SI8710823A8 - Postopek za pripravo nonapeptidnih in dekapeptidnih derivatov hormona za sproščanje luteinizirajočega hormona - Google Patents

Description

P - 823/87

SYNTEX (U.S.A.) Inc. Palo Alto« Californija S A D

POSTOPA! ZA POBIJANJE NONAPSPTIDNIH I DEKAPEPTIDNIH DERIVATA HORMONA ZA OSLOBADJANJE LUTEINIŽIRAJUČEG

HORMONA

Oblast tehnike u kolu spada pronalazak Pronalazak spada u oblast sinteze peptida

Tehnički problem

Tehnički problem ko ji je rešen predmetnim pronalaskom jeste po-stupak za dobljen j e novih nonapeptidnih i dekapeptidnih derivata opšte formule (I) kao što je detaljno objašnjeno u daljem tekstu Derivati gornje formule (I) nisu do sada opisani u literaturi pa je 1 sam postupak nov i originalen.

Stanje tehnike

Ovo je izdvojena prijava iz prijave P-1553/8o

Luteinizirajuči hormon (IB) i folikularni stimulirajuči hormon (PSH) oslobadjaju se iz prednjeg dela hipofize pod kontrolom hormona za oslobadjanje LH-RH ko ji proizvodi u regionu hipotalamusa. LH i PSH dejstvu ju na polne čeli j e tako da stimulišu sinte zu steroidnih hormona i stimulišu sazrevanje gameta. Pulsativno oslobadjanje LH-RH, pa tako i oslobadjanje IH i PSH, kontroliše reproduktivni ciklus kod domačih životinja i ljudi. Dalje, LH-RH ima efekte u placenti, u oslobadjanju HCG, i direktno u polnim - 2 - čelijama. Analozi agonista LH-RH korisni su za kontrolu plodnosti pomoču dva mehanizma dejstva.Niške doze analoga LH-RH mogu stimulisati ovulaciju i kori sne au za tretira-nje hipotalamusne i ovulatome plodnosti. Dopunski se mogu koristiti za hipogonadna stanja 1 impotenci ju, i stimulišu spermatogenezu i androgenu proizvodnju kod mužjaka. Paradoksalno, veče doze vrlo snažnih i dugotrajnih analoga LH-RH ima ju suprotan efekat i blokira ju ovulaeiju kod ženki i potisku ju spermatogenezu kod mužjaka. U vezi sa ovim efek-tima je potiski vanje normalnih nivoa cirkulacije seksualnih steroida gonadnog porekla, uključujuči i smanjivanje težine pomocnog organa kod mužjaka i ženki. Kod domačin životinja ovaj paradoksalen efekat promovige porast težine u situacijama tova, stimuliše abortus kod gravidnih životinja i uglavnom, dejstvu j e kao sterilni stimulant.

Prirodni hormon kojijoslobadja hormon LH-RH je deka-peptid ko ji se sestoji od prirodnih amino-kiselina (koje iejaju L-konfiguraciju izuzev shiralne amino-kiseline ^ glicina). Njegova sekvenca je sledeča: (piro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Lau-Arg-Pro-Gly-NH2. Proučevani su mnogi analozi ovog prirodnog materijala i pokazalo se da velika večina ovih ima nedovoljnu biolosku aktivnost da bi bila klinički kori sna. Pokazalo se da izvesne iza-brane modifikacije imaju blagottoran efekat na biološku aktivnost. Daleko najznačajnija modifikacija dobiva se menjanjem ostataka u 6-položaju od Gly u D-amino kiselinu. Na primer, zamena GIy ostataka u 6-položaju sa 9-Ala, D-Leu, D-Phe ili D-3Jrp vodila je do serije analoga LH-RH. Vidi M. Monahan, et al. Biochem·, 12. 4616 (1973) «a /D Ala^/-LHRH; za /D Al86/-LHRH; J.A. Vilchez-Martinez, et el, .Biochem.

Biophys. Res. Comm, £2, 1226 /1974/ za /D-Leu^LHRH i desGly /D-Leu6, Pro NHEt9 /LHRH ; i W.Vale, et al, Clinical Sndocrinology, 5th Supp., Blackv/ell Sciantific Publications, Oxford, England /1976/, p. 2615 and D.K. Coy, at al; Biochem. Biophys. Res. Comm., 67, 576 /1979/ za D-Trp^/ LHRH.

Pored suštinskih povečanja u ektivnosti dobivenih gore spomenutim supstitucijaraa u položaju 6, dalja povečanja u aktivnosti mogu se postiči eliminisenjem Gljr-KHg u položaju lo tako da se dobi ja nonapeptid keo alkil-, cikloalkil- ili fluoroalkil-amid, ili zamenom Gly-NH2 sa alfe-azaglicinamidom. Vidi, na primer, K. Pujino, et al, Biochem. Biophys. Resp. Comm. 49 , 865 /1972/, D.H. Coy, et al. Biochem. 14, 1848 /1975/ i A. S Dutta, et al, J. Chem. Soc. Perkin I, 1979, 379.

Zamena N-metil-leucina umesto leucinskog ostgtka u polo* žaju z vodi do povečane stabilnosti prema enzimatskoj degradaciji. Vidi, na primer, K. Ling et al, Biochem. Biophys. Res.Com 62, 8ol, /1975/.

Zamene triptofenskog ostatke u položeju 5 se 3- /1-neftil/ -L-alaninom vodi do povečanja biološke snage. Vidi, na primer, K. U. Prasad. et al, J. Med. Chem., 1;, 4-92 /1976/ i Y. Yabe, Chem. Pharm. Buli., 24-, /12/, 314-9 /1976/.

Tirozinski ostatak u položaju 5 može se zameniti sa fe-nilalaninom ili 3-/l-pentafluorofenil/-l-alaninom se suštinskim zadrževanjem biološke aktivnosti. Vidi, na primer, H. Yanaihara, et al, Biochem._ Biophys_. Res. Comm., 16, 877 /1973/· 4.

Bilo bi poželeno da se naprave dalji LH-RH koji ima-ju čafc i veči stepen biološke aktivnosti od ranije opisane i ko ji se mogu koristiti klinički na životinjama i ljudima.

Opis rešenja tehničkog problema sa primerima izvodjerfja

Sadašnji pronalazak se odnosi na postupak za dobivanje novih nonapeptidnih i ekapeptidnih derivata LH-RH. Odre-djenije sadašnji pronalazak se odnosi na postupak za dobivanje derivata LH-RH koji imaju, u 6-položajti, specifične ostatke neprirodnih D-amino-kiselina koji sadrže lipofilne karbocikliona aril /ili perhidroaril/ prstena ili fenil /ili cikoheksil/ prsten koji je visoko alkil supstitui-san. t

Specifičnije jedinjenja obezbedjena postupkom iz sada šn j eg pronalaska su nonapeptidi i dekapeptidi formule :

/pyro/Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Arg-Pro-Z / I / i njihove farmaceutski prihvatljive soli: V je triptofil, fenilalanil ili 3-/l-uaftil/-L-alanil; W je tirozil, fenilalanil ili 3-/l-pentafluorofenil/-L-alanil; 5 X ,1e D-aminokiselinski ostatak 0 -NH-CH-C- i ch2 i

R

u kojoj je R /a/ redikal ko ji sadrži karboeiklični eril izabran iz grupe kojs sadrži naftil, antril, fluorenil, fenantril, bifenilil, benzhidril i fenil supstituisan sa tri ili više nizih alkil grupa pravog niza; ili /b/ zasičeni karbociklični redikal izabran iz grupe koja sadrži cikloheksil supstituisan sa tri ili više nizih alkil grupa pravog nize, perhidronaftil, perhidrobi-fenilil, perhidro-2, 2-difenilmetil i adamatil; Y je leucil, izoleucil, nor-leucil ili N-metil-leucil Z je glicinamid ili -NH-R1, gde je* R^ niži alkil, cikloalkil, fluoro nizi alkil ili a 2 -HH-č-RH-lr gde je p R vodonik ili niži alkil.

Kao što je naznačeno gore i radi podesnosti u opisi-vanju ovog pronalaska, konvencionalne skracenice za razne obične amino kiseline koriste se koo što je uglavncm pri-hvaceno u peptidnoj nauči kao što je preporučeno u IUPAC-IUB Xommission on Biochemical Nomenclature, Bioche-mi£try, 11, 1726 /1972/ i pretstavljaju L-amino-kiseline sa izuzetkom nehiralne amino-kiseline glicina i sa da-ljim izuzetkom amino-kiseline u 6-fK>ložaju označenih se X. Sve peptidne sekvence koje su ovde spomenute - 6 - napisane su prema uglavnom prihvacenoj koncepciji prema ko jo j je N-terminalno amino-kiselina na levo» a C-terminal-na amiuo kiselina na desno.

Kako se ovde koristi, termin "farmeceutski prihvatljive soli" odnosi se ne soli koje 'zedjržavaju željenu bioldšku aktivnost osnovnog jedinjenja i ne daju nikakve neželjene toksikološke efekte. Frimeri takvih soli su /a/ edicione soli sa kiselinama obrazovane sa neorganskim kis el in a ra a, na primer, hlorovodonicnom kiselinom, bromovodoničnom kiselinom, sumpornom kiselinom, fosfornom kiselinom, azotnoir. kiselinom i sličnira; i soli obrazovane sa organskim kiseli-na::.a kao što su, na primer, sircetna kiselina, oksalna kiselina, vinska kiselina, dilibarne kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, glukonska kiselina, limunska kiselina, jabučna kiselina, askorbinska kiselina, benzoeva kiselina, alginska kiselina, poliglutaminska kiselina, t8ninska kiselina, pamoinska kiselina, naftalinsulfonske kiseline, naftalindisulfonske kiseline,· poligalakturonska kiselina; /b/ soli sa polivalentnim metalnim katjonima kao Što su cink, kalcijum, bizmut, bari jum, magnezijum, aluminijum, bakar, kobalt, nikl, kadmi jum i slični; ili sa organskim katjonom ko ji je obra-zovan iz K,N' -dibenziletilen-diamina ili etilendiamine: ili /c/ kombinacije /a/i /b/ n.pr., cink-tanatna so i slično.

Kako se ovde koristi termin "nizi alkil" odnosi se na zasicenu ugljovodoničnu grupu pravog ili račvastog niza ko ja ima od 1 do 4· ugljenikova atoma kao što su, na primer, metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, izobutil, sec-butil i terc-butil; termin "cikloalkil grupe" odnosi se n8 cikličnu zasičenu ugljovodoničnu grupu koja ima od 3 do 6 ugljenikovih atoma, na primer, ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil i cikloheksil; termin "fluoro-niži alkil" odnosi se na nižu alkil grupu u kojo j je jedan ili više vodonikovih atoma Z8menjen sa fluorom, kao što su, na primer, trifluorometil, pentafluoroetil, 2,2,2,-trifluo-roetil i slični.

Kako se ovde koristi "naftil" uključuje 1- i 2-naftil; "antril" uključuje 1-, 2- i 9-antril; "fluorenil" uključuje 2-, 3~» 4- i 9~fluorenil, "fenantril" uključuje 2-, 3- i 9-fenantril; i "adsmantil" uključuje 1- i 2-adam8ntil,

Fostupak iz sadašnjeg pronalaska poželjno obezbedjuje jedinjenje gde x je 3-/naftil/-D-alanil ili 3-/2,4-,fi-t-rim*ti> fenilalenil; W je tirozil i Y je loucil ili R-raetil-leucil. Naročito su pozeljna jedinjenja /piro/ 61u-His-Trp-Ser-Tyr-3-/2-n8ftil/-rD-alanil-Leu-Arg-Pro-Gly-NH5, * ^ - t /piro/ Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-/2-naftil/-D-alanil-N-metil-

Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, /piro/ Glu-His-Phe-Ser-Tyr-3-/2-naftil/-D-alanil-Leu-Arg-Fro-Gly-NH2, /piro/ Glu-Kis-Trp-Ser-Tyr-3-/2-,^,6-trimetilfenil/-D-; alanil-Leu-Arg-Fro-Gly-KH2, /pire/ Glu-iiis-Trp-Ser-Tyr-3 /2-naftil/-D-alanil-Leu-Arg-Pro-RHEt, i /piro/ ^lu-His-Trp-Ser-Tyr-3/2-n3ftil/-D-al.jnil-K-;netil-Leu-Arg-Pro-NHEt, i njihove farmaceutski prihvatljive soli. - 8 -

Naročito je poželjan /piro/ Glu-his-Trp-Ser-Tyr-3-/2-rnaftil/-D-al3nil-Xeu-Arg-Pro-Gly-KH2 i njegove farma-ceutski prihvatljive soli.

Jedinjenja i naročito njihove soli, ispoljavaju no očekivano snažniju i dugotrajniju LH-RH agonističku atkivnoi u poredjenju sa prethodnim najsnažnijim LH-RH agonstima, na ime /piro/ Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Ser-Arg-Poo-Gly-NH2 i odgovorajučim polietilamidom. Primarna mera snage je sposobnost za parcijalno ili kompletno potiskivanje estrusa kod odraslih ženki pacova sa normalnim ciklusom /odredjivan u toku 2-nedeljnog periodg/ pomocu potkožne injekcije koja £ daje 2 puta dnevno.

Drugi bioeseji ko ji se koriste za LH-RH analoge i koji su korišceni za jedinjenja iz sadašnjeg pronalaska uključuju: /a/ indukciju ovulacije na diestr us ili proestrus ženkama pacove pomocu potkožne injekcije /Rippel et al, ···

Prač. Soc. Exp. Bj0i. Med.. 148. 1193 /1975/. /b/ I>H i FSH oslobadjenje pomocu dispergovanih celij-skih kultura prednjeg dela hipofize kao što je mereno radioimunoesejom /Vala, et al, Sndocrinology,91, 562, /1972/, i /c/ LH i F8H oslobadjanje u perifernu cirkulaciju ovariektomizovanih, steroidima tretiranih pacove kao reakcija na intravenoznu injekciju kao što se meri radioimuno-esejom /Arimura, et al, ^ndocrinologv, 90» 163 /1972/.

Ra višem nivou aktivnost ovih jedinjenja može se demonstrirati in vivo potiskivanjem spermatogeneze i cirkulacije i nivoa testosterona u testisima kao - 9 - i dramatičnim smanjivanjem veličine prostate na psima koji pate od benigne hipertrofije prostate.

Zbcg gornjeg, jedinenja se rnogu koristiti u raznim situacijama u koji;r.a je važna kontrola LH i FSH, ili direktnog gonadnog dejstva, uključujuci:

Fiziološke korisnosti /efekti niških doza/ indukcija ovulacije kod anovul8torne neplodnosti i za tajmiranu ovulaciju kod ženki sisara; terapija neplodnosti zbog nezadovoljevajuce lutealne funkcije kod žena; terapija hipogonadotropne ili hipogonadne neplodnosti kod ljudi oba polo; terapija sindrome cistični jajnici /nimfomanija kod ste ke; indukcija ili pojačavanje seksualnog ponašanja ili terapija impotencija /frugidnosti/

Paradoksalne korisnosti /efekti visokih doza/ - kontracepcija ženki; ^ -potiskivanje ili odlaganje ovulacije; - indukcija parturicije; - Sinhronizacija ovulacije; - supresija estrusa; -promocija rasta kod ženki sisara; -luteoliza, indkcija menstruacije; --abortivno dejstvo u ranom, prvem delu; -terapija ednometrioze; -terapija dojčanih tumoro i cista; -terapija policističnog sindroma u jajnicima /otain-Leventhal/; -terapija karcinome uterusa; - Ιο - - terapije benigne hipertrofije prostate i karcinome prostate. - kontracepcija mužjaka; - terapija bolesti ko.ie. nasteju preteranom pro^zvodnjoin gonadnih hormona na oba pole; • funkcionalna kastracija kod mužjaka životinja za proizvode ju hrane; - potiskivanje praznjenja proestrusa.

Dalje, ove jedinjenja kao i LH-RH jedinjenja iz predje-Šnje nauke demonstriraju iznenadjujucu novu korisnost kao abortivna sredstva očevidno inhibirsnjem nivoa cirkulacije HC6 i ima ju direktan utica j na placentu'. Efekat na placentu može sugerireti korisnost protiv horiokarcinoma.

Jedinjenja obezbedjena postupkom iz ssdašnjeg pro-nalaska imaju rszličite korisne primene. Tako se mogu koristiti za inhibiranje ovulacije, tretiranje endometri-ože, redukciju veličine prostate ili inhibiranje spermatoge neze kod pacijenata-sisara kojima je potrebno takvo tretira pri čemu pomenuto tretiranje obuhvata devanje pomenutom pacijentu efikasne količine jedinjenja iz sadašnjeg postup-ka kao što je ovde opiseno ili fermaceutskog preparata koji sadrži to jedinjenje. Frilikom koriščenja daje se pscijentu kojem je takvo tretiranje potrebno efikasna količina jedinjenja iz postupka ili farmaceutski preparat koji sadrži to jedinjenje. Ova jedinjenja ili preparati mogu se davati na makoji od resnih načina zavisno od - 11 - specifičnog krajnjeg koriščenje, uključujuci oralni, parenteralni /koji uključuje potkožno, intremuskularno i intravenozno davenje/, vaginalno/ naročito za kontracepci-ju/, rektalni, bukalni /uključujuci podjezični/, ili intrenažalni. ^3jpodesniji način u datom slučaju zavisiče od primene odredjenog aktivnog sastojka, pacijenta koji je u pitanju i procene lekara. Jedinjenja ili preparat mogu se takodje davati pomocu formulacija za lagano oslobadjsnje, depo ili implant formulacija kao što je potpunije opisano niže.

Uglavnom za primene koje su gore opisane, ko je su takozvane "paradoksalne" ili primene visokih doza, podesno je davati ektivni sastojak u količinama izmedju oko O.ol i looyUg/kg telesne težine ne dan, poželjno izmedju oko 0.-1 i 5·0 */ug/kg telesne težine na dan. Ovo davanje jEI9 / može postiči jednim davanjem u toku dana, raspodelom u nekoliko doza ili laganim oslobadjanjem u cilju postizanja najefikasnijih rezultata.

Tacna doza i opseg davanje ovih jedinjenja i preparata obavezno ce zevisiti od potreba pojedinačnog pacijente koji se tretira, od tipa tretiranja, stepena bolesti ili po-treb8 i, naravno, pd procene lekara. Uglavnom, parenteral-no davanje zahteva niže doze od drugih postupaka davanja koji više zavise od apsorpcije.

Sadašnja jedinjenja se dobro podnose i relativno sU - 12 - netoksične. Reprezentativna jedinjenja pokazuju LD^Q vrednosti potkožnim davanjem miševima znatno iznad 4o mg/kg, što je vrlo veliki faktor bezbednosti u odnosu na potrebne terapeutske doze-.

Za koriščenje jedinjenja iz pronalaska formulišu se u farmaceutske preparate koji sadrže kao aktivni sastojak je-dinpenja iz sadašnjeg postupka, pri Čemu preparati obuhvata· ju takvo jedinjenje u smeši za farmaceutski prihv8tljivim, netoksičnim nosačem. Kao što je spomentuo gore, takvi preparati mogu se napreviti za koriščenje za parenteralno /potkožno,intramuskularno ili intravenozno/ devanje na-ročito u obliku tečnih rastvora ili suspenzija; za koriščenje u vaginalnom ili rektalnom davanju naročito u polu-čvrstim oblioima k80 što su kremovi i supozitorije; za oralno ili bukalno davenje naročito u obliku tableta ili kapsule; ili za intranazalno davanje naročito u obliku prahova, nazalnih kapi ili aerosolova. ^ .vV;iv···-·.·'

Preparati se mogu podesno davati u jediničnom doznom obliku i mogu se nepraviti ma ko j im od dobro poznatih postu paka u farmaceutskoj tehnici, na primer, kao što je opisano u Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mačk Publishing Compariy, Easton, PA., 197o. Formulacije za parenteralno davanje mogu sadr?ati kao obične sestoje vodu ili slani rasLvor, polialkilenglikole kao što je polietilenglikol, ulje biljnog porekla, hidrogenizovane naftaline i slično. Formulacije za vaginalno ili rektalno davanje, n.primer, supozitorije, mogu sadrgati kao sastojke, n.pr., polialkilenglikole, vazelin, kako buter, i slično. Formulacije - 13 - za davenje inbalacijom mogu biti čvrste i sadrže kao sastojke, na primer, laktozu ili mogu biti vodeni ili uljani rastvori za davenje u obliku nazelnih kapi. Za bukelno davanje tipični sastojci uključuju šecere, kalci-jum stearat, magnezijum-stearat, preželatinirani škrob i slično.

Narocito je pošeljno da se jedinjenja daju pacijentu u toku produženih vremenskih perioda, na primer, perioda od jedne nedelje do jedne godine od prvog davanja. Mogu se kori stiti različiti oblici za lagano oslobadjanje, depo ili instant oblici. Na primer, dozni oblik može sadržati farma-ceutski prihvatljivu netoksičnu so jedinjenje koje ima nizal stepen rastvorijivosti u telesnim fluidima, na primer, /A/ neka adiciona so sa kiselinama sa nekom pclubaznom kiseli-nom kao što su fosforna kiselina, sumporna kiselina, limun-ska kiselina, vinska kiselina, taninska kiselina, pamoinska kiselina,alginska kiseline, poliglutaminska kiselina, naftalin mondHili naftalin-disulfonska kiselina, t>oliga*iaktus ronska kiselina i slično; /B/ so sa katjonorn takvog poli-valentnog metala kao što su cink, kalcijum, bizmut, barijum megnezijurn, aluminijum, bakar, kobalt, nikl, kadmijum i slični, ili sa nekim organskim katjonorn koji je obrazovnn iz n.pr., I^IP-dibenziletilendiamina ili etilendiamina; ili /c/ kombinacije /a/ i /b/, n.pr., cink-tanstna so. Dalje, jedinjenja iz sadašnjeg pronslaska ili, poseljno, takve relativno nerastvorena so kao što su one koje su baš opisar mogu se formulisati u oblik gela, na primer, aluminijum-monostearatnog gela sa, na pr., sezamovim uljem, koji je - 14 - podestan za injekcije. Naročite poželjne su soli cinskove soli, cink-tanetna soli, pamoatne soli, i slične. Drugi tip depo formulacije za legano oslobadjanje za injekcije sadržece jedinjenje ili so koje je dispergoveno ili kapsulireno u netoksičnom , ne-antigenom polimeru koji se legeno degradira kao sto je polimer polimlečna ki-selina/ poliglikolna kiselina, na primer, kao sto je opisano u U.S. 3-,773,919. Jedinjenje ili, po željno, relativno rastvorene soli kao što su one koje su opisane gore mo-gu se formulisati u pilule sa holesterolskom osnovom, neročito za koriščenje ne životinjama. dodatne formulacije za sporo ošlobadjenje, implant ili depo formulacije, n.primer, lipozomi, dobro su poznati u literaturi. Vidi, na primer, "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Sistems", J.R. Robinson ed., Karcal Dekker, Inc., wew Yor 1978. Odredjena referenca za jedinjenja LH-RH tipa može se nači na primer, u U«S. 4,oko, 125.

Polipeptidi se mogu sintetizovati ma koj im tehnikama koje su poznete stručnječita u peptidnoj nauči. Sjajan izvod mnogih takvih pristupačnih tehnika može se neči u J.M. Stevart and J. D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis" W.H. Preeman Co., S8n Francisco, 1969, and J. Hainhofer, "Hormona1 Proteins end Peptides", Vol. 2, p. 46, Academic Press /New York/, 1973 se sinteze peptida u čvrstoj fazi i K. Lubke, "The peptides", V0i. 1. Academic Press /New York/, 1965, za klasične sinteze u rastvoru.

Uglavnom, ovi postupci obuhvataju sekvencijalno dodavanje jedne ili više aminckiselina ili podesno - 15 - zešticenih emino-kiselina rastučem. peptidnom nizu. Normalno, bilo srnino ili karboksilne grupa prve aminp~kiseline štiti se sa podesnom zaštitnom grupom. Zašticena ili deratizovana aminokiselina može se tada spojiti za neki intertan čvrst nosa č ili se koristi u rastvčru dcdavanjem sledeče amino-kiseline u sekvenci koja ima komplementarnu /amino ili karbo-ksilnu/ grupu ko ja je podesno zašticena, pod uslovima koji su podesni za obrezovanje amidne veze. Zaštitna grupa se tada uklanja iz ostatka novo dodane amino-kiseline i tada se doda sledeča amino-kiselina /podesno zašticena/, i tako dalje. Pošto su sve amino-kiseline koje se žele spojene u pravilnu i » sekvencu, mskoje preostale zsštitne grupe /i makoji čvrst nosač/ uklanjaju se sekvencijalno ili konkurentno, tako da se dobiva finalni polipeptid. Jednostavnom modifikacijom ovog opšteg postupka, moguce je da se doda više od jedne emino-kiseline rastučem nizu, na primer, kuplovanjem /pod uslovima koji ne racemizuju hiralne centre/ zašticenog tri-peptida sepravilno za št ičefiim dipeptidom tako da se obrezuj« posle uklanjanje zeštite, neki pentapeptid.

Naročit© poželjan postupak za pravljenje jedinjenja iz sadašnjeg pronslaska uključuje sintezu peptida u čvrstoj fazi. ! u ovom naročito poželjnom postupku alfa"amino funkcija amino-kiselina štiti se pomocu grupe kojs je osetljiva naj kiselinu ili bazu. Takve zaštitne grupe treba da imaju oso- ! bine da su stalilne pod uslovima za obrezovanje peptidne veze, a da se mogu lako uklanjati bez razaranja rastučeg peptidnog niza ili racemizscije ms kojih hiralnih centara koji se u njemu naleze. Fodesne zaštitne grupe su t-butiloksilkarbonil /BbC/, benziloksilkarbonil /Cbz/, - 16 - bifenilizopropiloksikarbonil, t-amiloksikerbonil, izoborni-loksikarbonil, 8lf a,alfa-diraatil-3,5-dimetoksibenziloksi-karbonil, θ-nitrofenilsulfenil, 2-cijano-t-butiloksikarbonil 9-fluorenilmetiloksikarbonil'i slično, naročito t-birtiloksi-karbonil /Boc/.

Naročito poželjna grupa za zaštitu bočnog niza su, za erginin: nitro, p-toliosulfonil, 4-metoksibenzolsulfonil, Cbz, Boc i 8damantiloksikarbonil; za tirozin: benzil, ©-bro-mobenziloksikarbonil, 2,6-dihlorobenzil, izopropil, ciklo-heksil, ciklopentil i acetil; za sarin: benzil i tetrahidro-piranil; za histidin: benzil, g-toluolsulfonil i 2,4-dinitro fenil. C-terminalna amino~kiselina speja se za podastan čvrst nosač. Podasni čvrsti nosači koji su korisni u gorajoj sinte zi su oni materijsli koji su inertni na raagensa i raakcione uslove postepanih reakcija kondenzacija-uklanjanje zaštite, . atakodje su nerastvorni u korišcenim sredinama. Ppdesni čvrsti noseči su polimer hlorometilpolistirol-divinilbenzol, polimer hidroksimetil-polistirol-divinilbenzol, i slični, naročito koristen nosač je polimer benzihidrilamino-polisti-rol-divinilbenzol koji su opisali P. Rivaille, et el, Helv. Chim. Acta., 54, 2772 /1971/. Spajanje za hlorometil poli-stirol-divinilbenzolski tip smole vrši se pomoou reakcije jjalfa Zg§-ti0ene araino-kiseline, naročito Boc-amino-kiseline, kao što je njenja cezijumova, tetrametilamonijum, trietilamc nijum, 4,5-diazobiciklo/5.4.o/undec-5-en ili slična so u et? nolu, acetonitrilu, Ν,Κ-dimetilformamidu /DMF/ i slična, naročito cezijumova so u DMP, sa hlorometil smolom na povišent - 17 - temperaturi, na primer, na izmedju oko 4o i 6o°C, poželjno oko 5o°C, tokom oko 12 do 48 časova, poželjno oko 24 česa. N -Boo-amino-kiselina spaja se za benzhidrilarainsku smo-lu pomocu N,N*-dicikloheksilk'arodiimida /DCC/l-hidroksibenzo-triazola /HBT/ preko kuplovanje tokom oko 2 do 24 česa, poželjno oko 12 fiasova na temperaturi izmedju oko lo i 5o°C, poželjno 25 °C u takvoiu rastvaraču kao što je dihlorometsn ili DMF, poželjno dihlorometsn, Kuplovanje sukoesivnih zešticenih amino-kiseline može se vršiti u nekom automatskom pblipeptidnom sintetizatoru kao što je dobro poznato u nauči. Uklanjanje Nslf8-zaštitiih grupa može se vršiti u prisustvu, na primer, rastvora trifluorosirčetne kiseline u metilenhlori du, hlorovodonike u dioksanu, hlorovodonika u sirčetnoj kiselini, ili drugog jako kiselog restvora, poželjno 5o# trifluorosirčetne kiseline u dihlorometanu na temperaturi pko obične. Svaka zaštičena amino-kiselina se poželjno uvodi X u približno 2.5 molamom viSku i kuplevanje se može vršiti u dihlorometanu, smešama dihlorometan/DMF, DMF i sličnim, neročito u metilenhloridu na temperaturi oko obične.

Sredstvo za kuplovanje je normalno DCC u dihlorometanu ali može biti N^-di-izo-propilkarodiimid ili drugi karbo-diimid ili samostalno ili u prisustvu HBT, N-hidrokisukcin-imida, drugih N-hidroksiimida ili oksima. Alternativno se mogu koristiti zašticeni aktivni estri amino-kiselina /na primer, p-nitrofenil, pentafluorofenil i slični/ ili simetrični anhidridi.

Na kraju sinteze u čvrstoj fazi potpuno zeštičeni polipeptid odvoji se od smole. Kada je veza za nosač smole benzilesterskog tipa, raskidanje je pomocu aminolize sa nekim alkilaminom ili fluoroaliklaminom za peptide sa pro- - 18 - linskim C-termin. som, ili aminolizom sa, na primer, emonijak-metanolom ili amonijak/etanolom za peptide sa glicinskim C-terminusom na temperaturi izmedju oko lo i 5o°C, poželj-no oko 25°C, tokom izmed ju oko lo i 5o°C, poželjno oko 25°G, tokom izmedju 12 i 24 Sasa, požel jno oko 18 časova. Alternativno se peptid može odvojiti ss smole transesterifi-kacijom, n.primer, sa metanolom i zatim amonolizom. Zaštičen: peptid se može prečistiti u ovom trenutku hromotografijom na silika-gelu. Uklanjanje /bočni niz/ zaštitnih grupa iz polipeptida vrši se tretiranjem proizvode minolize sa, na primer, anhidrovanim tečnim fluorovodonikom u prisustvu enizola ili drugog hvatača karbonijum jona, tretiranjem sa kompleksom fluorovodonik/piridin, tretiranjem sa tris-/trifluoroacetil/borom i trifluorosirčetnom kiselinom, redukci jom se vodonikom i pa ladij umom na ugl jeniku ili polivinilpirolidonu, ili redukci jom sa netrijumom u tečnom amonijaku, poželjno sa tečnim fluorovodonikom i anizolom na temperaturi izmedju -lo i + lo°C, požel jno oko 0°C, tokom izmedju oko 15 minuta i 1 česa, poželjno oko 3o minute.

Za glicinske terminalne peptide na benzhidrilaminskim smolama, raskidanje smole i faze uklanjanja zaštite mogu se spojiti u jednu fazu koriščenjem tečnog fluorovodo-nika i anizola kao što je opisano gore. Peptid koji je pot-puno oslobodjen zaštite se tada pročisti pomocu sekvence hromatografskih faza koriščenjem ma kojeg od ili svih sledečih tipova: jonska razmena na slabo baznoj smoli u acetatnom obliku; hidrofobna adsorptivna hromatografija na nederivati-zovanom polistirol-divinilbenzolu /na primer, Ambedite XAD/:, silika-gel adsorptivna hromatografija; jonoizmenjiva-čka hromatografija na karboksimetilcelulozi; particiona -19- hromatografija, n. pr., na Sephadex G-25, ili suprotnosmislena distribucija, tečna hromatografija visokih performanei (HPLC), naroči-to HPLC u reversnoj fazi na oktil- ili oktadecilsilil-silicijumdioksid-• noj koloni sa vezanom fazom. A ko se koristi racemska amino-kiselina u 6-položaju, finalni nonapeptidni ili dekapeptidni proizvodi se odvaja ju, i žel jeni peptid koji sadrži D-amino-kiselinu u 6-položaju ižoluje se i prečisti, požel jno za vreme gore opisanog hromatografskog postupka. .

Pravljenje peptida koji imaju C-terminalne azaglicinske amide požel jno se vrši koriščenjem poznatih peptidnih intermedijera. Ovo . je opisano detaljnije u Primeru 2,

Sadašnji pronalazak se odnosi na postupak za pravljenje jedi-njenja formule

(piro )Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Arg-Pro-Z

(D i njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, u kojoj je V triptofil , fenilalanil ili 3-(l-naftil)-L-alanil, V je tirozil, fMiilalanil/ili 3-( l-pentafluorofenil)-l-alanil, X je D-amino kiselinski ostatak i? - NH - CH - C -

H

R

u kojoj je R (a) radikal koji sadrži karbociklični aril izabran iz grupe koja sadrži naftil, antril, fluorenil, fenantril, - 2ο- bifetiil.benzhidril i fenil supstituisan sa tri ili više nižih · alkil grupa pravog niza; ili /b/ zasičeni kerbociklični radikal izabran iz grupe koja sadrgi cikloheksil supstituisan sa tri ili vise nižih alkil grupa pravog niza, perhidronaftil, perhidrobifeni-lil, perhidro-2,2-difenilmetil i edamantil; Y je leucil, izoleucil, nor-leucil ili N-metil-leucil; Z de glicinanrid ili -NH-R^·, gde d® R1 niži slkil, cikloalikl, fluoro nizi alkil ili 0 o -NH-Č-NH-R^ gde de 2 R vodonik ili niži alkil, pri čemu postupak obuhvata: /i/ uklandanje zaštitnih grupa i, opciono, kovalentrc vezanog čvrstog nosača se zašticenog polipe|>tida tako«: da se dobiva dedindende formule /I/ ili ndegova so, i opciono /ii/ konverziju dedindende Formule /I/ u farmaceutski jprihvatldivu so, ili z .·' ' ·> '· . : /lil/ konverzfidu soli dedindende formulo /I/ u farmabeut ski prihv8tldivu so, ili /iv/ razlag3nde soli dedindende formule /I/ u Slobodan polipeptid formule /I/.

Sledeči primeri dati su da omoguce stručndacim3 potpu-nije razurr.evande i praktikovande sadašndeg pronalaska.

Oni ne treba da budu shvaceni kao ogrsničende obiroa pronala ska, več jedino služe da ga ilustrudu.

Preparat A U balon sušen u sušnici kodi sadrži 0.1 1 epsolutnog etanola /destilisan iz magnezidum-etoksida/ doda se 1.52 g· metalnog natriduma. Kada razvidande vodonika prestane, - 21 - doda se lo.2l g. etil 2-acetamido-2-cijanoacetata i 13.26 g. 2-bromometilnaftaline. Rastvor se zagreva na ref- luksu 1 čas i tada se ohladi. Etanol se ukloni pod smanjenii pritiskom i ostatak se sakupi u etilacetatu.· Organski sloj ' · se ispere sa dve partije od po 5o ml. vode, jednom partijom od $o ml. zasicenog natrijum-hlorida i suši se preko magne-zijum sulfata. Rastvor se filtruje, rastvarač se oters pod smanjenim pritiskom i ostatjk se hidrolizuje u loo ml. kon-centrovane hlorovodonične kiseline na refluksu tokom 2 časa.

Smeša se ohladi i talog sirovog proizvoda se filtru je. °.irovi proizvod se ponovo rastvori u o. 3 1. vruče vode ko ja sadrži 5 ml. koncentrovane hlorovodonične Y seline tretirane sa aktivnim ugljem, i pH rastvora se pode si na 6 se koncentrovanim amonijum-hidroksidom. Talog se fi truje i suši u vakumu tako da se dobiva 11.3 6* čistog 3-/2-neftil/.D,L-alanina tačke topljenja 23o-232°C. t

Ponavljanjem gornjeg postupka, ali zamenom 2-bromome-tilneftalina sa stehiometrijski ekvivalentnom količinom 1- brommetilnaftalina, 9-brommetilantracena, 9-brommetilfluorena, 2- brommetilantracen8, l-brommetilantracena, alfa-hloroizodurena, 4-brommetilbifenila, l-bromometiladaraantana, 3- bromometilfenantrena, 22- 1-hlorometli-2,4,6-tri-(n-butil)benzola i l-hlorometil-2,3,4,5,6-pentametilbenzola dobivaju se sledeče amino klseline: 3-(l-naftil)-D,L-aljanin, tt. 185-187°C, 3-(9-antril)-D,L-alanin, tt: 290°C (HC1 so) 3-(9-fluorenil)-DyvL-> -alanin, 3-(2-fluorenll)-D,L-alanin, tt: 264-269°C 3-(2-antril)-DfL-alanin, 3-(1-antril)-D,L-alanin, 3-(2f 4,6-trimetilfenil) -D,L-alanin, tt. 235-237°C, 3-(4-bifenilil)-O,L-alanin, tt. 290°C, 3-(-adamantil) -D, L-alanin, 3- (3-f enantril) -D ,L-alanin, 3-(2,4,6-tri(n-butil)fenil)-D,L-alanin i 3-(2,3,4,5,6-pentametilfenil) -0,L-alanin.

Preparat B

Rastvor 18,2g 1,1-difeniletilena, 25,3g metil alfa-metoksi-N-benziloksikarbonilglicinata i l,5g 2-naftalin sulfonske kiseline u 300 ml suvog benzola ref luksu je se 2 dana* Sirovi proizvod se prečisti na koloni silicijumove kiseline koriščenjem gradi jen ta C^Clj prema CHjClj/EtOAc >r(18:1) . . Prečiščeni metil 2-/1-(2,2-difeniletilenil) /-N-benzll-okslkarbonilglicinat se hidrolizuje u odgovarajuču kiselinu pomoču ras tvora 10,9 g KOH u 350 ml 10% vodenog rastvora metanola. Dobivena sirova kiselina se rastvori u 100 ml 95% etanola ko ji sadrši 3 ml koncentrovane HC1 i hidrogenizuje se u prisustvu 2 g 10% Pd na uglju tokom 24 časa, tako da se dobiva 2,4 g 3-(2,2-difenilmetil) -D,L-alanina, tt. 235-237 °C. - 23 -

Preparat C

Rastvoru 12.9 6· 3-(2-naftil)-D,L-alanina u 12o ral 1 K NaOH doda se 6.23 ml. acetanhidrida. i 6o ni. IM NaOH tokom 1/2 časa na 0°C. pH se podesi na 2 sa konc. dCL i dobiveni talog se filtruje. Čvrstq supstanca se rekristališe iz 6o$o vodenog etanola tako da se dobiva 12.2 g. N-acetil-3-(2-na-ftil) D,L-alani-na.

Rastvoru 15 6· ove N-Acetil-araino-kiseline u 24o ml. suvog metanola doda se 15.8 ml. bor-trifluorid eterata i; siješa se refluksuje 1 čas. Alkohol se ispari, doda se 2oo ral vode i rastvor se ekstrahuje sa etilacetatora. Organski sloj se ispere sa vodenom bazom i kiselinora, suši se preko MgSO^, filtruje se i ispari se do ulja. Kristalizacija ovog ulja iz smeše etilacetat/heksan daje 14.2 g. metil N-acetil-3-(2-naftil)-D,L-alaninata, t.t. 79-8o°C.

Ponavljanjem-gornjeg postupka ali zamenom 3-(2-naitil)-D,L-alanina sa stehiometrijski ekvivalentnora količinom 3~(l-naftil)-D,L-alanina, 3-(2-fluorenil)-D,L-alanina, 3-(2-antril)-D>L-alaninat i 3-(2,2-difenilraetil)-D,L-alariina, dobivaju se metil K-acetil-3-(l-naftil)-D,i-alaninat, t.t. 97.5-9Sc metil N-acetil-3-(2-fluorenil)-D,L-alaninat, tit. 17o-171°C. metil N-acetil-3-(2-antril)-D,L-alaninat, i metil N-acetil-S-(2,2-difenilraetil)-DiL~alaninat, t.t. 113-114°C. -24--

Preparat D

Rastvor 6.6 g. metil N-acetil-3-(2-naftil)-D,L-alani nata u smeši 3oo ml. dimetilsulfoksida, 12o ml. IH KG1 i 78o ml H20 tretira se sa 33·6 mg. enzima subtilizina u 3 ml. 0.1 H KC1. pH se odriava na 7 pomoču automatske titrs cije sa 0,2 M NaCH pomocu Radioraetar pH-metra # posie 3o minuta sakupi se 7o ml. NaOH rastvora i hidroliza se zaustavi. Rastvor se zaalkali sa 12 g NaHCO^ i ekstrahu-je se sa etilacetatom. Organski sloj je sadržao metil N-acetil-3-(2-naftil)-D-alaninat. Kristalizacija iz etil acetata/heksana dala je žutu čvrstu supstancu, t.t. 8o-81°C.

Ova se prevede u slobodnu amino-kiselinu i tada u N-Hoc amino-kiselinu na sledeči način:

Rastvor 2.5 g. metil N-acetil-3-(2-naftil)-D-alani-nata u 6o ml. 6N HC1 zagreva se na 12o-13o°G tokom 3 čas i ohladi se na sobnu temperaturu. Beo talog koji se obra zuje se sakupi i rekristališe iz 5o ml H2O koja sadrži 1 ml 12N HC1 neutrslizacijora sa NH^OH na pH 6, suši se ' vakumu tako da se dobiva 1.2 g 3-(2-naftil)-D-alanina, t.t. 24-2-24-4·°, /od/p5 26.6° (c 0.5, GH^OO^).

Mešani rastvor 3-(2-nafti±)-D-alanina u smeši 55 ml IN NaOH, lo ml 1^0 i 2o ml dioksana tretira se sa 1.4-8 g di-terc-butildikarbonata i 0.22 g. magnezijum-oksida na 0°. rosle 1.5 časa doda se još 0,13 g di-terc-butiidikar-bonata i sraeša se pusti da dodje na sobnu temperaturu. Čvrsta supstanca se odvoji filtracijom 1 filtrat se kon-centruje na 5o ml· Ovaj vodeni rastvor se dovede na pH 2,5 sa NaHSO^ i ekstrahuje se sa etilacetatom.Organski - 25 - sloj se ispere sa 5# NaHSO^, vodom i sa zasičenim rastvo-rom soli. Etilacetatni rastvor se suši preko magnezijum-sulfata, filtruje se i koncetitruje do ulja koje kristali*' iz etar/heksana tako da se dobiva 1.3 g K-Boc 3-(2-naftil D-alanina, t.t. 9o-91 °C^5 -32.6° (c 0.8, MeOH)..

Ponavljanjem gornjeg postupka,ali zamenom metil N-ace-til-3-(2~naftil)-D,L-alaninata sa stehiometrijski ekvival-ntnom kolicinom netil N-acetil-3-(l-naftil)-I),L-alaninata, metil N-acetil-3-(2-fluorenil)-D,l-alaninata, metil N-acetil-3-(2-antril)-DtL-alaninata, i metil N-acetil-3-(2,2-difenilmetil)-l),L«ralaninata alfa dobiva ju se sledeča N -Boc amino-rkiseline, pr«* odgovarajucih. slobodnih Ifiseiina (amino): N-3oc-3-(2.fluorofenil)-D-alanin, t.t. 92-93°C, /o6/|^54,8° (c 0.5 MeOH), N-Boc-3-(2-fiuorenil)-D-alanin, t.t. 161-163°C (rasp^. N-Boc-3-(2-antril)-D-eianin, i N-Boc-3-(2-antril)-D-alanin, t.t. 153-Χ5400.

Preparat E U Parr bocu Z3 hidrogsnizaciju stavi se 0.85 g 3-(2-naf-til)-D-alanina, loo ml 2M hlorovodonične kiseline i 0.85 g· Adamsovog kat^lizatora (?t02)· kastvor se pakuje pod 2,86kPa gasa tokom 2o Časa u Parr aparatu za lidrogenizaciju. Sm* ša se zagreva da se rastvori beli talog i filtruje se kroz diatoraajsku zemlju. Koncentracije rastvora pod smenjenim pritiskom i zatim liofilizacije iz vode daje 0.8 g 3-(2-perhidronaftil)-D-alanina kao bele supstance t.t. 23o-232°C.

Ovaj materijal se rastvori u smeši 3*2 ml. lN-NaOH, - 26 -

5 ral vode i 15 ral dioksana, i tretira se sa o.14 g. MgO 1 0.85 g· di-terc-butildikarbonata. Posle 1 časa na 0°C i 2 časa na 25°C. suspenzija se filtruje, koncentruje do suva pod smanjenira pritiskom, ostatak se rastvori u vodi, ispere se sa dietiletrora i zakiseli na pri 2 sa NaHSO^. Zakišeljeni vodeni sloj se ekstrahuje tri puta sa etilacetatom i ekstrakti se spoje, suše se preko MgSO^, filtruju, i koncentruju tako da se dobiva 0.75 6· N-Boc-5~(2-perhidronaftil)-D-ala-nina kao belo ulje.

Deo od 0*1 g. ovog meterijala rastvori se u 5 ral. tetra-hidrofurana i titruje se na 0°C sa sveže napravljenim diazo-metanom dok svetlo žuta boja ne bude postojana. Reakcija se gasi sa 1 ml siršetne kiseline, rastvarač se ispari i ostatak se raspodeli izmedju 75 ml. etilacetata i 75 ml vode.

Organski sloj se ispere sa 5^ NaHCO^, vodom, zasičenim rastvo rora NaCl i suši se preko MgSO^. Rastvor se filtruje, koncentruje pod smanjenim pritiskom,, i stavi se na preparativnu ploču za tankoslojnu gromatogirafiju (debeo: 75o^um silika-gel 2o x 2o cm.). Ploca se razvija sa dihlorometanom/etilacetatoi:-(18/1) i traka proizvoda se odvoji. Silika-gel iz trake proizvoda se ispere sa dihlorometanom/etilacetatom (9-»l) na nuČ staklenora levku i filtrat se koncentruje tako da se dobiva 0.1 g metil N-Boc-3-(2-?erhidronaftil)-d-alaninat kao svetlo žuto ulje.

Gvaj materijal se dobiva kao smesa dva izomera u 2 položaju pernidronaftalinskog jezgra. Cva diasteroizomerna je-dinjenja se mogu odvojiti na koloni za tačnu hromatogra-fiju sa visokim performansama (Lichrosorb silika-gel 6o, 5 mikrona) sa etilacetatom/heksanora (1:9) kao eluentom i - 27 - hidrolizlije 3e u 3lobodnu kiselinu, N-3oc-3-(2-perhidrona-ftil)-D-alanin.

Ponavljanjem gornjeg postuoka ali zamenom 3-(2>rnaftil)-D-alanina sa stehiometrijski ekvivalentno^ količinom 3-(l-naftil)-D-alanina, 3-(2,2-difenilmetil)-D-alanina, 3-(2,4,6-trimetilfenil)-D,L-alanina, 3-(4-bifenilil)-D-I-alanina 3-(2,4,6-tri (n-butil)fenil)-D,L-alanina, i 3-(2,3»4,5>6-pentanetilfenil)-D,L-alanina, dobivaju se sledeče i\-3oc amino-kiseline^ K-5oc-3-(l-perhidronaftil)-D-alanin I\-3oc^3--(perhidro-2,2-di£eRil!n3til)-D-al3nin, >:-Boc-3-(2,4,6Ttrinietilcikioheksil)-.L),L-alanin, N-Boc-3-(2,4,6-tri(n-butil)cikioheksii)-jj ,~-alariin, K-Bec-3-(2,3,4-,5»6-pentametilcikloneksil)-I!,L-alanin.

Primer 1 * U reakcioni 3ud Beckraan 99o Peptid sintetizera stavi se C.8 g. (C.8 rnmol.) benzhidrilamino-polistirol-divi-nil-oenzol smol® 'Lab 3ysteraa, Inc,) kao sto je opisane u riibaille, gore. An ,ηο-kiseline se do'aju sekvencij3inc na ovu smolu pomočil programa za sintezu kako sledi: 1 ispirenje sa Cd .33 2 1 out 1,5 minuta 2 5o > CFjCOgH/OH^C] 2~ 1 nut 1,5 min uklanjanje zaštite 3 5o* cf^cc2h/ch2ci2— 1 put 3o min 4 ispiranje sa CH2C12 3 puta 1,5 min

Paza 5 10$ trietilamin /OK^GI % 2 pute “1,5~ min. 6 ispiranje sa CI^CJ^ 3 puta 1,5 min. 7 rastvor Nalfa-Boc-amino-kiseline 1 put edicije 8 rastvof Ν,Ν’-dicikloheksilkarbodiimida 1 put adicija 9 Ispiranje sa CH2CI2 i držanje— 1 put reakcija kuplo kuplovenje vanjo,*2 Časa lo Ispiranje sa CH2CI2— adicija 3 puta 1,5 min. 11 Ispiranje sa etanolom 3 puta 1,5 min . 12 ispiranje sa etanolom 3 puta 1,5 min. 13 ispiranje sa 3 puta 1,5 min.

Peze 1-13 korapletiraju ciklus kuplovanja za jednu amino-kiselinu a korapletnost reakcije se proverava pomoeu ninhidrinskog postupka opisanog u E.Kaiser, et.sl., Anal.Biochem, 34-,595 /197o/.

Smola se kupluje sekvencijalno sa 2,5 molarnim viškom svake zašticene amino-kiseline i T)CC. Tako se smole tretira za vreme sukcesivnih ciklusa kuplovanja sa 0.4-33 g. B6c-Gly-0H 0.4-32 g. Boc-Pro-OH 0.857 S· Boc-Leu-CH o.4^2 g Boc-Leu-OH . o.5o4 g. Boc-3-/2-naftil/-D-alanina i 0.272 g*. 1-hidroksiben zotriazols 0.724- g. N-Boc, 0-2-bromobenziloksikarbonil-l-tirozina, 0.59 g· Boc-Ser /Benzil/OH, 0.608 g. B8c-Trp-0H, 0.654· g. Boc-His /Tozil/-OH, i 0,524- g. piroglutaminske kiseline

Smola se ukloni iz reekcionog suda, ispere se sa CH2CI2 suši u vakumu tako da se dobiva 2.o g. zašticene polipeptidne smo

Polipeptidni proizvod se istovmemeno ukloni sa smole i potpuno se osloboii zaštite tretiranjeu sa anhidrovanim tečnim HF Smeša 2.o g zašticene polipeptidne smole i 2 ml anizola /hvatač/ Kel-P reakcionom sudu tretrira se sa 2o ml. redestilisanog /iz CoP7/ anhidrovanog tečnog HP ne 0°C tokom 3o minuta. HP se ispari u vakumu i oststak /piro/-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-/2- -29- naftil)-D-alanil-Leu-Arg-Pro-Gljr-NH^ , u obliku njegove HF soli, ispere se sa etrom. Ostatak se tada ekstrahuje sa glacijalnom sir-četnom kiselinom. Ekstrakt sa sircetnom kiselinom se liofilizira do prinosa od 0.8 g sirovog materijala.

Sirovi polipeptid se nanese na 4 x 40 cm. Amberlite XAD-4 kolonu (kopolimer polistirol-4% divinilbenzol) i eluira se sa konkavnim gradientom iž vode (0.5 l) prema etanolu (1 l). Epruvete koje sadrže frakcije iz istisnute zapremine 690 ml. do 1,470 ml se sakupe i osušedo suva tako da se dobija 490 mg delimično prečiš-čenog polipeptida.

Uzorak od 150 mg parcijalno prečišcenog proizvoda podvrgne se particionoj hromatografiji na 3 x 50 cm. koloni Sephadex G-25 koriščenjem rastvaračkog sistema 1-butanol/toluol/sirčetna kiselina/ /voda koji sadrži 1.5%piridina u odnosima 10:15:12:18. čiste frakcije se sakupe na bazi tankoslojne hromatografije (silika-gel ; BuOH/ /H 2 O/HO A c/EtOAc ; 1:1:1:1) i HP1C (5 mikrona, reversna faza, oktadecilsilil pakovanje ; 40% 0.03 M NH^OAc/60% acetonitril). Že-Ijeni proizvod izlazi iz kolone u frakcijama iz istisnute zaprem ipe od 1 ,000 ml do 1,400 ml (Rf 0. l). Čiste frakcije se sakupe. ispare se do suva sakupe se u H^O i luofiliziraju tako da se dobija 57 mg. čistog piro-glutamil-histidil-triptofil-seril-tirozil-3-(2-naftil)-D--alanil-leucil-arginil-propil-glicinamida u obliku adicione soli sa sircetnom kiselinom , /b//^5 - 27.4°(c 0.9 , HOAc),t.t. 185-193°C (rasp.).

Primer 2 (j)

Jedinjenja formule (I) u kojima je Z-NH-CNH-R^ mogu se napraviti klasičnim rešenjima za sintezu. -30-

Na primer, može se koristiti sledeči prilaz kada je "AzaGlyNH2" -NH-NH-C-NH„ :

II 2 O (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OMe Cbz-Leu-Arg-Pro-AzaGlyNH2 · 1 (1) no2 (2)

Boc-3- (2-naftil) -D-A la- Leu-Arg-Pro-A zaGly-NH H+ (O (piro)Gly-His-Trp-Ser-Tyr-N2 '--?-- (piro )Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftil) -D-A la-Leu- A rg-Pro-A za-Gly-NH2 kao Slobodan peptid ili so.

Kuplovanje pojedinacnih fragmenata može se vršiti postup-kom pomoču acilazida (J.Honzel,et.al. ,Coll.Czech.Chem.Comm., 26 2333( 1971)), pomoču DCC/HBT kuplovanja ili pomoču drugih tehnika kuplovanja fragmenata slobodnih od racemizacije. Jedinjenja (l) 1,(2) su poznata (M.Fujino, et,al. ,Biochem.Biophys.Res.Comm. ,57, * 1248(1974) iA.S.Dutta, et.al. ,J.Chem.Soc.Perkin I, 1979 379). Jedinjenje (3) se pravi iz (2) pomoču uklanjanja Cbz i nitro grupa hidrogenolizom, i zatim kuplovanjem sa N-Boc-3-(2-naftil) -D-ala-ninom koriščenjem DCC/HBT ili drugog sredstva za kuplovanje kao što je poznato u nauči. Vidi Dutta, et.al., supra, za slične LH-RH analogne sinteze.

Slično koriščenjem drugih amino-kiselina umesto N-Boc-3--(2-naftil )-D-alanina, mogu se napraviti druga jedinjenja formule(I), n.pr.: -31- (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftil)-D-Ala-N-metil--Leu-A rg-Pro-A zaGlyNH2 i (piro )Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-( 2,4,6-trimetilfenil )-D- -A la-Leu-A rg-Pro-A ζθβΙγΝΗ^ . Takodje, prilikom pravljenja jedinjenja (2), koriščenje AzaGly-NH-niži alkil umesto Aza- -Gly-NH daje odgovarajuči peptid sa AzaGly-NH-nižim alkil £» ter minusom, n. pr., (piro)Glu-His-Trp-;Ser-Tyr-3-( 2-naftil )-D-Ala-Leu--A rg-Pro-A zaGly-Et, (piro )Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (2-naf il) -D-A la-N-metil--Leu-A rg-Pro-A zaGly-Et i (piro )Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (2,4,6-trimetilfenil) -D--A la-Leu-A rg-Pro-A zaGly-et.

Primer 3

Prema postupku primera 1, rastvori se u 3 ml trifluorsir-četne kiseline u 40 ml'centrifugalnoj tubi. Homogeni rastvor se fretira sa 35 ml apsolutnog etra i nastali talog se centrifugira.

Sloj koji pliva po površini se dekantuje i talog resuspenduje u 40 ml etra i za tim centrifugira. Nastali sloj koji pliva po površini se dekantuje i talog u centrifugalnoj tubi se pazljivo osuši u vakuumu dajuči deprotektirani C-terminalni pentapeptid kao beli prah. Zatim se 160 mg (0,24 mmola, 20%-tni višak) piro-Glu--His-Trp-Ser-Tyr-OH (dobijenog prema postupku primera l) i 65 mg (0,48 mmola, 100%-tni višak) benzotriazola se rastvori u 3 ml redestilisanog dimetilformamida (DMF) u 40 ml centrifugalnoj tubi, i posle hladjenja rastvora u ledu, doda se 54 mg (0,24 mmola) Ν,Ν-dicikloheksilkarbodiimida. Ovoj smesi se doda depro- -32- tektirani pentapeptid, dobljen prethodno, u rastvoru 3 ml DMF koji sadrži 30 x 10 S (0,27 mmola) N-metilmorfolina, i reakcija ostavi da se odvija 48 časova na 4°C. Analitička suprotno fazna HPLC ukazuje da je završena reakcija. Reakciona smesa se filtrira i koncentriše u vakuumu do ulja, prenese u 7 ml 0,005 M amonijum-acetata na pH 7, prečisti propuštanjem kroz karboksimetil-sefadeks kolonu (2,5 x x 100 cm, pharmacia) i eluira sa gradientom od 0,005 do 0,49 M amonijum-acetatnog pufera na pH 7 . Eluent kolone se prati pomocu UV-apsorpcije na 280 nm i poslednje frakcije koje eluiraju sa glavnim pikom se procenjuju pomocu analitičke HPLC. Produkat koji sadrži i i frakcije se ohladi i liofilizira dajuči 210 mg piroGlu-His--Trp-Ser-Tyr-D-Nal/2)-Leu-Arg-Pro-Glu-NH^ kao beli prah (/d/^ -66°, C 1, l%CH3COOH).

Produkat se može dalje prečistiti pomocu preparativne suprotno fazne HPLC, upotrebljavajuči C-18 kolonu (3 . 10 ^m, 2,5x100 cm, Lichroprep od Mercka), eluiranjem sa 40%GH^CN/ 60% vode, 0,03 M amonijum-acetat, pH 4,5.

Primer 4 160 mg Boc-D-Nal(2)- Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (dobijenog prema postupku primera l) se rastvori u 3 ml trifluorsirčetne kiseline u 40 ml centrifugainoj tubi. Deprotektiranje i dalji postupak se odvija egzaktno kao što je opisano u prethodnom primeru 3. Zatim se 157 mg (0,22 mmola, 10%-tni višak) piro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-N2H^ (dobijenog hidrazinolizom odgovarajuceg metilestra) rastvori u 7 ml redestilisanog DMF i 0,265 ml (6,5 ekvivalenata 5,4 molarne HCl/ /metanol u dvogrloj posudi od 50 ml koja je osušena u sušnici. Ras- -33- ο -6 / tvor se ohladi do -25 C, kome se doda 36,6 x 10 l (31,8 mg , 1,4 1,4 ekvivalenata) terc.butil-nitrita. Ras tvor se meša 10 minuta na -25°V, i zatim doda 0,165 ml (l,5 mmola) N-metilmorfolina (do pH 7,5). Ovoj smeši se doda rastvor deprotektiranog pentapeptida, dobijenog prethodno, u 4 ml DMF koji sadrži 30 x 10 N-metilmorfolina. Vrednost pH ras tvora se podesi do pH 7,5 i reakcija dopusti da se odvija 3 časa na -20°C i zatim* 48 časova na +4°C. Anali tička HPLC ukazuje da je završena reakcija . Reakciona smesa se filtrira i koncentriše do ulja u vakuumu, i zatim prečisti pomoču jono-izmenjivačke kromatografije na karboksimetil-sefadeks koloni, tačno kao što je opisano u primeru 3, prethodno. Frakcije se sakup-Ijaju i liofolizuju dajuci 195 mg produkta, piro-Glu-His-Trp-Ser--Tyr-D-Nal(2)-Leu-Arg-Pro-Glu-NH2, kao beiičast prah (/ ol/^ -62° , c 1%CH3C00H).

Produkat se može dalje prečistiti preparativnom suprotnofaz-nom HFLC upotrebljavajuči C-18 Lichroprep kolonu, kao što je opisano u prethodnom primeru 3.

Primer 5 126 mg (0,1 mmola) piroGlu-Trp-Ser-Tyr-D-Nal(2)-Leu-Arg-Pro-OH, se rastvori u 5 ml Ν,Ν-dimetilformamida, torne se doda 15 mg (0,11 mmola) 1-hidroksibenzotriazola i 22,7 mg (0,11 mmola) N,N'-dicikloheksilkarbodiimida, na 0°C. Reakcija se nastavlja 1 čas, zatim se doda 12,3 mg H^N-CO-NH^-HCl na 0°C. Vrednost pH se podesi na 8-9. Reakcioni rastvor se zatim meša preko noči na 0°C. Reakciona smesa se upari do suvog i ostatak prečisti propuštanjem kroz cefadeks kolonu upotrebljavajuči sledeči gradijent : -34- 0,0005 amonijum-acetata, pH -4,5-2,2 M NH^-acetat, pH-7 : 0,2 M NH ^-acetat, pH-7-0,5 M NH ^-acetat, pH-7. Posle koncen-trisanja odgovarajuce frakcije se liofilizuju. Produkat se dalje prečisti pomoču HPLC, upo trebi ja vajuči 2,5-100 cm kolonu C-18 sup-rotna faza, kolona 25-40 x 10 ^m veličina cestica (Lichroprep od E.Mercka), pokretna faza je 33% CH CN/0,06 M NH -acetat, O 4 pH-4,5. Odgovarajuce frakcije se koncentrišu i liofilizuju dajuci produkat piroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Nal( 2 )-Leu-Arg-Pro-Aza--Glu-NH .

M

Ustvari primeri 3 i 4 specifično opisuju kuplovanje 2 peto-člana fragmenta, a primer 5 je kuplovanje nonapeptida sa amino-kiselinskim ostatkom.

Claims (1)

1. Patentni zahtev 1. Eostupak za dobivanje peptida opšte formule (I) ( piro ) Glu-His-V-Ser-Tyr-X-Y-Arg-Pro-Z (I) u kojoj: V je triptofil, fenilanil ili 3-(l-naftil)-L-alanil, X je 3(R)-D-alanil gde R je 2-na£til, 1-naftil, 2-fluorenil, 2,2-difenilmetil, 4-bifenil, 2,4,6-trimetilfenil i 9-antril, Y je L-leucil i N-metil-L-ieucil i Z je NHNHC0NH2 i NH-CH2-C0-NH2 ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, naznačen time, što se vrši kuplovanje deveto-članog peptida (piro ) Glu-His-V-Ser-Tyr-X-Y-Arg-Pro sa amino kiselinskim ostatkom takvim kao što je Aza-Gly-NH2 u pogodnom organskom rastvaraču takvom kao što je dimetil- formamid i na temperaturi od >25 dd +25°C ,u prisutvu N,N'-dieikloheksilkarbodiimida i 1-hidroksibenzotriazola na PH 7,5 ili se pod istim uslovima vrši kuplovanje petočlanih fragmenata (piro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr i D-Nal (2 ) -Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 u prisutvu N ,N' -dicikloheksilkarbodiimida na pH 8-9, tako da se dobija peptid gormule (I) ko ji se dalje prema potrebi sa kiselinom prevodi u svoju farmaceutski prihvatljivu so· SYNTEX, SAD Zastupnik: Apstrakt pronalska U prijavi je opisan postupak za dobivanje peptida opšte formule (I) (piro ) Glu-His-V-Ser-Tyr-X-Y-Pro-Z (I) u kojoj: V je triptofil, fenilanil ili 3-(l-naftil)-L-alanil, X je 3(R)-D-alanil gde R je 2-naftil, 1-naftil, 2-fluorenil, 2,2-difenilmetil, *M>ifenilf 2,4,6-trimetilfenil i 9-antrilt Y je L-leucil i N-metil-L-leucil i Z je NHNHCONHg i NH-CHg-CO-NHg, ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli« rostupak obuhvata kuplovanje deveto-Članog peptida (piro)Glu-His-V-Ser-Tyr-X-Y-Pro sa amino kiselinskim ostatkom Aza-Gljr-NHg ili se vrši kuplovanje petočlanih fragmenta (piro)-Glu-HIs-Trp-Ser-Tyr i D-Nal(2)-Leu-Arg-pro-Gly-NH2 u pogodnom organskom rastvaraču takvom kao što je dimetil-formamid, na temperaturi od -25 do 25°C tako da se dobija peptid formule (I)· ^uplovanje se vrši u prisustvu N,N'-dicikloheksilkarbodiimida i 1-hodroksibenzotriazola na pH 8-9 Prema potrebi dobi jeni peptid se sa kiselinom prevodi u svoju farmaceutski prihtatljivu so·