DK149046B

DK149046B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af lhrh-analoge nonapeptid- ogdecapeptidderivater eller farmaceutisk acceptable salte deraf

Info

Publication number: DK149046B
Application number: DK248880AA
Authority: DK
Inventors: John Joseph Nestor; Gordon Henry Jones; Brian Henry Vickery
Original assignee: Syntex Inc
Priority date: 1979-06-11
Filing date: 1980-06-10
Publication date: 1985-12-30
Also published as: IT1149971B; NZ193984A; GB2054603B; NL930103I2; DK79384D0; IT8022519A0; DK149046C; HK17486A; CA1157851A; PL224852A1; YU46315B; DK152734C; MY8600324A; NO151896C; YU82387A; DK79384A; DE3069013D1; DD152542A5; GR69259B; FI72527C

Description

i U9046

Luteiniserende hormon (LH) og follikulær stimulerende hormon (FSH) frigives fra hypofyseforlappen under kontrol af det frigivende hormon LH-RH dannet i det hypothalamiske område.

LH og FSH virker på gonaderne for at stimulere syntesen af steroidhormoner og for at stimulere gametmodningen. Den pulserende frigivelse af LH-RH og derved frigivelsen af LH og FSH styrer den reproduktive cyklus hos husdyr og mennesker.

LH-RH har desuden virkninger i placenta ved frigivelse af HOS (human cborionisk gonadotropin) og direkte på gonaderne. Agonist-analoge af LH-RH er nyttige til at styre fertiliteten ved hjælp af to virkningsmekanismer. Lave doser af LH-RH-analoge kan stimulere ovulation og er nyttig ved behandlingen af hypothalamisk og ovula-torisk infertilitet. De kan desuden anvendes til hypogona-dale betingelser og impotens og stimulerer spermatogenese og androgen produktion i hanner og hos mænd. Paradoksalt har større doser af kraftigt virkende og langtidsvirkende analoge af LH-RH en modsat virkning og blokerer ovulation hos hunner og kvinder og undertrykker spermatogenese hos hanner og mænd. Beslægtet med disse virkninger er en undertrykkelse af normale cirkulerende koncentrationer af seksualsteroider af gonadal oprindelse inklusive reduktion af vægten af accessorisk organ hos hanner og hunner og mænd og kvinder. Hos husdyr fremmer denne paradoksale virkning vægtforøgelsen i tilfælde med overskud af føde, stimulerer abort hos drægtige dyr og virker i almindelighed som et kemisk sterilisationsmiddel.

Det naturlige hormonfrigivende hormon LH-RH er et decapeptid, som udgøres af naturligt forekommende aminosyrer (som har L-konfigur at ionen bortset fra den achirale aminosyre·, glycin).

Dets sekvens er som følgers (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2. Mange analoge til dette naturlige materiale er blevet undersøgt, og et meget stort antal heraf har vist sig at have en utilstrækkelig biologisk virkning til at være klinisk nyttig. Visse valgte modifikationer har vist sig at have en gunstig virkning på biologisk aktivitet. Langt den mest signifikante modifikation er opnået ved at ændre resten i 6-stillingen fra Gly til en D-aminosyre. Ved at 2 149046 erstatte Gly-resten i 6-stillingen med D-Ala, D-Leu, D-Phe eller D-Trp har man f.eks. fået en serie af analoge til LH-RH med forøget aktivitet i forhold til LH-RH. Se M.Monahan, et al, Biochem., 12, 4616 (1973) for [D Ala6]-LHRH; J.A. Vilchez-Martinez, et al, Biochem. Biophys. Res. Comm., 59, 1226 (1974) for [D-Leu6]LHRH og desGly10[D-Leu6, Pro NHEt9] LHRH; D.H. Coy, et al, J. Med. Chem., 19, 423 (1976) for [D-Phe JLHRH og W. Vale, et al, Clinical Endocrinology, 5th SUpp., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England (1976), p. 2615 og D.H. Coy, et al; Biochem. Biophys. Res.

Comm., 67, 576 (1979) for [D-TRP6]LHRH.

Foruden de væsentlige aktivitetsforøgelser, der blev opnået ved de ovenfor nævnte i forbindelse med substitutionerne i . stilling 6, kan der opnås yderligere aktivitetsforøgelser ved at eliminere Gly-NH2 i stilling 10 for at give et nona-peptid som et alkyl-, cykloalkyl- eller fluoralkylamid eller ved at erstatte Gly-NH2 med et a-azaglycinamid.

Sé f.eks. M. Fujino, et al, Biochem. Biophys. Res. Comm.,49, 863 (1972), D. H. Coy, et al, Biochem. 14, 1848 (1975) og A.S. Dutta, et al, J. Chem. Soc. Perkin I, 1979, 379.

Anvendelse af N-methylleucin i stedet for leucinresten i stilling 7 fører til forøget stabilitet over for enzymatisk nedbrydning. Se f.eks. N. Ling, et al, Biochem Biophys. Res. Comm., 63, 801 (1975).

Erstatning af tryptophanresten i stilling 3 med 3-(1-naphthyl)-L-alanin fører til en forøgelse af den biologiske virkning.

Se f.eks. K.U. Prasad, et al, J. Med. Chem., 19, 492 (1976) og. Y. Yabe, Chem. Pharm. Bull., 24 (12), 3149 (1976).

Tyrosinresten i stilling 5 kan erstattes med phenylalanin eller 3-(1-pentafluorphenyl)-L-alanin med retentionen af væsentlig biologisk aktivitet. Se f.eks. N. Yanaihara, et al,

Biochem. Biophys. Res. Comm., 52, 64 (1973) og D. Coy, et al, J. Med. Chem., 16, 877 (1973).

3 149048

Det ville være ønskeligt at fremstille yderligere analoge til LH-RH, som har en endog højere grad af biologisk aktivitet end de tidligere beskrevne, og som kan anvendes klinisk til dyr og mennesker.

Formålet med den foreliggende opfindelse er således at tilvejebringe hidtil ukendte nonapeptid- og decapeptidderivater af LH-RH, som i 6-stillingen indeholder specifikke unaturlige lipofile D-aminosyrer.

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt LHRH-analogt nona- eller deca-peptidderivat med den almene formel (pyro)Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Arg-Pro-Z (I) eller de farmaceutisk acceptable salte deraf, hvori V er tryptophyl, phenylalanyl eller 3-(l-naphthyl)-L-alanyl, W er tyrosyl, phenylalanyl eller 3-(1-pentafluorphenyl)-L-alanyl, X er en D-aminosyrerest med den almene formel

O

-NH-CH-Ϊ- CH0 I 2

R

hvori R er et carbocyklisk arylholdigt radikal valgt fra den gruppe, der består af 1- og 2-naphthyl, 1-, 2- og 9-anthryl, 2-, 3-, 4-og 9-fluorenyl, 2-, 3- og 9-phenanthryl, biphenylyl, benzhydryl og phenyl substitueret med 3 til 5 ligekædede. C^-C^-alkyl-grupper, 4 U9046 ϊ er leucyl, isoleucyl, nor-leucyl eller N-methylleucyl, Z er glycinamid eller -NH-R^, hvori R1 er C1-C4 alkyl eller -NH-l-NH-R2, hvori 2 R er hydrogen eller C^-C^-alkyl, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den omfatter (i) kobling af de eventuelt beskyttede fragmenter af den ønskede forbindelse med formlen (I) og/eller fjernelse af beskyttelsesgrupper og eventuelt covalent bundet fast støttemateriale fra et beskyttet derivat af en forbindelse med formlen (I) til dannelse af en forbindelse af formlen (I) eller et salt deraf, og eventuelt (ii) omdannelse af en forbindelse med formlen (I) til et farmaceutisk acceptabelt salt, iiii) omdannelse af et salt af en forbindelse med formlen (I) til et farmaceutisk acceptabelt salt, eller (iv) dekomponering af et salt af en forbindelse af formlen (I) til et frit polypeptid med formlen (I).

Som angivet ovenfor og for at lette beskrivelsen af opfindelsen anvendes de for de forskellige almindelige aminosyrer sædvanlige forkortelser, som er almindeligt accepteret på peptidområdet og anbefalet af IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, Biochemistry, 11, 1726 (1972) og repræsenterer L-aminosyrer bortset fra den achirale aminosyre glycin og yderligere med undtagelse af aminosyrerne i 6-stillingen betegnet med X. Alle peptidsekvenser, som er nævnt heri, er skrevet i overensstemmelse med den almindeligt accepterede konvention, hvorved den N-terminale aminosyre er til venstre, og den C-terminale aminosyre er til højre.

5 149046

Udtrykket "farmaceutisk acceptable salte" betegner heri salte, som bevarer moderforbindelsens ønskede biologiske aktivitet og ikke giver uønskede toxikologiske virkninger. Eksempler på sådanne salte er (a) syreadditionssalte dannet med uorganiske syrer, f.eks. saltsyre, hydrogenbromidsyre, svovlsyre, phosphorsyre, salpetersyre og lignende, og salte dannet med organiske syrer såsom f.eks. eddikesyre, oxalsyre, vinsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, gluconsyre, citronsyre, æble-syre, ascorbinsyre, benzoesyre, garvesyre, pamoiasyre, algin-syre, polyglutaminsyre, naphthalensulfonsyrer, naphthalendi-sulfonsyrer, polygalacturonsyre, (b) salte med polyvalente metalkationer såsom zink, calcium, vismut, barium, magnesium, aluminium, kopper, cobolt, nikkel, cadmium og lignende eller med en organisk kation dannet ud fra Ν,Ν'-dibenzylethylen-diamin eller ethylendiamin,eller (c) kombinationer af (a) og (b), f.eks. et zinktannatsalt og lignende.

Udtrykket "C^-C^ - alkyl" betegner heri en ligekædet eller forgrenet mættet hydrocarbongruppe med 1-4 carbonatomer såsom f.eks. methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sek.-butyl og tert-butyl:

Foretrukne forbindelser fremstillet ifølge opfindelsen er de forbindelser, hvori X er 3-(2-naphthyl)-D-alanyl eller 3-(2,4,6-trimethyl-phenyl)-D-alanyl, Z er glycinamid eller -NHEt, V er tryptophyl eller phenylalanyl, W er tyrosyl, og Y er leucyl eller N-methylleucyl. Særligt foretrukne forbindelser er: (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr- (3- {9-anthry 1) -D-Ala) -Leu-Arg-Pro Gly-NH2 (smp. 187-195°C), (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-(3-(2,4,6-trimethylphenyl)-D-Ala)-N-MeLeu-Arg-Pro-Gly-NH2 (smp. 178-186°C) (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-N-methyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, 6 149046 (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-trimethylphenyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-NHEt og (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-N-methyl-Leu-Arg-Pro-NHEt og deres farmaceutisk acceptable salte.

(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 og salte heraf foretrækkes specielt.

Ifølge opfindelsen frsnstillede forbindelser og specielt saltene deraf udviser overraskende kraftig og langvarig LH-RH-antagonist-virkning i sammenligning med de hidtil mest kraftigt virkende LH-RH-antagonister, nemlig (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Ser-Arg-Pro-Gly-NH2 og det tilsvarende des-Gly-prolylethylamid. Et primært mål for styrke er evnen til delvis eller fuldstændig at undertrykke østrus i fuldt udviklede hunrotter med normal cyklus (bestemt over en 2 ugers periode) ved to gange daglig subcutan injektion.

Andre bioprøver, der er blevet anvendt til LH-RH-analoge, og som er blevet anvendt til forbindelser fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse, omfatter: (a) ovulationinduktion i diestrøse eller proestrøse hunrotter ved subcutan injektion (Rippel, et al, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 148, 1193 (1975)), (b) LH-og FSH-frigivelse ved hjælp af dispergerede hypbfyse-forlapcellekulturer som målt ved radioimmunobestemmelse (Vale, et al. Endocrinology, 91, 562 (1972) )f og (c) LH og FSH frigivelse i den perifere cirkulation af ovariectomiserede, steroidbehandlede rotter som reaktion på 7 149046 intravenøs injektion som målt ved radioimmunobestemmelse (Arimura, et alf Endocrinology, 90, 163 (1972)).

På et mere fremskredet niveau kan aktiviteten af disse forbindelser blive påvist in vivo ved undertrykkelse af sperma-togenese og cirkulerings- og testikulær-niveau af testosteron såvel som dramatisk reduktion i prostatstørrelse hos hunde, der lider af godartet prostatisk hypertrofi.

Som et resultat af det ovenfor anførte kan forbindelserne finde anvendelse i en lang række tilfælde, hvor styring af LH og FSH eller direkte gonadal virkning er vigtig,inklusive:

Fysiologiske anvendelser (lavdosisvirkninger) ovulationinduktion i anovulatorisk infertilitet og til tidsbestemt ovulation i hunpattedyr, terapi til infertilitet grundet på utilstrækkelig luteal' funktion hos kvinder, terapi for hypogonadotropisk eller hypogonadal infertilitet hos mennesker af begge køn, terapi for cystisk ovarisk/nymphomaniasyndrom hos kvæg, induktion eller forøgelse af seksualopførsel eller terapi for impotens/frigiditet.

Paradoxikale anvendelser (højdosisvirkninger) - ovulationundertrykkelse eller forhaling, - fødselsinduktion, 149046 δ - synkronisering af ovulation, - østrusundertrykkelse, - vækstfremmelse hos hundyr, - luteolyse, mensesinduktion, - terapi for endometriose, - terapi for bryst-tumorer og cyster, - terapi for polycystisk ovarisk syndrom (Stein-Leventhal), - terapi for uterincarcinom, - terapi for godartet prostatisk hypertrofi og for prostatisk carcinom, - terapi for sygdomme, som skyldes overdreven gonadal horman-produktion hos begge køn, - undertrykkelse af proestrøs udskillelse.

De ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede forbindelser har specielle anvendelser (inklusive anvendelser, som ikke tidligere er blevet beskrevet til LH-RH-analoge), såsom deres anvendelser til behandlingen af godartet prostatisk hypotrofi. De omhandlede forbindelser kan således anvendes til styring af endometriose, reduktion af prostatstørrelse eller hæmning af spermatogenese i et pattedyr, som har behov for eller ønsker nævnte behandling. Herved administreres der til pattedyr en effektiv mængde af en ifølge den foreliggende opfindelse fremstillet forbindelse eller et farmaceutisk produkt med indhold heraf.

Disse forbindelser eller produkter kan administreres ad en lang række veje afhængig af den specifikke anvendelse inklusive oralt, parenteralt (inklusive subcutan, intramus-kulær og intravenøs administration), vaginalt, rectalt, buealt (inklusive sublingualt) eller intranasalt. Den mest velegnede vej i et givet tilfælde vil afhænge af anvendelsen, den specielle aktive bestanddel, det involverede dyr eller menneske og den behandlende læges vurdering. Forbindelsen eller produktet kan også administreres ved hjælp af langsomt frigivende depot- eller implantationspræparater som beskrevet nærmere i det følgende.

9 149046

Til de ovenfor beskrevne anvendelser, som er såkaldte "para-doksikale" eller høj do s isanvendelser, er det almindeligvis hensigtsmæssigt at administrere den aktive bestanddel i mængder mellem ca. 0,01 og 100 pg/kg legemsvægt pr. dag, fortrinsvis mellem ca. 0,1 og 5,0 pg/kg legemsvægt pr. dag. Denne administration kan gennemføres ved hjælp af en enkelt daglig administration ved fordeling over adskillige applikationer eller ved hjælp af langsom frigivelse for at opnå de mest effektive resultater.

Den nøjagtige dosis og administrationsområdet af disse forbindelser og produkter vil nødvendigvis afhænge af behovet hos den, der behandles, behandlingstypen, graden af lidelse eller behov og naturligvis vurderingen af den behandlende læge. I almindelighed kræver parenteral administration lavere doser end andre administrationsmetoder, som er mere afhængige af absorption.

De ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser tåles udmærket og er forholdsvis ugiftige. Repræsentative forbindelser viser LD^Q-værdier ved subcutan administration til mus på godt over 40 mg/kg; en meget stor sikkerhedsfaktor i sammenligning med de ovenfor beskrevne terapeutiske doser.

Farmaceutiske produkter, der som aktiv bestanddel indeholder en ifølge den foreliggende opfindelse fremstillet forbindelse i blanding med en farmaceutisk acceptabel ikke toxisk bærer kan fremstilles til parenteral (subcutan, intramusku-lær eller intravenøs) administration, specielt i form af flydende opløsninger eller suspensioner, til vaginal eller rectal administration, specielt i halvfaste former såsom creme og stikpiller, til oral eller buccal administration, specielt i form af tabletter eller kapsler, eller til intranasal administration, specielt i form af pulver, næsedråber eller aerosolpræparater.

149046 ίο

Produkterne kan hensigtsmæssigt administreres i form af enhedsdoser og kan fremstilles ved hjælp af enhver af de i den farmaceutiske teknik velkendte metoder, f.eks. som beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, ΡΆ., 1970. Præparater til parenteral administration kan som almindelige hjælpestoffer indeholde sterilt vand eller saltvand, polyalkylenglycoler såsom polyethylenglycol, olier af vegetabilsk oprindelse, hydrogenerede naphthalener og lignende. Præparater til vaginal eller rectal administration, f.eks. stikpiller, kan som hjælpestoffer indeholde f. eks. polyalkylenglycoler, vaseline, kokos, smør og lignende. Præparater til inhalation kan være faste og som hjælpestoffer f.eks. indeholde lactose eller kan være vandige eller olie-agtige opløsninger til administration i form af næsedråber.

Til buccal administration omfatter typiske hjælpestoffer sukkerarter, calciumstearat, magnesiumstearat, prægelatineret stivelse og lignende.

Det er særligt ønskeligt at levere de ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede forbindelser til det menneske eller dyr, der behandles over længere tidsrum f.eks. i tidsrum fra en uge til et år, fra en enkelt administration. Forskellige langsomt frigivende depot-eller implantationsdoseringsformer kan anvendes. En doseringsform kan f.eks. indeholde et farmaceutisk acceptabelt ikke toxisk salt af forbindelsen, som har en lav opløselighedsgrad i legemsvæsker, f.eks. (a) et syreadditionssalt med en polybasisk syre såsom phosphorsyre, svovlsyre, citronsyre, vinsyre, garvesyre, pamoicsyre, algi-ninsyre, glutaminsyre, naphthalen mono- eller di-sulfonsyrer, polygalacturonsyre og lignende, (b) et salt med en polyvalent metalkation såsom zink, calcium, vismut, barium, magnesium aluminium, kobber, cobolt, nikkel, cadmium og lignende eller med en organisk kation dannet af f.eks. Ν,Ν'-dibenzylethylen-diamin eller ethylendiamin,eller (c) kombinationer af (a) og (b), f.eks. et zinkfcannatsalt. Forbindelser fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse eller fortrinsvis et forholdsvis uopløseligt salt som de netop ovenfor beskrevne, kan desuden tilberedes i en gel f.eks. en aluminiummonostearatgel med 11 149046 f.eks. sesamolie beregnet til injektion. Særligt foretrukne salte er zinksalte, zinktannatsalte, pamoatsalte og lignende. Andre typer af langsomt frigivende depotpræparater til injektion kan indeholde forbindelsen eller saltet dispergeret eller indkapslet i en langsomt nedbrydelig,ikke toxisk, ikke antigenisk polymer såsom en polymælkesyre/polyglycolsyrepoly-mer, f.eks. som beskrevet i U.S. patentskrift nr. 3.773.919. Forbindelserne eller fortrinsvis forholdsvis uopløselige salte såsom de netop ovenfor beskrevne kan også tilberedes i cholesterolmatrixselastikpiller, specielt til anvendelse i dyr. Yderligere langsomtfrigivende depot- eller implantationspræparater, f.eks. liposomer, er velkendt i litteraturen. Se f.eks. "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J.R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Der kan findes særlig henvisning til LH-RH-type forbindelser, f.eks. i U.S. patentskrift nr. 4.010.125.

De heri omhandlede polypeptider kan syntetiseres ved hjælp af enhver teknik, som kendes af fagfolk på peptidområdet. En udmærket oversigt over de mange mulige metoder kan findes i J.M. Stewart and J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, og J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", bind 2, side 46, Academic Press (New York), 1973 ang. fast-fasepeptidsyntese og E, Schroder og K. Lubke, "The Peptides", bind 1, Academic Press (New York), 1965 ang. klassiske opløsningssynteser.

Disse fremgangsmåder omfatter generelt trinvis tilsætning af en eller flere aminosyrer og passende beskyttede aminosyrer til en voksende peptidkæde. Enten aminogruppen eller carboxyl-gruppen af den første aminosyre beskyttes normalt ved hjælp af en egnet beskyttelsesgruppe. Den beskyttede eller afledte aminosyre kan så enten bindes til et inaktivt fast støttemateriale eller anvendes i opløsning ved tilsætning til den næste aminosyre i rækken, som har den komplementære (amino eller carboxyl) gruppe passende beskyttet under betingelser, som er velegnede til dannelse af amidbindingen. Den beskyttende 149046 12 gruppe fjernes så fra denne nytilsatte aminosyrerest, og den næste aminosyre (passende beskyttet) tilsættes så o.s.v.

Efter at alle de ønskede aminosyrer er blevet bundet i den passende række, kan eventuelle resterende beskyttelsesgrupper (og eventuel fast støttemateriale) fjernes i rækkefølge eller samtidigt til opnåelse af det færdige polypeptid. Ved simpel modifikation af denne almene metode er det muligt at tilsætte mere end én aminosyre på en gang til en voksende kæde, f.eks. ved kobling (under betingelser, som ikke racemiserer chiral-centrer)af et beskyttet tripeptid med et passende beskyttet dipeptid til dannelse efter fjernelse af beskyttelse et penta-peptid.

En særligt foretrukket fremgangsmåde omfatter fastfasepep-tidsyntese.

Ved denne særligt foretrukne metode beskyttes aminosyrernes α-amxnofunktion ved hjælp af en syre-eller basefølsom gruppe. Sådanne beskyttende grupper bør have den egenskab, at de er stabile over for betingelserne under peptidbindingsdannelsen, samtidig med at de let kan fjernes uden nedbrydelse af den voksende peptidkæde eller racemisering af eventuelle chiral-centrer, som findes deri. Egnede beskyttelsesgrupper er t-butyloxycarbonyl (Boc), benzyloxycarbonyl (Cbz), biphenyl-isopropyloxycarbonyl, t-amyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, α,a-dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, o-nitrophenyl-sulfenyl, 2-cyano-t-butyloxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxy-carbonyl og lignende, specielt t-butyloxycarbonyl (Boc).

. Særligt foretrukne sidekædebeskyttelsesgrupper er for arginin: nitro, p-toluensulfonyl, 4-methoxybenzensulfonyl, Cbz, Boc og adamantyloxycarbonyl,. for tyrosin: benzyl, o-brombenzyl-oxycarbonyl, 2,6-dichlorbenzyl, isopropyl, cyklohexyl, cyklo-pentyl og acetyl, for serin: benzyl og tetrahydropyrånyl, for histidin: benzyl, p-toluensulfonyl og 2,4-dinitrophenyl.

C-terminalaminosyren bindes til et passende fast størrte-materiale. Egnede faste støttemateriale, som er anvendelige 13 149046 til den ovennævnte syntese, er de materialer, som er inaktive over for reagenserne og reaktionsbetingelserne ved de trinvise kondensations-deprotektionsreaktioner såvel som uopløselige i de anvendte medier. Egnede faste støttematerialer er chlormethylpolystyren-divinylbenzenpolymer, hydroxymethyl-polystyren-divinylbenzenpolymer og lignende, specielt chlor-methyl-polystyren-1% divinylbenzenpolymer. I det specielle tilfælde, hvor C-terminalen af forbindelsen skal være gly- cinamid, er et særligt egnet støttemateriale benzhydrylamino-polystyren-divinylbenzenpolymeren, der er beskrevet af P. Rivaille, et al, Helv. Chim. Acta., 54, 2772 (1971). Vedhæft-ningen til chlormethylpolystyren-divinylbenzentypen af harpiks sker ved omsætning . af den Na-beskyttede aminosyre, specielt Boc-aminosyren, som dets cæsium-, tetramethylammonium-, triethylammonium-, 4,5-diazabicyklo[5,4,0]undec-5-en- eller lignende salt i ethanol, acetonitril, Ν,Ν-dimethylformamid (DMF) og lignende, specielt cæsiumsaltet i DMF, med chlor-methylharpiksen ved en forhøjet temperatur, f.eks. mellem ca. 40°C og 60°C, fortrinsvis ca. 50°C i fra ca. 12 til 48 timer, specielt ca. 24 timer. Na-Boc-aminosyren bindes til benz-hydrylaminharpiksen ved hjælp af en Ν,Ν'-dicyklohexylcarbo-diimid (DCC)/l-hydroxybenzotriazol (HBT). medieret kobling i fra ca. 2 til ca. 24 timer, fortrinsvis ca. 12 timer ved en temperatur på mellem ca. 10 og 50°C, fortrinsvis 25°C i et sådant opløsningsmiddel som dichlormethan eller DMF, fortrinsvis dichlormethan. Den successive kobling af beskyttede aminosyrer kan gennemføres i et automatisk polypeptidsyntetise-ringsapparat, som er velkendt i teknikken. Fjernelsen af Na-beskyttelsesgrupperne kan gennemføres i nærværelse af f.eks. en opløsning af trifluoreddikesyre i methylenchlorid, hydro-genchlorid i dioxan, hydrogenchlorid i eddikesyre eller anden stærk sur opløsning, fortrinsvis 50% trifluoreddikesyre i dichlormethan ved omkring omgivelsernes temperatur. Hver beskyttet aminosyre indføres fortrinsvis i omtrent 2,5 molært overskud, og koblingen kan gennemføres i dichlormethan, di-chlormethan/DMF blandinger, DMF og lignende, specielt i me-thylenchlorid ved omkring omgivelsernes temperatur. Koblingsmidlet er normalt DCC i dichlormethan, men kan være N,N!-di-iso-propylcarbodiimid eller andet carbodiimid enten alene 149046 14 eller i nærværelse af (l-hydroxybenzotriazol), N-hydroxy-succinimid, andre N-hydroxyimider eller oximer. Aktive estere af beskyttede aminosyrer (f.eks« p-nitropheny1, pentafluor-phenyl og lignende) eller symmetriske anhydrider kan alternativt anvendes.

Ved afslutningen af fastfasesyntesen fjernes det fuldt beskyttede polypeptid fra harpiksen. Når bindingen til harpiks-støttematerialet er af benzylestertypen, sker spaltning ved hjælp af aminolyse med en alkylamin eller fluoralkylamin for peptider med et prolin C-terminus eller ved aminolyse med f. eks ammoniak/methanol eller ammoniak/ethanol for peptider med en glycin C-terminus ved en temperatur mellem ca. 10 og 50°C, fortrinsvis ca. 25°C, imellem ca. 12 og 24 timer, fortrinsvis ca. 18 timer. Peptidet kan alternativt fjernes fra harpiksen ved transforestring, f.eks. med methanol, efterfulgt af aminolyse. Det beskyttede peptid kan renses på dette punkt ved hjælp af silicagelkromatografi. Fjernelsen af (sidekæde) beskyttelsesgrupper fra polypeptidet gennemføres ved behandling af aminolyseproduktet med f.eks. vandfri flydende hydrogenfluorid i nærværelse af anisol eller andre carbonium-deionisatorer, behandling med hydrogenfluorid/pyridinkompleks, behandling med tris(trifluoracetyl)bor og trifluoreddikesyre, ved reduktion med hydrogen og palladium-på-carbon eller poly-vinylpyrrolidon eller ved reduktion med natrium i flydende ammoniak, fortrinsvis med flydende hydrogenfluorid, og anisol ved en temperatur mellem ca. -10°C og +10°C, fortrinsvis ca.

0°C, i mellem ca. 15 minutter og 1 time, fortrinsvis ca. 30 minutter. Til glycinterminalpeptiderne på benzhydrylamin-harpikserne kan harpiksspaltningen og deprotektionstrinene kombineret i et enkelt trin under anvendelse af flydende hydrogenfluorid og anisol som beskrevet ovenfor. Det fuldstændigt deprotekterede polypeptid renses så ved en række af kromatografiske trin under anvendelse af et, flere eller alle af de følgende typer: ionbytning på svagt basisk harpiks i ace-tatform, hydrofobisk adsorptionskromatografi på uafledt poly-styren-divinylbenzen (f.eks. Amberlite XAD), silicageladsorp-tionskromatografi, ionbytterkromatografi på carboxymethyl- Η 9 046 15 cellulose, fordelingskromatografi, f.eks. på Sephadex G-25 eller modstrømsfordeling, high performance væskekromatografi (HHC), specielt omvendt fase HPLC på octyl- eller octadecyl-silyl-silica bundet fasesøjlepakning.

Hvis der anvendes en racemisk aminosyre i 6-stillingen, separeres de diastereomere nonapeptid- eller decapeptidslutpro-dukter, og det ønskede peptid indeholdende en D-aminosyre i 6-stillingen isoleres og renses, fortrinsvis under den ovenfor beskrevne kromatografiske proces.

Fremstillingen af peptider med C-terminalazaglycinamider sker fortrinsvis under anvendelse af klassiske peptidopløsningsmiddel- synteser under anvendelse af kendte peptidmellemprodukter.

Dette er beskrevet mere detaljeret i eksempel 3.

De efterfølgende eksempler er anført for,at fagfolk på dette område kan forstå den foreliggende opfindelse fuldstændigt og udøve denne.

Fremstillingsmetode A

Til en ovntørret kolbe indeholdende 0,1 liter absolut ethanol (destilleret fra magnesiumethoxid) blev der tilsat 1,52 g natriummetal. Da hydrogenudviklingen ophørte, blev der tilsat 10,21 g ethyl-2-acetamid-2-cyanoacetat og 13,26 g 2-brommethyl-naphthalen til opløsningen. Opløsningen blev opvarmet til tilbagesvaling i 1 time og derpå afkølet. Ethanolen blev fjernet under reduceret tryk, og resten blev optaget i ethyl-acetat. Det organiske lag blev vasket med to portioner vand hver på 50 ml, et portion mættet natriumchloridopløsning på 50 ml og blev tørret over magnesiumsulfat. Opløsningen blev filtreret, opløsningsmidlet blev afstrippet ved reduceret tryk, og resten blev hydrolyseret i 100 ml koncentreret saltsyre ved tilbagesvaling i 2 timer.

Hydrolyseblandingen blev afkølet, og det udfældede råprodukt blev filtreret fra. Råproduktet blev opløst igen i 0,5 liter 16 149066

varmt vand indeholdende 5 ml koncentreret saltsyre behandlet med carbon, og opløsningens pH-værdi blev indstillet til 6 med koncentreret ammoniumhydroxid. Bundfaldet blev filtreret og tørret i vakuum til opnåelse af 11,3 g ren 3-(2-naphthyl)-D,L-alanin med smeltepunkt 230-232°C

Ved gentagelse af den ovennævnte fremgangsmåde, idet der i stedet for 2-brommethylnaphthalen anvendes en støkiometrisk ækvivalent mængde 1- brommethylnaphthalen, 9-brommethylanthracen, 9-brommethylfluoren, 2- brommethylfluoren, 2- brommethylanthracen, 1-brommethylanthracen, α-chlorisoduren, 4-brommethylbiphenyl, 3- brommethylphenanthren, l-chlormethyl-2,4,6-tri-(n-butyl)benzen og l-chlormethyl-2,3,4,5,6-pentamethylbenzen fås henholdsvis følgende aminosyrer: 3-(l-naphthyl)-p,L-alanin, smp. 185-187°C, 3-(9-anthryl)-D,L-alanin, smp. 290°C (HCl-salt) 3-(9-fluorenyl)-D,L-alanin, 3-(2-fluorenyl)-D,L-alanin, smp. 264-269°C, 3-(2-anthryl)-D,L-alanin, 3-(1-anthryl)-D,L-alanin, 3-(2,4,6-trimethylphenyl)-D,L-alanin, smp. 235-237°C, 3-(4-biphenylyl)-D,L-alanin, smp. 290°C, 3-(3-phenanthryl)-D,L-alanin, 3-(2,4,6-tri{n-butyl)phenyl)-D,L-alanin og 3-(2,3,4,5,6-pentamethylphenyl)-D,L-alanin.

Fremstillingsmetode B

En opløsning af 18,2 g 1,1-diphenylethylen, 25,3 g methyl-a-methoxy-N-benzyloxycarbonylglycinat og 1,5 g 2-naphthalensul- 17 149046 fonsyre i 300 ml tør benzen blev tilbagesvalet, i to dage. Råproduktet blev renset på en søjle af kiselsyre under anvendelse af en gradient af CI^C^ til CI^C^/EtOAc (18 si}.- Det rensede methyl-2- [1-(2,2-diphenylethylenyl) ] -N-benzyloxycar-bonylglycinat blev hydrolyseret til den tilsvarende syre med en opløsning af 10,9 g KOH i 350 ml 10% vandig methanol. Den resulterende rå syre blev opløst i 100 ml 95% ethanol indeholdende 3 ml koncentreret HC1 og hydrogeneret i nærværelse af 2 g 10% Pd-på-carbon i 24 timer til opnåelse af 2,4 g 3-(2,2-diphenylmethyl)-D,L-alanin, snip. 235-237°C.

Fremstillingsmetode C

Til en opløsning af 12,9 g 3-(2-naphthyl)-D,L-alanin i 120 ml 1-M NaOH blev der sat 6,23 ml eddikesyreanhydrid og 60 ml 1 M NaOH i løbet af 1/2 time ved 0°C. pH-værdien blev indstillet på 2 med koncentreret HC1, og det resulterende bundfald blev filtreret. Det faste stof blev omkrystalliseret fra 60% vandig ethanol til opnåelse af 12,2 g N-acetyl-3-(2-naphthy1)-D,L-alanin.

Til en opløsning af 15 g af denne N-acetylaminosyre i 240 ml tør methanol blev der sat 15,8 ml bortrifluoridetherat, og · blandingen blev tilbagesvalet i 1 time. Alkoholen blev af-dampet, 200 ml vand blev tilsat, og opløsningen blev ekstraheret med ethylacetat. Det organiske lag blev vasket med vandig base og syre, tørret over MgSO^, filtreret og strippet til en olie. Krystallisation af denne olie fra ethylacetat/ hexan gav 14,2 g methyl-N-acetyl-3-(2-naphthyl)-D,L-alaninat, smp. 79-80°C.

Gentagelse af den ovennævnte fremgangsmåde, men ved erstatning af 3-(2-naphthyl1—D,L-alanin med en støkiometrisk ækvivalent mængde 3- (1-naphthyl)-D,L-alanin, 3-(2-fluorenyl)-D,L-alanin, 3-(2-anthryl)-D,L-alanin, 3-(1-anthryl)-D,L-alanin og 3-(2,2-diphenylmethy1)-D,L-alanin 149046 18 blev der opnået henholdsvis methyl-N-acetyl-3-(2-fluorenyl)-D,L-alaninat, smp. 97,5-98°C, methyl-N-acetyl-3-(2-fluorenyl)-D,L-alaninat, smp.l70-171°C/ methyl-N-acetyl-3-(2-anthryl)-D,L-alaninat og methyl-N-acetyl-3-(2,2-diphenylmethyl)-D,L-alaninat, smp. 113-114°C.

Fremstillingsmetode D

En opløsning af 6,6 g methyl-N-acetyl-3-(2-naphthyl)-D,L-alaninat i en blanding af 300 ml dimethylsulfoxid, 120 ml 1 M KC1 og 780 ml H20 blev behandlet med 33,6 mg af enzymet subtilisin i 3 ml 0,1 M KC1. pH-værdien blev holdt på 7 ved hjælp af en automatisk titrering med 0,2MNaOH ved hjælp af en Radiometer pH-stat. Efter 30 minutter var der blevet optaget 70 ml NaOH opløsning, og hydrolysen var standset. Opløsningen blev gjort basisk med 12 g NaHCO^ og blev ekstraheret med ethylacetat. Det organiske lag indeholdt methyl-N-acetyl-3- (2-naphthyl)-D-alaninat. Krystallisation fra ethyl-acetat/hexan gav et gult fast stof, smp. 8081°C.

Dette blev omdannet til den fri aminosyre og derpå til N-Boc-aminosyre som følger:

En opløsning af 2,5 g methyl-N-acetyl-3-(2-naphthyl)-D-ala-ninat i 60 ml 6N HC1 blev opvarmet til 120-130°C i 3 timer og afkølet til stuetemperatur. Det dannede hvide bundfald blev opsamlet og omkrystalliseret fra 50 ml 1^0 indeholdende 1 ml 12N HC1 ved neutralisation med NH^OH til pH 6 og tørret i vakuum til opnåelse af 1,2 g 3-(2-naphthyl)-D-alanin, smp. 242-244°C, [a]^5 26,6° (c 0,5, CH3COOH).

En omrørt opløsning af 3-(2-naphthyl)-D-alanin i en blanding . af 55 ml IN NaOH, 10 ml ^0 og 20 ml dioxan blev behandlet med 1,48 g di-tert-butyldicarbonat og o,22 g magnesiumoxid ved 0°C.

Efter 1,5 timer blev der tilsat yderligere 0,3 g di-tert-butyldicarbonat, og blandingen fik lov til at antage stuetemperatur.

19 149046

Det faste stof blev filtreret fra, og filtratet blev koncentreret til 50 ml. Denne vandige opløsnings pH-værdi blev indstillet på 2,5 med NaHSO^ og ekstraheret med ethylacetat. Det organiske lag blev vasket med 5% NaHSO^, vand og mættet saltopløsning. Ethylacetatopløsningen blev tørret over magnesiumsulfat, filtreret og koncentreret til en olie, som blev krystalliseret fra ether/hexan til opnåelse af 1,3 g N-Boc-3-(2-naphthyl)-D-alanin, smp. 90-91°C, [a]^ -32,6° (c 0,8,

MgOH).

Gentagelse af den ovennævnte fremgangsmåde, men ved erstatning af methyl-N-acetyl-3-(2-naphthyl)-D,L-alaninat med eh støkiometrisk ækvivalent mængde af methy1-N-ac ety1- 3 - (1 -naphthyl). -D, L-alaninat, methyl-N-acetyl-3-(2—fluorenyl)-D,L-alaninat, methyl-N-acetyl-3-(2-anthry1)-D,L-alaninat og methyl-N-acetyl-3-(2,2-diphenylmethyl)-D,L-alaninat opnås der henholdsvis de følgende Na-Boc-aminosyrer via de tilsvarende frie aminosyrer: N-Boc-3-(l-naphthyl)-D-alanin, smp. 92-93°C, [a]j^ 54,8° (c 0,5 MeOH), N-Boc-3-(2-fluorenyl)-D-alanin, smp. 161-163°C (dekompone-ring), N-Boc-3-(2-anthryl)-D-alanin og N-Boc-3-(2,2-diphenylmethyl)-D-alanin, smp. 153-154°C.

Eksempel 1 I reaktionsbeholderen af et Beckman 990 Peptidsynthetiserings-apparat blev der anbragt 0,8 g (0,8 mmol) benzhydrylamino-polystyren-divinylbenzen-harpiks (Lab Systems, Inc.) som beskrevet af Rivaille, supra. Aminosyre blev tilsat fortløbende til denne harpiks ved hjælp af et syntheseprogram som følger: 149046 20

Trin 1 CH2Cl2-vask 1 gang 1,5 min.

2 50% CF3C02H/CH2C12— 1 gang 1,5 min.

deprotektion 3 50% CF3C02H/CH2C12— 1 gang 30 min.

deprotektion 4 CH2Cl2-vask 3 gange 1,5 min.

5 10% triethylamin/CH2Cl2 2 gange 1,5 min.

6 CH2Cl2~vask 3 gange 1,5 min.

7 Na-Boc-aminosyreopløsning 1 gang tilsæt 8 N,N'-dicyklohexylcarbo- 1 gang tilsæt diimidopløsning 9 CH2C12-skylning og holde- 1 gang koblings- . ... reaktion kobling 2 tlmer 10 CH2C12—skyl tilsæt 1 gang 1,5 min.

11 CH2Cl2~vask 3 gange 1,5 min.

12 ethanol-vask 3 gange 1,5 min.

13 CH2Cl2~vask 3 gange 1,5 min.

Τϊ'ΐη 1-3 fuldender en koblingscyklus for én aminosyre, og fuldstændigheden af reaktionen checkes ved hjælp af ninhydrin-metoden ifølge E. Kaiser, et al., Anal. Biochem., 34, 595, (1970).

Denne harpiks blev koblet fortløbende med et 2,5 molært overskud af hver beskyttet aminosyre og DCC. Harpiksen blev således behandlet i løbet af efter hinanden følgende koblingsperioder med 0,433 g Boc-Gly-OH, 0,432 g Boc-Pro-OH, 0,857 ,g Boc-Arg(Tosyl)-OH, 0,462 g Boc-Leu-OH, 0,504 g Boc-3-(2-naphthyl)-D-alanin og 0,272 g 1-hydroxy-benzotriazol, 0,724 g ΤΓ-Boc ,ø-[ 2^brombenzyloxycarbonyl].rL-tyrosin, 0,59 g Boc-Ser (Benzyl).-OH, 0,608 g Boc-Trp-OH, 0,654 g Boc-His(Tosyl)-OH og 0,524 g pyroglutaminsyre.

21 149046

Harpiksen blev fjernet fra reaktionsbeholderen, vasket med CH2CI2 og tørret i vakuum til opnåelse af 2,0 g beskyttet polypeptidharpiks.

Polypeptidproduktet blev samtidigt fjernet fra harpiksen og fuldstændigt deprotektioneret ved behandling med vandfri flydende HF .En blanding af '2,0 g beskyttet polypeptidharpiks og 2 ml anisol (rensemiddel) i en Kel-^reaktionsbeholder blev behandlet med 20 ml gendestilleret (fra CoF^) vandfri flydende HF ved 0°C i 30 minutter. HF blev fjernet under vakuum^og resten af (pyro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-N^r som dets HF-salt, blev vasket med ether. Resten blev derpå ekstraheret med iseddikesyre. Eddikesyreekstrakten blev lyofiliseret til dannelse af 0,8 g råmateriale.

Det rå polypeptid blev anbragt på en 4 x 40 cm Amberlitl^XAD-4 søjle (polystyren-4% divinylbenzencopolymer) og elueret med en konkav gradient fra vand (0,5 liter) til ethanol (1 liter). Rørene indeholdende fraktioner fra udstrømmende volumen 690 ml - 1470 ml blev forenet og strippet til tørhed til opnåelse af 490 mg delvis renset polypeptid.

En 150 mg prøve af det delvis rensede produkt blev underkastet skillekromatografi på en 3 x 50 cm søjle af Sephade^G-25 under anvendelse af opløsningsmiddelsystemet 1-butanol/toluen/ eddikesyre/vand indeholdende 1,5% pyridin i forholdet 10:5:12: 18. De rene fraktioner blev forenet på basis af tyndtlags-kromatografi (silicagel; Bu0H/H20/H0Ac/Et0Ac; 1:1:1:1) og HPLC (5 mikron, omvendt fase, octadecylsilylpakning, 40% 0,03 M NHjOAc/60% acetonitril). Det ønskede produkt kom fra søjlen i fraktioner fra udstrømmende volumen 1000 ml - 1400 ml (Rf 0,1) . De rene fraktioner blev forenet, strippet til tørhed, optaget i H20 og lyofiliseret til opnåelse af 57 mg rent pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naphthyl)-D-ananyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid som dets eddikesyreadditionssalt, [a]p5 -27,4° (c 0,9, HOAc), smp. 185-193° C (dekomponering).

22 149046

Eksempel 2

Til syntesen af analoge med et C-endestillet Pro-NH-CH2CH3 blev der anvendt et synteseprogram svarende til det i eksempel 1 beskrevne. Beckman 990 peptidsyntetiserings-reaktionsbeholderen blev forsynet med 2,13' g Boc-Pro-O-harpiks fremstillet ved reaktionen af ækvimolære forhold af det tørre cæsiumsalt af Boc-Pro-OH med chlormethyl-polystyren/1% divinylbenzen (Lab Systems, Inc.). Boc-Pro-O-harpiksmængden, som blev taget, indeholdt 1,4 mmol prolin.

Harpiksen blev koblet fortløbende med et 2,5 molært overskud af hver beskyttet aminosyre og DCC. Harpiksen blev således omsat under successive koblingsperioder med 1,61 g Boc-Arg(Tosyl)-OH, 0,93 g Boc-Leu-0H;H20, 0,94 g Boc-3-(2-naphthyl)-D-alanin og 0,49 g 1-hydroxybenzo-triazol, 1,75 g N-Boc-O-2-brombenzyloxycarbonyl-L-tyrosin og 1,11 g Boc-Ser(Benzyl)-OH.

På dette syntesepunkt blev mængden af beskyttet polypeptid-harpiks opdelt i halvdele, og den ene halvdel blev kørt færdig ved fortløbende reaktion med 0,57 g Boc-Trp-OH, 0,77 g Βοσ-His(Tosyl)-OH og 0,21 g pyroglutaminsyre.

Harpiksen blev fjernet fra reaktionsbeholderen, vasket med CH2C12 og tørret i vakuum til opnåelse af 2,26 g beskyttet polypeptidharpiks.

Det beskyttede polypeptid blev spaltet fra harpiksen ved amino-lyse med 25 ml ethylamin i 18 timer ved 2°C. Ethylaminen fik lov til at fordampe, og harpiksen blev ekstraheret med methanol. Methanolen blev inddampet til opnåelse af 1,39 g 23 149046 pyro-Glu-His(Tosyl) - Trp - Ser(Benzyl)-Tyr(2-brombenzyloxy-carbonyl)-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-Leu-Arg(Tosyl)-Pro-NH- ch2ch3.

Det rå polypeptid blev deprotektioneret ved behandling med en blanding af 3 ml anisol og 30 ml gendestilleret (fra CoF^) vandfri flydende HF ved 0°C i 30 minutter i en Kel-F reaktionsbeholder. HF blev afdampet under vakuum, og resten blev vasket med ether. Resten blev opløst i 2 M eddikesyre og lyofi-liseret til opnåelse af 0,82 g rå (pyro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr- 3-(2-naphthyl)-D-alanin-Leu-Arg-Pro-NH-CH2CH3 som dets eddikesyreadditionssalt. Slutrensning blev opnået ved præparativ højeffektiv væskekromatografi af en 20 mg prøve på en 0,9 x 550 mm søjle af 40-50 μ octadecylsilyleret silica (Merck, Lichropre^C^g) . Elueringsmidlet var 64% 0,03 M NH^OAc/36% acetonitril. I fire løb blev der renset i alt 61 mg råmateriale. Efter tre lyofiliseringer fra vand blev der opnået 15 mg rent pyroglytamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolinethylamid som dets eddikesyreadditionssalt, smp. 180-190°C, [a]^ -57,2° (C 1,1, HOAc).

Eksempel 3 0 " 2

Forbindelser af formlen I, hvori Z er -NH-CNH-R , kan fremstilles ved hjælp af klassisk opløsningssyntese.

Der kan f.eks. anvendes følgende fremgangsmåde, hvori "AzaGlyNH-" er ? -NH-NH-C-NH2: 24 149046 (pyro)Glu-His-Trp-Ser- Cbz-Leu-Arg-Pro-AzaGlyNH,

Tyr-OMe N02 (1) (2)

V

Boc-3-(2-naphthyl-D-Ala-, Leu-Arg-Pro-AzaGly-NH0 Ψ + *

H

(pyro)Glu-His-Trp-

Ser-Tyr-N3 . ^ H-3-(2-naphthyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-AzaGly-NH2 (3) •i· * (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-AzaGly-NH2 som det fri peptid eller salt, [a]^5 -34,3°C (C 0,34, HOAc).

Koblingen af enkeltfragmenterne kan ske ved hjælp af acyl-azidmetoden (J. Honzel, et al. Coll. Czech. Chem. Comm, 26, 2333 (1971)) ved DCC/HBT-kobling eller andre racemiserings-fri fragmentkoblingsteknikker. Forbindelserne (1) og (2) er kendte forbindelser (jf. henholdsvis M- Fujino, et al,

Biochem. Biophys. Res. Comm., 57, 1248 (1974) og A. S. Dutta, et al, J. Chem.Soc. Perkin I, 1979, 379). Forbindelsen (3) fremstilles af (2) ved fjernelse af Cbz- og nitrogrupperne ved hydrogenolyse efterfulgt af kobling med N-Boc-3-(2-naphthyl )-D-alanin under anvendelse af DCC/HBT eller et andet i teknikken kendt koblingsmiddel. Se Dutta, et al, supra vedrørende en lignende LH-RH-analogsyntese.

Eksempel 4

Ved gentagelse af fremgangsmåden fra eksempel 1 og anvendelse af enten en D-aminosyre eller en D,L-aminosyre i stilling 6 (i sidstnævnte tilfælde, idet de diastereomere peptider separeres under kromatografi), idet de passende aminosyrer erstattes i fastfasesynteserækken, kan der opnås følgende decapep-tider, der isoleres og karakteriseres som deres eddikesyreadditionssalte : 25 149046 pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naphthyl) D-alanyl-N-methylleucyl-arginyl-prolyl-glycinamid, [α]£5 -26/6° (C=l, HOAc), pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(1-naphthyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid, smp. 173-175 C, [a]^5 -28,1° (0=0,8, HOAc), pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2-fluorenyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid, to]-25,8° (C=l, HOAc), pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(4-bi- 25 phenylyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid, [a]D -35,7° (C=l, HOAc), pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2,4,6-trimethylphenyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid, [<x]p5-42,l° (C=l, HOAc),

Eksempel 5

Ved at gentage fremgangsmåden fra eksempel 2 og anvende enten en D-aminosyre eller en D,L-aminosyre ved stilling 6 (i sidstnævnte tilfælde idet de diastereomere peptider separeres under kromatografi), idet de passende aminosyrer substitueres i fastfastsynteseforløbet, kan der opnås følgende nonapeptider, der isoleres og karakteriseres som deres eddikesyreadditionssalte: pyro-glutamyl-histidyl-phenylalanyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naph-thyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som dets ethylamid, smp. 180-190°C, [a]£5 -57,2° (C=l), 10% HOAc), 149066 26 pyro-glutamyl-histidyl-3-(1-naphthyl)-L-alanyl-seryl-tyrosyl- 3-(2-naphthyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som dets ethyl-amid, smp. 160-170°C, [a]25 -45,3°C (0*1, HOAc), pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2,2-di-phenylmethyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som dets ethyl-amid, smp. 176-206°C, [ct]2^ 33,7°C (C=l, 10% HOAc), og pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-N-methylleucyi-arginyl-prolin som dets ethylamid, smp. 170-185°C, [j3-81,1°C (C=0,7, 10% HOAc).

Eksempel 6 A. En opløsning af 0,1 g af hydrogenfluoridsaltet af (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-N^ (se eks. 1) opløses i 50 ml vand og sendes gennem en søjle af 50 g Dowex®3 anionbytterharpiks, som forud er blevet bragt i ligevægt med eddikesyre og vasket med deioniseret vand. Søjlen elueres med deioniseret vand, og den udstrømmende væske lyofiliseres til opnåelse af det tilsvarende eddikesyresalt af (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, [a]25 -27,5° (c 0,9, HOAc).

Eksempel 7

En opløsning af 50 mg (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-N^ eddikkesyresalt i 25 ml vand ledes gennem en 50 g søjle af Dowej^ 1(kraftigt basisk, kvaternær ammoniumanionbytterharpiks), som er blevet bragt i ligevægt med NaOH opløsning til fremstilling af modionhydroxidet. Søjlen elueres med 150 ml vand, og elueringsmidlet lyofiliseres til fremstilling af 45 mg af det ovennævnte polypeptid som den fri base.

Forsøg 1 Østrusundertrykkelse i rotter i' 27 f49046

Fremgangsmåde: Hunrotter (Hilltop Sprague Dawley, ca. 200 g med åbne vagina) vejes grupperet fem pr. bur og to bur pr. gruppe. Rotterne injiceres subkutant to gange daglig (bortset fra det nedenfor anførte) i 14 dage. Der udtages dagligt vaginalslim til bestemmelse af østruscyklusstadiet, og legemsvægten optegnes efter 0, 1 og 2 ugers forløb. Det antal hundyr, som udviser delvis østrusundertrykkelse (d.v.s. kun di-østrus og proøstrus, men ikke østrus) fra 4. dag,og procenten af hundyr, som viser fuldstændig østrusundertrykkelse (d.v.s. kun diøstrus) fra 4. dag, optegnes. ED^-værdierne bestemmes ud fra den bedst egnede lige linie af procentdataene for østrusundertrykkelse. LH-RH-analoge blev administreret som deres acetatsalte i fysiologisk saltvand indeholdende 0,1% bovinserumalbumin. Injektionsvolumenet var 0,2 ml, og den analoge indgik som 0,05, 0,1, 0,2 eller 0,4 pg. En kontrol (fysiologisk saltvand indeholdende bovinserumalbumin)' udviste ingen østrus-undertrykkelse. ED^-værdierne for kombineret partial- og fuldstændig østrusundertrykkelse er som følger; 28 149046

Forbindelse ED50 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)- 0,08 D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)- 0,22 D-alany1-Leu-Arg-Pro-NHEt (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)- 0,07 D-alanyl-N-MeLeu-Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)- 0,12 D-alanyl-N-MeLeu-Arg-Pro-NHEt (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-trimethyl- 0,08 phenyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(1-naphthyl)- 0,3 D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH^ (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(9-anthryl)- 0,27 D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(4-biphenylyl)- 0,28a D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-fluorenyl)- 0,40a D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,2-diphenyl 0,11 methyl-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-NHEt (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-trimethyl- 0,35a phenyl)-D-alanyl-N-MeLeu-Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro)-Glu-His-3-(1-naphthyl)-L-alanyl-Ser- 0,16

Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alany1-Leu-Arg-Pro-NHEt a -. For disse forbindelser skete der kun administration 1 gang daglig.

Claims

149046 Forsøg 2 Seks Swiss-Webster mus (Simonsen), som hver vejede ca. 25 g, blev injiceret subkutant med 0,25 ml af en vandig opløsning af (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 som dets acetatsalt. Dosen var 40 mg/kg eller ca. 1 mg/mus. Musene blev observeret to gange daglig med hensyn til dødelighed i 21 dage. Der blev ikke konstateret nogen dødelig virkning. LD^-værdien er derfor over 40 mg/kg. Sammenligningsforsøg. For yderligere at belyse opfindelsen blev der foretaget følgende sammenligningsforsøg. Forsøg 2 blev gentaget under anvendelse „-.af de to forsøgsforbindelser for at tilvejebringe sideordnet sammenligning af aktivitet. Ifølge opfindelsen Ifølge kendt teknik Forbindelse (3-(2-naphthyl)-D- (D-Trp)6-LHRH alanyl)6-LHEH Resultat ED50 = 0,04 jug/injek tions- ED,-0 = 0,08 ;ug/in- dosis jektionsdosis Konklusion: I det ovenfor anførte samænligningsforsøg er forbindelsen fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen dobbelt så kraftigt virkende som den kendte forbindelse. Patentkrav .

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af et LHRH-analogt nona- eller decapeptidderivat med den almene formel 14904¾ (pyro)Glu-His-V-Ser-w-X-Y-Arg-Pro-Z (I) eller de farmaceutisk acceptable salte deraf, hvori V er tryptophyl, phenylalanyl eller 3-(1-naphthyl)-L-alanyl, W er tyrosy1, phenylalanyl eller 3-(1-pentafluorphenyl)-L-alanyl, X er en D-aminosyrerest med den almene formel O -NH-CH-C- CH2 R hvori R er et carbocyklisk arylholdigt radikal valgt fra den gruppe, som består af 1- og 2-naphthyl, 1-, 2- og 9-anthryl, 2-, 3-, 4- og 9-fluorenyl, 2-, 3- og 9-phenanthryl, biphenylyl, benzhydryl og med 3 til 5 ligekædede C^-C^-alkylgrupper substitueret phenyl, Y er leucyl, isoleucyl, norleucyl eller N-methyl-leucyl, Z er glycinamid eller -NH-R^, hvori R^ er C^-C^-alkyl eller -NHC-NHR^, hvori R^ er hydrogen eller C-^-C^-alkyl, 0 kendetegnet ved, at den omfatter (i) kobling af de eventuelt beskyttede fragmenter af den ønskede forbindelse med formlen (X) og/eller fjernelse af beskyttelsesgrupper og eventuelt covalent bundet fast støttemateriale fra et beskyttet derivat af en forbindelse med formlen (I) til dannelse af en forbindelse med formlen (I) eller et salt deraf, og eventuelt (ii) omdannelse af en forbindelse med formlen (I) til et farmaceutisk acceptabelt salt, (iii) omdannelse af et salt af en forbindelse af formlen (I) til et farmaceutisk acceptabelt salt, eller (iv) dekomponering af et salt af en forbindelse af formlen (I) til et frit polypeptid med formlen (I).