FI72527B - Foerfarande foer framstaellning av en terapeutiskt anvaendbar polypeptid. - Google Patents

Description

ΓΒ1 m/UULUTUSjULKAISU 7 O C O 7 JSl® L J UTLÄGGN,NGSSKR,FT ' ^ ° ^ ' 0 p ^ ^ "t u Ί* y iv'|r'tty (45) τ”ΐ - 4· ^4- · 1 ’.- 7 ^ *- ^ ~ί - }·* ί ·ί ~)*y (51) Kv.lk.*/lnt.CI.* C 07 K 7/06 (21) Patenttihakemus — Patentansöknlng 80 1 856 (22) Hakemispäivä — Ansöknlngsdag 10.06.80

(H) (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 10.06.8 O

(41) Tullut julkiseksi — Bllvit offentlig 12.12 80

Patentti- ja rekisterihallitus Nähtäväks ipanon ja kuul.julkaisun pvm.— 07 Q9 87

Patent- och registerstyrelsen ' ' Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad ’ ' (86) Kv. hakemus — Int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begärd prioritet 11.06,79 USA (US) *47661 09-1 1.79 Ranska-Frankrike(FR) 792775*+ (71) Syntex (U.S.A.) INC., 3*+ 01 Hillview Avenue, Palo Alto, California, USA(US) (72) John Joseph Nestor, San Jose, California,

Gordon Henry Jones, Cupertino, California,

Brian Henry Vickery, Cupertino, California, USA(US) (7*4) Oy Koi ster Ab (5*0 Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen polypeptidin valmistamiseksi -Förfarande för framställning av en terapeutiskt användbar polypeptid

Keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen polypeptidin, jolla on kaava: (pyro)Glu-His-V-Ser-Tyr-X-Y-Arg-Pro-Z (I) ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, jossa kaavassa V on tryptofyyli, fenyylialanyyli tai 3-(1-naftyyli)-L-alanyyli; X on D-aminohappotähde 0 -NH-CH-C- CH2

R

2 72527 jossa R on karbosyklinen aryylin sisältävä radikaali, joka on valittu ryhmästä 1- ja 2-naftyyli, 1-, 2- ja 9-antryyli, 2-, 3-, 4-ja 9-fluorenyyli, 2-, 3- ja 9-fenantryyli, bifenylyyli, bentshyd-ryyli ja fenyyli, joka on substituoitu kolmella tai useammalla suoraket juisella C^^-alkyyliryhmällä: Y on leusyyli, isoleusyyli, norleusyyli tai N-metyylileusyyli; Z on glysiiniamidi tai -NH-R^, jossa R^" on C^_^-alkyyli tai 0 "22.

-NH-C-NH-R , jossa R on vety tai ^-alkyyli. Keksinnön mukaisesti valmistetut uudet yhdisteet ovat LH-RH:n nonapeptidi- ja dekapeptidijohdannaisia, joilla on 6-asemassa tiettyjä lipofii-lisiä D-aminohappoja.

Luteinisoiva hormoni (LH) ja rakkuloita stimuloiva hormoni (FSH) vapautuvat etumaisesta aivolisäkkeestä vapauttavan hormonin LH-RH, joka syntyy hypotalaamisella alueella, säätelemänä. LH ja FSH vaikuttavat sukurauhasiin stimuloiden steroidihormonien synteesiä ja stimuloiden sukusolujen kypsymistä. LH-RH:n sykkivä vapautuminen ja siten LH:n ja FSH:n vapautuminen säätelee lisääntymistä välittävää sykliä kotieläimissä ja ihmisissä. Lisäksi LH-RH:11a on vaikutuksia istukkaan vapauttamalla HCG ja suoraan sukurauhasiin. LH-RH:n agonistianalogit ovat käyttökelpoisia hedelmällisyyden säätelyyn kahdella toimintamekanismilla. LH-RH-analogien pienet annokset voivat stimuloida ovulaatiota ja ovat käyttökelpoisia hoidettaessa hypotalaamista ja ovula-toorista hedelmättömyyttä. Lisäksi niitä voidaan käyttää hypogo-nadaalisiin tiloihin ja impotenssiin sekä stimuloimaan spermato-geneesiä ja androgeenin tuotantoa miehessä. Paradoksaalisesti erittäin tehokkaiden ja pitkävaikutteisten LH-RH-analogien suuremmilla annoksilla on päinvastainen vaikutus ja ne estävät ovulaation naisessa ja tukahduttavat spermatogeneesin miehessä. Yhteydessä näihin vaikutuksiin on sukurauhasista peräisin olevien seksuaalisteroidien normaalien kiertomäärien tukahduttaminen, mukaanlukien väheneminen lisääntymiselimen painossa miehessä ja naisessa. Kotieläimissä tämä paradoksaalinen vaikutus edistää painon lisäystä syöttökarjan ollessa kysymyksessä, stimuloi keskenmenoa tiineissä eläimissä ja toimii yleensä kemiallisena ste-riloimisaineena.

3 72527

Luonnollinen hormoni, joka vapauttaa hormonin LH-RH, on dekapeptidi, joka koostuu luonnossa esiintyvistä aminohapoista (joilla on L-konfiguraatio lukuunottamatta akiraalista aminohappoa glysiini). Sen aminohapposekvenssi on seuraava: (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2. Tämän luonnon aineen monia analogeja on tutkittu ja pääosa niistä on osoittautunut biologiselta vaikutukseltaan riittämättömäksi ollakseen kliinisesti käyttökelpoinen. Tietyillä valintamodifikaatioilla on osoittautunut olevan edullinen vaikutus biologiseen aktiivisuuteen. Edullisin modifikaatio saadaan korvaamalla 6-asenan ryhmä Gly D-ami-nohapolla. Esimerkiksi 6-asemassa olevan Gly-ryhmän korvaaminen D-Ala:lla, D-Leu:lla, D-Phe:lla tai D-trp:lla on johtanut sarjaan LH-RH-analogeja, joilla on lisääntynyt aktiivisuus LH-RH:n g suhteen. Ks. M. Monahan et ai., Biochem. 12 (1973 ) 4615 /JD Ala_7-LHRH; J. A. Vilchez-Martinez et ai., Biochem. Biophys. Res. Comm.

59 (1974 ) 1226 ZX)- Leu® 7-LHRH ja desGly10 ZD-Leu6, Pro NHEt97-LHRH; D.H. Coy et ai., J. Med. Chem. 19 (1976) 423 iD-Phe67-LHRH; ja W Vale et ai., Clinical Endocrinlology, 5th Supp., Blackwell Scientific Publications, Oxford, Englanti (1976), s. 2615 ja D .

H. Coy et ai., Biochem. Biophys. Res. Comm. 67 (1979) 576 /J)-Trp_7-LHR.

Oleellisten aktiivisuuslisäysten lisäksi, jotka saadaan edellä mainituilla substituutioilla asemassa 6 voidaan aktiivisuutta edelleen lisätä poistamalla Gly-NH2 asemassa 10 antamaan nonanpeptidi alkyyli-, sykloalkyyli- tai fluorialkyyliamidina, tai korvaamalla Gly-NH2 of-atsaglysiiniamidilla. Ks. esimerkiksi M. Fujino et ai., Biochem. Biophys. Res. Comm 49 (1972) 863 D.H.

Coy et ai., Biochem. 14 (1975) 1848 ja A.S. Dutta et ai., J. Chem. Soc. Perkin I, 1979, 379.

Asemassa 7 olevan Leu-ryhmän korvaaminen N-metyylileusii-nilla johtaa lisääntyneeseen kestävyyteen entsymaattista hajoamista vastaan. Ks. esimerkiksi N. Ling et ai., Biochem. Biophys. Res. Comm. 63 (1975) 801.

Asemassa 3 olevan Trp-ryhmän korvaaminen 3-(l-naftyyli)-L-alaniinilla johtaa lisäykseen biologisessa tehokkuudessa. Ks. esimerkiksi K.U. Prasad et ai., J. Med. Chem. 19 (1976) 492 ja Y Yabe, Chem. Pharm. Bull 24 (1976) 12, 3149.

" 72527

Asemassa 5 olevan Tyr-ryhmä voidaan korvata fenyyliala-niinilla tai 3-(1-pentafluorifenyyli)-L-alaniinilla, jolloin säilytetään huomattava biologinen aktiivisuus. Ks. esimerkiksi N. Yanaihaira et ai., Biochem. Biophys. Res. Comm. 52 (1973) 64 ja D. Coy et ai., J. Med. Chem. 16 (1973) 877.

On ollut toivottavaa valmistaa muita LH-RH:n analogeja, joilla on jopa korkeampi biologinen aktiivisuus kuin edellä kuvatuilla ja joita voidaan käyttää kliinisesti eläimissä ja ihmisissä.

Keksinnön mukaisesti valmistetaan siis uusia kaavan I mukaisia LH-RH:n nonapeptidi- ja dekapeptidijohdannaisia, joilla on 6-asemassa tiettyjä lipofiilejä D-aminohappoja, sekä niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja.

Keksinnön mukaisesti kaavan I mukaiset yhdisteet valmistetaan analogiamenetelmin, joille menetelmille on tunnusomaista, että (a) lisätään peräkkäin yhtä tai useampaa aminohappoa tai sopivasti suojattua aminohappoa kasvavaan peptidiketjuun-, jonka jälkeen poistetaan peräkkäin tai samanaikaisesti suojaryhmät ja valinnaisesti kovalenttisesti sidottu kiinteä kantaja suojatusta polypeptidistä antamaan kaavan I mukainen yhdiste tai sen suola, tai (b) kaavan I mukaisen yhdisteen fragmenttia vastaava aminohappoa tai peptidi ja kaavan I mukaisen yhdisteen toista fragmenttia vastaava peptidi liitetään toisiinsa halutussa järjestyksessä ja valinnaisesti (c) muutetaan kaavan I mukainen yhdiste farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi, (d) muutetaan kaavan I mukaisen yhdisteen suola farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi, tai (e) hajotetaan kaavan I mukaisen yhdisteen suola vapaaksi kaavan I mukaiseksi polypeptidiksi.

Kaavan I mukaisia polypeptidejä voidaan syntetisoida siis millä tahansa peptidialaan perehtyneen tuntemalla menetelmällä. Erinomainen yhteenveto käytettävissä olevista monista menetelmistä löytyy J. M. Stewart * in ja J.D. Young*in julkaisusta "Solid Phase Peptide synthesis", WH. Freeman Co., San Francisco, 1969, 5 72527 sekä Meienhofer'in julkaisusta "Hormonal Proteins and Peptide", Voi. 2, s. 46., Academic Press (New York), 1973 kiinteä-faasi-peptidisynteeseille ja E. Schroder'in ja K. Lubke'n julkaisusta "The peptides", vol. 1. Academic Press (New York) 1965, klassista liuossynteesiä varten.

Yleensä nämä menetelmät käsittävät yhden tai useamman aminohapon tai sopivasti suojatun aminohapon lisäämisen kasvavaan peptidiketjuun. Normaalisti ensimmäisen aminohapon joko amino- tai karboksyyliryhmä suojataan sopivalla suojaryhmällä. Suojattu tai johdettu aminohappo voidaan sitten joko liittää inerttiin kiinteään kantajaan tai käyttää liuoksessa lisäämällä seuraava peräkkäinen aminohappo, jonka täydentävä (amino- tai karboksyyli-), ryhmä on sopivasti suojattu, olosuhteissa, jotka ovat sopivat amidisidoksen muodostamiseksi. Suojaryhmä poistetaan sitten tästä vastalisätystä aminohappotähteestä ja seuraava aminohappo (sopivasti suojattu) lisätään sitten ja niin edelleen. Senjälkeen kun kaikki halutut aminohapot on sidottu oikeaan jär-jestetykseen, kaikki jäljelläolevat suojaryhmät (ja jokainen kiinteä kantaja) poistetaan peräkkäin tai samanaikaisesti antamaan lopullinen polypeptidi. Tämän yleisen menettelytavan yksinkertaisella muunnoksella on mahdollista lisätä useampi kuin yksi aminohappo kerrallaan kasvavaan ketjuun, esimerkiksi liittämällä (olosuhteissa, jotka eivät rasemoi kiraalikeskuksia) suojattu tri-peptidi sopivasti suojattuun dipeptidiin muodostamaan, suojauksen poistamisen jälkeen, pentapeptidi.

Eräs erityisen edullinen menetelmä kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi käsittää kiinteäfaasipeptidisynteesin.

Tässä erityisen edullisessa menetelmässä aminohappojen ^-aminofunktio suojataan hapolla tai emäsherkällä ryhmällä. Tällaisilla suojaryhmillä tulisi olla ominaisuuksina, että ovat pysyviä olosuhteissa, joissa peptidisidos muodostetaan, samalla kun ne ovat helposti poistettavissa hajottamatta kasvavaa peptidiketjua tai rasemoimatta mitään sen sisältämistä ki-raalikeskuksista. Sopivia suojaryhmiä ovat t-butyylioksikarbonyy-li (Boc), bentsyylioksikarbonyyli (Cbz), bifenyyli-isopropyyli-oksikarbonyyli, t-amyylioksikarbonyyli, isobornyylioksikarbonyy-li, otj^-dimetyyli-3,5-dimetoksibentsyylioksikarbonyyli, o-nitro- 6 72527 fenyylisulfenyyli, 2-syaani-t-butyylioksikarbonyyli, 9-fluore-nyylimetyylioksikarbonyyli jne., erityisesti t-butyylioksikar-bonyyli (Boc).

Erityisen edullisia sivuketjun suojaryhraiä ovat arginii-nille: nitro, p-tolueenisulfonyyli, 4-metoksibentseenisulfonyyli, Cbz, Boc ja adamantyylioksikarbonyyli; tyrosiinille: bentsyyli, o-bromibentsyylioksikarbonyyli, 2,6-diklooribentsyyli, isopropyy-li, sykloheksyyli, syklopentyyli ja asetyyli; seriinille: bentsyyli ja tetrahydropyranyyli; histidiinille: bentsyyli, p-tolueenisulfonyyli ja 2,4-dinitrofenyyli.

C-pääteaminohappo liitetään sopivaan kiinteään kantajaan. Sopivia kiinteitä kantajia, jotka ovat käyttökelpoisia edellä mainittua synteesiä varten, ovat ne aineet, jotka ovat inerttejä reagoivien aineiden ja reaktio-olosuhteiden suhteen asteittaisissa kondensaatiosuojaryhmien-poistoreaktioissa, ja jotka samalla ovat liukenemattomia käytettyihin väliaineisiin. Sopivia kiinteitä kantajia ovat kloorimetyylipolystyreenidivinyylibentseeni-polymeeri, hydroksimetyylipolystyreenidivinyylibentseenipolymeeri jne., erityisesti kloorimetyylipolystyreeni-1-%:inen divinyyli-bentseenipolymeeri. Erikoistapausta varten, jossa yhdisteen C-pääte on glysiiniamidi, on erityisen käyttökelpoinen kantaja bentshydryyliaminopolystyreenidivinyylibentseenipolymeeri, kuten on kuvannut P. Rivaille et ai., Helv. Chim. Acta. 54 (1971) 2772. Liittäminen kloorimetyylipolystyreenidivinyylibentseenityyppi-seen hartsiin suoritetaan NoC-suojatun aminohapon, erityisesti Boc-aminohapon, sen keesium-, tetrametyyliammonium-, trietyyli-ammonium-, 4,5-diatsobisyklo-Z5,4,Ö7undek-5-eeninä tai samanlaisena suolana, reaktion avulla etanolissa, asetonitriilissä, N,N-dimetyyliformamidissa (DMF) jne., erityisesti keesiumsuolana DMF:ssa, kloorimetyylihartsin kanssa korotetussa lämpötilassa, esimerkiksi välillä n. 40-60°C, edullisesti n. 50°C:ssa.j n. 12-48 tunnin aikana, edullisesti n. 24 tunnin aikana. N ;>£-Boc-ami-nohappo liitetään bentshydryyliamiinihartsiin N,N1-disyklohek-syylikarbodi-imidi (DCC) 1-hydroksibentsotriatsolilla (HBT) välitetyn liitännän avulla n. 2- n. 24 tunnin aikana, edullises-t 12 tunnin aikana lämpötilassa välillä n. 10-50°C, edullisesti 25°C:ssa, liuottimessa, kuten dikkloorimetaanissa tai DMF:ssa,

II

7 72527 edullisesti dikloorimetaanissa. Peräkkäisten suojattujen aminohappojen liittäminen voidaan suorittaa alalla hyvin tunnetussa automaattisessa polypeptidisyntetisaattorissa. Noo-suojaryh-mien poistaminen voidaan suorittaa esimerkiksi liuoksen läsnäollessa, jossa on trifluorietikkahappoa metyleenikloridissa, kloorivetyä dioksaanissa, kloorivetyä etikkahapossa, tai muun vahvan hapon liuoksen, edullisesti 50-%risen trifluorietikka-hapon liuoksen dikloorimetaanissa läsnäollessa n. ympäristön lämpötilassa. Jokaista suojattua aminohappoa tuodaan edullisesti n. 2,5 moolissa ylimäärässä ja liittäminen voidaan suorittaa dikloorimetaanissa, dikloorimetaani/DMF-seoksissa, DMFrssa jne., erityisesti metyleenikloridissa n. ympäristön lämpötilassa. Kyt-kentäaine on normaalisti DCC dikloorimetaanissa, mutta voi olla N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidi tai muu karbodi-imidi joko yksinään tai HBTrn, N-hydroksisukkiini-imidin, muiden N-hydroksi-imidien tai oksiimien läsnäollessa. Vaihtoehtoisesti voidaan käyt-tä suojattuja aminohappoaktiivisia estereitä (esim. p-nitrofe-nyyliä, pentafluorifenyyliä jne.) tai symmetrisiä anhydridejä.

Kiinteäfaasisynteesin loputtua täysin suojattu polypepti-di poistetaan hartsista. Kun sidos hartsikantajaan on bentsyyli-esterityyppiä, lohkaisu tapahtuu aminolyysin avulla alkyyliamii-nilla tai fluorialkyyliamiinilla peptidejä varten, joilla on pro-liini-C-pääte, tai aminolyysillä, esimerkiksi ammoniakki/meta-nolilla tai ammoniakki/etanolilla peptideille, joilla on glysii-ni-C-pääte, lämpötilassa välillä n. 10-50°C, edullisesti n. 25°C:ssa, n. 12-24 tunnin, edullisesti 18 tunnin aikana. Vaihtoehtoisesti peptidi voidaan poistaa hartsista transesteröimällä, esim. metanolilla, mitä seuraa aminolyysi. Suojattu peptidi voidaan puhdistaa tässä vaiheessa piihappogeelikromatografiaa käyttäen. (Sivuketju)suojaryhmien poistaminen polypeptidistä suoritetaan käsittelemällä aminolyysituotetta esimerkiksi vedettömällä nestemäisellä fluorivedyllä anisolin tai muun karboniumhuuh-teluaineen läsnäollessa, käsittelemällä fluorivety/pyridiini-kompleksilla, käsittelemällä tris(trifluriasetyyli)boorilla ja trifluorietikkahapolla, pelkistämällä vedyllä ja palladiumilla hiilellä tai polyvinyylipyrrolidonilla, tai pelkistämällä natriumilla nestemäisessä ammoniakissa, edullisesti nestemäisellä s 72527 fluorivedyllä ja anisolilla lämpötilassa välillä n. -10 - +10°C, edullisesti n. 0°C:ssa n. 15 minuutista 1 tuntiin, edullisesti n. 30 minuuttia. Glysiinipäätepeptidejä varten bentshydryyliamii-nihartseilla hartsin lohkaisu ja suojauksen poistovaiheet voidaan yhdistää yhdeksi vaiheeksi käyttäen nestemäistä fluorivetyä ja anisolia kuten edellä kuvattiin. Polypeptidi, jonka suojaus on täysin poistettu, puhdistetaan sitten sarjalla kromatografisia vaiheita käyttäen jotakin tai kaikkia seuraavista tyypeistä: ioninvaihtoa heikosti emäksisellä hartsilla asetaattimuodossa; hydrofobista adsorptiokromatografiaa ei-johdetulla polystryeenidivi-nyylibentseenillä (esimerkiksi Amberlite XAD); piihappogeeliadsop-tiokromatografiaa; ioninvaihtokromatografiaa karboksimetyylisel-luloosalla; jakokromatografiaa, esim. Sephadex G-25:lla, tai vastavirta jakamista; suurtehonestekromatografiaa (HPLC), erityisesti vaihtofaasi-HPLC oktyyli- tai oktadekyylisilyylisilikaattifaasi-kolonnitäytteellä.

Jos käytetään raseemista aminohappoa 6-asemassa, diastereo-meerinen nonapeptidi- tai dekapeptidilopputuotteet erotetaan ja haluttu peptidi, joka sisältää D-aminohapon 6-asemassa, eristetään ja puhdistetaan, edullisesti edellä kuvatun kromatografisen prosessin aikana.

Peptidien, joissa on C-pääteatsaglysiiniamideja, valmistus suoritetaan edullisesti käyttäen klassista peptidiliuossynteesiä käyttäen tunnettuja peptidivälituotteita. Tämä on yksityiskohtaisemmin selostettu esimerkissä 3.

Keksinnön kuvaamisen helpottamiseksi käytetään tavanomaisia lyhennyksiä erilaisille tavallisille aminohapoille, jotka lyhennykset ovat yleisesti peptideille hyväksyttyjä ja IUPAC-IUB-Commission on Biochemical Nomenclature, Bichemistry, 11 (1972) 1726 suosittamia ja edustavat L-aminohappoja paitsi akiraal j.ami-nohappoa glysiini ja edelleen lukuun ottamatta 6-asemessa olevat X:llä·merkityt aminohapot. Kaikki tässä mainitut peptidisekvens-sit on kirjoitettu yleisen tavan mukaisesti, jolloin N-pääteami-nohappo on vasemmalla ja C-pääteaminohappo on oikealla.

Tässä käytettynä termi "farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat" tarkoittaa suoloja, jotka säilyttävät emäyhdisteen biolo- 9 72527 gisen aktiivisuuden eivätkä aiheuta epätoivottuja myrkyllisiä sivuvaikutuksia. Esimerkkejä tällaisista suoloista ovat (a) happoadditiosuolat, jotka on muodostettu epäorgaanisten happojen, esimerkiksi kloorivetyhapon, bromivetyhapon, rikkihapon, fosforihapon, typpihapon jne. kanssa; sekä suolat, jotka on muodostettu orgaanisten happojen, kuten esimerkiksi etikkahapon, oksaalihapon, viinihapon, meripihkahapon, maleiinihapon, fumaa-rihapon, glukonihapon, sitruunahapon, omenahapon, askorbiiniha-pon , bent soehapon , tanniinihapon , pamoiinihapon', algiinihapon , polyglutamiinihapon, naftaleenisulfonihappojen , naftaleenidi-sulfonihappojen ja polygalakturonihapon kanssa; (b) suolat moniarvoisten metallikationien, kuten sinkin, kalsiumin, vismutin, bariumin, magnesiumin, aluminiumin, kuparin, koboltin, nikkelin, kadmiumin, jne. kanssa; tai orgaanisen kationin kanssa, joka on muodostettu N,N’-dibentsyylietyleenidiamiinista tai etyleenidi-amiinista; tai (c) kohdan (a) ja kohdan (b) yhdistelmien kuten sinkkitannaattisuolojen jne. kanssa.

Tässä käytettynä termi C^_1+-alkyyli tarkoittaa suora- tai haaraketjuista tyydytettyä hiilivetyryhmää, jossa on 1-4 hiili-atomia, kuten esimerkiksi metyyliä, etyyliä, n-propyyliä, isopro-pyyliä, n-butyyliä, isobutyyliä, sek.-butyyliä ja tert.-butyyliä.

Tämän keksinnön edullisia yhdisteitä ovat ne, jossa X on 3-(2-naftyyli)-D-alanyyli tai 3-(2,4,6-trimetyylifenyyli)-D-ala-nyyli; Z on glysiiniamidi tai -NHEt; V on tryptofyyli tai fenyy-lialanyyli; ja Y on leusyyli tai N-metyylileusyyli. Erityisen edullisia yhdisteitä ovat (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyy-li)-D-alanyyli-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-( 2-nafcyyli)-D-a.lanyyli-N-metyyli-Leu-Arg-Pro-Gly-NH^, (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-trimetyylifenyyli)-D-alanyy~ li-Leu-Arg-Pro-Gly-Nl·^, (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyyli)-D-alanyyli-Leu-Arg-Pro-NHEt ja (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftvyli)-D-alanyyli-N-metyyli-Leu-Arg-Pro-NHEt sekä niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat .

10 72527

Erityisen edullinen on (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyyli)-D-alanyyli-Leu-Arg-Pro-Gly-Nf^ ja sen suolat.

Keksinnön mukaisesti valmistetuilla yhdisteillä ja erityisesti niiden suoloilla on yllättävän voimkas ja pitkävaikutteinen LH-RH-vastustava vaikutus verrattuna tähän asti tehokkaim-piin LH-RH-aganisteihin, nimittäin (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Ser-Arg-Pro-Gly-NH^:een ja vastaavaan prolyylietyyliamidiin. Tehokkuuden primaarimittana on kyky osoittain tai täydellisesti vaimentaa kiima normaalikiertoisissa täysikasvuisissa naaraspuolisissa rotissa (määritettynä 2 viikon jakson aikana) kahdella päivittäisellä ihonalaisella ruiskeella.

Muita eläinkoemäärityksiä, joita on käytetty LH-RH-ana-logeille ja joita on käytetty kaavan I mukaisille yhdisteille ovat: (a) ovulaatioinduktio dikiimaisissa tai prokiimaisissa naaraspuolisissa rotissa ihonalaisella injektiolla (Rippel et ai., Proc, Soc. Exp. Biol. Med. 148 (1975) 1193, (b) LH:n ja FSH:n vapautuminen dispergoiduilla etumaisen aivolisäkkeen solujen viljelmällä mitattuna radioimmunoanalyy-sillä (Vale et ai., Endocrinology 91 (1972) 562, sekä (c) LH:n ja FSH:n vapautuminen perifeeriseen kiertoon steroidilla käsitellyillä rotilla, joilta munasarja on poistettu, vastauksena laskimonsisäiselle injektiolle mitattuna radioimmu-noanalyysillä (Armura et ai., Endocrinology 90 (1972) 163.

Edistyneemmällä tasolla aktiivisuus näille yhdisteille voidaan osoittaa in vivo tukahduttamalla spermatogeneesi sekä kierto ja kivesten testosteronitasot sekä myös voimakkaalla vähenemisellä eturauhasen koossa koirilla, jotka kärsivät hyvänlaatuisesta eturauhasen liikakasvusta.

Seurauksena edellisestä yhdisteillä on käyttöä suuressa joukossa tilanteita, joissa LH:n ja FSH:n tai suoran sukurauhas-toiminnan säätö on tärkeä, kuten:

Fysiologiset käytöt (pienannosvaikutukset)

Ovulaatioinduktio anovulatoorisessa hedelmättömyydessä ja ajoitettua ovulaatiota varten naaraspuolisissa nisäkkäissä; hedelmättömyyden hoito, joka johtuu riittämättömästä lute-iinitoiminnasta naisissa; li 11 72527 typogonadotrooppisen tai hypogonadaalisen hedelmättömyyden hoito kummankin sukupuolen ihmisissä; rakkulamaisen munasarjan/nymfomaniaoireiden hoito karjassa; seksuaalisen käyttäytymisen aikaansaaminen tai parantaminen tai impotenssin/frigiditeetin hoito.

Paradoksaaliset käytöt (suurannosvaikutukset) - naisen hedelmöittymisen ehkäisy; - ovulaation tukahduttaminen tai viivyttäminen; - synnytyksen aiheuttaminen; - ovulaation synkronointi; - kiima tukahduttaminen; - kasvun edistäminen naaraspuolisissa eläimissä; - luteolyysin, kuukautisten aiheuttaminen; - varhaisen raskauden keskeytyslääke; - endometrioosin hoito; - nisäkasvainten ja rakkuloiden hoito; - monirakkulaisen munasarjaoireiston hoito (Stein-Leventhal) ; - kohtusyövän hoito; - hyvänlaatuisen eturauhasliikasvun ja eturauhassyövän hoito; - miehen ehkäisylääke; - sairauksien hoito, jotka sairaudet aiheutuvat liiallisesta su-kurauhashormonin tuotannosta kummassakin sukupuolessa; - funktionaalinen kastrointi urospuolisissa ruokaatuottavissa eläimissä; - esikiiman vaimentaminen.

Lisäksi nämä yhdisteet samoin kuin alan aikaisemmat LH-RH-yhdisteet osoittavat yllättävän uuden käytön raskauden keskeyttävinä aineina ilmeisesti estämällä HCG:n kiertomäärät ja suoralla vaikutuksella istukkaan. Vaikutus istukkaan voisi viitata käyt-tön kohdun suonikalvosyöpää vastaa.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan siis käyttää erikoistarkoituksiin (mukaanlukien käytöt, joita edellä kuvattiin LH-RH-analogeille), nimittäin ovulaation (ts. kontraseption) estämiseen naisella, endometriosiksen hoitoon, hyvänlaatuisen eturau-hashypertrofiän hoitoon ja spermatogeneesin estämiseen (ts. kont-raseptioon) miehillä.

12 72527

Kaavan I mukaisia yhdisteitä tai niitä sisältäviä yhdistelmiä voidaan antaa millä tahansa joukosta eri teitä riippuen nimenomaisesta loppukäytöstä, kuten suun kautta, parenteraali-sesti (kuten ihonalaisesti, lihaksensisäisesti ja laskimonsisäisesti), emättimen sisäisesti (nimenomaan kontraseptiota varten), peräsuolen kautta, poskensisäisesti (myös kielen alla) tai nenän-sisäisesti. Sopivin antotie jossakin määrätyssä tapauksessa riippuu käytöstä, nimenomaisesta vaikuttavasta aineosasta, kyseessä-olevasta kohteeesta ja lääkärin ratkaisusta. Yhdiste tai yhdistelmä voidaan myös antaa hitaasti vapauttavien, kesto- tai istutus-valmisteiden muodossa, kuten seuraavassa täydellisemmin selostetaan .

Yleensä käyttötarkoituksia varten, joita edellä kuvattiin, jotka ovat ns. "paradoksaalisia" tai suurannoskäyttöjä on tarkoi-tuksemukaista antaa aktiivista aineosaa määrissä välillä n. 0,01-100 pg/kg kehon painoa päivässä, edullisesti välillä n. 0,1-5,0 pg/kg kehon painon päivässä. Tämä antaminen voidaan suorittaa yhtenä ainoana päivittäisenä annoksena, jakamalla useammaksi annokseksi tai vapauttamalla hitaasti tehokkaimpien tulosten saavuttamiseksi.

Tarkka annos ja alue näiden yhdisteiden ja yhdistelmien antamiseksi riippuu välttämättä hoidettavan yksittäisen kohteen tarpeista, hoitotyypistä, kärsimyksen asteesta tai tarpeesta ja tietysti lääkärin arvioinnista. Yleensä parenteraalisessa antotavassa tarvitaan alempi annos kuin muissa antotavoissa, jotka ovat enemmän riippuvaisia absorptiosta.

Nämä yhdisteet ovat hyvin siedettäviä ja suhteellisen myrkyttömiä. Edustavien yhdisteiden LD^q-arvot annettaessa ihonalaisesti hiirille ovat hyvin yli 40 mg/kg; hyvin suuri turval-lisuuskerroin verrattuna hoitoannoksiin, joihin edellä viitattiin .

Farmaseuttisia yhdistelmiä, jotka sisältävät kaavan I mukaisia yhdisteitä, voidaan sopivasti antaa yksikköannosmuodossa ja voidaan valmistaa jollakin farmaasia alalla hyvin tunnetuista menetelmistä, kuten on kuvattu esimerkiksi julkaisussa Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA., 1970. Parenteraalisesti annettavat yhdistelmät voivat tavallisi-

II

13 72527 na apuaineina sisältää steriiliä vettä tai suolaliuosta, poly-alkyleeniglykoleja, kuten polyetyleeniglykolia, kasviperäisiä öljyjä, hydrattuja naftaleeneja jne. Emättimen tai peräsuolen kautta annettavat valmisteet, esim. peräpuikot, voivat apuaineina sisältää esimerkiksi polyalkyleeniglykoleja, vaseliinia, kaa-kaovoita jne. Sisäänhengittämällä annettavat valmisteet voivat olla kiinteitä ja sisältää apuaineina esimerkiksi maitosokeria tai voivat olla vesipitoisia tai öljymäisiä liuoksia annettaviksi nenätippojen muodossa. Posken kautta annettavia tyypillisiä apuaineita ovat sokerit, kalsiumstearaatti, magnesiumstearaatti, esihyytelöity tärkkelys jne.

Erityisen toivottavaa on toimittaa kaavan I mukaiset yhdisteet kohteelle pitkitettyinä ajanjaksoina, esimerkiksi, yhdestä viikosta yhteen vuoteen yhdestä ainaosta antokerrasta. Voidaan käyttää erilaisia hitaasti vapauttavia, kesto- tai is-tutusannosmuotoja. Annosmuoto voi sisältää esimerkiksi yhdisteen farmaseuttisesti hyväksyttävän, ei-myrkyllisen suolan, jolla on alhainen liukoisuusaste kehon nesteisiin. Lisäksi kaavan I mukaisia yhdisteitä tai, edullisesti, niiden suhteellisen liukenematon suola, voidaan muodostaa geeliksi, esimerkiksi, alumi-niummonosteraraattigeeliksi, esim. seesamiöljyn kanssa, joka sopii injektoitavaksi. Erityisen edullisia suoloja ovat sinkki-suolat, sinkkitannaattisuola, pamoaattisuolat jne. Eräs toisen-tyyppinen hitaasti vapauttava kestoyhdistelmä injektiointia varten sisältäisi yhdisteen tai suolan dispergoituna tai kapseloituna hitaasti hajoaavaan, ei-myrkylliseen, ei-antigeeniseen polymeeriin, kuten polymaitohappo/polyglukolihappo-polymeeriin, kuten on kuvattu esimerkiksi US-patentissa 3 773 919. Yhdisteet, tai, edullisesti, niiden suhteellisen liukenemattomat suolat, jollaisia edellä kuvattiin, voidaan muovata myös kolesteroli-matriisi-silasti-pelleteiksi, erityisesti käytettäviksi eläimissä. Muita hitaasti vapauttavia, kesto- tai istutusvalmis-teita, esim. liposomeja, tunnetaan hyvin kirjallisuudesta. Ks. esim. "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson, toimittaja, Marcel Dekker Inc., New York, 1978 Erikoisviite mitä LH-RH-tyyppisiin yhdisteisiin tulee, löytyy esimerkiksi US-patentista 4010125.

14 7252 7

Yhdisteiden farmaseuttinen vaikutus ilmenee seuraavis-ta kokeista.

Koe 1

Kiiman tukahduttaminen rotilla

Menetelmä: Naaraspuolisia rottia (Hilltop, Sprague Dawley, n. 200 g, emättimet avoinna) painoryhmitellään 5/häkki ja 2/häkki ryhmiin. Rottia injektoidaan ihonalaisesti, kahdesti päivässä (paitsi mitä alla mainitaan) 14 päivää. Päivittäiset emätinvoitelut tehdään kiimasykliasteen määrittämiseksi ja ruumiin painot merkitään muistiin 0, 1 ja 2 viikon jälkeen. Naaraiden, jotka osoittavat osittaista kiiman tukahtumista (ts. ainoastaan diestrusta ja proestrusta mutta ei estrusta) 4. päivästä lähtien ja naaraiden prosentti, jotka osoittavat täydellistä kiiman tukahtumista (ts. ainoastaan diestrus) 4. päivästä lähtien merkitään muistiin. ED^-arvot lasketaan estrus-tukah-tumisen prosenttiarvojen likiarvosuoralta. LHRH-analogit annettiin asetaattisuoloinaan fysiologisesti suolaliuoksesssa, joka sisälsi 0,1 % naudan seerumialbumiinia. Injektiotilavuus oli 0,2 ml ja analogia oli läsnä 0,05, 0,1, 0,2 tai 0,4 jig. Vertailu (fysiologinen suolaliuos, joka sisälsi BSA) ei osoittanut kiiman tukahduttamista. ED5Q-arvot yhdistetylle osittaiselle ja täydelliselle kiiman tukahduttamiselle ovat seuraavat:

Yhdiste ED5Q (jig/injektio) (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyyli)-D-alanyyli-Leu-Arg-Pro-Gly-N^ 0,08 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyyli)-D-alanyyli-Leu-Arg-Pro-NHEt 0,22 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyyli)-D-alanyyli-N.-MeLeu-Arg-Pro-Gly-N^ 0,07 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyyli)-D-alanyyli-N-MeLeu-Arg-Pro-NHEt 0,12 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-tri-metyylifenyyli)-D-alanyyli-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 0»08 is 72527

Yhdiste (jatkoa) ED^ (yig/injektio) (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(1-naf- tyyli)-D-alanyyli-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 0,3 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(9-antryy1i)- D-alanyyli-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 0,27 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(4-bifenylyyli)-D-alanyyli-Leu-Arg-Pro-Gly-NH^ 0,28a (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-fluorenyyli)-D-alanyyli-Leu-Arg-Pro-Gly-NH^ 0,4 0a (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-( 2,2-difenyyli--metyyli-D-alanyyli-Leu-Arg-Pro-NHEt 0,11 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-trimetyy-lifenyyli)-D-alanyyli-N-MeLeu-Arg-Pro-Gly-NH2 0,3 5a (pyro)Glu-His-3-(1-naftyyli)-L-alanyyli-Ser-Tyr-3-(2-naftyyli)-D-alanyyli-Leu-Arg-Pro-NHEt 0,16 a Näitä yhdisteitä annettiin ainoastaan kerran päivässä.

Koe 2 6 Swiss-Webster-hiirtä (Simonsen), joista kukin painoin n. 25 g, injektoitiin ihonalaisesti 0,25 ml :11a (pyro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyyli)-D-alanyyli-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2-asetaattisuolan vesipitoista liuosta. Annos oli 40 mg/kg eli n. 1 mg/hiiri. Hiiriä tarkkailtiin kahdesti päivässä kuolleisuuden suhteen 21 päivän ajan. Kuolettavia vaikutuksia ei havaittu. LD^q on sentähden suurempi kuin 40 mg/kg.

Seuraavat esimerkit annetaan, jotta alan ammattimiehet pystyisivät täydellisemmin ymmärtämään ja käyttämään tätä keksintöä.

72527 16

Valmistus A

Uunikuivaan pulloon, joka sisälsi 0,1 1 absoluuttista etanolia (tislattu magnesiumetoksidista) lisättiin 1,52 g natriuirnnetallia. Kun vedyn kehitys lakkasi, lisättiin liuokseen 10,21 g etyy-li-2-asetamido-2-syaaniasetaattia ja 13,26 g 2-bromimetyylinafta-leenia. Liuosta kuumennettiin palautusjäähdyttäen 1 tunti ja jäähdytettiin sitten. Etanolia poistettiin alennetussa paineessa ja jäännös koottiin etyyliasetaattiin. Orgaaninen kerros pestiin kahdella 50 ml:n annoksella vettä, yhdellä 50 ml:n annoksella kyllästettyä natriumkloridiliuosta ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla. Liuos suodatettiin, liuotin erotettiin alennetussa paineessa ja jäännös hydrolysoitiin 100 ml:ssa väkevää kloorivetyhappoa kuumentaen 2 tuntia palautusjäähdyttäen.

Hydrolyysiseos jäähdytettiin ja raakatuotteen sakka suodatettiin. Raakatuote liuotettiin uudelleen 0,5 l:aan kuumaa vettä, joka sisälsi 5 ml väkevää kloorivetyhappoa, jota oli käsitelty hiilellä, ja liuoksen pH asetettiin 6 teen väkevällä ammoniumhyd-roksidilla. Sakka suodatettiin ja kuivattiin tyhjössä antamaan 11,3 g puhdasta 3-(2-naftyyli)-D,L-alaniinia, jonka sulamispiste oli 230-232°C.

Toistamalla edellä kuvattu menettely ja korvaamalla 2-bro-mimetyylinaftaleeni stoikimetrisesti ekvivalentilla määrällä 1-bromietyylinaftaleenia, 9-bromimetyyliantraseenia, 2-bromimetyyli-fluoreenia, >~-kloori-isodureenia, 4-bromimetyylibifenyyliä, saadaan seuraavat aminohapot; 3-(l-naftyyli)-D,L-alaniini, sp- 185-187°C; 3-(9-antryyli)-D,L-alaniini, sp. 290° (HCl-suola), 3-(2-fluorenyyli)-D,L-alaniini, sp. 264-269°C; 3-(2,4,6-trimetyylifenyyli)-D,L-alaniini, sp. 235-237°C ja 3-(4-bifenylyyli)-D,L-alaniini, sp. 290°, vastaavasti.

Valmistus B

Liuosta, jossa oli 18,2 g 1,1-difenyylietyleeniä, 25,3 g metyyli-o(-metoksi-N-bentsyylioksikarbonyyliglysinaattia ja 1,5 g 2-naftaleenisulfonihappoa 300 mlrssa kuivaa bentseeniä, kuumennettiin palautusjäähdyttäen 2 päivää. Raakatuote puhdistettiin piihappokolonnissa käyttäen C^CH^^n gradienttia CH^Cl^/EtOAc :aan (18:1). Puhdistettu metyyli-2-Zl-(2,2-difenyylietylenyyli./-N-bentsyylioksikarbonyyliglysinaatti hydrolysoitiin vastaavaksi hapoksi liuoksella, jossa oli 10,9 g KOH 350 ml:ssa 10-%:ista ve- 72527 17 sipitoista metanolia. Saatu raakahappo liuotettiin 100 ml:aan 95-%:ista etanolia, joka sisälsi 3 ml väkevää HC1 ja hydrattiin 2 g:n 10-%:ista Pd/hiiltä läsnäollessa 24 tuntia antamaan 2,4 g 3-(2,2-difenyylimetyyli)-D,L-alaniinia, sp. 235-237°C.

Valmistus C

Liuokseen, jossa oli 12,9 g 3-(2-naftyyli)-D,L-alaniinia 120 ml:ssa 1 M NaOH, lisättiin 6,23 ml etikkahapon anhydridiä ja 60 ml 1 M NaOH 1/2 tunnin aikana 0°C:ssa. pH asetettiin arvoon 2 väkevällä HCl:llä ja saatu sakka suodatettiin. Sakka kiteytettiin uudelleen 60-%:isesta etanolista antamaan 12,2 g N-asetyyli-3-(2-naftyyli)-D,L-alaniinia.

Liuokseen, jossa oli 15 g tätä N-asetyyliaminohappoa 240 ml:ssa kuivaa metanolia, lisättiin 15,8 ml booritrifluoridi-eteraattia ja seosta kuumennettiin palautusjäähdyttäen 1 tunti. Alkoholi haihdutettiin, lisättiin 200 ml vettä ja liuosta uutettiin etyyliasetaatilla. Orgaaninen kerros pestiin vesipitoisella emäksellä ja hapolla, kuivattiin MgSO^tlla, suodatettiin ja erotettiin öljyksi. Tämän öljyn kiteyttäminen etyyliasetaatti/hek-saanista antoi 14,2 g metyyli-N-asetyyli-3-(2-naftyyli)-D,L-ala-ninaattia, sp. 79-80°C.

Toistamalla edellinen menettely ja korvaamalla 3-(2-naf-tyyli)-D,L-alaniini stoikiometrisesti ekvivalentilla määrällä 3-(l-naftyyli)-D,L-alaniinia, 3-(2-fluorenyyli)-D,L-alaniinia ja 3-(2,2-difenyylimetyyli)-D,L-alaniinia saadaan metyyli-N-asetyy-li-3-(l-naftyyli)-D,L-alaninaatti, sp. 97,5-98°C, metyyli-N-ase-tyyli-3-(2-fluorenyyli)-D,L-alaninaatti, sp. 170-171°C ja metyy-li-N-asetyyli-3-(2,2-difenyylimetyyli)-D,L-alaninaatti, sp. 113-114°C, vastaavasti.

Valmistus D

Liuosta, jossa oli 6,6 g metyyli-N-asetyyli-3-(2-naftyyli)-D,L-alaninaattia seoksessa, jossa oli 300 ml dimetyylisulfoksidia, 120 ml 1 M KC1 ja 780 ml H?0, käsiteltiin 33,6 mg:lla subti-lisiinientsyymiä 3 ml:ssa 0,1 M KC1. pH pidettiin 7:ssä titraa-malla automaattisesti 0,2 M NaOH:11a Radiometer pH-staatilla.

30 minuutin kuluttua 70 ml NaOH-liuosta oli otettu vastaan ja hydrolyysi lopetettiin. Liuos tehtiin emäksiseksi 12 g :11a NaHCO^ ja uutettiin etyyliasetaatilla. Orgaaninen kerros sisälsi metyyli- is 72527 N-asetyyli-3-(2-naftyyli)-D-alaninaatin. Kiteyttäminen etyyli-asetaatti/heksaanista antoi keltaisen jähmeän aineen, sp. 80-81°C.

Tämä muutettiin vapaaksi aminohapoksi ja sitten N-Boc-aminohapoksi seuraavasti:

Liuosta, jossa oli 2,5 g metyyli-N-asetyyli-3-(2-naftyy-li)-D-alaninaattia 60 ml:ssa 6N HC1, kuumennettiin 120-130°C:ssa 3 tuntia ja jäähdytettiin huoneenlämpötilaan. Muodostunut valkoinen sakka koottiin ja kiteytettiin uudelleen 50 ml:sta joka sisälsi 1 ml 12 N HC1 neutraloimalla NH^OHilla pH 6:een ja kuivattiin tyhjössä antamaan 1,2 g 3-(2-naftyyli)-D-alaniinia, sp. 242-244°, 26,6° (C, 0,5, CHgCC^H).

Sekoituksenalaista liuosta, jossa oli 3-(2-naftyyli)-D-ala-niinia seoksessa, jossa oli 55 ml IN NaOH; 10 ml H^O ja 20 ml dioksaania, käsiteltiin 1,48 g:lla di-tert-butyylidikarbonaat-tia ja 0,22 g :11a magnesiumoksidia 0°:ssa. 1,5 tunnin kuluttua lisättiin uudelleen 0,3 g di-tert-butyylidikarbonaattia ja seoksen annettiin tulla huoneen lämpötilaan. Sakka poistettiin suodattamalla ja suodos haihdutettiin 50 ml:ksi. Tämä vesipitoinen liuos saatettiin pH 2,5:een NaHSO^-.lla ja uutettiin etyyliasetaatilla. Orgaaninen kerros pestiin 5-%:isella NaHSO^.'lla, vedellä ja kyllästetyllä suolaliuoksella. Etyyliasetaattiliuos kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja haihdutettiin öljyksi, joka kiteytettiin eetteri/heksaanista antamaan 1,3 g N-Boc-3-(2-naftyy-li)-D-alaniinia, sp. 90-91°; Ζ.<^7^5 -32,6° (c, 0,8, MeOH).

Toistamalla edellinen menettely ja korvaamalla metyyli-N-asetyyli-3-(2-naftyyli)-D,L-alaninaatti stoikiometrisesti ekvivalentilla määrällä metyyli-N-asetyyli-3-(1-naftyyli)-D,L-ala-ninaattia, metyyli-N-asetyyli-3-(2-fluorenyyli)-D,L-alaninaattia ja metyyli-N-asetyyli-3-(2,2-difenyylimetyyli)-D,L-alaninaattia saadaan seuraavat Nd>(. -Boc-aminohapot, vastaavien vapaitten aminohappojen kautta: N-Boc-3-(l-naftyyli)-D-alaniini, sp. 92-93°C, 54,8° (c 0,5 MeOH), N-Boc-3-(2-fluorenyyli)-D-alaniini, sp. 161-163°C (hajoaa) ja N-Boc-3-(2,2-difenyylimetyyli)-D-alaniini, sp. 153-154°C, vastaavasti.

II

72527 19

Valmistus E

Parr-hydrauspulloon pantiin 0,85 g 3-(2-naftyyli)-D-ala-niinia, 100 ml 2 M kloorivetyhappoa ja 0,85 g Adam-katalyyttiä (Pt02)· Liuos pakattiin H^-kaasupaineessa 414- kPa 20 tunniksi Parr-hydrauslaitteeseen. Seosta kuumennettiin valkoisen sakan liuottamiseksi ja suodatettiin piimään läpi. Liuoksen haihduttaminen alennetussa paineessa, mitä seurasi lyofilisointi vedestä, antoi 0,8 g 3-(2-perhydronaftyyli)-D-alaniinia valkoisena jähmeänä aineena, sp. 230-232°C.

Tämä aine liuotettiin seokseen, jossa oli 3,2 ml lN-NaOH; 5 ml vettä ja 15 mldioksaania ja käsiteltiin 0,14 g:lla MgO ja 0,8 5 g :11a di-tert-butyylidikarbonaattia. 1 tunnin jälkeen 0°C:ssa ja 2 tunnin jälkeen 25°C:ssa suspensio suodatettiin, haihdutettiin kuiviin alennetussa paineessa, jäännös liuotettiin veteen, pestiin dietyylieetterillä ja hapotettiin pH 2:een NaHSO^lla. Hapotettua vesipitoista kerrosta uutettiin kolme kertaa etyyliasetaatilla ja uutteet yhdistettiin, kuivattiin MgS0^:lla, suodatettiin ja haihdutettiin antamaan 0,75 g N-Boc-3-(2-perhydronaf-tyyli)-D-alaniinia valkoisena öljynä.

0,1 g:n annos tätä ainetta liuotettiin 5 ml:aan tetra-hydrofuraania ja tiirattiin 0°C:ssa vastavalmistetulla diatsome-taanilla kunnes kirkkaankeltainen väri säilyi. Reaktio tukahdutettiin 1 ml :11a etikkahappoa, liuotin haihdutettiin ja jäännös jaettiin 75 ml:n etyyliasetaattia ja 75 ml:n vettä kesken. Orgaaninen kerros pestiin 5-%:isella NaHCO^lla, vedellä, 5-%:isella NaHSO^rlla, vedellä, kyllästetyllä NaCl-liuoksella ja kuivattiin MgSO^illa. Liuos suodatettiin, hiahdutettiin alennetussa paineessa ja levitettiin preparatiiviselle ohutkerroskromatografialevyl-le (750 p paksu, piihappogeeli, 20 x 20 cm). Levy kehitettiin dikloorimetaani/etyyliasetaatilla (18/1) ja tuotenauha poistettiin. Piihappogeeli tuotenauhasta pestiin dikloorimetaani/etyyli-asetaatilla 0:1) sintratussa lasisuppilossa ja suodos väkevöi-tiin antamaan 0,1 g metyyli-N-Boc-3-(2-perhydronaftyyli)-D-ala-ninaattia vaaleankeltaisena öljynä.

Tämä aine saatiin kahden isomeerin seoksena perhydronafta-leenirenkaan 2-asemassa. Nämä diastereomeeriset yhdisteet voi- 20 7 2 5 2 7 daan erottaa suurtehonestekromatografiakolonnilla (Lichrosorb piihappogeeli 60,5 mikronia) etyyliasetaatti/heksaani (1:9) elu-enttina ja hydrolysoida vapaaksi hapoksi, N-Boc-3-(2-perhydronaf-tyyli)-D-alaniini.

Esimerkki 1

Beckman 990 Peptide Synthesizer'in reaktioastiaan pantiin 0,8 g (0,8 mmol) bentshydryyliaminopolystyreenidiv.inyyli-bentseenihartsia (Lab Systems, Inc.), kuten on kuvannut Rivaille, supra. Aminohappoja lisättiin peräkkäin tähän hartsiin synteesi-ohjelman avulla seuraavasti:

Vaihe 1 CH2Cl2-pesu 1 kerta 1,5 min.

2 50 % CF3C02H/CH2C1 -- 1 kerta 1,5 min.

suojauksen poisto 3 50 % CF3C02H/CH2C12 — 1 kerta 30 min.

suojauksen poisto 4 CH2Cl2~pesu 3 kertaa 1,5 min.

5 10 % trietyyliamiini/CH2Cl 2 kertaa 1,5 min.

6 CH2Cl2-pesu 3 kertaa 1,5 min.

7 N:*>-Boc-aminohappoliuos 1 kerta add 8 N,N’-disykloheksyylikarbo- di-imidiliuos 1 kerta add 9 CH2C12 huuhtelu ja pidätys -- 1 kerta liitäntä- liittäminen reaktio 2 h 10 CH2Cl2—huuhtelu add 1 kerta 1,5 min.

11 CH2Cl2~pesu 3 kertaa 1,5 min.

12 etanoli-pesu 3 kertaa 1,5 min.

13 CHgCl^pesu 3 kertaa 1,5 min.

Vaiheet 1-13 tekevät valmiiksi liittämissyklin yhtä aminohappoa varten ja reaktion täydellisyys tarkistetaan E. Kaiser et ai’in ninhydriinimenetelmällä, Anal. Biochem. 34 (1970) 595.

Hartsiin liitettiin peräkkäin 2,5 moolinen ylimäärä kutakin suojattua aminohappoa ja DCC. Siten hartsia käsiteltiin peräkkäisten liittämissyklien aikana 0,433 g:11a Boc-Gly-OH, 0,43 g:11a Boc-Pro-OH, 0,857 g:11a Boc-Arg(tosyyli)-OH, 0,462 g :11a Boc-Leu-OH, 72527 21 0,504 g:lla Boc-3-(2-naftyyli M>alaniinia ja 0,272 g:lla 1-hydroksibentsotriatsolia, 0,724 g:lla N-Boc,0-2-bromibentsoyylioksikarbonyyli-L-tyrosiinia, 0,59 g:11a Boc-Ser (bentsyyli)-OH, 0,608 g:lla Boc-Trp-OH, 0,654 g:11a Boc-His(tosyyli)-OH ja 0,524 g:lla pyroglutamiinihappoa.

Hartsi poistettiin reakt ioastiasta, pestiin CH2C1 :Ha ja kuivattiin tyhjössä antamaan 2,0 g suojattua polypeptidi-hartsia.

Polypeptidituote poistetaan samanaikaisesti hartsista ja suojaus poistettiin täydellisesti käsittelemällä vedettömällä nestemäisellä HF:lla. Seosta, jossa oli 2,0 g suojattua poly-peptidihartsia ja 2 ml anisolia (huuhteluaine) käsiteltiin Kel-F reaktioastiassa 20 ml:lla uudelleentislattua (CoF^sta) vedetöntä nestemäistä HF 0°C:ssa 30 minuuttia. HF haihdutettiin tyhjössä ja (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyyli-D-alanyyli-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2:n tähden, HF-suolanaan, pestiin eetterillä. Jäännös uutettiin sitten jääetikalla ja jääetikkauute lyofilisoitiin antamaan 0,8 g raakatuotetta.

Raaka polypeptidi pantiin 4 x 40 cm:n Amberlite XAD-4 kolonniin (polystyreeni-4% divinyylibentseeni-sekapolymeeri) ja eluoitiin koveralla gradientilla vedestä (0,5 1) etanoliin (1 1). Putket, jotka sisälsivät jakeet poistovirtaustilavuudesta 690 ml -1,470 ml yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin antamaan 490 mg osittain ’puhdistettua polypeptidiä.

150 mg:n näyte osittain puhdistettua tuotetta saatettiin jakokromatografiaan 3 x 50 cm:n Sephadex G-25-kolonnissa käyttäen liuotinsysteemiä 1-butanoli/tolueeni/etikkahappo/vesi, joka sisälsi 1,5 % pyridiiniä, suhteissa 10:15:12:18. Puhtaat jakeet yhdistettiin ohutlevykromatografiän perusteella (piihappogeeli; Bu0H/H20/H0Ac/Et0Ac; 1:1:1:1) ja HPLC (5 mikronia, vaihtofaasi, oktadekyylisilyylitäyte; 40 % 0,03 M NH^OAc/60 % asetonitriili). Haluttu tuote tuli kolonnista jakeina ulosvirtaustilavuutena välillä 1,000 ml - 1,400 ml (Rf 0,1). Puhtaat jakeet yhdiste!- 22 72527 tiin, haihdutettiin kuiviin, koottiin i^Ochon ja lyofilisoi-tiin antamaan 57 mg puhdasta pyro-glutamyyli-histidyyli-trypto-fyyli-seryylityrosyyli-3-(2-naftyyli)-D-alanyyli-leusyyli-ar-ginyyli-propyyliglysiiniamidia etikkahappoadditiosuolanaan, -27,4° (c 0,9, HOAc) , sp. 185-193°C (hajoaa).

Esimerkki 2

Analogien, joilla on C-pääte Pro-NH-C^C^, synteesiä varten käytettiin synteesiohjelmaa, joka on samanlainen kuin esimerkissä 1 kuvattu. Beckamn 990 Synthesizer'in reaktioastiaan pantiin 2,13 g Boc-Pro-O-hartsia, joka oli valmistettu Boc-Pro-OH-kuvan cesiumsuolan reaktiolla kloorimetyyli-polystyreeni/1 % divinyylibentseenin kanssa ekvimolaareissa suhteissa (Lab Systems, Inc.). Käytetty Boc-Pro-O-hartsi-määrä sisälsi 1,4 mmoolia pro-liinia.

Hartsiin liitettiin peräkkäin 2,5 mooliylimäärässä kutakin suojattua aminohappoa ja DCC. Siten hartsi saatettiin peräkkäisten liitäntäsyklien aikana reagoimaan 1,61 g:n kanssa Boc-Arg(tosyyli)-OH, 0,93 g:n kanssa Boc-Leu-OH ^0, 0,94 g:n kanssa Boc-3-(2-naftyyli)-D-alaniinia ja 0,49 g:n kanssa 1-hydroksibentsotriatsolia, 1,75 g:n kanssa N-Boc-0-2-bromibentsyylioksikarbonyyli-L-tyrosiinia ja 1,11 g:n kanssa Boc-Ser(bentsyyli)-OH.

Synteesin tässä kohdassa suojatun polypeptidihartsin määrä jaettiin puoleksi ja toinen puoli käsiteltiin täydelliseksi peräkkäisillä reaktioilla 0,57 g:n kanssa Boc-Trp-OH, 0,77 g:n kanssa Boc-His(tosyyli)-OH ja 0,21 g:n kanssa pyroglutamiinihappoa.

Hartsi poistettiin reaktioastiästä, pestiin C^C^^lla ja kuivattiin tyhjössä antamaan 2,26 g suojattua polypeptidi-hartsia.

Suojattu polypeptidi lohkaistiin hartsista aminolyysillä 25 ml:11a etyyliamiinia 18 tunnin aikana 2°C:ssa Etyyliamiinin annettiin haihtua ja hartsi uutettiin metanolilla. Metanoli haihdutettiin antamaan 1,39 g pyro-Glu-His(tosyyli)-Trp-Ser(bentsyy- ti 23 7 2 5 2 7 li)-Tyr(2-bromibentsyylioksikarbonyyli)-3-(2-naftyyli)-D-ala-nyyli-Leu-Arg(tosyyliJ-Pro-NH-CHjCHg.

Raakapolypeptidistä poistettiin suojaus käsittelemällä seoksella, jossa oli 3 ml anisolia ja 30 ml uudelleen!islattua (CoF^rsta) vedetöntä nestemäistä HF 0°C:ssa 30 minuutissa Kel-F reaktioastiassa. HF haihdutettiin tyhjössä ja jäännös pestiin eetterillä. Jäännös liuotettiin 2M etikkahappoon ja lyofilisoi-tiin antamaan 0,82 g raaka-Cpyro)Glu—His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyy-li)-D-alaniini-Leu-Arg-Pro-NH-CH2CHg etikkahappoadditiosuolanaan. Lopullinen puhdistaminen saavutettiin preparatiivisella suurte-honestekromatografiällä 20 mg:n näytteestä 0,9 x 550 mm:n kolonnissa, jossa oli 40-50 poktadekyylisilyloitua silikaa (Merck, Lichroprep C^g). Eluenttina oli 64 % 0,03 M NH^OAc/36 % aseto-nitriili. Neljässä ajossa puhdistettiin yhteensä 61 mg raakaa ainetta. Kolmen lyofilisoinnin jälkeen vedestä saatiin 15 mg puhdasta pyroglutamyyli-histidyyli-tryptofyyli-seryyli-tyrosyy-li-3-(2-naftyyli)-D-alanyyli-leusyyli-arginyyli-proliini-etyyli-amidia etikkahappoadditiosuolanaan, sp. 180-190°C, -57,2° (C 1,1 HoAc).

Esimerkki 3 0 -- _ " 2 .

Kaavan I yhdisteitä, joissa Z on -NH-CNH-R voidaan valmistaa klassisella liuossynteesillä.

Voidaan käyttää esimerkiksi seuraavaa tapaa, jossa ’'AzaGlyNH2" on 0 -NH-NH-C-NH2: (pyro)Glu-His-Trp-Ser- Cbz-Leu-Arg-Pro-AzaGlyNH2

Tyr-OMe N02 (1) I (2) -M/

Boc-3-(2-naftyyli-D-Ala-v/ Leu-Arg-Pro-AzaGly-NHj (pyro)Glu-His-Trp-

Ser-Tyr-Ng H

H-3-(2-naftyyli-D-Ala-Leu-Arg-Pro-AzaGly-NH2 (3)

“I-J

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyyli)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Aza-Gly-NH2 24 72527 ry r vapaana peptidinä tai suolana, -34,3° (0,34 % HOAc).

Yksittäisten fragmenttien liittäminen voi tapahtua asyy-liatsidimenetelmällä (J. Honzel et ai., Coll. Czech. Chem. Comm.

26 (1971) 2333), DCC/HBT-liitännällä tai muulla rasemointivapaal-la fragmenttien liitäntämenetelmällä. Yhdisteet (1) ja (2)ovat tunnettuja (M. Fujino et ai., Biochem. Biophys. Res. Comm. 57 (1974) 1248 ja A. S. Dutta et ai., J. Chem. Soc. Perkin I 1979, 379, vastaavasti). Yhdiste (3) valmistetaan (2):sta poistamalla Cbz ja nit-roryhmät hydrogenolyysillä, mitä seuraa liittäminen N-Boc-3-(2-naf-tyyli)-D-alaniinin kanssa käyttäen DCC/HBT tai muuta alalla tunnettua liittämisainetta. Ks. Dutta et ai., supra, samanlaista LH-RH-analogien synteesiä varten.

Samalla tavalla käyttäen muita aminohappoja N-Boc-3-(2-naf-tyyli)-D-alaniinin asemasta voidaan valmistaa muita kaavan I yhdisteitä .

Valmistettaessa yhdistettä (II) atsaGly-NH-alemman alkyylin käyttö atsa-Gly-NH^ asemesta antaa vastaavan peptidin, jolla on atsa-Gly-NH-alempi alkyyli-pääte.

Esimerkki 4

Toistamalla esimerkin 1 menettely ja käyttämällä joko D-aminohappoa tai D,L-aminohappoa asemassa 6 (jälkimmäisessä tapauksessa erottaen diastereomeeriset peptidit kromatografiän aikana), korvaamalla sopivat aminohapot kiinteäfaasisynteesisarjassa saadaan seuraavat dekapeptidit, jotka eristetään ja luonnehditaan etikka-happoadditiosuoloinaan: (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(3-(9-antryyli)-D-Ala)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, sp. 187-195°C.

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(3-(2,4,6-trimetyylifenyyli)-D-Ala)-N-MeLeu-Arg-Pro-Gly-NH2j sp. 178-186°C

pyroglutamyyli-histidiyyli-tryptofyyli-seryyli-tyrosyyli-3-(2-naftyyli)-D-alanyyli-N-metyylileusyyli-arginyyli-prolyyli-glysiiniamidi, -26,6° (C=l, HOAc); pyroglutamyyli-histidyyli-tryptofyyli-seryyli-tyrosyyli-3-(l-naftyyli)-D-alanyyli-leusyyli-arginyyli-propyyli-glysiini-amidi, sp. 173- 5°C. -28,1° (C=0,8, HOAc); 11 25 72527 pyroglutamyyli-histidyyli-tryptofyyli-seryyli-tyrosyyli-3-(2-fluorenyyli)-D-alanyyli-leusyyli-arginyyli-propyyli-glysii-niamidi, -2 5,8° (C = l, HOAc); pyroglutamyyli-histidyyli-tryptofyyli-seryyli-tyrosyy-li-3-(4-bifenylyyli-D-alanyyli-leusyyli-arginyyli-propyyli-gly-siiniamidi, U<.7^ -35,7° (C=l, HOAc); pyroglutamyyli-histidyyli-tryptofyyli-seryyli-tyrosyyli-3-(2,4,S-trimetyylifenyylii-D-alanyyli-leusyyli-arginyyli-pro-lyyli-glysiiniaraidi, £7^77^ -42,1° (C = l, HOAc);

Esimerkki 5

Toistamalla esimerkin 2 menettely ja käyttämällä joko D-aminohappoa tai D,L-aminohappoa asemassa 6 (jälkimmäisessä tapauksessa erottaen diastereomeeriset peptidit kromatografiän aikana) , korvaamalla sopivat aminohapot kiinteäfaasisynteesisar-jassa, saadaan seuraavat nonapeptidit, jotka eristetään ja luonnehditaan etikkahappoadditiosuoloinaan: pyroglutamyyli-histidyyli-fenyylialanyyli-seryyli-tyrosyy-li-3-(2-naftyyli)-D-alanyyli-leusyyli-arginyyli-proliini etyyli-amidinaan, sp. 180-190°C, /-7.7^ -57,2° (C = l, 10 % HOAc), pyroglutamyyli-histidyyli-3-(l-naftyyli)-L-alanyyli-seryy-li-tyrosyyli-3-(2-naftyyli)-D-alanyyli-leusyyli-arginyyli-prolii-nin sen etyyliamidina, sp. 160-170°C, -45,3° (C = l, HOAc), pyroglutamyyli-histidyyli-tryptofyyli-seryyli-tyrosyyli-3-(2,2-difenyylimetyyli)-D-alanyyli-leusyyli-arginyyli-proliini sen etyyliamidina, sp. 176-206°C 33,7° (C = l, 10 % H0Ac), pyroglutamyyli-histidyyli-tryptofyyli-seryyli-tyrosyyli-3-(2-naftyyli)-D-alanyyli-N-metyylileusyyli-arginyyli-proliini sen etyyliamidina, sp. 170-185°C, [s>U^ -81,1° (C = 0,7, 10 % HOAc), Esimerkki 6 A. Liuos, jossa on 0,1 g (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyyli)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2:n (ks. esimerkki 1) fluori-vetysuolaa liuotetaan 50 ml:aan vettä ja viedään kolonnin läpi, jossa on 50 g Dowex 3 anioninvaihtohartsia, joka oli sitä ennen tasapainoitettu etikkahapolla ja pesty deionoidulla vedellä. Kolon-ni eluoidaan deionoidulla vedellä ja ulosvirtaus lyofilisoidaan antamaan vastaava (pyro)Glu-His-'Trp-Ser-Tyr-3- ( 2-naftyyli)-D-ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH^ :n et ikkahapposuola, /7^7^ -2 7,5° (C 0,9, HOAc).

26 7 2 5 2 7

Toistamalla edellinen ja korvaamalla etikkahappo hartsin tasapainoittamisen aikana muilla hapoilla saadaan, esimerkiksi, vastaavat suolat kloorivetyhapon, bromivetyhapon, rikkihapon, fosforihapon, typpihapon, bentsoehapon jne. kanssa.

Samalla tavalla voidaan valmistaa kaavan I muiden yhdisteiden happoadditiosuolat.

B. Kun kysymyksessä on suoloja, jotka ovat niukkaliukoisia veteen, näitä voidaan valmistaa saostamalla vedestä käyttäen haluttua happoa. Esimerkiksi:

Sinkkitannaattisuola - Liuosta, jossa oli 10 mg (pyro)-Glu - His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyyli)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2~ etikkahapposuola 0,1 mlrssa vettä, käsiteltiin liuoksella, jossa oli 8 mg tanniinihappoa 0,08 ml:ssa 0,25 M NaOH. Liuos, jossa oli 5 mg ZnSO^-heptanhydraattia 0,1 mlrssa vettä, lisättiin välittömästi LH-RH-analogin liuokseen.

Saatu suspensio laimennettiin 1 ml :11a vettä ja sakka lin-gottiin. Sakan päällä oleva neste dekantoitiin ja jäännös pestiin kahdesti 1 ml:n annoksilla vettä linkoamalla sakkaa ja dekantoi-malla sen päällä oleva neste. Sakka kuivattiin tyhjössä antamaan 15 mg edellä nimetyn LH-RH-analogin sekasinkkitannaattisuolaa.

Pamoaattisuola - Liuokseen, jossa oli 50 mg (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyyli)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2-etikka-happosuolaa seoksessa, jossa oli 1,6 ml etanolia ja 0,1 ml 0,25 M NaOH, lisättiin liuos, jossa oli 11 mg pamoiinihappoa 0,3 ml:ssa 0,25 M NaOH. Liuottimet poistettiin alennetussa paineessa ja jäännös suspendoitiin 2 ml:aan vettä, lingottiin ja sakan päällä oleva neste dekantoitiin. Sakka pestiin 1,5 ml:11a H20, lingottiin ja sakan päällä oleva neste dekantoitiin. Sakka kuivattiin tyhjössä antamaan 54 mg edellä nimetyn LH-RH-analogin pamoaattisuolaa.

Samalla tavalla voidaan valmistaa muita suoloja, jotka ovat niukkaliukoisia veteen.

C. Happoadditiosuolan valmistus vapaasta peptidistä.

Liuokseen, jossa on 50 mg (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (2-naftyyli)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 vapaana emäksenä, lisätään 30 ml IN etikkahappoa. Saatu liuos lyofilisoidaan antamaan 50 mg edellä nimityn LH-RH-analogin etikkahapposuolaa.

27 7 2 5 2 7

Samalla tavalla korvaamalla etikkahappo muilla hapoilla (stoikiometrisesti ekvivalenteissa määrissä peptidin suhteen) saatiin kaavan I mukaisten yhdisteiden muita happoadditiosuoloja, esim. suolat kloorivetyhapon, bromivetyhapon, rikkihapon, fosfo-rihapon, ja typpihapon kanssa.

D. Suolan valmistus metallikationin kanssa, esim. sinkki- suola.

Liuokseen, jossa oli 50 mg (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyyli)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2~etikkahapposuolaa seoksessa, jossa oli 0,4 ml 0,25 M NaOH, 0,3 ml vettä ja 1 ml etanolia, lisättiin liuos, jossa oli 15 mg ZnSO^-heptahydraattia 0,2 ml:ssa vettä. Sakka lingottiin ja sen päällä oleva neste de-kantoitiin. Sakka pestiin 1 ml :11a vettä linkoamalla ja dekan-toimalla päällä oleva neste. Sakka kuivattiin tyhjössä antamaan 48 mg edellä nimetyn LH-RH-analogin sinkkisuolaa.

Samalla tavalla voidaan valmistaa suoloja muiden moniarvoisten kationien, esim. kalsiumin, vismutin, bariumin, magnesiumin, aluminiumin, kuparin, kolbotin, nikkelin, kadiumin jne. kanssa.

Esimerkki 7

Liuos, jossa on 50 mg (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naf-tyyli)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2-etikkahapposuolaa 25 mlrssa vettä, viedään kolonnin läpi, jossa on 50 g Dowex 1 (voimakkaasti emäksinen, kvaternäärisen ammonium-anioninvaihtohartsi), joka oli tasapainoitettu NaOH-liuoksella vasta-ionin tekemiseksi hydrok-sidiseksi. Pylväs eluoidaan 150 ml :11a vettä ja eluentti lyofi-loidaan antamaan 45 mg vastaava polypeptidiä vapaana emäksenä.

Samalla tavalla muut kaavan I yhdisteiden happoadditiosuo-lat, esim. esimerkissä 6 mainitut voidaan muuttaa vastaaviksi vapaiksi emäksiksi.

Claims (10)

72527 28

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen polypepti-din, jolla on kaava: (pyro)Glu-His-V-Ser-Tyr-X-Y-Arg-Pro-Z (I) ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, jossa kaavassa V on tryptofyyli, fenyylialanyyli tai 3-(l-naftyyli)-l-alanyy- Ii; X on D-aminohappotähde 0 -NH-CH-C- R jossa R on karbosyklinen aryylin sisältävä radikaali, joka on valittu ryhmästä 1- ja 2-naftyyli, 1-, 2- ja 9-antryyli, 2-, 3-, i*-ja 9-fluorenyyli, 2- , 3- ja 9-fenantryyli, bifenylyyli, bents- hydryyli ja fenyyli, joka on substituoitu kolmella tai useammalla suoraketjuisella C^_^-alkyyliryhmällä; Y on leusyyli, isoleusyyli, norleusyyli tai N-metyylileusyyli; Z on glysiiniamidi tai -NH-R^, jossa R^" on ^-alkyyli tai 0 " 2 2 -NH-C-NH-R , jossa R on vety tai C^_l+-alkyyli, tunnettu siitä, että (a) lisätään peräkkäin yhtä tai useampaa aminohappoa tai sopivasti suojattua aminohappoa kasvavaan peptidiketjuun, jonka jälkeen poistetaan peräkkäin tai samanaikaisesti suojaryhmät ja valinnaisesti kovalenttisesti sidottu kiinteä kantaja suojatusta polypeptidistä antamaan kaavan I mukainen yhdiste tai sen suola, tai (b) kaavan I mukaisen yhdisteen fragmenttia vastaava aminohappo tai peptidi ja kaavan I mukaisen yhdisteen toista frag- 29 72527 menttia vastaava peptidi liitetään toisiinsa halutussa järjestyksessä ja valinnaisesti (c) muutetaan kaavan I mukainen yhdiste farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi, (d) muutetaan kaavan I mukaisen yhdisteen suola farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi, tai (e) hajotetaan kaavan I mukaisen yhdisteen suola vapaaksi kaavan I mukaiseksi polypeptidiksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa V on tryptofyyli tai fenyylialanyyli; X on 3-(2-naftyyli-D-alanyy-li tai 3-C2,4,6-trimetyylifenyyli)-D-alanyyli ; Y on leusyyli tai N-metyylileusyyli; ja Z on glysiiniamidi tai -NHEt.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa X on 3-(2-naftyyli)-D-alanyyli.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnet- t u siitä, että’valmistetaan (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyy-li)-D-alanyyli-Leu-Arg-Pro-Gly-Nl·^ tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että valmistetaan (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naf-tyyli)-D-alanyyli-N-metyyli-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnet- t u siitä, että valmistetaan Cpyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyyli) -D-alanyyli-Leu-Arg-Pro-NHEt tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

7. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnet- t u siitä, että valmistetaan (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyy-li)-D-alanyyli-N-metyyli-Leu-Arg-Pro-NHEt tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

8. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että valmistetaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa X on 3-( 2 ,*+,6-trimetyylifenyyli)-D-alanyyli.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että valmistetaan (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-C2,H,6- 30 7 2 5 2 7 tri-metyylifenyyli)-D-alanyyli-Leu-Arg-Pro-Gly-Nl·^ tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että valmistetaan (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyy-li)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Atsa-Gly-NH2 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola. Il 72527 31