CS228133B2 - Production method of nonpeptide and decapeptide derivative of hormone releasing luteinizae hormone - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby nonapeptidových a dekapeptidových derivátů hormonu uvolňujícího luteinizační hormon.

Luteinizační hormon (LH) a folikulostimulační hormon (FSH) se uvolňují z předního laloku hypofýzy pod vlivem uvolňovacího hormonu LH-RH, který se vytváří v hy· potalamu. LH a FSH působí na gonády, a tím stimulují syntézu steroidních hormonů a stimulují zrání pohlavních buněk. Pulsační uvolňování LH-RH, a tím i uvolňování LH a FSH, reguluje reprodukční cyklus u domácích zvířat a u lidí. LH-RH působí dále v placentě, kde uvolňuje HCG a působí přímo na gonády. Funkční analogy LH-RH mohou být použity pro regulaci plodnosti, přičemž mají dvojí účinek.

Nízké dávky analogů LH-RH mohou stimulovat ovulaci a jsou použitelné pro terapii hypotalamické a vaječníkové neplodnosti. Dále mohou být použity v případech malého vývoje gonád a impotence a stimulují spermatogenezi a vytváření androgenu u samců.

Naproti tomu vyšší dávky vysoce účinných a dlouho působících analogů LH-RH mají opačný účinek a blokují ovulaci u samic a potlačují spermatogenezi u samců. U těchto účinků se jedná o potlačení normálních cirkulačních hladin sexuálních steroidů pohlavního původu, včetně redukce hmotnosti pří2 datného orgánu u samců a u samic. U domácích zvířat vyvolává tento paradoxní účinek hmotnostní přírůstky při přísunu potravy, stimuluje potratovost gravidních zvířat a působí obecně jako chemický sterilant.

Přírodní hormon uvolňující hormon LH-RH je dekapeptid složený z aminokyselin, které se vyskytují v přírodě a které mají L-konfiguraci s výjimkou achirální aminokyseliny glycinu. Jejich sled je následující:

(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NHz.

Bylo studováno mnoho analogů této přírodní látky a bylo zjištěno, že jejich velká většina má nedostatečnou biologickou účinnost pro případné klinické použití. Dále bylo prokázáno, že určité modifikace mají pozitivní vliv na biologickou aktivitu. Zdaleka nejvýznamnější modifikace se získá záměnou zbytku Gly v 6. pozici na D-aminokyselinu. Například záměnou zbytku Gly v 6. pozici za D-Ala, D-Leu, D-Phe, nebo D-Trp se dojde k řadě analogů LH-RH se vrůstajícím účinkem vzhledem k LH-RH. Viz M. Monahan a kolektiv, Biochem., 12, 4616 (1973) — /D-Ala⁶/ /LHRH; J. A. Vilchez-Martinez a kolektiv, Biochem. Biophys. Res. Comm., 59, 1226 (1974) - /D-Leu⁶/-LHRH a desGlyWD-Leu⁶.

Pro NHEWLHRH; D. H. Coy a kolektiv, J. Med. Chem., 19, 423 (1976) — /D-Phe/LHRH; a W. Vale a kolektiv, Clinical Endocrinology,

5. vydání Blackwell Scientific Publications, Oxford, England (1976), str. 2615 a D. H. Coy a kolektiv, Biochem. Biophys. ' Res. Comm., 67, 576 (1979) — /D-Trp/LHRH.

Vedle podstatného zvýšení účinku dosaženého shora uvedenými substitucemi v poz-ici 6 může být dále účinek zvýšen eliminací Gly-NH2 v pozici 10, čímž se získá nonapeptid jako alkyl-, cykloalkyl- nebo fluoralkylamid, nebo záměnou Gly-NHž za a-azaglycinamid. Viz například M. Fujino a kolektiv, Biochem. Biophys. Res. Comm., 49, 863 (1972), D. , H. Coy a kolektiv, Biochem. 14, 1848 (1975) a A. S. Dutta a kolektiv, J. Chem. Soc. Perkin I, 1979, 379.

Substituce N-metylleucinu za leucinový zbytek v pozici 7 vede ke zvýšené stabilitě k enzymatické degradaci. Viz například N. Ling a kolektiv, Biochem. Biophys. Res. Comm., 63, 801 (1975).

Substituce triptofanového zbytku v pozici 3 3-(1-.naafyi )-L-alaninem vede ke· zvýšení biologického účinku. Viz například K. U. Prasad a kolektiv, J. Med. Chem., 19 492 (1976) a Y. Yabe, Chem. Pharm. · Bull., 24, · (12), 3149 (1979).

Tyrosinový zbytek v pozici 5 může být nahrazen fenylalaninem nebo 3-(1-pentaf luorfenyl)-L-alaninem při zachování podstatné biologické účinnosti. Viz ' například N. Yanaihara a kolektiv, Biochem. Biophys. Res. Comm., 52, 64 (1973) a D. Coy a kolektiv, J. Med. Chem., 16, 877 (1973).

Z hlediska použití by bylo žádoucí připravit další analogy LH-RH, které by měly ještě vyšší · biologický , účinek než sloučeniny popsané · · výše a které by byly klinicky použitelné pro zvířata · i pro · lidi.

Předmětem tohoto vynálezu je způsob výroby nonapeptidových a dekapeptidových derivátů hormonu, · uvolňujícího luteinizační hormon, obecného vzorce I (pyro· J-Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Arg-Pro-Z (I) v němž

V znamená tryptofyl, fenylalanyl nebo 3- (1^-^í^ati^l) -L-alanyl,

W , znamená tyrosyl, fenylalanyl nebo 3- (1-pentaf luorf enyl) -L-alanyl,

X znamená zbytek D-aminokyseliny obecného vzorce

O —nh—сн—σΙ

CH2 I R v němž R znamená (a) karbocyklický radikál obsahující , aryl vybraný ze skupiny zahrnující naftyl, an thryl, fluorenyl, , fenanthryl, bifenylyl, benzhydryl a fenyl substituovaný třemi až pěti rovnoretězými skupinami s 1 až 4 atomy uhlíku nebo (b) nasycený karbocyklický radikál, vybraný ze skupiny zahrnující cyklohexyl substituovanými třemi až pěti rovnořetězými alkylovými skupinami s 1 až 4 atomy uhlíku, perhydronaftyl, perhydrobifenylyl, perhydro^^-difenylmethyl a adamantyl,

Y znamená leucyl, iso-leucyl, nor-leucyl nebo N-methylleucyl,

Z znamená glycinamid nebo skupinu -NH-R1 v níž

R1 znamená alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, cykloalkyl se 3 až 6 atomy uhlíku, fluoralkyl s 1 až 4 atomy uhlíku nebo skupinu

O —NH—C—NH—R2 v níž

R² znamená atom vodíku nebo alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, jakož i jejich farmaceutických so-lí.

Jak vyplývá z výše uvedeného textu, používá se z důvodu srozumitelnosti popisu vynálezu pro různé běžné · aminokyseliny konvenční značení, které bylo obecně přijato v oboru peptidů, jak je doporučováno lUPAC-IUB Commission on , Biochemical Nomenclature, Blochemistry, 11, 1726 (1972J a znamená L-aminokyseliny s výjimkou achirální aminokyseliny glycinu a s další výjimkou aminokyselin v 6. pozici, označených X. Všechny zde uvedené peptidové řady · jsou řazeny podle obecně přijaté konvence, přičemž N- ukončení aminokyseliny je psáno vlevo a C-ukončení aminokyseliny je psáno vpravo.

Výraz „farmaceuticky přijatelné soh“ použitý v popisné části a v definici vynálezu znamená soli, které si podržují žádanou biologickou účinnost původní sloučeniny a nevykazují nežádoucí toxlkologické účinky.

Příkladem takových solí jsou (aj adiční soli s kyselinami, které se tvoří s anorganickými kyselinami, jako jsou kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina sírová, kyselina fosforečná, kyselina dusičná · a podobně; a soli, které se tvoří s organickými kyselinami, jako jsou například kyselina octová, kyselina šťavelová, kyselina vinná, kyselina jantarová, kyselina maleinová, kyselina fumarová, kyselina glnkonová, kyselina citrónová, kyselina jablečná, kyselina askorbová, kyselina benzoová, kyselina tříslová, · kyselina ,pamová, · kyselina alginová, kyselina ·· polyglutamová, kyselina naftalensulfonová,,, kyselina · naftalendisulfonová, kyselina, polygalakturonová;

(bj soli ·s kationty· · polyvalentních kovů, jako jsou zinek, vápník, vizmut, baryum, hořčík, hliník, měď, kobalt, nikl, kadmium a podobně, nebo s organickým kationtem, který se vytvoří z N,N‘-dibenzylethylendiaminu nebo ethylendiaminu; nebo (c) kombinace (a) a (b), například soli s tanátem zinku a podobně.

V textu používaný výraz „alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku“ zahrnuje lineární nebo rozvětvenou nasycenou uhlovodíkovou skupinu, jako jsou například methylová skupina, ethylová skupina, n-propylová skupina, izopropylová skupina, n-butylová skupina, izobutylová skupina, sekundární , a terciární butylová skupina.

Výraz „cykloalkyl se 3 až 6 atomy uhlíku“ znamená cyklickou nasycenou uhlovodíkovou skupinu, jako je například cyklopropylová skupina, cyklobutylová skupina, cyklopentylová skupina a cyklohexylová skupina.

Výraz „fluoralkyl s 1 až 4 atomy uhlíku“ znamená alkylovou skupinu, ve které je jeden nebo více atomů vodíku nahrazeno fluorem. Příkladem takových skupin může být trifluormethylová skupina, pentafluorethylová skupina, 2,2,2-trifluorethylová skupina a podobně.

Výraz „naftyl“ zahrnuje 1- a 2-naftylové skupiny; „anthrylová skupina“ znamená 1-, 2- a 9-antrylové skupiny; fluorenyl“ znamená 2-, 3-, 4- a 9-fluorenyl; fenantryl“ zahrnuje 2-, 3- a 9-fenantryl; a „adamantyl“ znamená 1- a 2-adamantyl.

Výhodné sloučeniny podle vynálezu jsou ty sloučeniny, ve kterých X znamená 3-(2-naftyl)tDtalanylovou skupinu nebo 3-(2,4,6-trií^f^tt^^llf^e^;^^ )-D-alanylovou skupinu;

Z znamená glycinamidovou skupinu nebo skupinu -NHEt; V znamená tryptofylovou skupinu nebo fenylalanylovou skupinu; W znamená tyrosylovou skupinu a Y leucylovou nebo N-methylleucylovou skupinu.

Zejména výhodnými sloučeninami jsou:

(pyro j -Olu-His-Tr p-Ser-Tyr-.3-

- (2-naf tyl) -D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NHž, (pyro )-01u-His-Trp-Ser-Tyr-3-

- (2-naf tyl j -D-alany 1-N-methyl-Leu-Arg-Pro-Oly-NHž, (pyro) -Olu-His-Phe-Ser-Tyr-3-

- (2-naf tyl ] -D-alanyl-Leu-Arg-Pr o-Gly-NHz, (pyro) -Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-

- (2,4,(^--^rimethylfeny 1) -D-alanyl-Leu-Arg-Pro-0ly-NH2, (pyro) -O.lu-His-Trp-Ser-Tyr-3-

- (2-naftyl-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-NHEt a (pyro) -O.lu-His-Trp-Ser-Tyr-3-‘(2-naftyl-D-alanyl-N-methyl-Leu-Arg-Pro-NHEt a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

Obzvláště výhodnou sloučeninou je potom (pyro) -Olu-His-Trp-Ser-Tyr-3- ((2-.na f tyl) -D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Oly-NHž a její soli.

Sloučeniny podle vynálezu a zejména jejich soli, vykazují neočekávatelně vysoký a dlouhotrvající funkční účinek LH-RH v porovnání s nejúčennějšími LH-RH analogy podle dosovadního stavu techniky, konkrétně s (pyro)-Olu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Ser-Arg-Pro-Oly-NHž a odpovídajícím prolylethylamidem. Prvotním měřítkem účinnosti je schopnost úplně nebo částečně potlačit estrus u krysích samic s normálním cyklem (zjišťováno během dvoutýdenního cyklu) při podkožní injekci dvakrát denně.

Další biologické zkoušky, které byly použity pro LH-RH analogy a které byly použity pro sloučeniny podle předmětného vynálezu zahrnují:

(a) vyvolání ovulace v diestru nebo proestru krysích samic při podkožním injektování [Rippel a kol., Proč. Soc. Exp Biol. Med., 148, 1193 (1975)];

(b) uvolňování LH a FSH rozptýlenými tkáňovými buňkami předního laloku hypofýzy, měřeno radioimunologickou zkouškou [Vale a kolektiv, Endocrinology, 91, 562 (1972)], a (c) uvolňování LH a FSH do periferní cirkulace ovarektomovaných, steroidně léčených krys po nitrožilním injektování, měřeno zkouškou radioíímujnoassay, [Arimura a kol.., Endocrinology, 90, 163 (19712)].

Účinek těchto sloučenin může být na vyšší úrovni demonstrován in vivo potlačením spermatogeneze, cirkulace a testikulárních hladin testosteronu, jakož i výrazným snížením velikosti prostaty u psů trpících benigní hypertrofií prostaty.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být na základě shora uvedených vlastností použity ve velkém množství případů, kde je důležitá regulace LH a FSH, nebo přímá činnost pohlavních žláz.

Patří mezi ně:

Fyziologické použití (působení nízkých dávek) — vyvolání ovulace při anovulační neplodnosti a pro časovanou ovulaci u samic savců, — terapie neplodnosti způsobené nedostatečnou funkcí žlutého tělíska u žen, — terapie hypogonadotropní nebo· hypo gonadální neplodnosti u lidí obou pohlaví, — terapie cystózní ovaria/nymfomanického syndromu u dobytka, — vyvolání nebo zlepšení sexuálního chování nebo terapie impotence/írigidity.

Paradoxní použití (působení vysokých dávek) — ženská antikoncepce, — potlačení nebo oddálení ovulace, — vyvolání porodu, — úprava nepravidelného cyklu, — potlačení estru, — podpora růstu u zvířecích samic, — luteolýza, vyvolání menstruace, — včasné vyvolání potratu v 1. trimestru, — terapie endometriózy, — terapie nádorů a cyst prsu, — terapie syndromu polycystického ovaria (Stein-Leventhal), — terapie nádoru dělohy, — terapie benigní hypertrofie prostaty a rakoviny prostaty, — mužská antikoncepce, — terapie chorob, které jsou následkem nadměrného vývoje pohlavních hormonů u obou pohlaví, — funkční kastrace u samců zvířat chovaných pro maso, — potlačení proestrálního uvolňování.

Uvedené sloučeniy, stejně jako LH-RH sloučeniny podle dosavadního stavu techniky, mohou být inavíc neočekávatelně použity jako potratová činidla, která výrazně snižují cirkulační hladiny HCG a .mají přímý účinek na placentu. Placentální účinek nabízí možnost použití 'proti choriokarcionu.

Další možností použití shora popsaných sloučenin (včetně použití, která nebyla pro LH-RH analogy dosud popsána), je zejména jejich použití pro inhibici ovulace (tj. antikoncepce) u samic, při léčbě endometriózy, v léčbě benigní hypertrofie prostaty, při inhibici spermatogeneze (tj. antikoncepce) u samců. Sloučeniny vyráběné způsobem podle tohoto vynálezu jsou tudíž použitelné pro inhibici ovulace, léčbu endometriózy, zmenšení velikosti prostaty nebo inhibici spermatogeneze u savců.

Při léčbě se podává účinné množství sloučeniny nebo farmaceutické směsi, obsahující účinnou sloučeninu. Tyto sloučeniny mohou být aplikovány jakýmkoliv způsobem, což závisí na jednotlivých případech. Mezi tyto způsoby aplikace patří aplikace orální, parenterální (včetně podkožní, nitrosvalové a nitrožilní), vaginální aplikace (zejména při antikoncepci), rektální aplikace, bukální (včetně sublinguální) nebo intranasální aplikace. Nejvýhodnější způsob podávaní bude v kterémkoliv z uvedených případů záviset na použití, vlastní aktivní složce, na subjektu a úvaze ošetřujícího lékaře. Sloučeniny nebo směsi mohou být aplikovány též ve formě pomalu se uvolňujících směsí, depotních nebo implantančiních směsí, jak je popisováno v dalším textu.

Pro shora uvedená použití, která jsou takzvaně „paradoxní“, neboli používají vysokých dávek, se obecně doporučuje aplikace aktivní složky v množství od přibližně 0,01 do přibližně 100 mikrogramů/kg tělesné hmotnosti za den, ve výhodném provedení od přibližně 0,1 do přibližně 5,0 mikrogramů/kg tělesné hmotnosti za den’ Podávání může být provedeno jednotlivou denní dávkou, rozložením na několik aplikací nebo pomalým uvolňováním, aby se dosáhlo co nejúčinnějších výsledků.

Přesné dávkování a způsob aplikace těchto sloučenin bude nutně záviset na potřebě individuálního ošetřovaného subjektu, na povaze léčby, na stupni zasažení nebo potřeby a pochopitelně na uvážení ošetřujícího lékaře. Parenterální aplikace obecně vyžaduje nižší dávkování než ostatní způsoby podávání, které závisí ve větší míře na absorpci.

Sloučeniy podle vynálezu jsou dobře snášeny a jsou relativně netoxické. Typické sloučeniny vykazují v hodnotách LD50 při podkožní aplikaci u myší hodně nad 40 -mg/ /kg, velice vysoký bezpečnostní faktor v porovnání s terapeutickými dávkami, které byly uvedeny výše.

Farmaceutické směsi obsahující jako aktivní složku sloučeninu vyráběnou způsobem podle tohoto vynálezu se skládají z aktivní sloučeniny a z farmaceuticky přijatelného netóxického nosičového materiálu. Tyto směsi, jak bylo uvedeno dříve, mohou být připraveny pro parenterální (podkožní, nitrosvalovou nebo nitrožilní) aplikaci, zejména ve formě roztoků nebo suspenzí; pro vaginální nebo rektální aplikaci obzvláště v semipevném stavu, jako jsou krémy nebo čípky; pro orální nebo bukální aplikaci, zejména ve formě tablet nebo kapslí; nebo pro intranasální aplikaci převážně ve formě prášků, nosních kapek a aerosolů.

Směsi mohou být výhodně aplikovány ve formě jednotlivých dávek a -mohou být připraveny jakýmkoliv ze způsobů, které jsou běžně známé ve farmaceutickém oboru, například jak je popsáno v Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing company, Easton, PA., 1970.

Směsi pro parenterální aplikaci mohou jako běžné pomocné látky obsahovat sterilní vodu nebo solanku, polyalkylenglykoly, jako je polyethylenglykol, olej rostlinného původu, hydrogenované naftaleny a podobně. Směsi pro vaginální nebo· rektální aplikaci mohou jako pomocné látky obsahovat například polyalkylenglykoly, vazelínu, kakaové máslo a podobně. Směsi pro inhalační aplikaci mohou být pevné a obsahují jako pomocné látky, například laktózu, nebo mohou být vodnými nebo olejovitými roztoky pro aplikaci ve formě nosních kapek. Při bukální aplikaci patří mezi typické pomocné látky cukry, stearan vápenatý, stearan hořečnatý, předželatinovaný škrob a podobně.

Pro použití je obzvláště žádoucí, aby se sloučeniny podle vynálezu uvolňovaly do subjektu z jednotlivé dávky během delšího časového úseku, například po dobu od jednoho· týdne do jednoho roku. Mohou být použity různé formy pomalého uvolňování, depotní nebo implantanční dávky. Ve složení dávkované látky může být například obsažena farmaceuticky přijatelná netoxická sůl sloučeniny, která má nízký · stupeň rozpustnosti v tělesných kapalinách, například (a) adiční sůl s vícesytnou kyselinou, jako je kyselina fosforečná, kyselina sírová, kyselina citrónová, kyselina vinná, kyselina tříslová, kyselina pamová, kyselina alginová, kyselina polyglutamová, kyseliny naftalen mono- nebo disulfonové, kyselina polygalakturonová a · podobně;

(b) sůl s kationtem polyvalentního kovu, jako je zinek, vápník, ivizrnut. baryum, hořčík, hliník, měď, kobalt, nikl, kadmium a podobně, nebo s organickým kationtem, který se vytvoří například z N,N‘-dibenzylethyendiaminu nebo z ethylendiamfnu; nebo (c) kombinace (a) a (b), například sůl s tanátem zinku.

Sloučeniny podle vynálezu, nebo ve výhodném provedení jejich relativně nerozpustné soli, které byly popsány výše, mohou být dále ··obsaženy v gelu vhodném píro injektování, jako je například gel monostearanu hlinitého, s například sezamovým olejem. Obzvláště výhodné soli jsou soli zinku, soli s tanátem zinku, pamoátové soli a podobně.

Další typ složení pro pomalé uvolňování při injektování může obsahovat sloučeninu •nnbo sůl dispergovanou nebo uzavřenou v pomalu degradujícím, netoxickém polymeru, který nemá antigenní účinky. Příkladem může být polymer kyselina polymléčná/kyselina polyglykolová, který je například popsán v patentu Spojených států amerických č. 3 773 919. Sloučeniny, nebo ve výhodném provedení relativně nerozpustné soli, jako jsou ty, které byly popsány výše, mohou být též obsaženy v cholesterolových silastikových peletách, zejména pro použití na zvířatech.

Další směsi pr.o pomalé uvolňování, depótní a implantační směsi, například liposony, jsou známé z dosavadního stavu techniky. Viz například „Suistained and Controlled Release Drug · Delívery Systems“, J. R. Robinson ed., · Marcel Dekker, lne., New York, 1978. Důležitý odkaz na LH—-RH typy sloučenin je .obsažen například v patentu Spjených států amerických č. 4 010 125.

Syntéza polypeptidů podle vynálezu může být provedena jakýmikoliv způsoby, které jsou známy z dosavadního stavu techniky v oboru · peptidů. Shrnutí mnoha · způsobů vhodných pro syntézu peptidů v pevné fázi je .obsaženo v J. M. Stewart a J. D. Young, „Solid Phase Peptide Synthesis“, W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969, a J. Meienhofer, „Hormonal Proteins and Peptides“, sv. 2, str. 46, · Academie Press [New York), 1973 a pro klasickou rozpouštědlovou syntézu E. Schr.oder a K. Lubke, „The Peptides“, sv. 1, Academie Press [New York), 1965.

Tyto postupy se obecně skládají z postupných adicí jedné nebo více aminokyselin nebo vhodně chráněných aminokyselin na rostoucí · (peptidový řetězec. Běžně · je buď · aminová, nebo karboxylové skupina první aminokyseliny chráněna vhodnou ochrannou skupinou. Chráněná aminokyselina, nebo aminokyselina ve formě derivátu, může být potom vázána · na pevný inertní nosič nebo může být použita v roztoku. Další aminskyselina ze sledu, která · má příslušnou aminovou nebo karboxylovou skupinu · vhodně · chráněnou se přidá za podmínek, které jsou vhodné pro vytváření amidové vazby. Ochranná skupina se potom ze zbytku této nově přidané aminokyseliny ' · odstraní, poté se přidá další (vhodně chráněná) · aminokyselina a · tento postup dále pokračuje. Po dosažení správného sledu, požadovaných aminokyselin se zbylé ochranné skupiny (a všechny pevné nosiče) následně nebo současně .odstraní, čímž se získá výsledný polypeptid.

Při jednoduché úpravě tohoto způsobu je možné přidávat k rostoucímu řetězci najednou. více než jednu aminokyselinu. Například při adici [za podmínek, kdy · nedochází k racemizaci asymetrických center) chráněného tripeptidu s vhodně chráněným dipeptidem se tvoří p.o · odstranění ochranných skupin pentapeptid.

Obzvláště vhodný způsob výroby peptidů podle vynálezu je syntéza v pevné fázi.

Při tomto zvláště výhodném způsobu je α-aminová funkční skupina aminokyseliny chráněna kyselinou nebo skupinou vnímavou k zásadám. Tato ochranná skupina by měla mít takové vlastnosti, aby byla stálá za podmínek' vytváření peptidové formace a současně aby byla snadno odstranitelná bez destrukce rostoucího peptidového řetězce . nebo· racemizace jakéhokoliv z asymetrických center, které jsou v řetězci obsaženy. Vhodnými ochrannými skupinami jsou t-butyloxy-karbonylová skupina (Boc), benzyloxykarbonylová skupina (Cbz), bifenylizopropyloxykarbonylová skupina, t-amyloxykarbonylová skupina, izobornyloxykarhonylová skupina, a,a-dimetyl-3,5-dimetoxybenzylox-ykarbonylová skupina, •o-mtrofenylsulfenylová skupina, 2-kyano-t-butyloxykarbonylová skupina, 9-fluorenylmetyloxykair- . bonylová skupina a podobně, obzvláště t-butyloxykarbonylová skupina (Boc).

Obzvláště výhodnými ochrannými skupinami bočního řetězce jsou — píro arginin: nitro skupina, p-toluensulfonylová skupina, mmetoxybenzensuinonová skupina, Cbz, Boc a adamaniy].exykarbeeylevá skupina; pro tyrosin: benzylová skupina, o-brombenzylexykarbenylevá skupina, 2,6-dlchlerbenzylevá skupina, isopropylová skupina, · cyklohexylová skupina, cyklopentylová skupina a acetylová skupina; pro se-rin: benzylová a tetrahydropyranylová skupina; pro histidin: benzylová skupina, p-toluensulfonylová skupina a 2,4-dinitrofeeylevá skupina.

C-nkončená aminokyselina je vázána na vhodný pevný nosič. Vhodnými pevnými nosiči, které jsou použitelné pro shora uvedenou syntézu, jsou takové materiály, které jsou · inertní k reakčním složkám a k reakčním · podmínkám stupňovitých kondenzačních a •deprotekčních reakcí a zároveň jsou nerozpustné v použitém médiu. Vhodnými pevnými nosiči jsou polymer chlormetylpelystyren-divmyibenzen, hydroxymetyl-polystyrein-divinylbenzen a · podobně, zejména · · polymer chlermetyl-polystyren-1⁰/o divinylbenzen. . Pro · speciální případ, kdy C-ukončení · sloučeniny · je tvořeno glycinamidem, je ·obzvláště vhodným nosičem polymer benzhydrylamiee-polystyren-divieylbenzen, popsaný v P. Rívaille a kol., Helv. Chim. Acta, 54, 2772 (1971).

Vazba k polymeru · chlermetylpelystyree-divmylbenzenového typu se vytvoří reakcí N“ chráněné aminokyseliny, zejména Boc-aminokyseliny ve formě česné, tetrametylamoniové, trietylamoniové, 4,5-diazobicyklo(5,4,0 )undec-5-enové nebo podobné soli v etanolu, acetornirilu, N,N-dimetylfermamidu (DMF) a podobně, obzvláště česné soli v DMF, s chlorm-stylovým polymerem při zvýšených teplotách, například v rozmezí od 40 do 60 °C, při výhodném provedení při teplotě přibližně 50 °C, po dobu od přibližně 12 do 48 hodin, ve výhodném provedení přibližně 24 hodin.

N^Boc-aminokyselina je vázána k benzhydrilamlnovému polymeru prostřednictvím nepřímé adiční reakce N,N‘-dlcyklohexylkarbediimid (DCC/l-hydrexybenztriazel (HBT), která se provádí po dobu od přibližně 2 do přibližně 24 hodin, ve výhod ném provedení přibližně 12 hodin při teplotě· v rozmezí přibližně 10 až 50 °C, ve výhodném provedení při teplotě 25 °C v rozpouštědle, jako je například dichlor^metan nebo DMF, ve výhodném provedení v dichlormetanu.

Adice následných chráněných aminokyselin může být provedena v automatickém syntetizá.toru polypeptidů, který je známý z dosavadního stavu techniky. Odstranění N“ · ochranných ' skupin může být provedeno· v přítomnosti například roztoku kyseliny ШПиопctové v metylenchiloridu, chlorovodíku v kyselině octové, chlorovodíku v dioxanu nebo v přítomnosti jiného roztoku silné kyseliny, ve výhodném provedení v přítomnosti 50% kyseliny trlfluorectové v dichlermetanu a při přibližně pokojové teplotě. Každá chráněná aminokyselina se při výhodném provedení používá v · pribllž-ně 2,5 molárním přebytku a adiční reakce může být provedena v dichlor^metanu, ve směsích dichlormetan/DMF, v DMF a podobně, obzvláště v metylénchloridu při pokojové teplotě. Adičním činidlem je běžně · DCC v dichlormetanu, · ale může jím být i N,N-diízepгopylkarbediimid nebo jiný karbodiimid, buď samostatně nebo v přítomnosti HBT, imid kyseliny N-^:hydrexyjaetarové, další · · N-hydrexyi:midy nebo oximy. Případně mohou být · použity také aktivní estery chráněných aminokyselin [například p-nitrOfenyl, pentafluorfenyl a podobně) nebo · symetrické anhydridy.

Na konci syntézy v pevné fázi se zcela chráněný polypeptid odstraní z polymeru. Jessiiže je vazba k polymernímu moisiči beinzy^í-arového typu, provede se odštěpení pomocí aminolýzy alkylaminem · nebo fl^uoralkylaminem u peptldů s prolinovým C-ukončením a · u peptidů s gly-cinovým · C-ukončením aminelýzeu například se směsí · amoeiak/metanel nebo ame^^iak/etanol. Pracuje se při teplotě v rozmezí od přibližně 10 do přibližně 50 °C, při výhodném provedení při teplotě přibližně 25 °C, po· dobu přibližně od 12 do 24 · hodin, ve výhodném provedení přibližně 18 · · hodin. Peptid může být od polymeru odělen také transesteгilikací, například metanolem, následovanou aminelýzou. V tomto stadiu může být chráněný peptid čištěn chгe.mategralicky na silikagelu.

Odstranění bočních ochranných skupin z polypeptidů se provede působením například bezvodého roztoku fluorovodíku na produkt aminolýzy v přítomnosti anizolu nebo jiné karbonové látky, působením komplexu fluorovodík/pyridin, působením tris(tiífluoracetyl) boronu a kyseliny М11югoctové na produkt aminolýzy, redukcí vodíkem a paládiem na uhlíku nebo redukcí sodíkem v kapalném čpavku, při výhodném provedení působením kapalného fluorovodíku a anisolu, při teplotách od přibližně —10 do přibližně +10 °C, ve výhodném pro vedení při teplotě přibližně 0 °C, po dobu od přibližně 15 minut do přibližně 1 hodiny, ve výhodném provedení přibližně 30 minut. U peptidů zakončených glycine,m a vázaných na benzh у dry lamino vém polymeru se odštěpení polymeru a odstranění ochranných skupin může provést v jednom kombinovaném stupni za použití kapalného fluorovodíku a anizolu, jak bylo popsáno výše.

Polypeptid zcela zbavený ochranných skupin se potom čistí sledem chromatografiekých operací, které využívají některé nebo všechny z následujících typů: výměna iontů na slabě bazickém polymeru v acetátové formě; hydrofobní absorpční chromatografie na polystyren-divinylbenzenu (například Amberlite XAD); absorpční chromatograf ie na silikagelu; chromatografie s výměnou iontů na karboxymetylceluloze; rozdělovači chromatografie, například na Sephadexu G-25, nebo protiproudé rozdělování; vysocevýkonná kapalná chromatografie (HPLC), zejména HPLC s reverzní fází na oktadecylsilice jako zakotvené fázi náplně kolony.

Jestliže se v 6. pozici použije racemická aminokyselina, oddělí se jako finální produkty diastereoizomerní nonapeptidy nebo dekapeptidy a žádaný peptid obsahující v 6. pozici D-aminokyselinu se izoluje a čistí při výhodném provedení pomocí shora uvedených chromatografických postupů.

Peptidy, které mají C-ukončení azaglycinamidy se s výhodou připravují pomocí klasické roztokové syntézy peptidů za pomocí běžných peptidových výchozích látek. Tento postup je podrobně popsán v příkladu 3.

Podstata výroby nonapeptidových a dekapeptidových derivátů hormonu, uvolňujícího luteinizační hormon, způsobem podle tohoto vynálezu je v tom. že se na sloučeninu obecného vzorce II (pyro)—Glu—His—V—Ser— (II)

I I (P4a (₽²)b —W—X—Y—Arg--Z‘—(S )_d

I I (P3)c v němž

V, W, X a Y mají shora uvedený význam a

Z‘ znamená Z, jak je definováno shora, nebo glycyl, pi, p2, рз _a pí značí postranní řetězce chráničích skupin, přičemž

P¹ se volí ze skupiny zahrnující benzyl, p-tolueinsulfoinyl, a 2,4-dinitrofenyl,

P² se volí ze skupiny zahrnující benzyl a tetrahydropyranyl,

P³ se volí ze skupiny zahrnující benzyl, o-brombenzyloxykarbonyl, 2,6-diCihlorbenzyl, isopropyl, cyklohexyl, cyklopentyl a acetyl, je-li W tyrosyl, a

P⁴ se volí zeskupiny zahrnující nitroskupinu, p-toluensulfonyl, 4-methoxybenzensulfonyl, benzyloxykairbonyl, t-butyloxykarbonyl a adamantyloxykarbonyl,

S znamená tuhý nosič složený z kopolymeru styrenu, pořípadě substituovaného, s s malým množstvím síťovacího činidla, jako je divinylbenzen a a, b, c a d značí jednotlivě celé číslo 0 nebo 1, působí činidlem .odstraňujícím chrániči skupiny, vybraným ze skupiny zahrnující anorganickou n-ebo organickou kyselinu, fluorovodík, vodík a sodík v kapalném amoniaku, při teplotě —10 až +10 °C a je-li d rovno 1, působí se na výslednou sloučeninu nebo na sloučeninu obecného vzorce II činidlem rozkládajícím tuhý nosič, vybraným ze skupiny zahrnující alkylamin s 1 až 4 atomy uhlíku, fluoralkylamin s 1 až 4 atomy uhlíku a amoniak, popřípadě s následujícím působením alkanolem s 1 až 4 atomy uhlíku za vzniku sloučeniny shora uvedeného obecného vzorce I nebo její soli a popřípadě sloučenina shora uvedeného obecného vzorce I se působením organické nebo anorganické kyseliny převede na její farmaceuticky vhodnou sůl nebo sůl sloučeniny shora uvedeného obecného vzorce I se působením jiné organické nebo anorganické kyseliny převede na farmaceuticky vhodnou adiční sůl nebo sůl sloučeniny shora uvedeného obecného vzorce I působením anorganické báze rozloží na volný peptid shora uvedeného obecného vzorce I.

Následující příklady jsou uvedeny z důvodu objasnění předmětného vynálezu. Příklady nelimitují rozsah vynálezu, ale slouží pouze pr.o jeho ilustraci a znázornění.

Příprava A

Do baňky, která byla vysušena v sušárně a která obsahovala 0,1 litru absolutního etanolu (destilovaného z etoxidu hořčíku) bylo přidáno 1,52 gramu kovového sodíku. Po skončení vyvíjení vodíku bylo do roztoku přidáno 10,21 gramu etyl-2-acetamido-2-kyaneacetátu a 13,2 gramu 2-brommetylnaftalenu. Roztok byl zahříván pod refluxem po dobu 1 hodiny a poté zchlazen. Etanol byl odpařen za sníženého tlaku a zbytek byl převeden do octanu etylnatého. Organická vrstva byla promyta dvěma 50mililitrovými díly vody, jedním 5Omililitrovým dílem nasyceného roztoku chloridu sodného a vysušena na síranu horečnatém. Roztok byl zfiltrován, -rozpouštědlo bylo oddestilováno za sníženého tlaku a zbytek byl hydrolyzován při refluxu po dobu 2 hodin 100 mililitry koncentrované kyseliny chlorovodíkové.

Hydrolyzovaná -směs byla ochlazena a sraženina surového produktu byla odfiltrována. Surový produkt byl opětně -rozpuštěn v 0,5 litru horké vody, která obsahovala 5 mililitrů koncentrované kyseliny chlorovodíkové upravené dřevným uhlím a pH roztoku bylo upraveno na 6 koncentrovaných hydroxidem amonným. Sraženina byla odfiltrována a vysušena ve vakuu, čímž bylo získáno 11,3 - gramu čistého 3-[2-naftyl)-D,-L-alaninu s teplotou tání 230 až 232 °C.

Opakování shora uvedeného postupu a záměnou stechiometricky ekvivalentních množství

1- brommetylnaftalenu,

9-brom'metylantracenu,

9-brommetylfluorenu,

2- brommetylfluorenu,

2- brommetylantracenu, l-brommetylantracenu, a-chlorizodurenu, 4-b-rommetylbifenylu, l-brommetyladamantanu,

3- brommetylfenantrenu, l-ohlormetyl-2,4,6--ri-[n-butyl) benzenu a l-chlormety--2,3,4,5,6-pentametylbe.nzenu, za 2-bro-mmethylnaftalen -se získají následující aminokyseliny:

3-(l-naftyl)-L,L- alanin, teplota tání 185—187 °C,

3- [ 9-эп1гу1) - D .L-alanin, teplota tání 290 °C [sůl s HC1),

3- [ 9-f luorf einy i)-D,L-alanin,

3- [ 2-fluorf enyl j -D,L-a lanin, teplota tání 264—269 °C,

3- [ 2-antryl) -D,L-alanin,

3- [ 1-antryl j -D,L-alanin,

3- [ 2,4,6-tri’metylf enyl j -D,L-alanin, teplota tání 235—2'137 °C,

3- [ 4-bif οιιΙι-Ι t -D,L-alanin, teplota tání 290 °C,

3- [ 1-adama ntyl) -D,L-alanin,

3- [ 3-f οι-ι^ιΙ ] -D,L-alanin,

3- [ 2,4,6-tri[n-butylj fenyl] -D,L-a-anin n

3- [ 2,3,4,5,6--00 taanethylfenyl ) -И^-п-ппПц.

Příprava B

Roztok 18,2 gramů 1,1-difenyletylénu, 25,3 gramu metal-a-metoxy-N-bellzyloxykarbcm.ΙΙ^Ιιοιμ^ a 1,5 gramu kyseliny 2-naftalensulfonové v 300 mililitrech bezvodého benzenu byl -refluxován -2 dny. Surový produkt byl čištěn na -sloupci kyseliny křemičité za použití gradientu -CH2CI2 k CH2CI2/ /EtOAc [18:1]. Vyčištěný metyl 2-[l-(2,2-difenaletalenyl) ] -N-benzyloxakarbonylglycinát byl hydrolyzován roztokem 10,9 gramu KOH v 350 -mililitrech 10% vodného metanolu na odpovídající kaselinu. Vzniklá -surová kyselina byla rozpuštěna ve 100 mililitrech 95% etanolu, který obsahoval 3 mililitry koncentrované kyseliny - chlorovodíkové -a - hadrogenován v přítomnosti 2 gramů 10% Pd -na uhlíku po dobu 24 hodin, čímž se získalo 2,4 gramu - 3-(2,2-difeny-metyl]-D,L·alaninu -o teplotě tání 235—237 °C.

Příprava C

Do roztoku 12,9 gramu 3-(2-nαftyl)-D,L-alalinu ve 120 mililitrech 1M roztoku hydroxidu sodného bylo během x/z hodiny a při teplotě 0 °C přidáno- 6,23 mililitru anhydrit kasefina octové a 60 mililitrů 1M ' roztoku hydroxidu sodného. Koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou bylo pH roztoku upraveno -na 2 a -vzniklá -sraženina byla odfiltrována. Pevný -podíl byl re-krystalizován z 60% vodného roztoku etanolu, čímž se získalo 12,2 gramu N-acety--3-[2-nαftyl)-D,L-n-alinu.

Do roztoku 15 gramů této N-acetalaminokyseliny v -240 mililitrech suchého metanolu bylo přidáno 15,8 -mililitrů eterátu trifluoridu boritého a -směs byla refluxována po dobu 1 hodiny. Alkohol byl odpařen, bylo přidáno 200 -mililitrů vody a roztok byl extrahován o etanem etylnatým. Organická vrstva byla promyta vodným roztokem zásady a kaselina, -vysušena na síranu horečnatém, zfiltrována -a destilována do olejového zbytku. Кгу81п^п^ tohoto oleje ze směsi octan ety-nαtý/hexal se získalo 14,2 gramu metаl-N-acetа--3-[2-nаft:аl )-D,L-αlαninátu s teplotou tání 79—80 °C.

Opakováním tohoto postupu a záměnou stechiometricky ekvivalentních množství

3- [ 1-naf tyl ]-D,L-aaaninu, .

3- [ 2-fluorf tnyl) -D,L-allaninu,

3- [ 2-a ntryl) -D.L-alaninu,

3-[1-antryl- í-D,L-a-anmu a

3- [ 2,2-dif enylmetyl) -D,L-a-aninu za 3-[2-naftal)-D,L-alanm se získají ιmetal-N-acetyl-3- [1-naftyl j -D,L-aaaniinát, teplota tání 97,5—98 °C, metyl-N-αcety--3-(2-fluorfenyl J-D^-alaninát, teplota tání 170—171 °C, imetyl-N-acetyl-3- (2-antryl )-D,L-alaninát a metyl-N-acetyl-3(2,2-difenylm'etyl)-D,L-alaninát, teplota tání ,113—114 °C.

Příprava D

Na roztok 6,6 gramu methyl-N-acetyl-3-(2-inaftyl)D,L-al-ani.nátu ve směsi 300 mililitrů dimethylsulfoxidu, 120 mililitrů 1M roztoku chloridu draselného a 780 mililtrů vody se působilo 33,6 miligramu enzymu subtilizinu ve 3 mililitrech O,1M roztoku chloridu draselného. Hodnota pH byla udržována na 7 prostřednictvím automatické titrace 0.2M roztokem hydroxidu sodného radiometrickým pH-statem. Po 30 minutách bylo přidáno 70 mililitrů roztoku hydroxidu sodného a hydrolýza byla ukončena. Poté bylo přidáno 12 gramů hydrouhličitanu sodného, čímž se stal roztok bazickým. Po extrakci o-ctane;m ethylnatým se vytvořila organická vrstva, která obsahovala methyl-N-acetyl-3-(2-naftyl )-D-alaninát. Krystalizaci z roztoku octan ethylnatý/hexan se získala žlutá pevná látka s teplotou tání 80 až 81 °C.

Tato látka byla převedena na volnou aminokyselinu a poté na N-Boc-aminokyselinu následující způsobem:

Roztok 2,5 gramu methyl-N-acetyl-3-(2-naftyl)-D-alaninátu v 60 mililitrech 6N roztoku kyseliny chlorovodíkové byl zahříván po dobu 3 hodin na teplotě 120 až 130 °C a potom ochlazen na pokojovou teplotu. Vzniklá bílá sraženina byla oddělena a rekrystalizována z 50 mililitrů vody, která obsahovala 1 mililitr 12N kyseliny chlorovodíkové a neutralizována hydroxidem amonným na pH 6. Po vysušení ve vakuu se získalo 1,2 gramu 3-(2-naftyl-D-alaninu o teplotě tání 242 až 244 °C, (ajo²⁵ 26,6° (c 0,5, CHsCOzH).

Na 'promíchávaný roztok 3-(2-naftyl)-D-alaninu ve směsi 55 mililitrů IN hydroxidu sodného, 10 mililitrů vody a 20 mililitrů dioxanu se působilo 1,48 gramu di-tercbutyldikarbonátu a 0,22 gramu kysličníku horečnatého při teplotě 0 °C. Po 1,5 hodiny bylo přidáno dalších 0,3 gramu di-tercbutyldikarbonátu a směs se nechala zchladnout na pokojovou teplotu. Pevný podíl byl odfiltrován a filtrát byl zkoncentrován na objem 50 mililitrů. Hodnota pH byla u tohoto vodného roztoku upravena pomocí kyselého síranu sodného na 2,5 a roztok byl extrahován octanem ethylnatým. Organická vrstva byla promyta 5% NaHSO^, vodou a nasyceným roztokem soli. Roztok octanu ethylnatého byl vysušen na síranu hořečnatém, zfiltrován a zkoncentrován na olej, který krystalizaci z roztoku ether/hexan poskytl výtěžek 1,3 gramu N-Boc-3-(2-naftyl j-D- alaninUj teplota tání 90 až 91 °C, (aJo²⁵ —32,6° (c 0,8, MeOH).

Opakováním shora uvedeného postupu a záměnou stechiometricky ekvivalentních množství ;methyl-N -acet у 1-3- (1-naíty 1) -D,L-alaninátu, imethyl-N-acetyl-B- (2-f luoirfenyl)-D,L-alaninátu, methy 1-bLacetyl-3- (2-:antryl ] -D,L-alaninátu a methyl-N-acetyl-B-^^-dífenyimethyl-D,L-alaninátu za methyl-N-acetyl-S-ÍZ-naftylJ-DjL-alaninát se získají přes odpovídající volné aminokyseliny následující N^-Boc^aminokyseliny:

;N-B;oc-3-(l-naftyl)-'D-alanin, teplota tání 92 až 93 °C, M²⁵ —54,fi° ;(c 0,5 MeOH},

N-Boc-S-řŽ-fluoríenylO-D^aíanin, teplota tání 161 až 163 (decj,

N-Boc-3- (Ž^antryl )-D-alanin a

N-Boc-3-(2,2-difenylmethyl^D-alanin, teplota tání 153 až 154 ^qC.

P ř í p r a v a E

Do Parrovy hydrogenační láhve bylo umístěno 0,85 gramu 3-(2-naftyl)-D-alaninu, 100 mililitrů 2M kyseliny chlorovodíkové a 0,85 gramu Adamsova katalyzátoru (PtOs). Směs byla v Parrově hydrogenačním přístroji natlakována vodíkem na 0,4 MPa a držena po dobu 20 hodin. Poté byla směs zahráta, aby se rozpustila bílá sraženina a zfilmována přes křeimelinu. Zakoncentrováním roztoku za sníženého tlaku následovaném lyofilizací z vody se získalo 0,8 gramu 3-(2-perhydTonaftylj-D-alaninu ve formě pevné látky o teplotě tání 230 až 232 °C.

Tato látka byla rozpuštěna ve směsi 3,2 mililitru IN hydroxidu sodného, 5 mililitrů vody a 15 mililitrů dioxanu a působilo se na ní 0,14 gramu kysličníku horečnatého á 0,85 gramu di-terc.butyldikarbonátu.

Po jedné hodině stání při teplotě 0 °C a dvou 'hodinách při teplotě 25 °C byla suspenze zfiltrována, zakoncentrována do sucha při sníženém tlaku, zbytek byl rozpuštěn ve vodě, promyt diethyletherem a okyselen hydrosíranem sodným na pH 2. Okyselená vodní vrstva byla třikrát extrahována octanem -ethylnatým, extrakty byly spojeny, vysušeny na síranu hořečnatém, zfiltrovány a zahuštěny. Tím se získalo 0,75 gramu N-Boc-3-(2-perhydroinaftyl)-D-alaninu ve formě bílého oleje.

0,1 gramu této látky bylo rozpuštěno v 5 mililitrech tetrahydrofuranu a titrováno čerstvě připraveným diazomethanem při teplotě 0 °C do stálého jasně žlutého zbarvení. Reakce byla ukončena pomocí 1 mililitru kyseliny octové, rozpouštědlo bylo odpařeno a zbytek byl rozdělen mezi 75 mililitrů octanu ethylnatého a 75 .mililitrů vody. Organická vrstva byla promyta 5% hydrouhličitanem sodným, vodou, 5% hydrosíranem sodným, vodou, nasyceným roztokem chloridu sodného a vysušena síranem hořečnatým. Roztok byl zfiltrován, zahuštěn za sníženého tlaku a umístěn na desku preparativní chromatografie na tenké vrstvě (tloušťka 750 mikrometrů, silikagel 20X20 centimetrů). Na desku se působilo dichlormethanem/ethylacetátem (18/1) a proužek produktu byl odstraněn. Silikagel z proužku produktu byl na skleněné fritové nálevce promýt dichlormethan/ethylacetátem (9 : 1) a filtrát po zahuštění poskytl 0,1 gramu methyl-N-Boc-3-(2-perhydronaftyl)-D-alaninu ve formě žlutého oleje.

Tato látka byla získána jako směs dvou izomerů na 2. pozici perhydronaftalenového jádra. Tyto diastereoizomerní sloučeniny mohou být odděleny ina koloně vysokoúčinné kapalné chromatografie (silikagel Lichrosorb 60, 5 mikronů) za použití ethylacetátu/hexanu (1:9) jako elučního činidla a mohou být hydrolyzovány na volnou kyselinu N-Boc-3-(2-perhydronaftyl-D-alanin.

Opakováním shora uvedeného postupu a záměnou stechiometricky ekvivalentních množství

3- (1-naftyl) -D-alaninu,

3-(2,2-dif enyimethy 1)-D-alaninu,

3- (2,4,6-tTimethylf enyl) -D,L-alaninu,

3- (4-bif enylyl j -D,L-alanininu,

3-(2,4,6-tri (n-butyl)fenyl) -D,L-alaninu a

3-(2,3,4,5,6-pentamethylf enyl)-D,L-alaninu za 3-(2-naftyl j-D-alanin se získají následující N-Boc-aminokyseliny:

N-Boc-3- (1-perhydronaf tyl) -D-alanin,

N-Boc-3- (perhydro-2,2-difenylmethyl-D-alanin,

N-Boc-3- (2,4,6-trimethylcyklohexyl) -D,L-alanin,

N-Boc-3-perhydro-4-bif enylyl ) -D,L-alani.n,

N-Boc-3- (2,4,6-tri (n-butyl) cyklohexyl) -D,L-alanin a

N-Boc-3- (2,3,4,5,6-pentamethylcyklohexyl)-D,L-alanin.

Příklad 1

Do reakční nádoby Beckrnanova syntetizátoru peptidů 990 bylo umístěno 0,8 gramu (0,8 milimolu) polymeru benzhydrylamino-polystyren-divinyl-benzen (Lab. Systems, Inc.j, který je popsán Rlvaillem, viz výše. К polymeru byly přidány postupně aminokyseliny podle následujícího syntézního programu:

Stupeň 1 promytí CH2CI2

50% CF3CO2H/CH2CI2 — deprotekce

50% CF3CO2H/CH2CI2 — deprotekce

CH2CI2 — promytí

10% triethylamin/CHžCh promytí CH2CI2 roztok N-Boc-aminokyseliny roztok N,N‘’dicyklohexylkarbodiimldu

CH2CI2 — propláchnutí a zádrž — adice

CH2CI2 — přídavek na propláchnutí . promytí CH2CI2

·.· promytí ethanolem promytí CH2CI2 krát 1,5 min.

krát 1,5 min.

krát 30 min.

krát 1,5 min.

krát 1,5 min.

krát 1,5 min.

krát přídavek krát přídavek krát adiční reakce 2 hod.

krát 1,5 min.

krát 1,5 min.

krát 1,5 min.

krát 1,5 min.

Stupně 1 až 13 představují adiční cyklus pro jednu aminokyselinu a 'ukončení reakce je kontrolováno ninhydrlnovou metodou podle E. Kaisera a kol., Anal. Biochem., 34, 595 (1970).

Na polymer bylo následně působeno 2,5 molárním přebytkem každé chráněné aminokyseliny a DCC. Během následujících edičních cyklů tedy bylo na polymer působeno:

0,433 gramu Boc-Gly-OH,

0,432 gramu Boc-Pro-OH,

0,857 gramu Boc-Arg(Tosyl)-OH,

0,462 gramu Boc-Leu-OH,

0,504 gramu Boc-3-(2-naftyl)-D-alaninu a

0,272 gramu 1-hydroxybenztriazolu,

0,724 gramu N-Boc,O-2-brombenzoyloxykarbonyl-L-tyrosinu,

0,59 gramu Boc-Ser(benzyl)-OH,

0,608 gramu Boc-Trp-OH,

0,654 gramu Boc-His(Tosyl)-OH a

0,524 gramu kyseliny pyroglutamové.

Polymer byl vyňat z reakční nádoby, promyt CH2CI2 a vysušen ve vakuu, čímž se získalo 2,0 gramu polymeru chráněného polypeptidu.

Polypetidový produkt byl potom oddělen od polymeru a zcela zbaven ochranných skupin působením bezvodého kapalného HF. Na směs 2,0 gramu polymeru chráněného polypeptidu, a 2 mililitry anisolu v reakční nádobě Kel-F bylo způsobeno 20 mililitry redestilovaného (z C0F3} bezvodého kapalného HF při teplotě 0 °C po dobu 30 minut. HF byl odpařen ve vakuu a zbytek (pyro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (2-naftyl) -D-alanylLeu-Arg-Pro-Gly-NH2 ve formě své HF soli byl promýt etherem. Zbytek byl potom extrahován ledovou kyselinou octovou. Ex trakt kyseliny octové byl lyofilizován, čímž se získalo 0,8 gramu surové látky.

Surový polypeptid byl potom vložen do kolony 4 X 40 cm, Amberlite XAD-4 (kopolymer polystyren-4% dívinylbenzen) a vymýván konkávním gradientem voda (0,5 litru) — ethanol (1 litr). Trubičky obsahující frakce od objemu vytékající kapaliny 690 mililitrů do 1470 mililitrů byly vysušeny dosuoha, čímž se získalo 490 miligramů částečně čistého polypeptidu.

150 miligramů vzorku částečně čistého polypeptidu bylo podrobeno rozdělovači chromatografii na koloně 3X50 cm, naplněné Sephadexem G-25 za použití rozpouštědlového systému 1-butanol/toluen/kyselina octová/voda obsahující 1,5% ~ pyridinu v poměrech 10 : 15 : 12 : 18. Čisté frakce byly získány pomocí chromatografie na tenké vrstvě (silikagel; BuOH/HzO/HOAc/EtOAc; 1:1:111) a HPLC (5 mikronů, reverzní fáze, náplň oktadecylsilylová; 40% 0,03M NH40Ac/60% acetonitril). Žádaný produkt opustil ko-lonu ve frakcích od objemu vytékající kapaliny 1000 mililitrů do 1400 mililitrů (Rf 0,1). Čisté frakce byly spojeny, oddestilovány dosucha, vloženy do vody a lyofilizovány. Výtěžkem bylo 57 miligramů čistého pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3- (2-naf tyl) -D-alanyl-leucyl-arginil-prolyl-glycinamidu ve formě adiční soli s kyselinou octovou (a)^⁵ —27,4° (c 0,9, HOAc), teplota tání 185 až 193 °C (dec.).

Příklad 2

Pro syntézu analogů s C-ukončením Pro-NH-CH2CH3 byl použit stejný syntézní program, který byl popsán v příkladu 1. Do· reakční nádoby Beckmanova syntetizátoru 990 bylo vloženo 2,13 gramu Boc-Pro-O-polymeru, připraveného· reakcí ekvimolárních množství suché česné soli Boc-Pro-OH s chlormethyl-polystyren/1% divinylbenzenem (Lab Systems·, lne.). Množství použitého BooPro-O-polyrneru obsahovalo 1,4 milimolu prolinu.

Na polymer bylo potom působeno 2,5 molárním přebytkem každé chráněné aminokyseliny a DCC. Polymer tedy reagoval během následných adičních cyklů s

1,61 gramu Boc-Arg( (Tosyl)-OH,

0,93 gramů Boc-Leu-OH H2O,

0,94 gramu jr^a^fft^l)-D--^ll^-ninu a

0,49 gramu 1-hydroxybenztriazolu,

1,75 gramu N-Boc-O-2-brombenzyloxykarbonyl-L-tyrosinu, a

1,11 gramu Boc-Ser(benzyl)-OH.

V tomto bodě syntézy bylo množství· polymeru chráněného polypeptidu rozděleno na polovinu. S jedním dílem bylo pokračováno následnou reakcí s

0,57 gramu Boc-Trp-OH,

0,77 gramu · Boc-His(Tosyl)-OH a

0,21 gramu kyseliny pyroglutamové.

Polymer byl z reakční nádoby vyjmut, promyt CH2CI2 a vysušen ve vakuu, čímž se získalo 2,26 gramu polymeru chráněného polypeptidu.

Chráněný polypetid byl od polymeru odštěpen aminolýzou 25 mililitry ethylaminu, která probíhala po· dobu 18 hodin při teplotě 2 °C. Ethylamin se nechal odpařit a polymer se extrahoval methanolem. Po odpaření methanolu se získalo 1,39 gramu pyro-Glu-His( Tosy 1) -Trp-Ser (benzyl) -Tyr (2-br ombenzyloxykarbonyl )-3-( 2-naf tyl) -D-alanyl-Leu-Arg (Tosyl) -Pr 0-NH-CH2CH3.

Surový polypeptid byl zbaven ochranných skupin působením směsi 3 mililitrů anisolu a 30 mililitrů redestilovaného (ZC0F3) bezvodého kapalného HF po dobu 30 minut při teplotě 0 °C v reakční nádobě Kel-F. Fluorovodík byl odpařen ve vakuu a zbytek byl promyt etherem. Rozpuštěním zbytku v 2M kyseliny octové a lyofylizací se získalo· 0,82 gramu surového· (ipyirro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-nafty))-D-alanil-Leu-Arg-rro-NH-CH2CH3 ve formě adiční soli s kyselinou octovou.

Konečné dočištění bylo dosaženo preparativní vysokoúčlnnou kapalnou chromatografií 20 miligramového vzorku na koloně 0,9X550 milimetrů s oktadecylsilyl-silikou (Měrek, lichroprep Cis). Elučním činidlem bylo 64% 0,03M NH4OAc/36-% acetonitrilu. Ve čtyřech bězích bylo vyčištěno celkem 61 miligramů surové látky. Po třech lyofilizacích z vody bylo získáno 15 miligramů čistého pyroglutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3- (2-naftyl) -D-alanyl-leucyl-arginyl-prolinetylamidu ve formě adiční soli· s kyselinou octovou, teplota tání 180 až 190 °C, (a)o²⁵ —57,2° (c 1,1 HoAc).

Opakováním shora uvedeného štěpení a záměnou stechiometrických množství n-butylaminu, cyklopropylaminu, cyklohexylaminu, trifluormethylaminu, pentafluorethylamínu a

2.2.2- trifluorethylaminu za ethylamin se získají odpovídající n-butylamiid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, trifluormethylamid, pentafluorethylamid a

2.2.2- trlfluoret^l^ylamid dříve uvedeného nonapeptidu.

Příklad 3

Sloučeniny o vzorci (l), ve kterém Z znamená skupinu

220133

O

II —NH—C—NH—R2 mohou být připraveny klasickou rozpouštědlovou syntézou.

O

II —NH—NH—C—NH2:

(pyro·) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OMe [1]

V (pyr.o } Glu-His-Tr p-Ser-Tyr-№

Jako příklad může být uvedeno následující znázornění, ve kterém „AzaGlyNHfe“ znamená skupinu

Cbz-Leu-Arg-Pro-AzaGlyNbhNCh _V (2)

Boc-3- (2 -naftyl) -D-Ala-Leu-Arg-PrO-AzaGly-NH2

H-3- (2-inaf tyl) -D-Ala-Leu- Arg-Pro-AzaGly-NH2 (3) l

(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (2-naf tyl) -D-Ala-Leu-Arg-Pro-Aza-Gly-NHz jako volný peptid nebo sůl.

Vazba jednotlivých fragmentů může probíhat acylazidovým způsobem [J. Honzel a kol., Coli. Czech. Cihem. Comm., 26, 2333 (1971);], DCC/HBT adicí nebo jiným způsobem bezracemizačního vázání fragmentů. Sloučeniny (1) a (2) jsou známé [M. Fujino a kol., Biochem. Blophys. Res. Comm., 57, 1248 (1974 a A. S. Dutta a kol., J. Chem. Soc. Perkin I, 1979, 379j. Sloučenina (3) se připraví ze sloučeniny (2) odstraněním Cbz a nitroskupin 'hydrogenolýzou následovanou adicí N-Boc-3-(2-naftyl)-D-alaninu za použití DCC/HBT nebo jiného edičního činidla známého z dosavadního stavu techniky. Syntézy obdobných LH-RH analogů popsal Dutta a kol., viz výše.

Za použití dalších aminokyselin namísto N-Boc-3-( 2-naftyl )-D-alaninu mohou být obdobně připraveny jiné sloučeniny o obecném vzorci (I), například (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (2-naftyl) -D-Ala-N-methy 1-Leu-Arg-Pro-AzaGlyNH2 a [ p yco) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,bj-rimethylfenyl )-D-Ala-Leu-Arg-Pro-AzaGlyNH2.

Také při přípravě sloučeniny (2) se při použitím buď D-amínokyseliny, nebo D,L-aGly-NH2 získá odpovídající peptid s ukončením AzaGly-NH-nižší alkyl, například (pyir o) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-[ Z-naftylpD-Ala-Leu-Arg-Pro-AzaGly-Et, (pyiro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-

- (2-naftyl) -D-Ala-N-methyl-Leu-Arg-Pro-AzaGly-Et a (pyro) Glu-His-Tr p-Ser-Tyr-3-

- (2,4,6--rim ethylfen yl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro- -AzaGly-Et.

Příklad 4

Opakováním postupu ' podle příkladu 1 a použitím buď D-ami-nokyseliny, nebo D,L-aminckyselíny v pozici 6 (v druhém případě separací diastereomerních peptidů ' během chromatografle) a substitucí vhodných aminokyselin ve sledu syntézy v pevné fázi - mohou být získány následující dekapepetldy, které se izolují a 'určují jako adiční soli s kyselinou octovou:

pyi^-gdutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-( 2-naftyl)-DalanyRN^methylleucyl-arginyl-pr.opy 1-gly-cinamid, (a]_D ²⁵ —26,6° (C = 1, . HOAc), pyro-glutamyl-histidyl-fenylalanyl-seryl-tyrosyl-3-( 2-naftyl )-D-alainyllleucyllargmyl-propyl-glycinamid, pyro-glutamyl-histidy 1-3-(1-naftyl-L-alanyl-stryl-tyrosyl-3- (2-na f ty 1) -D-alanyl-leucylla;rginyllpIolyllglycinami'd, pyгo-glutamylllhiistidyl-tιгyptofyllstΐ^,yl-fenylalanyl-3-( 2-naftyl )-D-alany Hencyl-argjiny 1-pr olyl-glycinamid, ρyro-glutamyl^Jhistidyl-t<ryptofyl-se·гyll

3- [ 1-pehtaf luorf enyl) -L-alanyl-3- (2-inaf ty 1) -D-alanyl-Ieucylarginyl-propyl-glycinamid, pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3- (1-na ftyl) -D-al·anyl-leucylla;rginyl-pIopyl-glycinamid, teplota tání 173,5 °C, (a)_D25 —28,1° (C = 0,8, HOAc), pyro-gl·utamyl-histidyl-tгyptofyllSt'ryl-tyrosyl-3- (2-.a-n t ry 1) -D-alanyl-leucyllarginyll -pгopyllglycinamid, pyro-glutamyl-llistidyl-tryptofyl-st·ryl-tyrosyl-3- (2-f luDrfen^yl-Dlalanyllleucy^l-aτginyllpгopyllg].ycin-amLd, [a]D25 —25,8° (O = 1, HOAc), pyro-glutamyl-histidylltгyptofyllStryl-tyrosyl-3- (3-f enantryl) -D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid, pyro-glutamyl-^lhi^ιstidylltIyptDfyl-seryl-tyro.syI-3- (4-bifenylyl) -D-alanyl-leucyltargmy^propyl-glycinamid, [a]_D25 —35,7° — 42,1° (C = 1, HOAc), pyro-glutamyl-Ыstidyl-tI’yptofyllSeI·yl-tyrosyl-3- (2,2-idif enylmethyl) -D-alanyl-leuiyl-aIginyl-pIDlyllglyciinamid, pyro-glutamyl-hístidyl-tryptofyllStryl-tyrosyl-3- (1a daman ty 1) -D-alanyl-leucyl-argmyl-prolyllglycinamid, pyro-glutamyl-hi·stidyl-tryptofyl-seryll -tyrosyl-3- (2,4,6--rimethylf enyl )-D-alanyl-leⁱucyl-aгginyl-prD)lyllglycmamid, (a) d²5 —42,Γ (C = 1, HOAc), pyro-glutamyl-'hi'Stidyl-tI’yptofyllS&гyll -tyrosyl-3- (2,4,6-tr i-n-butylf enyl) -D-alanyl-leucyl-aгgi;ny·l-pI^D^lyl-glycínamid, pyrD-glutamyl-hi^ιsiddy--t^ryptofyl-seryl-tyrosyl-3l(2,3,4,56-pentamtt'hylfeItyl]-D-alanyl-leucyl-argmyRproly--glycLnamid, pyr0lglutaplylЛvsiidy--IгypDofy^seгyl-tyrosyl-3- (2,4,6-trime thylcyklohexyl) -D-alanyllleucyl-arginyl-pIDlyl-glycinaelid, pyro-glutamyl-histidyl-tiryptofyl-seryl-tyrosyl-3- [ 2,4,6-tri (n-butyl) cyklohexyl] -D-alanyl-leucylaIgiπyIlpгDlyl·glycmaend, pyro-glutamyl-histidyl-tiryptofyl-ssryl-tyrosyl-3- ^^hydro-l-naf tyl) -D-alanyl-leucyllaгgmyl-p!Γolyl-glycinamjd, pyrOlg^,lutamyΐlhLStidyl-tгyptD)fy]lStIyl-tyr oⁱsyl-3- (perhydro^-naf tyl) -D-alanyl-leucyl-aгginyl-pгolyllglycinamid, pyIOlglutamyllhi·stidyl-tIyptofyl-stI'yl-ty·™^^- (4-]^i^Thydrobif enylyl) D-alanyl-leu·cyl-aIginyllprDlyl-glycinamid, pyгD-glutamyl-histidyl-tryptofyl-st·rylttyгosyt-3-(ρerhydiΓDt2,2-ιdiftnylmtthyl )-D-alainyl-leucyl-arginyL·prolyl-glycinam^:id, pyIo-glutamyl-histidyl-tryptofyl-st·ry^ tyrosyl^- (2-naftyl) -D-alanyl-izoleucylta!Iginyllprolyl-glycinamid, a pyro-glutamyl-Oistidyl-tryptofyl-stгyl-tyrosyl-3- (-naftyl) -D-alanll-nor leucyllarginyl-prolyl-glycinamld.

Příklad 5

Opakováním postupu podle příkladu 2 a použitím buď D-aminokyseliny, nebo D,L-aminokyseliny v pozici 6 (v druhém případě separací . diasteItomerních peptidů během chromatografie) a substitucí vhodných aminokyselin ve sledu syntézy v pevné fázi mohou . být získány následující nonapeptidy, kteiré se izolují a určují jako adiční solí s kyselinou octovou:

pyιIO-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl4уго8у1-3- (1-naf tyl) -D-alanyl-arginyl-prolinve formě svého ethylamidu, n-butylamidu, cyklopropylamidu, cyklohexylamidu, trifluormethylarnidu, pentafluorethylamidu a 2,2,21гШоигеШ^ап^и, pyгolglutamyllhistidyl·fenylalany--teryl-tyrosyl-3- (2-naftyl-D-alanyMeucyl-arginyl-prolin ve formě ethylamidu, teplota tání 180 až 190 °C, (a)_D25 —57,2° (C = 1, 10% HOAc), n-butylamidu, cyklopropylamidu, cyklohexylamidu, tгif^UDrmethylamidu, pentafluDrtthylamid^ιu a 2,2,2-trIfluorethylamid!U, pyIDlglutamyllOl·stidyl-3- (1-naftyl) -L-alanyl-seryl-tyr osyl-3- (2-snaf ty 1) -D-alanyl-leucyl-argi·nyl-prDlm jako ethylamid, teplota tání 160 až 170 °C, . (a)_D25 —45,3° (C = 1,

HOAc), n-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, fluoírmethylamid, pe.ntafluDrethylamid a 2,2_i2-t^ιг.ifluoгtthylamid, pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-fenylalanyl-3- (2-naf tyl) -D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin jako ethylamid, in-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, trifluormethylamid, pentafluorethylamid a 2,2,2-trifluoirethylamid, pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-3- (1-pentafl'uo.rf enyl ] -L-alany 1-3- (2-naftyl )-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin jako ethylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloihexylamid, trifluormethylamid, pentafluorethylamid a 2,2,2-triflujorethylamid, pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3- (1-antryl) -D-alanyl-leucyl-arginyl. -prolin jako ethylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, trifluormethylamid, pentafluorethylamid a 2,2,2-trifluorethylamid, pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seiryl-tyrosyl-3- (2-f luorenyl) -D-alanyl-iarginyl-proilin jako ethylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, trifluormethylamid, pentafluorethylamid a 2,2,2-trifluorethylamid, pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(3-feinantryl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin jako ethylamid, (n-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, trifluormethylamid, pentafluorethylamid a 2,2,2-trifluorethylamid, pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-sieiryl-tyrosyl-3- [4-bifenylyl j-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin jako ethylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, trifluomethylamid, pentafluorethylamid a 2,2,2-trifluoirethylamid, pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3- (2,2-dif enylmethyl) -D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin jako ethylamid, teplota tání 176 až 206 °C, (a)_D ²⁵ 33,7° (C = 1, 10% HOAcj, n-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, trifluormethylamid, peintafluormethylamid a 2,2,2-trifluorethylamid, pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-( 1-adamantyl )-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin jako ethylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, trifluormethylamid, pentafluorethylamid a 2,2,2-trifluorethylamid, pyiro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seiryl-tyrosyl-3-( 2,4,6-tro.methylf enyl )-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin jako ethylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, trifluormethylamid, pentafluorethylamid a

2,2,2-trifluorethylamid, pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seiryl-tyrosyl- [ 2,4,6-tri- (n-butyi) f enyl] -D-alanyl

-leucyl-arginyl-prolin jako ethylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, trifluormethylamid, pentafluorethylamid a

2,2,2-trifluorethylamid, pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosy 1-3-(2,3,4,5,6-pentamethylf enyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin jako ethylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, trifluormethylamid, pentafluorethylamid a 2,2,2-trifluorethylamid, pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyroeyl-3-{2,4,6-trimethylcykljohexyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl prolin jako ethylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, trifluormethylamid, pentafluorethylamid a 2,2,2-trifluorethylamid, pyro-glutamyl-hystidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-S-^ 2,4,6-tri (n-butyl) cyklohexyí ] -D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin jako ethylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, n-butylamid, trifluormethylamid, pentafluoirethylamid a 2,2,2-trifluorethylamid, pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(perhydro-l-naftyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin jako ethylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, trifluormethylamid, pentafluorethylamid a

2,2,2-trifluorethylamid, pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3- (perhydiro-2-naf tyl) -D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin jako ethylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, trifluormethylamid, pentafluorethylamid a

2.2.2- trifluorethylamid, pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosy.1-3- (4-perhydrobifenylyl) -D-alanyl-leucyl-airginyl-prolin jako ethylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, trifluarmethylamid, petntafluorethylamld a

2.2.2- trifluorethylamid, pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3- (perhydro-2,2-difenylmethyl )-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin jako ethylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, trifluormethylamid, pentafluorethylamid a 2,2,2-trifluorethylamid, pyro-glutamyl-histidyl-tiryptofyl-seryl-tyrosyl-3- (2-naftyl) -D-alanyl-N-methylleucyl-arginyl-prolin jako ethylamid, teplota tání 170 až 185 °C, (ce)_D ²⁵ —81,1° C = 0,7, 10% HOAc), n-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, trifluormethylamid, pentafluorethylamid a 2,2,2-trifluorethylamid, pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3- (2-naftyl) -D-alanyl-izoleucyl-arginyl-prolin jako ethylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, trifluor-ethyl amid, pentafluoirethylamid a 2,2,2-trif.luorethylamid a pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyroisyl-3- (2-naftyl) -D-alanyl-norleucyl-arginyl-prolin jako ethylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cyklohexylamid, t-rifluormethylamid, pentafluoirethylamid a 2,2,2-trifluorethylamid.

Příklad 6

A. Roztok 0,1 gramu hydrofluoridové soli (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (2-naftyl) -D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (viz příklad 1) se rozpustí v 50 mililitrech vody a prochází kolonou ianiontového měniče iontů Dowex 3 (50 gramů), který byl před tím regenerován kyselinou octovou a promyt deionizovanou vodou. Kolona se vymyje deionizovanou vodou a vytékající kapalina se lyofilizuje. Tím se získá odpovídající sůl (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (2-naftyl) -D-Ala-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 s kyselinou octovou, (α)π²⁵ —27,5° (c = “0,9, HOAc).

Opakování shora uvedeného postupu a náhradou dalších kyselin za kyselinu octovou během regenerace polymerního měniče iontů se mohou získat například odpovídající soli s kyselinou chlorovodíkovou, kyselinou bromovodíkovou, kyselinou sírovou, kyselinou fosforečnou, kyselinou dusičnou, kyselinou benzoovou a podobně.

Obdobně mohou být připraveny adiční soli s kyselinami jiných sloučenin o vzorci (I).

B. S.oli s nízkou rozpustností ve vodě mohou být připraveny ivysrážením z vody za použití požadované kyseliny. Například:

Sůl s tanátem zinku — na roztok 10 miligramů soli (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (2-naftyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 s kyselinou octovou v 0,1 mililitru vody se působilo roztokem 8 miligramů kyseliny tříslové v 0,0i8 mililitru 0,25M roztoku hydroxidu sodného. Do roztoku LH-RH analogu byl okamžitě přidán roztok síranu zinečnatého heptahydrátu v 0,1 mililtru vody. Vzniklý roztok byl zředěn 1 mililitrem vody a sraženina byla odstředěna v centrifúze. Kal byl dekantován a zbytek byl promyt dvakrát 1 mililitrem vody při odstřeďování sraženiny a dekantaci kalu. Sraženina byla vysušena ve vakuu, čímž se získalo 15 miligramů směsné soli shora uvedeného LH-RH analogu s tanátem zinečnatým.

Pamoátová sůl — do roztoku 50 miligramů (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (2-naftyl )-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NHa soli s kyselinou octovou ve směsi 1,6 ml ethanolu a 0,1 ml litru 0,25M roztoku hydroxidu sodného byl přidán roztok 11 miligramů kyseliny pamové v 0,3 mililitru 0,25M hydroxidu sodného. R.ozpouštědla byla odpařena za sníženého tlaku a zbytek byl suspendován ve 2 mili litrech vody, odstředěn na centrifúze a kal byl dekantován. Sraženina byla promyta 1,5 mililitru vody, odstředěna a kal byl dekantován. Sraženina byla vysušena ve vakuu, čímž se získal výtěžek 54 miligramů pamoátové soli výše uvedeného LH-RH analogu.

Obdobným způsobem mohou být připraveny další soli s nízkou rozpustností ve vodě.

C. Příprava adiční soli s kyselinou z volného peptidu.

Do roztoku 50 miligramů (pyro)Glu-His-Trp-Seir-Tyr-3- (2-naftyl) -D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 ve formě volné zásady se přidá 30 mililitrů IN kyseliny octové. Výsledný roztok se lyofilizuje, čímž se získá 50 miligramů soli výše uvedeného LH-RH analogu s kyselinou octovou.

Záměnou dalších kyselin za kyselinu octovou (ve stechiometiřicky ekvivalentních množstvích) byly obdobně získány další adiční soli sloučenin o vzorci (I) s kyselinami, například s kyselinou chlorovodíkovu, kyselinou bromovodíkovou, kyselinou sírovou, kyselinu fosforečnou, kyselinu dusičnou a podobně.

D. Příprava soli s kationtem kovu, například zinečnaté soli:

Do roztoku 50 miligramů soli (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (2-naftyl) -D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 s kyselinou octovou ve směsi 0,4 mililitru 0,25M hydroxidu sodného, 0,3 mililitru vody a 1 mililitru ethanolu byl přidán roztok 15 miligramů síranu zinečnatého heptahydrátu ve 0,2 mililitru vody. Sraženina byla odstředěna na centrifúze a kal byl dekantován. Sraženina byla promyta 1 mililitrem vody při odstřeďování a dekantaci kalu. Sraženina byla vysušena ve vakuu, čímž se získalo 48 miligramů zinečnaté soli výše uvedeného LH-RH analogu.

Obdobným způsobem mohou být připraveny další soli s multivalentními ka-tionty, například s vápníkem, vizmutem, baryem, hořčíkem, hliníkem, mědí, kobaltem, niklem, kadmiem a podobně.

Příklad 7

Roztok 50 miligramů (pyro)Glu-His-TrpSer-Tyr-3- (2-naftyl) -D-Ala-Leu-Arg-Piru-Gly-NH2 ve formě soli s kyselinou octovou v 25 mililitrech vody prochází 50 gramovou kolonou naplněnou Dowexem 1 (silně zásaditý, kvartérní amoniový měnič aniontů), který byl regenerován roztokem hydroxidu sodného, aby se výměnným iontem stal hydroxylový ion. Kolona se vymyje 150 mililitry vody a vytékající kapalina se lyofilizuje. Tím se získá výtěžek 45 miligramů odpovídajícího peptidu ve formě vofné zásady.

Obdobně mohou být další adiční soli sloučenin o vzorci (I) s kyselinami, například soli uvedené v příkladu 6, převedeny na · odpovídající volné zásady.

Příklad 8

V tomto příkladu jsou uvedeny typické farmaceutické směsi, které jako aktivní složku obsahují LH-RH analog podle předmětného vynálezu, například (pyro)Glu-HisTrp-Ser-Tyr- (2-naftyl ] -D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NHz buď jako takový ve formě farmaceuticky přijatelné soli, například ve formě adiční soli s kyselinou octovou, s tanátem zinku, ve formě zinečnaté soli apod.

A. Složení tablet pro bukální (například sublinguální) aplikaci:

1. LH-RH analog lisovatelný cukr, USP stearan vápenatý

50,0 mikoogaamu

96,0 miligramů ,0 milřgramů

2. LH-RH analog 30,0 mikrogaamů lisovatelný cukr, USP 98,5 miligramu stearan horečnatý 5,5milřaramu

3. LH-RH analog mannit, USP stearan horečnatý piOdželatmovaný škrob, USP

4. LH-RH analog laktóza, USP předželatinovaný škrob, USP stearan hořečnatý, USP

25,0 .mikrogramů

88,5 miligramu

1,5 miligramu

1'0',0 miligramů

200,0 mikrogramů '8'3,3 miligramu

15,0 miligramů

1,5 miligramu

Směsi pro bukální aplikaci se připraví následujícím způsobem:

(a) LH-RH analog se rozpustí ,v takovém množství vody, aby se po smísení s cukrem vytvořila vlhká zrnitá směs. Po skončeném míšení se směs vysuší v lískové nebo fluidní sušárně. Suchá zrna se potom prosejí, aby se rozrušily jakékoliv větší shluky a smísí se' se zbylými složkami. Zrnitá směs se potom lisuje na běžném tabletizačním stroji <na určitou hmotnost tablety.

(b) Při tomto způsobu výroby obsahují všechna složení 0,01% želatiny, USP. Želatina se nejprve rozpustí ve vodném rozpouštědle a potom se rozpustí LH-RH analog. Další postup je shodný jako v (a) výše.

Směs 4 může být použita též jako tableta pro orální podávání.

B. Složení pro dlouho působící nitrosvalové injektování.

1. Dlouho působící nl^^csv^a^l^^v^é injekce-gel se sezamovým olejem

LH-RH analog 1,0 miligramu monostearan hlinitý, USP 20,0 miligramů seznamový olej l,0mililtrru

Monostea-ran hlinitý se smísí se sezamovým olejem a zahřívá se při míchání na · teplotě 125 °C tak dlouho, až se vytvoří jasný žlutý roztok. Tato směs se potom sterilizuje v autoklávu a nechá se zchladnout. Potom se za roztírání přidá asepticky LH-RH analog. Obzvláště výhodnými LH-RH analogy jsou soli s nízkou rozpustností, například soli se zinkem, s tanátem zinku, pamoátové soli a podobně. Tyto soli se vyznačují výjimečně dlouhotrvající účinností.

2. Dlouho působící nir^^x^aov^é tajekce-mikrokapsle z biodegгadrvate'lnéhr polymeru

LH RH analog 1 % kopolymer · 25/75 glykrlid/laktid (vnitřní viskozita 0,5) 99%

Mikrokapsle (0-150 mí) o shora uvedeném složení se suspendují v:

dextróza 5,0 %

CMC, sodná sůl 0,5 % benzylalkohol 0,9 %

Tween 80 0,1 % , voda, čištěná q. s. 100,0·% miligramů mikrokapslí se suspenduje v 1,0 mililitru vehikula.

C. Vodné roztoky ' pro nitrrsvalrvé injektování

LH-RH analog 25 miligramů želatina, bez antigenních .

účinků 5 'miligramů voda pro injekcí q. s. 100 mililitrů

Želatina a LH-RH analog ' se rozpustí ve vodě · pro injekci a zfiltrovaný roztok se potom sterilizuje.

D. Vodný roztok pro .nasální ·aplikaci

LH-RH analog ' dextróza benzylalkohol voda, čištěná q. s.

250 miligramů gramů

0,9 gramu

100 mililitrů

LH-RH-analog, dextróza a benzylalkohol se .rozpustí ve vodě.

E. Složení pro rektální aplikaci

Vehikulum pro čípky pro rektální podávání

LH-RH analog 500 rnikrogramů

Witepsol H15 20,0 gramů

LH-RH analog se smísí s ' roztaveným Witepsolem H15, řádně se promísí a vlije se. do. 2 gramových forem.

P říklad . 9

Potlačení est-ru u . krys

Krysí samice (Hilltop, Sprague Dawley, přibližně 200 gramů, s -otevřenými vagínami) jsou ' skupinově váženy 5/kle-c a 2 klece/skupinu. - Krysám - jsou - dávány injekce (podkožní). dvakrát denně (s výjimkami uvedenými níže) po dobu 14 dní. Denně jsou odebírány vaginální výtěry, aby byl zjištěn stupeň estrálního cyklu a tělesné hmotnosti jsou zaznamenávány v 0, 1 a 2 týdnech. Dále je zaznamenáváno procento samic, které vykazujíčástečné potlačení estru (tj. pouze diestrus - a proestrus, ale žádný estrus) od dne 4 dále a procento samic vykazující kompletní potlačení -est-ru (tj. pouze diestrus) od dne 4 dále.

Hodnoty ED50 se -odvodí z přímkové závislosti - procentuálních údajů potlačení estru. LH-RH - analogy byly podávány ve formě svých acetátových -solí ve fyziologické solance obsahující 0,1 % hovězího albuminu.

I.njektované objemy byly 0,2 mililitru a analog byl přítomen -v množství 0,05, 0,1, 0,2 nebo 0,4 mikrogramu. Kontrolní - látka (fyziologická -solanka obsahující hovězí albumin) nevykazovala žádné potlačení esteru.

Hodnoty EDso pro částečné a úplné potlačení estru jsou následující:

Sloučenina ED50 (ug/inj.) (-pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-

- (2,4,6-trimethylfenyl) -D-alanyl-

-Leu-Arg-Pro-Gly-NH20,08 (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr^-(l-naffyl )-D-alany 1-Leu-Arg-Pro-Gly-NH20,3 (pyro) Glu-His-Tr p-Ser-Tyr-3-

- ( 9-antryl ) -D-alany 1-Leu-

-Arg-Pro-Gly-NH20,27 (pyro) Glu-His-Tr p-Ser-Tyr-3-

- (4-bifenylyl) -D-alanyl-Leu-

-Arg-Pro-Gly-NH20,28a (pyro) Glu-His-Tr p-Ser-Tyr^-

- (2-f luuorf enyl) -D-alanyl-Leu-

Arg-Pro-Gly-NH20,40a (•pyro) Glu-HiStTrptSertTyr-3t 2,2-diienylmethyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NHEt0,11 (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Ty·^-

- (2--4,6--Γίηιθίϊιγ lf enyl) -D-ialanyl-

-N-MeLeutArg-Pro-Gly-NH20,35a (pyro) Gl-u-His-3- (1-naatyl) -L-alanyl-S-er-Tyr-3- (2 -.-nafy l) -D-alanyl-Leu-Arg-Pro-NHEt0,16 a — tyto sloučeniny byly podávány jednou denně.

Sloučenina

ED50 (jUg/inj.)

Příklad 10 (pyro) Glm-His-Trp-Ser-Tyr^-

- (2-naafyl) - D-alanyl-Leu-

-Arg-Pro-Gly-NH20,08 (•pyro) Glu-His-Tr p-Ser-Tyr-3-

- (2--^у1) - D-alany 1-Leu-

-Arg-Pro-NHEt0,22 (pyro) Gl-u-His-Trp-Ser-Tyr^-

- (2-.naítyl) -D-j^lanyl-N-Me-

Leu-Arg-Prn-Gly-NH20,07

Šesti Swiss-Websterovým myším- (Slmonsen-), z nichž každá měla hmotnost přibližně 25 gramů, bylo podkožně injektováno 0,25 mililitrů vodného roztoku (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Ty^- (2-iuatyl) -D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 ve formě acetátové soli. Dávkování bylo 40 -miligramů/kg, nebo přibližně 1 m-iligra.m/myš. Po dobu 21 dní byla u myší dvakrát denně sledována úmrtnost. Nebyly pozorovány žádné -smrtící účinky. Hodnota LDso je tudíž vyšší než 40 miligramů/kg (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Ty^-(2-naftyl )--D-alany1-N-MeLeu-Arg-Pro-NHEt

Claims (2)

1. PŘEDMĚT . · VYNAlEZU

   1. Způsob výroby· nonapeptidových a · dekapeptidových derivátů hormonu, uvolňujícího luteinizační hormon, Obecného vzorce I (pyro) -Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Arg-Pro-Z (Ij v němž

   V znamená tryptofyl, fenylalanyl nebo 3-(l-naftylj-L-alanyl,

   W znamená tyrosyl, fenylalanyl nebo 3- (1-pentaf luorfenyl )-L-alanyl,

   X znamená zbytek D-aminokyse.liny obecného vzorce

   O

   II —NH—CH—C—

   CHz

   I

   R v němž R znamená (a) karbocyklický radikál obsahující aryl vybraný ze skupiny •zahrnující naftyl, anthryl, fluorenyl, fenanthrál, bifenyly!, beinzhydryl a fenyl substituovaný třemi až pěti rovnořetězými alkylovými skupinami s, . · 1 až 4 atomy ' uhlíku, nebo (b) nasycený karbocyklický radikál vybraný ze skupiny zahrnující cyklohexyl substituovaný · třemi až · · pěti rovnořetězými alkylovými skupinami s 1 až 4 atomy uhlíku, perhydronaftyl, perhydrobifenylyl, perhydro-2,2-difenylmethyl a adamantyl,

   Y znamená leucyl, isoleucyl, nor-leucyl nebo N-m-ethylleucyl,

   Z znamená glycinamid nebo skupinu —NH—Rf, v níž

   Ri značí · alkyl s 1 · až 4 atomy uhlíku, . cykloalkyl se 3 až 6 atomy uhlíku, fluoralkyl s , 1 až 4 atomy uhlíku nebo skupinu

   O

   II · —NH—C—NH—R2 v níž R² značí atom vodíku nebo alkyl s 1 až 4 atomy · uhlíku, a jejich farmaceuticky vhodných solí, vyznačující se tím, že se na sloučeninu obecného vzorce II (p.yro) — Glu—His—V—Ser—(I)] (Pi). (!P2)b —W—X—Y—Arg—Z‘— (S )d

   II (P3)cP v němž

   V, W, X a Y mají shora uvedený význam a Z‘ znamená Z, jak je uvedeno shora, nebo giycyi,

   P1, p2, p3 a pi značí postranní řetězce chránících skupin, přičemž

   P1 se volí ze skupiny zahrnující benzyl, p-toluensulfonyl a 2,4-dinitrofenyl, p2 se volí ze skupiny zahrnující benzyl a tetrahydropyranyl,

   P-3 .-se · · volí · ze skupiny zahrnující benzyl, o-brombenzyloxykarbonyl, 2,6-dlchlorbenzyl, isopropyl, cyklohexyl, cyklopentyl . a acetyl, je-li W · tyrosyl, a pi se volí ze skupiny zahrnující nitroskupinu, p-toluensulfonyl, 1-methoxybenzensulfonyl, benzyloxykarbonyl, t-butyloxykarbonyl a adiamantyloxykarbonyl,

   S · · znamená tuhý nosič, složený z kopolymeru · styrenu, popřípadě substituovaného, s malým množstvím · síťovacího činidla, jako je divinylbenzen, o o, b, c · a · d · značí jednotlivě celé číslo· 0 nebo 1, působí činidlem, odstraňujícím chrániči .skupiny vybraným ze skupiny zahrnující · anorganickou nebo organickou kyselinu, fluorovodík, vodík a sodík v kapalném amoniaku, · -při teplotě —10 až +10 · °C a je-li ·· --d · ·rovno 1, působí se · na výslednou sloučeninu · ·· nebo na · sloučeninu obecného vzorce II činidlem rozkládajícím tuhý nosič, vybraným ze · skupiny zahrnující alkylamin s 1 ož 4 atomy uhlíku, · fluoralkyamin s 1 až 4 atomy uhlíku, a amoniak, popřípadě s následujícím působením alkanolem s · 1 až 4 atomy· uhlíku, za vzniku . sloučeniny shora . uvedeného obecného vzorce I nebo · její · soli, a popřípadě sloučenina shora uvedeného · obecného vzorce I se působením organické nebo anorganické kyseliny převede na její farmaceuticky vhodnou sůl, · nebo sůl sloučeniny shora uvedeného· · obecného vzorce I se působením jiné organické nebo anorganické kyseliny převede na farmaceuticky vhodnou adiční . sůl, nebo sůl sloučeniny shora uvedeného obecného vzorce I se působením anorganické báze rozloží na volný polypeptid shora uvedeného obecného vzorce · · I.
2. 2. Způsob podle bodu 1 pro výrobu nonapeptidových a dekapeptidových derivátů hormonu, uvolňujícího luteinizační hormon, shora uvedeného obecného vzorce I, v němž Z znamená glycinamid ·ο ostatní substituenty mají sho-ra uvedený význam, vyznačující se tím, že se k reakci používá sloučeniny shora uvedeného obecného vzorce II, v němž a, b a c se rovnají 0, d je 1, P⁴ je nitroskupina nebo p-toluensulfonyl, Z je glycyl a ostatní substituenty mají shora uvedený význam, jako činidlo odstraňující chránící skupiny se používá fluorovodíku, jako činidlo rozkládající tuhý ' nosič se používá amoniak a postup, při němž še rozkládá tuhý nosič předchází postup, při němž se působí činidlem odstraňujícím chránící skupiny.