NO151896B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk virksomme nonapeptid- og dekapeptidderivater av det hormon som frigjoer det luteiniserende hormon - Google Patents

Description

Det luteiniserende hormon (LH) og det folliku-

lære stimulerende hormon (FSH) frigjbres fra hypofysefor-lappen under kontroll av det frigjbrende hormon LH-RH som fremstilles i det hypotalamiske området. LH og FSH virker på kjbnnskjertlene slik at man får stimulert syntesen av steroidhormoner og stimulert gametmodning. Den regelmes-

sige frigjøringen av LH-RH og derved frigjbring av LH og

FSH, kontrollerer forplantningssyklusen hos husdyr og mennesker. I tillegg til dette påvirker LH-RH placenta, frigjbr HCG og direkte på kjbnnskjertlene. Agonistanalog-

er av LH-RH kan brukes for å regulere forplantningsevnen

på to måter. Lave doser av LH-RH-analoger kan stimulere egglosningen og er folgelig brukbare for behandling av hypotalamisk sterilitet og sterilitet som skyldes manglende egglbsning. Ytterligere kan de brukes for såkalte hypogo-nale tilstander og impotens, kan stimulere spermatogenesen og fremstillingen av de mannlige kjbnnshormon. Paradoksalt nok vil stbrre doser av meget virksomme og lenge-varende analoger av LH-RH ha en motsatt effekt og kan blokkere egg-løsning i hunnen og undertrykke spermatogenesen hos hannen.

I forbindelse med disse effekter står en uhdertrykning av

de normale sirkulasjonsnivåer av seksuelle steroider av kjbnnskjertelopprinnelse, heri inngår en reduksjon av den accessoriske organvekt hos hannen og hunnen. I husdyr vil denne paradoksale effekt fremme vektbkning i en situasjon

med mye f6r, stimulere abort i svangre dyr og ellers generelt virke som et kjemisk steriliseringsmiddel.

Det naturlige hormonfrtgjbrende hormon LH-RH er

et dekapeptid som er sammensatt av maturlig forekommende aminosyrer (som har L-konfigurasjon bortsett fra den achirale aminosyren glycin). Den sekvens er fblgende : (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2. Mangeanaloger av denne naturlige forbindelse er blitt undersbkt, og en stbrre mengde av dem har vist seg å ha utilstrekkelig biologisk aktivitet til at de kan brukes klinisk. Imidlertid har visse utvalgte modifikasjoner vist seg å ha en fordelaktig effekt

på den biologiske aktiviteten. Den mest betydelige modifi-

kasjon oppnår man ved å forandre 6-stillingsresten fra Gly til en D-aminosyre. Hvis man f.eks. erstatter Gly-resten i 6-stillingen med D-Ala, D-Leu, D-Phe eller D-Trp,

s"å fb'rer dette til en serie analoger av LH-RH som har bket aktivitet i forhold til LH-RH. Se M. Monahan et al., Biochem., 12, 4616 (1973) for /D Ala^7-LHRH; J.A. Vilchez-Martinez et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 59, 1226

(1974) for /D-Leu^LHRH og desGly<10>/B-Leu<6>, Pro NHEt^LHRH; D.H. Coy et al., J. Med. Chem., 19, 423 (1976) for ^D-Phe_7-LHRH; og W. Vale et al., Clinical Endocrinology, 5th Supp., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England (1976), side 2615 og D.H. Coy et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 67, 576 (1979) for ^D-Trp^LHRH. I tillegg til den vesentlige bkning i aktivitet man kan oppnå ved hjelp av de ovenfor nevnte substitusjoner i stilling 6, så kan man oppnå ytterligere aktivitetsbkning ved å eliminere Gly-N^ i stilling 10, hvorved man får et nonapeptid som et alkyl-, cykloalkyl- eller fluoralkylamid, eller ved å erstatte Gly-NH2 med et a-azaglycinamid. Se f.eks. M. Fujino et al., Biochem, Biophys. Res. Comm., 49, 863 (1972), D.H. Coy et al., Biochem. 14, 1848 (1975) og A.S. Dutta et al, J. Chem. Soc. Perkin I, 1979, 379. En substitusjon med N-metyl-leucin i steden for leucinresten i stilling 7 forer til en bket stabilitet mot enzymnedbrytning. Se f.eks. N. Ling et al, Biochem. Biophys. Res. Comm., 63, 801 (1975).

En substitusjon av tryptofanresten i stilling

3 med 3-(l-naftyl)-L-alanin forer til en bkning i den biologiske styrken. Se f.eks. K.U. Prasad et al, J. Med. Chem., 19, 492 (1976) og Y. Yabe, Chem. Pharm. Bull., 24 (12),

3149 (1976).

Tyrosinres ten i stilling 5 kan erstattes med fenylalanin eller 3-(l-pentafluorfenyl)-L-alanin samtidig som man bibeholder en vesentlig biologisk aktivitet. Se f.eks. N. Yanaihara et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 52, 64 (1973) og D. Coy et al, J. Med. Chem., 16, 877 (1973). Det ville være bnskelig om man kunne fremstille ytterligere analoger av LH-RH som har enda høyere grad av biologisk aktivitet enn det som tidligere har vært beskrevet, og som klinisk kan brukes i mennesker og dyr.

Foreliggende oppfinnelse angår således fremstilling av nonapeptid- og dekapeptidderivater av LH-RH. Mer spesielt angår oppfinnelsen fremstilling av derivater av LH-RH som i 6-stillingen har spesifikke unaturlige D-aminosyrerester som inneholder lipofiliske karboksyliske rester, da spesielt resten som har 2 eller flere karbocykliske aryl- (eller perhydroaryl-)ringer eller en fenyl- (eller cykloheksyl-)ring som er sterkt alkylsubstituert.

Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles terapeutisk virksomme nonapeptid- og dekapeptidderivater med formelen:

og farmasøytisk akseptable salter derav hvor

V er tryptofyl, fenylalanyl eller 3-(l-naftyl)-L-alanyl;

W er tyrosyl, fenylalanyl eller 3-(l-pentafluor-fenyl)-L-alanyl;

X er en D-aminosyrerest

hvor R er

(a) et karbocyklisk arylholdig radikal valgt fra naftyl, antryl, fluorenyl, fenantryl, bifenylyl, benzhydryl og fenyl substituert med tre eller flere rettkjedede lavere alkylgrupper; eller (b) et mettet karbocyklisk radikal valgt fra cykloheksyl substituert med tre eller flere rettkjedede lavere alkylgrupper, perhydronaftyl, perhydrobifenylyl, perhydro-2,2-difenylmetyl og adamantylj

Y er leucyl, isoleucyl, nor-leucyl eller N-metyl-leucyl;

Z er glycinimid eller -NH-R^, hvor R1 er laverealkyl, cykloalkyl med 3-6 karbonatomer, fluor-laverealkyl

eller

hvor

R 2er hydrogen eller laverealkyl,

idet de lavere alkylgruppene inneholder 1-4 karbonatomer .

Som angitt ovenfor og av hensiktsmessighetsgrunner har man her brukt de vanlige forkortelser for de vanlige kjente aminosyrer, slik dette er anbefalt av' IUPAC-.IUB Commission on Biochemical Nomenclature, Biochemistry, 11, 1726 (1972), og de representerer her L-aminosyrer med unntak av den achirale aminosyreglycin og videre med unntak av aminosyrene i 6-stillingen som er betegnet med X. Alle de peptidsekvenser som er nevnt her, er angitt etter den vanlige kjente konvensjon hvor den N-terminale aminosyre er på venstre side mens den C-terminale aminosyre er på høyre side.

Slik begrepet "farmasøytisk akseptable salter" brukes her, så refererer det seg til salter som beholder sin forønskede biologiske aktivitet, og som ikke tilveie-bringer noen uønskede toksikologiske effekter. Eksempler på slike salter er (a) syreaddisjonssalter som dannes med uorganiske syrer såsom saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre, salpetersyre o.l., samt salter dannet med organiske syrer som f.eks. eddiksyre, oksalsyre, vinsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, glukonsyre, sitronsyre, eplesyre, askorbinsyre, benzosyre, garvesyre, pamoinsyre, algininsyre, polyglutaminsyre, naftalensulfon-syrer, naftalendisulfonsyrer, polygalakturonsyre; (b) salter med flerverdige metallkationer såsom sink, kalsium, vismut, barium, magnesium, aluminium, kobber, kobolt, nikkel, kadmium o.l.; eller med et organisk kation dannet fra N,N'-dibenzyletylen-diamin eller etylendiamin; eller (c) kombinasjoner av (a) og (b), f.eks. et sinktannatsalt o.l.

Med begrepet "lavere alkyl" forstås en rettkjedet eller forgrenet, mettet hydrokarbongruppe med 1-4 karbon-

atomer, såsom metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sek.-butyl og tert.-butyl; begrepet "cykloalkyl-gruppe" betegner en cyklisk mettet hydrokarbongruppe med 3-6 karbonatomer, f.eks. cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl og cykloheksyl; mens begrepet "fluor-lavere alkyl" betegner en lavere alkylgruppe hvor ett eller flere hydrogenatomer er erstattet med fluor, såsom trifluormetyl, pentafluoretyl, 2,2,2-trifluoretyl o.l.

Med begrepet "naftyl" forstås 1- og 2-naftyl; med "antryl" forstås 1-, 2- og 9-antryl; "fluorenyl" innbefatter både 2-, 3-, 4- og 9-fluorenyl; "fenantryl" innbefatter 2-, 3- og 9-fenantryl; og "adamantyl" innbefatter både 1-

og 2-adamantyl.

Foretrukne forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen er de hvor X er 3-(2-naftyl)-D-alanyl eller 3-(2,4,6-trimetylfenyl)-D-aianyl; Z er glycinamid eller -NHEt; V er tryptofyl eller fenylalanyl; ¥ er tyrosyl og Y er leucyl eller N-metyl-leucyl. Spesielt foretrukne forbindelser er f b'lg ende: (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2,

(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-D-alanyl-N-metyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2,

(pyro) Glu-His-Phe-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-2-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2,

(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-trimetylfenyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2,

(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-NHEt, og

(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-D-alanyl-

N-metyl-Leu-Arg-Pro-NHEt, og deres farmasøytisk akseptable salter.

Spesielt foretrukket er (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (2-naftyl )-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 og dets salter.

Forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen og da spesielt deres salter, har en overraskende sterk og lang-varig LH-RH-agonistaktivitet sammenlignet med de tidligere kjente sterke LH-RH-agonister, nemlig (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Ser-Arg-Pro-Gly-NH2 og det tilsvarende prolyl-etylamid. Et primært mål på styrken er evnen til partielt eller fullstendig å undertrykke brunst i normale cykliske voksne rotter (bestemt over en 2 ukers periode) ved en daglig 2-gangers subkutan injeksjon.

Andre bioprdver som har vært brukt for LH-RH-analoger og som har vært brukt for de fremstilte forbindelser, innbefatter fblgende: (a) eggløsnings induksjon i dibstrose og probstrbse hunnrotter ved subkutan injeksjon (Rippel et al., Proe. Soc. Exp. Biol. Med., 148, 1193 (1975)) (b) LH- og FSH-frigjbring ved dispergerte hypo-fyselappcellekulturer slik dette kan måles ved en radio-immunoprbve (Vale et al, Endocrinology, 91, 562 (1972)), og (c) LH- og FSH-firgjbring i det perifere blod-system hos steroidbehandlede rotter hvor eggstokkene var fjernet, i en reaksjon på intravenbs injeksjon slik denne kunne måles ved en radioimmunopfbve (Arimura et al, Enco-crinology, 90, 163 (1972)).

På et mer avansert nivå kan disse forbindelsers aktivitet vises ved en in vivo-nedsettelse av spermatogenesen og det sirkulerende og testikulære nivå av testoste-ron såvel som en dramatisk reduksjon av prostatastbrrelsen i hunder som lider av ondartet prostatahypertrofi.

Som et resultat av det ovennevnte vil forbindelser med formel I brukes i en rekke situasjoner hvor det er viktig med kontroll av LH og FSH, eller kontroll over en direkte kjønnskjertelvirkning, og de følgende situasjoner kan nevnes:

Fysiologisk nytte ( lavdoseeffekter )

eggldsningsinduksjon i sterilitet som skyldes manglende egglbsning og tidsbestemt egglbsning hos hunnlige pattedyr;

terapi for sterilitet som skyldes utilstrekkelig luteal funksjon hos kvinner;

terapi for hypogonadotrofi eller hypogonodal sterilitet hos begge kjdnn hos mennesker;

terapi for cystisk ovarie/nymfomanisymdrom hos kveg;

induksjon eller bkning av den seksuelle opptreden eller terapi for impotens eller frigiditet.

Paradoksale utnyttelsesmuligheter ( hdydoseeffekter)

- hunnlig befruktningshindring; - undertrykking av egglbsning eller forsinket egglbsning; - induksjon av barnefbdsel; - synkronisering av egglbsning; - dempning av brunst; - fremming av < vekst hos hunnlige dyre; - luteolyse, induksjon av menstruasjon; - induksjon av abort tidlig i de tre forste måneder av svangerskapet; - terapi for endometriose; - terapi for cyster og svulster i brystet; - terapi for polycystisk eggstokksyndrom (Stein-Leventhal); - terapi for livmor karsinom; - terapi for ondartet prostatahypertrofi og for prostatakarsinom; - befruktningshindrende middel for hanner; - terapi for lidelser som er et resultat av for stor kjbnnkjertelhormonproduksjon hos begge kjbnn; - funksjonell kastrasjon i hannlige matproduser-ende dyr;

- dempning av den probstrbse utskillelse.

Disse forbindelser så vel som tidligere kjente LH-RH-forbindelser viser en overraskende evne som abort-frembringende midler, tilsynelatende på grunn av at de hemmer sirkulasjonsnivået av HCG og har en direkte effekt på placenta. Den placentale effekten antyder at de også

kan brukes mot choriokarsinom.

De ifølge oppfinnelsen fremstilte forbindelser (innbefattende de som her ikke er beskrevet for LH-RH-analoger) har evne til å hemme eggløsning (f.eks. som et befruktningshindrende middel) i hunner, kan anvendes ved behandlingen av endometriose, ved behandlingen av ondartet prostatahypertrofi og ved hemming av spermatogensen (dvs.

som et befruktningshindrende middel) hos hanner. Forbindelsene med formel I kan med andre ord benyttes for å hemme en eggløsning, behandling eller styring av endometriose, reduksjon av prostatastørrelsen eller hemming av spermatogenesen hos pattedyr hvor det er ønskelig eller nødvendig med en slik behandling.

I praksis vil man tilføre en effektiv mengde av en forbindelse fremstilt ifølge oppfinnelsen eller et farma-søytisk preparat som inneholder en slik forbindelse, til et individ hvor det er nødvendig eller ønskelig med slik behandling. Disse forbindelser eller preparater kan tilsettes på en rekke forskjellige måter avhengig av den spesifikke bruk man ønsker, innbefattende oral, parenteral (heri inngår subkutan; intramuskulær og intravenøs), vaginal (spesielt som befruktningshindrende midler), rektalt, i munnhulen (heri inngår sublingualt) eller intranasalt. Den mest egnede tilførselsmåte vil være avhengig av bruken,

den spesielle ingrediens som inngår, pasienten, samt den lidelse eller tilstand som eventuelt skal behandles. Forbindelsen eller sammensetningen kan også tilføres slik at man får en sen frigjøring av den aktive ingrediens.

Ved generell bruk så vil man når man bruker den såkalte "paradoksale" eller høye dose tilføre den aktive

ingrediens i mengder på mellom 0,01 og 100 yg/kg kropps-

vekt pr. døgn, fortrinnsvis mellom 0,1 og 5,0 yg/kg kroppsvekt pr. døgn. Denne tilførsel kan utføres én gang daglig, eller fordeles utover flere tilførsler eller i en form som gjør at man får en langsom frigjøring hvorved man oppnår de mest effektive resultater alt etter tilfellene.

Den eksakte dose og tilførselsveien for disse forbindelser og sammensetninger vil være avhengig av det individ som skal behandles,-type av behandling, grad av lidelse eller behov, og selvsagt på basis av den bedømmelse som gis av den médisinske sakkyndige. Vanligvis vil parenteral tilførsel kreve lavere doser enn andre tilførsels-måter som er mer avhengige av absorpsjon.

Forbindelsene med formel I er godt tolererbare

og relativt ikke-toksiske. Representative forbindelser viser LD^Q ved subkutan tilførsel i mus over 40 yg/kg,

noe som er en stor sikkerhetsfaktor sammenlignet med tera-peutiske doser som er nevnt ovenfor.

Nevnte farmasøytiske preparater inneholder som aktiv ingrediens en forbindelse fremstilt ifølge oppfinnelsen, og innbefatter en slik forbindelse i blanding med en farma-søytisk akseptabel, ikke-toksisk bærer. Som nevnt ovenfor, kan slike preparater opparbeides for parenteral bruk (subkutan, intramuskulær eller intravenøs), da spesielt i form av flytende oppløsninger eller suspensjoner, for bruk i vaginal eller rektal tilførsel, da spesielt i form av halvfaste stoffer såsom kremer og suppositorier, for oral tilførsel eller tilførsel i munnhulen, da i form av

tabletter eller kapsler, eller intranasalt i form av pulvere, nesedråper, eller aerosoler.

Preparatene kan hensiktsmessig tilføres i enhetsdoseform og kan opparbeides på velkjente måter,

f.eks. slik det er beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1970. Preparater for parenteral tilførsel kan inneholde som for-

tynningsmidler sterilt vann eller saltopplbsning, poly-alkylenglykoler såsom polyetylenglykol, oljer av vegetabilsk opprinnelse, hydrogenerte naftalener og lignende. Preparater for vaginal eller rektal tilforsel, f.eks. suppositorier, kan inneholde fortynningsmidler såsom polyalkylen-glykoler, vaselin, kakaosmdr o.l. Preparater for tilforsel ved inhalering kan være faste og kan inneholde fortynningsmidler såsom laktose eller kan være vandige eller oljeaktige oppløsninger for tilforsel i form av nasale dråper. For tilforsel til munnhulen kan man ha typiske eksipienser, såsom sukkere, kalsiumstearat, magnesium-stearat, pregelatinert stivelse o.l.

Det er ofte bnskelig å tilfore forbindelser

med formel I til den enkelte pasient over lengre tidsrom, f.eks. i perioder på 1 uke til 1 år fra en enkelt tilforsel. Man kan for slike formål bruke im-planterte doser eller depoter som gir meget langsom frigjdring av den aktive ingrediens. Således kan en doseform inneholde et farmasbytisk akseptabelt ikke-toksisk salt av en forbindelse som har meget lav grad av opplbselighet i kroppsvæskene, f.eks. (a) et syreaddisjonssalt med en polysyre såsom fosforsyre, svovelsyre, sitronsyre, vinsyre, garvesyre, pamoinsyre, algininsyre, polyglutaminsyre, naftalen mono- eller di-sulfonsyre, polygalakturonsyre e.l.; (b) et salt med et flerverdig metallkation såsom sink, kalsium, vismut, barium, magnesium, aluminium, kobber, kobolt, nikkel, kadmium o.l., eller med et organisk kation dannet f.eks. fra N,N'-dibenzyletylendiamin eller etylendiamin; eller (c) kombinasjoner av (a) og (b), f.eks. et sinktannatsalt. I tillegg til dette kan forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelse, fortrinnsvis et relativt uopplbselig salt av den type som er beskrevet ovenfor, opparbeides i en gel, f. eks. en aluminiummonostearatgel med f.eks. sesamolje, og et slikt preparat kan være egnet for injeksjon. Spe-

sielt foretrukne salter er sinksalter, sinktannatsalter,

pamoatsalter o.l. Andre typer av slike depoter for lang-

som frigjoring for injeksjon kan inneholde forbindelsen eller saltet dispergert eller innkapslet i en langsomt nedbrytende, ikke-tokslsk, ikke-antigenisk polymer som en po-lymelkesyre/polygukolinsyrepolymer av den type som er beskrevet i U.S. patent nr. 3.773.919. Forbindelsene eller fortrinnsvis deres relativt uoppløselige salter kan også opparbeides i kolesterolmatrise-silastinpellets, fortrinnsvis for bruk i dyr. Ytterligere depoter eller implanter-ings sammensetning er for langsom frigjdring, såsom liposomer, er velkjente i litteraturen. Se f.eks. "Sustained and Con-trolled Release Drug Delivery Systems", J.R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Spesiell henvisning

med hensyn til LH-RH-typen av forbindelsene kan f.eks.

finnes i U.S. patent nr. 4.010.125.

Syntese av polypeptider representerer kjent teknikk,

.og en meget god oversikt over tilgjengelige teknikker for syntese av peptider finnes i J. M. Stuart og J. D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969, og J. Meienhofer, "Hormonal Proteins

and Peptides", bind 2, side 46, Academic Press (New York), 1973, for syntese av peptider i fast fase, og E. Schroder og K. Lubke, "The Peptides", bind 1, Academic Press (New York), 1965, for en klassisk oppløsningssyntese.

Generelt vil disse fremgangsmåter innbefatte en sekvensmessig addisjon av én'eller flere aminosyrer eller egnede beskyttede aminosyrer til en voksende peptidkjede. Normalt vil amino- eller karboksylgruppen i den første aminosyregruppen være beskyttet med en egnet beskyttende gruppe. Den beskyttende aminosyre kan så enten festes til en inert fast bærer eller brukes i oppløsning ved å tilsettes neste aminosyre i sekvensen med en komplementær (amino eller karboksyl)gruppe som er egnet beskyttet, under slike betingelser at man får dannet amidbindingen. Den beskyttende gruppe blir så fjernet fra den sist tilsatte aminosyregruppe og neste aminosyre (egnet beskyttet) blir så tilsatt, og så videre. Etter at alle de ønskede aminosyrer er festet i den ønskede rekkefølge, kan eventuelle gjenværende beskyttende grupper (og eventuelt fast bærer) fjernes enten i en viss sekvens eller samtidig, hvorved man får det endelige polypeptid. Ved en enkel modifikasjon av denne generelle fremgangsmåte er det mulig å addere mer enn én aminosyre på én gang til en voksende kjede, f.eks. ved kobling (under betingelser som ikke racemiserer chirale sentra), et beskyttet tripeptid med en passende beskyttet dipeptid, hvoretter man etter fjerning av beskyttende grupper får et penta-peptid.

Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles de ovenfor definerte forbindelser med formel I ved at man

(i) fjerner beskyttende grupper og eventuelt kovalent bundet fast bærer fra et beskyttet polypeptid for oppnåelse av en forbindelse med formel (I) eller et salt derav eller kobling av individuelle fragmenter av den ønskede forbindelse med formel I, og eventuelt (ii) omdanner en forbindelse med formel I til et farma-søytisk akseptabelt salt, (iii) omdanner et salt av en forbindelse med formel (I) til et farmasøytisk akseptabelt salt, eller (iv) dekomponerer et salt av en forbindelse med formel (I) til et fritt polypeptid med formel (I).

Det er foretrukket at peptidsyntesen utføres i fast fase. I denne spesielle foretrukne utførelse blir o-aminofunksjonen i aminosyrene beskyttet ved hjelp av en syre eller en basefølsom gruppe. Slike beskyttende grupper har den egenskap at de er stabile under de betingelser som hersker under peptidbindingsdannelsen, og de lar seg lett fjerne uten å ødelegge den voksende peptidkjeden eller race-misere eventuelle chirale sentra som også forefinnes i kjeden. Egnede beskyttende grupper er t-butyloksykarbonyl (Boe), benzyloksykarbonyl (Cbz), bifenylisopropyloksy-karbonyl, t-amyloksykarbonyl, isobornyloksykarbonyl, a,a-dimetyl-3,5-dimetoksybenzyloksykarbonyl, o-nitrofenyl-sulfenyl, 2-cyano-t-butyloksykarbonyl, 9-fluorenylmetyloksykarbonyl og lignende, spesielt 5-butyloksykarbonyl (Boe).

Spesielt foretrukne beskyttende grupper for sidekjeder, er

for ariginin: nitro, p-toluensulfonyl, 4-metoksybenzensulfonyl, Cbz, Boc_og adamantyLoksykarbonyl, for tyrosin: benzyl, o-brombenzyloksykarbonyl, 2,6-diklorbenzyl, isopropyl, cykloheksyl, cyklopentyl og acetyl, for serin: benzyl og tetrahydropyranyl, og for histinin: benzyl, p-toluensulfonyl og 2,4-dinitrofenyl.

Den C-terminale aminosyren blir festet til en egnet fast bærer: Egnede sådanne er forbindelser som er inerte overfor de reagenser og de reaksjonsbetingelser som forefinnes i den fortrinnsvise kondensasjon-beskyttelsesfjerning av beskyttende grupper, såvel som å være uløselige i de media som brukes. Egnede faste stoffer i så henseende er klormetylpolystyren-divinylbenzenpolymer, hydroksymetyl-polystyren-divinylbenzenpolymer o.l., da spesielt klormetylpolystyren-1% divinylbenzenpolymer. I

de spesielle tilfeller hvor C-avsluttede grupper i forbindelsen vil være glycinamid, så er en spesielt brukbar bærer benzhydrylamino-polystyren-divinylbenzenpolymer av den type som er beskrevet av P. Rivaille et al, Heiv. Chim. Acta, 54, 2772 (1971). Festingen av klormetylpolystyren-divinylbenzentypen av harpikser utføres ved hjelp av en reaksjon mellom 1^-beskyttet aminosyre, da spesielt en Boc-aminosyre, såsom dets cecium-, tetrametylammonium-, trietylammonium-, 4,5-diazobicyklo /~5>4,07undek-5-en, eller lignende salt i etanol, acetonitril, N,N-dimetylformamid (DMF) o.l.

og da spesielt ceciumsaltet i DMF, med klormetylharpiksen ved forhøyet temperatur, f.eks. mellom 40 og 60°C, fortrinnsvis ved ca. 50°C i 12-48 timer, fortrinnsvis ca. 24 timer. Na<->Boc-aminosyren settes til benzhydryl-aminharpiksen ved hjelp av en N,N'-dicykloheksylkarbodiimid (DCC)/l-hydroksybenzotriazol (HBT) som vil gi en kobling i et tidsrom fra 2-24 timer, fortrinnsvis 12 timer ved en temperatur mellom 10 og 50°C, fortrinnsvis 25°C

i et oppløsningsmiddel såsom diklormetan eller DMF, fortrinnsvis diklormetan. Kobling av suksessive beskyttede aminosyrer kan så utføres i et automatisk polypeptidsynteseapparat av den type som er velkjent. Fjerningen av de -beskyttende grupper kan utføres f.eks. i nærvær av en oppløsning av trifluoreddiksyre i metylenklorid, hydrogenklorid i dioksan, hydrogenklorid i eddiksyre eller en annen sterk syreoppløsning, fortrinnsvis 50% trifluoreddiksyre i diklormetan ved romtemperatur. Hver av de beskyttedé amino-

syrer tilsettes fortrinnsvis i et overskudd på 2,5 molar, og koblingen kan utføres i diklormetan^ diklormetan/DMF-blandinger, DMF o.l,., spesielt i metylenklorid ved romtemperatur. Koblingsmid-let er normalt DCC i diklormetan, men kan være N,N'-di-iso-propylkarbodiimid eller et annet karbodiimid, enten alene eller i nærvær av HBT, N-hydroksysuccinimid, andre N-hydrok-syimider eller oksimer. Alternativt kan man bruke en beskyttet aminosyre-aktivester (f.eks. p-nitrofenyl, pen-tafluorfenyl o.l.) eller symmetriske anhydrider.

Etter at syntesen er fullstendig, blir det beskyttede polypeptid fjernet fra harpiksen. Når bindingen til harpiksen er av benzylestertypen, kan avspaltningen skje ved aminolyse med et alkylamin eller fluoralkylamin for peptider med en prolin-C-terminus, eller ved aminolyse, f.eks. med ammoniakk/metanol eller ammoniakk/etanol for peptider med en glycin-C-terminus ved en temperatur mellom 10 og 50, fortrinnsvis ved 25°C, i et tidsrom fra 12 - 24 timer, fortrinnsvis ca. 18 timer. Alternativt kan peptidet fjernes fra harpiksen ved transforestring, f.eks. med metanol fulgt av en aminolyse.' Det beskyttede peptid kan renses på dette punkt ved hjelp av silisiumdioksydgel-kromatografi. Fjerning av beskyttende grupper på side-kjedene fra polypeptidet kan utfb'res ved å behandle amino-lyseproduktet med f.eks. vannfritt flytende hydrogenfluorid i nærvær av anisol eller en annen karboniumrensende forbindelse, behandling med hydrogenfluorid/pyridinkompleks, behandling med tris(trifluoracetyl)bor og trifluoreddiksyre, ved reduksjon med hydrogen og palladium på karbon eller polyvinylpyrrolidon, eller ved en reduksjon med natrium i flytende ammoniakk, fortrinnsvis med flytende hydrogenfluorid, og anisol ved temperaturer mellom -10 og +10, fortrinnsvis ca. 0°C i tidsrom fra 15 minutter til 1 time, fortrinnsvis 30 minutter. For glycinterminale peptider på benzhydrylaminharpiksene kan harpiksavspaltningen og fjerningen av de beskyttende grupper kombineres i et enkelt trinn ved å bruke flytende hydrogenfluorid og anisol. Polypeptidet uten beskyttende grupper kan så renses ved en rekkefolge av kromatografiske trinn hvor man bruker én eller flere av de fdlgende typer: ioneutbytning på svak basisk harpiks i acetatform, hydrofob adsorbsjonskromatografi på polystyren-divinylbenzen (f.eks. "Amberlite XAD"), adsorbsjonskromatografi på silisiumdioksydgel, ioneutbytningskromatografi på karboksymetylcellulose, fordelingskromatografi, f.eks. på "Sephadex G-25", eller mot-stromsfordeling, hdytrykksvæske-kromatografi (HPLC), da spesielt reversert fase HPLC hvor kolonnepakningen er oktyl- eller oktadecylsilyl-silisiumdioksydgel som fore-ligger i bundet fase.

Hvis en racemisk aminosyre brukes i 6-stillingen, så kan det diastereomere nonapeptid eller dekapeptid skilles, og det fordnskede peptid inneholdende en D-aminosyre i 6-stillingen kan isoleres og renses, fortrinnsvis under de ovennevnte kromatografiske prosesser.

Fremstillingen av peptider med C-terminale azaglycinamider blir fortrinnsvis utfort ved å bruke en klassisk peptidoppldsningssyntese hvor man bruker kjente peptid-mellomprodukter. Denne fremgangsmåte, er mer de-taljert beskrevet i eksempel 3.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Fremstilling A

En ovnstørket kolbe inneholdende 0,1 liter abso-lutt etanol (destillert fra magnesiumetoksyd) ble tilsatt 1,52 g natriummetall. Etter at hydrogenutviklingen var stoppet opp, tilsatte man 10,21 g etyl-2-acetamido-2-cyano-acetat og 13,26 g 2-brommetylnaftalen. Oppløsningen ble kokt under tilbakeløp i 1 time og så avkjølt. Etanolen ble fjernet under redusert trykk, og resten oppløst i etylacetat. Det organiske lag ble vasket med to 50 ml porsjoner av vann, én 50 ml porsjon med mettet natriumkloridoppløsning, og ble så tørket over magnesiumsulfat. Oppløsningen ble filtrert, oppløsningsmiddelet fjernet ved redusert trykk, og resten ble hydrolysert i 100 ml konsentrert saltsyre ved tilbakeløpskoking i 2 timer.

Hydrolyseblandingen ble avkjølt og bunnfallet fra råproduktet ble frafiltrert. Dette ble gjenoppløst i 0,5 liter varmt vann inneholdende 5 ml konsentrert saltsyre behandlet med trekull, og oppløsningens pH ble justert til 6 med konsentrert ammoniumhydroksyd. Bunnfallet ble frafiltrert og tørket i vakuum-, og man fikk 11,3 g rent 3-(2-naftyl)-D,L-alanin3 smeltepunkt 230-232°C.

Ved å bruke samme fremgangsmåte, men ved å bruke støkiometrisk ekvivalente mengder av

1- brommetylnaftalen,

9-brommetylantracen,

9-brommetylfluoren,

2- brommetylfluoren,

2- brommetylantracen,

1-brommetylantracen,

a-klorisoduren,

4-brommetylbifenyl,

1-brommetyladamantan,

3- brommetylfenantren, l-kl.ormetyl-2,4,6-tri-(n-butyl)benzen og

l-klormetyl-2,3,4,5,6-pentametylbenzen,

istedenfor nevnte 2-brommetylnaftalen, fikk man fremstilt følgende aminosyrer: 3-(l-naftyl)-D,L-alanin, smeltepunkt 185 - 187°C, 3-(9-antryl)-D,L-alanin, smeltepunkt 290°C (HC1-

3-(9-fluorenyl)-D,L-alanin,

3-(2-fluorenyl)-D,L-alanin, smeltepunkt 264 - 269°C, 3-(2-antryl) -D,L-alanin,

3-(1-antryl) -D,L-alanin,

3- (2,4,6-trimetylfenyl)-D,L-alanin, smeltepunkt 235 - 237°C,

3-(4-bifenylyl)-D,L-alanin, smeltepunkt 290°C, 3-(1-adamantyl)-D,L-alanin,

3-(3-fenantryl)-D,L-alanin,

3-(2,4,6-tri(n-butyl)fenyl)-D,L-alanin og

3-(2,3,4,5,6-pentametylfenyl)-D,L-alanin, henholdsvis.

Fremstilling B

En oppldsning av 18,2 g 1,1-difenyletylen, 25,3 g metyl-oc-metoksy-N-benzyloksykarbonylglycinat og 1,5 g 2-naftalensulfonsyre i 300 ml torr benzen ble kokt under til-bakelbp i 2 ddgn. Råproduktet ble renset på en kolonne av silisiumdioksyd idet man brukte en gadient av CH2C12 til CH2Cl2/EtOAc (18:1). Det rensende metyl-2-^I-(2,2-difenyl-etylenyl27-N-benzyloksykarbonylglycinat ble hydrolysert til den tilsvarende syren med en oppldsning av 10,9 g KOH

i 350 ml 10% vandig metanol. Den resulterende urene syren He opplb'st i 100 ml 95% etanol inneholdende 3 ml konsentrert HC1 og hydrogenert i nærvær av 2 g 10% Pd på karbon i 24 timer, hvorved man fikk 2,4 g 3-(2,2-difenylmetyl)-D,L-alanin, smeltepunkt 235 - 237°C

Fremstilling C

En oppldsning av 12,9 g 3-(2-naftyl)-D,L-alanin i 120 ml 1-molar NaOH ble tilsatt 6,23 ml eddiksyreanhydrid og 60 ml 1-molar NaOH i 18pet av en halv time ved 0°C. pH ble justert til 2 med konsentrert saltsyre og bunnfallet frafiltrert. Det ble omkrystallisert fra 60% vandig etanol og man fikk 12,2 g N-acetyl-3-(2-naftyl)-D,L-alanin. En oppldsning av 15 g av denne N-acetylaminosyren i 240 ml tdrr metanol ble tilsatt 15,8 ml bortrifluorid-eterat og blandingen ble kokt under tilbakeldp i. 1 time. Alkoholen ble fordampet, 200 ml vann tilsatt og oppløs-ningen ekstrahert med etylacetat. Det organiske lag ble vasket med vandig base og syre, tdrket over magnesiumsulfat, filtrert og destillert til en olje. Utkrystallisering av denne oljen fra etylacetat/heksan ga 14,2 g metyl-N-acetyl-3-(2-naftyl)-D,L-alaninat, smeltepunkt 79 - 80°C.

Ved å bruke samme fremgangsmåte som beskrevet ovenfor, men ved å bruke en stdkiometrisk ekvivalent mengde av: 3-(1-na ftyl)-D,L-alanin,

3-(2-fluorenyl)-D,L-alanin,

3-(2-antryl)-D,L-alanin,

3-(l-antryl)-D,L-alanin, og

3-(2,2-difenyImetyl)-D,L-alanin

istedenfor nevnte 3-(2-naftyl)-D,L-alanin, fikk man fremstilt fdlgende forbindelser: metyl-N-acetyl-3-(1-naftyl)-D,L-alaninat, smeltepunkt 97,5 - 98°C,

metyl-N-acetyl-3-(2-antryl)-D,L-alaninat, smeltepunkt 170 - 171°C,

metytN-ac etyl-3-(2-antryl)-D,L-alaninat, og

metyl-N-acetyl-3-(2,2-difenylmetyl)-D,L-alaninat, smeltepunkt 113 - 114°C, henholdsvis.

Fremstilling D

En oppldsning av 6,6 g metyl-N-acetyl-3-(2-naftyl )-D,L-alaninat i en blanding av 300 ml dimetylsulfoksyd, 120 ml 1-molar KC1 og 780 ml vann ble behandlet med 33,6 mg av enzymet subtilisin i 3 ml 0,1-molar KC1. pH ble holdt på 7 ved hjelp av automatisk titrering med 0,2-molar NaOH

i et Radiometer pH stat. Etter 30 minutter var 70 ml av NaOH-oppldsningen absorbert, og hydrolysen ble stoppet. Oppldsningen ble gjort basisk med 12 g NaHCO^ og ekstrahert med etylacetat. Det organiske lag inneholdt metyl-N-acetyl-3- (2-naftyl )-D-alaninat. Utkrystallisering fra etyl-

acetat og heksan ga et gult fast stoff, smeltepunkt 80 - 81°C.

Denne forbindelsen ble omdannet til den frie aminosyren og så til N-Boc-aminosyre på fSigende måte: En opplSsning av 2,5 g metyl-N-acetyl-3-(2-naftyl )-D-alaninat i 60 ml 6N HC1 ble holdt på 120 - 130°C i 3 timer og så avkjdlt til romtemperatur. Det hvite bunnfallet ble frafiltrert og omkrystallisert fra 50 ml vann inneholdende 1 ml 12N HC1 ved ndytralisering med NH^OH til pH 6 og så tdrket i vakuum, hvorved man fikk 1,2 g 3-(2-naftyl)-D-alanin, smeltepunkt 242 - 244°C, Z£7Jp 26,6°

(c 0,5, CH3C02H).

En rort oppldsning av 3-(2-naftyl)-D-alanin i en blanding av 55 ml IN NaOH, 10 ml vann og 20 ml dioksan ble behandlet med 1,48 g di-tert-butyl-dikarbonat og o,22 g magnesiumoksyd ved 0°C. Etter 1,5 timer ble ytterligere 0,3 g di-tert-butyl-dikarbonat tilsatt og blandingen oppvarmet til romtemperatur. Det faste stoff ble fjernet ved filtrering, og filtratet konsentrert til 50 ml. Den vandige opplesningen ble bragt til pH 2,5 med NaHSO^ og så ekstrahert med etylacetat. Detybrpaniske lag ble vas-

ket med 5% NaHSO^, vann og en mettet saltsyreoppldsning. Etylacetatoppldsningen ble så tdrket over magnesiumsulfat, filtrert og konsentrert til en olje som ble utkrystallisert fra eter og heksan, hvorved man fikk 1,3 g N-Boc-3-(2-naftyl)-D-alanin, smeltepunkt 90 - 91°C, fål^ " -32,6° (c 0,8, MeOH):

Ved å bruke samme fremgangsmåte, men ved å bruke

en stBkiometrisk ekvivalent mengde av:

metyl-N-acetyl-3-(l-naftyl)-D,L-alaninat, metyl-N-acetyl-3-(2-fluor enyl)-D,L-alaninat, metyl-N-acetyl-3-(2-antryl)-D,L-alaninat, og metyl-N-acetyl-3-(2,2-difenylmetyl)-D,L-alaninat istedenfor metyl-N-acetyl-3-(2-naftyl)-D,L-alaninat, fikk man fremstilt de fBlgende Na<->Boc-aminosyrer via de tilsvarende frie aminosyrer: N-Boc-3-(l-naftyl)-D-'alanin, smeltepunkt 92 - 93°C, ZI7d<5> 54,8° (c 0,5 MeOH),

N-Boc-3-(2-fluorenyl)-D-alanin, smeltepunkt 161 -

163 C (dekomponering),

N-Boc-3-(2-antryl)-D-alanin og

N-Boc-3-(2,2-difenylmetyl)-D-alanin, smeltepunkt 153 - 154°C, henholdsvis.

Fremstilling E

I en Parr hydrogeneringskolbe ble det plassert 0,85 g 3-(2-naftyl)-D-alanin, 100 ml 2-molar saltsyre og 0,85 g av Adam's katalysator (PtO-). Opplbsningen ble pak-ket under ca. et trykk på 4 kg/cm av H20-gass i 20 timer i et Parr hydrogeneringsapparat. Blandingen ble oppvarmet for å oppldse det hvite bunnfallet og ble så filtrert gjennom diatomerjord. Konsentrasjonen av opplbsningen ved redusert trykk fulgt av en lyofilisering fra vann ga 0,8 g 3-(2-perhydronaftyl)-D-alanin som et hvitt fast stoff, smeltepunkt 230 - 232°C.

Denne forbindelsen ble oppib'st i en blanding av 3,2 ml IN NaOH, 5 ml vann og 15 ml dioksan og ble så behandlet med 0,14 g MgO og 0,85 g di-tert-butyldikarbonat. Etter 1 time ved 0°C og 2 timer ved 25°C ble suspensjonen filtrert, konsentrert til tbrrhet ved redusert trykk, residuet opplost i vann, vasket med dietyleter og surgjort til pH 2 med NaHSO^. Det surgjorte vandige lag ble ekstrahert tre ganger med etylacetat, og ekstraktene ble slått sammen, torket over magnesiumsulfat, filtrert og konsentrert, hvorved man fikk 0,75 g N-Boc-3-(2-perhydronaftyl)-D-alanin som en hvit olje.

En 0,1 g porsjon av denne forbindelsen ble opplbst i 5 ml tetrahydrofuran og titrert ved 0°C med nylig fremstilt diazometan inntil man fikk en vedvarende gul farge. Reaksjonen ble stoppet med 1 ml eddiksyre, opplbsningen for-dampet og residuet delt mellom 75 ml etylacetat og 75 ml vann. Det organiske lag ble vasket med 5% NaHCO^, vann,

5% NaHSO^, vann, mettet NaCl-opplbsning og torket over MgSO^. Opplbsningen ble filtrert, konsentrert under redusert trykk og påsatt en preparativ tynnsjiktkromatografiplate (750 ^u tykk, silisiumdioksydgel, 20 x 20 cm). Platen ble utviklet med diklormetan/etylacetat (18/1) og produktbåndet ble

fjernet. Silisiumdioksydgelen fra produktbåndet ble vasket med diklormetan/etylacetat (9:1) i en glasstrakt, og filtratet ble konsentrert hvorved man fikk 0,1 g metyl-N-Boc-3-(2-perhydronaftyl)-D-alaninat som en lysegul olje.

Denne forbindelsen ble oppnådd som en blanding av to isomerer ved 2-stillingen i perhydronaftalenkjernen. Disse siastereomeriske forbindelser kan skilles ved hjelp av en hoytrykksvæskekromatografikolonne ("Lichrosorb" silisiumdioksydgel 60, 5 mikron) med etylacetat/heksan (1:9) som elueringsmiddel og deretter hydrolyseres til den frie syren, N-Boc-3-(2-perhydronaftyl)-D-alanin.

Ved å bruke samme fremgangsmåte og en stdkiometrisk ekvivalent mengde av

3-(1-naftyl)-D-alanin,

3-(2,2-difenylmetyl)-D-alanin,

3-(2,4,6-trimetylfenyl)-D,L-alanin, 3-(4-bifenylyl)-D,L-alanin,

3-(2,4,6-tri(n-butyl)fenyl)-D,L-alanin, og

3-(2,3»4,5,6-pentametylfenyl)-D,L-alanin istedenfor 3-(2-naftyl)-D-alanin, fikk man fremstilt de fdlgende N-Boc-aminosyrer: N-Bo c-3-(1-perhydr onaftyl)-D-alanin, N-Boc-3-(perhydro-2,2-difenylmetyl)-D-alanin, N-Boc-3-(2,4,6-trimetylcykloheksyl)-D,L-alanin, N-Boc-3-(perhydro-4-bifenylyl)-D,L-alanin,

N-Boc-3-(2,4,6-tri(n-butyl)cykioheksyl)-D,L-alanin, og

N-Boc-3-(2,3,4,5,6-pentamentylcykloheksyl)-D,L-alanin, henholdsvis.

Eksempel 1

I reaksjonskaret i et "Beckman 990" peptidsyn-teseapparat plasserte man 0,8 g (0,8 mmol) benzhydrylamino-polystyren-divinylbenzenharpiks (Lab Systems, Inc.) slik det er beskrevet av Rivaille referert ovenfor. Aminosyrene ble tilsatt i en rekkefdlge til denne harpiksen ved hjelp av et synteseprogram på fdlgende måte:

Trinnene 1-15 utgjbr en koblings syklus for én aminosyre, og at reaksjonen var fullstendig ble sjekket ved hjelp av ninhydrinmetoden til E. Kaiser et al., Anal. Biochem., 34, 595 (1970).

Harpiksen ble koblet i rekke fdlge med et 2,5-molart overskudd av hver beskyttet aminosyre og DCC. Således ble harpiksen under de suksessive koblingssykluser behandlet med

0,433 g Boc-Gly-OH,

0,432 g Boc-Pro-OH,

0,857 g Boc-Arg(Tosyl)-OH,

0,462 g Boc-Leu-OH,

0,504 g Boc-3-(2-naftyl)-D-alanin og 0,272 g 1-hydroksybenzotriazol,

0,724 g N-Boc,0-2-brombenzoyloksykarbonyl-L-tyrosin,

0,59 g Boc-Ser(Benzyl)-0H,

0,608 g Boc-Trp-OH,

0,654 g Boc-His(Tosyl)-OH, og

0,524 g pyroglutaminsyre.

Harpiksen ble fjernet fra reaksjonskaret, vasket med CH2CI2 og torket i vakuum hvorved man fikk 2,0 g beskyttet polypeptidharpiks.

Polypeptidproduktet ble samtidig fjernet fra harpiksen og alle beskyttende grupper fjernet ved behandling med vannfri flytende HF. En blanding av 2,0 g beskyttet polypeptidharpiks og 2 ml anisol (rensende- forbindelse) i et "Kel-F"-reaksjonskar ble behandlet med 20

ml nylig destillert (fra CoF^) vannfri flytende Hf ved 0°C

i en halv time. Flussyren ble fordampet under vakuum, og residuet av (pyro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, som sitt HF-salt, ble vasket med eter. Residuet ble så ekstrahert med iseddik. Eddiksyreekstrak-tet ble lyofilisert og ga 0,8 g av råproduktet.

Dette råprodukt ble påsatt en 4 x 10 cm "Amberlite XAD-4"-kolonne (polystyren-4% divinylbenzensampolymer) og eluert med en konkav gradient fra vann (0,5 liter) til etanol (1 liter). De rorene som inneholdt fraksjoner fra volumet 690 ml - 1.470 ml ble slått sammen og destillert til tdrrhet, hvorved man fikk 490 mg av delvis renset polypeptid.

En 150 mg prdve av dette delvis resende produkt ble underkastet fordelingskromatografi på en 3 x 50 cm kolonne av "Sephadex G-25" idet man brukte et oppldsnings-middelsystem av 1-butanol/toluen/eddiksyre/vann inneholdende 1,5% pyridin i forholdet 10:15:12:18. De rene fraksjoner ble slått sammen på basis av tynnsjiktkromatografi (silisiumdioksydgel; Bu0H/H20/H0Ac/Et0Ac; 1:1:1:1) og HPLC (5 mikron, reversert fase, oktadecylsilylpakking;

40% 0,03-molar NH^0Ac/60% acetonitril). Det fordnskede produkt kom ut av kolonnen i fraksjoner som lå mellom 1.000 ml og 1.400 ml referert fra begynnelsen av utstrøm-ningen av kolonnen (Rf 0,1). De rene fraksjoner ble slått

sammen, destillert til tdrrhet, oppldst i H20 og lyofilisert, hvorved man fikk 57 mg rent pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naftyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-profyl-glycinamid som sitt eddiksyreaddisjonssalt, [aj^ - 27,<4>° (c 0,9, HOAc), smeltepunkt 185 - 193°C (dekomponering) .

Eksempel 2

For syntese av analoger med en C-terminal Pro-NH-CH2CH^, brukte man et synteseprogram som var identisk med det som er beskrevet i eksempel 1. Reaksjonskaret i nevnte "Beckman 990" synteseapparat ble tilsatt 2,13 g Boc-Pro-O-harpiks fremstilt ved å reagere ekvimolare mengder av det torre cesiumsaltet av Boc-Pro-OH med klormetylpolystyren/l9é divinylbenzen (Lab Systems, Inc.). Mengden av Boc-Pro-O-harpiks inneholdt 1,4 mmol prolin.

Harpiksen ble i sekvens koblet med 2,5-molart overskudd av hver beskyttet aminosyre og DCC. Harpiksen ble således omsatt med suksessive koblingssykluser med 1,61 g Boc-Arg(Tosyl)-OH,

0,93 g Boc-Leu-OH H20,

0,94 g Boc-3-(2-naftyl)-D-alanin og 0,49 g 1-hydroksybenzotriazol,

1,75 g N-Boc-0-2-brombenzyloksykarbonyl-L-tyrosin og 1,11 g Boc-Ser(Benzyl)-0H.

På dette tidspunkt av syntesen ble mengden av beskyttet polypeptidharpiks spaltet i to deler og den ene halvdelen ble fdrt gjennom hele reaksjonen med

0,57 g Boc-Trp-OH,

0,77 g Boc-His(Tosyl)-OH, og

0,21 g pyroglutaminsyre.

Harpiksen ble tatt ut fra reaksjonskaret, vasket med CH2C12 og torket i vakuum, hvorved man fikk 2,26 g beskyttet polypeptidharpiks.

Det beskyttede polypeptid ble spaltet av fra harpiksen ved aminolyse med 25 ml etylamin i 18 timer ved 2°C. Etylaminet ble fordampet og harpiksen ekstrahert med metanol. Metanolen ble fordampet og man fikk l,39.g pyro-Glu-His(To syl)-Trp-Ser(Benzyl)-Tyr(2-brombenzyloksykar bonyl)-3-(2-naftyl) -D-alanyl-Leu-Ar g( Tosyl) -Pro-NH-CH^H^.

De beskyttende grupper på dette urene polypeptid ble fjernet med en behandling med 3 ml anisol og 30 ml nylig destillert (fra CoF^) vannfri flytende HF ved 0°C

i en halv time i et <n>Kel-F"-reaksjonskar. Flussyren ble fordampet under vakuum, og residuet vasket med eter. Residuet ble opplost i 2-molar eddiksyre og lyofilisert, hvorved man fikk 0,82 g urent (pyro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-D-alanin-Leu-Arg-Pro-NH-CH2CH^ som sitt eddik-syreaddisjons salt. Den endelige rensning ble oppnådd ved preparativ hdytrykksvæskekromatografi på en 2Q mg prove på en 0,9 x 550 mm kolonne 40-50 ^u oktadecylsilylert silisiumdioksyd (Merck, "Lichroprep C18"). Elueringsmidlet var 64% 0,03-molar NH^OAc/36% acetonitril. I fire forsdk fikk man renset 61 mg urent polypeptid. Etter tre lyofi-liseringer fra vann, fikk man fremstilt 15 mg rent pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naftyl)-D-alanyl-leucyl-ariginyl-prolin-etylamid. som sitt eddiksyreaddisjonssalt, smeltepunkt 180 - 190°C, ^a7^<5> -57,2° (c 1,1, HoAc).

Ved å gjenta ovennevnte spalting, men ved å bruke en stokiométrisk mengde av:

n-butylamin,

cyklopropylamin,

cykloheksylamin,

trifluormetylamin,

pentafluoretylamin, og

2,2,2-trifluor etylamin

istedenfor etylamin, fikk man fremstilt de tils/arende n-butylamid,

cyklopropylamid,

cykloheksylamid,

trifluormetylamid,

pentafluoretylamid, og

2,2,2-trifluor etylamid

av det forannevnte nonapeptid.

Eksempel 3

Forbindelser med formel I hvor Z er

kan fremstilles ved en klassisk oppldsningssyntese.

Man kan f.eksp bruke fdlgende syntesevei hvor "AzaGlyNH2" er -NH-NH-C-NH2:

som det frie peptid eller salt [a]^<5> = -34,3 (C 0,34, HOAc).

Aminosyreanalyse:

Ser, 0,74(1); Glu, 0,89(1); Pro, 0,94(1); Leu, 0,98(1);

Tyr, 1,00(1); His, 1,03(1); NH^, 1,13(1); Trp, 1,01(1);

Arg, 0,99(1); Nal(2), 1,08(1).

Koblingen av de individuelle fragmenter kan utføres ved acyl-acidmetoden (J. Honzel et al, Coll. Czecg. Chem. Comm., 2333 (1971), ved DCC/ HBT-kobling eller hvor man bruker koblingsteknikk med racemisering av frie fragmenter. Forbindelsene (1) og (2) er kjente (M. Fujino et al, Biochem. Biophys. Res. Comm., 57, 1248 (1974) og A.S. Dutta et al., J. Chem. Soc. Perkin I, 1979, 379, henholdsvis). Forbindelsene nr. (3) fremstilles fra (2) ved fjerde Cbz og nitrogruppene ved hydrogenolyse, hvoretter man utfører en kobling med N-Boc-3-(2-naftyl)-D-alanin idet man bruker DCC/HBT eller et annet kjent koblingsmiddel. Se Dutta et al referanse som ovenfor, for en lignende LH-RH-analogsyntese.

På lignende måte kan man ved å bruke andre aminosyrer istedenfor N-Boc-3-(2-naftyl)-D-alanin fremstille andre forbindelser med formel I, f.eks. fdlgende: (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-na ftyl)-D-ala-N-metyl-Leu-Arg-Pro-AzaGlyNH2 og

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-trimetylfenyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-AzaGlyNH2. Ved fremstillingen av forbindelse (2) så kan man også bruke AzaGly-NH-lavere alkyl istedenfor Aza-Gly-NH2, og dette gir det tilsvarende peptid med en AzaGly-NH-lavere alkyl terminalgruppe, f.eks.

(pyr o)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-AzaGly-Et,

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-D-Ala-N-metyl-Leu-Arg-Pro-AzaGly-Et og

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-trimetylfenyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-AzaGly-Et.

Eksempel 4

Man kan ved å bruke fremgangsmåten fra eksempel

1 og bruke enten en D-aminosyre eller en D,L-aminosyre i stilling 6 (i sistnevnte tilfelle må man skille de diastere- omeriske peptider under kromatografien), og ved å bruke passende aminosyrer i den fastefasesyntesesekvensen, kan man få fremstilt de folgende dekapeptider som ble isolert og karakterisert som sine eddiksyreaddisjonssaltér: pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naftyl)-D-alanyl-N-metylleucyl-arginyl-propyl-glycinamid, [ aj^ -26,6° (c = 1, HOAc),

pyro-glutamyl-histidyl-3-(1-naftyl)-L-alanyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naftyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-

i glycinamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-fenylala— nyl-3-(2-naftyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-fenylalanyl-3-( 2-naftyl )-D-alanyl-leucyl-arginyl-pro;lyl-glycinamid,

i pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-3-(1-penta-fluorfenyl)-L-alanyl-3-(2-naftyl)-D-alanyl-leucylarginyl-

prolyl-glycinami d,

pyr o - glut amyl -hi sti dyl - tr yp t o fyl - s er yl - tyr o syl-3-(l-naftyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid, smeltepunkt 173 - 175°C, [ zj^ -28,1° (C=0,8, HOAc),

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(2-antryl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(2-fluorenyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid, laj^ -25,8° (C=l, HOAc),

pyr o-glutamyl-hi sti dyl-trypto fyl-s er yl-tyro syl-3-(3-fenantryl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(4-bifenylyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid, ZI7d<5> -35,7° (C=l, HOAc),

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(2,2-difenylmetyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(1-adamantyl)-D-alanyl-leucyl-ariginyl-prolyl-glycinamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(2,4,6-trimetylfenyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid, Zi7^<5> -<4>2,1° (C=l, HOAc),

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-/2,4,6-tri-(n-butyl)fenyl7-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid ,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(2,3,4,5,6-pentametylfenyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl - gly cinami d,

pyro-glutamyl-hi s ti dyl-trypto fyl-s eryl-tyro sy1-3-(2,4,6-trimetylcykloheksyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid,

pyr o-glutamyl-hi sti dyl-1 r yp t o f y 1 - s er y 1 -1 yr o sy 1 - 3-/5,4,6-tri(n-butyl)cykloheksyl7-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(p erhydr o-1-na fty1)-D-alanyl-1eucyl-ar giny1-prolyl-glycinamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(perhydro-2-naftyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(4-perhydrobifenylyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid,

pyro-glutamyl-histidy1-tryptofyl-seryl-tyr osy 1-3-(perhydro-2,2-difenylmetyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamid ,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(2-na ftyl)-D-alanyl-isoleucyl-arginyl-prolyl-glycinamid,

og

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naftyl)-D-alanyl-norleucyl-arginyl-prolyl-glycinamid.

Eksempel 5

Man gjentok fremgangsmåten fra eksempel 2 og

brukte enten en D-aminosyre eller en D,L-aminosyre i stilling 6 (i det sistnevnte tilfelle kan man skille de diastereo-meriske peptider under kromatografien), og brukte passende aminosyrer i nevnte faste fase-syntesesekvens, hvorved man fikk fremstilt de fSigende nonapeptider som ble isolert og karakterisert som sine eddiksyreassisjonssalter: pyr o-glutamy1-histidy1-1ryptofy1-sery1-3-(1-naftyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid.

pyro-glutamyl-histidyl-fenylalanyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naftyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som som sitt etylamid, smeltepunkt 180 - 190°C, [ aj^ -57,2° (C=l, ltøé HOAc), n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, tri^ fluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid.

pyro-glutamyl-histi dyl-3-(1-na ftyl)-L-alany1-ser yl-tyrosyl-3-(2-naftyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som sitt et<y>lamid,. smeltepunkt 160 - 170°C, Z£7jp -45,3

(C=l, HOAc), n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluor-

etylamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-fenylalanyl-3-(2-na ftyl)-D-alanyl-leucyl-ar ginyl-prolin som sitt etylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-3-(l-pentafluorfeny])-L-alanyl-3-(2-naftyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(lpantryl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(2-fluorenyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(3-fenantryl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(4-bifenylyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(2,2-difenylmetyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, smeltepunkt 176 - 206°C, /a7p<5> 33,7° (C=l, 10% HOAc), n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tyrptofyl-seryl-tyrosyl-3-(1-adamantyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(2,4,6-trimetylfenyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl/2*, 4,6-tr i- (n-butyl)fenyl7-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, n-butylamid-, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamidå pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(2,3,4,5,6-pentametylfenyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid,

pyro-glutamy1-histidy1-tryptofy1-s er y1-tyrosy1-3-(2,4,6-trimetylcykloheksyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluonetylamid og 2,2,2-tr i fluor etylami d,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-/2,4,6-tri(n-butyl)cykloheksyl7-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamidi,. pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(perhydro-l-naftyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(perhydro-2-naftyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksyl-

amid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid,

pyr o-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyr o s y 1 - 3-(4-perhydrobifenylyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid,

pyro-glutamy1-histidyl-tryptofy1-sery1-tyrosy1-3-(perhydro-2,2-difenylmetyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-pro-

lin som sitt etylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naftyl)-D-alanyl-N-metylleucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, smeltepunkt 170 - 185°C, [ aj^ -81,1°C

(C=0,7, 10% HOAc), n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naftyl)-D-alanyl-isoleucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid, og

pyro-glutamyl-histidyl-tryptofyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naftyl)-D-alanyl-norleucyl-arginyl-prolin som sitt etylamid, n-butylamid, cyklopropylamid, cykloheksylamid, trifluormetylamid, pentafluoretylamid og 2,2,2-trifluoretylamid.

Eksempel 6

A. En oppldsning av 0,1 g av hydrogenfluorid-saltet av (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (se eksempel 1) ble oppldst i 50 ml vann

og fort gjennom en kolonne av 50 g "Dowex 3" anionutbyt-ningsharpiks som på forhånd var ekvilibrert med eddiksyre og vasket med deionisert vann. Kolonnen ble eluert med deionisert vann, og væsken fra kolonnen ble lyofilisert, hvorved man fikk det tilsvarende eddiksyresalt av (pyro)-

Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, /a7|<55> -27,5° (c 0,9, HOAc).

Ved å gjenta ovennevnte fremgangsmåte,men ved å bruke andre syrer enn eddiksyre under ekvilibreringen av harpiksen, kan man f.eks. få fremstilt de tilsvarende salter med saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre, salpetersyre, benzosyre o.l.

På lignende måte kan man fremstille syreaddisjonssalter av andre forbindelser med formel I.

B. I forbindelse med salter med lav vannopploselighet kan disse fremstilles ved utfelling fra vann ved å bruke den forønskede syre. F.eks.: Sinktannatsalt - en oppldsning.av 10 mg (pyro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 eddiksyresalt i 0,1 ml vann ble behandlet med en oppldsning av 8 mg garvesyre i 0,08 ml 0,25-molar NaOH. En oppldsning av 5 mg ZnSO^-heptahydrat i 0,1 ml vann ble umiddelbart tilsatt opplbsningen av LH-RH-analogen.

Den resulterende suspensjonen ble fortynnet med

1 ml vann og bunnfallet sentrifugert. Den overliggende væske ble helt av og residuet vasket to ganger med 1 ml porsjoner av vann ved sentrifugering av bunnfallet og avhelling av væsken. Bunnfallet ble tbrket i vakuum og ga 15 mg av et blandet sinktannatsalt av ovennevnte LH-RH-analog. - Pamoatsalt - en oppldsning av 50 mg (pyro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (2-naftyl)-D-Ala-Leu-Ar g-Pro-Gly-NH2 eddiksyresalt i en blanding av 1,6 ml etanol og 0,1 ml 0,25-molar NaOH ble tilsatt en oppldsning av 11 mg pamoinsyre i 0,3 ml 0,25-molar NaOH. Oppldsningsmidlene ble fjernet ved redusert trykk og residuet ble suspendert i 2 ml vann, sentrifugert og væsken ble helt av. Bunnfallet ble vasket med 1,5 ml H20, sentrifugert og den overliggende væske ble helt av. Bunnfallet ble torket i vakuum, hvorved man fikk 54 mg av pamoatsaltet av den ovennevnte LH-RH-analog.

På lignende måte kan man fremstille andre salter

med lav vannopploselighet.

C. Fremstilling av syreaddisjonssalt fra det frie peptid.

En oppldsning av 50 mg av (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (2-naftyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 som den frie base ble tilsatt 30 ml IN eddiksyre. Den resulterende oppldsning ble lyofilisert, og man fikk 50 mg av eddiksyre saltet av ovennevnte LH-RH-analog.

På lignende måte kan man ved å erstatte eddik-syren med andre syrer (i stdkiometrisk ekvivalente mengder i forhold til peptidet) fremstille andre syreaddisjonssalter av forbindelser med formel (I), f.eks. salter med saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre og salpetersyre.

D. Fremstilling av salt med metallkation, f.eks. sinksalt - En oppldsning av 50 mg (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (2-naftyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 eddiksyresalt

i en blanding av 0,4 ml 0,25-molar NaOH, 0,3 ml vann og 1 ml etanol ble tilsatt en oppldsning av 15 mg sinksulfat-heptahydrat i 0,2 ml vann. Bunnfallet ble sentrifugert og væsken helt av. Bunnfallet ble så vasket med 1 ml vann ved sentrifugering og avhelling av væsken. Til slutt ble bunnfallet torket i vakuum og man fikk 48 mg av sinksaltet av ovennevnte LH-RH-analog.

På lignende måte kan man fremstille salter av andre flervalente kationer såsom kalsium, vismut, barium, magnesium, aluminium, kobber, kobolt, nikkel, kadmium og lignende.

Eksempel 7

En oppldsning av 50 mg (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3- (2-naftyl )-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 eddiksyresalt

i 25 ml vann ble fort gjennom en 50 g kolonne av "Dowex 1"

(sterkt basisk, kvaternær ammoniumanionutbytningsharpiks)

som var ekvilibrert med NaOH-opplosning for å få tilveie-bragt de foronskede hydroksydioner. Kolonnen ble eluert med 150 ml vann, og væsken lyofilisert hvorved man fikk 45 mg av det tilsvarende polypeptid som den frie base.

På lignende måte kan man omdanne andre syreaddisjonssalter av forbindelser med formel (i), f.eks. de som er nevnt i eksempel 6, til de tilsvarende frie baser.

Eksempel 8

Det er i det fdlgende angitt typiske farmasdy-tiske sammensetninger som inneholder som aktiv ingrediens en LH-RH-analog ifdlge foreliggende oppfinnelse, f.eks.

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2» enten som sådan eller som et farmasøytisk akseptabelt salt, f.eks. eddiksyreaddisjonssaltet, sinksaltet, sinktannatsaltet etc.

A. Tablett for bruk i munnhulen (sublingualt):

Fremgangsmåte for fremstilling

a. LH-RH-analogen ble oppldst i vann, dvs. en tilstrekkelig mengde til å danne en våt granulering når den ble blandet med sukkerdelen av fortynningsmidlene. Etter fullstendig blanding ble granulatet torket i et trau eller i et fluidisert sjikt. De tdrre granulatene

ble så siktet for å bryte opp stbrre klumper, og så blandet med de gjenværende komponenter. Granulatet ble så presset i en standard tablettmaskin til den spesifikke tablett-vekten.

b. I denne fremgangsmåten vil alle sammensetninger inneholde 0,01% gelatin USP. Gelatinen blir forst opplost i det vandige granuleringsopplbsningsmiddel fulgt av LH-RH-analogen. De gjenværende trinn er som under a) ovenfor.

i Preparat 4 kan også brukes som en tablett for oral tilforsel.

B. Lengevarende intramuskulært injiserbar sammensetning.

1. Lengevarende I. M- injiserbar - Sesamoljegel

Aluminiummonostearatet ble kombinert med sesam-oljen og oppvarmet til 125°C under rbring inntil man fikk en klar gul opplbsning. Blandingen ble så sterilisert i en autoklav og avkjblt. LH-RH-analogen ble så tilsatt asep-tisk. Spesielt foretrukne LH-RH-analoger er salter med lav oppibselighet, f.eks. sinksalter, sinktannatsalter, pamoatsalter o.l. Disse har eksepsjonelt lang varighet med hensyn til aktivitet.

2. Lengevarende I.M.-injiserbare- bionedbrytbare polymermikrokapsler

Mikrokapsler (0 - 150 ^u) av ovennevnte sammensetning suspendert i:

25 mg av mikrokapslene vil bli suspendert i 1,0 ml av væsken. C. Vandig oppldsning for intramuskulær injeksjon

Opplos gelatin og LH-RH-analogen i vann for injeksjon, hvoretter man utforer en steriliseringsfiltrering.

D. Vandig oppldsning for nasal tilfdrsel

Opplos LH-RH-analogen, dekstrose, benzylalkohol i renset vann og q.s. til volum.

E. Preparat for rektal tilforsel:

LH-RH-analogen ble slått sammen med det smeltede "Witepsol H15", blandet og helt over i 2 g former.

Eksempel 9

Demping av brunst hos rotter

Fremgangsmåte:

Hunnlige rotter (Hilltop, Sprague Dawley, vekt ca. 200 g med åpne vaginaer) ble puttet i veide grupper på 5 pr. bur og 2 bur pr. gruppe. Rottene ble injisert subkutendst to ganger daglig (med unntak som angitt nedenfor) i 14 ddgn. Daglig ble det tatt ut vaginale utstrykning er for å bestemme status på brunstsyklus og kroppsvektene ble målt i begynnelsen og etter 1 og 2 uker. Prosent av hunnene som viste delvis demping av brunst (dvs. bare for brunst og etterbrunst men ingen skikkelig brunst) fra 4. dag og fremover, og prosent av hunner som viste fullstendig demping av hele brunsten (dvs. bare forbrunst) fra dag 4 ble angitt. ED^Q-verdiene er avledet fra den beste rette linje' når det gjelder prosentvis data for demping av brunst. LH-RH-analogene ble tilfort som sine acetat-salter i en fysiologisk saltoppldsning inneholdende 0,1% storfeserumalbumin. Injeksjonsvolumet var 0,2 ml og analogene var tilstede i mengder på 0,05, 0,1, 0,2 og 0,4 /ug. En kontroll (fysiologisk saltoppldsning inneholdende BSA) viste ingen dempning av brunsten.

EDcjQ for de dyr som viste delvis eller fullstendig dempning av brunsten var fdlgende:

a - Disse forbindelser inngis bare én gang daglig.

Eksempel 10

6 Swiss-Webster-mus (Simonsen) som hver veide ca. 25 g ble injisert subkutendst med 0,25 ml av en vandig oppldsning av (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 som sitt acetatsalt. Dosen var 40 mg/kg kroppsvekt eller ca. 1 mg pr. mus. Musene ble observert to ganger daglig for mortalitet i 3 uker. Man kunne ikke observere noen letale effekter. LD^q er fdlgelig mer enn 40 mg/kg kroppsvekt.

Claims (11)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk virksomme nonapeptid- og decapeptidderivater med formelen: og farmasøytisk akseptable salter derav, hvor V er tryptofyl, fenylalanyl eller 3-(1-naftyl)-L-alanyl ; W er tyrosyl, phenylalanyl eller 3~(1-pentafluor-fenyl)-L-alanyl; X er en D-aminosyrerest hvor R er (a) et karbocyklisk arylholdig radikal valgt fra naftyl, antryl, fluorenyl, fenantryl, bifenylyl, benzhydryl og fenyl substituert med tre eller flere rettkjedede laverealkylgrupper ; eller (b) et mettet karbocyklisk radikal valgt fra cykloheksyl substituert med 3 eller flere rettkjedede laverealkylgrupper, perhydronaftyl, perhydrobifenylyl, perhydro-2,2-difenylmetyl og adamantyl; Y er leucyl, isoleucyl, nor-leucyl eller N-metyl-leucyl; Z er glycinamid eller -NH-R<1>, hvor R<1> er laverealkyl, cykloalkyl med 3-6 karbonatomer, fluor-laverealkyl eller , hvor R 2er hydrogen- eller laverealkyl, idet laverealkylgruppene inneholder 1-4 karbonatomer, karakterisert ved at man (i) fjerner beskyttende grupper og eventuelt kovalent bundet fast bærer fra et beskyttet polypeptid for oppnåelse av en forbindelse med formel (I) eller et salt derav, eller kobling av individuelle fragmenter av den ønskede forbindelse med formel (I), og eventuelt: (ii) omdanner en forbindelse med formel (I) til et farma-søytisk akseptabelt salt, (iii) omdanner et salt av en forbindelse med formel (I) til et farmasøytisk akseptabelt salt, eller (iv) dekomponerer et salt av en forbindelse med formel (I) til et fritt polypeptid med formel (I).

2. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man fremstiller en forbindelse hvor V er tryptofyl eller fenylalanyl, W er tyrosyl, X er 3-(2-naftyl)-D-alanyl eller 3-(2,4,6-trimetyl-fenyl)-D-alanyl, Y er leucyl eller N-metyl-leucyl, og Z er glycamid eller -NHEt.

3. Analogifremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at man fremstiller en forbindelse hvor X er 3~(2-naftyl)-D-alanyl.

4. Analogifremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at man fremstiller forbindelsen (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 og dens farmasøytisk akseptable syre-addisj onssalter.

5- Analogifremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at man fremstiller forbindelsen (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-D-alanyl-N-metyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 og dens farmasøytisk akseptable salter.

6. Analogifremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at man fremstiller forbindelsen (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-NHEt og dens farmasøytisk akseptable salter.

7. Analogifremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at man fremstiller forbindelsen (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-D-alanyl-N-metyl-Leu-Arg-Pro-NHEt og dens farmasøytisk akseptable salter.

8. Analogifremgangsmåte ifølge krav 3» karakterisert ved at man fremstiller forbindelsen (pyro)Glu-His-Phe-Ser-Syr-3-(2-naftyl)rD-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-IW^ og dens farmasøytisk akseptable salter.

9. Analogifremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at man fremstiller en forbindelse hvor X er 3~(2,4,6-trimetylfenyl)-D-alanyl.

10. Analogifremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at man fremstiller forbindelsen (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-trimetylfenyl)-D-alanyl— Leu—Arg-Pro-Gly-NH2 og dens farmasøytisk akseptable salter.

11. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man fremstiller forbindelsen (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naftyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Aza-Gly-NH2 ok dens farmasøytisk akseptable salter.