Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych pochodnych dziewiecio- i dziesieciopeptydo¬ wych o wzorze (piro)Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Arg- Fro-Z oraz ich farmakologicznie dopuszczalnych soli, w którym V oznacza grupe tryptofylowa, fe- nyloalanylowa lub 3-(naftylo-l)-L-alanylowa, W oznacza grupe tyrozylowa, fenyloalanylowa lub 3-(pieciofluorofenylo-l)-L-alanylowa, a X oznacza reszte D-aminokwasu o wzorze -NH-CH(CH2R)- -G(=0)- w którym R oznacza karbocykliczny rod¬ nik zawierajacy pierscien arylowy, wybrany z gru¬ py obejmujacej rodnik naftylowy, antrylowy, fluo- renylowy, fenantrylowy, dwufenylilowy, benzhy- drylowy i fenylowy, podstawiony co najmniej 3—5 nizszymi, prostolancuchowymi rodnikami alkilowy¬ mi lub R oznacza nasycony, cykliczny rodnik we¬ glowodorowy wybrany z grupy obejmujacej rodnik cykloheksylowy podstawiony 3—5 nizszymi, prosto¬ lancuchowymi rodnikami alkilowymi, rodnik per- hydronaftylowy, perhydrodwufenylilowy perhydro- -2,2-dwufenylometylowy i adamantylowy, Y ozna¬ cza grupe leucylowa, izoleucylowa, nor-leucylowa lub N-metyloleucylowa, Z oznacza glicynoamid lub grupe o wzorze -NH-R1, w którym R1 oznacza rod¬ nik alkilowy o Ih^I atomach wegla, rodnik cyklo- alkilowy o 3—6 atomach wegla, rodnik fluoro- alkilowy o 1—4 atomach wegla lub rodnik o wzo¬ rze -NH-C(=0)-NH-R5, w którym R2 oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy o 1—4 atomach wegla oraz ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli. 15 20 25 30 Hormon luteinizujacy (LH) i hormon pobudzaja¬ cy wzrost pecherzyków (FSH) sa wydzielane przez przedni plat przysadki mózgowej, a wydzielanie ich jest regulowane przez czynnik uwalniajacy LH- -RH wydzielany w podwzgórzu. LH i FSH oddzia- lywuja na gonady stymulujace synteze hormonów sterydowych i dojrzewanie komórek plciowych.Pulsacyjne uwalnianie LH-RH a tym samym i uwalnianie LH i FSH reguluje cykl reprodukcyj¬ ny zwierzat domowych i ludzi. Ponadto LH-RH ma wplyw na lozysko, na uwalnianie HCG i bezposred¬ nio na gonady. Agonistyczne analogi LH-RH sa uzyteczne w regulacji plodnosci, dzialajac dwiema drogami. Niskie dawki analogów LH i RH moga stymulowac owulacje i sa uzyteczne w leczeniu podwzgórza i bezplodnosci wynikajacej z niedo¬ mogi jajników. Ponadto mozna je stosowac w wa¬ runkach niedorozwoju gruczolów plciowych i im¬ potencji, i stymulowac spermatogeneze oraz produk¬ cje androgenu u samców. Paradoksalnie, wieksze dawki silniejszych i dlugodzialajacych analogów LH-RH wywoluja efekt przeciwny i blokuja owu- lacje u samic oraz tlumia spermatogeneze u sam¬ ców. Z tymi wplywami zwiazane jest obnizenie normalnego poziomu w ukladzie krazenia sterydów plciowych pochodzacych z gonad, obejmujac zmniejszenie wagi narzadów dodatkowych u sam¬ ców i samic. U zwierzat te paradoksalne wplywy sprzyjaja przyrostowi wagi w przypadku braku ograniczen w pozywieniu, stymuluja poronienia 126 655126 655 3 4 u zwierzat ciezarnych i ogólnie biorac, dzialaja ja¬ ko chemiczne czynniki sterylizujace.Naturalny czynnik uwalniajacy hormon LH-RH jest dziesieciopeptydem zawierajacym wystepujace •w przyrodzie aminokwasy (o konfiguracji L, z wy¬ jatkiem achiralnego aminokwasu — glicyny). Ich sekwencja jest nastepujaca: (piro)-Glu-His-Trp- -Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gyl-NH2. Badano wiele analogów tej naturalnej substancji i dla przewaza¬ jacej wiekszosci udowodniono, ze sa one niedosta¬ tecznie czynne biologicznie, aby byly uzyteczne kli¬ nicznie. Najznaczniejsza modyfikacje uzyskano za¬ mieniajac znajdujaca sie w pozycji 6 reszte Gly na D-aminokwas. Na przyklad, zastepujac reszte Gly znajdujaca sie w pozycji 6 przez D-Ala, D-Phe lub D-Trp uzyskano serie analogów LH-RH o zwiekszo¬ nej aktywnosci w stosunku do LH-RH. Opisal to M. Monahan i in., Biochem., 12, 4616 (1/973) dla [D Ala8]-LHRH; J.A. Vilchez-Martinez i in., Biochem.Biophys.Res.Comm. 59, 1226 (1974) dla [D Leu8] LHRH i des Gly*0 [DLeu6, ProNHEt»]LHRH; D.H.Coy i in., J.Med.Chem. 19, 423 (1976) dla [D-Phe*]- -LHRH oraz W.Vale i in., Clinical Endocrinology, 5 th. Supp., Blackwell Scientific Publications, Ox¬ ford, England (1|976), str.. 2615 i D.H.Coy i in., Bio- chem.Biophys.Res.Comm. 67, 576 (1979) dla [D-Trp6] LHRH.Ponadto, prócz znacznego zwiekszenia aktywnosci wyzej opisana droga zamiany w pozycji 6, mozna uzyskac dalsze zwiekszenie aktywnosci eliminujac Gly-NHa w pozycji 1/0, co prowadzi do uzyskania dziewieciopeptydu jako alkilo-, cykloalkilo- lub fluoroalkiloamidu, badz tez zastepujac Gly-NH2 przez a-azaglicynamid (patrz, na przyklad, M Fuji- no i in., Biochem.Biophys.Res.Comm., 49, 863 (1972), D.H.Coy i in., Biochem., 14, 1848 (1975) i A.S. Dutta i in., J.ehem.Soc.Perkin I, li979, 379).Zastapienie reszty leucyny znajdujacej sie w po¬ zycji 7 N-metyloleucyna prowadzi do zwiekszenia odpornosci na degradacje enzymatyczna (opisal to, na przyklad, N.Ling i in., Biochem.Biophys.Res.Comm., 63, 801 (1975)).Zastapienie reszty tryptofanu w pozycji 3 przez 3-(naftylo-l)-L-alanine prowadzi do wzrostu aktyw¬ nosci biologicznej (opisal to, na przyklad, K.U. Pra- sad i in., J.Med.Chem., 19, 492 (1976) oraz Y. Yabe, Chem.Pharm. Buli., 24 (12), 3149 (1|976)).Reszte tyrozyny w pozycji 5 mozna zastapic fe¬ nyloalanina lub 3-(pieciofluorofenylo-l)-L-alanina bez zmiany zasadniczej aktywnosci biologicznej, co opisali, na przyklad, N. Yanaihara i in., Biochem.Biophys.Res.Comm,, 52, 64 (1973) oraz D. Coy i in., J.Med.Chem., 16, 877 (1973).Znakomity przeglad sposobów syntezy polipepty- dów mozna znalezc w monografii J.M. Stewarta i J.D. Younga „Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co. San Francisco 1969 i publikacji J. Meinhofera „Hormonal Proteins and Peptides" Vol. 2, str. 46, Academic Press (New York) 1973 w odniesieniu do syntezy peptydów z udzialem fa¬ zy stalej oraz w publikacji E. Schrodera i K. Lub- kego „The Peptides", Vol 1, Academic Press (New York) 1965, w odniesieniu do klasycznej syntezy w roztworze.Na ogól, sposoby te polegaja na kolejnym przy¬ laczeniu jednego lub wiecej aminokwasów lub od¬ powiednio zablokowanych aminokwasów do rosna¬ cego tak lancucha peptydowego. Zazwyczaj grupe aminowa lub karboksylowa pierwszego aminokwa- B su blokuje sie odpowiednia grupa blokujaca. Na¬ stepnie zablokowany aminokwas lub jego pochod¬ na przylacza sie do obojetnego, stalego nosnika lub uzywa w roztworze dodajac do sekwencji nastepny aminokwas majacy komplementarna (aminowa lub 1° karboksylowa) grupe odpowiednio zablokowana w warunkach odpowiednich do utworzenia wiaza¬ nia amidowego. Potem usuwa sie grupe blokujaca z tej nowo dodanej pozostalosci aminokwasu, do¬ daje nastepny, odpowiednio zablokowany amino- 15 kwas. Po polaczeniu 'wszystkich pozadanych ami¬ nokwasów we wlasciwej kolejnosci usuwa sie, ko¬ lejno lub równoczesnie pozostale grupy blokujace (lub staly nosnik) i otrzymuje sie koncowy polipep- tyd. Przez prosta modyfikacje tego sposobu umoz- 20 liwia sie dodawanie do lancucha wiecej niz jedne¬ go aminokwasu równoczesnie. Na przyklad mozna sprzegac (w warunkach nie powodujacych racemi- zacji centrów chiralnych) zablokowany trójpeptyd z wlasciwie zablokowanym dwupeptydem uzysku- 25 jac, po odblokowaniu, pieciopeptyd.Szczególnie korzystnym sposobem wytwarzania peptydów jest ich synteza z udzialem fazy stalej.W tym szczególnie korzystnym sposobie grupe a-aminowa aminokwasu blokuje sie grupe wrazli- 30 wa na kwas lub zasade. Owe grupy blokujace po¬ winny byc stabilne w warunkach tworzenia wia¬ zania peptydowego i latwe do usuniecia bez des¬ trukcji lancucha peptydowego lub racemizacji cen¬ trów chiralnych tego lancucha. Do odpowiednich 35 grup blokujacych nalezy grupa IH-rzed.-butyloksy- karbonylowa (Boc), benzyloksykarbonylowa (Cbz)9 dwufenyloizopropyloksykarbonylowa, III-rzed.- -amyloksykarbonylowa, izobornyloksykarbonylo- wa, a, a-dwumetylo-3,5-dwumetoksybenzyloksykar- 40 bonylowa, o-nitrofenylosulfenylowa, 2-cyjano-(III- -rzed.butyloksy)karbonylowa, . 9-fluorenylometylo- ksykarbonylowa itp., zwlaszcza grupa Ill-rzed.-bu- tyloksykarbonylowa.Szczególnie korzystnymi grupami blokujacymi 43 boczne lancuchy sa: dla argininy — grupa p-tolue- nosulfonylowa, 4-metoksybenzenosulfonylowa, Cbz, Boc i adamantyloksykarbonylowa, dla tyrozyny — grupa benzylowa, o-bromobenzyloksykarbonylowa, 2,6-dwuchlorobenzylowa, rodnik izopropylowy, cy- w kloheksylowy, cyklopentylowy i grupa acetylowa; dla seryny — grupa benzylowa i czterowodoropira- nylowa, a dla histydyny — grupa benzylowa, p-to- luenosulfonylowa i 2^,4-dwunitrofenylowa.Aminokwas przylaczony jest do odpowiedniego 55 stalego podloza od strony atomu wegla. Do odpo¬ wiednich stalych nosników uzytecznych w stosun¬ ku do reagentów w warunkach kolejnych reakcji kondensacji i odblokowywania oraz nierozpuszczal¬ ne w stosowanych mediach. Odpowiednimi nosnika- 60 mi stalymi sa chlorometylopolistyren — polimer dwuwinylobenzenu, hydroksymetylopolistyren — po¬ limer dwuwinylobenzenu, zwlaszcza chlorometylo¬ polistyren — polimer dwuwinylobenzenu (1%).W specjalnym przypadku, gdy koncówke C zwiaz- 65 ku stanowi glicynoamid, szczególnie uzytecznym12C €55 5 « nosnikiem jest benzhydryloaminopolistyren — poli¬ mer dwuwinylobenzenowy opisany przez P. Rivalle i in., Helv.Chim.Acta, 54, 2772 (1971). Polaczenie z zywica typu chlorometylopolistyren — polimer dwuwinylobenzenowy realizuje sie przez reakcje aminokwasu zablokowanego przy atomie azotu w pozycji a, zwlaszcza Boc-aminokwasu, takiego jak jego sól cezowa, czterometyloamoniowa, trójetylo- amoniowa, 4,5-dwuazabicyklo[5.4.0]-undecen-5-owa lub "podobne, w etanolu, acetonitrylu, N,N-dwume- tyloformamidzie (DMF), zwlaszcza soli cezowej w DMF, z zywica chlorometylowa w pod¬ wyzszonej temperaturze, na przyklad miedzy okolo 40 a 60°C, korzystnie okolo 50°C, prowadzo¬ na w czasie od okolo 12 do 48 godzin, korzystnie okolo 24 godzin. N«-Boc-aminokwas laczy sie z zy¬ wica benzhydryloaminowa, za pomoca N'N'-dwucy- kloheksylokarbóndwuimidu (DCC) 1-hydroksybenz- triazolu (HBT) w ciagu od okolo 2 do okolo 24 go¬ dzin, korzystnie okolo 1,2 godzin, w temperaturze miedzy okolo 10 a 50°C, korzystnie 25°C, w rozpu¬ szczalniku, takim jak dwuchlorometan lub DMF, korzystnie w dwuchlorometanie. Sprzeganie zablo¬ kowanych aminokwasów mozna prowadzic w do¬ brze znanym automatycznym urzadzeniu do synte¬ tyzowania pólipeptydów. Grupy blokujace atomu azotu w pozycji a mozna usunac w obecnosci, na przyklad, roztworu kwasu trójfluorooctowego w chlorku metylenu, chlorowodoru w dioksanie, chlorowodoru w kwasie octowym lub w innym roz¬ tworze mocnego kwasu, korzystnie 50% roztworze kwasu trójfluorooctowego w dwuchlorometanie w temperaturze bliskiej temperatury otoczenia. Ko¬ rzystne jest stosowanie kazdego zablokowanego aminokwasu w nadmiarze okolo 2,5 moli i sprze¬ ganie w dwuchlorometanie, mieszaninach dwuchlo- rometan/DMF, zwlaszcza w chlorku metyle¬ nu w temperaturze Otoczenia. Czynnikiem sprzega¬ jacym jest zwykle DCC w dwuchlorometanie ale mozna tez stosowac N,N-dwuizopropylokarbóndwu- imid lub inny karbondwuimid, sam lub w obecno¬ sci HBT, N-hydroksysukcynimidu, innych N-hydro- ksyimidów lub oksymów. Alternatywnie, mozna uzyc aktywne estry zablokowanych aminokwasów (np. p-nitrófenylowy, pieciofluorofenylowy) lub sy¬ metryczne bezwodniki. ^ Przy koncu syntezy z udzialem fazy stalej cal¬ kowicie zablokowany polipeptyd odszczepia sie od zywicy.Byloby pozadane otrzymanie kolejnych analogów LH-RH, które wykazywaly nawet wyzsza aktyw¬ nosc biologiczna od dotychczas opisanych i które moznaby stosowac klinicznie zwierzetom i ludziom.Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania nowych dziewieciopeptydowych i dzie- sieciopeptydowych pochodnych LH-RH zawieraja¬ cych w pozycji 6 niektóre lipofilowe D-aminokwa¬ sy. Opisane sa rózne sposoby stosowania tych zwiaz¬ ków i zawierajace je srodki lecznicze. Mówiac do¬ kladniej, przedmiotem wynalazku jest sposób wy¬ twarzania pochodnych LH-RH posiadajacych w po¬ zycji 6 reszty specyficznych, nienaturalnych D-ami- nokwasów zawierajacych lipofilowe reszty karbo- cykliczne, zwlaszcza reszty zawierajace dwa lub wiecej aromatyczne pierscienie karbocykliczne (lub uwodornione) albo pierscien fenylowy (lub cyklo- heksylowy) podstawiony grupami alkilowymi.Przy opisywaniu niniejszego wynalazku, dla wy¬ gody uzyto dla róznych znanych aminokwasów skróty przyjete w chemii peptydów, zalecane przez Komisje Nomenklatury Biochemicznej IUPAC-IUB, Biochemistry, 11, 1726 (1972), dotyczace L-amino- kwasów z wyjatkiem achiralnego aminokwasu gli¬ cyny i, z drugim wyjatkiem aminokwasu w pozy¬ cji 6 oznaczonego przez X. Wszystkie sekwencje aminokwasów napisane sa tu zgodnie z ogólnie przyjeta konwencja, przy czym aminokwasy zakon¬ czone atomem N sa po lewej stronie, a zakonczo¬ ne atomem C sa po prawej stronie.Termin „dopuszczalne w lecznictwie sole" ozna¬ cza sole, które maja pozadana aktywnosc biologicz¬ na zwiazków wyjsciowych i nie wywoluja zadnego niepozadanego efektu toksykologicznego. Przyklada¬ mi takich soli sa sole addycyjne z kwasami nie¬ organicznymi, takimi jak na przyklad kwas chloro¬ wodorowy, bromowodorowy, siarkowy, fosforowy, azotowy itp., sole addycyjne z kwasami organicz¬ nymi, takimi jak na przyklad kwas octowy, szcza¬ wiowy, winowy, bursztynowy, maleinowy, fumaro¬ wy, glukonowy, cytrynowy, jablkowy, askorbinowy, benzoesowy, garbnikonowy, cytrynowy, 4,4'-metyle- nodwu(3-hydroksynaftalenokarboksylowy-2) (embo- nowy), alginowy, poliglutaminowy, kwasy naftale- nosulfonowe, kwas poligalakturonowy, sole wielo- wartosciowych kationów metali, takich jak cynk, wapn, bizmut, bar, magnez, glin, miedz, kobalt, ni¬ kiel, kadm itp., albo tez sole kationów organicz¬ nych utworzonych z N,N'-dwubenzyloetylenodwu- aminy lub etylenodwuaminy, badz tez kombinacje soli addycyjnych z kwasami i soli z kationami jak na przyklad sól taninianu cynku.Termin „nizsza grupa alkilowa" oznacza prosty lub rozgaleziony lancuch weglowodorowy zawiera¬ jacy 1—4 atomów wegla, taki jak, na przyklad, grupa metylowa, etylowa, n-propylowa, izopropylo- wa, n-butylowa, izobutylowa, H-rzed.-butylowa i Ill-rzed.-butylowa. Termin „grupa cykloalkilowa" oznacza nasycony pierscien weglowodorowy zawie¬ rajacy 3i—6 atomów wegla, na przyklad, grupe cy- klopropylowa, cyklobutylowa, cyklopentylowa i cy- kloheksylowa. Termin „nizsza grupa fluoroalkilo- wa" oznacza nizsza grupe alkilowa, w której co najmniej jeden atom wodoru jest zastapiony ato¬ mami fluoru, taka jak na przyklad, grupa trójfluo- rometylowa, pieciofluoroetylowa, 2,2,2-trójfluoro- etylowa.W niniejszym opisie „grupa naftylowa" obejmuje grupe naftylowa-1 i -2, „grupa antrylowa" obejmu¬ je grupe antrylowa-1, -2 i -9, „grupa fluorenylowa" obejmuje grupe fluorenylowa-2, -3, -4 i -9, „grupa fenantrylowa" obejmuje grupe fenantrylowa-2, -3 i -9, a „grupa adamantylowa" obejmuje grupe ada- mantylowa-1 i -2.Korzystnymi zwiazkami otrzymywanymi sposo¬ bem wedlug niniejszego wynalazku sa takie zwiaz¬ ki o wzorze wyzej przedstawionym, w którym X oznacza grupe 3-(naftylo-2)-D-alanylowa lub 3- ^2^,6-trójmetylofenylo)-D-alanyJowa, Z oznacza glicynamid lub NHEt, V oznacza grupe tryptofylo- wa lub fenyloalahylowa, W oznacza grupe tyrozy- 10 15 20 25 30 55 40 45 50 55 60 65126 655 7 a Iowa a Y oznacza grupe leucylowa lub N-metylo- leucylowa, a zwlaszcza (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -3- ro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-trójmetylofenylo)- -D-alanylo-Leu-Arg-Pro-Gyl-NH2, (piro)Glu-His- -Trip-Ser-Tyr-3-{naftylo-2-)-D-alanylo-Leu-Arg- -Pro-NHEt i (ipiroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(naftylo- -2|)-D-alanylo-N-metylo-Leu-Arg-Pro-NHEt i ich sole dopuszczalne w lecznictwie.Szczególnie korzystny jest zwiazek o sekwencji Glu-Hiis-Trp-Ser-Tyr-3-(naftylo-2)-D-alanylo- -Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 i jego sole.Zwiazki otrzymane sposobem wedlug wynalazku, a zwlaszcza ich sole, odznaczaja sie niespodziewa¬ nie silna i dlugotrwala aktywnoscia agonistyczna LHRH w porównaniu z poprzednio najsilniejszymi agonistami LH-RH, a mianowicie w porównaniu z (piro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Ser-Arg-Pro- -Gly-NH2 i odpowiednim proliloetyloamidem. Przy7 blizona miara aktywnosci jest zdolnosc do czescio¬ wego lub calkowitego stlumienia rui w normal¬ nym cyklu doroslych szczurów plci zenskiej (ozna¬ czona w okresie 2 tygodni) po wprowadzeniu droga iniekcji podskórnej dwa razy dziennie.Inne badania biologiczne przeprowadzone z ana¬ logami LH-RH i ze zwiazkami otrzymanymi sposo¬ bem wedlug niniejszego wynalazku obejmowaly: a) wywolanie jajeczkowania u szczurów plci zen¬ skiej w okresie dioestrum lub proestrum droga in- jekcji podskórnej (Rippel i in., Proc.Soc.Exp.Biol Med., 148, 1193 (1975)), b) uwalnianie LH i FSH przez zdyspergowane kultury komórek przysadki mózgowej, oznaczone metoda radioimmunologiczna " c) uwalnianie LH i FSH do ukladu krazenia obwo¬ dowego pozbawionych jajników, traktowanych ste¬ rydami szczurów w odpowiedzi na iniekcje dozyl¬ na mierzona metoda radioimmunologiczna (Arimu- ?ra i in., Endocrinology, 90, 1|63 (1972)).W badaniach bardziej zaawansowanych aktyw¬ nosc tych zwiazków mozna wykazac in vivo przez obnizenie spermatogenezy i poziomu testosteronu w ukladzie krazenia i w jadrze oraz znaczne zmniejszenie rozmiaru prostaty u psów cierpiacych na lagodny przerost sterczowy.W wyniku badan okazalo sie, ze zwiazki takie moga znalezc zastosowanie w wielu róznych sy¬ tuacjach, w których regulacja LH i FSH lub bez¬ posrednie dzialanie gruczolów plciowych jest waz¬ ne, obejmujace zastosowania fizjologiczne (skutki malych dawek), takie jak wywolane jajeczkowania w przypadku bezplodnosci nie wywolanej niedomo¬ ga jajników u ssaków plci zenskiej, leczenie bez¬ plodnosci wystepujacej na skutek niewystarczaja¬ cej aktywnosci cialka zóltego u kobiet, leczenie bezplodnosci u samic i samców ludzi wynikajacej z niedostatecznego wydzielania hormonów gonado- tropowych i plciowych, leczenie syndromu torbie¬ lowaty jajnik (nadmierna pobudliwosc plciowa u bydla, wywolanie lub zwiekszenie pobudliwosci plciowej lub leczenie impotencji) ozieblosci, oraz zastosowanie paradoksalne (skutki wiekszych da¬ wek), taki jak zapobieganie ciazy u samic, stlumie¬ nie lub opóznienie owulacji, wywolanie porodu, synchronizacja owulacji, zatrzymanie, rui, romo- wanie wzrostu" u zwierzat plci zenskiej, luteoliza — wywolanie miesiaczki, wczesne wywolanie poronie¬ nia w pierwszym trimestrze, leczenie endometrio- zy, leczenie guzów i torbieli sutków, leczenie zespo¬ lu wielotorbielowego jajnika czenie raka macicy, leczenie lagodnego przerostu sterczowego i raka prostaty, przeciwdzialanie za¬ plodnieniu u samców, leczenie chorób wywolanych nadmierna produkcja hormonów gruczolów plcio¬ wych u osobników obu ploi, czynnosciowa kastra¬ cja zwierzat plci meskiej przeznaczonych do produ¬ kowania zywnosci oraz zatrzymanie wydzieliny w okresie proestrum.Ponadto, zwiazki te, podobnie do opisywanych wczesniej zwiazków LH-RH, niespodziewanie moga znalezc zastosowanie jako srodki wywolujace po¬ ronienia na drodze inhibitowania ilosci krazacej HCG i majac bezposredni wplyw na lozysko. Wplyw na lozysko moze sugerowac ich stosowanie jako srodków przeciwko choriocarcinoma.Zwiazki otrzymane sposobem wedlug wynalazku (wlaczajac w to nie opisane tu analogi LH-RH), ma¬ ja zastosowanie do zahamowania owulacji (tj. za¬ pobieganie ciazy) u samic, w leczeniu endometrio- zy, w leczeniu lagodnego przerostu sterczowego i do zahamowania spermatogenezy (tj. zapobieganie za¬ plodnieniu) u samców, polegajace na podawaniu choremu odpowiedniej ilosci zwiazku otrzymanego sposobem wedlug wynalazku lub tez srodka leczni¬ czego zawierajacego ten zwiazek.W praktyce sposób stosowania polega na podaniu osobnikowi, dla którego jest to konieczne lub po¬ zadane odpowiedniej ilosci zwiazku otrzymanego sposobem wedlug wynalazku lub srodka lecznicze¬ go ten zwiazek zawierajacego. Zwiazki te lub srod¬ ki mozna podawac jakakolwiek droga w zaleznosci od przeznaczenia, taka jak droga doustna, pozajeli¬ towa (w tym podskórna, domiesniowa i dozylna), dopochwowa (szczególnie przy zapobieganiu zaplod¬ nieniu) doodbytnicza, dopoliczkowa (w tym — pod jezyk) lub donosowa. Najodpowiedniejszy sposób podania, w kazdym przypadku zalezy od celu uzy¬ cia, rodzaju srodka, leczonego osobnika i oceny le¬ karza. Zwiazek lub srodek leczniczy mozna rów¬ niez podawac w postaci wszczepionych lub odklada¬ nych w organizmie leków o powolnym uwalnianiu substancji czynnej, jak to opisano szczególowiej po¬ nizej.Zazwyczaj, w wyzej opisanych zastosowaniach tzw. „paradoksalnych" lub duzej dawki korzystnie jest podawac skladnik aktywny w ilosci od okolo 0,01 do 100 jAg/kg ciezaru ciala dziennie, zwlaszcza od okolo 0,1 do 5(,0 ng/kg ciezaru ciala dziennie.Dawka ta moze byc podana jednorazowo, moze byc podzielona na kilka czesci lub tez podana poprzez powolne uwalnianie w celu uzyskania najskutecz¬ niejszego dzialania.Dokladna dawka i tryb podawania tych zwiaz¬ ków i srodków beda uzaleznione od indywidualne¬ go osobnika poddanego leczeniu, od rodzaju lecze¬ nia, od stopnia cierpienia lub potrzeby i oczywi¬ scie, od oceny lekarza. Zazwyczaj, podawanie poza¬ jelitowe wymaga mniejszych dawek innymi sposo¬ bami, które sa bardziej uzaleznione od absorpcji.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalaz¬ lo ue 20 25 30 35 40 45 50 55 60126 655 9 10 ku sa dobrze tolerowane i stosunkowo nietoksycz¬ ne. LD50 dla reprezentatywnych zwiazków poda¬ nych podskórnie myszom wynosi ponad 40 mg/kg, a wiec znacznie wiecej niz wynosi najwieksza daw¬ ka stosowana przy leczeniu, podana powyzej.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wyna¬ lazku stosuje sie w postaci srodków leczniczych za¬ wierajacych jako skladnik aktywny zwiazek otrzy¬ many sposobem wedlug wynalazku oraz dopuszczal¬ ny w lecznictwie, nietoksyczny nosnik. Jak wspom¬ niano wyzej, srodki takie mozna przygotowac w po¬ staci nadajacej sie do uzycia pozajelitowego (pod¬ skórnego, domiesniowego lub dozylnego), zwlaszcza w postaci cieklych roztworów lub zawiesin, do uzy¬ cia dopochwowego lub doodbytniczego, zwlaszcza w postaci pólstalych kremów i czopków, do uzycia doustnego lub dopoliczkowego, zwlaszcza w posta¬ ci tabletek lub kapsulek, badz tez do uzycia dono- ;sowego, zwlaszcza w postaci proszków, kropli do nosa lub aerozolu.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalaz¬ ku, stosowane w postaci srodków leczniczych moz¬ na wygodnie podawac w dawkach jednostkowych, które przygotowuje sie znanymi sposobami, na przyklad, opisanymi w Remington^ Pharmaceuti- cal Sciences, Mack Publishmg Company, Easton, PA., 1070. Srodki nadajace sie do podawania poza¬ jelitowego moga zawierac jako zwykle zarobki, ja¬ lowa wode lub solanke, glikole poliksyalkilenowe, takie jak glikol polioksyetylenowy, oleje pochodze¬ nia roslinnego, uwodornione naftaleny itp. Srodki w postaci nadajacej sie do podawania dopochwo^ wego i doodbytniczego, na przyklad czopki, moga zawierac jako zarobki, na przyklad, glikole polio- ksyalkilenowe, wazeline, maslo kakaowe itp. Srod¬ ki w postaci nadajacej sie do inhalacji moga byc w postaci stalej i zawierac jako zarobki, na przy¬ klad, laktoze lub tez moga byc roztworami wod¬ nymi lub oleistymi do podawania w postaci kropli.Typowymi zarobkami w srodkach do podawania dopoliczkowego sa cukry, stearynian wapnia, stea¬ rynian magnezu, wstepnie zzelowana skrobia itp.Szczególnie pozadane jest dostarczanie choremu zwiazków otrzymanych sposobem wedlug wynalaz¬ ku przez dluzszy okres, na przyklad od 1 tygodnia do 1 roku w postaci pojedynczych dawek. Mozna tez stosowac metode powolnego uwalniania, sklado¬ wania lub wszczepiania. Na przyklad, srodek moze zawierac dopuszczalna w lecznictwie, nietoksyczna sól zwiazku, która slabo sie rozpuszcza w cieczach ustrojowych, na przyklad, sól addycyjna z kwasem wielozasadowym, takim jak kwas fosforowy, siar¬ kowy, cytrynowy, winowy, garbnikowy, embonowy, alginowy, poliglutamihowy, naftalenomono- i dwu- sulfonowy, poligalakturonowy itp. lub sól z katio¬ nem wielowartosciowego metalu takiego jak cynk, wapn, bizmut, bar, magnez, glin, miedz, kobalt, ni¬ kiel, kadm itp. lub z kationami organicznymi utwo¬ rzonymi, na przyklad, z N,N'-dwubenzyloetyleno- dwuaminy lub etylenodwuaminy badz tez sól ad¬ dycyjna z kwasem i kationem, na przyklad sól ta- ninianu cynku. Ponadto, zwiazki wytworzone spo¬ sobem wedlug wynalazku, lub, korzystnie, odpo¬ wiednio nierozpuszczalne sole takie jak wyzej opi¬ sane mozna stosowac w postaci zelu, na przyklad zelu monostearynianiu glinowego z, na przyklad olejem sezamowym, odpowiednim do iniekcji. Ko¬ rzystne sa sole cynku, sole taninianu cynku, sole embonianu. Inny rodzaj srodka wolnouwalniajace- go skladnik aktywny do iniekcji moze zawierac zwiazek lub sól zdyspergowane lub zakapsulkowa- ne w wolno rozkladajacym sie, nietoksycznym nie- antygenicznym polimerze, takim jak na przyklad polimer kwasu mlekowego i kwasu glikólowego opisany w opisie patentowym Stanów Zjednoczo¬ nych Ameryki nr 3773919; Zwiazki, lub korzystniej odpowiednio nierozpuszczalne sole, takie jak wyzej opisane moga byc formowane w peletki w szkiele¬ cie cholesterolowym, zwlaszcza do podawania zwie¬ rzetom. Dobrze znane w literaturze sa równiez in¬ ne formy powolnego uwalniania, skladowania lub wszczepiania, na przyklad liposomy (patrz, na przy¬ klad „Sustained and Controlled Release Drug Deli- very Systems", J.R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc. New York, 1978). Szczególne referencje w od¬ niesieniu do zwiazków typu LH-RH mozna znalezc, na przyklad, w opisie patentowym Stanów Zjedno¬ czonych Ameryki nr 4010125.Ponizej podano sklad i sposób wytwarzania ty¬ powych srodków farmaceutycznych, zawierajacych jako skladnik aktywny analog LH-RH otrzymywa¬ ny sposobem wedlug niniejszego wynalazku, na przyklad -D-alanylo-Leu-Arg-Pro-Gly-NHj lub jego dopu¬ szczalna w lecznictwie sól, na: przyklad sól addy¬ cyjna z kwasem octowym, sól cynkowa, sól tani¬ nianu cynku itp.A. Tabletki do podawania dopoliczkowego (na przyklad pod jezyk) zawieraja 50,0 \ig analogu LH- -RH, 96,0 mg dajacego sie sprasowac cukru USP i 4,0 mg stearynianu wapnia albo 30,0 |ig analogu LH-RH, 98,5 mg dajacego sie sprasowac cukru, USP i 1,5 mg stearynianu magnezu, albo 25,0 [*g analogu LH-RH, 88,5 mg mannitolu,, USP, 1,5 mg stearynianu magnezu i 10,0 mg wstepnie zzelowanej skrobi, USP badz tez 200,0 \ig analogu LH-RH, 83,3 mg laktozy USP, 15,0 mg wstepnie zzelowanej skro¬ bi, USP i 1,5 mg stearynianu magnezu.Tabletki otrzymuje sie rozpuszczajac analog LH- -RH w wodzie, w takiej ilosci by uzyskac mokre granulki po zmieszaniu z czescia cukru jako zarób- ka. Nastepnie granulki sie suszy w suszarni taco¬ wej lub fluidalnej. Wysuszone granulki przesiewa sie, aby pozbyc sie wiekszych agregatów i miesza z pozostalymi skladnikami. Na koncu granulki pra¬ suje sie w standardowej tabletkarce w tabletki o odpowiednim ciezarze.Mozna równiez otrzymywac tabletki irmym nie¬ co sposobem, w którym do wszystkich wyzej poda¬ nych kompozycji dodaje sie 0,01i% zelatyny, USP.Zelatyne rozpuszcza sie jako pierwsza, a nastep¬ nie analog LH—RH. Pozostale etapy zostaja bez zmian.Sklad srodka leczniczego podany jako ostatni mo¬ ze sluzyc równiez do otrzymywania tabletek do po¬ dawania doustnego.B. Lek o dlugotrwalym dzialaniu w postaci da¬ jacej sie wstrzykiwac domiesniowo zawiera: 1) 1,0 mg analogu LH-RH, 20,0 mg mtoostearynianu gli¬ nu, USP oraz olej sezamowy do 1,0 ml, albo 2) ana- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 00126 655 ii 12 logu LH-RH i &9% kopolimeru glikolid/laktyd w stosunku 25/75 o liczbie lepkosciowej 0,5.Kompozycje 1 formuje sie w lek mieszajac mo- nostearynian glinu z olejem sezamowym w tempe¬ raturze 125°C az do uzyskania przezroczystego zól¬ tego roztworu. Nastepnie calosc poddaje sie stery¬ lizacji w autoklawie i chlodzi, z kolei dodaje sie aseptycznie analog LH-RH ucierajac. Szczególnie korzystne sa w tym przypadku sole zle rozpuszczal¬ ne analogów LH-RH jak na przyklad sole cynku, sole taninianu cynku, sole ambonianu itp. Lek ten odznacza sie wyjatkowo dlugotrwalym dzialaniem.Kompozycje 2 formuje sie w rozkladalne biolo¬ gicznie polimeryczne mikrokapsulki. Mikrokapsulki (0—150| \i) zawiesza sie w mieszaninie zawieraja¬ cej 5,0% dekstrozy, 0,5% soli sodowej CHC, 0,9% al¬ koholu benzolowego, 0,1% Tween 80 i oczyszczona wode do 100%. 25 mg mikrokapsulek mozna zawie¬ sic w 1,0 ml vehiculum.C. Wodny roztwór do wstrzykiwania domiesnio¬ wego, zawiera 25 mg analogu LH-RH, 5 mg zela¬ tyny niearitygenicznej i wode do iniekcji do 100 ml.Przygotowuje sie go rozpuszczajac zelatyne i ana- logf LH-RH w wodzie do iniekcji, i sterylizujac przesaczony roztwór.D. Wodny roztwór do podawania donosowego za¬ wiera 250 mg analogu LH-RH, 5 g dekstrozy, 0,9 g alkoholu benzylowego i wode oczyszczona do 100 ml. Otrzymuje sie go przez rozpuszczenie analogu LH-RH, dfekstrozy i alkoholu benzylowego w oczy¬ szczonej wodzie i uzupelnienie do zadanej objetosci.E. Leki do podawania doodbytniczego, w postaci czopków zawieraja 50Q fig analogu LH-RH i 20,0 g Witepsolu H15. Otrzymuje sie je mieszajac doklad¬ nie analog LH-RH ze stopionym Witepsolem HIS i wlewajac do 2 g form.Sposób wytwarzania nowych pochodnych dziewie- cio- i dziesieciapeptydowych o wzorze: (piro)Glu- -His-V-Ser-W-X-Y-Arg-Pro-Z, w którym wszystkie symbole maja poprzednio podane znaczenie polega na tym, ze zwiazek o wzorze (piro)-Glu-His(P1)a-V- -S^r(P*b-W V, W, X i Y maja poprzednio podane znaczenie, a Z' ma znaczenie podane dla Z lub oznacza grupe glicylowa, P1, P*, P« i F* oznaczaja grupy blokujace w lancuchach bocznych, przy czym P1 oznacza gru¬ pe benzylowa, p-toluenosulfonylowa lub 2,4-dwuni- trofenylowa, £* oznacza grupe benzylowa lub tetra- hydropiranylowa, P* oznacza grupe benzylowa, o- -bromobenzyloksykarbonylowa, 2,6-dwuchloroben- zylowa, izopropylowa, cyklóheksylowa, cyklopenty- lowa lub acetylowa gdy W oznacza grupa tyrozylo- wa, a P4 oznacza grupe nitrowa, p-toluenosulfony¬ lowa, 4-metoksybenzenosulfonylowa, benzyloksy- karbonylowa, Ill-rz. — butyloksykarbonylowa lub grupe adamantyloksykarbonylowa, S oznacza staly nosnik skladajacy sie z kopolimeru ewentualnie podstawionego styrenu z niewielka iloscia srodka sieciujacego takiego jak dwuwinylobenzen, a kazdy z symboli a, b, ci d oznacza liczbe 0 lub 1, trak¬ tuje sie w temperaturze —10 do + 10°C srodkiem odszczepdajacym grupy blokujace wybranym z gru¬ py obejmujacej kwasy organiczne i nieorganiczne, fluorowodór, wodór i sód w cieklym amoniaku, a gdy d w powyzszym wzorze oznacza lb zwiazek wyjsciowy lub produkt otrzymany w wyniku od- szczepienia od niego grup blokujacych poddaje sie dzialaniu srodka odszczepiajacego staly nosnik, wy¬ branego z grupy obejmujacej nizsza alkiloamine, nizsza fluoroalkiloamine i amoniak, poprzedzonemu ewentualnie traktowaniem nizszym alkanolem, wy¬ twarzajac zadana pochodna peptydowa lub jej sól, i ewentualnie otrzymany produkt przeksztalca sie w farmaceutycznie dopuszczalna sól przez trakto¬ wanie kwasem organicznym lub nieorganicznym, lub przeksztalca otrzymana sól przez traktowanie innym kwasem organicznym lub nieorganicznym, w farmaceutycznie dopuszczalna sól addycyjna z kwasem, lub rozklada sie otrzymana sól przez traktowanie nieorganiczna zasada z wytworzeniem wolnego polipeptydu. • Jezeli polaczenie z zywicznym podlozem ma cha¬ rakter wiazania estru benzylowego, trzeba je roz¬ szczepiac przez aminolize za pomoca alkiloaminy lub fluoroalkiloaminy dla peptydów zakonczonych grupa zawierajaca C pochodzaca od proliny lub za pomoca, na przyklad mieszanin amoniak/metanol lub amoniak/etanol dla peptydów zakonczonych grupa zawierajaca C pochodzaca od glicyny, w tem¬ peraturze okolo 25°C w ciagu okolo 1,2 do 24 go¬ dzin, korzystnie okolo 18 godzin. Alternatywnie, peptyd mozna odszczepic od zywicy przez trans- estryfikacje, np. metanolem, i nastepujaca po niej aminolize. Zablokowany peptyd mozna wówczas oczyscic chromatograficznie na zelu krzemionko¬ wym. Grupy blokujace z lancuchów bocznych poli¬ peptydu usuwa sie traktujac produkt aminolizy, na przyklad, bezwodnym, cieklym fluorowodorem w obecnosci anizolu lub innego srodka wychwy¬ tujacego grupy karboniowe, kompleksem fluorowo¬ dór/pirydyna, trój(trójfluoroacetylo)borem lub kwa¬ sem trójfluorooctowym, przez redukcje wodorem w obecnosci palladu na weglu lub poliwinylopiroli- donie, lub przez redukcje sodem w cieklym amo¬ niaku, korzystnie cieklym fluorowodorem i anizo- lem w temperaturze od okolo —10°C do okolo 10°C, korzystnie okolo 0°C, w ciagu, na przyklad, od okolo 15 minut do 1 godziny, korzystnie okolo 30 minut. W przypadku peptydów zakonczonych gli¬ cyna na zywicy benzyhydryloaminowej etapy roz¬ szczepiania i odblokowania mozna polaczyc w je¬ den, stosujac ciekly fluorowodór i anizol. Calkowi¬ cie odblokowany polipeptyd oczyszcza sie etapami chromatograficznie stosujac dowolny lub wszystkie z wymienionych tu srodków: wymiana jonowa na slabo zasadowej zywicy w formie octanowej, hy¬ drofobowa chromatografia adsorpcyjna na zywicy polistyrendwuwinylobenzen (na przyklad Amberlite XAD); chromatografia adsorpcyjna na zelu krze¬ mionkowym, chromatografia jonowymienna na kar- boksymetylocelulozie, chromatografia podzialowa, na przyklad na Sephadex G-.25, lub rozdzial w prze- ciwpradzie, wysokosprawna chromatografia cieczo¬ wa (HPLC), zwlaszcza z odwrócona faza na kolum¬ nie wypelnionej oktylo- lub oktadecylo-sililo-krze- mionka.Jezeli w pozycji 6 znajduje sie racemiczny ami¬ nokwas, wówczas rozdziela sie diastereomeryczne produkty koncowe, dziewiecio- lub dziesieciopep- tydy, wyodrebnia pozadany peptyd zawierajacy D- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60126 655 13 H \ -aminokwas w pozycji 6 i oczyszcza, korzystnie wy¬ zej opisanym sposobem chromatograficznym.Peptydy z koncówkami C pochodzacymi od ami¬ dów azaglicyny wytwarza sie korzystnie, klasycz¬ nym, roztworowym sposobem syntezy przy uzyciu znanych peptydów posrednich. Szczególowo opisano to w przykladzie VIII.Korzystne peptydy o wzorze: (piro)-Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Arg-Pro-Z,w którym Z oznacza glicynoamid a pozostale symbole maja poprzednio podane znaczenie zgodnie z wynalazkiem wytwarza sie w ten sposób, ze zwiazek o wzorze (piro)-Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Arg którym P4 oznacza grupe nitrowa lub p-toluenosul- fonylowa, V, W, X, Y i S maja znaczenie podane wyzej, a Z' oznacza grupe glicylowa, traktuje sie fluorowodorem stanowiacym srodek odszczepiajacy grupy blokujace i amoniakiem, stanowiacym sro¬ dek odszczepiajacy staly nosnik, przy czym odszcze- pianie stalego nosnika poprzedza odszczepianie grup blokujacych.Ponizsze przyklady umozliwiaja lepsze zrozumie¬ nie istoty wynalazku. Nie stanowia one jakiegokol¬ wiek ograniczenia jego zakresu i sa tylko repre¬ zentatywna ilustracja wynalazku, przy czym przy¬ klady I—XII ilustruja sposób wytwarzania nowych peptydów, a przyklady XIII i XIV wyniki badan aktywnosci biologicznej tych peptydów.Przyklad I. Do wysuszonej w piecu kolby za¬ wierajacej 0,1 litra absolutnego alkoholu (destylo¬ wanego znad etanolami magnezu) dodaje sie 1,52 g metalicznego sodu. Po zakonczeniu wydzielania sie wodoru do roztworu dodaje sie 10,21i g 2-acetami- do-2-cyjanooctanu etylu i 13,26 g 2-bromometylo- . naftalenu i calosc utrzymuje w stanie wrzenia w ciagu 1 godziny. Po ochlodzeniu usuwa sie eta¬ nol pod zmniejszonym cisnieniem, a pozostalosc miesza sie z octanem etylu. Warstwe organiczna przemywa sie dwukrotnie 50 ml wody, raz 50 ml nasyconego roztworu chlorku sodowego i suszy nad siarczanem magnezu. Nastepnie roztwór sie saczy, rozpuszczalnik odpedza pod zmniejszonym -cisnie-, niem a pozostalosc hydrolizuje w 100 ml stezonego kwasu chlorowodorowego utrzymujac calosc w sta¬ nie wrzenia w ciagu 2 godzin.Mieszanine po hydrolizie oziebia sie i wytracony osad surowego produktu odsacza. Surowy produkt rozpuszcza sie ponownie w 500 ml goracej wody zawierajacej 5 ml stezonego kwasu chlorowodoro¬ wego potraktowanego weglem drzewnym i dopro¬ wadza pH roztworu do wartosci 6 przy uzyciu ste¬ zonego wodorotlenku amonowego. Osad odsacza sie i suszy pod zmniejszonym cisnieniem uzyskujac 1-1*3 g czystej 3-(naftylo-2)-D,L-alaniny o tempera¬ turze topnienia 230-n232°C.Postepujac zasadniczo w sposób opisany powyzej lecz stosujac zamaist' 2-bromometylonaftalenu: 1- -bromometylonaftalen, 9-bromometyloantracen, 9- -bromometylofluoren, 2-bromometylofluoren, 2-bro- mometyloantracen, 1-bromometyloantracen, a-chlo- roizoduren, 4-bromometylodwufenyl, 1-bromomety- loadamantan, 3-bromometylofenantren, 1-chlorome- tylo-2,4,6-trój{n-butylo)benzen i 1-chlorometylo- -2,3,4,5,6-pieciometylobenzen w ilosci stechiome- trycznie równowaznej otrzymuje sie, odpowiednio, takie aminokwasy jak 3-(naftylo-l)-D,L-alanina o temperaturze topnienia 185—187°C 3-(antrylo-9)- -D,L,-alanina o temperaturze topnienia 290°C (sól HC1), 3-(fluorofenylo-9)-D,L-alanina, 3-(fluorofeny- 5 lo-2)-D,L-alanina o temperaturze topnienia 264— 269°C, 3-(antrylo-2)-D,L-alanina, 3-{antrylo-l)-D,L- -alanina, 3-(2,4,6-trójmetylofenylo)-D,L-alanina o temperaturze topnienia 235—237°C, 3-(dwufenylilo- 4)-D,L-alanina o temperaturze topnienia 290°C, 3- io - -alaniina, 3-[2,4,6-trój(n-butylo)fenylo]-D,L-alanina i 3-<2,3,4,5,6-pieciometylofenylo)-D,L-alanina.Przyklad II. Roztwór 18,2 g 1,1-dwufenylo- etylenu, 25,3 g a-metoksy-N-benzyloksykarbonylo- 15 glicynianu metylu i 1,5 g kwau naftalenosulfonowe- go-2 w 300 ml suchego benzenu utrzymuje sie w stanie wrzenia w ciagu 2 dni. Surowy produkt oczyszcza sie na kolumnie z kwasem krzemowym stosujac stopniowe wymywanie CH2CI4 do CH2Cls/ 20 /EtOAc (18:1). Oczyszczony 2-[l-/2,2-dwufenyloetyle- nylo)]-N-benzyloksykarbonyloglicynian metylu hy¬ drolizuje sie do odpowiedniego kwasu roztworem 10,9 g KOH w 350 ml 10% wodnego roztworu meta¬ nolu. Otrzymany surowy kwas rozpuszcza sie 25 w 100 ml 95% etanolu zawierajacego 3 ml stezo¬ nego HC1 i uwodornia w obecnosci 2 g 10% Pd na weglu w ciagu 24 godzin otrzymujac 2,4 g 3-(2,2- -dwufenylometylo)-D,L-alaniny o temperaturze top¬ nienia 2135—237°C. 30 Przyklad III. Do roztworu 12,9 g 3-(naftylo- -2)-D,L-alaniny w 120 ml 1 m roztworu NaOH do¬ daje sie w temperaturze 0°C w ciagu 0,5 godziny 6,23 ml bezwodnika octowego i 60 ml 1 m roztworu NaOH, pH doprowadza sie do wartosci 2 stosujac 35 stezony HC1 i wytracony osad odsacza. Nastepnie osad krystalizuje sie z 60% wodnego roztworu eta¬ nolu otrzymujac 12,2 g N-acetylo-3-(naftylo-2)-DlL- alaniny.Do roztworu 15 g tak otrzymanego N-acetyloami- 40 nokwasu w 240 ml suchego metanolu dodaje sie 15,8 ml eteratu trójfluorku boru i calosc utrzymuje sie w stanie wrzenia w ciagu 1 godziny. Nastepnie alkohol sie odparowuje, dodaje 200 ml wody i roz¬ twór ekstrahuje octanem etylu. Warstwe organicz- 45 na przemywa sie wodnym roztworem zasady i kwa¬ su, suszy nad MgS04, saczy i odpedza rozpuszczal¬ nik. Otrzymany olej krystalizuje sie z mieszaniny octan etylu/heksan otrzymujac 14,2 g N-acetylo-3- -(naftylo-2)-D,L-alanianu metylu o temperaturze 50 topnienia 79—80°C.Postepujac zasadniczo w sposób opisany powyzej, lecz stosujac zamiast 3-(naftylo-2)-D,L-alaniny: 3- -(naftylo-l)-D,L-alanine, 3-(fluorofenylo-2)-D,L-ala- nine, (3-antrylo-2)-D,L-alanine, 3{-antrylo-l)-D,L- 55 -alanine i 3-(2,2-dwufenylometylo)-D,L-alanine w ilosci stechiometrycznie równowaznej otrzymuje sie, odpowiednio N-acetylo-3-{naftylo-l)-D,L-alanian metylu o temperaturze topnienia 97,5—98°C, N-ace- tylo-3-(fluoronylo-2)-D,L-alanian metylu o tempe- 60 raturze topnienia 170—171°C, N-acetylo-3-(antrylo- -2)-D-alanian metylu oraz N-acetylo-3-(2,2-dwufe- nylometylo)-D,L-alanian metylu o temperaturze topnienia 113—114°C.Przyklad IV. Roztwór 6,6 g N-acetylo-3- w tylo-2)^D,L-alanianu metyjju w mieszaninie 300 ml126 655 15 Iti dwumetylosulfotlenku, 120 ml 1 m roztworu KC1 i 780 ml H20 traktuje sie 33,6 mg enzymatycznej subtilizyny w 3 ml 0,1 m roztworu KC1. Utrzymuje sie wartosc pH równa 7 stosujac automatyczne mia¬ reczkowanie 0^2 m roztworem NaOH przy uzyciu pH-statu Radiometer. Po 30 minutach dodaje sie 70 ml roztworu NaOH i hydroliza ustaje. Roztwór alkalizuje sie 12 g NaHCOj i ekstrahuje octanem etylu. Warstwa organiczna zawiera N-acetylo-3- -(naftylo-2)-D-alanianu metylu. Po krystalizacji z mieszaniny octan etylu/heksan otrzymuje sie zól¬ te cialo stale o temperaturze topnienia 80—81°.C Produkt ten przeprowadza sie w wolny amino¬ kwas a nastepnie w N-Roc-aminokwas w sposób nastepujacy.Roztwór 2,5 g N-acetylo-3-i(naftylo-2)-D-alanianu metylu w GO ml 6n roztworu HC1 utrzymuje sie w temperaturze 120—130°C w ciagu 3 godzin a na¬ stepnie chlodzi do temperatury pokojowej. Wytra¬ cony bialy osad zbiera sie, krystalizuje z 50 ml H«0 zawierajacej 1 ml 12 n roztworu HC1 zobojet¬ niajac calosc do pH o wartosci 6 przy uzyciu NH4OH i suszy pod zmniejszonym cisnieniem otrzy¬ mujac 1,2 g 3-(naftylo-2)-D-alaniny o temperatu¬ rze topnienia 242~244°C, [a]25 — 26,6°(c = = 0,5, CH3COOH), Do mieszanego roztworu 3-(naftylo-2)-D-alaniny w mieszaninie 55 ml In roztworu NaOH, 10 ml H2O i 20 ml dioksanu dodaje sie, w temperaturze 0°C, 1,48 g dwuweglanu dwu(III-rzed.-butylowego) i 0,22 g tlenku magnezu. Po 1,5 godzinie dodaje sie jeszcze 0,3 g dwuweglanu dwuflll-rzed.-butylowe- go) i pozostawia mieszanine do ogrzania sie do tem¬ peratury pokojowej. Osad oddziela sie przez odsa¬ czenie i przesacz zaUeza do objetosci 50 ml; pH te¬ go roztworu doprowadza sie do wartosci 2„5 przy uzyciu NaHSO* i ekstrahuje octanem etylu. War¬ stwe wodna przemywa sie 5% roztworem NaHS04, woda i nasyconym roztworem soli. Warstwe octa¬ nowa suszy sie nad siarczanem magnezu, saczy i zateza otrzymujac olej, który krystalizuje sie z mieszaniny eter/heksan. Uzyskuje sie 1,3 g N-Boc- -3-(naftylo-2)-D-alanine o temperaturze topnienia 90—91°, Wg -32,6°(c = 0,8, NaOH).Postepujac zasadniczo w sposób opisany powyzej, lecz stosujac zamiast N-acetylo-3-(naftylo-2)-D,L- -alanianu metylu stechiometrycznie równowazna ilosc N-acetylo-3-(naftylo-l)-D,L-alariianu metylu, N-acetylo-3-(fluorofenylo-2)-D,L-alanianu metylu, N-acetylo-3-(antrylo-2)-D,L-alanianu metylu i N- -acetylo-3-(2,2-dwufenylometylo)-D,L-alanianu me¬ tylu otrzymuje sie poprzez odpowiednie wolne ami¬ nokwasy, No-Boc-aminokwasy, takie jak odpowied¬ nio N-Boc-3- topnienia 92—&3°C, [a]^ 54,8° (c = 0,8, MeOH), N- -Boc-3-(fluoraienylo-2)-D-alanina topniejaca z roz¬ kladem w temperaturze 161—163°C, N-Boc-3-(an- trylo-2)-D-alanina i N-Boc-3-(2,2-dwufenylometylo)- -D-alanina o temperaturze topnienia 153—154°C.Przyklady. W aparacie Parra do uwodornia¬ nia umieszcza sie 0,85 g 3-(naftylo-2-)-D-alaniny, 100 ml 2 m roztworu kwasu chlorowodorowego i 0,85 g katalizatora Adam'a (Pt02). Roztwór utrzy¬ muje sie pod cisnieniem wodoru równym 0,42 MPa w ciagu 20 godzin. Nastepnie mieszanine ogrzewa sie w celu rozpuszczenia bialego osadu i saczy przez ziemie okrzemkowa. Roztwór zaAeza sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem i liofilizuje woda otrzymujac 0,8i g 3-(perhydro/naftylo-2)-D-alaniny w postaci * osadu o temperaturze topnienia 230^-232°C.Produkt ten rozpuszcza sie w mieszaninie 3,2 ml In roztworu NaOH, 5 ml wody i 15 ml dioksanu i dodaje 0,14 g MgO i 0,85 g dwuweglanu dwu rzed.-butylowego). Calosc utrzymuje sie w tempe- 10 raturze 0°C w ciagu 1 godziny i w temperaturze 25°C w ciagu 2 godzin a nastepnie zawiesine odsa¬ cza sie, przesacz zateza do sucha pod zmniejszonym cisnieniem, pozostalosc rozpuszcza w wodzie, prze¬ mywa eterem etylowym i zakwasza NaHS04 do 15 pH =* 2. Zakwaszona warstwe wodna ekstrahuje sie trzykrotnie octanem etylu, zebrane ekstrakty suszy sie nad MgS04, saczy i zateza otrzymujac 0,75 g N- -Boc-3-(perhydronaftylo-2)-D-alaniny w postaci bialego osadu. 20 0*1 g tak otrzymanego produktu rozpuszcza sie w 5 ml czterowodorofuranu i miareczkuje w tem¬ peraturze 0°C, swiezo przygotowanym dwuazometa- nem do uzyskania trwalego jasnozóltego zabarwie¬ nia. Reakcje sie przerywa l ml kwasu octowego, 25 rozpuszczalnik odparowuje a pozostalosc dzieli po¬ miedzy 75 ml octanu etylu i 75 ml wody. Warstwe organiczna przemywa sie 5% roztworem NaHCOs, woda, 5% roztworem NaHS04, woda, nasyconym roztworem NaCl i suszy nad MgS04. Nastepnie roz- 30 twór saczy sie, przesacz zateza pod zmniejszonym cisnieniem i nanosi na plytke preparatywnej chro¬ matografii cienkowarstwowej (750 ja grubosci, zel krzemionkowy, 20X20 cm). Plytke rozwija sie mie¬ szanina dwuchlorometan/octan etylu (18:1) i usu- 35 wa pasmo produktu. Zel krzemionkowy z pasma produktu przemywa sie mieszanina dwuchlorome¬ tan/octan etylu (9:1) na lejku szklanym ze spiekiem i przesacz zateza otrzymujac 0,1 g N-Boc-3-(perhy- dronaftylo-2)-D-alanianu metylu w postaci jasno 40 zóltego oleju.Tak otrzymany produkt stanowi mieszanine 2 izo¬ merów w pozycji 2 pierscienia perhydronaftaleno- wego. Te diastereoizomery mozna rozdzielic na wy- sokosprawnej kolumnie do chromatografii cieczo- 45 wej (Lichrosorb silica gel 60, 5 \i) przy uzyciu mie¬ szaniny octan etylu/heksan (1:9) jako eluenta i zhy- drolizowac do wolnego kwasu N-Boc-3- naftylo-2)-D-alaniny.Plostepujac zasadniczo w sposób opisany powy- w zej, lecz stosujac zamiast 3-(naftylo-2)-D-alaniny stechiometrycznie równowazne ilosci 3-(naftylo-l)- -D-alaniny, 3?(2,2-dwufenylometylo)-D-alaniny, 3- ^(2,4,6-trójmetylo)-D-alaniny, 3-(dwufenylilo-4)-D,L- -alaniny, 3-[2y4,6-trój(n-butylo)fenylo]-D,L-alaniny i 55 3-(2,,3,4,5,6-pieciometylofenylo)-D,L-alaniny otrzy¬ muje sie odpowiednie N-Boc-aminokwasy takie, jak N-Boc-3-(perhydronaftyk)-l)-D-alanina, N-Boc-3- H(perhydro-2,2-dwufenylometylo)-D-alanina, N- -Boc-3-<2,4i,a-trójmetylocykloheksylo)-D,L-alanina, 60 N-Boc-3-(perhydrodwufenylilo-4)-D,L-alanina, N- -Boc-3-[2,4,6-trój(n-butylo)eykloheksylo]-D,L-ala-* nina i N-Boc-(2,3,4,5,6-pieciometylocykloheksylo)- -D,L-alanina.Przyklad VI. W naczyniu reakcyjnym Beck- m man 990 Peptide Synthesizer umieszczono 0,8 g (0,8126 655 17 18 mmola) zywicy benzhydryloamino-polistyreno-dwu- -winylobenzenowej (Lab Systems, Inc.) jak opisal cytowany juz Rivaille. Do tej zywicy dodano ko¬ lejno aminokwasy wedlug programu w nastepuja¬ cy sposób: CH2C12 mycie 50% CF3C02H/CHaCl3 — odblokowanie 50% CFSC02H/CH2C12 — odblokowanie CHaCl2 mycie 10% trójetyloamina/ Cri2Cl2 CH;2C12 mycie Roztwór N«-Boc aminokwasu Roztwór N,N'-dwucy kloheksylokarbondwu imid CH2C12 plukanie i sprzeganie CH2Cla plukanie CH2C12 mycie etanol mycie CH;2C12 mycie 1 1 1 3 2 3 1 1 L- 1 1 3 3 3 raz raz raz razy razy razy raz raz raz raz razy razy razy 1,5 min 1,5 min 30 min 1,5 min 1,5 min 1,5 min dodanie dodanie reakcja sprzegania 2 godziny 1,5 min 1,5 min 1,5 min 1,5 min Etapy 1—13 stanowia caly cykl sprzegania dla aminokwasu a kompletnosc reakcji sprawdzana me¬ toda ninhydrynowa wedlug E. Kaisera i in., Anal.Blochem. 34, 595 (1970).Zywice sprzegano kolejno z 2,5 molowym nad¬ miarem kazdego zablokowanego aminokwasu i DCC. Tak wiec, podczas kolejnych cykli sprzega¬ nia zywice potraktowano: 0,433 g Boc-Gyl-OH, 0,432 g Boc-Pro-OH, 0,857 g Boc-Arg (Tosyl)-OH, 0,462 g Boc-Leu-OH, Q,504 Boc-3-(naftylo-2)-D-ala- niny i 0,272 g 1-hydroksybenzotriazolu, 0,724 g N- -Boc, 0-2-bromobenzoiloksykarbonylo-L-tyrozyny, 0,59 g Boc-Ser(Benzyl)-OH, 0,608 g Boc-Trp-OH, 0,654 g Boc-His-{Tosyl)-OH i 0,524 g kwasu piroglu- taminowego.Nastepnie usunieto z naczynia reakcyjnego, prze¬ myto CH2Cl2 i wysuszono pod zmniejszonym cisnie¬ niem uzyskujac 2,0 g zablokowanej zywicy polipep- tydowej.Produkt polipeptydowy odszczepiono od zywicy i równoczesnie calkowicie odblokowano traktujac bezwodnym cieklym HF. Mieszanine 2,0 g zabloko¬ wanej zywicy polipeptydowej i 2 ml anizolu (sro¬ dek wychwytujacy) traktowano w naczyniu reak¬ cyjnym Kel-F 20 ml redestylowanego wodnego cieklego HF w temperaturze 0°C w ciagu 30 minut. HF odparowano pod zmniejszonym cis¬ nieniem a pozostalosc (piro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -3-(naftylo-2)-D-alanylo-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 w postaci soli HF przemyto eterem, nastepnie ekstra¬ howano lodowatym kwasem octowym. Ekstrakt kwasu octowego liofilizowano otrzymujac 0,8 g su¬ rowego produktu.Surowy polipeptyd naniesiono na kolumne o wy¬ miarach 4X40 cm z Amberlitem XAD-4 (kopolimer, polistyren — 4% dwuwinylobenzen) i przemywano stopniowo zwiekszajac stezenie etanolu,, od wody (0,5 litra) do etanolu (1 litr). Probówki zawierajace frakcje strumienia wyplywajacego od objetosci 690 ml do 1470 ml zebrano, i odpedzono rozpuszczalnik do sucha uzyskujac 490 mg czesciowo oczyszczone¬ go polipaptydu. 150 mg próbki czesciowo oczyszczonego produktu poddano chromatografii podzialowej na kolumnie o wymiarach 3X 50 cm wypelnionej Sephadexem G- -2|5 stosujac uklad rozpuszczalników butanol-1/to- luen/kwas octowy/woda zawierajaca 1,5% pirydyny w stosunku 10:15:12:18. Czyste frakcje zebrano na podstawie chromatografii cienkowarstwowej (zel krzemionkowy; BuOH«(H02)HoAc (EtOAc, 1:1:1:1) i HPLC (5 n, faza odwrócona, wypelnienie oktade- cylosililowe, 40%, 0,03 m NH4OAc (60% acetonitryl).Pozadany produkt zawarty byl we frakcjach stru¬ mienia wyplywajacego od objetosci 1000 ml do 1|400 ml (Rf = 0,1). Czyste frakcje zebrano, zatezo- no do sucha, zmieszano z woda i liofilizowano otrzymujac 57 mg czystego (piro)-glutamylo-histy- dylo-tryptofylo-serylo-tyrozylo-[3-naftylo-2J-D- -alanyloj-leucylo-arginylo-proliloglicynamidu w po¬ staci soli z kwasem octowym topniejacego z roz¬ kladem w temperaturze 185—194°C, [a]2* -27,4° (c = 0,9, HOAc).Przyklad VII. W celu zsyntetyzowania analo¬ gów zakonczonych C-Pro-NH-CH2CH3 zastosowano program identyczny z opisanym w przykladzie VI.W naczyniu reakcyjnym Beckman 990 Synthesizer umieszczono 2,13 g Boc-Pro-O-zywicy otrzymanej w wyniku reakcji równomolowych ilosci suchej soli cezowej Boc-Pro-OH i zywicy chlorometylopolisty- reno (!% dwuwinylobenzenowej (Lab Sysfems, Inc.).Uzyta próbka Boc-Pro-O-zywicy zawierala 1,4 mmola proliny.Zywice sprzegano kolejno z 2,5 molowym nad¬ miarem kazdego zablokowanego aminokwasu i DDC. Takwiec, zywice sprzegano kolejno z 1^6,1 g Boc-Arg(Tosyl)-OH, 0,93 g Boc-Leu-OH-2HO, 0,9,4 g Boc-3-(naftylo-2)-D-alaniny i 0,49 g 1-hydroksy¬ benzotriazolu, 1,75 g N-Boc-O-2-bromobenzyloksy- 'karbonylo-L-tyrozyny i 1,1|1 g Boc-Ser(Benzyl)OH.W tym momencie syntezy zablokowana zywice polipeptydowa podzielono na pól i jedna polowe poddano, w celu zakonczenia sekwencji, kolejnym reakcjom sprzegania z kolejno: 0,57 g Boc-Trp-OH, 0,77 g Boc-His(Tosyl)-OH, i 0,21 g kwasu piroglu- taminowego. Zywice usunieto z naczynia reakcyj¬ nego,, przemyto CH2C12 i wysuszono pod zmniejszo¬ nym cisnieniem otrzymujac 2,26 g zablokowanej zy¬ wicy polipeptydowej.Zablokowany polipeptyd usunieto z zywicy dro¬ ga aminolizy 25 ml etyloaminy w temperaturze 2°C w ciagu 18 godzin. Nastepnie pozwolono etyloaminie odparowac a zywice ekstrahowano metanolem. Po odparowaniu metanolu uzyskano 1,39 g piro-Glu- -His(Tosyl)-Trp-Ser ksykarbonylo)-3-(naftylo-2)-D-alanylo-Leu-Arg Z surowego polipeptydu usunieto grupy blokuja¬ ce traktujac go mieszanina 3 ml anizolu i 30i ml redestylowanego (z CoF8) bezwodnego cieklego HF w temperaturze 0°C w ciagu 30 minut w naczyniu reakcyjnym Kel-F. HF usunieto pod zmniejszonym cisnieniem a pozostalosc prjamyto eterem. Nastep¬ nie pozostalosc rozpuszczono w2o) roztworze kwe- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60126 635 19 20 su octowego i liofilizowano otrzymujac 0,82 g su¬ rowego (piro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(naftylo-2)- -D-alanylo-Leu*Arg-Pro-NHCH2CHg w postaci soli z kwasem octowym. Koncowe oczyszczanie zreali¬ zowano droga preparatywnej wysokosprawnej chramotografii cieczowej czyszczac 2,0 mg próbki na kolumnie G,9X55fo mm wypelnionej oktadecylo- sililowana krzemionka (Merck, Lichroprep cis), stosujac jako eluent 64% 0,03 m NH4CAc (36% ace- tonitrylu). Caly surowy produkt 61 mg, oczyszczo¬ no w czterech ratach. Po trzech liofilizacjach z wo¬ dy, otrzymano 15 mg czystego piroglutamylo-histy- dylo-tryptofylo-serylo-tyrozylo-3-(naftylo-2)-D- -alanylo-leucylo-arginylo-prolino-N-etyloamid w postaci soli z kwasem octowym o temperaturze topnienia 180—190°C i [a]25-57^20 (c = 1,1, HoAc).Piowtarzajac opisany sposób usuwania póiipepty- du z zywicy, lecz stosujac zamiast etyioaminy ste- chiometryczna ilosc n-butyloaminy, cyklopropylo- aminy, cykloheksyloaminy, trójfluorometyloaminy, pieciofluoroetyloamiiiy i 2,2,2-tróffluoroetyloarniny otrzymuje sie odpowiednio, N-i(n-butylo)-amid, N- -cyklopropyloamid, N-cyklohek&yloamid, N-trój- fluorometyloamid, pieciofluoroetyloamid i 2,2,2-trój- fluoroetyloamid wyzej wymienionego dziewieciopep- ._tydu.Pr z y ki a d VIII. Zwiazki, w których Z ozna¬ cza — NH-C = O/NHR* mozna otrzymac metoda klasyczna. Mozna, na przyklad, zastosowac nastepu¬ jacy sposób postepowania, przedstawiony na sche¬ macie, w którym „Aza Gly NHa" oznacza -NH-NH- -C/=Q/-NH3: Otrzymuje sie wolny peptyd; lubj jego sól.Sprzeganie indywidualnych fragmentów mozna prowadzic: metoda acyloazydów [J. Honzel i in., Coli. Czech.Chem.Comm., 26, 2333 (1971)] metoda sprzegania DCC/HBT lub inna technika sprzega¬ nia nie powodujaca racemizacjL Zwiazki (1) i (2) sa znane (odpowiednio, M. Fujino i in., Biochem.BiophySyRes.Comm. 57, 1,248 (1974) i A.S. Dutta i in., . J. Chem.Soc.Perkin I, 1979, 379). Zwiazek (3) otrzy¬ mano ze .zwiazku (2) przez usuniecie Cbz i grup nitrowych droga hydrogenolizy, a nastepnie sprze¬ zenie z N-Boc-3-(naftylo-2)-D-alanina przy uzyciu PCG/HBT lub innego znanego srodka sprzegajace- . gp. Synteze podobnych analogów LH-RH opisal cy¬ towany juz Dutta i in. Podobnie, stosujac zamiast N-Boc-3r(naftylo-2i)-D-alaniny inne aminokwasy , mozna otrzymac inne zwiazki, na przyklad (piro)- -Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(naftylo-2)-D-Ala-N-mety- lo-Leu-Arg-Pro-Aza-Gly-NH2 i (piro)Glu-His-Trp- -Ser-Tyr73-(2,4,6-trójmetylofenylo)-D-Ala-Leu- -Arg-Pro-Aza-GlyNH2 Równiez otrzymujac zwiazek (2) i stosujac zamiast Aza-Gly-NH2 Aza-Gly^NH- -nizszy alkil, otrzymuje: sie odpowiednie peptydy zakonczone Aza-Gly^NH-nizszy alkil, na przyklad (piro)Glu-His-Trp-Ser^Tyr-3^(naftylo-2)-D-Ala- -Leu-Arg-Pro-Aza-Gly-Et, (piro)Glu-His-Trp-Ser- -Tyr-3-(naftylo-2)-D-Ala-N-metylo-Leu-Arg-Pro- -Aza-Gly-Et i (piro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6- -trójmetylefenyk)-D-Ala-Leu-Arg-PriO-Aza-Gly-Et.Przyklad IX. Postepujac w sposób opisany w przykladzie VI i stosujac albo D-aminokwasy albo D,L^aminokwasy w pozycji 6 (w tym ostatnim przypadku rozdzielajac diastereoizomeryczne pep¬ tydy podczas chromatografii) zamiast odpowiednich aminokwasów w syntezie z udzialem fazy stalej mozna otrzymac nastepujace dziesieciopeptydy, któ¬ re zostaly wyodrebnione i scharakteryzowane jako sole z kwasem octowym: piro-glutamylo-histydylo-tryptofylo-serylo-tyrozy- lo-3-i(naftylo-2,-)-D-alanylo-N-metyloleucylo-argi- nylo-proliloglicynamid o [a]^—26,6° (c = 1, HoAc), piro-glutamylo-histydylo-fenylo-alanylo-serylo-ty- rozylo-3(naftylo-2)-D-alanlo-leucylo-arginylo-proli- lo-gljcynamid, piro-glutamylo-histydylo-3-(naftylo- -l)-L-alanylo-serylo-tyrozylo-3-(naftylo-2)-D-ala- nylo-leucylo-arginylo-prolilo-glicynamid, piro-glu- tamylo-histydylo-tryptofylo-serylo-fenyloalanylo- -3-(naftylo-2)-D-alanylo-leucylo-arginylo-prolilo- -glicynamid, piro-glutamylo-histydylo-tryptofylo- -serylo-3-(pieciofluorofenylo-l)-L-alanylo-3^(nafty- lo-2)-D-alanylo-leucylo-arginylo-proliloglicynamid, piro-glutamylo-histydylo-tryprofylo-serylo-tyrozy- lo-3-(naftylo-l)-D.-alanylo-leucylo-arginylo-proli- lo-glicynamid o temperaturze topnienia 173—5°C i [a]^ — 28,81° (c = 0,8, HoAc), piro-glutamylo-histy- dylo-tryptofylo-serylo-tyrozylo-3-(antrylo-2)-D- -alanylo-leucylo-arginylo-prolilo-glicynamid, piro- -glutamylo-histydylo-tryptofylo-serylo-tyrozylo-3- -(fluorenylo-2)-D-alanylo-leucylo-arginylo-prolilo- -glicynamid o [a] ^-25,8° (c = 1, HoAc), piro-glu- tamylo'-histydyro-tryptofylo-serylo-tyrozylo-3-(fe- nantryló-3-)-D-alafiylo-leucylo-arginylo-prolilogli- cynamid, piro-glutamylo-histydylo-tryptofylo-se- rylo-tyrozylo-3-(dwufenylilo-4)-D-alanylo-leucylo- -arginylo-prolilio-glicynamid o [a]2£ —35,7° (c = 1, HoAc), piro-glutamylo-histydylo-tryptofylo-sery- lo-tyrozylo-3-(2,,2-dwufenylpmetylo)-D-alanylo- -leucylo-arginylo-proliloglicynamid, piro-glutamy- lo-histydylo-tryptofylo-serylo-tyrozylo-3-(adaman- tylo-l)-P7alanylo-leucylo-arginylo-prolilo^glicyna- mid, , pirci-glutamylo-histydylo-tryptofylo-serylo- -tyrO'zylo-3T(2,4,6,7tr.pjmetylofenylQ)-D-alanylo-leu- cylo-arginylo-prolilOr,glicynamid o [a]^ —42,1° (c = = 1,' HoAc), piro-glutamylo-histydylo-tryptofylo-se- rylo-tyrozylo-3-[2,4,6-trój(n-butylo)fenylo]-D-ala- nylo-leucylo-arginylo-prolilorglicynamid, i piro-glu- tamylo-histydylo-tryptofyJo-serylo-tyrozylo-3- -(2,3,4,5i,6-pieciometylofenylo)-D-alanylo-leucylo- -arginylo-prolilo-glicynamid, piro-glutamylo-his- tydylo-tryptofylo-serylo-tyrozylo-3-(2,4,6-trójmety- locykloheksylo)-D-alanylo-leucylo-arginylo-proli- lo-glicynamid, piro-glutamylo-histydylo-tryptofylo- serylo-3-{2,4,6-trój(n-butylo)cykloheksylo}-D-alany- lo-leucylo-arginylo-prolilo-glicynamid, piro-gluta- mylo-histydylo-tryptofylo-serylo-tyrozylo-3-(per- hydronaftylo-il)-D-alanylo-leucylo-arginylo-prolilo- -glicynamid,, piro-glutamylo-histydylo*tryptofylo- -serylQ-tyrozylot3-(perhydronaftylo-^)-D-alanylo- -leucylo-prolilo-glicynamid, pirp-glutamylo-histy- dylo-tryptofylo-serylo-tyrozylo-3-(perhydrodwufe- nylilo-4)-D-alanylo-leucylo-argiriylo-prolilo-glicy- namid, piro-glutamylo-histydylo-tryptofylo-serylo- -tyrozylo-3^(perhydro*2,2-dwu£enylometylo)-D-ala- nylo-leucylo-arginylo-prolilo-glicynamid, piro-glu- tamylo-histydylo-tryptofylo-serylo-tyrozylo-3-(naf- tylo-2)-D-alanylo-izoleucylo-arginylo-prolilo-glicy- namid i piro-glutamylo-histydylo-tryptofylo-serylo- 10 15 20 .25 30 35 40 45 50 55 60126 655 21 22 -tyrozylo-3-(naftylo-2)-D-alanylo-norleucylo-argi- nylo-prolilo-glicynamid.Przyklad X. Postepujac w sposób opisany w przykladzie Xi stosujac albo D-aminokwasy albo D,L-aminokwasy w. pozycji 6 (w tym drugim przy- 5 padku, rozdzielajac diastereomeryczne peptydy pod¬ czas oczyszczania chromatograficznego) zastepujac odpowiednie aminokwasy syntezie z udzialem fazy stalej mozna otrzymac nastepujace dziewieciopep- tydy, które zostaly wyodrebnione i scharakteryzo¬ wane jako sole z kwasem octowym: piro-glutamy- lo-histydylo-tryptofylo-serylo-tyrozylo-3-(naftylo- -l)-D-alanylo-leucylo-arginylo-prolina jako etylo¬ amid, n-butyloamid, cyklopropyloamid, cyklohek- syloamid, trójfluorometyloamid, pieciofluoroetylo¬ amid i 2,2,2-trójfluoroetyloamid, piro-glutamylo-hi- stydylo-fenylo-alanylo-serylo-tyrozylo-3-(naftylo- -2)-D-alanylo-leucylo-arginylo-prolina jako etylo¬ amid o temperaturze topnienia 180—190° i [a] * —57,2° (c = 1, 1,0% HoAc), n-butyloamid, cyklopro¬ pyloamid, cykloheksyloamid, trójfluorometyloamid, pieciofluoroetyloamid i 2,2,2-trójfluoroetyloamid, pi- ro-glutamylo-histydylo-3-(naftylo-I)-L-alanylo-se- rylo-tyrozylo-3-naftylo-2)-D-analylo-leucylo-argi- nylo-prolina jako etyloamid o temperaturze topnie¬ nia 1Ó0—170°C [a]2^ -45,3° (c = 1, HoAc) n-buty¬ loamid, cyklopropyloamid, cykloheksyloamid, trój¬ fluorometyloamid, pieciofluoroetyloamid i 2,2,2-trój¬ fluoroetyloamid, piro-glutamylo-histydylo-trypto- fylo-serylo-fenyloalanylo-3-(naftylo-2)-D-alanylo- -leucylo-arginylo-prolina jako efyloamid, n-butylo¬ amid, cyklopropyloamid, cykloheksyloamid, trój¬ fluorometyloamid, pieciofluoroetyloamid i 2,2,2- -trójfluoroetyloamid, piro-glutamylo-histydy- lo-tryptofylo-serylo-3-{pieciofluorofenylo-li)-L-ala- nylo-3-(naftylo-2)-D-alanylo-leueylo-arginylo-pro- lina, jako etyloamid, n-butyloamid, cyklopropylo¬ amid, cykloheksyloamid, trójfluorometyloamid, pie¬ ciofluoroetyloamid i 2,2,2-trójfluoroetyloamid, pi- ro-glutamylo-histydylo-tryptofylo-serylo-tyrozylo- -3- jako etyloamid, n-butyloamid, cyklopropyloamid, cykloheksyloamid, trójfluorometyloamid, piecioflu¬ oroetyloamid i 2,2,2-trójfluoroetyloamid, piro-gluta- mylo-histydylo-tryptofylo-serylo-tyrozylo-3-(flu- orofenylo-2)-D-alanylo-leucylo-arginylo-prolina ja¬ ko etyloamid, n-butyloamid, cyklopropyloamid, cy¬ kloheksyloamid, trójfluorometyloamid, pieciofluoro¬ etyloamid i 2,2,2-trójfluoroet'yloamid, piro-glutamy- lo-histydylo-tryptofylo-serylo-tyrozylo-3-(fenantry- lo-3)-D-alanylo-leucylo-arginylo-prolina jako etylo¬ amid, n-butyloamid, cyklopropyloamid, cyklohek¬ syloamid, trójfluorometyloamid, pieciofluoroetylo¬ amid, i 2,2,,2-trójfluoroetyloamid, piro-glutamylo- -histydylo-tryptofylo-serylo-tyrozylo-3-(dwufenyli- lo-4)-D-alanylo-leucylo-arginylo-prolina jako etylo¬ amid, n-butyloamid, cyklopropyloamid, cykloheksy¬ loamid, trójfluorometyloamid, pieciofluoroetylo¬ amid, i 2,2,2-trójfluoroetyloamid, piro-glutamylo- -histydylo-tryptofylo-serylo-tyrozylo-3^(2,2-dwufe- nylometylo)-D-alanylo-leucylo-arginylo-prolina ja¬ ko etyloamid o temperaturze topnienia 176—206°C i [a2D5 -33,7° (c = 1, 10% HoAc), n-butyloamid, cy¬ klopropyloamid, cykloheksyloamid, trójfluoromety¬ loamid, pieciofluoroetyloamid i 2,2,2-trójfluoroetylo¬ amid, piro-glutamylo-histydylo-tryptofylo-serylo- -tyrozylo-3-(adamantylo-l-D-alanylo-leucylo-argi- nylo-prolina jako etyloamid, n-butyloamid, cyklo¬ propyloamid, cykloheksyloamid, trójfluorometylo¬ amid, pieciofluoroetyloamid i 2,2,2-trójfluoroetylo- ami,d piro-glutamylo-histydylo-tryptofylo-seryló- -tyrozylo-3-(2j4,6-trójmetylofenylo)-D-alanylo-leu- cylo-arginylo-prolina jako etyloamid, n-butyloamid, cyklopropyloamid, cykloheksyloamid, trójfluorome¬ tyloamid, pieciofluoroetyloamid i 2,2,2-trójfluoroety¬ loamid, piro-glutamylo-histydylo-tryptofylo-sery- lo-tyrozylo-[2,6,4-trój^(n-butylo)fenylo]-D-alanylo- -leucylo-arginylo-prolina jako etyloamid, n-butylo¬ amid, cyklopropyloamid, cykloheksyloamid, trójflu¬ orometyloamid, pieciofluoroetyloamid i 2,2,2rtrój- fluoroetyloamid, piro-glutamylo-histydylo-trypto- fylo-serylo-tyrozylo-3-(2,3,4,5,6-pieciometylofenylo)- -D-alanylo-leucylo-arginylo-prolina jako etyloamid, n-butyloamid, cyklopropyloamid, trójfluorometylo¬ amid, pieciofluoroetyloamid i 2,2,2-trójfluoroetylo¬ amid, piro-glutamylo-histydylo-tryptofylo-serylo- -tyrozylo-3-(2,4,6-trójmetylocykloheksylo-)-D-ala- nylo-leucylo-arginylo-prolina jako etyloamid, cyklo¬ propyloamid, cykloheksyloamid, trójfluorometylo¬ amid, pieciofluoroetyloamid i 2,2,2-trójfluoroetylo¬ amid, piro-glutamylo-histydylo-tryptofylo-serylo- -tyrozylo-3 -arginylo-prolina jako etyloamid, n-butyloamid, cy¬ klopropyloamid, cykloheksyloamid, trójfluoromety¬ loamid, pieciofluoroetyloamid i 2,2,2-trójfluoroetfylo- amid, piro-glutamylo-histydylo-tryptofylo-serylo- -tyrozylo-3-(perhydronaftylo-2)-D-alanylo-leucylo- -arginylo-prolina jako etyloamid, n-butyloamid, cyklopropyloamid, cykloheksyloamid, trójfluorome¬ tyloamid, pieciofluoroetyloamid i 2,2,2-trójfluoroety¬ loamid, piro-glutamylo-histydylo-tryptofylo-sery- lo-tyrozylod-3-(perhydrodwufenylilo-4)-D-alanylo- -leucylo-arginylo-prolina jako etyloamid, n-butylo¬ amid, cyklopropyloamid, cykloheksyloamid, trójflu¬ orometyloamid, pieciofluoroetyloamid i 2,2,2-trójflu¬ oroetyloamid, piro-glutamylo-histydylo-tryptofylo- -serylo-tyrozylo-3- -D-alanylo-leucylo-arginylo-prolina jako etyloamid, n-butyloamid, cyklopropyloamid, cykloheksyloamid, trójfluorometyloamid, pieciofluoroetyloamid i 2,2,2- -trójfluoroetyloamid, piro-glutamylo-histydylo- -tryptofylo-serylo-tyrozylo-3-(naftylo-2)-D-alanylo- -N-metylo-leucylo-arginylo-prolina jako etyloamid o temperaturze topnienia 170—185°C i [a]^5—81,1° (c = 01,7, 10% HoAc), n-butyloamid, cyklopropylo¬ amid, cykloheksyloamid, trójfluorometyloamid, pie¬ ciofluoroetyloamid i 2,2,2-trójfluoroetyloamid, piro- -glutamylo-histydylo-tryptofylo-serylo-tyrózylo-3- - jako etyloamid, n-butyloamid, cyklopropyloamid, cykloheksyloamid, trójfluorometyloamid, piecioflu¬ oroetyloamid i 2,2,2-trójfluoroetyloamid oraz piro- -glutamylo-histydylo-tryptofylo-serylo-tyrozylo-3- - jako etyloamid, n-butyloamid, cyklopropyloamid, cykloheksyloamid, trójfluorometyloamid, piecioflu- orometyloamid i 2,2;,2-trójfluoroetyloamid.Przyklad XI. Roztwór 0,1 g fluorowodorku (piro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-S-(naftylo-2)-D-Ala- -Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 {patrz przyklad VI) rozpu- 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60126 655 23 24 szczono w 50 ml wody i przepuszczono przez kolum¬ ne wypelniona 50 g zywicy anionowymiennej Do- wex 3, która uprzednio potraktowano kwasem octo¬ wym i przemyto zdemineralizowana woda. Kolum¬ ne eluowano zdemineralizowana woda i eluat lio¬ filizowano otrzymujac odpowiedni octan (piro)-Glu- -ffis-Trp-Ser-Tyr~3-(naftyol-2)-D-Ala-Leu-Pro-Gly- -NH* o [ag -27,5° (c = 0,9, HoAc).Postepujac w sposób opisany powyzej, lecz sto¬ sujac do zywicy zamiast kwasu octowego inne kwa¬ sy mozna otrzymac odpowiednie sole z kwasem chlorowodorowym, bromowodorowym, siarkowym, fosforowym,, azotowym, benzoesowym itp.Podobnie mozna otrzymac sole addycyjne z kwa¬ sami innych zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku.W przypadku malej rozpuszczalnosci soli w wo¬ dzie, mozna je otrzymac wytracajac z wody odpo¬ wiednim kwasem. Na przyklad: sól taninianu cyn¬ ku — roztwór 10 mg octanu -Ser-Tyr-3-(naftylo-2)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly- -NHj w 0,1 ml wody potraktowano roztworem 8 mg kwasu garbnikowego w 0,08 ml 0,25 m roztworu NaOH i natychmiast dodano roztwór 5 mg siedmio- wodzianu ZnS04 w 0,1 ml wódy.Otrsymana zawiesina rozcienczono 1 ml wody i osad odwirowano. Ciecz znad osadu zdekantowa- no a pozostalosc przemyto dwukrotnie i ml wody mieszajac osad z woda, wirujac i dekantujac ciecz znad osadu. Osad wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem Otrzymujac 15 mg mieszanej soli tani¬ nianu cynku i wyzej wymienionego analogu LH- -RH.Sól embonianu — do roztworu 50 mg octanu (pi- ro)-Glu-His-Trp-Ser-3-(naftylo-2)-D-Ala-Leu-Arg- -Pro-Gly-NEg w mieszaninie 1,6 ml etanolu i 0,1 ml 0,25 m roztworu NaOH dodano roztwór 11 mg kwa¬ su embonowego w 0,3 ml 0,2)5 m roztworu NaOH.Rozpuszczalniki usunieto pod zmniejszonym cisnie¬ niem a pozostalosc zmieszano z 2 ml wody, odwi¬ rowano i zdekantowano ciecz znad osadu. Osad przemyto 1,5 ml H^O odwirowujac osad i dekantu- jiac ciecz znad osadu. Osad wysuszono pod zmniej¬ szonym cisnieniem uzyskujac 54 mg soli embonia¬ nu wymienionego wyzej analogu LH-RH.Podobnie mozna otrzymywac inne sole zle roz¬ puszczalne w wodzie.Solfe mozna otrzymywac równiez z wolnych pep- tydów. Do roztworu 50 mg (piro)-Gly-His-Trp-Ser- -Tyr-^naftylo-2)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NHf ja¬ ko wolnej zasady dodano 30 ml In roztworu kwa¬ su octowego. Otrzymany roztwór liofilizowano otrzymujac 50 mg soli kwasu octowego i wyzej wy¬ mienionego analogu LH-RH.Podobnie, zastepujac kwas octowy innymi kwa¬ sami w stosunku do peptydu) otrzymano inne sole ad¬ dycyjne z kwasami zwiazków wytwarzanych sposo¬ bem wedlug wynalazku na przyklad, sole z kwasem chlorowodorowym, bromowodorowym, siarkowym, fosforowym, azotowym.Mozna równiez otrzymywac sole z kationami me¬ tali, na przyklad sól cynku: do roztworu 50 mg octanu (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(naftylo-2)-D- -Ala-Leu-Arg-Rro-Gly-NH« w mieszaninie 0,4 ml 0,25 m roztworu NaOH, 0,3 ml wfedy i 1 ml etano¬ lu dodano 15 mg siedmiowodzianu Z11SO4 w 0,2 ml wody. Osad odwirowano i ciecz znad osadu zde¬ kantowano. Osad przemyto 1 ml wody droga wiro¬ wania i dekantacji, nastepnie wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem otrzymujac 48 mg soli cynku wspomnianego wyzej analogu LH-RH.W podobny sposób mozna otrzymac sole z innymi wielowartosciowymi kationami, na przyklad wap¬ niem, bizmutem, barem, magnezem, glinem, mie¬ dzia, kobaltem, niklem, kadmem itp.Przyklad XII. Roztwór 50 mg octanu (piro)- -Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(naftylo-2)-D-Ala-Leu-Arg- -Pro-Gly-NH2 w 25 ml wody przepuszczono przez kolumne zawierajaca 50 g Dowexu 1 (silnie zasa¬ dowa zywica anionowa oparta na czwartorzedowej zasadzie amoniowej) potraktowanego roztworem NaOH w celu dostarczenia kompensujacego jonu wodorotlenowego. Kolumne przemyto 1-50 ml wody i eluat liofilizowano otrzymujac 45 mg odpowied¬ niego polipeptydu w postaci wolnej zasady.Podobnie z innych soli addycyjnych z kwasami jak na przyklad soli wymienionych w przykladzie XI mozna otrzymac odpowiednie wolne zasady.Przyklad XIII. Zatrzymanie rui u szczurów.Szczury ploi zenskiej (Hiktrp, Sprague Dawley, ok. 200 g z otwarta pochwa) zgrupowano wedlug wagi po 5 w klatce i po 2 klatki w grupie. Dwa razy dziennie robiono szczurom zastrzyki podskórne (z wyjatkami opisanymi ponizej) przez 14 dni. Co¬ dziennie pobierano rozmaz z pochwy w celu ozna¬ czenia etapu cyklu rujowego a w czasie 0, 1 i 2 ty¬ godni wazono. Poczynajac od 4 dnia obliczono pro¬ cent* samic wykazujacych czesciowe stlumienie rui (tzn. fazy dioestrum i proestrum nie oestrum) oraz procent samic z calkowitym stlumieniem rui (tzn. tylko fazy dioestrum). Obliczono ED5f z najlepiej pasujacej linii prostej przeprowadzonej przez punk¬ ty oznaczajace wyniki procentowe zaniku rui. Ana¬ logi LH-RH podano w postaci ich soli z kwasem octowym w soli fizjologicznej zawierajacej 0,1% albuminy surowicy wolowej (BSA). Wstrzykiwano po 0,2 ml roztworu zawierajacego 0,0^, 0,1, 0,2 lub 0,4 \ig analogu LH-RH. Plyn kontrolny (sól fizjolo¬ giczna zawierajaca BSA) nie powodowal zaniku rui. Otrzymane wyniki dla EDs8 uwzgledniajac czesciowe i calkowite wstrzymanie rui podano w ponizszej tabeli. 1 Zwiazek 1 1 . . . '. '. (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -3-(naftylo-2-)-D-alanylo- -Leu-Arg-Pro-Gly-NH* (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -3-(naftylo-2-)-D-alanylo- -Leu-Arg-Pro-NHEt (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -3-{naftylo-2-)-D-alanylo- -N-Me-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -3-(naftylo-2-)-D-alanylo- | N-Me-Leu-Arg-Pro-NHEt ED5< X|tg/iniekcje) 2 0,08 0,22 0,07 0,12 10 15 20 ?5 30 35 40 45 50 55 60126 655 25 20 1 1 (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -3-(2,2,6-trójmetylofenylo)- -D-alanylo-Leu-Arg-Pto- -Gly-NHa (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -3-(naftylo-l)-D-alanylo-Leu- -Arg-Pro-Gly-NHs (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (antrylo-9)-D-alanylo-Leu- Arg-Pro-Gly-NHa (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -3-(dwufenylilo-4)-D-alanylo- -Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -3-(fluorofenylo-2)-D-alany- lo-Leu-Arg-Pro-Gly-NH* (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -3-(2,2-dwufenylo-metylo)- -D-alanylo-Leu-Arg-Pro- -Gly-NHEt (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -3-(2,4,6-trójmetylofenylo)- -D-alanylo-N-MeLeu-Arg- -Pro-Gly-NH2 (piro)Glu-His-3-(naftylo-l)- -L-alanylo-Ser-Tyr-3-(naf- -tylo-2)-D-alanylo-Leu-Fro- -NHEt 2 0,08 0,3 0,27 0,28a 0,40a 0,11 0,35« Q,16 a Te zwiazki wstrzykiwano tylko raz dziennie.Przyklad XIV. 6 myszom Swiss — Webster (Simonsen) wazacym po okolo 25 g wstrzyknieto podskórnie 0,25 ml wodnego roztworu octanu (pi- ro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(naftylo-2)-D-alanylo- -Leu-Arg-Pro-Gly-NHg w ilosci 40 mg/kg lub okolo 1 mg/mysz. Myszy obserwowano dwa razy dziennie przez 21 dni. Nie zaobserwowano przypadków smiertelnych. Tak wiec LD60 wynosi powyzej 40 mg/kg.Zastrzezenie patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych pochodnych dzie- wiecio- i dziesieciopeptydowych o wzorze (piro)Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Argo-Fro-Z, w którym V oznacza grupe tryptofylowa, fenylo- alanylowa lub 3-(naftylo-l)-L-alanylowa, W ozna¬ cza grupe tyrozylowa, fenyloalanylowa lub 3-{pie- ciofluorofenylo-l)-L-alanylowa, a X oznacza resz¬ te D-aminokwasu o wzorze -NH-CH(CH2R)-C<=0)-, w którym R oznacza karbocykliczny rodnik zawie¬ rajacy pierscien arylowy, wybrany z grupy obej¬ mujacej rodnik naftyIowy, antrylowy, fluorenyIo¬ wy, fenantrylowy, dwufenylilowy, benzyhydrylowy i fenylowy, podstawiony co najmniej 3—5 nizszy¬ mi, prostolancuchowymi rodnikami alkilowymi lub R oznacza nasycony, cykliczny rodnik weglowodo¬ rowy wybrany z grupy obejmujacej rodnik cyklo- heksylowy podstawiony 3—5 nizszymi, prostolancu¬ chowymi rodnikami alkilowymi, rodnik perhydro- naftylowy, perhydrodwufenylilowy, perhydro-2,2- -dwufenylometylowy i adamantylowy, Y oznacza grupe leucylowa, izoleucylowa, nor-leucylowa lub N-metyloleucylowa, Z oznacza glicynoamid lub gru¬ pe o wzorze -NH-R1 w którym R1 oznacza rodnik alkilowy o 1—4 atomach wegla, rodnik cykloalki- lowy o 3—6 atomach wegla, rodnik fluoroalkilowy o 1—4 atomach wegla lub rodnik o wzorze -NH- -C(=0)-NH-R2, w którym R2 oznacza atom wodo¬ ru lub rodnik alkilowy o 1—4 atomach wegla, oraz ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli, znamien¬ ny tym, ze zwiazek o wzorze (piro)-Glu-His-(P1)a- -V-Ser(P«)b-Wi(P»)c-X-Y-Arg(P*)-Pro-Z/-(S)d,w któ¬ rym V, W, X i Y maja poprzednio podane znacze¬ nie, a Z' ma znaczenie podane dla Z lub oznacza grupe glicylowa, P1, Pa, P* i P4 oznaczaja grupy blokujace w lancuchach bocznych, przy czym P1 oznacza grupe benzylowa, p-toluenosulfonylowa lub 2,4-dwunitrofenyIowa, P* oznacza grupe benzylowa lub tetrahydropiranylowa, P8 oznacza grupe benzy¬ lowa, o-bromobenzyloksykarbonylowa, 2,6-dwu- chlorobenzylowa, izopropylowa, cykloheksylowa, cy- klopentylowa lub acetylowa gdy W oznacza grupe tyrozylowa, a P4 oznacza grupe nitrowa, p-tolueno¬ sulfonylowa, 4-metoksybenzenosulfonylowa, benzy- loksykarbonylowa, III-rzed.- butyloksykarbonylowa lub grupe adamantyloksykarbonylowa, S oznacza staly nosnik skladajacy sie z kopolimeru ewentu¬ alnie podstawionego styrenu z niewielka iloscia srodka sieciujacego takiego jak dwuwinylobenzen, a kazdy z symboli a, b, c i d oznacza liczbe 0 lub 1„ traktuje sie w temperaturze —10 do +10°C srod¬ kiem odszczepiajacym grupy blokujace wybranym z grupy obejmujacej kwasy organiczne i nieorga¬ niczne, fluorowodór, wodór i sód w cieklym amo¬ niaku, a gdy d w powyzszym wzorze oznacza 1, zwiazek wyjsciowy lub produkt otrzymany w wy¬ niku bdszczepiania od niego grup blokujacych pod¬ daje sie dzialaniu srodka odszczepiajacego staly nosnik, wybranego z grupy obejmujacej nizsza al- kiloamine, nizsza fluoroalkiloamine i amoniak, po¬ przedzonemu ewentualnie traktowaniem nizszym alkanolem, wytwarzajac zadana pochodna peptydo- wa lub jej sól, i ewentualnie otrzymany produkt przeksztalca sie w farmaceutycznie dopuszczalna sól przez traktowanie kwasem organicznym lub nie¬ organicznych, lub przeksztalca otrzymana sól przez traktowanie innym kwasem organicznym lub nie¬ organicznym w farmaceutycznie dopuszczalna sól addycyjna z kwasem, lub rozklada sie otrzymana sól przez traktowanie nieorganiczna zasada z wytwo¬ rzeniem wolnego polipeptydu. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania zwiazku o wzorze (piroJ-Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Arg-Pro-Z, w którym Z oznacza glicynoamid, zwiazek o wzo¬ rze w którym P4 oznacza grupe nitrowa lub p-tolueno¬ sulfonylowa, V, W, X, Y i S maja wyzej podane znaczenie a Z' oznacza grupe glicylowa, traktuje sie fluorowodorem stanowiacym srodek odszczepia- jacy grupy blokujace i amoniakiem, stanowiacym srodek odszczepiajacy staly nosnik, przy czym od- szczepianie stalego nosnika poprzedza odszczepianie grup blokujacych.M) as 20 25 30 35 40 45 50 55 (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -3-(2,2,6-trójmetylofenylo)- -D-alanylo-Leu-Arg-Pto- -Gly-NHa | 0,08 (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -3-(naftylo-l)-D-alanylo-Leu- -Arg-Pro-Gly-NH* | 0,3 (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (antrylo-9)-D-alanylo-Leu- Arg-Pro-Gly-NHa | 0,27 (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -3-(dwufenylilo-4)-D-alanylo- -Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 I 0,28a (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -3-(fluorofenylo-2)-D-alany- lo-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 [ 0,40a (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -3-(2,2-dwufenylo-metylo)- -D-alanylo-Leu-Arg-Pro- -Gly-NHEt | 0,11 (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr- -3-(2,4,6-trójmetylofenylo)- -D-alanylo-N-MeLeu-Arg- -Pro-Gly-NHa | 0,35« (piro)Glu-His-3-(naftylo-l)- -L-alanylo-Ser-Tyr-3-(naf- -tylo-2)-D-alanylo-Leu-Pro- -NHEt | Q,16126 655 (piro)Glu-His-Trp-Ser- Tyr-OMe (piro)Glu-His-Trp Ser-Tyr-Nj Cbz-Leu-Arg-Pro-AzaGlyNHj N02 121 Boc-3-(2-naftylo -H-Ala- Leu-Arg-Pro-AzaGly-NH2 H+ H-3-(2-naftylo)-D-Ata- Leu-Arg-Pro-AzaGly -NH2 | |3| (piro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftylo)-£- Ala -Leu-Arg-Pro-Azo- Gly - NH2 Schemat ZGK 0761/1131/5 — 80 egz.Cena 100 zl PL PL PL