DD152542A5 - Verfahren zur herstellung neuer peptide - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Peptide fuer die Anwendung als Arzneimittel, beispielsweise zur Behandlung von Unfruchtbarkeit und anderen hormonellen Stoerungen. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von neuen Peptiden mit hoeherer biologischer Aktivitaet. Erfindungsgemaess werden Verbindungen der Formel (I) sowie ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze hergestellt. (pyro)Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Arg-Pro-Z. Hierin bedeuten beispielsweise: V Tryptophyl, Phenylalanyl u.a.; W Tyrosyl, Phenylalanyl u.a.; X ein D-Aminosaeurerest in welchem R fuer (a) einen carbocyclischen arylhaltigen Rest aus der Gruppe von Naphthyl, Anthryl u.a. oder (b) einen gesaettigten carbocyclischen Rest aus der Gruppe von Cyclohexyl, der mit 3 oder mehreren geradkettigen niedrigen Alkylgruppen substituiert ist, u.a. steht; Y Leucyl, Isoleucyl u.a.; Z Glycinamid oder -NH-R&exp1!, wobei R&exp1! niedrig Alkyl, Cycloalkyl u.a.

Description

Berlin, den 12,11,1980

AP C 07 C/221 687 1 6 8 7 ~^Λ~ ⁵⁷ 650/11

Vßrfahron zur" Herstellung neuer Peptide

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Nonapeptid- und Decapeptidderivate von LH-RH₅ die in 6-Stellung bestimmte lipophile D-Aminosäuren aufweisen«, Die vorliegende Erfindung richtet sich auch auf verschiedene Verfahren zur Verwendung dieser Verbindungen und auf ihre pharmazeutischen Präparate* Weiter betrifft die vorliegende Erfindung Ver~ fahren zur Herstellung der obigen neuen Verbindungen und äer in diesen Verfahren geeigneten Zwischenprodukte*

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Das Luteinisierungshormon (LH) und Follikelstimulierungshormon (FSH) werden aus dem Hypophysenvorderlappen unter Kontrolle des im Hypothalamusbereieh gebildeten Frei« setzungshortnons LH~RH freigesetzt« LH und FSH wirken auf die Gonaden unter Stimulierung der Synthese von Steroid» hormonen und Stimulierung der Gametenreifung«, Die zyklische Freisetzung von LH-RH und dadurch die Freisetzung von LH und FSH regelt den reproduktiven Zyklus bei Haustieren und Menschen« Weiter beeinflußt LH~RH auch die Plazenta durch Freisetzung von HCG und wirkt direkt auf die Gonaden, Agonistenanaloge von LH-RH sind auch durch zwei Wirkungs~ mechanismen zur Fruchtbarkeitskontrolle geeignet. Niedrige Dosen von LH-RH Analogen können die Ovulation stimulieren und eignen sich zur "Behandlung hypothalamischer und ovüla« torischer Unfruchtbarkeit« Weiter können sie bei hypo·» gonadalen Erkrankungen und Impotenz verwendet werden, und

O Π ·?.! Π U ·! Q O Π /. Oil O rr ¹J Γ\

.12,11*1980

• AP C 07 C/221 687 .

2 16 8 7.. _m 2 _m· ' 57 650/11

sie stimulieren die Spermatogenese und Androgenproduktion beim Mann« Paradoxerweise haben größere Dosen der äußerst wirksamen und langanhaltenden Analogen von LH-RH die ent« gsgerigesetzte Wirkung und blockieren die Ovulation bei der Frau und unterdrücken die Spermatogenese beim Mann* Verwandt mit diesen Wirkungen ist eine Unterdrückung der normal zirkulierenden Konzentrationen von Sexualsteroiden gonadalen Ursprungs einschließlich einer Verringerung des Gewichts der männlichen und weiblichen Anhangsorgane,. Bei Haustieren begünstigt diese paradoxe Wirkung eine Gewichtserhöhung bei gleichbleibender geregelter Fütterung und stimuliert die Abortion bei tragenden Tieren und wirkt allgemein als chemisches Sterilisationsmittel»

Das natürliche hormonfreisetzende Hormon LH-RH ("natural hormone releasing hormone") ist ein Decapeptid aus natür« lieh vorkommenden Aminosäuren (die mit Ausnahme der achira« len Aminosäure Glycin die L-Konfiguration haben). Seine Folge ist so; (pyro) Glu«-His«°Trp-Ser~Tyr-Gly~Leu-Arg~Pro-GIy-NH₂, Viele Analoge dieses natürlichen Materials sind ' untersucht worden» und ihre große Vielzahl hat eine zu unzureichende biologische Wirksamkeit gezeigt, um klinisch geeignet zu

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sein. Ganz bestimmte Modifikationen haben eine, günstige Wirkung auf die biologische Aktivität gezeigt. Die bei weitem bedeutendste Modifikation erhält man, wenn man den Rest in ö^SteMung von GIy in eine D-^Aminosäure verändert. Wird z.B. der GIy Rest in 6-Stellung durch D-AIa, D-Leu, D-Phe oder D-Trp ersetzt, so erhält man eine Reihe von Analogen des LH-RH mit einer im Verhältnis zu LH-RH erhöhten Aktivität (vgl. Monah£2i, Biochem., 1_2, 4616 (1973) für /ß-AIa₁J-LHRH; Vilchez-Martinez, Biochem. Biophys.Res.Comm., j>2, 1226 (1974) für /D-LeU⁶JLHRH und desGly¹⁰/D-Leu⁶, Pro NHEt⁹JUmE; Coy, J.Med.Chem., 1j5, 423 (1976) für /Ö-Phe J⁷LHRH; und Vale, Clinical Endocrinology, 5.Ergänz., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England (1976)„ Seite 2615> und Coy, Biochem.Biophys.Res.Comm., 62, 576, (1979) für /D-TrpVLHRH.

Neben der wesentlichen Aktivitätserhöhung durch den obigen Austausch in 6-Stellung kann man weitere Aktivitätserhöhungen durch Eliminieren der GIy-NH₂ ⁱⁿ 10-Stellung unter Bildung eines Nonapeptids als Alkyl-, Cycloalkyl- oder Fluorälkylamid oder durch Austausch von GIy-NHp durch ein ft-Azaglycinamid erreichen. (Vgl. z.B. Fujino, Biochem.Biophys. Res. Comm. , 49, 863 (1972), Coy, Biochem. ,14, 1848

(1975) und Dutta, J.Chem.Soc.Perkin I, 12Z2* 379.)

Der Austausch von N-Methyl-leucin für den Leucinrest in 7~Stellung führt zu erhöhter Stabilität gegen enzymatischen Abbau (vgl. z.B. Ling, Biochem.Biophys.Res.Comm. _f 6^,,801 so (1975)).

Der Austausch des Tryptophanrestes in 3-Steilung durch 3-(1-Naphthyl)-L-alanin führt zu erhöhter biologischer Wirksamkeit (vgl. Prasad, J.Med.Chem. _f Ij?, 492 (1976)„und Yabe, Chem.Pharm.Bull., 24 (12), 3149 (1976).

Der Tyrosinrest in 5-Stellung kann durch Phenylalanin oder 3«*(l~Pentafluorphenylj^L^alanin ersetzt werden, wobei die wesentliche biologische Aktivität erhalten bleibt (vgl* 2β B* Yänaihara» Biochem, Biophys» Res. Comm*, 52, 64 (1973), und Coy, D* Med«, Chenu, 16, 877 (1973))·

der Erfindung

Ziel aer Erfindung ist die Bereitstellung weiterer Analoge des LH-RH mit noch höherer biologischer Aktivität als bisher beschrieben, die klinisch bei Mensch und Tier verwendet werden könnten.

Pari e g un,c] d es We sens d eτ*J=£_f i η d un g

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Analoge des LH-RH mit höherer biologischer Aktivität aufzufinden und Verfahren zu deren Herstellung zu entwickeln«

Erfindungsgemäß wurden neue Nonapeptid« und Decapeptidderivate von LH-RH aufgefunden* Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf Derivate von LH«RH, die in 6~Stellung bestimmte unnatürliche D-Aminosäurereste aufweisen, die lipophile carbocyclische Reste, insbesondere Reste mit 2 oder mehreren carbocyclischen Aryl« oder Perhydroarylringen oder einen hoch alkylsubstituierten Phenyl- oder Cyclohexylring enthalten«

Die erfindungsgeraäßen Verbindungen sind insbesondere Nonapeptide und Decapeptide öer Formel

(pyro)Glu~His»V-Ser~W~X~Y-Arg~Pro-Z

und ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze, in welcher

V für TryptGphyl* Phenylalanyl oder 3-(1-Naphthyl)~L.~alanyl

steht; W Tyrosyli Phenylalanyl oder 3™(l~PentafluQrphenyl}~L·-

älanyl bedeutet; . .

X ein D-Aminosäureros.t

221687_O - 5 -

-NH-CH-C-CH₉

-is, - I^

* J R

in welchem R für

(a) einen carbocyclischen, arylhaltigen Rest aus der Gruppe von Naphthyl, Arithryl, Fluorenyl, Phenanthryl, Biphenylyl, Benzhydryl und Phenyl, die mit 3 oder mehreren geradekettigen niedrigen Alkylgruppen substituiert sein kann, oder

(b) einen gesättigten carbocyclischen Rest aus der Gruppe von mit 3 oder mehreren, geradekettigen niedrigen Alkylgruppen substituiertem Cyclohexyl, Perhydronaphthyl, Perhydrobiphenylyl, Perhydro-2,2-dipheny!methyl und * Adamantyl steht; , '

Y bedeutet Leucyl, Isoleucyl, nor-Leucyl oder N-Methyl~ leucyl; Z ist Glycinamid oder -InTH-R wobei

R niedrig Alkyl, Cycloalkyl, Fluor-niedrig-alkyl

O 2

oder „ « bedeutet, und wobei R für

"-NH-C-NH-R^ Wasserstoff oder niedrig Alkyl steht.

Wie oben gezeigt und der Einfachheit halber werden für die verschiedenen üblichen Aminosäuren die in der Peptidtechnik üblichen Abkürzungen (empfohlen von der IUPAC-IUB Commission! on Biochemical Nomenclature, Bioehem., JM,, 1726 (1972) verwendet und bedeuten L-Aminosäuren mit Ausnahme d,er achiralen Aminosäure Glycin sowie mit Ausnahme der durch X dargestell ten Aminosäuren in 6-Stellung, Alle hier genannten Peptidsequenzen werden in üblicher Weise geschrieben, bei der die N-endständige Aminosäure sich auf der linken Seite und dyLe C-ends.Jändige Aminosäure auf der rechten Seite befindet.!

2 2 16 8 7.6.

Die hier verwendete Bezeichnung "pharmazeutisch annehmbare Salze" bezieht sich auf Salze, die die gewünschte biologisch Aktivität der Grundverbindung bewahren und keinerlei uner-

5- wünschte toxikologische. Wirkung ausüben, Solche Salze sind z.B. (a) mit anorganischen Säuren gebildete Säure-Additionssalze, z.B. Salze der Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure usw.; und mit organischen Säuren gebildete Salze, z.B. Salze der Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäu-

• re, Gluconsäure, Zitronensäure, Apfelsäure, Ascorbinsäure, Benzoesäure, Gerbsäure, Pamoasäure, Alginsäure, Polyglutamin· säure, Naphthalinsulf ons äur^Qj Naphthal indi sulfonsäuren, Poly4· galacturonsäure; (b) Salze mit mehrwertigen Metallkationen, wie Zink, Calcium? Wismut, Barium, Magnesium, Aluminium, Kupfer, Kobalt, Nickel , Cadmium usw.; oder mit einem aus Ν,Ν'-Dibenzyläthylendiamin oder Äthylendiamin gebildeten, organischen Kation; oder (c) Kombinationen aus (a) und (b), wie z.B. ein Zinktannatsaiz usw.

Die hier verwendete Bezeichung "niedrig Alkyl" bezieht sich auf eine gerade oder verzweigtkettige, gesättigte Kohlenwasserstoff gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Äthyl, n-Propyl, Isopropyl, η-Butyl, Isobutyl, sek.-Butyl und tert.-Butyl; die Bezeichung "Cycioalkylgruppe" bezieht sich auf eine cyclische gesättigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Cyclopropyl, Cyclobut}'!, Cyclopentyl und Cyclohexyl; die Bezeichung "Fluor-niedrigalkyl" bezieht sich auf eine niedrige Alkylgruppe, in weleher ein oder mehrere Wasserstoffatome durch Fluor ersetzt sind, wie z.B. Trifluor-methyl, Pentafluoräthyl, 2,2,2-Trifluoräthyl usw.

,.Die.hier verwendete Bezeichnung "Naphthyl" umfaßt 1-und 2-Naphthyl; "Anthryl" umfaßt 1-, 2- und 9-Anthryl; p*luorenyl" umfaßt 2-, 3-* 4- und 9-Fluorenyl; "Phenanthryl" umfaßt 2-, 3- und 9-Phenanthryl; und Adamantyl" umfaßt 1- und 2-Adamantyl.

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Bevorzugt werden solche erfindungsgemäßen Verbindungen, in welchen X für 3-(2-Naphthyl)-D-alanyl oder 3-(2,4,6-trimethylphenyl)-D-alanyl steht, Z Glycinamid oder -NHEt ist, 5. V^für Tryp^ophyl oder Phenylalanyl steht, W Tyrosyl und Y Leuyl oder N-Methyl-leucyl bedeuten. Besonders bevorzugte Verbindungen sind:

(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-

Leu-Arg-Pro-Gly-NH2,

(pyro) Glu~His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-N-methyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂,

(pyro)Glu-His-Phe-Ser-Tyr-S-(2-naphthyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Prc-Gly-NH2,

(pyro) Glu-His-Trp~Ser-Tyr-3-(2,4,6-trirnethylphenyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂,

(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl~ Leu-Arg-Pro-NHEt, ·:-

(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-S-(2-naphthyl)-D-alanyl-M-methyl-Leu-Arg-Pro-NHEt; und deren pharmazeutisch annehmbare Salze.

Besonders wird (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-lffiLp und seine Salze.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen, insbesondere ihre Salze, zeigen eine überraschend starke, langanhaltende LH-RH Agoni stenaktivität im Vergleich zu den bisher wirksamsten LH-RH Agonisten, nämlich (pyro)GIu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Ser-Arg-Pro-Gly-NHp und dessen entsprechendes Prolyläthylamid. ,,.

Ein primäres Maß für die Wirksamkeit ist die Fähigkeit zur teilweisen oder vollständigen Östrussuppression bei erwachsenen weiblichen Ratten mit normalem Zyklus ( bestimmt über eine Dauer von 2 Wochen) durch zweimalige tägliche subkutane Injektion.

Weitere, für LH-RH Analoge und auch für die erfindungsgemäßen Verbindungen angewendeten Biobestimmungen umfassen:

16 8 7-8 - . . .

(a) Ovulätionsinduktion bei weiblichen Ratten mit Diös.trus oder Proöstrus durch subkutane Injektion (Rippel, Proc.Soc. Exp.Biol.Med., .148, 1193 (1975)),

(b) LH und FSH Freisetzung durch dispergierte Zellkulturen der vorderen Hypophyse, geraessen durch Radioimmunbestimmung (Vale, Endocrinology, £1, 562 (1972)) und (c) LH und FSH Freisetzung in die periphere Zirkulation ovariektomisierter, steroidbehandelter Platten als Ansprechen auf eine intravenöse Injektion, gemessen durch Radioimmunbestimmung (Arimura, Endocrinology, 90, 163 (1972)).

In fortschrittlicherer Weise kann die Aktivität dieser Verbindungen in vivo durch Senkung der Spermatogenese und der is zirkulierenden und testikulären Konzentrationen von TestOrsteron sowie durch eine dramatische Verringerung der Prostat? größe bei Hunden, die an gutartiger Prostatahypertrophie leiden, nachgewiesen werden.

Daher können die obigen Verbindungen in vielen Fällen verwendet v/erden, wo eine Kontrolle von LH und FSH oder die direkte gonadale Wirkung von Bedeutung sind, wie z.B.: Physiologische Verwendungen (Wirkungen niedriger Dosen) Ovulationsinduktion bei anovulatorischer Unfruchtbarkeit und zur zeitgesteuerten Ovulation bei weiblichen Säugetieren Therapie bei Unfruchtbarkeit aufgrund unzureichender Lutealfunktion bei Frauen;

Therapie bei hypogonadotropher oder hypogonadaler Unfruchtbarkeit bei beiden Geschlechtern

Therapie bei cystischem Ovarien/Nymphomanie-Syndrom bei Rindern.(Haustieren)

Indu-ktion oder Verstärkung des Sexualverhaltens oder Therapie bei Impotenz/Frigidität.

Paradoxe Verwendungen (Wirkungen hoher Dosen) weibliche Kontrazeption

Ovulationssuppression oder -verzögerung Einleitung der Wehen Synchronisation der Ovulation

22 1 6ffT; _g L

Östrussuppression (Unterdrückung der Brunft) - Wachstumbeschleunigung bei weiblichen Tieren Luteolyse, Mensesinduktion *5 Abtreibungsmittel im ersten Trimenen ^f Therapie bei Endometriose

Therapie bei Mammatumoren und -zysten ., Therapie bei polycystischem Ovariensyndrom (Stein-Leventhal) Therapie bei Uteruscarcinom Therapie bei gutartiger Prostatahypertrophie und Prostatacarcinom

männliche Kontrazeption

Therapie bei Erkrankungen aufgrund einer exzessiven Gonadalhormonproduktion bei beiden Geschlechtern; funktionale Kastration bei männlichen Nutztieren; Suppression des Proöstrusaustoßes.

Vielter zeigen diese sowie die bekannten LH-RH Verbindungen eine überraschende neue Eignung als Abort-einleitende Mittel, offenbar durch Inhibierung der zirkulierenden HCG Konzentrationen und durch direkte Wirkung auf die Placenta. Die

.,, placentale Wirkung könnte auch eine Eignung gegen Choriocarcimon nahelegen.

In einem weiteren Merkmal bezieht sich die vorliegende Erfindung auf besondere Verwendungen derjobigen Verbindungen (einschließlich von Verwendungen, die bisher für LH-RH Analoge nicht beschrieben worden sind), nämlich zur Ovulations- inhibierung (d.h. Kontrazeption) bei Frauen, bei der Behandlung von Endometriose, bei der Behandlung von gutartiger -Prostatahypertrophie und bei der Inhibierung der Spermatogenese (d.h. Kontrazeption) beim Mann. Somit richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Ovulationsinhibierung, Endometriosenbehandlung, Verringerung der _s Prostatagröße oder.Inhiberung der Spermatogenese bei Mensch und Tier, der bzw. das. eine solche Behandlung benötigt oder wünscht; die Behandlung besteht in der Verabreichung einer

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wirksamen Menge einer oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Verbindung oder eines diese enthaltenden, pharmazeutischen Präparates.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird eine v/irksame Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung oder eines dieselbe enthaltenden pharmazeutischen Präparates dem Patienten verabreicht., der eine solche Behandlung braucht oder wünscht

to Diese Verbindungen oder Präparate können auf verschiedene Weise verabreicht werden, die von ihrer spezifischen Endverwendung abhängt, z.B. oral, parenteral (einschließlich subkutan, intramuskulär und intravenös), vaginal (insbesondere zur Kontrazeption), rektal, buccal (einschließlich sublingual) oder intranasal. Die in einem gegebenen Fall zweckmäßigste Verabreichungsweise hängt vom Zweck, dem besonderen aktiven Bestandteil, dem Patienten und dem Urteil des Mediziners ab. Die Verbindung oder das Präparat kann auch mittels langsam freisetzender, Depot- oder Implantatformulierungen verabreicht werden, wie im folgenden noch genauer beschrieben v/ird.

Für die oben beschriebenen Zwecke, bei denen sich um die "paradoxe" oder hoch-doslerte Verwendung handelt, ist es zweckmäßig, den aktiven Bestandteil in Mengen zwischen etwa 0,01 und 100 /ug/kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise zwischen etwa 0,1 und 5,0 /Ug/kg Körpergewicht pro Tag, zu verabreichen. Diese Verabreichung kann durch eine einzige Tagedosis, über einige Mal verteilt oder durch Depotforinulierung erfolgen.., um die günstigsten Ergebnisse zu erzielen.

Die genaue Dosis und Verabreichungsweise dieser Verbindungen und Präparate hängt selbstverständlich von den Bedürfnissen des jeweiligen behandelten Patienten, der Art der Behändlung, dem Ausmaß des zu behandelnden Zustandes und auch dem Urteil des Mediziners ab. Gewöhnlich erfordert die parenterale Verabreichung niedrigere Dosen als andere

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Verabreichungsweisen, die stärker von der Absorption abhängen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden gut toleriert und sind relativ nicht-toxisch. Repräsentative Verbindungen zeigen bei subkutaner Verabreichung an Mäuse LDc₀ Werte erheblich über 40 mg/kg, was ein sehr großer Sicherheitsfaktor im Vergleich zu den oben genannten, therapeutischen Dosen ist.

Außerdem bezieht sich die vorliegende Erfindung auf pharmazeutische Präparate, die als aktiven Bestandteil eine erfindungsgemäße Verbindung enthalten und dieselbe in Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen Träger umfassen. Wie oben erwähnt, können diese Präparate zur parenteralen (subkutanen, intramuskulären oder intravenösen) Verabreichung insbesondere in Form von flüssigen Lösungen oder Suspensionen, zur Verwendung bei vaginaler oder rektaler Verabreichung insbesondere in halbfester Form, z.B. als Cremes oder Suppositorien; zur oralen oder buccalen Ver-.. abreichung insbesondere in Form von Tabletten oder Kapseln oder zur intranasalen Verabreichung insbesondere in Form von Pulvern, Nasentropfen oder' Aerosolen hergestellt werden..

Die Präparate werden zweckmäßig in Einzeldosisform verabreicht und können in bekannter Weise, z.B. gemäß Remington's! Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Comp., Eastori, Pa., 1970, hergestellt werden. Formulierungen zur parenteralen Verabreichung können als übliche Streckmittel steriles Wasser oder Kochsalzlösung, Polyalkylenglykole, wie Poly- j äthylenglykol, Öle pflanzlichen Ursprungs, hydrierte Naph~ thaline usw., enthalten, Formulierungen zur vaginalen oder rektalen Verabreichung, „z.B. Suppositorien, können als Streckmittel u.a. Polyalkylenglykole, Vaseline, Kakaobutter USW* enthalten. Formulierungen.zur Inhalation können fest sein und als Streckmittel z.B. Lactose enthalten, oder wässrige oder ölige Lösungen zur Verabreichung als Nasen-

T21.6"T7 - 12 :- =

tropfen sein. Zur buccalen Verabreichung umfassen die typischen Streckmittel Zucker, Calciumstearat, Magnesiumstearat, vorgelierte Stärke usw.

Es ist besonders zweckmäßig, die erfindungsgemäßen Verbindungen dem Patienten über längere Zeit, z.B. von einer Woche bis zu einem Jahr» aus einer einzigen Verabreichung zu geben, wozu langsam freisetzende, Depot- oder Implantatformulierungen geeignet sind. Eine Dosierungsform kann z.B. ein pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxisches Salz der Verbindung mit geringer Löslichkeit in den Körperflüssigkeiten enthalten, z.B. (a) ein Säure-Additionssalz mit einer mehrbasischen Säure, wie Phosphorsäure, Schwefelsäure, Zitronensäure", Weinsäure, Gerbsäure, Pamoasäure, Alginsäure, Polyglutaminsäure, Naphthalinmono- oder -disulfonsäuren_? Polygalacturonsäure usw.; (b) ein Salz mit einem mehrwertigen Metallkation, wie Zink, Calcium, Wismut, Barium, Magnesium, Aluminium, Kupfer, Kobalt, Nickel, Cadmium usw*, oder mit einem organischen, z.B. aus Ν,Ν'-Dibenzyläthylendiamin oder Äthylendiamin gebildeten Kationj: oder (c) Kombinationen aus (a) und (b), wie ein Zinktannatsalz. Weiter können die erfindungsgemäßen Verbindungen oder vorzugsweise ihre relativ unlöslichen,- oben erwähnten Salze zu einem Gel, z.B. einem Aluminiummonostearatgel, z.B. mit Sesamöl, formuliert werden, das zur Injektion geeignet ist. Besonders bevorzugte Salze sind Zinksalze, Zinktannatsalze, Pamoatsalze usw. Eine andere Art von Depotformulierung zur Injektion kann die Verbindung oder das Salz in einem sich langsam abbauenden, nicht-toxischen, nicht-antigenen Polymeren, z.B. einem Polymilchsäure/Polyglykolsäure-polymeren dispergiert oder eingekapselt enthalten (vgl. die US PS 3 773 919). Die Verbindungen oder vorzugsweise die relativ unlöslichen, oben beschriebenen Salze können auch zu silastischen Tabletten in einer Cholesterinmatrix formuliert werden, insbesondere zur Verwendung bei Tieren. Weitere langsam freisetzende, Depot- oder Implantatformulierungen,. z.B. Liposome, sind in der Literatur bekannt; vgl. z.B. "Sustained

and Controlled Release Drug Delivery Systems", J.R. Robinson ed., Marcel Dekker Inc., New York, 1978. Besondere Hinweise, bezüglich LH-RH-artiger Verbindungen finden sich .5. z.B.^in der ,US-PS 4 010 125.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in jeder in der Peptidtechnik bekannten Weise hergestellt werden. Eine ausgezeichnete Zusammenfassung der Verfahren findet sich bei Stewart und Young "Solid Phase Peptide Synthesis", V/.H.Freeman Co., San Francisco, 1969, und Meienhofer "Hormonal Proteins and Peptides", Bd. 2, Seite 46, Academic Press New York, 1973, für die Peptidsynthese in fester Phase und bei Schroder und Lubke "The Peptides", Bd. 1, Academic- Press New York, 1965, für die klassische Synthese in Lösung.

Gewöhnlich umfassen diese Verfahren die aufeinanderfolgende Addition einer oder mehrerer Aminosäuren .oder zweckmäßig geschützter Aminosäuren an eine wachsende Peptidkette. Normalerweise ist entweder die Amino- oder Carboxylgruppe der ersten Aminosäure durch eine geeignete, schützende Gruppe geschützt. Die geschützte oder derivatisierte Aminosäure kann entweder~"an einen inerten festen Träger gebunden sein oder in Lösung verwendet werden, indem man die nächste Aminosäure in der Sequenz mit zweckmäßig geschützter, komplementärer (Amino- oder Carboxyl)-gruppe unter den zur Bildung der Amidbind.ung geeigneten Bedingungen addiert. Dann wird die schützende Gruppe von diesem neu addierten Aminosäurerest entfernt und die nächste (zweckmäßig geschützte) Aminosäure wird addiert und so weitejr Wenn alle gewünschten Aminosäuren in der richtigen Sequenz gebunden sind, werden irgendwelche verbleibenden, schützen-_# den Gruppen (oder der feste Träger) sequentiell oder gleichzeitig zur Bildung des endgültigen Polypeptids entfernt. Durch einfache Modifikation dieses allgemeinen Verfahrens kann man mehr als eine Aminosäure auf. einmal an eine wachsende Kette addieren, z.B. indem man (unter

22 1.687 . 14 -

Bedingungen, die die chiralen Zentren nicht racemisieren) ein geschütztes Tripeptid mit einem entsprechend geschützten Dipeptid unter Bildung (nach Entfernung der schützenden Gruppen) eines Pentapeptids kuppelt. -

Ein besonders bevorzugten Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen ist die Peptidsynthese in fester Phase.

.

Bei diesem besonders bevorzugten Verfahren wird die p(-Aminofunktion der Aminosäuren durch eine säuren- oder basenempfindliche Gruppe geschützt; solche Gruppen sollten gegen Bedingungen bei der Bildung der Peptidbindung stabil sein, während sie ohne Zerstörung der wachsenden Peptidkette oder Racemisierung irgendwelcher chiralen, darin enthaltenen Zentren leicht entfernbar sein sollten. Geeignete schützende Gruppen sind tert.-Butyloxycarbonyl (Boc), Benzyloxycarbonyl (Cbz), Biphenylisopropyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, </,^-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, o-Nitrophenylsulfenyl, 2-Cyan-tert,-butyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl usw., insbesondere tert.-Butyloxycarbonyl (Boc).

Besonders bevorzugte, schützende Seitenkettengruppen sind für Arginin: Nitro, p-Toluolsulfonyl, 4-Methoxybenzolsulfonyl, Cbz, Boc und Adamantyloxycarbonyl; für Tyrosin: Benzyl, o-Brombenzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyl, Isopropyl, Cyclohexyl, Cyclopentyl und Acetyl; für Serin:

Benzyl und Tetrahydropyranyl; für Histidin: Benzyl, p-Toluol sulfonyl und 2,4-Dinitrophenyl.

Die C-endständige Aminosäure ist an einen geeigneten festen Träger gebunden. Für die obige Synthese, geeignete feste Träger sind gegen Reaktionsteilnehmer und -bedingungen der stufenweisen Kondensations-Deprotektions-Reaktionen inert und in den verwendeten Medien unlöslich; geeignet sind z.B. Chlorine thy ipolystyrol/Divinylbe.nzol»Polymere, Hydroxy-

methyl/Polystyrol/DivinyTbenzol-Polymere usw, insbesondere Chlormethyl/Polystyrol/1 % Divinylbenzol-Polymere. Wenn die C-endständige Gruppe der Verbindung GIycinamid ist, ist ein besonders zweckmäßiger Träger das·*' Benzhydrylamino/ Polystyrol/Divinylbenzol-Polymere gemäß HeXv.Chim.Acta, j§4, 2772 (1971). Die Bindung an das Chlormethyl/Polystyrol/

ftf

Divinylbenzol-Harz erfolgt durch Reaktion der N -geschütz- ten Amiriosäure, insbesondere der Boc-Aminosäure, als deren Cäsium-, Tetramethy!ammonium-, Triäthylammonium-, 4,5-Dia.zabicyclo/B.A.Ö/undec-S-en- oder ähnliches Salz in Äthanol, Acetonitril, Ν,Ν-Dimethylformamid (DI-IF) usw., besonders das Cäsiumsalz in Dimethylformamid, mit dem Chlorraethylharz bei erhöhter Temperatur, z.B. zwischen etwa 40 und 6O⁰C, vorzugsweise etwa 5O⁰C, für etwa 12 bis 48 Stunden, vorzugsweise etwa 24 Stunden. Die Ν**-Boc-Aminosäure wird'an das Benzhydrylaminharz durch eine etwa 2 bis etwa 24-stündige, vorzugsweise etwa 12-stündige, Kupplung mittels eines NjN'-DicyclohexylcarbodiimidiDDCj/i-Hydroxybenzotriazols .

(HBT) bei einer Temperatur zwischen etwa 10*und 50⁰C, vorzugsweise etwa 25⁰C, in einem Lösungsmittel, wie Dichlormethan oder Dimethylsulfoxid, vorzugsweise Dichlormethan, gebunden. Die Kupplung der nachfolgenden, geschützten Aminosäuren kann in bekannter'Yeise in einem automatischen Polypeptidsynthesizer durchgeführt werden. Die Entfernung der N^-schützenden Gruppe kann z.B. in Anwesenheit einer Lösung aus Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, Chlorwasserstoff in Dioxan, Chlorwasserstoff in Essigsäure oder eine andere starke Säurelösung, vorzugsweise 50-^ige Trifluoressigsäure in Dichlormethan, etwa bei Zimmertemperatur erfolgen. Jede geschützte Aminosäure wird vorzugsweise in etwa 2,5 molarem Überschuß eingeführt, und die Kupplung kann in Dichlormethan, Dichlormethan/DiyiF-Mischungen, DMF usw., insbesondere in Methylenchlorid, bei etwa Zimmertemperatur

_or erfolgen. Das Kupplungsmittel ist normalerweise DCC in

Dichlormethan, man kann aber auch'N^'-Diisopropylcarbodiimiä oder ein anderes Carbodiimid allein oder in Anwesenheit von

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HBT, N-Hydroxysuccinirnid, anderen N-Hydroxyimiden oder Oximen, verwenden. Oder es können aktive» geschützte Aminosäureester (z.B. p-Nitrophenyl, Fentafluorphenyl usw.)ooder symmetrische Anhydride.verwendet werden.

Am Ende der Synthese in fester Phase wird das völlig geschützte Polypeptid vom Harz entfernt. Ist die Bindung an den Harzträger eine Benzylesterbindung, dann erfolgt die Abspaltung mittels Aminolyse mit einem Alkylamin oder Fluoralkylamin für Peptide mit C-endständiger Prolingruppe oder durch Aminolyse z.B. mit Ammoniak/Methanol oder Ammoniak/Äthanol für Peptide mit C-endständiger Glycingruppe bei einer Temperatur zwischen etwa 10 und 50° C, Vorzugs- ·

s weise etwa 25⁰C, für'etwa 12 bis 24 Stunden, vorzugsweise etwa 18 Stunden. Das Peptid kann vom" Harz auch durch Umesterung, z.B. mit Methanol, und anschließende Aminolyse entfernt werden. An diesem Punkt kann das geschützte Peptid durch Chromatographie mit Kieselsäuregel gereinigt werden.

Die Entfernung der schützenden (Seitenketten)gruppen vom Polypeptid erfolgt durch Behandlung des Aminolyseproduktes* z.B. mit wasserfreiem flüssigem Fluorwasserstoff in Anweseni heit von Anisol oder einem Carboniumabtrennraittel, Behandlung mit einem Fluorwasserstoff/Pyridin-Komplex, Behandlung mit Tris-(trifluoracetyl)-bor und Trifluoressigsäure, durch Reduktion mit Wasserstoff und Palladium-auf-Kohle oder Polyvinylpyrrolidon oder durch Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak, vorzugsweise mit flüssigem Fluor-• wasserstoff, und Anisol bei einer Temperatur zwischen etwa -10 und +1O⁰C, vorzugsweise etwa O⁰C, für etwa 15 Minuten bis 1 Stunde, vorzugsweise etwa 30 Minuten. Bei Peptiden mit endständiger Glycingruppe auf Benz-hydrylaminharzen kann die Harzabspaltung und Deprotektion zu einer einzigen ' 'Stufe unter Verwendung von flüssigem Fluorwasserstoff und Anisol wie oben kombiniert werden. Dann wird das von schützenden Gruppen vollständig befreite Polypeptid durch einige oder alle der folgenden chromatographischen Stufen gereinigt: Ionenaustausch auf einem schwach basischen Harz

2 "S

^ in Acetatform; hydrophobe Adoorptionschromatographie auf underiviertem PoJ-ystyrol-Divinylbenzol (z.B. Amberlite>r^ XAD); AdsorptionsChromatographie auf Kieselsäuregel; IonenauStauschchromatographie auf Carboxymethylcellulose j Teilungschromatographie, z.B. auf Sephadex^G-25, oder Gegenstromverteilung; hochqualifizierte Flüssigkeitschromatographie (HPLC = high performance liquid chromatography), insbesondere Umkehrphasen-HPLC auf einer Kolonnenfüllung mit an Octyl- oder Octadeylsilyl-Kieselsäur gebundener Phase.

Wird eine racemische Aminosäure in 6-Stellung verwendet, dann werden die diastereomeren Nonapeptid- oder Decapeptid-¹S endprodukte getrennt, und das gewünschte, eine D-Aminosäure in 6-Stellung enthaltende Peptid wird, vorzugsweise während des oben beschriebenen chromatographischen Verfahrens, isoliert und gereinigt.

Die Herstellung von Peptiden mit C-endständigen Azaglycinamiden erfolgt vorzugsweise durch klassische Peptidlösungs- -, synthese unter Verwendung bekannter Peptidzwischenprodukte, wie dies in Beispiel 3 näher erläutert wird.

In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich daher die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren £ur Herstellung von Verbindungen der Formel:

(pyro)Glu-His-V-Ser-W-X-y-Arg-Pro-Z (I)

und ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze, in welchen V für Tryptophyl,· Phenylalanyl oder 3-(1-Naphthyl)-L-alanyl ateht

W Tyrosyl, Phenylalanyl oder 3-(1-Pentafluorphenyl)-L-alanyl bedeutet;

X ein D-Aminosäurerest ., 0 _ ' -NH-CH-C- · '

CH_Q

12,11,1980 AP C 07 C/221 687 221687. - 18 -· 57 650/11

ist, in welchem R für

(a) einen carbocyclischen arylhaltigen Rest aus der Gruppe von Naphthyl, Anthryl, Fluorenyl, Phenanthryl, Biphenylyl, Benzhydryl und Phenyl,, der mit 3 oder mehreren geradekettigen niedrigen Alkylgruppen substituiert ist, oder

(b) einen gesättigten carbocyclischen Rest aus der Gruppe von Cyclohexyl, der mit 3 oder mehreren geradekettigen niedrigen Alkylgruppen substituiert ist, Perhydronaphthyl, Perhydrobiphenylyl, Perhydro-2,2-»diphenylraethyl und Adamantyl steht;

Y Leucyl, Isoleucyl, nor-Leucyl oder N-Methyl-leucyl ist;

1 1

Z Glycinamid oder -NH-R ist, wobei R für niedrig Alkyl, Cycloalkyl, Fluor-niedrig-alkyl oder μ _P steht*

-NH-C-NH-R

wobei R Wasserstoff oder niedrig Alkyl bedeutet,

das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(i) schützende Gruppen und wahlweise den kovalent gebundenen festen Träger von einem geschützten PoIy-? peptid unter Bildung einer Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes derselben entfernt und wahlweise

(ii) eine Verbindung der Formel (I) in ein pharmazeutisch annehmbares Salz umwandelt oder

(iii) ein Salz einer Verbindung der Formel (I) in ein pharmazeutisch annehmbares Salz umwandelt oder

(iv) ein Salz einer Verbindung der Formel (I) in ein freies Polypeptid der Formel (I) überführt«

In^-einer besonderen Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Verbindungen hergestellt* in welchen V für

Tryptophyl oder Phonylalanyl steht, W Tyrosyl bedeutet, X 3~(2.»Naphthyl)~D-alanyl oder 3-(2,4,6-Trimethylph@nyl)-£- alanyl ist, Y für Leucyl oder N-Methyl-leucyl steht und Z Glycinamid oder -NHEt bedeutet, oder Verbindungen, in welchen X für 3~(2,4,6~Trimethylphenyl)«D-alanyX steht«

Besonders wertvoll sind die folgenden Verbindungen:

(pyro)GluM-Iis-Trp-Ser~Tyr~3-(2-naphthyl)~l>>alanyl->Leu-Arg»Pro-Gly«NH₂ oder dessen pharmazeutisch annehmbare Salze, (pyro JGIu-His~Trp~Ser~Tyr~3-(2-naphthyl)«D-alanyl~N~methyl~ Leu-Arg-Pro-Gly-NH« oder dessen pharmazeutisch annehmbare Salze,

(pyro)Glu-His-Trp»Ser-Tyr-3-(2~naphthyl)-D_t~alanyl-LeM-Arg«* Pro-NHEt oder dessen pharmazeutisch annehmbare Salze,

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr~3«(2-naphthyl}-D_i-.alanyl'»N"methyl-Leu~Arg«Pro«i\!HEt oder dessen pharmazeutisch annehmbare Salze,

(py ro) GIu-Hi s-Phe~Ser- Ty r-3*-(2-naphthyl )»D«alanyl~Leu~

NHg oder dessen-pharmazeutisch annehmbare Salze,

(pyro)Glu~His-Trp-»Ser-Tyr-3-(2,4,6-trimethylph0nyl)-D« alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NHp oder dessen pharmazeutisch annehmbare Salze«

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung„

Versuch A

. f cam » . 111* in HTiTIiHfI

In einen im Ofen getrockneten Kolben, der 0,1 1, abs* Äthanol (aus Magneeiumäthoxid destilliert) enthielt, wurden 1,52 g metallisches Natrium gegeben,, Nach Aufhören der VVaöserstoffentvvlcklung. wurden zur Lösung 10,21 g Äthyl-2-acetamldo-2-cyanacetat und 13.26 g 2-Brommethylnaphthalin

· - ZO-

Ί2Γ2ΤΤΓΒ"7 -

zugefügt. Die Lösung wurde 1 Stunde zum Rückfluß erhitzt und dann abgekühlte Das Äthanol wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in Äthylacetat aufgenommen

zweimal s die organische Schicht wurde/mit je 50 ml Wasser, 50 ml gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde filtriert, das Lösungsmittel wurde bei vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in 100 ml konz. Salzsäure 2 Stunden bei Rückfluß hydrolysiert. .

Die Hydrolysemischung wurde abgekühlt und der Niederschlag des Rohproduktes filtriert. Das Rohprodukt wurde erneut in 0,5 1 heißem Wasser, das 5 ml konz., mit Holzkohle behandelter Salzsäure enthielt, gelöst, und der pH Wert der Lösung wurde mit konz. Ammoniumhydroxid auf 6 eingestellt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und unter Vakuum ge- trocknet und lieferte 11,3 g reines 3-(2-Naphthyl)-D,L-> alanin mit einem F. von 230 bis 232⁰C. .

V/urdm im obigen Verfahren anstelle von 2-Brommethylnaphthalin eine stöchiometrisch äquivalente Menge von 1-Brommethylnaphthalin

9-Brommethylanthrapen, "\

9-Brommethylfluoren

2~Brommethylfluoren

2-Bromrnethylanthracen-

1-Brommethylanthracen

tC-Chlorisodurol .

4~Brommethylbiphenyl "1-Brommethyladamantan

3~Brommethylphenanthren -

1-Chlormethyl-2,4,6-tri-(n-butyl)-benzol und 1-Chlor-methyl-2,3,4»5»6-pentamethylbenzol verwendet, dann erhielt man die folgenden Aminosäuren:

3-(1-Naphthyl)-D,L-alanin; F. 185 bis 187⁰C 3-{9-Anthryl)-D,L_ralanin; F. 29O⁰C (HCl Salz) ,

2 Λ 3-(9- Fluorenyl)-D,L-alanin

3-(2-Fluorenyl)-D,L-alanin; F₀ 264 bis 269°C 3-(2-Anthryl)-D,L-alanin 5t 3-(1-Anthryl)-D,L-alanin

3-(2,4,6-Trimethylphenyl)-D,L-alanin; F. 235 bis 237⁰C 3-(4-Biphenylyl)-D,L-alanin; F. 29O⁰C 3-(1-Adamantyl)-D,L-alanin « 5-(3™Phenanthryl)-D,L-alanin

3-(2,4,6-Tri-(n-butyl)-phenyl)-D,L~alanin und 3-(2,3»4,516-Pentamethylphenyl)-D,L-alanin. Versuch B

Eine Lösung aus 18,2 g 1,1-Diphenyläthylen, 25»3 g Methylo(—methoxy-N-benzyloxycarbonylglyci.nat und 1,5 g 2-Naph- thalinsulfonsäure in 300 ml trockenem Benzol wurden 2 Tage zum Rückfluß erhitzt. Das Rohprodukt wurde auf einer Kiesel Säurekolonne unter Verwendung eines Gradienten aus CHpCIp zu CHpClp/EtOAc (18:1) gereinigt. Das gereinigte Methyl-2-/i -(2,2-diphenyläthylenyl)_7-N-benzyloxycarbonylglycinat wurde mit einer Lösung aus 10,9 g KOH in 350 ml 10-^igem wässrigem Methanol zur entsprechenden Säure hydrolysiert. Die erhaltene rohe Säure wurde in 100 ml 95-%igem Äthanol, das 3 ml konz. HCl enthielt, gelöst und in Anwesenheit von 2 g 10~% Pd auf Kohle 24 Stunden hydriert, wodurch man .

2j4 g 3-(2,2~Diphenylmethyl)-D,L-alanin mit einem F. von 235-237⁰C erhielt.

Zu einer Lösung aus 12,9 g 3-(2-Naphthyl)-D,L-alanin in 120 ml 1M NaOH wurden 6,23 ml Essigsäureanhydrid und 60 ml IM NaOH innerhalb von einer halben Stunde bei O⁰C zugefügt. ν Der pH Wert wurde mit konz. HCl auf 2 eingestellt und der erhaltene Niederschlag filtriert. Der Feststoff wurde aus 60-^igem Äthanol umkristallisiert und lieferte 12,2 g N~Acetyl-3-(2-naphthyl)-D, Lj-alanin.

Zu einer Lösung aus 15 g dieser N-Acetylaminosäure in 240 ml trockenem Methanol wurden 15,8 ml Bortrifluoridätherat

augefügt und die Mischung 1 Stunde zum Rückfluß erhitzt. Der Alkohol wurde abgedampft, 200 ml Wasser wurden zugefügt und die Lösung mit Äthylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit w-ässriger Base und Säure gewaschen, über MgSO, getrocknet, filtriert und zu einem Öl gestrippt. Die Kristallisation dieses Öles aus Äthylacetat/Hexan ergab 14,2 g-Methyl-N-acetyl-3-C2-naphthyl)-D_,L-alaninat mit einem F. von 79 bis 80⁰C.

Wurde im obigen Verfahren das 3-(2-Naphthyl)-D_,L-alanin durch eine stöchiometrisch äquivalente Menge von 3-(1 -Naphthyl) -Oj Lj-alanin

3-( 2~Fluorenyl)-D^Lj-alanin 3-(2-Anthryl)^D_>,L_ralanin und

3~(2,2-Diphenylmethyl)-D,L_r-ralanin '

ersetzt, dann erhielt man

Methyl-N-acetyl-3-(1-naphthyl)-D^L-alaninat; F. 97,5 bis 98⁰C .

Methyl-Nracetyl-3-(2-fluorenyl)-p_-,L-a]anlnat; F. 170 bis 171⁰C

Methyl-N-acetyl~3-(2-anthryl)-D^L_i-alaninat bzw. Methyl-N-acetyl-3-(2,2-diphenylmethyl)-D_sL-alaninat; P 113 bis 114⁰C.

Versuch D

Eine Lösung aus 6,6 g Methyl-N-acetyl-3-C2-naphthyl)-D,L-alamnat i_n einer Mischung aus 300 ml Dimethylsulf oxid7 ~ 120 ml 1M KCl und 780 ml H₂O wurde mit 33,6 mg des Enzyms " Subtilisin in 3 ml 0,1M KCl behandelt. Der pH Wert wurde mittels automatischer Titrierung mit 0_t2M NaOH in einer entsprechenden Radiometervorrichtung auf 7 gehalten. Nach 30 Minuten waren 70 ml der NaOH Lösung aufgenommen, und die Hydrolyse wurde abgebrochen. Die Lösung wurde mit 12 g NaHCO₃ basisch gemacht und mit Äthylacetat extrahiert. Die Organische Schicht enthielt Methyl-N-acetyl-3-(2-naphthyl)-JD-alaninat. Die Umkristallisation aus Äthylacetat/Hexan

lieferte einen gelben Feststoff mit einem F. von 80 bis 81°(

Dieser wurde dann wie folgt in die freie Aminosäure und die N-Boc-Aminosäure umgewandelt:

Eine Lösung aus 2,5 g Methyl-N-acetyl-3-(2-naphthyl)~_D_r alaninat in 60 ml 6N HCl wurde 3 Stunden auf 120 bis 130⁰C erhitzt und auf Zimmertemperatur abgekühlt. Der weiße gebildete Niederschlag wurde gesammelt und aus 50 ml Wasser, das 1 ml 12N HCl enthielt, durch Neutralisation mit NH₄OH auf pH 6 umkristallisiert und unter Vakuum zu 1,2 g 3-(2-Naphthyl)-Ibalanin mit einem F. von 242 bis 244⁰C getrocknet; Z«7d⁵ 26,6° (C 0,5, CH₃CO₂H).

Eine Lösung aus 3-(2-Naphthyl)-p_-alanin in einer Mischung aus 55 ml 1N NaOH, 10 ml HpO und 20 ml Dioxan wurde unter Rühren mit 1,48 g Di-tert.-butyldicarbonat und 0,22 g Magnesiumoxid bei O⁰C behandelt. Nach 1 1/2 Stunden wurde weitere 0,3 g Di-tert.-butyldicarbonat zugefügt und die Mischung auf Zimmertemperatur sich erwärmen gelassen. Der Feststoff; wurde abfiltriert und das Filtrat auf 50 ml konzentriert. Diese wässsrige Lösung wurde mit NaHSO₄ auf pH 2,5 gebracht und mit Äthylacetat extrahiert. Die organisch Schicht wurde mit 5 % NaHSO₄, Wasser und gesättigter Salzlösung gewaschen. Die Äthylacetatlösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem Öl konzentriert, das aus Äther/Hexan kristallisiert wurde und 1,3 g N-Boc-3-(2-Naphthyl)-_:Pj-alanin mit einem F. von 90 bis 91 °C

hthyl)_:Pj lieferte; /Χ/β⁵~32,6° (C 0,8, MeOH).

Wurde im obigen Verfahren des Methyl-N-acetyl-3-(2-naphthyl)-I),jL-alaninat wurde eine stöchiometrisch äquivalente ' Menge von _ _<;

Methyl-N-acetyl-3-(1"naphthyl)-D_,L-alaninat

Methyl~N-acetyl-3^(2-anthryl)-D_,L~alaninat und Methyl-N-acetyl-3-(2,2-dipheny!methyl)-I^Jj-

2 2 1 6 8 7 ' -

ersetzt, dann erhielt man über die entsprechenden freien Aminosäuren die folgenden N -Boc-Aminosäuren: N-Boc-3~(1-Naphthyl)-D_ralanin; F. 92 bis 93⁰C; β (C 0,5 MeOH)

N-Boc-3-(2-Fluorenyl)-D_ralanin; F. 161 bis 163⁰C u.Zers. N-Boc-3-(2-Anthryl) -JD-alanin und

N-Boc-3-(2,2-diphenylmethyl)-D_ralanin; F. 153 bis 154⁰C. Versuch Ξ "

ίο In einen Parr Hydrierungskolben wurden 0,85 g 3-(2-Näphthyl D^alanin, 100 ml 214 Salzsäure und 0,85 g Adam's Katalysator (PtOp) gegeben und die Lösung in der Vorrichtung 20 Stunden unter gasförmigem Hp eines Druckes von 4,1 bar belassen. Die Mischung wurde zum Lösen des weißen Nieder- ' Schlages erhitzt und durch Diatomeenerde filtriert. Die Konzentration der Lösung bei vermindertem Druck und anschließende Lyophilisation aus Wasser lieferte 0,8 g 3-(2-Perhydronaphthyl)-Dj-alanin als weißen Feststoff mit einem F. von 230 bis 232⁰C.

Dieses Material wurde in einer Mischung aus 3>2 ml 1N NaOH, 5 tül Wasser und 15 ml Dioxan gelöst und mit 0,14 g MgO und 0,85 g Di-tert.-butyldicarbonat behandelt. Nach 1 Stunde bei O⁰C und 2 Stünden bei 25⁰C wurde die Suspension filtriert, unter vermindertem Druck zur Trockne konzentriert und der Rückstand in Wasser gelöst, mit Diäthyläther gewaschen und mit* NaHSO- auf pH 2 angesäuert. Die angesäuerte wässrige Schicht wurde 3 Mal mit Äthylacetat extrahiert und die Extrakte kombiniert, über MgSO^ getrocknet, filtriert und konzentriert und lieferten 0,75 g N-Boc-3-(2-Perhydronaphthyl)-D_s-alanin als weißes öl.

Ein 0,1 g Anteil dieses Materials wurde in 5 ml Tetrahydrofuran gelöst und bei O⁰C mit frisch hergestelltem Diazomethan titriert, bis die leuchtend gelbe Farbe bestehen blieb. Die Reaktion wurde mit 1 ml Essigsäure abgeschreckt, das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand zwischen 75 ml .Äthylacetat und 75 ml Wasser geteilt. Die

2 2 1 6 8 7 - 24 - ·

organische Schicht wurde mit 5 %igem NaHCO.*, Wasser, 5-%ig. NaHSO/, Wasser, gesättigter NaCl Lösung gewaschen und über MgSO^ getrocknet. Die Lösung wurde filtriert, unter verminderten! Druck konzentriert und auf eine präparative Dünnschicht-Chromatographieplatte (750 ρχ dick, Kieselsäuregel, 20 χ 20 cm) gegeben. Die Platte wurde mit 18:1 Dichlormethan/Äthylacetat entwickelt und das Produktband entfernt. Das Kieselsäuregel aus dem Produktband wurde mit 9/1 Dichlormethan/Äthylacetat auf einem gefritteten Glastrichter gewaschen und das Filtrat zu 0,1 g Methyl-N-Boc-3~(2-perhydronaphthyl)-D.-alaninat als hellgelbes Öl konzentriert.

Dieses Material wurde als Mischung aus zwei Isomeren in der 2-Stellung der Perhydronaphthalinkernes erhalten. Diese diastereomeren Verbindungen können auf einer hochwertigen Flüssigkeits-Chromatographiekolonne (Liehrοsorb Kieselsäuregel 60, 5 Micron) mit 1:9 Äthylacetat/Hexan als Eluierungsmittel getrennt und zur freien Säure, nämlich N-Boc~3~(2-perhydronaphthyl)-JD₍-alanin hydrolysiert werden.

Wird im obigen Verfahren anstelle von 3-(2-Naphthyl)-J>alanin eine stöchiometrisch äquivalente Menge von 3-( 1-Naphthyl)-Dj-alanin

3- (2,2-Diphenylrnethyl) -J>-alanin

3-(2,4,6-Tr ime thylphenyl)-p_, L-alanin • 3-(4-Biphenyl)-D_,L-alanin 3-(2,4,6-Tri-(n-butyl)-phenyl)-jD,Ljalanin und 3- (2,3,4,5,6~Pentame thylphenyl) -D_, L-alanin verwendet, dann erhält man die folgenden N-Boc-Aminosäuren:

N-Boc~3-(1-Perhydronaphthyl)-^-alanin N-Boc-3-(Perhydro-2,2-dip.henylmethyl)-D_i-alanin n~Boc-3- (2,4,6-Trime thylcyclohexyl) -I), Lj-alanin N-Boc-3-(Perhydro-4~biphenylyl)-D₄ Lj-alanin

2 2 1 6 8 7 . ₂₆ .

N-Boc-3-( 2,4,6, -Tri-(n-butyl)-cyclohexyl) -D_, Lj-alanin und N-Boc-3-( 2,3,4,5, β-Pentamethylcyclohexyl) -JD, L~alanin. Beispiel 1 . · In das Reaktionsgefäß eines Beckman 990 Peptid-Synthesizers wurde 0,8 g (0,8 Millimol) Benzhydrylamino-Polystyrol-Divinylbenzol-Harz (Lab Systems, Inc.) (HeIv.Chim.Acta 54, 2772 (1971)) gegeben. Diesem Harz wurden nach dem folgenden Syntheseprogramm sequentiell Aminosäuren addiert:

Stufe 1	CH2Cl2 Wäsche	1	Mal	1,5 min
2	Dep£oteKti6n	1	Mal	1,5 min
3	DeproteKtion	1	Mal	30 min
4	CHpCIp V7äsche	3	Mal	1,5 min
5	10 % Triäthylamin/CH2C12	2	Mal	1,5 min
6	CHpCIp Wäsche	3	Mal	1,5 min
7	N •'Boc-Aminosäurelösung	1	Mal	addiert
8	N, N'-Dicyclohexylcarbo- diimidlösung	1	Mal	addiert
9	CH2Cl2 Spülen und Halten Kuppeln	1	Mal	Kupplungs reaktion 2 std
10	CH2Cl2 Spülen	1	Mal	1,5 min
11	CH2Cl2 Wäsche -	3	Mal	1,5 min
12	Äthanolwäsche	3	Mal	1,5 min
13	CH2Cl2 Wäsche	3	Mal	1,5 min

Die Studen 1 bis 13 beenden einen Kupplungszyklus für eine Aminosäure, und die Beendigung der Reaktion wurde nach dem Ninhydrin-Verfahren von Kaiser et al, Anal.Biochem. J54, 595 (1970) kontrolliert.

Das Harz wurde sequentiell mit einem 2,5 molaren Überschuß ^eder geschützten Aminosäure und DCC gekuppelt. So wurde das Harz während der aufeinander folgenden Kupplungszyklen * mit

0,433 g Boc-Gly-OH 0,432 g Boc-Pro-Oh 0,857 g Boc-Arg(Tosyl)-OH

.22 1 6 87 - ge -.

O$ 462 g Boc-Leu-QH

0,504 g Boc-3-r(2-Naphthyl)-JD-alanin und 0,272 g 1-Hydroxybenzotriazol ν >

> 0,724 g N-Boc,0-2-Brorabenzoyloxycarbonyl-_iL·-tyrosin 0,59 g Boc-Ser(Benzyl)-OH 0,608 g Boc-Trp-OH 0,654 g Boc-His(Tosyl)-OH und 0,524 g Pyroglutaminsäure

ίο behandelt. Das Harz wurde aus dem Reaktionsgefäß entfernt^ mit CHoCIp gewaschen, unter Vakuum getrocknet und lieferte 2,0 g geschütztes Polypeptidharz.

Das Polypeptidprodukt wurde gleichzeitig aus dem Harz entfernt und durch Behandlung mit wasserfreiem flüssigem HP vollständig von schützenden Gruppen gefreit. Eine Mischung aus 2,0 g geschütztem Polypeptidharz und 2 ml Anisol (Abtrennmittel) in einem KeI-F Reaktionsgefäß wurde mit 20 ml erneut (aus CoF^₅) destilliertem, wasserfreiem, flüssigem HF bei O⁰C 30 Minuten behandelt. Das HF wurde unter Vakuum abgedampft und der Rückstand aus (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr»3-(2-naphthyl)-D_ralanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (als " HF Salz) mit Äther gewaschen. Dann wurde der Rückstand mit Eisessig extrahiert"""und der Extrakt lyophilisiert; . so erhielt man 0,8 g Rohmaterial.

Das rohe Polypeptid wurde auf eine 4 χ 40 cm Amberlite^' XAD-4 Kolonne (Copolymeres aus Polystyrol und 4 % Divinylbenzol) gegeben und mit einem konkaven Gradienten aus 0,5 1 Wasser zu 1 1 Äthanol eluiert. Die die Fraktionen des Ausflußvolumens von 690 ml bis 1470 ml enthaltenden Rohren wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft, wodurch man 490 mg teilweise gereinigtes Polypeptid erhielt»

Eine 1"50. mg Probe des teilweise gereinigten Produktes wurde auf einer 3 x 50 cm Kolonne aus Sephadex^ G-25 unter Verwendung eines 1,5 % Pyridin enthaltenden Lösungsmittelsystems aus 1-Butanol, Toluol, Essigsäure und Wasser

2 2 16 8 7 - 2-s: -

im Verhältnis von 10:15:12:18 einer Teilungschromatographie unterworfen. Die reinen Fraktionen wurden auf der Basis von Dünnschichtchromatographie (Kieselsäuregel; BuOH/HpO/ ; HOAc/EtOAc; 1:1:1:,1·) und HPLC (5 Micron, Umkehrphase, pctadecylsilylfüllung; 40 % 0,03M NH₄OAc/60 % Acetonitril) vereinigt. Das gewünschte Produkt verließt die Kolonne in Fraktionen des Ausflußvolumens 1000 ml bis 1 400 ml (Rf 0,1). Die reinen Fraktionen wurden vereinigt, zur Trockne eingedampft, in Wasser aufgenommen und zu 57 mg reinem Pyro-glutamyl~histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl~3-(2-naphthyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid als dessen Essigsäure-Additionssalz lyophilisiert; Ij^JtC -27,4° (C 0,9, HOAc), F. 185 bis 193⁰C u.Zers.

B e i s- p i 'e 1 2

Zur Synthese der Analogen mit C-endständigem Pro-NH-CHUCH:* wurde ein dem Beispiel 1 identisches Syntheseprogramm verwendet. Das Beckman-990-Synthesizer-Reaktionsgefäß wurde mit 2,13 g Boc-Pro-O-Harz, hergestellt durch Reaktion äquimolarer Verhältnisse des trockenen Cäsiumsalzes von Boc-Pro-OH mit Chlormethyl-polystyrol/1 % Divinylbenzol (Lab Systems. Inc.) beschicht. Die verwendete Menge an Boc-Pro-O-Harz enthielt 1,4 Millimol Prolin.

Das Harz wurde sequentiell mit einem 2,5 molaren Überschuß jeder geschützten Aminosäure und DCC gekuppelt. So wurde das Harz während der aufeinander folgenden Kupplungszyklen mit

. 1,61 g Boc-Arg(Tosyl)-OH O»93 g Boc-Leu-OH H₂O

0,94 g .Boc-3-(2-Naphthyl)-p_~alanin und 0,49 g 1-Hydroxybenzotriazol

1*75 g N-Boc-0-2-Brombenzyloxycarbonyl-_L_-tyrosin und 1,11 g Boc-Ser-(Benzyl)-OH umgesetzt.

12.11,1980 _a« AP C 07 C/221

'2-2 16 8 7 — » - . 57 eso/n

An diesem Punkt der Synthese wurde die Menge des geschützten Polypeptidharzes halbiert, und die eine Hälfte wurde durch sequentielle Reaktion mit 0,57 g Boc-Trp-OH

0_f77 g Boc-His~(Tosyl)-OH und ·

0,21 g Pyroglutaminsäure

vollständig umgesetzte Das Harz wurde aus dem Reaktionsgefäß entfernt, mit CH₂Cl₂ gewaschen und unter Vakuum zu 2,26 g geschütztem Polypeptidharz getrocknet«

Das geschützte Polypeptid kann vom Harz durch Aminolyse mit 25 ml Äthylamin für 18 Stunden bei 2 ⁰C abgespalten werden« Das Athylamin wird abgedampft und das Harz mit Methanol extrahiert« Nach Abdampfen des Methanols erhielt man 1.-39 g Pyro»Glu-His(Tosyl)-Trp-Ser (Benzyl )-Ty r(2~ brombenzyloxycarbonyl)-3-(2-naphthyl)~D-alanyl~Leu-Arg (Tosy1)-Pr0-NH-CH₂CH₃«

Das rohe Polypeptid wurde durch Behandlung mit einer Mischung aus 3 ml Anisol und 30 ml erneut (aus CoF₃) destilliertem, wasserfreiem, flüssigem HF bei O ⁰C 30 Minuten in einem Kel-F-Reaktionsgefäß von schützenden Gruppen befreit« Das HF wurde unter Vakuum abgedampft und der Rückstand mit Äther gewaschen» Der Rückstand wurde in 2 M Essigsäure gelöst und zu 0,82 g rohem (Pyro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr»3-(2-naphthyl)-D-alanin-Leu-Arg-Pro-NH«CH_pCH als Essigsäure-Additionssalz lyophilisiert» Die endgültige Reinigung erfolgte durch präparative Hochleistungs-Flüssig«* keitschromatographie einer 20-mg-.Probe auf einer 0,9 χ 550 mm Kolonne aus 40 bis 5p ρ octadecylsilylierter kieselsäure« Das Eluierungsmittel war 64 % 0,03 M NH OAc/36 %

12,11,1980 AP C 07 C/221 2 2 16 8 7 . 2g% . 57 650/11

Acetonitril« In vier Versuchen wurden insgesamt 61 mg Rohmaterial gereinigt» Nach drei Lyophilisationen aus Wasser erhielt man 15 mg reines Pyroglutamyl-histidyltryptophyl-seryl~tyrosyl-3«»(2-naphthyl)-D-.alanyl-leucylarginyl-prolin-äthylamid als Essigsäure-Additionssalz; F* 180 bis 190 ⁰C; C^}f.⁵ -57,2° (C 1,1,HOAc).

~~ TTTWW7

Wurde im obigen Verfahren das.Äthylamin durch eine stöchiometrische Menge von , . ,

n-Butylamin Cyclopropylamin, Cyclohexylamin Trifluormethylamin Pentafluoräthylamin und 2,2,2-Trifluoräthylamin

ersetzt, dann erhielt man das entsprechende .n-Butylamid, Cjrclopropylamid Cyclohexylamid Trifluormethylamid Pentaflüor-äthylamid bzw

2,2,2-Trifluoräthylamid des obigen Nonapeptids

Beispiel 5 0

It p

verbindungen der Formel I, in welcher Z für -NH-CNH-R · steht, können durch klassische Lösungssynthese hergestellt werden. Dabei kann wie folgt verfahren werden, wobei "AZaGIyNH₂" i? _o bedeutet:

-NH-NH-C-NH²

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-OMe

(D

Cbz-Leu-Arg-Pro-AzaGlyNH. (2)

Glu~His-Trp« Ser-Tyr-N₃

Boc-3-(2-Naphthyl-D-Ala-Leu-Arg-Pro-AzaGly-NH ₀ TT+

H-3-(2-Naphthyl)-D-AIa Leu-Arg-Pro-AzaGly-NH

(3)

(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-.(2-naphthyl) -D-Ala-Leu-Arg-Pro'-Aza-Gly-~NK₂

als.freies Peptid oder Salz.

2 216 87 -JS,/-

Das Kuppeln der einzelnen Fragmente kann nach dem Acylazid-Verfahren (Honzel et al. Coll.Czech.Chem.Comm. 26, 2333 (1971)), durch DCC/HBT Kupplung oder andere Verfahren unter Racemisierung freier Fragmente erfolgen. Die Verbindungen

(1) und (2) sind bekannt (M.FuJino et al, Biochem.Biophys. Res.Comm., £7, 1248 (1974) bzw. A.S.Butta et al, J.Chem.Soc. Perkin I, 1979, 379). Die Verbindung (3) wird aus (2) durch Entfernung von Cbz und der Nitrogruppen durch Hydrogenolyse und^änschließendes Kuppeln mit N-Boc-3-(2-Naphthyi; D-alanin unter Verwendung von DCC/HBT oder eines anderen ' bekannten Kupplungsmittels hergestellt. Für eine Synthese ähnlicher LH-RH Analoge siehe die unmittelbar oben genannte Stelle in J.Chem.Soc.

-

Durch Verwendung anderer Aminosäuren anstelle von N-Boc-3-(.2-Naphthyl)-Djalanin können andere Verbindungen der Formel I hergestellt werden, wie z.B.:

(p'yro)Glu-^s-His-Trp-Ser-Tyr-3-( 2-naphthyl) -JDj-Ala-N-methyl-Leu-Arg-Pro-AzaGlyNH2 und

(pyro)GIu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-trimethylphenyl) -JD₇AIa-'Leu-Arg-Pro-AzaGlyNHp. Bei der Herstellung der Verbindung

(2) liefert die Verwendung von AzaGly-NH-niedrig-alkyl anstelle von Aza-Gly-NHp das entsprechende Peptid mit einem Aza-Gly-NH-niedrig-alkyl-terminus, z.B.

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-JD-Ala-Leu-Arg-Pro-Aza-Gly-Et

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D_rAla-N-methyl-Leu-Arg-Pro-AzaGly-Et und

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-trimethylphenyl)-D^ Ala-Leu-Arg-Pro-AzaGly-Et

Beispiel 4

Durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 1 und Verwendung einer D- oder D,L-Aminosäure in 6-Stellung (wobei im letzteren Fall die diastereomeren Peptide während der Chromatographie getrennt werden) unter Einsatz der jeweiligen Aminosäuren in der Synthesesequenz in fester Phase kann man die folgenden Decapeptide isolieren und als ihre Essigsäure-Additionssalze kennzeichnen:

22 16 87 - **·-.

pyro-Glutamyl--histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl»3- (2-naphthylJD-alanyl-N-methylleucyl-arginyl-prolyl-glycinamid;. [a]g⁵ -26.6° (C=I, HOAc); · '. ;

5- pyro~(Jlutamyl-histidyl~phenylalanyl-seryl-tyrosyl-3-

(2-naphthyl)."D~alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid j -

pyro~Glutamyl-histidyl~3-(1-naphthyl)-L-alanyl-seryltyrosyl-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolylglycinamidy

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-phenylalanyl-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid;

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-3-(l-pentafluor phenyl)-L-alanyl-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-leucylarginyl-prolyl-glycinamid/

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-S-(1-naphthyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid j

F. . 173-5°C, [α]δ⁵ -28.1° (C=O.8, HOAc); pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2-

anthryl)-D-alanyl-leucyl-arainyl-prolyl-glycinamid/ _v pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-S-(2-fluorenylJ-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinaraid ·- ia]g⁵ -25.8° (C=I, HOAc);

pyro-Glutamyl-histid.yl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(3-phenanthryl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinaraid pyro~Glutamyl~histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(4-biphenylyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid ; Ia)P -35*7° (C=I, HOAc) ;

pvro-Glutarayl-histidyl-tryρtoρhyl-seryl-tyrosyl-3-(2,2-diphenylmethyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolylglycinamidj

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-S-(1-adamantyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid_;·

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-S-(2,4,6-trimethylphenyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-³⁵glycinamidJ [a]g⁵ -42.1° (C=I, HOAc);

Λ . 221687 - g pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-a

[2,4,6-tri-(η-butyl)phenyl]-D-alanyl-leucyl-arginylprolyl-glycinamid·.

. pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3 (2,3,4,5,6-pentamethylphenyl)-D-alanyl-leucyl-arginylprolyl-glycinamid;

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-a

(2,4,6-trimethylcyclohexyl)-D-alanyl-leucyl-arginylprolyl-glycinamid;

pyro~Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyi:osyl-3-{2,4,6-tri(η-butyl)cyclohexyl]-D-alanyl-leucyl-arginylll

pyro~Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(perhydro-1-naphthyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-pro¹vl- glycinamidj

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-S-(perhydro-2~naphthyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolylglycinamidj

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-S-(4-perhydrobiphenylyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolylglycinamidj

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-S-(perhydro-2,2-diphenylmethyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-

prolyl-glycinamidj

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naphthylJ-D-alanyl-isoleucyl-arginyl-prolyi-glycinamid

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-S-(2-.

naphthyiJ-D-alanyl-norleucyl-arginyl-prolyl-glycinamid . Beispiel §__

Durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 2 und Verwendung einer D- oder D,L-Aminosäure in 6-Stellung (im letzteren Fall werden die diastereomeren Peptide während

. ^

der Chromatographie getrennt) und Einsatz der jeweiligen Aminosäuren in der Synthesesequenz in fester Phase erhielt man die folgenden Nonapeptide als ihre Essigsäure-Additions salze:

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(1-naphthyl)^D_>-alanyl-leu.cyl-arginyl-prolin als dessen Äthylamid, n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid,

i- Trifluormethylamid, Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Trifiüoäthylamid; . .

pyro-Glutamyl-histidyl-phenylalanyl-seryl-tyrosyl-3-(2-' naphthyl)-D_ralanyl-leucyl-arginyl-prolin als dessen

Äthylamid; F 180-190⁰C A7^⁵-57,2° (C=1, 10 % HOAc), ιό n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifluormethyl amid, Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Trifluoräthylamide pyro-Glutamyl-histidyl-3-(1-naphthyl)-L-alanyl-seryltyrosyl"-3~( 2-naphthyl) -D_-alanyl-leucyl-arginyl~prolin dessen Äthylamid; F. 160~170°C Z^J^⁵-^5»3° (C=1, HOAc), n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifluormethylamid, Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Trifluoräthyl-

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-phenylalanyl-3-( 2-naphthyl)-J>alanyl-le.'Ucyl-arginyl-prolin als dessen Äthylamid, n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifluormethylamid, Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Trifluoräthylamid^

pyro~Glutamyl~histidyl-tryptophyl-seryl-3-(1-pentafluorphenyl)-L-alanyl-3-(2-napHthyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl- prolin als dessen Äthylamid, n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifluormethylamid, Pentafluoräthylamid

• und 2,2,2-Trifluoräthylamidj

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl~tyrosyl-3-(1-anthryl)-JDjalanyl-leucyl-arginyl-prolin als dessen Äthylamid, n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifluormethylamid, Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Trifluoräthylamidj

pyro-Glutamyi-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2-fluürenyl)-Dj-alanyl-leucyl~arginyl-prolin als dessen Äthylamid, n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifluormethylamid, Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Trifluoräthylamid»

— 2 2 1 6 B 7 -

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-( 3-phen-

anthryl) ID-alanyl-leucyl-arginyl-prolin als dessen

Äthylamid, n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifiuormethylamid, Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Trifluoräthylamidj

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(4-biphenylyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin als dessen Äthylamid, n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifluormethylamid, Pentalluoräthylamid und 2,2,2-Trifluoräthylamidj

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-( 2,2-diphenylmethyl)~JD^alanyl-leucyl-arginyl-prolin als dessen Äthylamid; F. 176-206°C /oc7Jp33,7^O (C=1, 10% HOAc), j

is n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifluormethyl amid, Pentafluoräthylamid und 2i2,2-Trifluoräthylamid* pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-( 1-adamantyli-Dj-alanyl-leucyl-arginyl-prolin als dessen Äthylamid, n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifluormethylamid, Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Trifluoräthylamid;

.pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2,4,6-trimethylphenyl)-D_ralanyl-leucyl-arginyl-prolin als dessen Äthylamid, n-Butylamid, "Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifluormethylamid, Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Trifluoräthylamid*, pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-^,^^- tri- (n-butyl) -phenyl/ -D-alanyl-τ—leucyl-arginyl-prolin als dessen Äthylamid, n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifluormethylamid, Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Trifluoräthylamidj pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-( 2,3,4, Sfe-pentamethylphenylJ-JD-alanyl-leucjrl-arginyl-prolin als dessen Äthylamid, n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifluormethylamid, Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Trifluoräthylamid·

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-jJ-(2,4,6-triraethylcyclohexyl)«0>-alanyl-leucyl-arginyl-prolin als dessen Äthylamid, n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifluormethylamid, Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Trifluoräthylamidj · .

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-/2,4,6-tri-(n~butyl)-cyclohex3rl7-D_-alanyl-leucyl-arginyl-prolin als dessen Äthylamid, n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifiuormethylamid, Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Trlfluoräthylamid;

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-J-Cperhydro-1-naphthyl)-^-alanyl-leucyl-arghyl-prolin als dessen Äthylamid, n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifiuormethylamid, Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Trifluoräthylamid'

pyro-Glutamyl~histidyl~tryptophyl-seryl~tyrosyl-3-(per·» hydro-2-naphthyl)-J>alanyl-leucyl-arginyl-prolin als dessen Äthylamid, n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifiuormethylamid, Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Trif luoräthylamid <_f

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-ö-(4-perhydrobiphenylylJ-^-alanyl-leucyl-arginyl-prolin als dessen Äthylamid, n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifiuormethylamid, Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Tri-.fluoräthylamid ;

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-J-Cperhydro-2,2-dipheny!methyl) -^-alanyl-leucyl-arginyl-prolin ' als dessen Äthylamid, n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifiuormethylamid, Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Trifluoräthylamidy

pyro-Glutamyl~histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naphthyl)-'^-alanyl-N-ⁱmethyl-leucyl-arginyl-prolin als dessen Äthylamid; F. 170-185°C Ζ^ί7β⁵-81,1° (C=O,7; 10 % HOAc), n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifiuormethylamid i Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Trifluoräthylamid j .

2g:

2216 87- ^ -

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl~seryl-tyrosyl-3-(2-naphthyl)-^)-alanyl-isoleucyl-arginyl-prolin als dessen Äthylamid, n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifluormethylaraid, PentafIuoräthylamid und 2,2,2-Trifluoräthylamid und

pyro-Glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naphthyl)-J>-alanyl-norleucyl-arginyl-prolin als dessen Äthylamid, n-Butylamid, Cyclopropylamid, Cyclohexylamid, Trifluormethylamid, Pentafluoräthylamid und 2,2,2-Trifluoräthylamid.

Beispiel 6

A. Eine Lösung aus 0,1 g des Fluorwasserstoffsalzes von (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl) -J>-Ala-Leu-Arg-Pro-GIy-NH₂ (vgl. Beispiel 1) wurde in 50 ml Wasser gelöst und durch eine Kolonne aus 50 g Dowex^ 3 Anionenaustauscherharz geleitet, das vorher mit Essigsäure äquilibriert und mit deionisiertem Wasser gewaschen worden war. Die Kolonne wurde mit deionisiertem Wasser eluiert und der Ausfluß lyophilisiert, wodurch man das entsprechende Essigsäuresalz von (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-jD^Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂; f^J^³-27_t5° (C 0,9, HOAc) erhielt.

Wurden im obigen Verfahren anstelle der Essigsäure andere Säuren während der Äquilibrierung des Harzes verwendet, dann erhielt man z.B. die entsprechenden Salze mit Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Benzoesäure usw.

In ähnlicher Weise können die Säure-Additionssalze anderer Verbindungen der Formel I hergestellt werden. B· Salze mit geringer Wasserlöslichkeit können durch Ausfällung aus Wasser unter Verwendung der gewünschten Säure hergestellt -werden; wie z.B.:

Zinktannatsalz - eine Lösung als 10 mg (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NHg-Essigsäuresalz in 0,1 ml Wasser wurde mit einer Lösung aus 8 mg Gerbsäure in 0,08 ml 0,25M NaOH behandelt. Zur Lösung des LH-RH

2 2 16 8 7 - gT. ^\

Analogen wurde sofort eine Lösung aus 5 mg ZnSO/ Hepta- ! hydrat in 0,1 ml Wasser zugefügt« !

5- Die erhaltene Suspension wurde mit 1 ml Wasser verdünnt ' und der Niederschlag zentrifugiert. Die überstehende i Flüssigkeit wurde dekantiert und der Rückstand zwei Mal mit $e 1 ml Wasser durch Zentrifugieren desselben und Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit gewaschen. Der Niederschlag wurde unter Vakuum getrocknet und lieferte mg des gemischten Zinktannatsalzes des obigen LH-RH Analogen

Pamoatsalz - zu einer Lösung aus 50 mg (pyro)Glu-His-Trp-Ser~Tyro-3-(2«naphthyl)-D_rAla-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂-Essig-

säuresalz in einer Mischung aus 1,6 ml Äthanol und 0,1 ml 0,25M NaOH wurde eine Lösung aus 11 mg Pamoa-saure in 0»3 ml 0,25M NaOH zugefügt. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in 2 ml Wasser suspendiert, zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit dekantiert. Der Niederschlag wurde mit 1,5 ml Wasser gewaschen, zentrifugiert und unter Vakuum getrocknet; so erhielt man 54 mg des Pamoatsalzes des obigen LH-RH Analogen.

In ähnlicher Weise können andere Salze mit geringer Wasser, löslichkeit hergestellt werden.

C. Herstellung des Säure-Additionssalzes aus dem freien Peptid

Zu einer Lösung aus 50 mg (pyro)Glu-His-Trp-Ser—Tyr-3-(2-naphthylJ-Pj-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NHp als freie Base wurden 30 ml 1N Essigsäure zugefügt und die erhaltene Lösung zu 50 mg des Essigsäuresalzes des obigen LH-RH Analogen lyophilisiert. .

.

Durch Ersetzen der Essigsäure durch andere Säuren (in stöchiometrisch äquivalenten Mengen bezüglich des Peptids) erhielt man andere Säure-Additionssalze der Verbindungen

. 22 16 87 V ^i ... ~ ~~

von Formel (I), z.B. die Salze von Salzsäure, Bromwässerstoff säure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure.

D. Herstellung des Salzes mit einem Metallkation, z.B. das Zinksalz

Zu einer Lösung aus 50 mg (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthylJ-JD^Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-N^-Essigsäuresalz in einer Mischung aus 0,4 ml 0,25M NaOH, 0,3 ml Wasser und 1 ml Äthanol wurde eine Lösung, aus 15 mg ZnSO^-Heptahydrat in 0,2 ml Wasser zugefügt. Der Niederschlag wurde mit 1 ml Wasser durch Zentrifugieren und Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit gewaschen, dann unter Vakuum getrocknet und lieferte 48 mg des Zinksalzes der obigen LH-RH Analogen.

In ähnlicher Weise können Salze mit anderen mehrwertigen Kationen, wie Calcium, Wismut, Barium, Magnesium, Aluminium, Kupfer, Kobalt, Nickel, Cadmium usw., hergestellt werden.

Beispiel £

Eine Lösung aus 50 mg (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthylJ-^-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NHp-Essigsäuresalz in 25 ml Wasser wurde durch eine 50 g Kolonne aus Dowex^v—'1 (stark basisches, quaternäree Ammonium-anionenaustauscherharz) geleitet, die mit NaOH Lösung äquilibriert worden war, um das Gegenionenhydroxid herzustellen. Die Kolonne wurde mit 150 ml Wasser eluiert und das Eluierungsmittel lyophilisiert; so erhielt man 45 mg des entsprechenden Polypeptids als freie Base.

In ähnlicher Weise können andere Säure-Additionssalze der Verbindungen der Formel (I), z.B. die in Beispiel 6 genannten Verbindungen, in die entsprechenden freien Basen umgewandelt werden. .

Beispiel 8

Im Folgenden werden typische pharmazeutische Präparate aufgeführt, die als aktiven Bestandteil ein erfindungsgemäßen LH-RH Analoges enthalten, z.B. (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-J>alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 p_{er se}

als pharmazeutisch annehmbares Salz, 2.B. das Essigsäure-Additionssalz, das Zinksalz, Zinktannatsalz usw.

A. Tablettenformulierungen für buccale (z.B. sublinguale) Verabreichung

1. LH-RH Analoges 50,0 /Ug

komprimierbarer Zucker, USP 96,0 rag

Calciumstearat . 4,0 mg

2. LH-RH Analoges 30,0 /Ug

komprimierbarer Zucker; USP 98,5 mg

Magnesiumstearat . 1,5 mg

3. LH-RH- Analoges 25,0 /Ug Mannit; USP 88,5 mg ·

Magnesiumstearat; USP 1,5 mg

vor-gelatinierte Stärke; USP 10,0 mg

4. LH-RH Analoges . 200,0 /Ug Lactose; USP 83,3 mg vor-gelatinierte Stärke; USP 15,0 mg

Magnesiumstearat; USP 1,5 mg

Herstellungsverfahren

a. Das LH-RH Analoge wurde in einer ausreichenden Wassermengo gelöst, um beim Mischen mit dem Zuckeranteil de-s Streckmittels ein nasses Granulat zu bilden. Nach vollständigem Mischen wurde das Granulat auf einem Boden- oder Wirbelbetttrockner getrocknet, dann zum Aufbrechen großer Aggregate gesiebt und mit dem restlichen Komponenten gemischt. Das Granulat wurde auf einer üblichen Tablettiermaschine auf das spezifische Tablettengewicht komprimiert.

b. Bei diesem Herstellungsverfahren umfassen alle Formulierungen 0,01 % Gelatine USP; diese wurde zuerst im wässrigen Granulierungslösungsmittel gelöst, dem dann das LH-RH Analoge zugegeben wurde. Die übrigen Stufen waren wie bei Verfahren (a) oben.

Die obige Formulierung 4 kann auch als Tablette zur oralen Verabreichung verwendet werden.

22 1 6 87 -

B. Lang wirkende, intramuskulär injizierbare Formulierung 1. Lang wirkendes, i.m. injizierbares Sesamölgel

LH-RH Analoges 1,0 mg

Aluminiummonostearat; USP 20,0 mg

Sesampl q.s. ad 1,0 ml

Das Aluminiummonostearat wurde mit dem Sesamöl kombiniert und unter Rühren bis zur Bildung einer klaren gelben Lösung/ erhitzt. Diese Mischung wurde dann in einem Autoklaven sterilisiert und abkühlen gelassen. Anschließend wurde das LH-RH Analoge aseptisch uiter Verreiben zugefügt. Besonders bevorzugte LH-RH Analoge sind Salz mit geringer Löslichkeit, z.B* Zinksalze, Zinktannatsalze, Pamoatsalze usw. Diese zeigen eine außergewöhnlich langanhaltende Aktivität 2. Lang wirkende, i.m. injizierbare, biozersetzbare Polymermikrokapseln LH-RH Analoges 1 %

25/75 Glycolid/Lactid-Copolymer

(grundmolare Viskositätszahl 0,5) 99 %

Mikrokapsel (0 bis 150 /u) der obigen Formulierung sus-

/

pendiert in:

,Dextrose 5»0 %

CMC, Natrium 0,5 %

Benzylalkohol - 0,9 %

0,1 %

.

gereinigtes Wasser q.s. 100,0 %

25 mg der Mikrokapseln wurden in 1,0 ml Träger suspendiert.

C« Wässrige Lösung zur intramuskulären Injektion

LH-RH Analoges 25 mg

Gelatine; nicht-ant-igeniseh 5

Wasser zur Injektion q.s. ad 100 ml

Gelatine und LH-RH Analoges wurden im Wasser für die Injektion gelöst, dann wurde die Lösung steril filtriert.

/ auf 125 C

- If -

D. Wässrige Lösung zur nasalen Verabreichung

LH-RH Analoges . 250 mg

Dextrose · 5 g

Benzylalkohol . 0,9 g

gereinigtes Wasser q.s. ad 100 ml LH-RH Analoges, Dextrose und Benzylalkohol wurden im gereinigten Wasser gelöst und auf das entsprechende Volumen gebracht.

.

E, Formulierung zur rektalen Verabreichung Suppositorienträger zur rektalen Verabreichung LH-RH Analoges 500 /Ug

Whitepsol^H15 20,0 g

Das LH-RH Analoge wurde mit dem geschmolzenen Whitepsol H15 kombiniert, gründlich gemischt und in 2-g-Formen gegossen. I Beispiel 9 . ., ' , |

Östrussuppression bei Ratten j

Weibliche Ratten (Hilltop, Sprague Dawley) von etwa 200 g | mit offener Vagina wurden zu Gruppen von 5 pro Käfig gewogen, wobei 2 Käfige pro Gruppe dienten. Die Ratten wurden 2 Mal täglich (mit Ausnahme der unten aufgeführten Fälle) 14 Tage subkutan injiziert. Es wurden tägliche Vaginaabstriche gemacht, um das Stadium des Östruszyklus zu bestimmen; das Körpergewicht der Ratten wurde bei 0, 1 und 2 Wochen bestimmt. Der Prozentsatz an Ratten, die vom Tag an eine teilweise Östrussuppression (d.h. nur Diöstrus und Proostrus, jedoch keinen Östrus) zeigten, sowie der Prozentsatz an Ratten mit vollständiger Östrussuppression (d.h. nur Diöstrus) vom Tag 4 an wurden festgestellt. Die EDaQ Werte wurden aus der besten geraden Linie der Prozentdaten der Östrussuppression hergeleitet. Die LH-RH Analogen wurden als ihre Acetatsalze in physiologischer Kochsalzlösung mit 0,1 % Rinderserumalbuinin verabreicht. Das Injektionsvolurnen betrug 0,2 ml, und die Analogen waren in Mengen) von 0,05? 0,1, 0,2 oder 0,4 /Ug anwesend. Eine Kontrolle (.BSA enthaltende, physiologische Kochsalzlösung) zeigte keine Östrussuppression.

22 16 87.

Die ED₅₀ Werte für die kombinierte teilweise und vollständige Östrussuppression waren wie folgt:

Verbindung ED50 (pg/inj.)

(pyrp)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)- 0,08

D-alany1-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)- 0,22 D-alanyl-Leu-Arg-Pro-NHEt

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)- 0,07 D-alanyl-N-MeLeu-Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)- 0_f12

D-alanyl-N-MeLeu-Arg-Pro-NHEt (pyro)GIu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6- 0|08

trimethylphenyl)-D-alany1-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(1-naphthyl)- 0,3 D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(9-anthryl)- 0,27

D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(4- 0,28a

biphenylyl)-D-alanyl-Leu-Arg-

Pro-Gly-NH2 ;

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-fluorenyl)- 0_f40^a D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,2-diphenyl- 0,11

methyl-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NHEt (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6- 0,35^a trimethylphenyl)-D-alanyl-N-MeLeu-

Arg-Pro-Gly-NH₂ (pyro)-Glu-His-3-(1-naphthyl)-L-alanyl- 0,16 Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-NHEt

a - bei diesen Verbindungen erfolgte die Verabreichung nur einmal täglich

Beispiel

6 Swiss-Webster Mäuse (Simonsen) von ^e etv/a 25 g Gewicht wurden subkutan mit 0,25 ml einer wässrigen Lösung aus

5 (pyro)Glu~His-Trp-Ser-Tyr-3~( 2-naphthyl) -J^-alanyl-Leu-Arg-PrO-GIy-NH₂ als dessen Acetatsalz injiziert. Die Dosis betrug 40 rag/kg oder etwa 1 mg/Maus. Die Mäuse wurden zweimal täglich 21 Tage lang auf Sterblichkeit untersucht. Es wurde keine lethale Wirkung festgestellt. Daher liegt

io die LDf-Q über 40 mg/kg.

Claims (5)

12.11.1980

I^ AP C 07 C/221 687

1 6 87 -44- 57 650/11

Erfindungsanspruch

1« Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel (I):

(pyro)Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Arg-Pro-Z (I)

und ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze, in welcher V für Tryptophyl, Phenylalanyl oder 3-(l-Naphthyl)-L-

alanyl steht;
W Ty rosy 1, Phenylalanyl oder 3-(l-Pentafluorphenyl)-L.-alanyl bedeutet;

X ein D-Aminosäurerest n
" -NH-CH-C-

?^H2

. .. '' ' · ^R : - '

1st, in welchem R für

(a) einen carbocyclischen arylhaltigen Rest aus der Gruppe von Naphthyl, Anthryl, Fluorenyl, Phenanthryl, Biphenylyl, Benzhydryl und Phenyl, der mit 3 oder mehreren geradekettigen niedrigen Alkylgruppen substituiert ist, oder

(b) einen gesättigten carbocyclischen Rest aus der Gruppe von Cyclohexyl, der mit 3 oder mehreren geradekettigen niedrigen Alkylgruppen substituiert ist,

' Perhydronaphthyl, Perhydrobiphenylyl, Perhydro-2,2-diphenylmethyl und Adamantyl steht;

Y Leucyl, Isoleucyl, nor-Leucyl oder N-Methyl-leucyl ist; Z Glycinamid oder -NH-R ist, wobei R niedrig Alkyl, Cycloalkyl, Fluor-niedrig-alkyl oder P, oist,

-NH-C-NH-R^ '

wobei R Wasserstoff oder niedrig Alkyl bedeutet, gekennzeichnet dadurch, daß man

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221 687. «45-^ 57 650/11

(i) schützende Gruppen und wahlweise den kovalent gebundenen festen Träger von einem geschützten Polypeptid unter Bildung einer Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes derselben entfernt und wahlweise

(ii) eine Verbindung der Formel (I) in ein pharmazeu«· tisch annehmbares Salz umwandelt oder

(iii) ein Salz einer Verbindung der Formel (I) in ein pharmazeutisch annehmbares Salz umwandelt oder

(iv) ein Salz einer Verbindung der Formel (I) in ein freies Polypeptid der Formel (I) überführt»

2_# Verfahren nach Punkt 1, 'gekennzeichnet dadurch, daß man eine Verbindung herstellt, in welcher V für Tryptophyl oder Phenylalanyl steht, W Tyrosyl bedeutet, X 3-(2-NaphthylJ-D.-alanyl oder 3-(2_f4,6«Trimethylphenyl)-j3-alanyl ist, Y für Leucyl oder N-Methyl-leucyl steht und Z Glycinamid oder -NHEt bedeutet_#

3* Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man eine Verbindung herstellt, in welcher X für 3~(2-Naphthyl) ~D»alanyl steht»-

4* Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man (pyro)Glu«His-Trp~Ser~Tyr»3~(2-naphthyl)~D~alanyl~Leu~ Arg-Pro-Gly-NHp oder dessen pharmazeutisch annehmbare Salze herstellt»

"5#"Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß man (pyro)Gl_u«-'His-Trp-.Ser'-Tyr~3~(2-naphthyl)-"D~alanyl->N« methyl-Leu-Arg-Prd-Gly-NHp oder dessen pharmazeutisch annehmbare Salz© herstellt»

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.g AP C 07 C/221 687

6» Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß man (pyro3Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-£-alanyl-Leu-Arg-Pro-NHEt oder dessen pharmazeutisch annehmbare Salze herstellt.

Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß man (pyrG)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-N-methyl-Leu-Arg-Pro-NHEt oder dessen pharmazeutisch annehmbare Salze herstellt.

8. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß man (pyro)Glu-His-Phe-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl~Leu-Arg-Pro-Gly-NHp oder dessen pharmazeutisch annehmbare Salze herstellt*

9* Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man . eine Verbindung herstellt, in welcher X für 3-(2,4,6-Trimethylphenyl)~£~alanyl steht.

10. Verfahren nach Punkt 9, gekennzeichnet dadurch, daß man (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-triraethylphenyl)-D-alanyl—Leu—Arg-Pro-Gly-NH« oder dessen pharmazeutisch annehmbare Salze herstellt.