DK152734B - Lhrh-analoge nonapeptid- og decapeptidderivater og farmaceutisk acceptable salte deraf og middel til kontraception - Google Patents

Description

Lute ini ser ingshormon (LH) og fo 11 ike1stimu1 erende hormon (FSH) frigives fra hypofyseforlappen under kontrol af det frigivende hormon LH-RH dannet i det hypothal am i ske område. LH og FSH virker på gonaderne for at stimulere syntesen af steroidhormoner og for at stimulere gametmodningen. Den pulserende frigivelse af LH-RH og derved frigivelsen af LH og FSH styrer den reproduktive cyklus hos husdyr og mennesker. LR-RH har desuden virkninger i placenta ved frigivelse af HCG (humant choriongo-nadetropi n) og direkte på gonaderne. Agoni st-analoge af LH-RH er nyttige til at styre fertiliteten ved hjælp af to virkningsmekanismer. Lave doser af LH-RL-analoge kan stimulere ovulation og er nyttig ved behandlingen af hypothalamisk og ovulatorisk infertilitet. De kan desuden anvendes til hypogo-nadale betingelser og impotens og stimulerer spermatogenese og androgen produktion i hanner og hos mænd. Paradoksalt har større doser af kraftigt virkende og langtidsvirkende analoge af LH-RH en modsat virkning og blokerer ovulation hos hunner og kvinder og undertrykker spermatogenese hos hanner og mænd. Beslægtet med disse virkninger er en undertrykkelse af normale cirkulerende koncentrationer af seksualsteroider af gonadal oprindelse inklusive reduktion af vægten af accessorisk organ hos hanner og hunner og mænd og kvinder. Hos husdyr fremmer denne paradoksale virkning vægtforøgelsen i tilfælde med overskud af føde, stimulerer abort hos drægtige dyr og virker i almindelighed som et kemisk sterilisationsmiddel.

Det naturlige hormonfrigi vende hormon LH-RH er et decapeptid, som udgøres af naturligt forekommende aminosyrer (som har L-konfigurationen bortset fra den achirale aminosyre glycin). Dets sekvens er som følger: (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu--Arg-Pro-Gly-NH2· Mange analoge til dette naturlige materiale er blevet undersøgt, og et meget stort antal heraf har vist sig at have en utilstrækkelig biologisk virkning til at være klinisk nyttig. Visse valgte modifikationer har vist sig at have en gunstig virkning på biologisk aktivitet. Langt den mest signifikante modifikation er opnået ved at ændre resten i 6-stilling fra Gly til en D-aminosyre. Ved at erstatte Gly-resten i 6-stillingen med D-Ala, D-Leu, D-Phe eller D-Trp har man f.eks. fået en serie af analoge til LH-RH med forøget aktivitet i forhold til LH-RH. Se M. Monahan, et al., Biochem., 12, 4616 (1973) for [D Ala6]-|_HRH; J.A. Vilchez-Martinez, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 59, 1226 (1974) for [D-Leu6]LHRH og desGlyl°[D-Leu6, Pro NHEt9] LHRH; D.H. Coy, et al., J. Med. Chem., 19, 423 (1976) for [D-Phe]LHRH og W. Vale, et al., Clinical Endocrinology, 5th Supp., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England (1976), p. 2615 og D.H. Coy, et al.; Biochem. Biophys. Res. Comm., 67, 576 (1979) for [D-TRP6]LHRH.

Foruden de væsentlige aktivitetsforøgelser, der blev opnået ved de ovenfor nævnte i forbindelse med substitutionerne i stilling 6, kan der opnås yderligere aktivitetsforøgelser ved at eliminere Gly-NH2 i stilling 10 for at give et nonapeptid som et alkyl-, cykloalkyl- eller fluoralkylamid eller ved at erstatte Gly-NH2 med et α-azaglycinamid.

Se f.eks. M. Fujino, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 49, 863 (1972), D.H. Coy, et al., Biochem. 14, 1848 (1975) og A.S. Dutta, et al., J. Chem. Soc. Perkin I, 1979, 379.

Anvendelse af N-methy11eucin i stedet for leucinresten i stilling 7 fører til forøget stabilitet over for enzymatisk nedbrydning. Se f.eks. N. Ling, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 63, 801 (1975).

Erstatning af tryptophanresten i stilling 3 med 3-(1-naphthyl) -L-alanin fører til en forøgelse af den biologiske virkning. Se f.eks. K.U. Prasad, et al., J. Med. Chem., 19, 492 (1976) og Y. Yabe, Chem. Pharm. Bull., 24 (12), 3149 (1976).

Tyros i nresten i stilling 5 kan erstattes med phenylalanin eller 3-(1-pentaf1uorpheny1)-L-a1 an in med retentionen af væsentlig biologisk aktivitet. Se f.eks. N. Yanaihara, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 52, 64 (1973) og D. Coy, et al., J. Med. Chem., 16, 827 (1973).

Det ville være ønskeligt at fremstille yderligere analoge til LH-RH, som har en endog højere grad af biologisk aktivitet end de tidligere beskrevne, og som kan anvendes klinisk til dyr og mennesker.

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte nonapeptid-og decapeptidderi vater af LH-RH, som i 6-stillingen har visse lipofile D-aminosyrer. Opfindelsen angår endvidere midler til kontraception indeholdende forbindelserne.

Forbindelserne ifølge opfindelsen er mere specielt nonapept i -der og decapepti der, som er ejendommelige ved den almene formel

(pyro)Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Arg-Pro-Z

(I) og de farmaceutisk acceptable salte deraf, hvori: V er tryptophyl, phenylalanyl eller 3-(1-naphthyl)-L-alanyl, W er tyrosyl, phenylalanyl eller 3-(1-pentaf1uorpheny1)-L-ala-nyl, og X er en D-aminosyrerest med den almene formel hvori R er

(a) et carbocykli sk, arylholdigt radikal valgt fra den gruppe, der består af 1- og 2-naphthyl, 1-, 2- og 9-anthryl, 2-, 3-, 4- og 9-fluorenyl, 2-, 3- og 9-phenanthry1, biphenyl, benz-hydryl og med tre til fem ligekædede Cj_4alkylgrupper substitueret phenyl, Y er leucyl, isoleucyl, nor-leucyl eller N-methy11eucy1, Z er glycinamid eller -NH-rI, hvori Ri er en Ci_4alkylgruppe eller

, hvori R2 er hydrogen eller Ci_4alkylgruppe.

Som angivet ovenfor og for at lette beskrivelsen af opfindelsen anvendes de for de forskellige almindelige aminosyrer sædvanlige forkortelser, som er almindeligt accepteret på peptid- området og anbefalet af IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, Biochemistry, 11, 1726 (1972) og repræsenterer L-aminosyrer bortset fra det achirale aminosyreglycin og yderligere med undtagelse af aminosyrerne i 6-stillingen betegnet med X. Alle peptidsekvenser, som er nævnt heri, er skrevet i overensstemmelse med den almindeligt accepterede konvention, hvorved den N-terminale aminosyre er til venstre, og den C-terminale aminosyre er til højre.

Udtrykket "farmaceutisk acceptable salte" betegner heri salte, som bevarer moderforbindelsens ønskede biologiske aktivitet og ikke giver uønskede toxi kolog i ske virkninger. Eksempler på sådanne salte er (a) syreadd i tionssalte dannet med uorganiske syrer, f.eks. saltsyre, hydrogenbrom idsyre, svovlsyre, phos-phorsyre og salpetersyre, og salte dannet med organiske syrer såsom f.eks. eddikesyre, oxalsyre, vinsyre, ravsyre, maleinsy-re, fumarsyre, gluconsyre, citronsyre, æblesyre, ascorbi nsyre, benzoesyre, garvesyre, pamoicsyre, alginsyre, polyglutaminsy-re, naphthalensulfonsyrer, napthtalendisulfonsyrer, polygalac-turonsyre, (b) salte med polyvalente metal kat i oner såsom zink, calcium, vismut, barium, magnesium, aluminium, kopper, cobolt, nikkel og cadmium eller med en organisk kation dannet ud fra N, N '-di benzyl ethylendiamin eller ethyl endiami η , eller (c) kombinationer af (a) og (b), f.eks. zinktannatsalt.

Udtrykket "lavere alkyl" betegner heri en ligekædet eller forgrenet mættet hydrocarbongruppe med 1-4 carbonatomer såsom f.eks. methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sek.-butyl og tert-butyl, udtrykket "cykloalkylgruppe" betegner en cyklisk mættet hydrocarbongruppe med 3-6 carbonatomer, f.eks. cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl og cyklohexyl, udtrykket "f luor-lavere-alkyl" betegner en lavere alkylgruppe, hvori et eller flere af hydrogenatomerne er erstattet med fluor såsom f.eks. trif1uormethy1, pentaf1uorethy1 og 2,2,2-tri-f1uorethy1.

Udtrykket "naphthyl" anvendes heri som omfattende 1- og 2-naphthyl, "anthryl" omfatter 1-, 2- og 9-anthryl, "fluorenyl" omfatter 2-, 3-, 4- og 9-fluorenyl, "phenanthry1" omfatter 2-, 3- og 9-phenanthryl og "adamanty1" omfatter 1- og 2-adamantyl.

Foretrukne forbindelser ifølge opfindelsen er de forbindelser, hvori X er 3-(2-naphthyl)-D-alanyl eller 3-(2,4,6-tri methyl -phenyl)-D-alany!, Z er glycinamid eller -NHEthyl, V er tryp-tophyl eller phenyl al any!, W er tyrosyl, og Y er leucyl eller N-methylleucyl. Særligt foretrukne forbindelser er: (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-G1y-NH2, (pyro) Glu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alany1-N-methyl-

Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, (pyro) GIu-His-Phe-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alany!-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2/ (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-trimethylphenyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2» (pyro) GIu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-NHEt og (pyro) GIu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-N-methyl-Leu-Arg-Pro-NHEt og deres farmaceutisk acceptable salte.

(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alany1-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 og salte heraf foretrækkes specielt.

Forbindelserne ifølge opfindelsen og specielt saltene deraf udvi ser overraskende kraftig og langvarig LH-RH-antagoni st-virkning i sammenligning med de hidtil mest kraftigt virkende LH-RH-antagonister, nemlig (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Ser-Arg-Pro-Gly-NH2 og det tilsvarende des-Gly-prolylethyla-mid. Et primært mål for styrke er evnen til delvis eller fuldstændig at undertrykke østrus i fuldt udviklede hunrotter med normal cyklus (bestemt over en 2 ugers periode) ved to gange daglig subkutan injektion.

Andre bioprøver, der er blevet anvendt til LH-RH-ana1oge, og som er blevet anvendt til forbindelser ifølge den foreliggende opfindelse, omfatter: (a) ovu1 atϊon induktϊon i diestrøse eller proestrøse hunrotter ved subkutan injektion (Rippe!, et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 148, 1193 (1975)), (b) LH- og FSH-frigivelse ved hjælp af dispergerede hypofyse-forlapcellekulturer som målt ved radioimmunobestemme1 se (Vale, et al., Endocrinology, 91, 562 (1972)), og (c) LH- og FSH-frigivelse i den perifere cirkulation af ova-riectomiserede, steroidbehandlede rotter som reaktion på intravenøs injektion som målt ved radio i mmunobestemme!se (Ar i mura, et al.. Endocrinology, 90, 163 (1972)).

På et mere fremskredet niveau kan aktiviteten af disse forbindelser blive påvist in vivo ved undertrykkelse af spermatoge-nese og cirkulerings- og test i kulær niveau af testosteron såvel som dramatisk reduktion i prostatstørrelse hos hunde, der lider af godartet prostatisk hypertrofi.

Som et resultat af det ovenfor anførte kan forbindelserne finde anvendelse i en lang række tilfælde, hvor styring af LH og FSH eller direkte gonadal virkning er vigtig, inklusive:

Paradoxikale anvendelser (høidosisvirkninqer) - kontraception for kvinder, - ovulationundertrykkelse eller forhaling, - østrusundertrykkelse, - kontraception for mænd, - funktionel kastrering hos foderproducerende handyr.

Til de ovenfor beskrevne anvendelser, som er såkaldte "para-doksikale" eller højdosisanvendelser, er det almindeligvis hensigtsmæssigt af administrere den aktive bestanddel i mængder mellem ca. 0,01 og 100 pg/kg legemsvægt pr. dag, fortrinsvis mellem ca. 0,1 og 5,0 Mg/kg legemsvægt pr. dag. Denne administration kan gennemføres ved hjælp af en enkelt daglig administration ved fordeling over adskillige applikationer eller ved hjælp af langsom frigivelse for at opnå de mest effektive resul tater.

Den nøjagtige dosis og administrationsområdet af disse forbindelser og midler vil nødvendigvis afhænge af behovet hos den, der behandles og behandlingstypen. I almindelighed kræver parenteral administration 1avere doser end andre administrationsmetoder, som er mere afhængige af absorption.

De foreliggende forbindelser tåles udmærket og er forholdsvis ugiftige. Repræsentative forbindelser viser LDso-værdier ved subcutan administration til mus på godt over 40 mg/kg en meget stor sikkerhedsfaktor i sammenligning med de ovenfor beskrevne terapeutiske doser.

Den foreliggende opfindelse angår også midler til kontracep-tion, der som aktiv bestanddel omfatter forbindelser ifølge den foreliggende opfindelse, hvilke midler omfatter en sådan forbindelse i blanding med en farmaceutisk acceptabel, ikke toxisk bærer. Som nævnt ovenfor kan sådanne midler fremstilles til brug til parenteral (subcutan, intramuskulær eller intravenøs) administration, specielt i form af flydende opløsninger eller suspensioner, til brug i vaginal eller rectaladministra-tion specielt i halvfaste former såsom creme og stikpiller, til oral eller buccal administration, specielt i form af tabletter eller kapsler, eller intranasalt, specielt i form af pulver, næsedråber eller aeroso1 præparater.

Midlerne kan hensigtsmæssigt administreres i form af enhedsdoser og kan fremstilles ved hjælp af enhver af de i den farmaceutiske teknik velkendte metoder, f.eks. som beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA., 1970. Præparater til parenteral administration kan som almindelige hjælpestoffer indeholde sterilt vand eller saltvand, polyalkylenglycoler såsom polyethylenglycol, olier af vegetabilsk oprindelse, hydrogenerede naphthalener og lignende. Præparater til vaginal eller rectal administration, f.eks. stikpiller, kan som hjælpestoffer indeholde f.eks. polyalkylenglycoler, vaseline, kokos, smør og lignende. Præparater til inhalation kan være faste og som hjælpestoffer f.eks. indeholde lactose eller kan være vandige eller olieagtige opløsninger til administration i form af næsedråber. Til buccal administration omfatter typiske hjælpestoffer sukkerarter, calciumstearat, magnesiumstearat, prægel at ineret stivelse og 1 ignende.

Det er særligt ønskeligt at levere forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse til det menneske eller dyr, der behandles over længere tidsrum, f.eks. i tidsrum fra en uge til et år, fra en enkelt administration. Forskellige langsomt fri-givende depot- eller implantationsdoseringsformer kan anvendes. En doseringsform kan f.eks. indeholde et farmaceutisk acceptabelt ikke toxisk salt af forbindelsen, som har en lav opløsel ighedsgrad i legemsvæsker, f.eks. (a) et syreadditionssalt med en polybasisk syre såsom phosphorsyre, svovlsyre, citronsyre, vinsyre, garvesyre, pamoicsyre, algininsyre, gluta-minsyre, naphthalen mono- eller di-sul fonsyrer, polygalactu-ronsyre og lignende, (b) et salt med en polyvalent metalkation såsom zink, calcium, vismut, barium, magnesium, aluminium, kobber, cobolt, nikkel, cadmium og lignende eller med en organisk kation dannet af f.eks. Ν,Ν'-dibenzylethylendiamin eller ethylendiamin, eller (c) kombinationer af (a) og (b), f.eks. et zinktannatsalt. Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse eller fortrinsvis et forholdsvis uopløseligt salt som de netop ovenfor beskrevne, kan desuden tilberedes i en gel f.eks. en al uminiummonostearatgel med f.eks. sesamolie beregnet til injektion. Særligt foretrukne salte er zinksalte, zinktannatsalte, pamoatsalte og lignende. Andre typer af langsomt frigivende depotpræparater til injektion kan indeholde forbindelsen eller saltet dispergeret eller indkapslet i en langsomt nedbrydende ikke toxisk, ikke antigenisk polymer såsom en polymælkesyre/polyglycolsyrepolymer, f.eks. som beskrevet i US patentskrift nr. 3.773.919. Forbindelserne eller fortrinsvis forholdsvis uopløselige salte såsom de netop ovenfor beskrevne kan også tilberedes i cholesterolmatrixelastikpi1-ler, specielt til anvendelse i dyr. Yderligere langsomt frigivende depot- eller implantationspræparater, f.eks. liposomer, er velkendt i litteraturen. Se f.eks. "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J.R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Der kan findes særlig henvisning til LH-RH-type forbindelser, f.eks. i US patentskrift nr. 4.010.125.

Polypeptiderne ifølge den foreliggende opfindelse kan syntetiseres ved hjælp af enhver teknik, som kendes af fagfolk på peptidområdet. En udmærket oversigt over de mange mulige metoder kan findes i J.M. Stewart and J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969, og J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", bind 2, side 46, Academic Press (New York), 1973 ang. fastfasepeptidsyntese og E. Schroder og K. Lubke, "The Peptides", bind 1, Academic Press (New York), 1965 ang. klassiske opløsningssynteser.

Disse fremgangsmåder omfatter generelt trinvis tilsætning af en eller flere aminosyrer og passende beskyttede aminosyrer til en voksende peptidkæde. Enten aminogruppen eller carboxyl-gruppen af den første aminosyre beskyttes normalt ved hjælp af en egnet beskyttelsesgruppe. Den beskyttede eller afledte aminosyre kan så enten bindes til et inaktivt fast støttemateriale eller anvendes i opløsning ved tilsætning til den næste aminosyre i rækken, som har den komplementære (amino eller carboxyl) gruppe passende beskyttet under betingelser, som er velegnede til dannelse af amidbindingen. Den beskyttende gruppe fjernes så fra denne nytilsatte aminosyrerest, og den næste aminosyre (passende beskyttet) tilsættes så o.s.v. Efter at alle de ønskede aminosyrer er blevet bundet i den passende række, kan eventuelle resterende beskyttelsesgrupper (og eventuel fast støttemateriale) fjernes i rækkefølge eller samtidigt til opnåelse af det færdige polypeptid. Ved simpel modifikation af denne almene metode er det muligt at tilsætte mere end én aminosyre på en gang til en voksende kæde, f.eks. ved kobling (under betingelser, som ikke racemiserer chiralcen-trer) af et beskyttet tripeptid med et passende beskyttet d i -peptid til dannelse efter fjernelse af beskyttelse et penta-pept i d.

En særligt foretrukket fremgangsmåde til fremstilling af forbindelser ifølge den foreliggende opfindelse omfatter fastfa-sepept i dsyntese.

Ved denne særligt foretrukne metode beskyttes aminosyrernes a-aminofunktion ved hjælp af en syre- eller basefølsom gruppe Sådanne beskyttende grupper bør have den egenskab, at de er stabile over for betingelserne under peptidbindingsdannelsen, samtidig med at de let kan fjernes uden nedbrydelse af den voksende peptidkæde eller racemisering af eventuelle chiral-centrer, som findes deri. Egnede beskyttelsesgrupper er t-bu-tyloxycarbonyl (Boc), benzyloxycarbonyl (Cbz), bi phenyl isopropyl oxycarbonyl, t-amyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, α,α-di methyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, o-nitrophenylsulfe-nyl, 2-cyano-t-buty1oxycarbonyl og 9-f1uorenylmethyloxycarbonyl , specielt t-butyloxycarbonyl (Boc).

Særligt foretrukne s idekædebeskytte 1 sesgrupper er for arginin: nitro, p-toluensulfonyl, 4-methoxybenzensulfony 1, Cbz, Boc og adamantyloxycarbonyl, for tyrosin: benzyl, o-brombenzyloxycarbonyl , 2,6-dichlorbenzyl, isopropyl, cyklohexyl, cyklopentyl og acetyl, for serin: benzyl og tetrahydropyrany1, for histi-din: benzyl, p-toluensulfonyl og 2,4-dinitrophenyl.

C-terminalaminosyren bindes til et passende fast støttemateriale. Egnede faste støttematerialer, som er anvendelige til den ovennævnte syntese er de materialer, som er inaktive over for reagenserne og reaktionsbetingelserne ved de trinvise konden-sations-deprotektionsreaktioner såvel som uopløselige i de anvendte medier. Egnede faste støttematerialer er chlor, methyl -polystyren-divinylbenzenpolymer og hydroxymethyl polystyrendi -vinylbenzenpolymer, spec ielt chlormethyl-polystyren-1% di vi -nylbenzenpolymer. I det specielle tilfælde, hvor C-terminalen af forbindelsen er glycinamid, er et særligt egnet støttemateriale benzhydrylaminopolystyren-divinylbenzenpolymeren, der er beskrevet af P. Rivaille, et al., Helv. Chim. Acta., 54, 2772 (1971). Vedhæftningen til chlormethylpolystyren-divinylbenzen-typen af harpiks sker ved omsætning af den Na-beskyttede aminosyre, specielt Boc-aminosyren, som dets cæsium-, tetramet-hylammon i um-, tri ethyl ammon ium-, 4,5-d iazabicyklo[5,4,0]undec-5-en- eller lignende salt i ethanol, acetonitril og N,N-di met-iiylformamid (DMF), specielt cæsiumsaltet i DMF, med chlormet- hylharpiksen ved en forhøjet temperatur, f.eks. mellem ca. 40°C og 600C, fortrinsvis ca. 50°C i fra ca. 12 til 48 timer, specielt ca. 24 timer. N“-Boc-aminosyren bindes til benzhy-drylaminharpiksen ved hjælp af en N,N1-di cyklohexy1carbodi i mid (DCC)/l-hydroxybenzotriazol (HBT) medieret kobling i fra ca. 2 til 24 timer, fortrinsvis ca. 12 timer ved en temperatur på mellem ca. 10 og 50°C, fortrinsvis 25°C i et sådant opløsningsmiddel som dich1 ormethan eller DMF , fortrinsvis dichlor-methan. Den successive kobling af beskyttende aminosyrer kan gennemføres i et automatisk po1ypeptidsynteti ser ingsapparat, som er velkendt i teknikken. Fjernelsen af Na-beskyttelsesgrupperne kan gennemføres i nærværelse af f.eks. en opløsning af trif1uoreddikesyre i methylenchlorid, hydrogenchlorid i dioxan, hydrogenchlorid i eddikesyre eller anden stærk sur opløsning, fortrinsvis 50% tri fluoreddikesyre i dichlormethan ved omkring omgivelsernes temperatur. Hver beskyttet aminosyre indføres fortrinsvis i omtrent 2,5 molært overskud, og koblingen kan gennemføres i dichlormethan, dich1ormethan/DMF blandinger, DMF og lignede, specielt i methylenchlorid ved omkring omgivelsernes temperatur. Koblingsmidlet er normalt DCC i dichlormethan, men kan være N,N"-di iso-propy1carbodiimid eller andet carbodiimid enten alene eller i nærværelse af HBT, N-hy-droxysuccinimid, andre N-hydroxyimider eller oximer. Aktive estere af beskyttede aminosyrer (f.eks. p-nitropheny1 eller pentaf1uorpheny1) eller symmetriske anhydrider kan alternativt anvendes.

Ved afslutningen af fastfasesyntesen fjernes det fuldt beskyttede polypept i d fra harpiksen. Når bindingen til harpiksstøt-tematerialet er af benzyl estertypen, sker spaltning ved hjælp af aminolyse med en alkylamin eller fluoralkylamin for peptider med et prolin C-terminus eller ved aminolyse med f.eks. ammon i ak/methanol eller ammoniak/ethanol for peptider med en glycin C-terminus ved en temperatur mellem ca. 10 og 50°C, fortrinsvis ca. 25°C, imellem ca. 12 og 24 timer, fortrinsvis ca. 18 timer. Peptidet kan alternativt fjernes fra harpiksen ved transforestring, f.eks. med methanol, efterfulgt af aminolyse. Det beskyttede peptid kan renses på dette punkt ved hjælp af s i 1 i cage!kromatografi. Fjernelsen af (sidekæde) beskyttelsesgrupper fra polypeptidet gennemføres ved behandling af aminolyseproduktet med f.eks. vandfri flydende hydrogenfluorid i nærværelse af an i sol eller andre carbon iumfjernere eller deionisatorer, behandling med hydrogenf 1uorid/pyridi nkompleks, behandling med tris(trifluoracetyl)bor og trifluoreddi-kesyre, ved reduktion med hydrogen og palladium-på-carbon eller polyvinylpyrrolidon eller ved reduktion med natrium i flydende ammoniak, fortrinsvis med flydende hydrogenfluorid, og anisol ved en temperatur mellem ca. -10°C og +10°C, fortrinsvis ca. 0°C, i mellem ca. 15 minutter og 1 time, fortrinsvis ca. 30 minutter. Til giycinterm i nal peptiderne på benzhydryla-minharpikserne kan harpiksspaltningen og deprotektionstrinnene kombineret i et enkelt trin under anvendelse af flydende hydrogenfluorid og anisol som beskrevet ovenfor. Det fuldstændigt deprotekterede polypeptid renses så ved en række af kromatografiske trin under anvendelse af et, flere eller alle af de følgende typer; ionbytning på svagt basisk harpiks i acetatform, hydrofobi sk adsorptionskromatografi på uafledt polysty-ren-diviny 1 benzen (f.eks. Amberlite XAD), si 1icalgeladsorpti-onskromatografi, ionbytterkromatografi på carboxymethylcellu-lose, fordelingskromatografi, f.eks. på Sephadex G-25 eller modstrømsfordeling, high performance væskekromatografi (HPLC), specielt omvendt fase HPLC på octyl- eller octadecylsilylsi1i-ca bundet fasesøj 1epakning.

Hvis der anvendes en racemisk aminosyre i 6-stillingen, separeres de diastereomere nonapeptid- eller decapeptidslutproduk-ter, og det ønskede peptid indeholdende en D-aminosyre i 6-stillingen isoleres og renses, fortrinsvis under den ovenfor beskrevne kromatografiske proces.

Fremstillingen af peptider med C-terminalazaglycinamider sker fortrinsvis under anvendelse af klassiske peptidopløsningssynteser under anvendelse af kendte peptidmellemprodukter. Dette er beskrevet mere detaljeret i eksempel 3.

Fremstillingen af forbindelserne ifølge opfindelsen kan ske ved en fremgangsmåde, som omfatter (i) kobling af de enkelte eventuelt beskyttede fragmenter af den ønskede forbindelse med formlen I og/eller fjernelse af beskyttelsesgrupper og eventuelt covalent bundet fast støttemateriale fra et beskyttet polypeptid til opnåelse af en forbindelse af formlen (I) eller et salt deraf, og (ii) eventuelt omdannelse af en forbindelse af formlen (I) til et farmaceutisk acceptabelt salt, eller (i i i) om nødvendigt omdannelse af et salt af en forbindelse af formlen (I) til et farmaceutisk acceptabelt salt, eller (iv) om nødvendigt dekomponer i ng af et salt af en forbindelse af formlen (i) til et frit polypeptid af formlen (I).

De efterfølgende eksempler er anført for, at fagfolk på dette område kan forstå den foreliggende opfindelse fuldstændigt og udøve denne.

Fremstillingsmetode A

Til en ovntørret kolbe indeholdende 0,1 liter absolut ethanol (destilleret fra magnesiumethoxid) blev der tilsat 1,52 g natriummetal. Da hydrogenudviklingen ophørte, blev der tilsat 10,21 g ethyl-2-acetamid-2-cyanoacetat og 13,26 g 2-brommet-hylnaphthalen til opløsningen. Opløsningen blev opvarmet til tilbagesvaling i 1 time og derpå afkølet. Ethanolen blev fjernet under reduceret tryk, og resten blev optaget i ethyl acetat. Det organiske lag blev vasket med to portioner vand hver på 50 ml, en portion mættet natriumchloridopløsning på 50 ml og blev tørret over magnesiumsulfat. Opløsningen blev filtreret, opløsningsmidlet blev afstrippet ved reduceret tryk, og resten blev hydrolyseret i 100 ml koncentreret saltsyre ved tilbagesvaling i 2 timer.

Hydrolyseblandingen blev afkølet, og det udfældede råprodukt blev filtreret fra. Råproduktet blev opløst igen i 0,5 liter varmt vand indeholdende 5 ml koncentreret saltsyre behandlet med carbon, og opløsningens pH-værdi blev indstillet til 6 med koncentreret ammoniumhydroxid. Bundfaldet blev filtreret og tørret i vakuum til opnåelse af 11,3 g ren 3-(2-naphthy1)-D,L-alanin med smeltepunkt 230-232°C.

Ved gentagelse af den ovennævnte fremgangsmåde, idet der i stedet for 2-brommethylnaphtha!en anvendes en støkiometrisk ækvivalent mængde 1- brommethylnaphthalen, 9-brommethylanthracen, 9-brommethylf luoren, 2- brommethylfluoren, 2- brommethylanthracen, 1-brommethylanthracen, a-chlorisoduren, 4-brommethylbiphenyl, 1-brommethyladamantan, 3- brommethylphenanthren, l-chlormethyl-2,4,6-tri-(n-butyl)benzen og l-chlormethyl-2,3,4,5,6-pentamethylbenzen fås henholdsvis følgende aminosyrer: 3-(1-naphthyl)-D,L-alanin, smp. 185-187°C, 3-(9-anthryl)-D,L-alanin, smp. 290°C (HCl-salt) 3-(9-fluorenyl)-D,L-alanin, 3-(2-fluorenyl)-D,L-alanin, smp. 264-269°C, 3-(2-anthryl)-D,L-alanin, 3-(1-anthryl)-D,L-alanin, 3-(2,4,6-trimethylphenyl)-D,L-alanin, smp. 235-237°C, 3-(4-biphenylyl)-D,L-alanin, smp. 290°C, 3-(1-adamantyl)-D,L-alanin, 3-(3-phenanthryl)-D,L-alanin, 3-(2,4,6-tri(n-butyl)phenyl)-D,L-alanin og 3-(2,3,4,5,6-pentamethylphenyl)-D,L-alanin.

Fremstillingsmetode B

En opløsning af 18,2 g 1,1—diphenylethylen, 25,3 g methyl-ot-methoxy-N-benzyloxycarbonylglycinat og 1,5 g 2-naphthalensul-fonsyre i 300 ml tør benzen blev tilbagesvalet i to dage. Råproduktet blev renset på en søjle af kiselsyre under anvendelse af en gradient af Ci^C^ til C^C^/EtOAc (18:1). Det rensede methyl-2—[1-(2,2-diphenylethylenyl)]-N-benzyloxycar-bonylglycinat blev hydrolyseret til den tilsvarende syre med en opløsning af 10,9 g KOH i 350 ml 10% vandig methanol. Den resulterende rå syre blev opløst i 100 ml 95¾ ethanol inde holdende 3 ml koncentreret HCl og hydrcgeneret i nærværelse af 2 g 10% Pd-på-carbon i 24 timer til opnåelse af 2,4 g 3-(2,2-diphenylmethyl)-D,L-alanin, smp. 235-237 C.

Fremstillingsmetode C

Til en opløsning af 12,9 g 3-(2-naphthyl)-D,L-alanin i 120 ml 1-M NaOH blev der sat 6,23 ml eddikesyreanhydrid og 60 ml 1 M NaOH i løbet af 1/2 time ved 0°C. pH-værdien blev indstillet på 2 med koncentreret HCl, og det resulterende bundfald blev filtreret. Det faste stof blev omkrystalliseret fra 60% vandig ethanol til opnåelse af 12,2 g N-acetyl-3-(2-naphthyl)-D,L-alanin.

Til en opløsning af 15 g af denne N-acetylaminosyre i 240 ml tør methanol blev der sat 15,8 ml bortrifluoridetherat, og blandingen blev tilbagesvalet i 1 time. Alkoholen blev af-dampet, 200 ml vand blev tilsat, og opløsningen blev ekstraheret med ethylacetat. Det organiske lag blev vasket med vandig base og syre, tørret over MgSO^, filtreret og strippet til en olie. Krystallisation af denne olie fra ethylacetat/ hexan gav 14,2 g methyl-N-acetyl—3—(2-naphthyl)-D,L-alaninat, smp. 79-80°C.

Gentagelse af den ovennævnte fremgangsmåde, men ved erstatning af 3-(2-naphthyl)-D,L-alanin med en støkiometrisk ækviva- lent mængde 3-(1-naphthyl)-D,L-alanin, - 3-(2-fluorenyl)-D,L-alanin, 3-(2-anthryl)-D,L-alanin, 3-(1-anthryl)-D,L-alanin og 3-(2,2-diphenylmethyl)-D,L-alanin blev der opnået henholdsvis methyl-N-acetyl-3-(2-fluorenyl)-D,L-alaninat, smp. 97,5~98°< methyl-N-acetyl-3-(2-fluorenyl)-D,L-alaninat, smp.170-171°C methyl-N-acetyl-3-(2-anthryl)-D,L-alaninat og methyl-N-acetyl-3-(2,2-diphenylmethyl)-D,L-alaninat, smp. 113-114°C.

Fremstillingsmetode D

En opløsning af 6,6 g methyl-N-acetyl-3-(2-naphthyl)-D,L-alaninat i en blanding af 300 ml dimethylsulfoxid, 120 ml 1 M KCl og 780 ml H^O blev behandlet med 33,6 mg af enzymet subtilisin i 3 ml 0,1 M KCl. pH-værdien blev holdt på 7 ved hjælp af en automatisk titrering medO,2MNaOH ved hjælp af en Radiometer pH-stat. Efter 30 minutter var der blevet optaget 70 ml NaOH opløsning, og hydrolysen var standset. Opløsningen blev gjort basisk med 12 g NaHCO^ og blev ekstraheret med ethylacetat. Det organiske lag indeholdt methyl-N-acetyl-3- (2-naphthyl)-D-alaninat. Krystallisation fra ethyl-acetat/hexan gav et gult fast stof, smp. 8081°C.

Dette blev omdannet til den fri aminosyre og derpå til N-Boc-aminosyre som følger:

En opløsning af 2,5 g methyl-N-acetyl-3-(2-naphthyl)-D-ala-ninat i 60 ml 6N HC1 blev opvarmet til 120-130°C i 3 timer og afkølet til stuetemperatur. Det dannede hvide bundfald blev opsamlet og omkrystalliseret fra 50 ml E^O indeholdende 1 ml 12N HC1 ved neutralisation med NH^OH til pH 6 og tørret i vakuum til opnåelse af 1,2 g 3-(2-naphthyl)-D-alanin, smp. 242-244°C, [a]^5 26,6° (c 0,5, CH3COOH).

En omrørt opløsning af 3-(2-naphthyl)-D-alanin i en blanding af 55 ml IN NaOH, 10 ml H^O og 20 ml dioxan blev behandlet med 1,48 g di-tert-butyldicarbonat og o,22 g magnesiumoxid ved 0°C. Efter 1,5 timer blev der tilsat yderligere 0,3 g di-tert-butyldicarbonat, og blandingen fik lov til at antage stuetemperatur. Det faste stof blev filtreret fra, og filtratet blev koncentreret til 50 ml. Denne vandige opløsnings pH-værdi blev indstillet på 2,5 med NaHSO^ og ekstraheret med ethylacetat. Det organiske lag blev vasket med 5% NaHSO^, vand og mættet saltopløsning. Ethylacetatopløsningen blev tørret over magnesiumsulfat, filtreret og koncentreret til en olie, som blev krystalliseret fra ether/hexan til opnåelse af 1,3 g N-Boc-3-(2-naphthyl)-D-alanin, smp. 90-91°C, [a]^ -32,6° (c 0,8,

MgOH).

Gentagelse af den ovennævnte fremgangsmåde, men ved erstatning af methyl-N-acetyl-3-(2-naphthyl)-D,L-alaninat med en støkiometrisk ækvivalent mængde af methyl-N-acetyl-3- (1-naphthyl). -D, L-alaninat, methyl-N-acetyl-3-(2—fluorenyl)-D,L-alaninat, methyl-N-acetyl-3-(2-anthryl)-D,L-alaninat og methyl-N-acetyl-3-(2,2-diphenylmethyl)-D,L-alaninat opnås der henholdsvis de følgende Na-Boc-aminosyrer via de tilsvarende frie aminosyrer: N-Boc-3-(1-naphthyl)-D-alanin, smp. 92-93°C, 54,8° (c 0,5 MeOH), N-Boc-3-(2-fluorenyl)-D-alanin, smp. 161-163°C (dekompone-ring), N-Boc-3-(2-anthryl)-D-alanin og

N-Boc-3-(2,2-diphenylmethyl)-D-alanin, smp. 153-154°C. Fremstillingsmetode E

I en Parr-hydrogeneringskolbe blev der anbragt 0,85 g 3-(2- naphthyl)-D-alanin, 100 ml 2 M saltsyre og 0,85 g Adam's katalysator (PtO~). Opløsningen blev lukket inde under 60 5 2 4,14x10 N/m H^gas i 20timer i et Parr hydrogeneringsapparat. Blandingen blev opvarmet for at opløse det hvide bundfald og blev filtreret gennem diatoméjord. Koncentrering af opløsningen ved reduceret tryk efterfulgt af lyofilicering fra vand gav 0,8 g 3-(2-perhydronaphthyl)-D-alanin som et hvidt fast stof med smeltepunkt 230-232°C.

Dette stof blev opløst i en blanding af 3,2 ml 1 N NaOH, 5 ml vand og 15 ml dioxan og blev behandlet med 0,14 g MgO og 0,85 g di-tert-butyldicarbonat. Efter 1 time ved 0°C og 2 timer ved 25°C blev suspensionen filtreret, koncentreret til tørhed ved reduceret tryk, resten opløst i vand, vasket med diethylether og syrnet til pH-værdi 2 med NaHSC>4. Det syrnede vandige lag blev ekstraheret 3 gange med ethylacetat, og ekstrakterne blev forenet, tørret over MgSO^, filtreret og koncentreret til opnåelse af 0,75 g N-Boc-3-(2-perhydronaphthyl)-D-alanin som en hvid olie.

En 0,1 g portion af dette stof blev opløst i 5 ml tetrahydro-furan og titreret ved 0°C med frisk fremstillet diazomethan, indtil den lysegule farve holdt sig. Reaktionen blev kvalt med 1 ml eddikesyre, opløsningsmidlet blev afdampet, og resten blev fordelt mellem 75 ml ethylacetat og 75 ml vand. Det organiske lag blev vasket med 5% NaOCO^, vand, 5% NaHS04, vand, mættet NaCl-opløsning og tørret over MgSO^. Opløsningen blev filtreret, koncentreret under reduceret tryk og overført til en præparativ tyndtlagskroinatografiplade (750 μ tyk, sili-cagel, 20 x 20 cm). Pladen blev fremkaldt med dichlormethan/ ethylacetat (18/1), og produktbåndet blev fjernet. Silicage-len fra produktbåndet blev vasket med dichlormethan/ethylacetat (9:1) på en frittet glastragt, og filtratet blev koncentreret til opnåelse af 0,1 g methyl-N-Boc-3-(2-perhydronaphthyl)-D-alaninat som en lysegul olie.

Dette stof blev opnået som en blanding to isomere ved 2-stil-lingen af perhydronaphthalenkernen. Disse diastereomere forbindelser kan adskilles på en højeffektiv væskekromatografi-søjle (Lichrosorl^silicagel 60, 5 mikron) med ethylac-etat/ hexan (1:9) som elueringsmiddel og hydrolyseres til den fri syre, N-Boc-3-(2-perhydronaphthyl)-D-alanin.

Ved at gentage den ovennævnte fremgangsmåde, men i stedet for 3-(2-perhydronaphthyl)-D-alanin at anvende en støkiometrisk ækvivalent mængde 3-(1-naphthyl)-D-alanin, 3-(2,2-diphenylmethyl)-D-alanin, 3-(2,4,6-trimethylphenyl)-D,L-alanin, 3-(4-biphenyny1)-D,L-alanin, 3-(2,4,6-tri(n-butyl)phenyl)-D,L-alanin og 3-(2,3,4,5,6-pentamethylphenyl)-D,L-alanin opnås der henholdsvis de følgende N-Boc-aminosyrer: N-Boc-3-(1-perhydronaphthyl)-D-alanin, N-Boc-3-(perhydro-2,2-diphenylmethyl)-D-alanin.

N-Boc-3-(2,4,6-trimethylcyklohexy1)-D,L-alanin, N-Boc-3-(perhydro-4-biphenylyl)-D,L-alanin, N-Boc-3-(2,4,6-tri-n-butyl)cyklohexyl-D,L-alanin og N-Boc-3-(2,3,4,5,6-pentamethylcyklohexyl)-D,L-alanin.

Eksempel 1 I reaktionsbeholderen af et Beckman 990 Peptidsynthetiserings-apparat blev der anbragt 0,8 g (0,8 mmol) benzhydrylamino-polystyren-divinylbenzen-harpiks (Lab Systems, Inc.) som beskrevet af Rivaille, supra. Aminosyre blev tilsat fortløbende til denne harpiks ved hjælp af et syntheseprogram som følger:

Trin 1 CH2Cl2-vask 1 gang 1,5 min.

2 50% CF3C02H/CP2C12— 1 gang 1,5 min.

deprotektion 3 50% CF3C02H/CH2C12— 1 gang 30 min.

deprotektion 4 CH2Cl2-vask 3 gange 1,5 min.

5 10% triethylamin/CH2Cl2 2 gange 1,5' min.

6 CH2Cl2-vask 3 gange 1,5 min.

7 Na-Boc-aminosyreopløsning 1 gang tilsæt 8 N,N1-dicyklohexylcarbo- 1 gang tilsæt diimidopløsning 9 CH2Cl2-skylning og holde- 1 gang koblingskobling reaktion 3 2 timer 10 CH2C12—skyl tilsæt 1 gang 1,5 min.

11 CH2Cl2~vask 3 gange 1,5 min.

12 ethanol-vask 3 gange 1,5 min.

13 CH2Cl2~vask 3 gange 1,5 min.

Trin 1-13 fuldender en koblingscyklus for én aminosyre, og fuldstændigheden af reaktionen checkes ved hjælp af ninhydrin-metoden ifølge E. Kaiser, et al., Anal. Biochem., 34, 595, (1970) .

Denne harpiks blev koblet fortløbende med et 2,5 molært overskud af hver beskyttet aminosyre og DCC. Harpiksen blev således behandlet i løbet af efter hinanden følgende koblingsperioder med 0,433 g Boc-Gly-OH, 0,432 g Boc-Pro-OH, 0,857,g Boc-Arg(Tosyl)-OH, 0,462 g Boc-Leu-OH, 0,504 g Boc-3-(2-naphthyl)-D-alanin og 0,272 g 1-hydroxy-benzotriazol, 0,724 g Boc,0-^2-brombenzyloxycarbonylJ-L-tyrosin, 0,59 g Boc-Ser (Benzyl)-OH, 0,608 g Boc-Trp-OH, 0,654 g Boc-His(Tosyl)-OH og 0,524 g pyroglutaminsyre.

Harpiksen blev fjernet fra reaktionsbeholderen, vasket med og tørret i vakuum til opnåelse af 2,0 g beskyttet polypeptidharpiks.

Polypeptidproduktet blev samtidigt fjernet fra harpiksen og fuldstændigt deprotektioneret ved behandling med vandfri flydende HF. En blanding af 2,0 g beskyttet polypeptidharpiks og 2 ml anisol (rensemiddel) i en Kel-F=o:eaktionsbeholder blev behandlet med 20 ml gendestilleret (fra CoF^) vandfri flydende HF ved 0°C i 30 minutter. HF blev fjernet under vakuum;og resten af (pyro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, som dets HF-salt, blev vasket med ether. Resten blev derpå ekstraheret med iseddikesyre. Eddikesyreekstrakten blev lyofiliseret til dannelse af 0,8 g råmateriale.

Det rå polypeptid blev anbragt på en 4 x 40 cm Amberlite XAlf^4 søjle (polystyren-4% divinylbenzencopolymer) og elueret med en konkav gradient fra vand (0,5 liter) til ethanol (1 liter). Rørene indeholdende fraktioner fra udstrømmende volumen 690 ml - 1470 ml blev forenet og strippet til tørhed til opnåelse af 490 mg delvis renset polypeptid.

En 150 mg prøve af det delvis rensede produkt blev underkastet skillekromatografi på en 3 x 50 cm søjle af Sephadex G-2^under anvendelse af opløsningsmiddelsystemet 1-butanol/toluen/ eddikesyre/vand indeholdende 1,5% pyridin i forholdet 10:5:12: 18. De rene fraktioner blev forenet på basis af tyndtlags-kromatografi (silicagel; Bu0H/H20/H0Ac/Et0Ac; 1:1:1:1) og HPLC (5 mikron, omvendt fase, octadecylsilylpakning, 40% 0,03 M NH^OAc/60% acetonitril). Det ønskede produkt kom fra søjlen i fraktioner fra udstrømmende volumen 1000 ml - 1400 ml (Rf 0,1). De rene fraktioner blev forenet, strippet til tørhed, optaget i H2O og lyofiliseret til opnåelse af 57 mg rent pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3~(2-naphthyl) -D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid som dets eddikesyreadditionssalt, [α]ρ~* “27,4° (c 0,9, HOAc) , smp. 185-193° C (dekomponering).

Eksempel 2

Til syntesen af analoge med et C-endestillet Pro-NH-CH^CH^ blev der anvendt et synteseprogram svarende til det i eksempel 1 beskrevne. Beckman 990 Peptide Synthesizer-reaktionsbeholderen blev forsynet med 2,13 g Boc-Pro-O-harpiks fremstillet ved reaktionen af ækvimolære forhold af det tørre cæsiumsalt af Boc-Pro-OH med chlormethyl-polystyren/1% divinylbenzen (Lab Systems, Inc.). Boc-Pro-O-harpiksmængden, som blev taget, indeholdt 1,4 mmol prolin.

Harpiksen blev koblet fortløbende med et 2,5 molært overskud af hver beskyttet aminosyre og DCC. Harpiksen blev således omsat under successive koblingsperioder med 1,61 g Boc-Arg(Tosyl)-OH, 0,93 g Boc-Leu-OH, H20, 0,94 g Boc-3-(2-naphthyl)-D-alanin og 0,49 g 1-hydroxybenzo-triazol, 1,75 g N-Boc-O-2-brombenzyloxycarbonyl-L-tyrosin og 1,11 g Boc-Ser(Benzyl)-OH.

På dette syntesepunkt blev mængden af beskyttet polypeptid-harpiks opdelt i halvdele, og den ene halvdel blev kørt færdig ved fortløbende reaktion med 0,57 g Boc-Trp-OH, 0,77 g Boc-His(Tosyl)-OH og 0,21 g pyroglutaminsyre.

Harpiksen blev fjernet fra reaktionsbeholderen, vasket med CH2C12 og tørret i vakuum til opnåelse af 2,26 g beskyttet polypeptidharpiks.

Det beskyttede polypeptid blev spaltet fra harpiksen ved ami-nolyse med 25 ml ethylamin i 18 timer ved 2°C. Ethylaminen fik lov til at fordampe, og harpiksen blev ekstraheret med methanol. Methanolen blev inddampet til opnåelse af 1,39 g pyro-Glu-His(Tosyl) - Trp-Ser(Benzyl)-Tyr{2-brombenzyloxycarbony1)-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-Leu-Arg(Tosyl)-Pro-NH-CH2CH3.

Det rå polypeptid blev deprotektioneret ved behandling med en blanding af 3 ml anisol og 30 ml gendest i 11 eret (fra C0F3) vandfri flydende HF ved 0°C i 30 minutter i en Kel-F reaktionsbeholder. HF blev afdampet under vakuum, og resten blev vasket med ether. Resten blev opløst i 2 M eddikesyre og lyo-f i 1 i seret til opnåelse af 0,82 g rå (pyro)-G 1u-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanin-Leu-Arg-Pro-NH-CH2CH3 som dets eddikesyreadditionssalt. Slutrensning blev opnået ved præparativ højeffektiv væskekromatografi af en 20 mg prøve på en 0,9 x 550 mm søjle af 40-50 μ octadecy1 s i 1y1eret silica (Merck, Lic-hroprep®Ci8)· Elueringsmidlet var 64% 0,03 M NH40Ac/36% aceto-nitril. I fire løb blev der renset i alt 61 mg råmateriale. Efter tre lyofi 1iseringer fra vand blev der opnået 15 mg rent pyroglutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolinethylamid som dets eddikesyreadditionssalt, smp. 180-190°C, [a]25 -57,2° (C 1,1, HOAc).

Eksempel 3

Forbindelser af formlen X, hvori Z er

kan frem stilles ved hjælp af klassisk opløsningssyntese.

Der kan f.eks. anvendes følgende fremgangsmåde, hvori "AzaGlyNH2" er

som det fri peptid eller salt,

Koblingen af enkeltfragmenterne kan ske ved hjælp af acylazid-metoden (J. Honzel, et al., Coll. Czech. Chem. Comm., 26, 2333 (1971)) ved DCC/HBT-kobling eller andre racemiseringsfri fragmentkoblingsteknikker. Forbindelserne (1) og (2) er kendte forbindelser (jf. henholdsvis M. Fujino, et al., Biochem. Bio-phys. Res. Comm., 57, 1248 (1974) og A.S. Dutta, et al., J. Chem. Soc. Perkin I, 1979, 379). Forbindelsen (3) fremstilles af (2) ved fjernelse af Cbz- og nitrogrupperne ved hydrogeno-lyse efterfulgt af kobling med N-Boc-3-(2-naphthy1)-D-alan in under anvendelse af DCC/HBT eller et andet i teknikken kendt koblingsmiddel. Se Dutta, et al., supra vedrørende en lignende LH-RH-analogsyntese.

Eksempel 4

Ved gentagelse af fremgangsmåden fra eksempel 1 og anvendelse af enten en D-aminosyre eller en D,L-aminosyre i stilling 6 (i sidstnævnte tilfælde, idet de diastereomere peptider separeres under kromatografi), idet de passende aminosyrer erstattes i fastfasesynteserækken, kan der opnås følgende decapepti der, der isoleres og karakteriseres som deres eddi ksyreadd it ionssal te: pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-{2-naphth- yl)-D-alanyl-N-methylleucyl-arginyl-prolyl-glycinamid, [a]25

D

-26,6° (C = l, HOAc) , pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(l-naphth- yl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid, smp. 173-175°C, [a]25 -28,1° (C=0,8, HOAc), 0 pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2-fluore-nyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid, [a]25 -25,8° (C=l, HOAc), ° pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(4-biphenyl- yl )-D-alanyl-N-leucyl-arainyl-propyl-glycinamid, [a]25 -35,7°

D

(C=l, HOAc), og pyro-g1utamy1-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2,4,6-tri- methylphenyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid, [a] 25

D

-42,1° (C=l, HOAc).

Eksempel 5

Ved at gentage fremgangsmåden fra eksempel 2 og anvende enten en D-aminosyre eller en D,L-aminosyre ved stilling 6 (i sidstnævnte tilfælde, idet de diastereomere peptider separeres under kromatografi), idet de passende aminosyrer substitueres i fastfasesyntesefor løbet, kan der opnås følgende nonapepti der, der isoleres og karakteriseres som deres eddikesyreadditionsal te: pyro-glutamyl-histidyl-phenylalanyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naphth- yl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som dets ethylamid, snip.

180-190°C, [a]25 -57,2° (C=l, 10% HOAc),

D

pyro-giutamyl-hi stidyl-3-(1-naphthyl)-L-a1 any1-sery1 -tyrosy1 -3-(2-naphthyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som dets ethylamid, smp. 160-170°C, [a]25 -45,300 (C=l, HOAc},

D

pyro-giutamyl-hist i dyl-tryptophyl-sery1-tyrosy1-3-(2,2-diphe- nyImethy1)-D-a1 any1 -1eucy1-arginy 1-pro 1 in som dets ethylamid, smp. 176-206°C, [a]25 -33,70 (C=l, 10% HOAc) og

D

pyro-glutamyl-hi sti dy1-tryptophyl-sery 1-tyrosyl-3-(2-naphthyl)-O-al any 1-N-methyl leucyl-arg i ny 1-pro 1 i n som dets ethylamid, smp. 170-185°C, [a]25 -81,1° (C=0,7, 10% HOAc).

D

Eksempel 6 A. En opløsning af 0,1 g af hydrogenfluoridsaltet af (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (se eks. 1) opløses i 50 ml vand og sendes gennem en søjle af 50 g Dowex 3® anionbytterharpiks, som forud er blevet bragt i ligevægt med eddikesyre og vasket med deioniseret vand. Søjlen elueres med dioniseret vand, og den udstrømmende væske lyofi-liseres til opnåelse af det tilsvarende eddikesyresalt af (pyro) GIu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2/ [a]25 -27,5° (c 0,9, HOAc).

Eksempel 7

En opløsning af 50 mg (pyro)GIu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl )-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 eddikesyresalt i 25 ml vand ledes gennem en 50 g søjle af Dowex 1® (kraftigt basisk, kvater-nær ammoniumanionbytterharpiks), som er blevet bragt i ligevægt med NaOH opløsning til fremstilling af modionhydroxidet.

Søjlen elueres med 150 ml vand, og elueringsmidlet lyofilise-res til fremstilling af 45 mg af det ovennævnte polypeptid som den fri base.

Eksempel 8

De følgende er typiske produkter, der som den aktive bestanddel indeholder en LH-RH-analog ifølge den foreliggende opfindelse, f.eks. (pyro)GIu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthy1)-D-ala-nyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 i sig selv eller som et ikke-toksisk salt, f.eks. eddikesyreadditionssaltet, zinksaltet eller zink-tannatsaltet.

A. Tabletpræparater til buccal (f.eks. under tungen) administration: 1. LH-RH-analog 50,0 ,ug

Sammenpresseligt sukker, USP* 96,0 mg

Calciumstearat 4,0 mg 2. LH-RH-analog 30,0 pg

Sammenpresseligt sukker, USP 98,5 mg

Magnesiumstearat 1,5 mg * USP = United States Pharmacopeia 3. LH-RH-analog 25,0 μ g

Mannitol, USP 88,5 mg

Magnesiumstearat, USP 1,5 mg

Prægelatineret stivelse, USP 10,0 mg 4. LH-RH-analog 200,0 ;ug

Lactose, USP 83,3 mg

Prægelatineret stivelse, USP 15,0 mg

Magnesiumstearat, USP 1,5 mg

Fremstillingsmetode a. LH-RH-analog opløses i vand i en tilstrækkelig mængde til at danne et vådt pulver, når det blandes med hjælpestoffernes sukkerdel. Efter endt blanding tørres pulveret i en bakke eller i et fluidiseret leje. Det tørre pulver sigtes derpå til nedbrydning af eventuelle større aggregater og blandes derpå med de resterende komponenter. Pulveret sammenpresses så på en standard tabletteringsmaskine til den specifikke tabletvægt .

b. Ved denne fremstillingsmetode indeholder alle præparater sædvanligvis 0,01% gelatine, USP. Gelatinen opløses først i det vandige granuleringsopløsningsmiddel efterfulgt af den LH-RH-analoge. De resterende trin er som angivet ovenfor under (a) .

Præparatet 4 kan også anvendes som tablet til oral administration.

B. Langtidsvirkende intramuskulært injicerbart praparat.

1. Langtidsvirkende intramuskulært injicerbar - Sesamoliegel LH-RH-analog 1,0 mg

Aluminiummonostearat, USP 20,0 mg

Sesamolie til opløsning indtil 1,0 ml

Aluminiummonostearatet forenes med sesamolien og opvarmes til 125°C under omrøring, indtil der dannes en klar gul opløsning. Denne blanding autoklaveres så, indtil den er steril, og får lov til at afkøle. Den LH-RH-analoge tilsættes så aseptisk under sønderdeling. Særligt foretrukne LH-RH-analoge er salte af lav opløselighed, f.eks. zinksalte, zinktannatsalte, pamo-atsalte og lignende. Disse giver usædvanlig lang aktivitetsvarighed .

2. Langtidsvirkende intramuskulært injicerbar - Bionedbrydelige polymermikrokapsler LH-RH-analog 1% 25/75 glycolid/lactid- 99% copolymer (0,5% indre viskositet)

Mikrokapsler (0-150 p) af ovennævnte sammensætning suspenderet i:

Dextrose 5,0% CMC, natrium 0,5%

Benzylalkohol 0,9%

Tween 80 0,1%

Vand, renset til opløsning 100,0% 25 mg mikrokapsler blev suspenderet i 1,0 ml bærer.

C. Vandig opløsning til intramuskulær injektion LH-RH-analog 25 mg

Gelatine, ikke antigenisk 5 mg

Vand til injektion til opløsning indtil 100 ml

Opløs gelatine og LH-RH-analog i vand til injektion, steriliser derpå filteropløsningen.

D. Vandig opløsning til nasal administration.

LH-RH-analog 250 mg

Dextrose ^

Benzylalkohol 0,9 mg

Vand, renset til opløsning indtil 100 ml

Opløs LH-RH-analog, dextrose, benzylalkohol i renset vand og til opløsning til volumenet.

E. Sammensætning til rektal administration

Stikpillebærer til rektal administration LH-RH-analog 500 pg

Witepsol H15 20,0 g

Den LH-RH-analoge forenes . med det smeltede Witepsol H15, blandes omhyggeligt og hældes i 2 g forme.

Eksempel 9 Østrusundertrykkelse i rotter

Fremgangsmåde: Hunrotter (Hilltop Sprague Dawley, ca. 200 g med åbne vagina) vejes grupperet fem pr. bur og to bur pr. gruppe. Rotterne injiceres subkutant to gange daglig (bortset fra det nedenfor anførte) i 14 dage. Der udtages dagligt vaginalslim til bestemmelse af østruscyklusstadiet, og legemsvægten optegnes efter 0, 1 og 2 ugers forløb. Det antal hundyr, som udviser delvis østrusundertrykkelse (d.v.s. kun di-østrus og proøstrus, men ikke østrus) fra 4. dag,og procenten af hundyr, som viser fuldstændig østrusundertrykkelse (d.v.s. kun diøstrus) fra 4. dag, optegnes. ED j-q-værdierne bestemmes ud fra den bedst egnede lige linie af procentdataene for østrusundertrykkelse. LH-RH-analoge blev administreret som deres acetatsalte i fysiologisk saltvand indeholdende 0,1% bovinserumalbumin. Injektionsvolumenet var 0,2 ml, og den- analoge indgik som 0,05, 0,1, 0,2 eller 0,4 pg. En kontrol (fysiologisk saltvand indeholdende BSA) udviste ingen østrusundertrykkelse. ED^q-værdierne for kombineret partial- og fuldstændig østrusundertrykkelse er som følger:

Forbindelse ED50 jetton (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)- 0,08 D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)- 0,22 D-alanyl-Leu-Arg-Pro-NHEt (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)- 0,07 D-alanyl-N-MeLeu-Arg-Pro-Gly.-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)- 0,12 D-alanyl-N-MeLeu-Arg-Pro-NHEt (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-trimethyl- 0,08 phenyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(1-naphthyl)- 0,3 D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(9-anthryl)- 0,27 D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(4-biphenylyl)- 0,28a D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2—fluorenyl)- 0,40a D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,2-diphenyl- 0,11 methyl-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-'NHEt (pyro) Glu-PIis-Trp-Ser-Tyr-3- (2,4,6-trimethyl- 0,35 phenyl)-D-alanyl-N-MeLeu-Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro)-Glu-His-3-(1-naphthyl)-L-alanyl-Ser- 0,16

Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-NHEt a - For disse forbindelser skete der kun administration 1 gang daglig.

Claims (9)

1. LHRH-analoge nona- og decapeptidderivater, kendetegnet ved, at de har den almene formel (pyro)Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Arg-Pro-Z (I) og de farmaceutisk acceptable salte deraf, hvori: V er tryptophyl, phenylalanyl eller 3-(1-naphthy1)-L-alanyl, W er tyrosyl, phenylalanyl eller 3-(1-pentaf1uorphenyl)-L-ala-nyl, og X er en D-aminosyrerest med den almene formel

hvori R er (a) et carbocykli sk, arylholdigt radikal valgt fra den gruppe, der består af 1- og 2-naphthyl , 1-, 2- og 9-anthryl, 2-, 3-, 4- og 9-fluorenyl, 2-, 3- og 9-phenanthry1 , biphenyl, benz-hydryl og med tre til fem ligekædede C^-^alkylgrupper substitueret phenyl , V er leucyl, isoleucyl, nor-leucyl eller N-methylleucyl, Z er glycinamid eller -NH-Rl, hvori Ri er en Cj_4alkylgruppe eller

, hvori R2 er hydrogen eller Ci_4alkylgruppe.

2. Forbindelser ifølge krav 1, kendetegnet ved, at V er tryptophyl eller phenylalanyl, W er tyrosyl, X er 3-{2-naphthyl)-D-alanyl eller 3-(2,4,5-trimethy1 phenyl)-D-alany 1, Y er leucyl eller N-methyl-leucyl, og Z er glycinamid eller -NHEthyl.

3. Forbindelse ifølge krav 2, kendetegnet ved, at X er 3-(2-naphthyl)-D-alanyl.

4. Forbindelse ifølge krav 2, k e n d e t e g n e t ved, at den er (pyro)G1u-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-a1 any 1-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 eller de farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf.

5. Forbindelse ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den er (pyro)G1u-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthy1)-D~a1 any1-N-methyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 eller (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthy1)-D-alany!-Leu-Arg-Pro-NHEt eller (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-N-methyl-Leu-Arg-Pro-NHEt eller (pyro)G1u-His-Phe-Ser-Tyr-3-(2-naphthyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-G1y-NH2 eller de farmaceutisk acceptable salte deraf.

6. Forbindelse ifølge krav 2, kendetegnet ved, at X er 3-(2,4,6-trimethy1pheny1)-D-alany 1.

7. Forbindelse ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den er (pyro)GIu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-trimethy1pheny1)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 eller de farmaceutisk acceptable salte deraf.

8. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er (pyro)GIu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphthy1)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Aza-Gly-NH2 eller de farmaceutisk acceptable salte deraf.

9. Middel til kontracepti on, kendetegnet ved, at det omfatter forbindelser ifølge krav 1 med den almene formel

eller farmaceutisk acceptable salte deraf, hvori: V er trypto-phyl, phenylalanyl eller 3-(1-naphthyl)-L-alany 1, W er tyro-syl, phenylalanyl eller 3-(l-pentafluorphenyl)-L-alanyl, og X er en D-aminosyrerest med den almene formel

hvori R er (a) et carbocykli sk, arylholdigt radaikal valgt fra den gruppe, der består af 1- og 2-naphthyl, 1-, 2- og 9-anthryl, 2-, 3-, 4- og 9-f1uorenyl, 2-, 3- og 9-phenanthry1, biphenyl, benz-hydryl og med tre til fem ligekædede C^_4alkylgrupper substitueret phenyl, Y er leucyl, isoleucyl, nor-leucyl eller N-methyl-leucyl, Z er glycinamid eller -NH-R1, hvori R1 er en Ci_4alkylgruppe eller 0 II -NH-C-NH-R2, hvori R2 er hydrogen eller en Ci_4alkylgruppe, i blanding med en farmaceutisk acceptabel, ikke toksisk bærer.