FR2458538A1 - Derives nonapeptidiques et decapeptidiques de l'hormone liberant l'hormone luteinisante, leur procede de production et composition pharmaceutique les contenant - Google Patents

Abstract

L'INVENTION A TRAIT AU DOMAINE DE LA CHIMIE PHARMACEUTIQUE. ELLE CONCERNE DES DERIVES NONAPEPTIDIQUES ET DECAPEPTIDIQUES DE L'HORMONE LIBERANT L'HORMONE LUTEINISANTE. LES COMPOSES DE L'INVENTION SONT DOUES DE PROPRIETES AGONISTES PUISSANTES ENVERS L'HORMONE LIBERANT L'HORMONE LUTEINISANTE.

Description

L'hormone lutéinisante (HL) et l'hormone folliculo-

stimulante (HFS) sont libérées du lobe antérieur de la glande hypophysaire sous le contrôle de l'hormone de libération HHT produite dans la région hypothalamique. L'hormone HL et HFS agissent sur les gonades en stimulant la synthèse d'hormones stéroidiques et en stimulant la maturation des gamètes. La libération pulsatile de l'hormone HHT et par conséquent la libération des hormones HL et HFS influencent le cycle de

reproduction des animaux domestiques et des êtres humains.

En outre, l'hormone HHT exerce. des effets sur le placenta, dans la libération de la gonadotrophine chorionique humaine, et directement sur les gonades. Des analogues agonistes de l'hormone HHT sont utiles pour influencer la fertilité, selon deux mécanismes d'action. De faibles doses d'analogues de HHT peuvent stimuler l'ovulation et sont utiles dans le traitement de la non-fertilité hypothalamique et ovulatoire. En outre, on peut les utiliser dans des cas d'hypogonadisme et d'impuissance,

et pour stimuler la spermatogénèse et la production d'andro-

gènes chez le mâle. Paradoxalement, des doses élevées d'ana-

logues de HHT très puissants et à longue durée d'action exercent un effet opposé et inhibent l'ovulation chez la femelle, et suppriment la spermatogénèse chez le mâle. On observe en relation avec ces effets, une suppression des taux normaux en circulation de stéroldes sexuels d'origine gonadique, ainsi qu'une réduction du poids des organes accessoires chez le mâle et chez la femelle. Chez les animaux domestiques, cet effet paradoxal favorise le gain de po;ds dans un élevage, stimule l'avortement chez les animrau:- gravides et, d'unie façon

générale, se comporte comme un stlrilisant zhimique.

L'hormone de liberation HET est sous sa forme naturelle un decapeptide forr: d'uainoacides naturels (qui ont la configuration L, excepté l'aminoacide achiral que constitue la glycine). Sa séquence est la suivante: (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GLy-NH2. De nombreux analogues de cette substance naturelle ont été étudiés et la plupart d'entre eux se sont montrés insuffisamment actifs du point de vue biologique pour qu'on puisse les utiliser cliniquement. Certaines formes déterminées ont fait preuve

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d'un effet bénéfique sur l'activité biologique. La modifi-

cation la plus importante est de loin obtenue en changeant le résidu Gly en position 6 en un D-aminoacide. Par exemple,

en remplaçant le résidu Gly en position 6 par le rédisu D-

Ala, D-Leu, D-Phe ou D-Trp, on a obtenu une série d'analogues de l'hormone HHT d'activité supérieure à celle de l'hormone naturelle (voir M. Monahan et collaborateurs, "Biochem.", 12 4616 (1973) pour la /D Ala_67-HHT; J.A. Vilchez-Martinez et collaborateurs, "Biochem. Biophys. Res. Comm." 59, 1226 (1974)

pôu la L u6- 10-" 6 9-

pour la D-Leu67/HHT et la desGly10 /D-Leu, Pro NHEt_7 HHT; D.H. Coy et collaborateurs, "J. Med. Chem.", 19, 423 (1976) pour la /D-Phe7 HHT; et W. Vale et collaborateurs, "Clinical

Endocrinology", 5e supplément, Blackwell Scientific Publica-

tions, Oxford, Grande-Bretagne (1976), page 2615 et D.H. Coy et collaborateurs, "Biochem. Biophys. Res. Comm.", 67, 576 6-

(1979) pour la LD-Trp_7 HHT.

En plus des améliorations notables d'activité obtenues par les substitutions en position 6 auxquelles il est fait allusion ci-dessus, d'autres améliorations d'activité peuvent être obtenues en éliminant le groupement Gly-NH2 en position 10 pour obtenir un nonapeptide sous la forme d'un alkylamide, d'un cycloalkylamide ou d'un fluoralkylamide, ou en remplaçant Gly-NH2 par uni amide d'a-azaglycine (voir par exemple M. Fujino et collaborateurs, "Biochem. Biophys. Res. Comm." 49, 863 (1972), D.H. Coy et collaborateurs, "Biochem.",

14, 1848 (1975) et A.S. Dutta et collaborateurs, "J. Chem. Soc."

Perkin I, 1979, 379.

Le remplacement du résidu de leucine en position 7 par le résidu de Nméthyl-leucine accroît la stabilité envers la degradation-enzymatique (voir par exemple N. Ling et

collaborateurs, "Biochem. Biophys. Res. Comm.", 63, 801 (1975).

Le remplacement du résidu de tryptophane en posi-

tion 3 par la 3-(1-naphtyl)-L-alanine entraîne une élévation

du pouvoir biologique (voir par exemple K.Ui Prasad et colla-

borateurs, "J. Med. Chem.", 19, 492 (1976) et Y. Yabe, "Chem.

Pharm. Bull.",24 (12), 3149 (1976).

Le résidu de tyrosine en position 5 peut être

remplacé par la phénylalanine ou la 3-(1-pentafluorophényl)-

L-alanine avec le maintien d'une activité biologique notable

(voir par exemple N. Yanaihara et collaborateurs, "Biochem.

Biophys. Res. Comm.", 52, 64 (1973) et D. Coy et collabo-

rateurs,"J. Med. Chem." 16, 877 (1973).

Il serait désirable de préparer d'autres analogues de HHT ayant un degré d'activité biologique encore plus grand que ceux qui ont été décrits jusqu'à présent et qui peuvent être utilisés cliniquement chez les animaux et les êtres humains. La présente invention a trait à de nouveaux dérivés nonapeptidiques et décapeptidiques de l'hormone HHT qui portent, en position 6, certains D-aminoacides lipophiles. L'invention concerne aussi diverses méthodes d'utilisation de ces composés et des compositions pharmaceutiques qui les contiennent. Un

autre aspect de l'invention implique des procédés de produc-

tion des nouveaux composés décrits ci-dessus et des composés

intermédiaires utiles dans ces procédés.

La présente invention concerne de nouveaux dérivés nonapeptidiques et décapeptidiques de l'hormone HHT. Plus particulièrement, la présente invention concerne des dérivés de l'hormone HHT qui portent, en position 6, des résidus spécifiques non naturels de D-amino-acides renfermant des restes carbocycliques lipophiles, en particulier des résidus renfermant deux ou plusieurs noyaux aryle (ou perhydroaryle) carbocycliques ou un noyau phényle (ou cyclohexyle) qui est

hautement alkylé.

Les composés de la présente invention sont plus particulièrement des nonapeptides et décapeptides de formule: (pyro)Glu-His-V-Ser-W-X-Y-ArgPro-Z (I)

(y compris leurs sels acceptables du point de vue pharmaceu-

tique), formule dans laquelle:

V est un groupe tryptophyle, phénylalanyle ou 3-(1-

naphtyl)-L-alanyle;

W est un groupe tyrosyle, phénylalanyle ou 3-(1-penta-

fluorophényl)-L-alanyle; X est un résidu de D-amino-acide de formule: o

-NH-CH-8-

1H2 R o R représente: (a) un radical contenant un groupe aryle carbocyclique choisi entre des groupes naphtyle, anthryle, fluoré- nyle, phénanthryle, biphénylyle, benzhydryle et phényle portant trois ou plus de trois substituants alkyle inférieurs à chaîne droite; ou (b) un radical carbocyclique saturé choisi dans la classe comprenant un groupe cyclohexyle portant

trois ou plus de trois substituants alkyle infé-

rieurs à chaîne droite, le groupe perhydronaphtyle, perhydrobiphénylyle, perhydro-2,2-diphénylméthyle et.adamantyle; Y est un groupe leucyle, isoleucyle, nor-leucyle ou N-méthyl-leucyleo;

Z est le glycinamide ou un groupe -NH-R1, dans le-

quel

R1 est un groupe alkyle inférieur, cycloalkyle, fluor-

O 2

alkyle inférieur ou -NH-C-NH-R et R2 est un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur. Comme indiqué ci-dessus, et pour la. commodité de

la description du présent mémoire, les abréviations classiques

pour les divers amino-acides courants sontutiliséesde la manière généralement admise dans le domaine des peptides, comme préconisé par l'IUPAC-IUB Commission on Biochemical

Nomenclature, 'Biochemistry", 11, 1726 (1972) et ces abrévia-

tions représentent des L-amino-acides à l'exception de la glycine, aminoacide achiral, et à l'exception, en outre, des amino-acides en position 6, désignés par X. Toutes les séquences peptidiques mentionnées dans le présent mémoire correspondent au mode d'écriture conforme aux conventions générales, en sorte que l'amino-acide terminal lié par l'azote se trouve à gauche et que l'amino-acide terminal lié par le carbone se trouve à droite. L'expression "sels acceptables du point de vue pharmaceutique" utilisé dans le présent mémoire désigne des sels qui gardent l'activité biologique désirée du composé dont ils dérivent et ne confèrent aucun effet toxicologique indésirable. Des exemples de ces sels comprennent (a) des sels d'addition d'acides formés avec des acides inorganiques, par exemple l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide nitrique, etc.; et des sels formés avec des acides organiques tels que, par exemple, l'acide acétique, l'acide oxalique, l'acide tartrique, l'acide succinique, l'acide maléique, l'acide fumarique, l'acide gluconique, l'acide citrique, l'acide malique, l'acide ascorbique, l'acide benzoique, l'acide

tannique, l'acide pamoique, l'acide alginique, l'acide poly-

glutamique, des acides naphtalènesulfoniques, des acides naphtalènedisulfoniques, l'acide polygalacturonique; (b) des sels formés avec des cations métalliques polyvalents tels que zinc, cadmium, bismuth, baryum, magnésium, aluminium, cuivre, cobalt, nickel, cadmium, etc.; ou avec un cation organique

formé à partir de N,N'-dibenzyléthylènediamine ou d'éthylène-

diamine; ou encore (c) des associations de (a) et (b), par exemple un tannate de zinc, etc. L'expression "alkyle inférieur" utilisée dans le présent mémoire désigne un groupe hydrocarboné saturé à chaîne droite ou à chaîne ramifiée ayant 1 à 4 atomes de carbone, par exemple méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, isobutyle, sec.-butyle.et tertiobutyle; l'expression. "groupe cycloalkyle" désigne un groupe hydrocarboné saturé cyclique

ayant 3 à 6 atomes de carbone, par exemple cyclopropyle, cyclo-

butyle, cyclopentyle et cyclohexyle; l'expression "alkyle inférieur fluoré' désigne un groupe alkyle inférieur dont un ou plusieurs atomes d'hydrogène sont remplacés par du fluor,

par exemple trifluorométhyle, pentafluoréthyle, 2,2,2-

trifluoréthyle, etc. Le terme "naphtyle" utilisé dans le présent mémoire désigne des groupes 1- et 2-naphtyle; le terme "anthryle" désigne les groupes 1-, 2- et 9-anthryle; le

terme "fluorényle" désigne les groupes 2-, 3- 4- et 9-

fluorényle; le terme "phénanthryle" désigne les groupes 2-, 3- et 9phénanthryle; et le terme "adamantyle" désigne les

groupes 1- et 2-adamantyle.

Des exemples appréciés de composés de l'invention

comprennent les composés dans lesquels X est le groupe 3-(2-

naphtyl)-D-alanyle ou 3-(2,4,6-triméthylphényl)-D-alanyle; Z est le glycinamide ou le groupe -NHEt; V est un groupe tryptophyle ou phénylalanyle; W est un groupe tyrosyle et Y

est un groupe leucyle ou N-méthyl-leucyle. On apprécie parti-

culièrement les composés suivants:

(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)-D-alanyl-

Leu-Arg-Pro-Gly-NH2,

(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)-D-alanyl-

N-méthyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2,

(pyro) Glu-His-Phe-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)-D-alanyl-

Leu-Arg-Pro-Gly-NH2,

(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-triméthylphényl)-

D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2,

(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)-D-alanyl-

Leu-Arg-Pro-NHEt, et

(pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)-D-alanyl-

N-méthyl-Leu-Arg-Pro-NHEt, et leurs sels acceptables du point

de vue pharmaceutique.

30. On apprécie particulièrement le composé (pyro)

Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-

NH2 et ses sels.

Les composés de l'invention et en particulier leurs sels déploient une activité agoniste de l'hormone HHT étonamment puissante et de longue durée comparativement aux agonistes d'hormones HHT les plus puissants connus jusqu'à

présent, à savoir les composés (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-

Trp-Ser-Arg-Pro-Gly-NH2 et le prolyléthylamide correspondant.

Une mesure primaire de la puissance réside dans l'aptitude à supprimer partiellement ou totalement l'oestrus chez des

femelles adultes de rats dont le cycle est normal (détermina-

tion sur une période de deux semaines), par injection sous-

cutanée deux fois par jour.

D'autres épreuves biologiques qui ont été utilisées pour les analogues de l'hormone HHT et que l'on a utilisées pour-les composés de la présente invention comprennent les épreuves suivantes (a) induction de l'ovulation chez des femelles de rats en phase de dioestrus ou de prooestrus par injection

sous-cutanée (Rippel et collaborateurs, "Proc. Soc. Exp. Biol.

Med.", 148, 1193 (1975)), (b) libération des hormones HL et HFS par des

cultures dispersées de cellules du lobe antérieur de l'hypo-

physe, comme mesuré par l'épreuve radioimmunologique (Vale et collaborateurs, "Endocrinology", 91, 562 (1972)),et (c) libération des hormones HL et HFS dans la circulation périphérique de rats ovariectomisés, traités avec des stéroides, en réponse à une injection intraveineuse, comme mesuré par l'épreuve radioimmunologique (Arimura et

- collaborateurs, '.Endocrinology", 90, 163 (1972)).

A un niveau plus avancé, l'activité de ces composés peut être mise en évidence in vivo par l'abaissement de la spermatogénèse et des taux en circulation et testiculaires de la testostérone, de même que la réduction considérable de

grosseur de la prostate chez des chiens atteints d'hypertro-

phie prostatique bénigne. Il résulte de ce qui précède que les composés de l'invention peuvent être utilisés dans une grande variété de situations pour lesquelles le contrôle des hormones HL et HFS ou de l'action gonadique directe est important, à savoir: indications physiologiques (effets à faible dose) induction de l'ovulation dans la non-fertilité anovulatoire et pour l'ovulation déterminée dans le temps de femelles de mammifères;

traitement de la non-fertilité due à une insuffi-

sance de la fonction lutéinique chez la femme; - traitement de la nonfertilité hypogonadotrophique ou hypogonadique chez les êtres humains des deux sexes; traitement du syndrome kyste de l'ovaire/nymphoma- nie chez le bétail; induction ou exaltation du comportement sexuel ou

traitement de l'impuissance et de la frigidité.

indications paradoxales (effets à forte dose) *10 -contraception chez la femelle; -suppression ou retardement de l'ovulation -déclenchement de la parturition -synchronisation de l'ovulation; -suppression de l'oestrus; activation de la croissance chez les femelles d'animaux; - lutéolyse, induction menstruelle; - effet avortif précoce, pendant le premier trimestre - traitement de l'endométriose; - traitement des tumeurs et kystes mammaires - traitement du syndrome polycystique ovarien (SteinLeventhal) - traitement du carcinome utérin - traitement de l'hypertrophie prostatique bénigne et du carcinome de la prostate; - contraception chez le mâle;

- traitement de troubles résultant de l'hyperpro-

duction d'hormone gonadique chez les insectes 0. - castration fonctionnelle chez les màles d'animaux destinés à la boucherie;

- suppression de l'excitation prooestrale.-

En outre, ces composés, tout comme les composés connus du type HHT, offrent un intérêt nouveau et surprenant en tant qu'agents abortifs, vraisemblablement par inhibition des taux en circulation de gonadotrophine chorionique humaine

et par l'effet direct qu'ils doivent exercer sur le placenta.

L'effet placentaire pourrait suggérer une utilité contre le chorioépithéliome. Un autre aspect de la présente invention réside

dans les utilisations particulières des composés décrits ci-

dessus (y compris des utilisations qui n'ont pas encore été décrites pour des analogues d'hormones HHT), à savoir leurs utilisations dans l'inhibition de l'ovulation (c'est-à-dire

la contraception) chez la femelle, le traitement de l'endo-

métriose, le traitement de l'hypertrophie prostatique bénigne

et l'inhibition de la spermatogénèse (c'est-à-dire la contra-

ception) chez le mâle. Ainsi, sous ces aspects, l'invention

est axée sur un procédé utile pour l'inhibition de l'ovula-

tion, le traitement de l'endométriose, la réduction de gros-

seur de la prostate et l'inhibition de la spermatogénèse chez un mammifère ou un être humain nécessitant ou désirant un tel traitement, lequel consiste à administrer au patient, une quantité efficace d'un composé de la présente invention comme défini ci-dessus, ou une composition pharmaceutique contenant

ce composé.

Dans la mise en pratique du procédé de l'invention, une quantité efficace d'un composé nouveau ou d'une composition pharmaceutique contenant ce composé est administrée au patient nécessitant ou désirant un tel traitement. Ces composés ou compositions peuvent être administrés par l'une quelconque de diverses voies d'administration, selon l'application finale

spécifique, par exemple par voie orale, parentérale (adminis-

tration sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse),vagina-

le (en particulier pour la contraception), rectale, buccale,

(y compris sublinguale) ou intranasale. La voie d'administra-

tion la plus convenable dans chaque cas donné dépend de l'uti-

lisation, de l'ingrédient actif particulier, du sujet impliqué

et de l'appréciation du médecin traitant. Le composé ou la.

composition qui le contient peut aussi être administré au moyen de formulationsà effet retardé ou d'implants à libération

lente, comme décrit de façon plus détaillée dans ce qui suit.

En général, pour les applications décrites ci-

dessus, que l'on appelle applications "paradoxales" ou appli-

cations à forte dose, ii convient d'administrer l'ingrédient actif en quantités d'environ 0,01 à 100 pg par kilogramme de poids corporel par jour et de préférence d'environ 0,1 à 5,0 pg/kg de poids corporel par jour. Cette administration peut être effectuée une seule fois par jour, répartie en plusieurs applications, ou par libération lente en vue d'obtenir les

résultats les plus efficaces.

La dose exacte et le régime d'administration de ces composés et compositions dépendent nécessairement des

io besoins du sujet individuel en traitement, du type de traite-

ment, du degré d'atteinte ou de nécessité et, naturellement,

de l'appréciation du médecin traitant. En général, une adminis-

tration parentérale nécessite une dose plus faible que d'autres

modes d'administration, qui dépendent davantage de l'absorption.

Les composés de l'invention sont bien tolérés et relativement non toxiques. Des exemples représentatifs de ces composés ont-des DL50 par administration sous-cutanée à la souris bien au-delà de 40 mg/kg, ce qui constitue un très

grand facteur de sécurité, comparativement aux doses thérapeu-

tiques indiquées ci-dessus.

Un autre aspect de la présente invention réside dans des compositions pharmaceutiques contenant comme ingrédient actif un composé de la présente invention, lesdites compositions renfermant ce composé en mélange avec un support non toxique

acceptable du point de vue pharmaceutique. Comme mentionné ci-

dessus, ces compositions peuvent être préparées en vue de leur utilisation par administration parentérale (sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse), en particulier sous la forme

de solutions ou suspensions liquides; en vue de leur utilisa-

tion par administration vaginale ou rectale, notamment sous des formes seîni-solides telles que crèmes et suppositoires; en vue de leur administration orale ou buccale, en particulier sous forme de comprimés ou de capsules; ou en vue de leur administration intranasale, en particulier sous la forme de

poudres, de gouttes nasales ou d'aérosols.

Les compositions peuvent avantageusement être administrées sous une forme posologique unitaire et peuvent être préparées par l'un quelconque des procédés bien connus dans le domaine pharmaceutique, comme décrit par exemple dans "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Company, Easton, PA., 1970. Des formulations destinées à l'administration parentérale peuvent contenircomme excipients

communs, de l'eau ou une solution saline stérile, des polyalky-

lène-glycols tels qu'un polyéthylène glycol, des huiles d'ori-

gine végétale, des naphtalènes hydrogénés, etc. Des formula-

tioris destinées à l'administration vaginale ou rectale, par exemple des suppositoires, peuvent contenir des excipients tels que des polyalkylèneglycols, de la vaseline, du beurre de cacao, etc. Des formulations destinées à l'administration par inhalation peuvent être solides et peuvent contenir comme

excipients, par exemple, du lactose ou peuvent être des solu-

tions aqueuses ou huileuses destinées à l'administration sous la forme de gouttes nasales. Pour l'administration buccale, des excipients représentatifs comprennent le sucre, le stéarate de calcium, le stéarate de magnésium, l'amidon prégélatinisé, etc. Il est particulièrement désirable de délivrer les composés de la présente invention aux patients pendant des périodes prolongées, par exemple pendant des périodes

allant d'une semàine à un an, en une seule et même administra-

tion. Diverses formes posologiques à libération lente, à effet retardé ou par implantation, peuvent être utilisées. Par exemple, une forme posologique peut contenir un sel non toxique

acceptable du point de vue pharmaceutique du composé de l'in-

vention qui a un faible degré de solubilité dans les liquides corporels, par exemple (a) un sel d'addition formé avec un polyacide tel que l'acide phosphorique, l'acide sulfurique, l'acide citrique, l'acide tartrique, l'acide tannique, l'acide pamoique, l'acide alginique, l'acide polyglutamique, les

acides naphtalène mono- ou disulfoniques, l'acide polygalactu-

ronique, etc.; (b) un sel formé avec un cation de métal poly-

valent tel que zinc, calcium, bismuth, baryum, magnésium, aluminium, cuivre, cobalt, nickel, cadmium, etc.ou avec un

cation organique formé par exemple à partir de N,N'-dibenzyl-

éthylènediamine ou d'éthylènediamine; ou (c) des associations des possibilités indiquées en (a) et (b), par exemple un

tannate de zinc. En outre, les composés de la présente inven-

tion ou, de préférence, un sel relativement insoluble choisi parmi ceux qui viennent d'être énumérés, peuvent être formulés en un gel, par exemple un gel de monostéarate d'aluminium avec, par exemple, l'huile de sésame, cette forme convenant à l'injection. Des sels particulièrement appréciés sont des sels de zinc, des sels de zinc de l'acide tannique, des sels de l'acide pamoique, etc. Un autre type de formulation à effet retardé à libération lente pour l'injection pourrait contenir le composé ou le sel sous une forme dispersée ou encapsulée dans un polymère non antigénique, non toxiquelà dégradation lente tel qu'un polymère acide polylactique/acide polyglycolique, comme décrit par exemple dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3 773 919. Les composés ou, de préférence, les sels relativement insolubles tels que ceux qui ont été décrits ci-dessus, peuvent aussi être formulés en

pellets à matrice de cholestérol, notamment pour animaux.

D'autres formulations à effet de retard ou à implantation à libération lente, par exemple des liposomes, sont bien connues dans la littérature (voir par exemple "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J.R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc.,New York, 1978. On peut trouver des renseignements notamment en ce qui concerne les composés HHT dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique no 4 010 125-) Les polypeptides de la présente invention peuvent être obtenus par voie de synthèse par l'une quelconque des

techniques connues du spécialiste dans le domaine des peptides.

Une excellente récapitulation des nombreuses techniques disponibles est donnée par J.M. Stewart et JD. Young dans "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969 et par J. Meienhofer dans "Hormonal Proteins and Peptides", volume 2, page 46, Academic Press (New York), 1973, pour la synthèse de peptides en phase solide, et E. Schroder et K. Lubke, "The Peptides", volume 1, Academic

Press (New York) 1965 pour la synthèse classique en solution.

En général, ces procédés impliquent l'addition en

série d'un ou plusieurs amino-acides ou d'amino-acides conve-

nablement protégés à une chaîne peptidique en cours de crois-

sance. Normalement, le groupe amino ou carboxyle du premier aminoacide est protégé par un groupe protecteur convenable. L'amino-acide protégé ou sous une forme dérivée peut ensuite être attaché à un support solide inerte ou utilisé en solution par addition de l'amino-acide suivant de la série, dont le groupe complémentaire (amino ou carboxyle) est convenablement protégé, dans des conditions propices à la formation de la liaison amidique. Le groupe protecteur est ensuite enlevé

de ce résidu d'aminoacide nouvellement ajouté, puis l'amino-

acide suivant (convenablement protégé) est ajouté, et ainsi de suite. Après que tous les amino-acides désirés ont été

attachés dans l'ordre correct, tous groupes protecteurs res-

tants (et tout support solide) sont éliminés successivement ou simultanément pour donner le polypeptide final. Par une simple modification de ce mode opératoire général, il est possible d'ajouter plus d'un amino-acide à la fois à une chaîne en cours de croissance, par exemple par couplage (dans des conditions qui ne racémisent pas les centres de chiralité) d'un tripeptide protégé avec un dipeptide convenablement protégé pour former, après l'élimination des groupes protecteurs, un pentapeptide.

Un procédé particulièrement apprécié pour la pré-

paration de composés de la présente invention implique la

synthèse des peptides en phase solide.

Dans ce procédé particulièrement apprécié, la fonction a-amino des aminoacides est protégée par un groupe sensible aux acides ou aux bases. De tels groupes protecteurs doivent avoir la propriété d'être stables dans les conditions de la formation de liaisons peptidiques, tout en étant aisément éliminables sans destruction de la chaîne peptidique en cours de croissance ou sans racémisation de l'un quelconque des

centres de chiralité qui y sont contenus. Des groupes protec-

teurs convenables comprennent le groupe tertiobutyloxycarbo-

nyle (Boc), benzyloxycarbonyle (Cbz), biphénylisopropyloxycar-

bonyle, tertio-amyloxycarbonyle, isobornyloxycarbonyle, a,a-

diméthyl-3,5-diméthoxybenzyloxycarbonyle, o-nitrophénylsulfé-

nyle, 2-cyano-tertio-butyloxycarbonyle, 9-fluorénylméthyloxy-

carbonyle,etc.,notamment le groupe tertio-butyloxycarbonyle (Boc). Des groupes particulièrement appréciés pour proté- ger la chaîne latérale sont, pour l'arginine: des groupes nitro, p-toluènesulfonyle, 4méthoxybenzènesulfonyle, Cbz, Boc et adamantyloxycarbonyle; pour la tyrosine: des groupes benzyle, o-bromobenzyloxycarbonyle, 2,6dichlorobenzyle, isopropyle, cyclohexyle, cyclopentyle et acétyle; pour la sérine: les groupes benzyle et tétrahydropyranyle; pour

l'histidine: les groupes benzyle, p-toluènesulfonyle et 2,4-

dinitrophényle. L'amino-acide formant l'extrémité carbonée est lié à unsupport solide convenable. Les supports solides convenables utiles pour la synthèse ci-dessus comprennent des matières qui sont inertes envers les réactifs et les

conditions réactionnelles des réactions échelonnées de conden-

sation et d'élimination des groupes protecteurs, tout en étant insolubles dans les milieux utilisés. Des supports solides

convenables comprennent un polymère de chlorométhylpolysty-

rène et de divinylbenzène, un polymère d'hydroxyméthylpoly-

styrène et de divinylbenzène, etc, notamment un polymère de chlorométhylpolystyrène et de 1 % de divinylbenzène. Pour le cas spécial dans lequel l'extrémité carbonée du composé est le glycynamide, un support particulièrement utile est le polymère de benzhydrylamino- polystyrène et de divinylbenzène,

décrit par P. Rivaille et collaborateurs dans "Helv. Chim.

Acta." 54, 2772 (1971). La liaison à la résine de type chlorométhylpolystyrène-divinylbenzène est effectuée par la réaction de l'amino-acide à atome Ne-protégé, notamment le Boc-amino acide, sous la forme de son sel de césium, de

tétraméthylanmoniumn de triéthylammonium, de 4,5-diazabicyclo-

/5.4,07 undéc-5-ène ou d'un sel similaire dans l'éthanol, l'acétonitrile, le N,N-diméthylformamide (DMF), etc.,notamment le sel de césium dans le DMF, avec la résine chlorométhylique à une température élevée, par exemple entre environ 40 et 60 C, de préférence environ 50 C, pendant une période d'environ 12 à 48 heures, de préférence pendant environ 24 heures. Le Na-Boc-aminoacide est lié à la résine du type benzhydrylamine par un couplage à médiation N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC)/1hydroxybenzotriazole (HBT) pendant environ 2 à environ 24 heures, de préférence pendant environ 12 heures à une température comprise entre environ 10 et 50 C, de préférence à 25 C dans un solvant tel que le dichlorométhane ou le DMF, de préférence le dichlorométhane. Le couplage d'amino-acides protégés successifs peut être effectué dans un synthétiseur automatique pour polypeptides, comme cela est bien connu dans la pratique. L'élimination des groupes protégeant l'atome Na peut être effectuée par exemple en présence d'une solution d'acide trifluoracétique dans le chlorure de méthylène, une solution de gaz chlorhydrique dans le dioxanne, une solution de gaz chlorhydrique dans l'acide acétique ou une autre solution d'acide fort, de préférence une solution à 50 %

d'acide trifluoracétique dans le dichlorométhane à une tempéra-

ture de l'ordre de la température ambiante. Chaque amino-acide protégé est de préférence introduit en un excès molaire d'environ 2,5 M et le couplage peut être effectué dans le dichlorométhane, dans des mélanges de dichlorométhane et de DMF, dans le DMF, etc.,notamment dans le chlorure de méthylène, à une température de l'ordre de la température ambiante. L'agent de couplage est normalement le DCC dans le dichlorométhane, mais il peut s'agir du N,N'-diisopropylcarbodiimide ou d'un

autre carbodiimide seul ou en présence de HBT, de N-hydroxy-

succinimide, d'autres N-hydroxyimides ou d'oximes. A titre de variante, des esters actifs d'aminoacides protégés (par

exemple l'ester de p-nitrophényle, l'ester de pentafluoro-

phényle, etc. ou des anhydrides symétriques peuvent être utilisés. A la fin de la synthèse en phase solide, le

polypeptide entièrement protégé est séparé de la résine.

Lorsque la liaison au support de résine est du type ester benzylique, un clivage est effectué par aminolyse avec une

alkylamine ou une fluoralkylamine pour des peptides à extré-

mité carbonée de proline ou par aminolyse avec par exemple un mélange d'ammoniaque et de méthanol ou d'ammoniaque et d'éthanol pour des peptides à extrémité carbonée de glycine, à une température d'environ 10 à 50 C, de préférence à environ 25 C pendant une période d'environ 12 à 24 heures et de préférence pendant environ 18 heures. A titre de

variante, le peptide peut être enlevé de la résine par trans-

estérification, par exemple au méthanol, puis aminolyse. Le

peptide protégé peut être purifié à ce stade par chromatogra-

phie sur gel de silice. L'élimination du polypeptide des groupes protecteurs en chaîne latérale est effectuée par traitement du produit d'aminolyse, par exemple avec du fluorure d'hydrogène liquide anhydre en présence d'anisole, ou d'un autre accepteur d'ions carbonium, traitement avec le complexe de fluorure d'hydrogène et de pyridine, traitement avec le tris(trifluoracétyl)bore et l'acide trifluoracétique, par réduction avec l'hydrogène et le palladium fixé sur du carbone ou la polyvinylpyrrolidone ou par réduction avec du sodium dans de l'ammoniac liquide, de préférence avec du

fluorure d'hydrogène liquide, et de l'anisole à une tempéra-

ture d'environ -10 à +10 C, de préférence environ 0 C pendant une période d'environ 15 minutes à une heure, de préférence pendant environ 30 minutes. Pour les peptides terminés par la glycine, fixés sur des résines du type benzhydrylamine, les étapes de clivage de la résine et d'élimination du groupe protecteur peuvent être combinées en une seule et même étape utilisant le fluorure d'hydrogène liquide et l'anisole comme décrit ci-dessus. Le polypeptide entièrement débarrassé-des groupes protecteurs est ensuite purifié par une succession d'étapes 'chromatographiques utilisant l'une quelconque ou la totalité des opérations suivantes: échange d'ions sur une

résine simplement basique sous la forme acétate; chromatogra-

phie par adsorption hydrophobe sur polystyrène-divinylbenzène sous une forme non dérivée (par exemple "Amberlite XAD");

chromatographie par adsorption sur gel de silice; chromato-

graphie par échange d'ions sur carboxyméthylcellulose; chromatographie de partage, par exemple sur "Sephadex G-25" ou distribution à contre-courant; chromatographie liquide à haute performance (CLHP), notamment CLHP en phase inversée sur garniture de colonne à phase liée du type octyl- ou octadécylsilyl-silice. Si un amino-acide racémique est utilisé dans la

position 6, les nonapeptides ou décapeptides diastéréoisoméri-

ques obtenus finalement comme produits sont séparés, et le peptide désiré renfermant un D-amino-acide en position 6 est isolé et purifié, de préférence au cours du processus

chromatographique décrit ci-dessus.

La préparation de peptides dont l'extrémité

carbonée est formée d'amides du type azaglycine est de préfé-

rence effectuée par synthèse peptidique classique en solution,

en utilisant des composés intermédiaires peptidiques connus.

Cette préparation est décrite plus en détail dans

l'exemple 3.

Ainsi, selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne un procédé de production de composés de formule: (pyro)Glu-His-V-Ser-W-X-YArg-Pro-Z (I) et de leurs sels acceptables du point de vue pharmaceutique, (formule dans laquelle:

V est un groupe tryptophyle, phénylalanyle ou 3-

(1-naphtyl)-L-alanyle;

* W est un groupe tyrosyle, phénylalanyle ou 3-(1-

pentafluorophényl)-l-alanyle; X est un résidu de D-amino-acide de formule: o

-NH-CH-C-

cil R o R représente: (a) un radical carbocyclique renfermant un groupe aryle choisi dans la classe comprenant les radicaux naphtyle, anthryle, fluorényle, phénanthryle, biphénylyle, benzhydryle et phényle portant trois ou plus de trois substituants alkyliques inférieurs à chatne droite; ou (b) un radical carbocyclique saturé choisi dans la *- classe des radicaux cyclohexyle portant trois ou plus de trois substituants alkyliques inférieurs à chaîne droite et les radicaux perhydronaphtyle, perhydrobiphénylyle, perhydro-2,2-diphénylméthyle et adamantyle; Y est un groupe leucyle, isoleucyle, nor-leucyle ou N-méthyl-leucyle; Z est le glycinamide ou un groupe -NH-R, o R1 est un radical alkyle inférieur, cycloalkyle, fluoralkyle inférieur ou un radical -NH-C-NH-R dans lequel

R2 est un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle infé-

rieur), procédé caractérisé en ce qu'il consiste: (i) à éliminer les groupes protecteurs et, le cas échéant, le support solide lié par covalence d'un polypeptide protégé pour donner un composé de formule (I) ou un sel de ce composé et, le cas échéant (ii) à convertir un composé de formule (I) 30. en un sel acceptable du point de vue pharmaceutique, ou (iii) à convertir un sel d'un composé de formule (I) en un sel acceptable du point de vue pharmaceutique, ou (iv) à décomposer un sel d'un composé de formule (I) en un polypeptide libre

de formule (I).

L'invention est illustrée par les exemples suivants,

donnés à titre non limitatif.

PREPARATION A

On charge 1,52 g de sodium métallique dans un ballon séché au four contenant 0,1 1 d'éthanol absolu (distillé

sur de l'éthylate de magnésium). Lorsque le dégagement d'hy-

drogène a cessé, on ajoute à la solution 10,21 g de 2-acéta-

mido-2-cyanacétate d'éthyle et 13,26 g de 2-bromométhylnaphta-

lène. On chauffe la solution au reflux pendant 1 heure puis on la refroidit. On chasse l'éthanol sous pression réduite et on reprend le résidu dans de l'acétate d'éthyle. On lave la phase organique avec deux portions de 50 ml d'eau, une portion de 50 ml de solution saturée de chlorure de sodium, puis on

la déshydrate sur du sulfate de magnésium. On filtre la solu-

tion, on chasse le solvant sous pression réduite et on hydro-

lyse le résidu dans 100 ml d'acide chlorhydrique concentré au reflux pendant 2 heures. Le mélange hydrolysé est refroidi et le précipité de produit brut est filtré. Le produit brut est redissous dans 0,5 litre d'eau chaude contenant 5 ml d'acide chlorhydrique concentré traité au charbon de bois et le pH de la solution est ajusté à 6 par addition d'hydroxyde d'ammonium concentré. Le précipité est filtré et séché sous vide en donnant il,3 g de 3-(2-naphtyl)-D,L-alanine pure

fondant à 230-232 C.

En répétant le mode opératoire ci-dessus, et en

remplaçant le 2-bromométhylnaphtalène par une quantité stoe-

chiométriquement équivalente de chacun des composés suivants: 1bromométhylnaphtalène, 9-bromométhylanthracène, 9-bromométhylfluorène, 2bromométhylfluorène, 2-bromométhylanthracène, l-bromométhylanthracène, ochlorisodurène, 4-bromométhylbiphényle, 1-bromométhyladamantane, 3bromométhyiphénanthrène, 1-chlorométhyl-2,4,6-tri-(n-butyl)benzène, et 1chlorométhyl-2,3,4,5,6-pentamiéthylbenzène, on obtient les amino-acides suivants: 3-(1-naphtyl)-D,L-alanine fondant à 185-187 C, 3-(9-anthryl)-D, L-alanine fondant à 290 C (chlorhydrate) 3-{9-fluorényl)-D,L-alanine, 3(2-fluorényl)-D,L-alanine, fondant à 264-269 C, 3-(2-anthryl)-D,L-alanine, 3-(1-anthryl)-D,L-alanine, 3-(2,4,6-triméthylphényl)-D,L-alanine fondant à

235-237 C,

3-(4-biphénylyl)-D,L-alanine fondant à 290 C, 3-(1-adamantyl)-D,L-alanine, 3-(3-phénanthryl-D,L-alanine, 3-(2,4,6-tri-(n-butyl)phényl)-D,L-alanine et respectivement 3-(2,3,4,5,6-pentaméthylphényl)-D,L-alanine.

PREPARATION B

On fait refluer pendant deux jours une solution

de 18,2 g de 1,1-diphényléthylène, 25,3 g d'a-méthoxy-N-

benzyloxycarbonylglycinate de méthyle et 1,5 g d'acide 2-

naphtalènesulfonique dans 300 ml de benzène anhydre. On purifie le produit brut sur une colonne d'acide silicique en utilisant un gradient allant du chlorure de méthylène à un mélange de

chlorure de méthylène et d'acétate d'éthyle à 18:1. Le 2-/1-

(2,2-diphényléthylényl)7-N-benzyloxycarbonylglycinate de méthyle purifié est hydrolysé en l'acide correspondant avec une solution de 10,9 g de KOH dans 350 ml de méthanol aqueux

à 10 %. L'acide brut résultant est dissous dans 100 ml d'étha-

nol à 95 contenant 3 ml d'acide chlorhydrique concentré et la solution est hydrogénée en présence de 2 g de palladium à % fixé sur du carbone, pendant 24 heures, ce qui donne

2,4 g de 3-(2,2-diphénylméthyl)-D,L-alanine fondant à 235-237 C.

PREPARATION C

On ajoute 6,23 ml d'anhydride acétique et 60 ml de NaOH 1 M en une demiheure à 0 C0. une solution de 12,9 g de 3-(2-naphtyl-D,L-alanine dans 120 ml de NaOH 1 M. On

ajuste le pH à 2, par addition d'acide chlorhydrique concen-

tré et on filtre le précipité résultant. On fait recristalli-

ser la substance solide dans de l'éthanol aqueux à 60 %, ce

qui donne 12,2 g de N-acétyl-3-(2-naphtyl)-D,L-alanine.

On ajoute 15,8 ml de complexe d'éther de trifluo- rure de bore à une solution de 15 g de ce N-acétylaminoacide dans 240 ml de méthanol anhydre et on fait refluer le mélange pendant une heure. On évapore l'alcool, on ajoute 200 ml d'eau et on extrait la solution à l'acétate d'éthyle. On lave la

phase organique avec une base aqueuse et un acide, on la déshy-

drate sur du sulfate de magnésium, on la filtre et on l'éva-

pore pour obtenir une huile. Par cristallisation de cette huile dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'hexane, on obtient 14,2 g de N-acétyl-3(2-naphtyl)-D,L-alaninate de

méthyle fondant à 79-80 C.

En répétant le mode opératoire ci-dessus et en remplaçant la 3-(2-naphtyl) -D,L-alanine par une quantité stoechiométriquement équivalente de l'un des composés suivants: 3-(1-naphtyl)-D,L-alanine, 3-(2-fluorényl)-D,Lalanine, 3-(2-anthryl)-D,L-alanine, 3-(1-anthryl)-D,L-alaline, et 3-(2;2diphénylméthyl)-D,L-alanine, on obtient respectivement les composés suivants: N-acétyl-3-(1-naphtyl)-D,L-aianinate de méthyle, fondant à 97,598 C, N-acétyl-3-(2-fluorényl)-D,L-alaninate de méthyle, fondant à 170171 C, N-acétyl-3-(2-anthryl)-D,L-alaninate de méthyle,et N-acétyl-3-(2,2diphénylméthyl)-D,L-alaninate de

méthyle fondant à 113-114 C.

PREPARATLON D

On traite avec 33,6 mg de l'enzyme appelé subtili-

sine dans 3 ml de KC1 0,1 M, une solution de 6,6 g de N-acétyl-

3-(2-naphtyl)-D,L-alaninate de méthyle dans un mélange de 300 ml de diméthylsulfoxyde, 120 ml de KC1 1 M et 780 ml d'eau. On maintient le pH à 7 par titrage automatique avec de l'hydroxyde de sodium 0,2 M au moyen d'un appareil "Radiometer" de stabilisation du pH. Au bout de 30 minutes, ml de solution de NaOH ont été absorbés et l'hydrolyse est interrompue. La solution est rendue basique par addition de 12 g de NaHCO3 et elle est extraite à l'acétate d'éthyle.

La phase organique contient du N-acétyl-3-(2-naphtyl)-D-

alaninate de méthyle. Par cristallisation dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'hexane, on obtient une substance

solide jaune fondant à 80-81 C.

On convertit cette substance en amino-acide libre puis en N-Boc aminoacide de la façon suivante:

On chauffe une solution de 2,5 g de N-acétyl-3-

(2-naphtyl)-D-alaninate de méthyle dans 60 ml de HC1 6N à 120-130 pendant 3 heures et on laisse refroidir la solution à la température ambiante. Le précipité blanc qui se forme est recueilli et recristallisé dans 50 ml d'eau contenant 1 ml d'acide chlorhydrique 12 N par neutralisation à pH 6 avec de l'ammoniaque, et il est séché sous vide en donnant 1,2 g de 3-(2-naphtyl)-D-alanine fondant à 242-244 . /--25=

26,6 (c = 0,5, CH3CO2H).

Une solution sous agitation de 3-(2-naphtyl)-D-

alanine dans un mélange de 55 ml de NaOH 1 N, 10 ml d'eau et ml de dioxanne, est traitée avec 1,48 g de dicarbonate de ditertio-butyle et 0, 22 g d'oxyde de magnésium à 0 . Au

bout d'une heure et demie, on ajoute encore 0,3 g de dicar-

bonate de ditertiobutyle et on laisse le mélange se réchauffer à la température ambiante. On sépare la matière par filtration et on concentre le filtrat à 50 ml. On ajuste le pH de cette solution aqueuse à 2,5 par addition de NaHSO4 et on extrait à l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée avec du sulfate acide de sodium à 5 %, de l'eau et une solution saturée de sel. La solution dans l'acétate d'éthyle est déshydratée sur du sulfate de magnésium, filtrée et concentrée en une huile qui est cristallisée dans un mélange d'éther et d'hexane en donnant 1,3 g de NBoc 3-(2-naphtyl)-D-alanine fondant à

-91 . /a 7 25 _ 32,6 (c = 0,8, MeOH).

En répétant le mode opératoire ci-dessus et en remplaçant le N-acétyl-3(2-naphtyl)-D,L-alaninate de méthyle par une quantité stoechiométriquement équivalente de chacun des composés suivants: Nacétyl-3-(1-naphtyl)-D,L-alaninate de méthyle, N-acétyl-3-(2-fluorényl)-D, L-alaninate de méthyle, N-acétyl-3-(2-anthryl)-D,L-alaninate de méthyle, et N-acétyl-3-(2,2-diphénylméthyl)-D,L-alaninate de méthyle, on obtient respectivement les N a-Boc amino-acides suivants, en passant par les amino-acides libres correspondants: N-Boc-3-(1-naphtyl)-D-alanine, fondant à

92-93C; - 25

92-93C; a D = 54,8 (c = 0,5, méthanol), N-Boc-3-(2-fluorényl)-D-alanine, point de fusion 161-163 C (décomposition), N-Boc-3-(2-anthryl)-D-alanine, et N-Boc-3-(2,2-diphénylméthyl)-D-alanine, fondant

à 153-154 C.

PREPARATION E

On charge dans une bouteille d'hydrogénation de Parr 0,85 g de 3-(2naphtyl)-D-alanine, 100 ml d'acide

chlorhydrique 2 M et 0,85 g de catalyseur d'Adam (PtO2).

La solution est maintenue sous pression d'hydrogène gazeux

de 4,2 bars pendant 20 heures dans un appareil d'hydrogéna-

tion de Parr. Le mélange est chauffé pour dissoudre le-pré-

cipité blanc et la solution est filtrée sur de la terre de diatomées. Par concentration de la solution sous pression réduite, suivie d'une lyophilisation pour éliminer l'eau,

on obtient 0,8 g de 3-(2-perhydronaphtyl)-D-alanine sous la.

forme d'une substance solide blanche fondant à 230-232 C.

Cette matière est dissoute dans un mélange de 3,2 ml de NaOH IN, 5 ml d'eau et 15 ml de dioxanne et la solution est traitée avec 0,14 g de MgO et 0,85 g de dicarbonate de di-tertio-butyle. Au bout d'une heure, à 0 C

24 2458538

et de 2 heures à 25 C, la suspension est filtrée, concentrée à sec sous pression réduite, le résidu est dissous dans l'eau, la solution est lavée à l'éther de diéthyle puis elle est acidifiée à pH 2 par addition de NaHSO4. La phase aqueuse acidifiée est extraite trois fois à l'acétate d'éthyle et les extraits sont rassemblés, déshydratés sur du sulfate de magnésium, filtrés et concentrés en donnant 0,75 g de N-Boc-3-(2perhydronaphtyl)-D-alanine sous la forme d'une huile blanche. Une portion de 0,1 g de cette matière est dissoute dans 5 ml de tétrahydrofuranne et la solution est titrée à 0 C avec du diazométhane fraîchement préparé jusqu'à ce que la couleur jaune brillante persiste. Le mélange réactionnel est désactivé avec 1 ml d'acide acétique, le solvant est chassé par évaporation et le résidu est réparti entre 75 ml d'acétate d'éthyle et 75 ml d'eau. La phase organique est lavée avec du bicarbonate de sodium à 5 %, de l'eau, du sulfate acide de sodium à 5 %, de l'eau, une

solution saturée de chlorure de sodium, puis elle est déshy-

dratée sur du sulfate de magnésium. La solution est filtrée, concentrée sous pression réduite et chargée sur une plaque de chromatographie préparative sur couche mince (gel de silice, 750 pm d'épaisseur, 20 x 20 cm). La plaque est développée avec un mélange de dichlorométhane et d'acétate d'éthyle à 18/1 et la bande correspondant au produit est enlevée. Le gel de silice de la bande correspondant au

produit est lavé avec un mélange de dichlorométhane et d'acéta-

te d'éthyle à 9:1 sur un entonnoir à verre fritté et le

filtrat est concentré en donnant 0,1 g de N-Boc-3-(2-

perhydronaphtyl)-D-alaninate de méthyle sous -la forme d'une

huile de couleur jaune clair.

Cette substance et obtenue sous la forme d'un mélange de deux isomères dans la position 2 du noyau de perhydronaphtalène. Ces composés diastéréoisomériques peuvent être séparés sur une colonne de chromatographie en phase liquide à haute performance (gel de silice "Lichrosorb 60", micromètres) en utilisant comme éluant un mélange d'acétate d'éthyle et d'hexane à 1:9, et ils sont hydrolysés en

acide libre, à savoir la N-Boc-3-(2-perhydronaphtyl)-D-

alanine. En répétant le mode opératoire ci-dessus, et en remplaçant la 3(2-naphty>-D-alanine par une quantité

stoechiométriquement équivalente de l'un des composés sui-

vants: 3-(1-naphtyl)-D-alanine, 3-(2,2-diphénylméthyl)-D-alanine, 3-(2,4, 6-triméthylphényl)-D,L-alanine, 3-(4-biphénylyl)-D,L-alanine, 3-(2,4,6tri(n-butyl)phényl)-D,L-alanine, et 3-(2,3,4,5,6-pentaméthylphényl)-D,Lalanine, on obtient respectivement les N-Boc amino-acides suivants: I5 NBoc-3-(1-perhydronaphtyl)-D-alanine, N-Boc-3-(perhydro-2,2-diphénylméthyl) -D-alanine, N-Boc-3-(2,4,6-triméthylcyclohexyl)-D,L-alanine, N-Boc-3(perhydro-4-biphénylyl)-D,L-alanine,

N-Boc-3-(2,4,6-tri-(n-butyl)cyclohexyl)-D,L-

alanine, et

N-Boc-3-(2,3,4,5,6-pentaméthylcyclohexyl)-D,L-

alanine.

EXEMPLE 1

On charge dans. le récipient de réaction d'un synthétiseur de peptide "Beckman 990", 0,8 g (0,8 mmole) de

résine benzhydrylamino-polystyrène-divinylbenzène (Lab.

Systems, Inc.) comme décrit par Rivaille (voir ci-dessus).

Des amino-acides sont ajoutés successivement à cette résine selon le programme de synthèse suivant: Etape 1 lavage au chlorure de méthylène 1 fois 1,5 min 2 50 % de CF3CO2H/CH2C12- 1 fois 1,5 min élimination du groupe protecteur 3 50 % de CF3CO2H/CH2C12 - 1 fois 30 min élimination du groupe protecteur 4 lavage avec CH2C12 3 fois 1,5 min 10 % de triéthylamine/CH2C12 2 fois 1,5 min Etape 6 lavage avec CH2C12 3 fois 1,5 min 7 solution de N -Boc-amino-acide 1 fois addition

8 solution de N,N'-dicyclohexyl-

carbodiimide 1 fois addition 9 rinçage avec CH2C12 1 fois réaction

(à conserver)- de coupla-

couplage ge, 2 h addition du CH2C12 de rinçage 1 fois 1,5 min 11 rinçage au CH2C12 3 fois 1,5 min LO 12 rinçage à l'éthanol 3 fois 1,5 min 13 rinçage au CH2C12 3 fois 1,5 min Les étapes 1 à 13 constituent un cycle de couplage pour un amino-acide et l'accomplissement de la réaction est vérifié par la méthode à la ninhydrine selon E.Kaiser et collaborateurs, "Anal. Biochem.",34, 595 (1970). La résine est couplée successivement avec un excès 2,5 M de chaque amino-acide protégé et le DCC. Ainsi, la résine est traitée pendant les cycles successifs de couplage avec: 0,433 g de Boc-Gly-OH, 0,432 g de Boc-Pro-OH, 0,857 g de Boc-Arg(tosyl)-OH, 0, 462 g de Boc-Leu-OH, 0,504 g de Boc-3-(2-naphtyl)-D-alanine et 0,272 g de 1-hydroxybenzotriazole,

0,724 g de N-Boc,O-2-bromobenzoyloxycarbonyl-

L-tyrosine, 0,59 g de Boc-Ser(benzyl)-OH, 0,608 g de Boc-Trp-OH, 0,654 g de Boc-His(tosyl)-OH, et

0,524 g d'acide pyroglutamique.

La résine est retiree du récipient de réac-

tion, lavée au chlorure de méthylène et séchée sous vide

en donnant 2,0 g de résine portant le polypeptide protégé.

Le produit polypeptidique est en même temps

séparé de la résine et totalement débarrassé du groupe pro-

tecteur par traitement avec du fluorure d'hydrogène liquide anhydre. Un mélange de 2,0 g de résine portant le polypeptide protégé et de 2 ml d'anisole (accepteur) dans un récipient de réaction de type "Kel-F" est traité avec 20 ml de HF liquide anhydrerédistillé,sur CoF3) à O C pendant 30 minutes. Le fluorure d'hydrogène est évaporé sous vide et le résidu de

(pyro)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)-D-alanine-Leu-Arg-

Pro-Gly-NH2, sous la forme de son fluorhydrate, est lavé à l'éther. Le résidu est ensuite extrait à l'acide acétique cristallisable. L'extrait acétique est lyophilisé en donnant

0,8 g de matière brute.

Le polypeptide brut est chargé sur une colonne de "Amberlite XAD-4" de 4 x 40 cm (copolymère de polystyrène et de 4 % de divinylbenzène) et la colonne est éluée avec un gradient concave allant de 0,5 1 d'eau à 1 1 d'éthanol. Les tubes contenant les fractions de volume d'effiuentde 690 ml à 1 470 ml sont rassemblés et évaporés à sec en donnant 490 mg

de polypeptide partiellement purifié.

Un échantillon de 150 mg du produit partiellement purifié est soumis à une chromatographie de partage sur une

colonne de 3 x 50 cm de "Sephadex G-25" en utilisant un sys-

tème de solvants formé de 1-butanol/toluène/acide acétique/ eau, contenant 1,5 % de pyridinedans les proportions de :15:12:18. Les fractions pures sont rassemblées sur la base de la chromatographie sur couche mince (gel de silice; BuOH/ - H20/HOAc/EtOAc; 1:1:1:1) et de la chromatographie en phase liquide à haute performance (5 pm, phase inversée, garniture

octadécylsilylée; 40 % de NH40Ac 0,03 M/60 % d'acétonitrile).

Le produit désiré sort de la colonne dans les fractions allant de 1000 à 1400 ml d'effluent (Rf = 0,1). Les fractions pures sont rassemblées, évaporées à sec, le résidu est repris dans l'eau et la solution est lyophilisée en donnant 57 mg de

pyroglutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2-naphtyll-

D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamide pur sous la forme de son sel d'addition d'acide acétique; /o(_25 _27,4

(c=0,9, HOAc), point de fusion 185-193 C (décomposition).

EXEMPLE 2

Pour la synthèse d'analogues à extrémité carbonZe Pro-NH-CH2CH3, on utilise un programme de synthèse identique à celui qui a été décrit dans l'exemple 1. Le récipient de réaction du synthétiseur "Beckman 990" est chargé avec 2,13 g de Boc-Pro-O-résine, préparée par réaction de proportions équimolaires du sel de césium anhydre de Boc-Pro-OH avec une résine chlorométhyl-polystyrène/divinyl-

benzène (1 %) (Lab.Systems, Inc.). La quantité de Boc-Pro-

O-résine utilisée contient 1,4 mmole de proline.

La résine est couplée successivement avec un excès 2,5 M de chaque aminoacide protégé et de DCC. Ainsi, la résine est amenée à réagir au cours des cycles successifs de couplage avec: 1,61 g de Boc-Arg (tosyl)-OH 0,93 g de Boc-Leu-OH / H20 0,94 g de Boc-3-(2-naphtyl)-D-alanine et 0,49 g de 1-hydroxybenzotriazole

1,75 g de N-Boc-O-2-bromobenzyloxycarbonyl-L-

tyrosine et 1,11 g de Boc-Ser(benzyl)-OH.

A ce stade de la synthèse, la quantité de résine portant le polypeptide protégé est divisée en deux et une moitié est soumise à un traitement final par réaction avec, successivement: 0,57 g de Boc-Trp-OH -0,77 g de Boc-His(tosyl)-OH, et

0,21 g d'acide pyroglutamique.

La résine est retirée du récipient de réaction, lavée au chlorure de méthylène et séchée sous vide en donnant

2,26 g de résine portant le polypeptide protégé.

Le polypeptide protégé est clivé de la résine

par aminolyse avec 25 ml d'éthylamine pendant 18 heures à 2 C.

On laisse l'éthylamine s'évaporer et on extrait la résine au

méthanol. Le méthanol est évaporé en donnant 1,39 g de pyro-

Glu-His(tosyl)-Trp-Ser(Benzyl)-Tyr(2-bromobenzyloxycarbonyl)-

3-(2-naphtyl)-D-alanyl-Leu-Arg(tosyl)-Pro-NH-CH2CH3. Le polypeptide brut est débarrassé des groupes protecteurs par traitement avec un mélange de 3 ml d'anisole et 30 mil de HF liquide anhydre redistillé (sur COF3) à 0 C

pendant 30 minutes dans un récipient de réaction "Kel-F".

Le fluorure d'hydrogène est évaporé sous vide et le résidu est lavé à l'éther. Il est ensuite dissous dans de l'acide acétique 2 M et la solution est lyophilisée en donnant 0,82 g de pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3(2-naphtyl)-D-alanine-Leu-Arg- Pro-NH-CH2CH3 brut sous la forme de son seld'addition d'acide acétique. La purification finale est effectuée par

chromatographie préparative en phase liquide à haute perfor-

mance d'un échantillon de 20 g sur une colonne de 0,9 x 550mm de silice octadécylsilylée en particules de 40 à 50 pm (Merck, "Lichroprep C18"). L'éluant consiste en un mélange de 64 % de NH40Ac 0,03 M et de 36 % d'acétonitrile. On

purifie en quatre essais un total de 61 mg de matière brute.

Apres trois lyophilisations dans l'eau, on obtient 15 mg

d'éthylamide de pyroglutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-

tyrosyl-3-(2-naphtyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-proline pur sous la forme de son sel d'addition d'acide acétique, fondant -25

à 180-190 C; = -57,2 (c = 1,1, HoAc).

En répétant le clivage ci-dessus et en rem-

plaçant l'éthylamine par une quantité stoechiométrique des composés suivants: n-butylamine, cyclopropylamine, cyclohexylamine, trifluorométhylamine, pentafluoréthylamine, et 2,2,2-trifluoréthylamine, on obtient le n-butylamidet le cyclopropylamide, le cyclohexylamide, le trifluorométhylamide, le pentafluoréthylamide, et le 2,2,2trifluoréthylamide

correspondants du nonapeptide mentionné ci-dessus.

EXEMPLE 3

Des composés de formule (I) dans laquelle Z O est un groupe -NH-CNH-R peuvent être préparés par synthèse

classique en solution.

2458538

Par exemple, on peut utiliser l'approche suivante, dans laquelle "AzaGlyNH2"1 désigne le-groupe o0

NH-NH-C-NH2:

(pyro)Glu-His-Trp-Ser- Cbz-Leu-Arg-Pro-AzaGlyNH Tyr-OMe NO2 (1) t (2) (2)

Boc-3-(2-naphtyl)-D-Ala-

Leu-Arg-Pro-AzaGlyNH 2

+1 2

H+

]ôyro)Giu-.is-Trp-

Ser-Tyr-N3 A

H-3-(2-naphtyl) -D-Ala-

Leu-Arg-Pro-AzaGl-NH2 (3)

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-nazhtyl) -D-

Ala-Leu-Arg-Pro-Aza-Gly-NHà2

sous la forme du peptide libre ou du sel.

Le couplage des fragments individuels peut être effectué par le procédé à l'azide d'acyle (J. Honzel et collaborateurs "Coll. Czech. Chem. Comm.", 26, 2333 (1971)), par couplage DCC/HBT ou par d'autres techniques de couplage de fragments libres par racémisation. Les composés

(1) et (2) sont connus (M. Fujino et collaborateurs, "Biochem.

Biophys. Res. Comm." 57, 1248 (1974) et A.S. Dutta et colla-

borateurs, "J. Chem. Soc. Perkin I", 1979, 379, respectivement).

Le composé (3) est préparé à partir du composé (2) par élimi-

nation des groupes Cbz et nitro par hydrogénolyse, suivie

d'un couplage avec la N-Boc-3-(2-naphtyl)-D-alanine en utili-

sant DCC/HBT ou un autre agent de couplage connu dans la pratique. (voir Dutta et collaborateurs, ci-dessus, pour une

synthèse similaire d'analogues de l'hormone HHT).

De même, en utilisant d'autres amino-acides à la place de la N-Boc-3-(2naphtyl)-D-alanine, on peut préparer d'autres composés de formule I, par exemple:

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)-D-

ala-N-méthyl-Leu-Arg-Pro-AzaGlyNH2 et

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-triméthyl-

phényl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-AzaGlyNH2. De même, dans la prépa-

ration du composé (2), en utilisant un composé AzaGly-NH-

alkyle inférieur à la place du composé Aza-Gly-NH2, on

obtient le peptide correspondant à terminaison AzaGly-NH-

alkyle inférieur, par exemple:

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)-D-Ala-

Leu-Arg-Pro-Azagly-Et,

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)-D-Ala-

N-méthyl-Leu-Arg-Pro-Azagly-Et, et

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-triméthyl-

phényl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-AzaGly-Et.

EXEMPLE 4

En répétant le mode opératoire de l'exemple 1 et en utilisant un D-aminoacide. ou un D,L amino-acide en position 6 (dans ce dernier cas enséparant les peptides

diastéréoisomériques pendant la chromatographie), en rempla-

çant les aminoaèides convenablement choisis dans la séquence

de la synthèse en phase solide, on peut obtenir les décapepti-

des suivants qui sont isolés et caractérisés sous la forme de leurs sels d'addition d'acide acétique:

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-tyrosyl-

3-(2-naphtyl)D-alanyl-N-miéthylleucyl-arginyl-prolyl-glycin-

amide, / -.25 = -26,6 (c = 1, HOAc);

pyro-glutamyl-histidyl-phénylalanyl-séryl-

tyrosyl-3-(2-naphtyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycina-

mide;

pyro-glutamyl-histidyl-3-(1-naphtyl)-L-alanyl-

séryl-tyrosyl-3-(2-naphtyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-

glycinamide;

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-phényl-

alanyl-3-(2-naphtyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamide;

pyro-glutamyi-histidyl-tryptophyl-séryl-3-(1-

pertafluorophényl)-L-alanyl-3-(2-naphtyl)-D-alanyl-leucyl-

arginyl-propyl-glycinamide;

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryvi-tyrosyl-3-(1-

naphtyl)-D-alanyl-leucyl-arginyi-prolyl-glycinamiade,fondant à 173-50C, [a]5 -28.1 (C=0,8, HOAc); pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryltvyrosyl-3-(2- anthryl)-D-alanyl-leucyl-arginyi-prolyl-glycinamide;

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2-

fluorenyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamide, !"] 5 -25,8 (C=1, HOAc);

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-tyrosyl-3-(3-

phenanthryl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-proiyl-glycinamide;

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-

(4-biphenylyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinamide, [a]5 -35,7 (C=1, HOAc);

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-tyrosyl-3-

(2,2-diphénylméthyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-

glycinamide;

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-tyrosyl-3-(1-

adamantyl)-D-alanyl-leUcyl-arginyl-prolyl-giycinamide;

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-tyrosyl-3-

(2,4,6-triméthylphenyl)-D-alanyl-leucyl-arginyi-prolyl-

glycinamide, [a]5 -42,1 (C=1, HOAc);

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-tyrosyl-3-

[2,4,6-tri-(n-butyl)phénylj-D-alanyl-leucyl-arginyl-

prolyl-glycinamide;

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-

(2,3,4,5,6-pentamethylphényl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-

prolyl-glycinamide;

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryvl-trosyl-3-

(2,4,6-trimethylcyclohexyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-

prolyl-glycinamide;

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-servl-tyrosyl-3-

[2,4,6-tri(n-butyl)cyclohexyl]-D-alanyl-leucyl-arginyl-

prolyl-glycinamide;

* pyro-glutamnvl-histidyl-tryptophyl-seryvl-yrosy!-3-

(perhydro-l-naphtyl)-D-alanyl-!eucyl-arginyl-prolyi-

glycinamide;

pyro-glutamvl-histidyl-tryvDtophyl-séryl-tyrosyl-3-

(perhydro-2-naphtyl)-D-alanyl-ieucyl-arginyl-proiyl-

glycinamide;

pyro-glutamyi-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-

(4-perhydrobiphénylyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-prolyl-

glycinamide;

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-

(perhydro-2,2-diphenylméthyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-

prolyl-glycinamide;

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-tyrosyl-3-(2-

naphtyl)-D-alanyl-isoleucyl-arginyl-prolyl-glycinamide; et

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-seryl-tyrosyl-3-(2-

naphtyl)-D-alanyl-norleucyl-arginyl-prolyl-glycinamide.

EXEMPLE 5

En répétant le mode opératoire de l'exemple 2 et en utilisant un D-aminoacide ou un D,L-ami.no-acide en position 6 (en séparant dans ce dernier cas les peptides diastéréoisomériques au cours de la chromatographie), en choisissant les amino-acides convenables dans la séquence de synthèse en phase solide, on peut obtenir les nonapeptides suivants qui sont isolés et caractérisés sous la forme de leurs sels d'addition d'acide acétique:

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-

tyrosyl-3-(1-naphtyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-proline sous la

forme de son éthylamide, n-butylamide, cyclopropylamide., cy-

clohexylamide, trifluorométhylamide, pentafluoréthylamide et 2,2,2trifluoréthylamide,

pyro-glutamyl-histidyl-phénylalanyl-séryl-

tyrosyl-3-(2-naphtyl-D-alanyl-leucyl-arginyl-proline sous -25 la forme de son éthylamide fondant à 180-190 C, /-a -

= -57,2 (C=l, HOAc 10 %), de son n-butylamide, cyclopropyl-

amide, cyclohexylamide, trifluorométhylamide, pentafluoréthyl-

amide et 2,2,2-trifluoréthylamide,

34 2458538

pyro-glutamyl-histidyl-3-(1-naphtyl)-L-alanyl-

séryl-tyrosyl-3-(2-naphtyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-proline25 sous la forme de son éthylamide fondant à 160-170 C, / a_/ D -45,3 (c=l, HOAc), de son n-butylamide, cyclopropylamide, cyclohexylamide, trifluorométhylamide, pentafluoréthylamide et 2,2,2-trifluoréthylamide,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-phényl-

alanyl-3-(2-naphtyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-proline sous la forme de son éthylamide, n-butylamide, cyclopropylamide, cyclohexylamide, trifluorométhylamide, pentafluoréthylamide et 2,2,2-trifluoréthylamide,

pyro-glutamide-histidyl-tryptophyl-séryl-3-

(1-pentafluorophényl-L-alanyl-3-(2-naphtyl)-D-alanyl-leucyl-

arginyl-proline sous la forme de son éthylamide, n-butylamide, cyclopropylamide, cyclohexylamide, trifluorométhylamide, pentafluoréthylamide et 2,2,2-trifluoréthylamide,

pyro-glutamide-histidyl-tryptophyl-séryl-

tyrosyl-3-(1-anthryl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-proline sous la forme de son éthylamide, n-butylamide, cyclopropylamide, cyclohexylamide, trifluorométhylamide, pentafluoréthylamide et 2,2,2-trifluoréthylamide,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-tyrosyl-

3-(2-fluorényl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-proline sous la forme

de son éthylamide,n-butylamide, cyclopropylamide, cyclohexyl-

amide, trifluorométhylamide, pentafluoréthylamide et 2,2,2-

trifluoréthylamide,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-tyrosyl-

3-(3-phénanthryl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-proline sous la forme

de son éthylamide, n-butylamide, cyclopropylamide, cyclohexyl-

amide, trifluorométhylamide, pentafluoréthylamide et 2,2,2-

trifluoréthylamide,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-tyrosyl-

3-(4-biphénylyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-proline sous la forme

de son éthylamide, n-butylamide, cyclopropylamide, cyclohexyl-

amide, trifluorométhylamide, pentafluoréthylamide et 2,2,2-

trifluoréthylamide,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-tyrosyl-

3-(2,2-diphénylméthyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-proline sous la

- - 25 37

forme de son éthylamide fondant à 176-206 C, a7 D 33,70 (C = 1, HOAc 10 %) et de son n-butylamide, cyclopropylamide, cyclohexylamide, trifluorométhylamide, pentafluoréthylamide et 2,2,2-trifluoréthylamide,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-tyrosyl-

3-(1-adamantyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-proline sous la forme

de son éthylamide, n-butylamide, cyclopropylamide, cyclohexyl-

amide, trifluorométhylamide, pentafluoréthylamide, et 2,2,2-

trifluoréthylamide,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-tyro-

syl-3-(2,4,6-triméthylphényl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-proline

sous la forme de son éthylamide, n-butylamide, cyclopropyl-

amide, cyclohexylamide, trifluorométhylamide, pentafluoréthyl-

amide et 2,2,2-trifluoréthylamide,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-tyrosyl-

/2,4,6-tri-(n-butyl)phényl7-D-alanyl-leucyl-arginyl-proline

sous la forme de son éthylamide, n-butylamide, cyclopropyl-

amide, cyclohexylamide, trifluorométhylamide, pentafluor-

éthylamide et 2,2,2-trifluoréthylamide,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-

tyrosyl-3-(2,3,4,5,6-pentaméthylphényl)-D-alanyl-leucyl-

arginyl-proline sous la forme de son éthylamide, n-butyl-

amide, cyclopropylamide, cyclohexylamide, trifluorométhylamide, pentafluoréthylamide et 2,2,2-trifluoréthylamide,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-

tyrosyl-3-(2,4,6-triméthylcyclohexyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-

proline sous la forme de son éthylamide, n-butylamide, cyclo-

propylamide, cyclohexylamide, trifluoromnéthylamide, pentafluor-

éthylémide et 2,2,2-trifluoréthylamide,

pyro-glutanyl-histidyl-tryptophyl-séryl-

tyrosyl-/2,4,6-tri-(n-butyl) cyclohexyl7-D-alanyl-leucyl-arginyl-

proline, sous la forme de son éthylamide, n-butylamide, cyclo-

propylamide, cyclohexylamide, trifluorométhylamide, penta-

fluoréthylamide et 2,2,2-trifluoréthylamide,

3 6 2458538

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-

tyrosyl-3-(perhydro-1-naphtyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-proline

sous la forme de son éthylamide, n-butylamide, cyclopropyl-

amide, cyclohexylamide, trifluorométhylamide, pentafluor-

éthylamide, et 2,2,2-trifluoréthylamide,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-tyrosyl-

3-(perhydro-2-naphtyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-proline sous la forme de son éthylamide,n-butylamide, cyclopropylamide, cyclohexylamide, trifluorométhylamide, pentafluoréthylamide, et 2,2,2-trifluoréthylamide,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-tyrosyl-

3-(4-perhydrobiphénylyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-proline sous la forme de son éthylamide, n-butylamide, cyclopropylamide, cyclohexylamide, trifluorométhylamide, pentafluoréthylamide et 2,2,2-trifluoréthylamide,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-tyrosyl-

3-(perhydro-2,2-diphénylméthyl)-D-alanyl-leucyl-arginyl-

proline sous la forme de son éthylamide, n-butylamide, cyclo-

propylamide, cyclohexylamide, trifluorométhylamide, penta-

fluoréthylamide et 2,2,2-trifluoréthylamide,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-

tyrosyl-3-(2-naphtyl)-D-alanyl-N-méthylleucyl-arginyl-proline --25 sous la forme de son éthylamide, fondant à 170-185 C, / -7_5

-81,1 (C=0,7, HOAc à 10 %), de son n-butylamide, cyclo-

propylamide, cyclohexylamide, trifluorométhylamide, penta-

fluoréthylamide et 2,2,2-trifluoréthylamide,

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-tyrosyl-

3-(2-naphtyl)-D-alanyl-isoleucyl-arginyl-proline sous la forme

de son éthylamide, n-butylamide, cyclopropylamide, cyclohexyl-

amide, trifluorométhylamide, pentafluoréthylamide et 2,2,2-

trifluoréthylamide, et

pyro-glutamyl-histidyl-tryptophyl-séryl-

tyrosyl-3--(2-naphtyl)-D-alanyl-norleucyl-arginyl-proline sous la forme de son éthylamide, n-butylamide, cyclopropylamide, cyclohexylamide, trifluorométhylamide, pentafluoréthylamide

et 2,2,2-trifluoréthylamide.

EXEMPLE 6

A. On dissout 0,1 g du fluorhydrate de (pyro) Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2naphtyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (voir exemple 1) dans 50 ml d'eau et on fait passer la solution sur une colonne de 50 g de résine d'échange anionique "Dowex 3" qui a été préalablement équilibrée avec de l'acide acétique et lavée à l'eau désionisée. On élue la colonne à l'eau désionisée et on lyophilise l'effluent pour obtenir

le sel d'acide acétique correspondant de (pyro)Glu-His-Trp-

- -25 Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, / / D25

-27,5 (c = 0,9, HOAc).

En répétant le mode opératoire ci-dessus et en remplaçant l'acide acétique par d'autres acides au cours de l'équilibrage de la résine, on peut obtenir par exemple les sels correspondants de l'acide chlorhydrique, de l'acide bromhydrique, de l'acide sulfurique, de l'acide phosphorique, de l'acide nitrique, de l'acide benzo-que, etc. De même, on peut préparer des sels d'addition d'acides d'autres composés de formule I. B. Dans le cas de sels de faible solubilité dans l'eau, on peut préparer ces sels par précipitation dans l'eau en utilisant l'acide désiré. Par exemple: sel de zinc de l'acide tannique - une solution

de 10 mg de sel d'acide acétique de (pyro)Glu-His-Trp-Ser-

Tyr-3-(2-naphtyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 dans 0,1 ml d'eau est traitée avec une solution de 10 mg d'acide tannique dans 0,08 ml de NaOH 0,25 M. Une solution de 5 mg de ZnSO4 heptahydraté dans 0,1 ml d'eau est immédiatement ajoutée à la

solution de l'analogue de HHT.

La suspension résultante est diluée avec 1 ml d'eau et le précipité est centrifugé. La liqueur surnageante est versée par décantation et le résidu est lavé deux fois

avec des portions de 1 ml d'eau par centrifugation du préci-

pité et décantation de la liqueur surnageante. Le précipité est séché sous vide en donnant 15 mg du tannate de zinc

mixte de l'analogue de HHT mentionné ci-dessus.

Sel d'acide pamoique - On ajoute une solution de 11 mg d'acide pamoique dans 0,3 ml d'hydroxyde de sodium 0,25 M à une solution de 50 mg de sel d'acide acétique de

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tr-3-(2-naphtyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-

NH2 dans un mélange de 1,6 ml d'éthanol et de 0,1 ml de NaOH 0,25 M. On chasse les solvants sous pression réduite et on met le résidu en suspension dans 2 ml d'eau, on centrifuge

la suspension et on verse la liqueur surnageante par décan-

tation. On lave le précipité avec 1,5 ml d'eau, on le

centrifuge et on verse la liqueur surnageante par décanta-

tion.-On sèche le précipité sous vide pour obtenir 54 mg

du sel d'acide pamoique de l'analogue de HHT mentionné ci-

dessus. On peut préparer d'une façon similaire d'autres

sels de faible solubilité dans l'eau.

C. Préparation d'un sel d'addition d'acide

à partir du peptide libre.

On ajoute 30 ml d'acide acétique 1N à une solu-

tion de 50 mg de (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)-D-

Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 sous la forme de la base libre. La solution résultante est lyophilisée en donnant 50 mg du sel

d'acide acétique de l'analogue de HHT mentionné ci-dessus.

En procédant de façon similaire et en remplaçant

l'acide acétique par d'autres acides (en quantités stoechiomé-

triquement équivalentes par rapport au peptide), on obtient d'autres sels d'addition d'acides de composés de formule (I),

par exemple les sels d'acide chlorhydrique, d'acide bromhydri-

qued'acide sulfur.ique, d'acide phosphorique et d'acide nitrique.

D. Préparation d'un sel avec un cation métal-

lique, par exemple le sel de zinc.

On ajoute une solution de 15 mg de ZnSO4 heptahydraté dans 0,2 ml d'eau à une solution de 50 mg de

sel d'acide acétique de (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-

naphtyl)-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 dans un mélange de 0,4 ml

de NaOH 0,25 M, 0,3 ml d'eau et 1 ml d'éthanol. On centri-

fuge le précipité et on verse la liqueur surnageante par décantation. On lave le précipité avec un millilitre d'eau

par centrifugation et décantation de la liqueur surnageante.

On sèche le précipité sous vide pour obtenir 48 mg du sel

de zinc de l'analogue de HHT mentionné ci-dessus.

On peut préparer de manière similaire des sels d'autres cations multivalents, par exemple calcium, bismuth, baryum, magnésium, aluminium, cuivre, cobalt, nickel, cadmium, etc.

EXEMPLE 7

On fait passer une solution de 50 mg du sel

d'acide acétique de (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)-

D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 dans 25 ml d'eau sur une colonne de 50 g de "Dowex 1" (résine fortement basique d'échange

anionique sous la forme ammonium quaternaire) qui a été équi-

librée avec une solution d'hydroxyde de sodium pour former l'hydroxyde de l'ion opposé. La colonne est éluée avec 150 ml

d'eau et l'éluant est lyophilisé en donnant 45 mg du polypep-

tide correspondant sous la forme de la base libre.

De même, d'autres sels d'addition de composés de formule I, par exemple ceux qui sont mentionnés dans l'exemple 6, peuvent être convertis en les bases libres correspondantes.

EXEMPLE 8

On donne ci-après des exemples représentatifs de compositions pharmaceutiques contenant, comme ingrédient actif, un analogue de HHT de la présente invention, par

exemple le composé (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)-

D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, sous sa forme propre ou sous la forme d'un sel acceptable du point de vue pharmaceutique., par exemple le sel d'addition d'acide acétique, le sel de zinc, le sel de zinc de l'acide tannique, etc.

A. Formulations en comprimés pour l'adminis-

tration buccale (par exemple sublinguale).

1. Analogue de HHT 50,0 pg Sucre compressible, USP 96,0 mg Stéarate de calcium 4,0 mg 2. Analogue de HHT 30,0 vg Sucre compressible, USP 98,5 mg Stéarate de magnésium 1,5 mg 3. Analogue de HHT 25,0 pg mannitol, USP 88, 5 mg stéarate de magnésium,USP 1,5 mg amidon prégélatinisé, USP 10,0 mg 4. Analogue de HHT 200,0 pg lactose, USP 83,3 mg Amidon prégélatinisé, USP 15,0 mg stéarate de magnésium, USP 1,5 mg Méthode de préparation a. On dissout l'analogue de HHT dans de l'eau, en quantité suffisante pour former des granulés humides par mélange avec le sucre entrant dans la composition des excipients. Après mélange total, les granulés sont séchés

dans un plateau ou dans un appareil de séchage à lit fluidisé.

Les granulés secs sont ensuite tamisés de manière à rompre tous les gros blocs formés, puis ils sont mélangés avec les composants restants. Les granulés sont ensuite pressés sur une pastilleuse classique en comprimés correspondant au

poids unitaire choisi.

b. Dans cette méthode de préparation, toutes les formula-

tions doivent contenir 0,01 % de gélatine USP. La gélatine doit tout d'abord être dissoute dans le solvant aqueux de granulation, l'analogue de HHT étant dissous ensuite. Les

étapes restantes sont les mêmes qu'en (a) ci-dessus.

La formulation 4 pourrait aussi être utilisée sous

forme de comprimés,en vue de l'administration orale.

B. Formulation injectable par voie intramus-

culaire, à longue durée d'action.

1. Gel à l'huile de sésame injectable par voie intramus-

culaire, à longue durée d'action Analogue de HHT 1,0 mg monostéarate d'aluminium, USP 20,0 mg huile de sésame, quantité suffisante pour 1,0 ml Le monostéarate d'aluminium est mélangé avec l'huile de sésame et le mélange est chauffé à 125 C sous

agitation jusqu'à ce qu'une solution jaune clair se forme.

On stérilise ensuite ce mélange par autoclavage et on le lais-

se refroidir. L'analogue de HHT est ensuite ajouté dans des conditions aseptiques, par trituration. Des analogues de HHT particulièrement appréciés sont des sels de faible solubilité,

par exemple des sels de zinc, des sels de zinc d'acide tanni-

que, des sels d'acide pamoique, etc. Ces sels ont une durée

d'activité extrêmement longue.

2. Microcapsules en polymère biodégradable, injec-

tables par voie intramusculaire, à longue durée d'action Analogue de HHT 1 % Copolymère glycolide /lactide à 25/75 (viscosité intrinsèque

0,5) 99 %

Microcapsules (0-150 pm) de la formulation ci-

dessus en suspension dans le milieu suivant: dextrose 5,0 % sel de sodium de la carboxyméthylcellulose 0,5 % alcool benzylique 0,9 % "Tween 80" 0,1 %

eau purifiée, quantité suffi-

sante pour 100,0 % On met en suspension 25 mg de microcapsules dans

1,0 ml de véhicule.

C. Solution aqueuse pour l'injection intramusculaire Analogue de HHT 25 mg Gélatine, non antigénique 5 mg Eau pour injectables, quantité suffisante pour 100 ml On dissout la gélatine et l'analogue de HHT dans l'eau pour injectables puis on stérilise la solution par

filtration.

D. Solution aqueuse pour l'administration nasale Analogue de HHT 250 mg Dextrose 5 g alcool benzylique 0,9 g eau purifiée, quantité suffisante pour 100 ml On dissout l'analogue de HHT, le dextrose et l'alcool benzylique dans de l'eau purifiée et on complète

au volume désiré par addition d'eau.

E. Formulation pour l'administration rectale

Véhicule pour suppositoire en vue de l'ad-

ministration rectale Analogue de HHT 500 lig "Witepsol H15" 20,0 g L'analogue de HHT est mélangé avec le "Witepsol H15" fondu, le mélange est homogénéisé puis il est versé dans des moules pour suppositoires de 2 g.-_

-EXEMPLE 9

Suppression de l'oestrus chez le rat Mode opératoire: Des femelles de rats (Hilltop, Sprague Dawley, d'environ 200 g, dont les vagins ont été ouverts) sont groupés par poids à raison de 5 par cage et de deux cagespar groupe. Les rats reçoivent des injections sous-cutanées deux fois par jour (sauf dans les cas indiqués

ci-dessous), pendant 14 jours. Des frottis vaginaux quoti-

diens sont effectués pour déterminer le stade du cycle oestral

et les poids corporels sont notés après 0, 1 et 2 semaines.

Le pourcentage de femelles présentant une suppression par-

tielle de l'oestrus (c'est-à-dire avec seulement le diocctrus et le prooestrus, mais sans oestrus) à partir du

4e jour et le pourcentage de femelles présentant une suppres-

sion totale de l'oestrus (c'est-à-dire avec seulement le dioestrus) à partir du quatrième jour sont notés. Les doses DE50 sont calculées d'après la droite la mieux adaptée des pourcentages de suppression de l'oestrus. Les analogues de HHT sont administrés sous la forme de leurs sels d'acide acétique dans une solution physiologique de sels contenant 0, 1 % de sérum-albumine de boeuf. Le volume d'injection est de 0,2 ml et l'analogue est présent en quantité de 0,05, 0,1, 0,2 ou 0,4 pg. Un témoin (solution plysiologique de sel contenant de la sérum albumine de boeuf) ne présente

aucune suppression de l'oestrus.

Les doses DE50 pour la suppression combinée partielle et totale de l'oestrus sont les suivantes: Composé

(pg/injec-

|: _ -

(pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)- 0,08 Ln D-alanyl-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)- 0,22 D-alanyl-Leu-Arg-ProNHEt (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)- 0;07 D-alanyl-N-MeLeu-ArgPro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)- 0,12 D-alanvl-NMeLeu-Arg-Pro-NHEt (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6- 0 08

triméthylphényl)-D-alanyil-Leu-

Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(l-naphtyl)- 0j3 D-alanyl-LeuArg-Pro-Gly-NH (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(9-anthryl)- 0;27 D-alanyl-LeuArg-Pro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(4- 028a Il /

biphenylyl)-D-alanyl-Leu-Arg-

Pro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-fluorényl)- O 40a D-alanyl-LeuArg-Pro-Gly-NH2 (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,2-diph'nyl- 0,11 methyl-Dalanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NHEt (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6- 0 35a

trimethylphényl)-D-alanyl-N-MeLeu-

Arg-Pro-Gly-NH2 (pyro)-Glu-His-3-(1-naphtyl) -L-alanyl- 016

Ser-Tyr-3-(2-naphtyl) -D-alanyl-

Leu-Arg-Pro-NHEt a) Pour ces composés l'administration n'est effectuée qu'une

-. pa: jour.

EXEMPLE 10

On injecte par voie sous-cutanée à six souris Swiss-Webster (Simonsen) pesant chacune environ 25g, 0,25 ml

d'une solution aqueuse de (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-

naphtyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 sous la forme de son sel d'acide acétique. La dose est de 40 mg/kg ou d'environ 1 mg par souris. Les souris sont observées deux fois par

jour pendant 21 jours, pour déceler des cas de mortalité.

Aucun effet léthal n'est observé. La dose DL50 est donc

i0 supérieure à 40 mg/kg.

Claims (9)

REVENDICATIONS

1. Un composé de formule: (pyro)Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Arg-Pro-Z (I) (ou un sel composé), V W X acceptable du point de vue pharmaceutique de ce formule dans laquelle

est un groupe tryptophyle, phénylalanyle ou 3-(1-

naphtyl)-L-alanyle;

est un groupe tyrosyle, phénylalanyle ou 3-(1-penta-

fluorophényl)-L-alanyle; est un résidu de D-amino-acide de formule: Il

-NH-CH-C-

RH2 R dans laquelle R représente

(a) un radical contenant un groupe aryle carbocy-

clique, choisi entre les radicaux naphtyle, anthryle, fluo-

rényle, phénanthryle, biphénylyle, benzhydryle et phényle portant trois ou plus de trois substituants alkyliques inférieurs à chaîne droite; ou (b) un radical carbocyclique saturé choisi entre un radical cyclohexyle portant trois-ou plus de trois substituants

alkyliques inférieurs à chaîne droite, un groupe perhydro-

naphtyle, perhydrobiphénylyle, perhydro-2,2-diphénylméthyle ou adamantyle; Y est un groupe leucyle, isoleucyle, nor-leucyle ou N-méthyl-leucyle; Z représente le glycinamide ou un groupe -NH-R1, o R1 est un radical alkye inférieur, cycloalkyle, f2 2 fluoralkyle inférieur ou -NH-d-NH-R, R étant un atome

d'hydrogène ou un radical alkyle inférieur.

2. Composé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que V est un groupe tryptophyle ou phénylalanyle;

W est un groupe tyrosyle; X est un groupe 3-(2-naphtyl)-D-

alanyleou 3-(2,4,6-triméthylphényl)-D-alanyle; Y est un groupe leucyle ou N-méthyl-leucyle; et Z est le glycinamide

ou un groupe -NHEt.

3. Composé suivant la revendication 2, caractérisé

en ce que X est un groupe 3-(2-naphtyl)-D-alanyle.

4. Le composé (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-

naphtyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 ou un sel acceptable du point de vue pharmaceutique de ce composé suivant la

revendication 2.

5. Le composé (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-

naphtyl)-D-alanyl-N-méthyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, (pyro)Glu-

His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-NHEt,

(pyro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)-D-alanyl-N-méthyl-

Leu-Arg-Pro-NHEt ou (pyro)Glu-His-Phe-Ser-Tyr-3-(2-naphtyl)-

D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 ou un sel acceptable du point

de vue pharmaceutique de ce composé suivant la revendica-

tion 3.

6. Composé suivant la revendication 2, caractérisé

en ce que X est un groupe 3-(2,4,6-triméthylphényl)-D-alanyle.

7. Le composé (pyro)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-3-(2,4,6-

triméthylphényl)-D-alanyl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 ou un sel acceptable du point de vue pharmaceutique de ce composé,

suivant la revendication 6.

8. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle renferme un composé de formule: (pyro)Glu-His-V-Ser-W-X-Y-Arg-Pro-Z (I) ou un sel acceptable du point de vue pharmaceutique de ce composé (formule dans laquelle:

V est un groupe tryptophyle, phénylalanyle ou 3-

(1-naphtyl)-L-alanyle;

W est un groupe tyrosyle, phénylalanyle ou 3-(1-

pentafluorophényl)-L-alanyle; X est un résidu de D-amino-acide de formule: o Il

-NH-CH-C-

i H2 R dans laquelle R représente

a) un radical contenant un groupe aryle carbocycli-

que, choisi entre les radicaux naphtyle, anthryle, fluorényle, phénanthryle, biphénylyle, benzhydryle

et phényle portant trois ou plus de trois subs-

tituants alkyliques inférieurs à chatne droite; ou b) un radical carbocyclique saturé choisi entre un radical cyclohexyle portant trols ou plusde'trois substituants alkyliques inferieurs à chaîne droite, un groupe perhydronaphtyle, perhydrobiphénylyle, perhydro-2,2- diphénylméthyle ou adamantyle; Y est un groupe leucyle, isoleucyle, nor- leucyle ou N-méthyl-leucyle; Z représente le glycinamide ou un groupe -NH- R1, o R1 est un radical alkyle inférieur, cycloalkyle, O

2

fluoralkyle inférieur ou -NH-C-NH-R, R étant un atome d'hydrogène ou un radical alkyle inférieur, en mélange avec un support non toxique

acceptable du point de vue pharmaceutique.

9. Procédé de production d'un composé de formule: (pyro)Glu-His-V-Ser-W-XY-Arg-Pro-Z (I) et de ses sels acceptables du point de vue pharmaceutique (formule dans laquelle

V est un groupe tryptophyle, phénylalanyle ou 3-

(1-naphtyl)-L-alanyle; W est un groupe tyrosyle, phénylalanyle ou 3-(1pentafluorophényl)-L-alanyle X est un résidu de D-amino-acide de formule: I

-NH-CH-C-

-H2 R dans laquelle R représente a) un radical contenant un groupe aryle carbocyclique choisi entre les radicaux naphtyle, anthryle, fluorényle, phénanthryle, biphénylyle, benzhydryle

et phényle portant trois ou plus de trois substi-

tuants alkyliques inférieurs à chaine droite; ou b) un radical carbocyclique saturé choisi entre un radical cyclohexyle portant trois ou plus de trois substituants alkyliques inférieurs à chaîne droite, un groupe perhydronaphtyle, perhydrobiphénylyle, perhydro-2,2diphénylméthyle ou adamantyle; Y est un groupe leucyle, isoleucyle, norleucyle ou N-méthyl-leucyle; Z représente le glycinamide ou un groupe -NHR1, ou R est un radical alkyle inférieur, cycloalkyle, ou fluoralkyle inférieur ou NH-C-NH-R, R étant un atome d'hydrogène ou un radical alkyle inférieur, caractérisé en ce qu'il consiste

(i) à enlever les groupes protecteurs et le cas éché-

ant le support solide lié par covalence d'un polypeptide protégé pour obtenir un composé de formule (I) ou un sel de ce composé et, le cas échéant (ii) à. convertir un composé de formule (I) en un sel acceptable du point de vue pharmaceutique, (iii) à convertir un sel d'un composé de formule (I) en un sel acceptable du point de vue pharmaceutique, ou (iv) à décomposer un sel d'un composé de formule (I)

en un polypeptide libre de for-mule (I).