顯示質量爲1617.6 Da，其與所計算之質量1617.8 Da相符。將此肽如實施例1進行分析，且50微克劑量下，其呈現長效壓制LH分泌之生物活性持續時間◊其經3天後與阿賽林之效果實質上相同，而於96小時具有較其稍更佳之抑制作用。 _____37_— 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公t ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

505658 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 Λ7 B7________ 五、發明説明（) 實施例i: 使用實施例1A所列述之一般合成程序’合成得肽 [4Aph(Hor)5，D-Amf(MeCbm)6]-安泰得，其具有分子式Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Apli(L-氫乳袖醯基）-D-Amf(MeCbm)-Leu_ILys-Pro-D-Ala-NH2 ° 取代將位置上之 D-4Amf與過量存於DMF之異氰酸第三丁醋反應’而係將其與異氰酸甲醋反應。然後如實施例1A所述完成十肽中間物之合成。接著將該肽樹脂如實施例1所述進行洗滌 '裂解及去保護，隨後將其純化° MRp-HPLC純化作用中獲得肽Ac·0-2Ν3ΐ·0_4€ρα-0-3Ρ&1-86Γ·4Αρ1ι(Ι^ 氫乳淸醯基）-D-4Amf(MeCbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 ° 其經確疋爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於99%° LSIMS分析顯示質量爲1659.8 Da，其與所計算之質量1659.8 Da相符。如實施例1將此肽於標準活體內大鼠測試中進行分析顯示，於50微克劑量下，第4號肽呈現較阿賽林更佳壓制LH 分泌之作用，且經認爲呈現非常長效壓制LH分泌之生物活性持續時間。

眚施例4A 重複實施例4所列述之合成，惟以醋酸酐取代異氰酸甲酯，而產生肽[4Aph(Ho〇5，D-Amf(Ac)6]-安泰得。於 RP-HPLC 純化作用中獲得肽 Ac-D-2Nal_D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-氫乳淸醯基:l-DWAmflAchLei卜ILys-Pro-D-Ala-NH2 。其經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於99%。 __38________ 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再^Γ本頁)

、11 505658 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ7 五、發明説明（丨Μ LSIMS分析顯示質量爲1644.8 Da，其與所計算之質量 1644.8 Da相符。將此肽如實施例1中於50微克劑量下進行分析，且其呈現長效壓制LH分泌之生物活性持續時間。顯示其經3天後與阿賽林之效果實質上相同，而於96小時具有較其稍更佳之抑制作用。

眚施例4B 將如實施例1中所合成得且經測試之十肽進行修飾，而使其於C-末端具有D-丙胺醇而非D-丙胺醯胺。首先使用如實施例1A所述之一般合成，惟使用諸如購自Bachem股份有限公司之Merrifidd樹脂（經氯甲基化之交聯聚苯乙烯），合成得於C-末端具有呈自由態酸之脯胺酸的九肽片段。經裂解、·去保護及純化後，獲得下列 D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-ProOH ◊將 0.15毫莫耳經完全去保護且經HPLC-純化之九肽，與3.0毫莫耳D-丙胺醇（Lancaster化學品公司）一起溶於3毫升乾燥 DMF中。然後，0.60毫莫耳PyBOP (Novabiochem)固體加入作爲偶合劑，並將反應混合物於室溫下攪拌30分鐘。將反應藉由添加200毫升水驟止產生一種乳液，其藉由使用冰醋酸將pH値調整至2.5而轉爲澄淸。將所成之十肽AC-D-2Nal· D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro- D_Ala-ol使用利用ΤΕΑΡ (ρΗ2·3)作爲緩衝劑之製備型RP-HPLC進行純化，隨後再以0.1% TFA作爲緩衝進行純化。所成之肽經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於99% _____39__一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公t ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

505658 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ 7 __Β7 五、發明説明（η ) 。MS分析顯示質量爲1632.9 Da，其與所計算之質量1632.8 Da相符。如實施例1將此肽於標準活體內大鼠測試中進行分析顯示，於50微克劑量下，該肽具生物活性，且此生物活性持續達至少96小時。該肽經認爲具非常長效之作用。實施例4C 重複實施例4B所列述之合成，惟於反應混合物中以3.0 毫莫耳L-丙胺醇(AldHdge化學品公司）取代D-丙胺醇。將所成之十肽如實施例4B所述純化，且經確定爲實質上均勻，其具有純度經評估爲大於99%。MS分析顯示質量爲1632.9 Da，其與所計算之質量1632.8 Da相符。如實施例1將此肽於標準活體內大鼠測試中進行分析顯示，於50微克劑量下，該肽具生物活性，且此生物活性持續達至少96小時。該肽經認爲具非常長效之作用。實施例4D 將如實施例1中所合成得且經測試之十肽進行修飾，而使其於C-末端具有D-丙胺醇而非D-丙胺醯胺。使用如實施例1所述之一般合成，惟使用位於Merrifield樹脂上之SPPS ，合成得於C-末端具有呈自由態酸之脯胺酸的九肽片段。經裂解、去保護及純化後，獲得下列九肽：AC-D-2Nal·D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-〇H 。然後如實施例4B將經純化之九肽與D-丙胺醇反應，並將所成之十肽卜4Aph(H〇r)-D- 4Amf(Cbm)_Leu-ILys-Pro-D-Ala-ol·使用如實施例 4B 所述之 ___ _____40____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公t ) (請先閱t背Is··之注意事項' ¥本頁) •裝- 、-口 505658 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ7 B7 五、發明説明（0 ) RP-HPLC進行純化，惟其係使用pH値爲6.5之TEAP而非pH 値爲2·3之TEAP ◊所成之肽經確定爲實質上均勻，具有純度經評估爲大於99%。MS分析顯示質量爲1618.9 Da，其與所計算之質量1618.8 Da相符。該肽於活體內之分析顯示，其具生物活性。實施例4Ε 重複實施例4D中所列述之合成，惟以L-丙胺醇取代D-丙胺醇。將所成之十肽：Ac-D_2Nal_D-4Cpa-D_3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala_ol使用如實施例4D所述之RP-HPLC進行純化，且該肽經確定爲實質上均勻，其具有純度經評估爲大於99% ◊ MS分析顯示質量爲 1618.9 Da，其與所計算之質量1618.8 Da相符。該肽於活體內之分析顯示，其具生物活性。實施例5 使用實施例1A所列述之一般合成程序，合成得肽 [4Aph(D-Hor)5，D-Amf(Cbm)6]-安泰得，其具有分子式Ac-D-^Nal-D-ACpa-D-^Pal-Ser-AAph^D-氫乳淸藤基）-D-Amf(Cbra)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2。取代將5-位置上之Aph 與L-氫乳淸酸反應，而係將該側鏈與D-氫乳淸酸反應。然後如實施例1A所述完成十肽中間物之合成。接著將該肽樹脂如實施例1所述進行標準洗滌、從樹脂裂解及去保護，隨後將其純化。於RP-HPLC純化作用中獲得肽氫乳淸醯基）_D- 4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2。其經確定爲實質上均 _____41__ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） " t先閲—背*.之注意事項再本頁) .裝· 505658 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製五、發明説明（β) 勻，且其純度經評估爲大於98%。LSIMS分析顯示質量爲 1645.8 Da，其與所計算之質量1645.8 Da相符。該肽使用標準活體內大鼠測試之分析顯示，於50微克劑量下，該肽呈現長效壓制LH分泌之生物活性持續時間歷經2天大約與阿賽林相同’且於72及96小時持續作用稍差之壓制程度。

實施例5_A 重複實施例5所列述之合成，惟取代將4Amf之已去保護側鏈與異氰酸第三丁酯反應’而係將其與醋酸酐反應。於 RP-HPLC 純化作用中獲得肽 Ac-D_2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-氫乳淸醯基）-D-4Amf(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala- NH2。其經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於99% 。L.SIMS分析顯示質量爲1644.7 Da，其與所計算之質量 1644.8 Da相符。將此肽如實施例1中進行分析，且於5〇微克劑量下，該肽經3天後呈現與阿賽林實質上相同之LH分泌壓制作用：於96小時，其呈現較阿賽林稍更佳之抑制作用。窗施例6 重複實施例1F所列述之合成，惟對於6-位置殘基使用 NaBoc-D_4Amf(Fmoc)取代使用NaBoc-D-4Aph(Fmoc)，而形成十肽[4Amf(Hor)5，D-4Amf(Ac)6]-安泰得。於RP-HPLC純化作用中獲得 Ac-D-2Nal_D-4Cpa-D-3Pd-Ser-4Amf(L-氫乳淸醯基）-D-4Aph(乙醯基）_Leu-Lys(異丙基）-Pro-D_Ala-NH2 。其經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於99%。 __ ___42 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂 505658 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ7 B7 五、發明説明（β) MS分析顯示質量爲1658.7 Da，其與所計算之質量1658.8 Da相符。如實施例1將此肽進行分析，且於50微克劑量下，該肽經發現對壓制LH具有長效之作用時間◊經最初之兩天後約與阿賽林相同，而經第3及第4天後呈現幾乎與阿賽林相等之功效。

實施例6A 重複實施例6所列述之合成，惟取代將D-4Amf之已去保護側鏈與醋酸酐反應，而係將其如實施例1所列述與異氰酸第三丁酯反應，以形成十肽[4Amf(H〇r)5，D-4Amf(Cbm)6]-安泰得◊於RP-HPLC純化作用中獲得肽AoD-SNal-D^Cpa-DaPal-Sei^AmiTL-氫乳淸醯基）-D-4Amf(胺甲醯基)-Leu_Lys(異丙基)-Pf〇-D-Ala-NH2。其經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於99%。LSIMS分析顯示質量爲 1659.6 Da，其與所計算之質量1659.8 Da相符。如實施例1將此肽進行分析，且於50微克劑量下，其於 1天後對壓制LH分泌具有與阿賽林相同之活性，且於2天後幾乎相同。其經3天後活性稍微較差，但經4天後呈現大約與阿賽林相同之活性。

實施例6B 重複實施例6A之合成，惟反應係與異氰酸甲酿反應取代與異氰酸第三丁酯反應，以產生肽[4Amf(Ho〇5， 4Amf(MeCbm)6]-安泰得。於RP-HPLC純化作用中獲得肽Ac-D-2NalD-4Cpa-D-3Pal·Se卜4Amf(L氫乳淸醯基)-D-4Aph(甲 43 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

505658 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（4丨）基胺甲醯基)-Leu-Lys(異丙基)_pro-i>Ala-NH2。其經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲約99%。MS分析顯示質量爲1673_6 Da，其與所計算之質量1673.8 Da相符。如實施例1所列示將此肽進行測試，且於50微克劑量下，其於1天後對壓制LH分泌具有與阿賽林相同之活性，且於2天後大約相同。於3天及4天時，其持續對壓制LH分泌之作用顯著較阿賽林差。窗施例6C 重複實施例6之合成，惟以D-氫乳淸酸取代L-氫乳淸酸，而形成肽 HAmfp-Hor/，D-4Amf(Ac)6]-安泰得。於RP-HPLC 純化作用中獲得肽 Ac-D_2Nal-D-4Cpa-D_3Pal-Ser-4Amf(D-氫乳淸醯基）-D-4Amf(乙醯基）-Leu-LysC異丙基）-Pro，D-Ala-NH2。其經確定爲實質上均勻，且其純度經評估爲大於^9% ◊ MS分析顯示質量爲1658.7 Da，其與所計算之質量1658.8 Da相符。如實施例1所列示將此肽進行測試，且於50微克劑量下，其實質上與阿賽林同樣有效達1及2天◊於第3天，其實質上較阿賽林具較少功效，且之後其生物功效顯著減低。眚施例7 使用於實施例1至5中所列述之程序，亦製備得下列 GnRH拮抗劑肽類： [4Aph(Hor)3，D-4Amf(Cbm)6，Pro9NHCH2CH3]-安泰得 [4Aph(Hor)5，D-4Aph(Cbm)6，Pro9NHCH2CH3]_安泰得 [Acr-DJNal1，4FD-Phe2，4Aph(Hor)3]-阿賽林 _ _ _44 _ 本ϋ尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） "" (請先閱讀背面'之注意事項再W4本頁) •裝. -訂丨衡 505658 Λ7 B7 五、發明説明（杼） [BZ-D-2NW1，4N02D-Phe2，4Aph(Hor)5，D-4Aph(Hor)6]-安泰得 [For-D^Nal1 ^ 40CH3D-Phe2 ^ 4Amf(Hor)3 ^ D-4AphCD-Hor)0]- 安泰得 [Acr-DdNal1，4BrD-Phe2，4Aph(Imz)5，D-4Aph(Imz)6]·安泰得 [Pn-DdNal1，4CH3D-Phe2，3Aph(D-Imz)5，D-4Aph(D-Hor)6]-安泰得 [By-DdNal1，3,4C12D-Phe2，4Aph(Hor)5，D-4Aph(Hor)6]·安泰得 [Vl-DJNal1，4N02D-Phe2，4Aph(Hor)5，D-3Aph(Cbm)6]·安泰得 [Vac-DdNal1，CaMe4ClD-Phe2，4Aph(Hor)5，Gly1。]-阿賽林 [Pn-DdNal1，3Aph(Imz)5，D-3Amf(D-Hor)6-Agl1()]-安泰得 [Acr-DdNal1，4Aph(Hor)5，Arg(Et2)s，D-Agl(Me)1。]-阿賽林 [MeCbm-DJNal1，4Aph(Hor)5，Arg8，D-Agl(Me)1。]-阿賽林 [Cbm-DdNal1，3Amf(Imz)5，Ala1。]-阿賽林 [EtCbm-DdNal1，4Amf(Hor)5，Pro9NHCH2CH3]-阿賽林 [Acr-D-SNal1，4Aph(Imz)5，D-4Amf(Cbm)6-Arg8]-安泰得 [Cbm-DdNal1，4Aph(MeCbm)5，4Amf(MeCbm)6，Arg(Et2)8]-安泰得經濟部中央標準局員工消費合作社印製 [4Aph(Hor)5，D-4Aph(Imz)6，D-Agl1Q]-安泰得 [Ac-D-lNal1，4Amf(Hor)5，D-4Amf(D-Hor)6-Arg8]-安泰得 [PrCmb-D^Nal1 ， 4Aph(Imz)5 ， D-4 Ahp(EtC-bm)6 ，

Pro9NHCH2CH3]-安泰得 [4Amf(Hor)5，D-Lys(Nic)6，AzaGly1。]-安泰得 [4Amf(Hor)5，D-Cit6，Har(Et2)s]-安泰得 [4Aph(Hor)5，D-Lys(Nic)6，D-Agl1。]-安泰得 [4Aph(Hor)5，D-Hci6，Agl(Me)1Q]·安泰得 _45____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 505658

經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（D) [4Aph(Hor)5，D-3Pal6，Har8，Agl1。]-安泰得 [4APh(Hor)3，D-4Aph(For)6，D-AgUMe)1。]-安泰得 [4APh(Hor)5，D-4Aph(atz)6，Har(Et2)8]·安泰得 [4Aph(Hor)5，c^AphUprCbm)6，D-Agl1。]-安泰得 [For-D-lNal1，4Ainf(Hor)5，D-4Amfi>tz)6，Gly10]-安泰得 [4Aph(D-H〇r)5，D-4Aph(Cbm)6，Ala1()_ol]·安泰得此等肽類於抑制LH分泌方面具生物功效。前述受測試化合物經顯示於抑制LH分泌方面，呈現達到至少一般可與已知如安泰得之相對應GnRH拮抗劑肽（彼等認爲係類似體)相比擬之生物功效的程度。如於此領域歷經十年之充分測試結果，此方經廣泛接受測量LH壓制作用之測試所測定的生物功效，已被接受作爲此類化合物能夠壓制促性腺素分泌，及因此呈現出有用抵消促性腺素抗排卵功效之證據。基於優越之可溶度、對活體內膠凝作用之抗性、長的生物活性持續時間及其他特性，此等化合物經認爲一般可用作爲抵消促性腺素劑，以壓制促性腺素分泌及抑制由性腺釋出類固醇，例如作爲抗排卵劑◊ 本發明化合物往往係以醫藥上可接受、無毒性之鹽類，例如呈酸加成鹽或以金屬錯合物之形式投藥；而可能以醋酸鹽與棕櫚酸鹽(棕櫚酸之鹽類）爲較佳。若活性成分係以片劑形式投藥時，則片劑可含有醫藥上可接受、無毒性之稀釋劑，其包括黏著劑例如西黃耆膠、玉米澱粉或明膠 :崩解劑例如藻膠；及潤滑劑例如硬脂酸鎂。可進行存於等張食鹽水、磷酸鹽緩衝劑等類中之靜脈內投藥。本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X297公梦) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

T 505658 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（通常醫藥組合物會包含有效量之肽，與習用、醫藥上可接受之載體或賦形劑。通常當以靜脈內給予時，劑量爲每公斤宿主體重約10微克至約2.5毫克之肽。此等化合物之性質可使其能有效以口服投藥；然而，口服劑量可能較高。畢竟，以此等肽類治療個體一般係以，與使用其他GnRH 拮抗劑之臨床治療相同的方法，使用於其中該化合物爲可溶之適宜載體，且投予足以於病患中壓制LH及FSH之劑量而完成。亦可希望將GnRH拮抗劑歷經長時期，例如歷時一星期至一年，自單一投藥進行遞送，且可利用緩慢釋出、置放或植入劑量形式◊ 此等化合物可經靜脈內、皮下、肌肉內、口服、經皮、鼻內、肺內 '直腸內或陰道內投藥予哺乳動物，以達到生育力抑制及/或調控作用，且於應用上適於可逆壓制性腺活性，例如調節發身期早發或於放射或化學療法期間之性腺活性。彼等亦可用於治療類固醇-依賴性腫瘤。有效劑量將依投藥形式及所受治療之特定晡乳動物品種而有所變化。某些此等化合物具有如50毫克/毫升高之溶解度，且其慣常地可呈pH値爲5·4之5_10毫克/毫升溶液。局部劑量形式之實例爲含有該肽之pH値爲約6的抑菌水溶液，該溶液係以非經腸道投藥，以提供範圍自約0.1至2.5毫克/公斤體重每天之劑量。此等化合物經認爲於活體內具良好耐受性且對膠凝作用具抗性；於是，彼等經認爲特別適用於經由皮下注射’以pH値爲約4.9的約5°/。甘露糖醇抑菌水溶液，於 —__ 47 請先閱讀，背意頁裝訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐 505658 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A1 B7 五、發明説明uy) ~' 適當濃度（高於約〇·75毫克/毫升且甚至高於約1·〇毫克/•毫升）下投藥，其於注射處無產生膠凝之危險。此等GnRH拮抗劑肽類亦可於活體內及活體外用於診斷上。此等肽類可經活體內注射，隨後分析患者之血流以測定激素分泌，例如LH分泌之減少程度。可完成活體外分析以測定某特定腫瘤細胞是否對GnRH敏感。於此項分析中，係將腫瘤細胞培養物以GnRH拮抗劑肽類處理，然後偵測激素分泌及細胞增殖情形。雖然本發明已敘述關於其較佳具體實施例，應了解可進行對習於該項技藝人士而言爲顯而易知之改變與修飾，而不會偏離本發明於所附申請專利範圍中所列示之範園。而;Nf-末端可保持未經取代或可使用其他相等之乙醯化基團，而以乙醯基或以經取代或未經取代之胺甲醯基爲較佳。除Aph或D-Aph外，可將Ahp或D-Ahp用於5-及6-位置上。除 Aph(Ac)外，可將胺基Phe基團以另可供選擇揭示於美國專利案5,506,207中的乙醯化試劑，例如甲酸、p_Ala(atz)及加瑪-胺基丁酸（atz)處理，其同樣產生呈現長效持續時間之 GnRH拮抗劑；因此，所成之殘基認爲係D_及L-4Aph(Ac)之相等物。Lys(Bu)與Lys(Et2)二者認爲係ILys之相等物；然而以ILys爲最佳。其他厭水性胺基酸殘基亦可用於p位置及6-位置(如前文所提及者）中，其較佳呈D-異構物形式，且且認爲係該等所指定者之相等物。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱t背私之注意Ϋ-項再^4本頁) •裝· -訂

Claims

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1.一種具有下列分子式之GnRH掊抗劑肽： X-D-Nfal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Xaa8-Pro-Xaai。，及其醫藥上可接受之鹽，其中： X爲具有至多7個碳原子之醯基，或爲Q，而Q爲〇 II C-NHR 5 且R爲Η或G-C5烷基； Α 爲 4C1、4F、4Br、4N〇2、4CH3、40CH3、3,4C12 或 CaMe4Cl ; Xaas 爲 Aph(Qi)或 Amf(Qi)，而 Qi 爲 Q 或 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 零 Η 〇、人 Ν Η 〇或 II 〇訂： ΗΝ ΝΗ (D-或 L- Hor) 線 (D-或 L- Imz) · Xaa6 爲 D-Aph(Q2)、D-Amf(Q2)、D-Lys(Nic)、D-Cit、D-Hci 或 D-Pal，而 Q2 爲 For、Ac、3-胺基-1，2,4-三11坐、或 Qi Xaa8 爲 Lys(ip〇、Arg、Har、Arg(Eh)或 Har(Et2);且 Xaaio 爲 D-Ala-NH2、D-Ala-o卜 Ala-o卜 NHCH2CH3、 Gly-NHb、Ala-NH2、AzaGly-NH2、Agl-NtL·、D-Agl-NH2、 Agl(Me)-NH2或 D- Agl(Me)-NH2，其條件爲當 Xaa5含有 Q 時，則Xaa6亦含有Q (D-Nal表示於β-碳原子上經萘基取代之丙胺適用中國國家標準(CNS)Α4規格(210 X 297公釐） 505658 A8 D8 六、申請專利範圍酸的r>-異構物； (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) D-Pal表示業已於β-碳原子上經毗啶基取代之丙胺酸的D-異構物； Aph 表示 NH2Phe ; Amf表示NH2CH2Phe，其中有一個與側鏈胺基鍵聯之亞甲基； H〇r表示氫乳淸醯基； Imz 表示 2-咪 Π坐 D定酮-4-幾基（2-imidazolidone-4-carbonyl)； Lys(Nic)表示Νε-菸鹼醯基賴胺酸； D-Cit表示瓜胺酸之D-異構物； D-Hci表示高瓜胺酸之D-異構物； Lys(ipr)表示Νε-異丙基賴胺酸，其Lys之ε-胺基經烷基化； Har*表示高精胺酸； ♦ Ala-ol表示丙胺醇； AzaGly-NH2 表示 NHNHCONH2 ; Agl表示α-胺基甘胺酸； For表示甲醯基；Ac表示乙醯基，Et表示乙基及Me表示甲基）。 2.根據申請專利範圍第1項之GnRH拮抗劑肽，其中 X、A及Xaa8係如申請專科範圍第1項中所定義； Q爲胺甲釀基或甲基胺甲釀基； D-Pal 爲 D-3Pal ; ___2 ___ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐） A8B8C8D8 505658 六、申請專利範圍 Xa'as 爲 4Aph(Qi)或 4Amf(Qi)，而 Qi 爲 Q 或

(D-或 L- Hor) (D-或 L- Imz) Xaa6 爲 D-4Aph(Q2)、D-4Amf(Q2)，而 Q2 爲 Q 或 D-或 L-Hor或D-或L-Imz ;其條件爲當心爲Q時，則Q2亦爲Q，且 Xaaio 爲 D-Ala-NH2、D-Ala-ol 或 Ala-o卜 3. 根據申請專利範圍第1或2項之GnRH拮抗劑肽，其中 Qi 爲 L-Hor 或 D-Hor。 4. 根據申請專利範圍第1或2項之GnRH拮抗劑肽，其中 X 爲 Ac ’ Xaas爲 Lys(ipr)且 Xaai。爲 D-Ala-NH2。 5. 根據申請專利範圍第1或2項之GnRH拮抗劑肽，其中 Xaas 爲 4Aph(L-或 D-Hor)且 Xaa6 爲 D-4Aph(Ac)、D-4Aph(atz)或 D-3Pal (4Aph(atz)表示 4-(3’-胺基 _1H-If，2f，4f-三唑基- 5f- 基）胺基苯丙胺酸）。 6. 根據申請專利範圍第1或2項之GnRH拮抗劑肽，其中Xaa5爲4Aph(L-或D-Hor)而Q2爲Q且11爲11或甲基。 7. 根據申請專利範圍第1或2項之GnRH拮抗劑肽，其中 Xaas 爲 4Aph(L-或 D-Hor)且 Xaa6 爲 D-Cit 或 D-Hci。 8. 根據申請專利範圍第1或2項之GnRH拮抗劑肽， _____3____ ^紙張尺度通用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 訂：線 505658 g8S 六、申請專利範圍其中 Xia6 爲 D-4Aph(D-Hor)。 9. 根據申請專利範圍第1項之GnRH掊抗劑肽，其中 X 爲 For、Ac、Acr、Pn、By、VI、Vac、Bz 或 Q，而 Q係如申請專利範圍第1項中所定義； A 爲 4C1 或 4F ; D-Pal 爲 D-3Pal ; Xaa5 爲 Aph(Qi)或 Amf(Qi)，而 Qi 爲 Hor 或 Imz 之 D-異構物、L-異構物或D/L-異構物混合物； Xaa6 爲 D-Aph(Q〇、D_Amf(Q2)、D-Cit、D-Lys(Nic)或 D-Pal，而 Q〗爲 For、Ac、Q 或 Qi ; Xaas 爲 Lys(ipr);且 Xaa1〇爲 D-Ala-NH2、D-Ala-o卜 Ala-o卜 NHCH2CH3 或 Gly-NH2 (Acr :丙烯醯基；Pn:正丙醯基；By: 丁酿基 ;VI :戊醯基；Vac :乙烯乙醯基；Bz ··苄醯基）〇 10. 根據申請專利範圍第9項之GnRH拮抗劑肽，其中 Qi爲L-或D-Hor且爲D-4Amf(Q) ’而R爲Η或甲基。 11. 根據申請專利範圍第9項之GnRH拮抗劑肽，其中 X 爲 Ac 或 Q，R 爲 Η 或甲基，Xaa6 爲 D-4Aph(Q2)、D** 4Amf(Q2)或 D-3Pal，而 Q2 爲 Ac、Q 或 Qi ;且 Xaaio 爲 D-Ala-NH2。 12. 根據申請專利範圍第1項之GnRH掊抗劑肽，其具 ___4 __ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 、言線 A8B8C8D8 505658 六、申請專利範圍有下列分子式：Ac-DdNal-DJCpa-DJPal-SeMApha-Hoi:)-XawLeu-LysdprO-Pro-Xaai。，其中 Xaa6 爲 D-4Aph(Ac)、D-3Pa卜D-4Aph(胺甲醯基）、D-4Amf(胺甲酿基）、D-4Amf(甲基胺甲醯基)或 D-4Aph(D-Hor)，旦 XaaiQ 爲 D-Ala_NH2、D· Ala-ol 或 Ala-ol ( D-4Cpa 表示 D-4ClPhe) 〇 13. 根據申請專利範圍第12項之GnRH拮抗劑肽，其具有分子式 Ac-DJNal-DWCpa-D^Pal-SeMApha-Hor)- D -4Aph(胺甲醯基)-Leu-Lys(ipr)-Pro-D-Ala-NH2，或其醫藥上可接受之鹽。 14. 一種用於哺乳動物中抑制促性腺素分泌之醫藥組合物，其包含有效量作爲活性成分之根據申請專利範圍第1 、2及9至13項中任一項之GnRH拮抗劑肽，與無毒性之稀釋劑結合。 15· —種用於製造GnRH拮抗劑肽之中間物，其具有下列分子式：Xi-D-NaMA^-Phe-D-Pal-SeKXyXaas-Xaa^Leu-Lys(ipr)(X4)-Pro-X5，其中： X1爲α-胺基保護基； Α 爲 4C1 或 4F， X2爲Η或羥基保護基； Xaas 爲 Aph(Qi)或 Amf(Qi)，而 Q!爲 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁)

_ — 5_ 本紙張尺度適用中國國ϋ準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 505658 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 (D=或 L- Hor) (D-或 L- Imz) 之D-異構物、L-異構物或D/L-異構物混合物； Xaa6 爲 D-Aph(Q2)、D-Amf(Q〇或 D-Pal，而 Q2 爲 Ac、 Qi、胺甲醯基或甲基胺甲醯基； X4爲酸-不安定性胺基保護基；且 X5 爲 D-Ala-、Gly_、Ala-、Agl-、D-Agl-、Agl(Me)-或D-Agl(Me)-樹脂撐體；N(Et)-樹脂撐體；D-Ala、Gly或 Ala之醯胺，乙基醯胺；AzaGly-NH2 ;或OH。 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 訂ί 線本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐)